WO2016066054A1 - 尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂及制备方法 - Google Patents

尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂及制备方法 Download PDF

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刘�东
黎磊
郑明彬
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江苏东博生物医药有限公司
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/82—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a precipitate or turbidity

Definitions

  • the invention belongs to a urine detecting reagent, and particularly relates to a detection reagent and a preparation method for an abnormal metabolite in the human body, 5-hydroxyindoleacetic acid.
  • the urine screening reagent is screened by the detection of abnormal metabolites in the urine of patients with tumor diseases.
  • the experimental data show that it is 1000 times more sensitive than the current tumor markers, and is 100,000 times more sensitive than CT and MRI. It is used to judge the possibility of malignant tumor in advance, and avoids the blood-sucking, which is easy to cause infection.
  • the invention provides a urine tumor detection marker 5-hydroxyindole acetic acid detecting reagent and a preparation method thereof, It is used to solve the problem of low detection accuracy.
  • the technical solution of the present invention is: the tumor marker 5-hydroxyindole acetic acid detection reagent in the urine, including Hg 2+ , Hg 2 2+ , Cu 2+ , WO 4 2- , SO 4 2- and NO 3 - aqueous solutions.
  • the concentration of the tumor marker 5-hydroxyindole acetic acid detecting reagent in the urine is Hg 2+ 0.17 to 0.50 mol/L, and the concentration of Hg 2 2+ is 0.25 to 0.88 mol/L, Cu 2
  • the concentration of + is 0.35 to 5.41 mmol/L, and the concentration of WO 4 2- is 0.37 to 5.40 mmol/L.
  • the invention also provides a preparation method of a tumor marker 5-hydroxyindoleacetic acid detecting reagent in urine, comprising the following steps:
  • nitric acid solution dilute commercially available concentrated nitric acid to 2 to 6 times the original volume, and cool to room temperature for use;
  • B solution weigh a certain amount of mercury nitrate dissolved in the nitric acid solution configured in step 2) to obtain a B solution;
  • the commercially available concentrated sulfuric acid concentration is about 98%, and the commercially available concentrated nitric acid concentration is about 65%.
  • the Hg 2+ content in step 3) is from 1.5 to 2.2 mol/L.
  • the Hg 2 2+ content in step 4) is from 1.8 to 2.5 mol/L.
  • the Cu 2+ content in step 5 is from 0.001 to 0.008 mol/L.
  • the WO 4 2- content in step 6) is from 0.01 to 0.03 mol/L.
  • the metabolic abnormality caused by cancer cells causes the 5-hydroxyindole acetic acid content in the urine to rise sharply compared with ordinary people.
  • the present invention reacts with the 5-hydroxyindoleacetic acid in the reagent to produce a red, red-like precipitate.
  • the detection method has a high sensitivity; mercury ions can react with other anions in the urine (such as halogen ions, nitrite ions) to form a white complex precipitate, in addition, copper ions can Stabilizes the red precipitate produced after the reaction, and because the mercury ion and the mercury ion are easily hydrolyzed or change with the temperature, the ratio of the ions in the reagent affects the reagent reaction sensitivity, and the copper ion can also ensure the reagent.
  • mercury ions can react with other anions in the urine (such as halogen ions, nitrite ions) to form a white complex precipitate
  • copper ions can Stabilizes the red precipitate produced after the reaction, and because the mercury ion and the mercury ion are easily hydrolyzed or change with the temperature, the ratio of the ions in the reagent affects the reagent reaction sensitivity, and the copper ion can also ensure the reagent.
  • the stability of the medium ions provides the stability of the reagent; and the tungstate ion can react with organic acids such as hippuric acid and glucuronic acid in the urine to form a corresponding non-red precipitate of the organic acid complex, and in the urine.
  • organic acids such as hippuric acid and glucuronic acid in the urine
  • the electrolyte reaction such as phosphate forms a non-red precipitate of the phosphotungstic heteropoly acid complex, and can also bind to abnormal metabolism caused by other diseases. Red and precipitated protein binding, thus greatly eliminate interference, improve the specific detection reagent.
  • the technical solution provided by the invention has the advantages of easy availability of raw materials, low cost, simple preparation process, stable performance of the obtained reagents, high universality, high sensitivity and good specificity for cancer detection, simple detection process, short time and easy Judging, it is especially suitable for large-scale population screening and cancer clinical auxiliary diagnosis and dynamic examination of efficacy.
  • All raw materials are common chemical grades of analytical grade, and the preparation process is also carried out under normal temperature and normal pressure.
  • a tumor marker 5-hydroxyindoleacetic acid detection reagent in the urine comprising an aqueous solution of Hg 2+ , Hg 2 2+ , Cu 2+ , WO 4 2- , SO 4 2- and NO 3 - , wherein Hg 2
  • the concentration of + is 0.30 mol/L
  • the concentration of Hg 2 2+ is 0.40 mol/L
  • the concentration of Cu 2+ is 3.03 mmol/L
  • the concentration of WO 4 2- is 0.91 mmol/L.
  • the preparation process is as follows:
  • a tumor marker 5-hydroxyindoleacetic acid detection reagent in the urine comprising an aqueous solution of Hg 2+ , Hg 2 2+ , Cu 2+ , WO 4 2- , SO 4 2- and NO 3 - , wherein Hg 2
  • the concentration of + is 0.30 mol/L
  • the concentration of Hg 2 2+ is 0.40 mol/L
  • the concentration of Cu 2+ is 3.03 mmol/L
  • the concentration of WO 4 2- is 0.91 mmol/L.
  • the preparation process is as follows:
  • a tumor marker 5-hydroxyindoleacetic acid detection reagent in the urine comprising an aqueous solution of Hg 2+ , Hg 2 2+ , Cu 2+ , WO 4 2- , SO 4 2- and NO 3 - , wherein Hg 2
  • the concentration of + is 0.39 mol/L
  • the concentration of Hg 2 2+ is 0.79 mol/L
  • the concentration of Cu 2+ is 0.70 mmol/L
  • the concentration of WO 4 2- is 4.74 mmol/L.
  • the preparation process is as follows:
  • the tumor marker 5-hydroxyindole acetic acid detecting reagent in the urine includes an aqueous solution of Hg 2+ , Hg 2 2+ , SO 4 2- and NO 3 - .
  • the preparation process is as follows: 1 part of commercially available concentrated sulfuric acid is diluted with water to 3 parts, cooled to room temperature, and a certain amount of mercury sulfate is dissolved therein, wherein the mercury ion content is 2 mol/L; 1 part of commercially available concentrated nitric acid is diluted with water to 3 parts. After cooling to room temperature, a certain amount of mercuric nitrate was dissolved therein, wherein the content of mercuric ions was 2.2 mol/L; and the above two solutions were uniformly mixed at a volume ratio of 1:1.2 to obtain a comparative reagent.
  • test subjects were taken 4 mL of fresh clean urine and added to an ampoule containing 0.5 ml of the reagent (test reagent prepared in Example 1), and left to stand for 5 min with a slight shaking.
  • the color of the precipitate was compared with a standard colorimetric plate. And the color is shown in Table 1 below:
  • test reagent used in the test method was the comparative test reagent prepared in Example 4, and the test results are shown in Table 4.
  • this reagent In order to further verify the effect of this reagent, we used this reagent to observe the dynamic changes of some cases of various malignant tumors, that is, the test results before and after treatment (surgery, radiotherapy, chemotherapy), as shown in Table 5.

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Abstract

一种尿液检测试剂，具体涉及一种对人体内异常代谢物—5-羟吲哚乙酸检测试剂及制备方法。所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，包括Hg 2+、Hg 2 2+、Cu 2+、WO 4 2-、SO 4 2-和NO 3 -的水溶液。所述制备方法包括如下步骤：硫酸溶液的制备；硝酸溶液的制备；A溶液的制备；B溶液的制备；C溶液的制备；D溶液的制备；E溶液的制备和混合。该制备方法的原材料易得，低廉，制备过程简单，获得的试剂性能稳定，用于癌症检测具有普适性强、灵敏度高和特异性好等特点，检测过程简单，时间短，易于判断，特别适合于大规模的人群普查及癌症临床辅助诊断和疗效动态检查。

Description

尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂及制备方法 技术领域
本发明属于尿液检测试剂，具体涉及一种对人体内异常代谢物—5-羟吲哚乙酸检测试剂及制备方法。
背景技术
癌症死亡率在所有疾病中占据首位，是人类健康的第一杀手已成为威胁人类生命和健康的一大病因，据统计每隔25年，癌症患者的人数就要翻一番。不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅猛上升，2030年这个数字可能会增至1320万。因此，癌症的防治已成为全球的卫生战略重点之一，而治疗癌症的关键在于早期发现、早期诊断和早期治疗。影像检测往往只能发现中晚期肿瘤类疾病，难以达到早期发现的目的，且价格昂贵，操作复杂，不适合大规模的人群普查。
尿液筛查试剂是通过肿瘤类疾病病人尿液中异常代谢物的检测进行筛查，实验数据表明其比目前的肿瘤标志物灵敏1000倍，比CT、MRI等影像检测灵敏10万倍，可以用于提前判断恶性肿瘤发生的可能性，且避免了抽血这项容易引起感染的环节。
但由于尿液中成分复杂，某些微量成分或者因其他病因导致的代谢异常产物同样会与检测试剂中的汞离子、亚汞离子结合生成颜色沉淀，会严重干扰检测结果的准确性，因此目前的尿液代谢物检测试剂虽然灵敏很高，但常常会出现假阳性问题，大大降低了检测的准确性，造成误诊，限制了其应用价值。
发明内容
本发明提供了一种尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂及制备方法， 用以解决检测准确性低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，包括Hg2+、Hg2 2+、Cu2+、WO4 2-、SO4 2-和NO3 -的水溶液。
优选地是，所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂中的浓度为Hg2+0.17～0.50mol/L，Hg2 2+的浓度为0.25～0.88mol/L，Cu2+的浓度为0.35～5.41mmol/L，WO4 2-的浓度为0.37～5.40mmol/L。
本发明还提供了尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)硫酸溶液的制备：将市售浓硫酸用水稀释至原体积的2～6倍，冷却至室温备用；
2)硝酸溶液的制备：将市售浓硝酸用水稀释至原体积的2～6倍，冷却至室温备用；
3)A溶液的制备：称取一定量的硝酸汞溶于步骤2)配置的所述硝酸溶液中获得A溶液；
4)B溶液的制备：称取一定量的硝酸亚汞溶于步骤2)配置的所述硝酸溶液中获得B溶液；
5)C溶液的制备：称取一定量的硫酸铜溶于步骤1)配置的所述硫酸溶液中获得C溶液；
6)D溶液的制备：称取一定量的钨酸钠溶于水中获得D溶液；
7)混合：将步骤3)、4)、5)和6)中制备的A、B、C和D溶液按1:(1.1～1.8):(2～5):(0.3～0.9)体积比混合，即得所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂。
公知常识中，所述市售浓硫酸浓度约为98％，所述市售浓硝酸浓度约为65％。
优选地是，步骤3)中Hg2+含量为1.5～2.2mol/L。
优选地是，步骤4)中Hg2 2+含量为1.8～2.5mol/L。
优选地是，步骤5)中Cu2+含量为0.001～0.008mol/L。
优选地是，步骤6)中WO4 2-含量为0.01～0.03mol/L。
癌细胞导致的代谢异常，会使尿液中5-羟吲哚乙酸含量较常人大幅上升，本发明通过试剂中的亚汞离子与5-羟吲哚乙酸反应产生红色、类红色沉淀，从而据此初步判断是否携带癌细胞，该检测方法具有高灵敏度的特点；汞离子能与尿液中其他的阴离子(如卤素离子、亚硝酸根离子)反应生成白色络合物沉淀，另外，铜离子可以稳定反应后产生的红色沉淀，并且因为汞离子和亚汞离子易水解或随温度变化导致二者比例发生变化，影响试剂中离子浓度配比，影响试剂反应灵敏度，而铜离子同样也可以保证试剂中离子的稳定，提供试剂的稳定性；而钨酸根离子能与尿液中的有机化物如马尿酸、葡萄糖醛酸等有机酸反应生成相应的有机酸络合物非红色沉淀，与尿液中的磷酸盐等电解质反应生成磷钨杂多酸络合物非红色沉淀，还能结合因其他疾病导致异常代谢的血红蛋白结合并使之沉淀，从而大大排除干扰，提高了检测试剂的特异性。
本发明提供的技术方案，原材料易得，低廉，制备过程简单，获得的试剂性能稳定，用于癌症检测具有普适性强、灵敏度高和特异性好等特点，检测过程简单，时间短，易于判断，特别适合于大规模的人群普查及癌症临床辅助诊断和疗效动态检查。
具体实施方式
所有原材料均为分析纯级别的普通化学制剂，制备过程也都在常温、常压下进行。
实施例1
所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，包括Hg2+、Hg2 2+、Cu2+、 WO4 2-、SO4 2-和NO3 -的水溶液，其中Hg2+的浓度为0.30mol/L，Hg2 2+的浓度为0.40mol/L，Cu2+的浓度为3.03mmol/L，WO4 2-的浓度为0.91mmol/L。
制备过程如下：
1)市售浓硫酸1份用水稀释成3份，冷却至室温备用；
2)市售浓硝酸1份用水稀释成3份，冷却至室温备用；
3)A溶液的制备：称取一定量的硫酸汞溶于步骤2)的硝酸溶液中，其中汞离子含量为2mol/L；
4)B溶液的制备：称取一定量的硝酸亚汞溶于步骤2)的硝酸溶液中，其中亚汞离子含量为2.2mol/L；
5)C溶液的制备：称取一定量硫酸铜溶于步骤1)的硫酸溶液中，，其中铜离子含量为0.005mol/L；
6)D溶液的制备：称取一定量的钨酸钠溶于蒸馏水中，其中钨酸根离子含量为0.015mol/L；
7)混合：将制备的A、B、C和D溶液按1:1.2:4:0.4体积比均匀混合，即得尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂。
实施例2
所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，包括Hg2+、Hg2 2+、Cu2+、WO4 2-、SO4 2-和NO3 -的水溶液，其中Hg2+的浓度为0.30mol/L，Hg2 2+的浓度为0.40mol/L，Cu2+的浓度为3.03mmol/L，WO4 2-的浓度为0.91mmol/L。
制备过程如下：
1)市售浓硫酸1份用水稀释成4份，冷却至室温备用；
2)市售浓硝酸1份用水稀释成4份，冷却至室温备用；
3)A溶液的制备：称取一定量的硫酸汞溶于步骤2)的硝酸溶液 中，其中汞离子含量为1.6mol/L；
4)B溶液的制备：称取一定量的硝酸亚汞溶于步骤2)的硝酸溶液中，其中亚汞离子含量为2mol/L；
5)C溶液的制备：称取一定量硫酸铜溶于步骤1)的硫酸溶液中，，其中铜离子含量为0.003mol/L；
6)D溶液的制备：称取一定量的钨酸钠溶于蒸馏水中，其中钨酸根离子含量为0.02mol/L；
7)混合：将制备的A、B、C和D溶液按1:1.5:3:0.7体积比均匀混合，即得尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂。
实施例3
所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，包括Hg2+、Hg2 2+、Cu2+、WO4 2-、SO4 2-和NO3 -的水溶液，其中Hg2+的浓度为0.39mol/L，Hg2 2+的浓度为0.79mol/L，Cu2+的浓度为0.70mmol/L，WO4 2-的浓度为4.74mmol/L。
制备过程如下：
1)市售浓硫酸1份用水稀释成6份，冷却至室温备用；
2)市售浓硝酸1份用水稀释成6份，冷却至室温备用；
3)A溶液的制备：称取一定量的硫酸汞溶于步骤2)的硝酸溶液中，其中汞离子含量为2.2mol/L；
4)B溶液的制备：称取一定量的硝酸亚汞溶于步骤2)的硝酸溶液中，其中亚汞离子含量为2.5mol/L；
5)C溶液的制备：称取一定量硫酸铜溶于步骤1)的硫酸溶液中，其中铜离子含量为0.002mol/L；
6)D溶液的制备：称取一定量的钨酸钠溶于蒸馏水中，其中钨酸 根离子含量为0.03mol/L；
7)混合：将制备的A、B、C和D溶液按1:1.8:2:0.9体积比均匀混合，即得尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂。
实施例3 对比例
所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，包括Hg2+、Hg2 2+、SO4 2-和NO3 -的水溶液。
制备过程如下：市售浓硫酸1份用水稀释成3份，冷却至室温，称取一定量的硫酸汞溶解其中，其中汞离子含量为2mol/L；市售浓硝酸1份用水稀释成3份，冷却至室温，称取一定量的硝酸亚汞溶解其中，其中亚汞离子含量为2.2mol/L；将上述两种溶液按1:1.2体积比均匀混合，即得对比例检测试剂。
实施例5 效果验证试验
1.试验对象
1)经临床诊断确诊为恶性肿瘤(已经临床检测手段确诊)的患者共957名，年龄20-80，男女各占一半，其中确诊的癌症有甲状腺癌、肝癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌等；
2)非肿瘤良性疾病组654名，年龄20-80岁，男女各半；
3)正常健康人组1854名，年龄20-80岁，男女各半为经检查健康合格者。
2.试验方法
所有试验对象均取新鲜洁净尿液4mL加入装有0.5ml试剂(实施例1制备的检测试剂)的安瓿中，稍加振荡静置约5min，将沉淀颜色与标准比色板对照判定结果，结果及颜色如下表1所示：
表1 尿液中检测5-羟吲哚乙酸判定标准
检测标准 符号 颜色
阴性 - 浅黄色或白色
弱阳性 ± 浅红色
阳性 + 红色
强阳性 ++ 深红色
3.实验结果：
1)癌症筛查：
表2 各组尿液比较
Figure PCTCN2015092604-appb-000001
表3 不同恶性肿瘤检测结果
癌症名 甲状腺癌 肝癌 胃癌 食道癌 乳腺癌 宫颈癌 鼻咽癌
患者例数 131 212 105 120 50 47 292
阳性数 131 210 105 120 50 46 290
阳性率 100％ 99.1％ 100％ 100％ 100％ 97.9％ 99.3％
如上所示，在医院所提供的957名恶性肿瘤患者中，检测出阳性患者有948名，检出率达99.05％，在正常组(0.22％)和非肿瘤良性疾病组(3.8％)中检出皆低于5％，说明本发明提供的尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂进行恶性肿瘤的筛查灵敏度高，阳性率高，表3的结果同时也证明本制剂能广泛的鉴别不同恶性肿瘤。
实施例6
与实施例4的试验对象相同，试验方法中所用检测试剂为实施例4中制备的对比例检测试剂，测试结果如表4。
表4 各组尿液比较
Figure PCTCN2015092604-appb-000002
通过对比例可以进一步对比发现，本发明提供的技术方案大大降低了假阳性的概率，提供了检测的精确度。
实施例7
为进一步验证此试剂效果，我们用该试剂观察了各种恶性肿瘤部分病例的动态变化，即治疗前与治疗(手术、放疗、化疗)后的检测结果，详见表5。
表5 治疗前后尿液5-羟吲哚乙酸变化
Figure PCTCN2015092604-appb-000003
以上结果表明，本制剂用于尿液检测可以作为恶性肿瘤治疗(手术、放疗、化疗)评价的客观指标，尿液中5-羟吲哚乙酸测定和其他的肿瘤标记物一样，是能够反映患者的病情变化，其浓度是会随着患者病情的变化而发生改变的。说明本试剂是能够对癌症患者的疗效观察及预后是有帮助的。

Claims (7)

  1. 一种尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，其特征在于，包括Hg2+、Hg2 2+、Cu2+、WO4 2-、SO4 2-和NO3 -的水溶液。
  2. 根据权利要求1所述一种尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂，其特征在于，所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂中的浓度为Hg2+0.17～0.50mol/L，Hg2 2+的浓度为0.25-0.88mol/L，Cu2+的浓度为0.35-5.41mmol/L，WO4 2-的浓度为0.37-5.40mmol/L。
  3. 权利要求1或2所述一种尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
    1)硫酸溶液的制备：将市售浓硫酸用水稀释至原体积的2～6倍，冷却至室温备用；
    2)硝酸溶液的制备：将市售浓硝酸用水稀释至原体积的2～6倍，冷却至室温备用；
    3)A溶液的制备：称取一定量的硝酸汞溶于步骤2)配置的所述硝酸溶液中获得A溶液；
    4)B溶液的制备：称取一定量的硝酸亚汞溶于步骤2)配置的所述硝酸溶液中获得B溶液；
    5)C溶液的制备：称取一定量的硫酸铜溶于步骤1)配置的所述硫酸溶液中获得C溶液；
    6)D溶液的制备：称取一定量的钨酸钠溶于水中获得D溶液；
    7)混合：将步骤3)、4)、5)和6)中制备的A、B、C和D溶液按1:(1.1～1.8):(2～5):(0.3～0.9)体积比混合，即得所述尿液中肿瘤标志物5-羟吲哚乙酸检测试剂。
  4. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤3)中Hg2+含量为1.5～2.2mol/L。
  5. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤4)中Hg2 2+含量为1.8～2.5mol/L。
  6. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤5)中Cu2+含量为0.001～0.008mol/L。
  7. 根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，步骤6)中WO4 2-含量为0.01～0.03mol/L。
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