CN111020002A - 一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒 - Google Patents

一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，包括：磷酸缓冲液、试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4、5‑羟吲哚醋酸氧化酶、5‑羟基吲哚乙酸(IAA)标准品；其中，试剂R1为FeCI3或Fe2(SO4)3溶液，试剂R2为高氯酸或H2SO4溶液，试剂R3为MnCI2或MnSO4溶液，试剂R4为四氯酚溶液。本发明组成的试剂盒能用于人肝癌尿液定量的标志物检测，灵敏度高。本发明试剂盒使用微量尿液作为检测标本，具有采集方便，节约检测费用等优点。

Description

一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒
技术领域
本发明专利涉及医学检验领域，具体涉及一种尿液检测筛查肝癌的试剂盒。
背景技术
肝癌是中国最常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率仍呈上升趋势。早期诊断患者的预后较好，术后5年生存率提高。肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约八十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。
肝癌的诊断主要依赖最常用的是肝脏超声检查，超声检查为非侵入性检查，对人体组织无任何不良影响，其操作简单、直观准确、费用低廉、方便无创、广泛普及，可用于肝癌的普查和治疗后随访。医学上已经发现并具有一定临床价值的肿瘤标志物大概有100多种，包括胚胎类、糖类糖蛋白酶类蛋白类、激素类三大类。
目前发现的主要肝癌肿瘤标志物包括血清甲胎蛋白AFP等，甲胎蛋白正常值一般小于20ug/L，当一般大于500ug/L,持续4周，或由低浓度逐渐升高不降，这是肝细胞癌的标准学检查。约有10％的病灶被漏诊。此外，AFP偏高也可能是生殖细胞肿瘤。据统计显示，约有一半生殖细胞肿瘤患者其AFP显示呈阳性。同时，甲胎蛋白作为唯一一个应用最广的血清学标志物在肝癌的诊断和监测中发挥着重要的作用，但是其对早期肝癌的检出率不高。
国内外很多相关医学研究者致力于寻找更理想的肝癌早期诊断标志物，以期补充、替代甲胎蛋白标志物等的检查，提高诊断准确性，协助疾病风险评估，监测肿瘤的恶性程度，预测肿瘤进展，使肝癌的诊断更为准确、经济。
上海东方肝胆外科医院的研究团队，经10余年研究、1000多例临床实验发现，人体内一种叫GPC3的蛋白聚糖物可作为检出早期肝癌的分子标志物。上述研究指出GPC3基因定位于人染色体X26.10，参与了生长、发育以及细胞对生长因子的反应等生命过程。对于早期肝癌的敏感性为72％，在患者小于3cm的肿瘤组织中仍可检测到它的存在，而甲胎蛋白检出率仅为22％；34名肝癌患者中有18名血清中检测到它的阳性。而20名肝硬化病人仅有1名检测结果呈阳性。所以说，人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)的检测有效性从上述结果和其它同类研究的数据看对肝癌的阳性率诊断在51-53％，早期发现的程度还有待于进一步研究。
肿瘤标志物升高并不一定患有癌症，其筛查的意义仅在于提示作用。肿瘤标志物升高不仅用于肿瘤性疾病，例如慢性肝炎、前列腺增生、子宫内膜异位以及服用了某些药物都有可能会干预检查结果。若肿瘤标志物动态检测结果持续升高，则提示有可能存在异常，需要进一步做彩超、CT、PET-CT等检查，必要时可通过病理活体组织检查明确诊断。现有的用于肝癌标志物检测的试剂盒，癌发初期诊断的意义不大，阳性后往往癌症已经发展到中晚期，也无法有力的确定癌症侵润性程度，而且，检测漏诊率相对较大。因此本领域仍缺乏非常有效的试剂盒，尤其是缺少对于肝癌的早期筛查有较大意义的检测办法。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供一种定量尿液检测筛查肝癌有早期意义的试剂盒，该试剂盒、灵敏度高。
检测物的代谢过程
5-HT是一种吲哚胺，5-HT能神经元在脑内主要集中在位于脑干正中线的中缝核群内，其纤维向上至大脑皮层、纹状体、血脑和下丘脑等，下行至脊髓灰质的胶质区、侧角和前角。5-HT的合成是色氨酸在色氨酸羟化酶作用下生成5-羟色氨酸(5-HTP)，又在5-羟色胺酸脱羧酶催化下脱去羧基生成5-HT。在单胺氧化酶作用下，5-HT降解为5-羟吲哚醋酸(5-hy-droxyindole acetic acid，5-HIAA)。
检测原理
在无机酸存在时，通过下述两个反应，用吲哚乙酸及Mn2+、四氯酚、5-羟吲哚醋酸氧化酶反应后的生成物和Fe3+发生反应，有粉红或红色的螯合物产生。在530nm进行比色定量测定。将上述反应结果的比色测量值与标准曲线值进行比较，从而得到测量的实际结果。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，包括：磷酸缓冲液(PBS溶液)、试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4、5-羟吲哚醋酸氧化酶、5-羟基吲哚乙酸(IAA)标准品；其中，试剂R1为FeCI3或Fe2(SO4)3溶液，试剂R2为高氯酸或H2SO4溶液，试剂R3为MnCI2或MnSO4溶液，试剂R4为四氯酚溶液；
根据上文技术方案，优选的情况下，所述离心的条件为：3500-4500rpm离心15-25分钟。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂R1与试剂R2使用时的体积比为1:(40-50)；
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂R3、试剂R4在使用前按照体积比1:(1-3)混合配制。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述磷酸缓冲液为浓度0.02-0.06mol/L的磷酸缓冲液，优选为0.02mol/L；所述磷酸缓冲液的pH为6.0-7.2，优选为6.0-6.1。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂R1为浓度0.27-0.9mol/L的FeCI3或Fe2(SO4)3溶液.
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂R2为浓度20-40％的高氯酸，或按照浓H2SO4与水的体积为3：2配制而成的H2SO4溶液。
根据上文技术方案，更为优选的情况下，所述检测试剂R2为浓度30％的高氯酸。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述H2SO4溶液为浓H2SO4 300ml加蒸馏水至500mL配制而成。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂R3为浓度0.7-1.3mmol/L的MnCI2或MnSO4溶液，浓度为1-1.2mmol/L。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂R4为浓度为0.9-1.4mmol/L的四氯酚溶液。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述吲哚乙酸氧化酶的制备方法为：将绿豆下胚轴加入磷酸缓冲液中，冰浴研磨，离心，取上清液，即为粗酶液，将粗酶液过滤后使用；
其中，所述绿豆下胚轴与磷酸缓冲液的比例关系为(4-6)g：50ml。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述离心的条件为：3500-4500rpm离心15-25分钟。根据上文技术方案，优选的情况下，所述IAA标准品配制成IAA标准溶液，所述IAA标准溶液的浓度为90-300μmol/L，优选为90-120μg/mL。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂R1(FeCI3或Fe2(SO4)3溶液)均由磷酸盐缓冲液配制而成，即在使用时均用磷酸盐缓冲液进行溶解；所述试剂R2(H2SO4溶液)、试剂R3(MnCI2或MnSO4溶液)、试剂R4(四氯酚溶液)均由蒸馏水配制而成，即在使用时均用蒸馏水进行溶解；所述IAA标准溶液先用少量乙醇将IAA标准品溶解，再加入蒸馏水配制而成。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂盒还包括：盒体、位于盒体内的酶标板和用于装有试剂的试剂瓶；规格：48T/96T。
根据上文技术方案，优选的情况下，所述试剂盒的保存条件：2-8℃低温保存，保质期：12个月。
本发明还涉及保护利用上述的试剂盒在检测筛查肝癌中的应用，试剂盒能组成的试剂盒能用于人肝癌尿液定量的标志物检测。
本发明的有益效果：
(1)5-HIAA的过度分泌，导致尿中5-HIAA量有所改变，通过对肝癌患者和正常人尿液标本检测发现，与肝癌出现的频率和严重程度有相关性。5-HIAA当其浓度为4.005-4.96mg/L时，表征的是侵略性低，浓度为4.97-5.66mg/L时，表征的是侵略性稍高，浓度大于5.67mg/L时表示侵略比较大。尿中5-HIAA轻度升高可发生在腹泻等其它疾病。
(2)组成的试剂盒能用于人肝癌尿液定量的标志物检测。
本试剂盒通过IAA代谢物的检测结果，可以综合判断肝癌侵略性水平，即恶性程度，指导医生进行检查和治疗，有助于调整和加快患者治疗；可以达到早发现早治疗的有益目标。通过持续动态监测，可以早期发现肿瘤的出现。
(3)本发明提供的试剂盒灵敏度高。
(4)本发明试剂盒使用微量尿液作为检测标本，具有采集方便，节约检测费用等优点。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。
下述实施例中，所用各试剂的来源如下：
IAA标准品，盒装液体，厂家：上海西宝生物科技有限公司；
FeCI3、MnCI2·4H2O、四氯酚，厂家：上海西宝生物科技有限公司
35％高氯酸，浓H2SO4，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，磷酸等常用试剂均购自于国药集团化学试剂有限公司。
本发明实施例中溶液采用以下配制方法：
IAA标准溶液的配制：准确称量IAA(AR)10mg，先用少量乙醇溶解，然后用蒸馏水(缓冲液)定容至100mL(浓度为100μg/mL)作为贮备液，然后用贮备液配成浓度标准溶液，作为工作液(现用现配)。
试剂R1液为0.5mol/L的FeCI3溶液15mL，试剂R1由磷酸盐缓冲液配制。
试剂R2液为35％高氯酸500mL。
试剂R3为1mmol/L MnCI2溶液的配制：称取MnCI2.4H2O 19.8mg，用蒸馏水定容至100mL。
试剂R4为1mmol/L四氯酚溶液的配制：称取四氯酚16.3mg，用蒸馏水定容至100mL。
0.02mol/L磷酸缓冲液(PBS)的配制：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠2.7g，磷酸二氢钾0.2g，加蒸馏水至1000mL，用磷酸调节pH到6.0。
吲哚乙酸氧化酶的制备方法为：称取5g绿豆下胚轴，加入预冷的磷酸缓冲液(pH6.0)50ml，冰浴研磨，4000rpm离心20分钟，取上清液，即为粗酶液，将粗酶液过滤后使用。
实施例1
一、操作步骤
1、加样：分别设空白孔、标准孔和待测样品孔，下述的操作按照表1进行加样。
2.在酶标板上空白孔加入蒸馏水20μL，IAA标准溶液先准确加20μL到标准孔内，再加待测尿液标本20μl到待测样品孔中。分别加磷酸缓冲液50μL到标准孔和待测样品孔中。加样时将标本加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3、温育：用封板膜封板后置37℃温育10分钟。
4、R试剂混合液的配制：将试剂R1和R2进行配制后备用，按体积比R1:R2＝1:50，在使用前混合，避光保存。
5、操作按下表1分别将R试剂和B试剂加入到标准孔和待测样品孔，其中B试剂在使用前已配制，B试剂的配制方法：将试剂R3和试剂R4在使用前按照体积比1:1混合配制混合液，再每70-100ml混合液中加入上述方法提取的5-羟吲哚醋酸氧化酶5ml。
表1 尿标本加样反应
Figure BDA0002329126650000051
6、混匀水浴
分别将加样后的标准孔、待测样品孔轻轻震荡混匀，37℃水浴避光反应10分钟。加样后的空白孔37℃水浴避光反应10分钟。
7、测定
上酶标仪，用530nm测量各孔的吸光度(OD值)，检测出反应结果。
8、结果计算：
按照公式：X＝A×C/B，计算待测吸光度。
式中，标准浓度(A)【IAA标准值200μg/mL】；标准吸光度(B)【标准反应后检测的OD值】；
待测浓度(X)，待测吸光度(C)【为标本反应后检测的OD值】
所述的待测样品孔中，R试剂能与5-HIAA生成一种红色物质，而色素的生成量与样本中5-HIAA的浓度成正比；用酶标仪进行定量检测，比色法(OD＝530nm)，检测530nm处测吸光度，其颜色的深浅和样品中的待测物质呈正相关。通过上计算公式可以得到待测目标物质的量。
9、标准曲线制作：
配制IAA系列浓度工作液(其中浓度分别为0mg/L，30mg/L，60mg/L，90mg/L，120mg/L，150mg/L)，按照下表2进行加样。于40℃温箱暗处保温30min(加速显色反应)；于530nm下比色，以OD值为纵坐标，以IAA浓度(μg/ML)为横坐标，绘出标准曲线。
表2 标准曲线反应步骤
Figure BDA0002329126650000061
【参考范围】
正常范围：(新鲜尿)0.65—3.35mg/L
【影响因素】
1.5-HIAA的分泌率与年龄、性别和种族基本无关。
2.应排除食物因素(富含5-HT的食物、香蕉、李子、西红柿和核桃等)。
3.应排除药物(利舍平、噻嗪类衍生物、卢戈液等)可能引起的假阳性或假阴性的影响，一般需禁该种类药物48h以上。
检测干扰：食品和药物(香蕉、西红柿、杏、核桃、茄子、利血平、酚噻嗪衍生物、卢戈氏液等)。
附注:
(1)标本采集后，应立即测定或贮存于冰箱冰冻，但不超过1周。
(2)避免各种可能有影响的药物，测定前1～2天应停服药物以免干扰。
【注意事项】
1.鸭梨、香蕉、茄子、菠萝、李子和胡桃等富含5-HT，易至5-HIAA假性升高，检查前3-4天应禁食此类食物。
2.乙酰苯胺及有关药物，止咳药，可至假性升高；酚噻嗪、异丙嗪等药物可至假性降低，因此在测定期间应停用上述药物。
3.应用荧光分光光度法和HPIC法可提高测定的灵敏度，并可排除上述药物的干扰，提高特异性，有条件的实验室可采用。
三、检测分析
表3 检测结果简要分析表
Figure BDA0002329126650000071
注释：因为肝癌病人的检测结果和正常人检测的范围有一定的交叉范围，且本发明的诊断试剂是辅助性诊断，对于大于3.35mg/L的建议其到医院接受进一步确诊。对于在1.12与3.35区间的交叉范围，采用动态跟踪复检的方法，一旦多次复检发现其检测值逐渐升高时，则可作为一个肝癌危险发生信息，建议其到医院全面检查和诊断；同时，我们也会配套AFP等方法进行联合检测验证。
四、检测性能试验
1.准确性：所测标准品在定值的±10％。
2.精密度：根据上述试剂以及方法检测IAA代谢衍生物的浓度，测量结果见表4。
表4 IAA精密度实验测定数据
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CV％
检测结果mg/L(室内) 43 47 46 45 49 46 45 48 49 50 4.7
检测结果mg/L(室间) 50 48 47 45 48 46 49 44 46 47 3.89
注释：上述表1-10为标准试管编号。
3.本发明试剂盒的检测范围
对IAA标准品，分别配制6个不同浓度的样本溶液，0mg/L，30mg/L，60mg/L，90mg/L，120mg/L，150mg/L，分别测定吸光度，由公式X＝A×C/B计算可知，检测结果成线性关系，线性范围0-150mg/L。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，包括：磷酸缓冲液、试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4、5-羟吲哚醋酸氧化酶、5-羟基吲哚乙酸标准品；
其中，试剂R1为FeCI3或Fe2(SO4)3溶液，试剂R2为高氯酸或H2SO4溶液，试剂R3为MnCI2或MnSO4溶液，试剂R4为四氯酚溶液。
2.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1为浓度0.27-0.9mol/L的FeCI3或Fe2(SO4)3溶液。
3.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2为浓度20-40％的高氯酸，或浓H2SO4与水按照3：2的体积比配制而成的H2SO4溶液。
4.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂R3为浓度0.7-1.3mmol/L的MnCI2或MnSO4溶液。
5.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂R4为浓度为0.9-1.4mmol/L的四氯酚溶液。
6.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述吲哚乙酸氧化酶的制备方法为：将绿豆下胚轴加入磷酸缓冲液中，冰浴研磨，离心，取上清液，过滤；
其中，所述绿豆下胚轴与磷酸缓冲液的比例关系为4-6g:50ml。
7.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2使用时的体积比为1:40-50。
8.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂R3和试剂R4在使用前按照体积比1:1-3混合配制。
9.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述PBS溶液为浓度0.02-0.06mol/L的磷酸缓冲液，pH为6.0-7.2。
10.根据权利要求1所述的一种用于尿液筛查肝癌的试剂盒，其特征在于，所述离心的条件为：3500-4500rpm离心15-25分钟。
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