RU2816878C1 - Биологический агент для проведения анализа уровня внеклеточной опухолевой днк и способ его применения - Google Patents
Биологический агент для проведения анализа уровня внеклеточной опухолевой днк и способ его применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816878C1 RU2816878C1 RU2022128771A RU2022128771A RU2816878C1 RU 2816878 C1 RU2816878 C1 RU 2816878C1 RU 2022128771 A RU2022128771 A RU 2022128771A RU 2022128771 A RU2022128771 A RU 2022128771A RU 2816878 C1 RU2816878 C1 RU 2816878C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- level
- biomaterial
- seq
- insdseq
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 76
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 66
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 117
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 54
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims abstract 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 26
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 9
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 8
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 4
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101100321419 Homo sapiens ZDHHC1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150105104 Kras gene Proteins 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 201000008129 pancreatic ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 2-chloro-n-[[(2r,3s,5r)-3-hydroxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl]acetamide Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CNC(=O)CCl)[C@@H](O)C1 SNBCLPGEMZEWLU-QXFUBDJGSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000010197 meta-analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000771 oncological effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 101100268670 Caenorhabditis elegans acc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000782074 Homo sapiens Palmitoyltransferase ZDHHC1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 206010023129 Jaundice cholestatic Diseases 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005267 Obstructive Jaundice Diseases 0.000 description 1
- 102100036609 Palmitoyltransferase ZDHHC1 Human genes 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 101150047500 TERT gene Proteins 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000006682 Warburg effect Effects 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000009607 mammography Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Описан биологический агент для проведения анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала. Агент представляет собой синтетический фрагмент ДНК длинной 88 пар оснований, представленный в виде двух комплементарных друг другу цепей ДНК с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. Агент используется в качестве экзогенного контроля при определении внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала. Также описан набор для проведения цифровой полимеразной цепной реакции. Набор включает описанный биологический агент и прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно, а также олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд с последовательностью SEQ ID NO: 5. Раскрыт способ анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии. Добавляют в образец реагенты из описанного набора. Выделяют ДНК из биоматериала. Проводят количественное определение внеклеточной опухолевой ДНК и количественное определение описанного агента. Проводят расчет коэффициента экстракции ДНК, используемого для нормализации уровня внеклеточной опухолевой ДНК. Изобретение может быть использовано для повышения точности и воспроизводимости количественного анализа уровня опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 2 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике в области онкологии, и может быть использовано для повышения точности и воспроизводимости количественного анализа уровня опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях.
Уровень техники
Онкологические заболевания являются одной из ключевых проблем современного здравоохранения. По данным Международного агентства по изучению рака, в 2020 году по всему миру было зарегистрировано 19,3 млн новых случаев рака, а также 10 млн смертей, ассоциированных с ним [Sung H., Ferlay J., Siegel R.L. et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. // CA: a cancer journal for clinicians. 2021. Vol. 3(71). P. 209-249. DOI:10.3322/caac.21660]. Известно, что выживаемость онкологических больных тем выше, чем раньше был поставлен соответствующий диагноз [Loud J.T., Murphy J. Cancer Screening and Early Detection in the 21(st) Century. // Seminars in oncology nursing. 2017. Vol. 2(33). P. 121-128. DOI:10.1016/j.soncn.2017.02.002]. Раннее выявление опухоли также способствует значительному снижению затрат на терапию пациента [Blumen H., Fitch K., Polkus V. Comparison of Treatment Costs for Breast Cancer, by Tumor Stage and Type of Service. // American health & drug benefits. 2016. Vol. 1(9). P. 23-32. DOI:10.1371/journal.pone.0207993].
В настоящее время золотым стандартом диагностики злокачественных новообразований является биопсия с последующим гистологическим/гистохимическим исследованием. Этот подход незаменим для классификации опухоли по стадии и типу. Однако в ряде случаев проведение биопсии затруднено, например, при глиобластомах и выраженных диссеминированных метастазах. Также использование биопсии для столь необходимой ранней диагностики рака нецелесообразно не только из-за высокой инвазивности метода, но и из-за того, что на этом этапе опухоль может быть еще не сформирована и прицельный забор биоматериала невозможен. Тем не менее для некоторых видов онкологических заболеваний существуют широко используемые подходы к скринингу, например, маммография при раке молочной железы и анализ уровня простатспецифического антигена при раке простаты, однако они характеризуются довольно низкими чувствительностью и специфичностью [Catalona W.J. Prostate Cancer Screening. // The Medical clinics of North America. 2018. Vol. 2(102). P. 199-214. DOI:10.1016/j.mcna.2017.11.001].
Не менее важным с клинической точки зрения является мониторинг активности опухолевого процесса, будь то регрессия новообразования на фоне терапии или рост опухоли с метастазированием. На данный момент для этого преимущественно используются различные методы визуализации, включающие лучевую диагностику, магнитно-резонансную томографию и ультразвуковое исследование. Использование подобных методов сопряжено с низкой воспроизводимостью, ввиду субъективности анализа, а также требует участия высококвалифицированного персонала [Yoon S.H., Kim K.W., Goo J.M., Kim D.-W., Hahn S. Observer variability in RECIST-based tumour burden measurements: a meta-analysis. // European journal of cancer (Oxford, England: 1990). 2016. (53). P. 5-15. DOI:10.1016/j.ejca.2015.10.014.].
Вышеперечисленных недостатков традиционных подходов к диагностике и мониторингу онкологического процесса лишена современная техника выявления дериватов опухоли в биологических жидкостях организма - жидкостная биопсия. Данный подход уже зарекомендовал себя как крайне перспективная альтернатива традиционной биопсии в отношении диагностики онкологических заболеваний [Zhu Y., Zhang H., Chen N., Hao J., Jin H., Ma X. Diagnostic value of various liquid biopsy methods for pancreatic cancer: A systematic review and meta-analysis. // Medicine. 2020. Vol. 3(99). P. e18581. DOI:10.1097/MD.0000000000018581]. Наиболее распространенным направлением жидкостной биопсии является анализ внеклеточной опухолевой ДНК (воДНК), выявляемой по характерным для злокачественного новообразования мутациям или изменениям паттернов метилирования и представляющая собой небольшие фрагменты ДНК размером 50-150 пар оснований. Однако нерешенным вопросом остается выбор способа представления результатов количественного анализа воДНК: абсолютный в виде копий (или единиц массы) на единицу объема или нормализованный по уровню какого-либо иного маркера.
Из уровня техники известен способ абсолютного отображения результатов количественного анализа воДНК [Патент US7888008B2; Method for the detection of cancer], по которому уровень воДНК, измеренный с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, представляется в виде нг в 1 мл плазмы пациента. Ключевым недостатком данного способа является низкая воспроизводимость результатов, ограничиваемая воспроизводимостью самого процесса выделения ДНК из плазмы, а также влиянием погрешности пипетирования на стадиях внесения биологического образца, элюирования ДНК и внесения раствора ДНК в реакционную смесь. Не менее значимым является то, что данный способ подразумевает калибровку при помощи серийных разведений стандартных образцов ДНК, что также снижает воспроизводимость результатов, так как анализ серийных разведений стандартных образцов ДНК в равной степени связан с погрешностью пипетирования на разных стадиях их подготовки. Ограниченная воспроизводимость подобного абсолютного подхода к представлению результатов количественного анализа воДНК в образцах биоматериала онкологических больных затрудняет не только сравнение данных между разными лабораториями, но и процесс регулярного мониторинга уровня воДНК в рамках цикла химиотерапии для оценки степени ответа на лечение.
Так, из уровня техники известен способ абсолютного представления результатов количественного анализа воДНК [Seremet T., Jansen Y., Planken S. et al. Undetectable circulating tumor DNA (ctDNA) levels correlate with favorable outcome in metastatic melanoma patients treated with anti-PD1 therapy // Journal of Translational Medicine 2019. Vol. 1(17). P. 1-13. DOI:10.1186/S12967-019-2051-8], в соответствии с которым уровень воДНК представляется в виде копий на 1 мл плазмы пациента. Данный способ подразумевает абсолютный количественный анализ при помощи метода цифровой капельной ПЦР, который не нуждается в серийных разведениях какого-либо стандартного раствора для калибровки. Тем не менее воспроизводимость количественного анализа по данному способу все же подвержена влиянию ряда вышеназванных факторов, таких как ограниченная воспроизводимость процесса выделения ДНК из биоматериала, а также погрешностям пипетирования на разных стадиях. Обозначенные недостатки способа нашли отражение в низкой корреляции уровня воДНК в плазме с размером злокачественного новообразования (коэффициент корреляции составил всего 0,32, что соответствует крайне слабой положительной корреляции).
Из уровня техники также известен способ нормализации уровня опухолевой ДНК по уровню метилированного гена ZDHHC1 [Патент EP3230476B1; ZDHHC1 for normalizaing methylation detection assays]. Данный способ подразумевает, что определенный с помощью количественной ПЦР уровень биомаркера с характерным для желудочно-кишечных злокачественных новообразований паттерном метилирования будет нормализован по уровню метилированного гена ZDHHC1. Недостатком данного способа является тот факт, что метилированный ген ZDHHC1 не присутствует (или крайне малочисленен) в крови и плазме пациентов без метастатического рака. Следовательно, нормализация по его уровню в данном биоматериале невозможна, однако такой способ подходит для образцов фекалий и ткани. Также стоит отметить, что данный способ нормализации воДНК подходит только для анализа по паттернам метилирования и не применим для выявления воДНК по мутациям, характерным для опухолевых клеток.
Из уровня техники известен и способ представления результатов количественного анализа воДНК в виде доли воДНК от уровня общей ДНК в биоматериале [Jain M., Kamalov D., Tivtikyan A. et al. Urine TERT promoter mutations-based tumor DNA detection in patients with bladder cancer: A pilot study // Molecular and Clinical Oncology 2021. Vol. 15 (253). DOI:10.3892/mco.2021.2415]. В соответствии с данным способом уровень воДНК в моче измеряется по мутациям в промоторе гена TERT, а затем делится на сумму уровней воДНК и ДНК дикого типа и представляется в виде фракции (%). Данный способ подразумевает цифровую капельную ПЦР в качестве метода количественного анализа. Относительный характер представления данных избавляет способ от влияния погрешности пипетирования или ограниченной воспроизводимости процесса выделения ДНК из биоматериала. Однако корреляция фракции воДНК с размером злокачественного новообразования была статистически незначимой. Причиной этому может являться влияние так называемого эффекта Варбурга [Meng W., Hao Y., He C. et al. Exosome-orchestrated hypoxic tumor microenvironment // Molecular Cancer. 2019. Vol. 1(18). DOI:10.1186/S12943-019-0982-6], который приводит к закислению окружающей опухоль ткани и к выделению из нее ДНК дикого типа в ходе апоптоза или активной секреции, ассоциированной с репаративными процессами. В результате значение фракции воДНК оказывается заниженным, ведь чем больше опухоль, тем более явным оказывается данный эффект, и вместе с ростом числителя в формуле вычисления фракции воДНК растет и знаменатель.
Таким образом, в настоящее время существует необходимость в разработке способа нормализации уровня воДНК в биоматериале для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях, лишенного всех вышеперечисленных недостатков.
Техническая проблема, решаемая посредством заявляемого изобретения, заключается в необходимости разработки способа нормализации уровня воДНК в образцах биоматериала для количественного анализа с применением жидкостной биопсии, отличающегося от аналогов возможностью применения в любом жидком биоматериале, устойчивостью к влиянию каких-либо эндогенных факторов в организме пациента, ограниченной воспроизводимости процесса выделения нуклеиновых кислот из биоматериала и погрешностям пипетирования, а также повышающего способность уровня воДНК отражать размер злокачественного новообразования.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нормализованного значения концентрации воДНК в биоматериале пациента с онкологическим заболеванием, коррелирующего с размером опухоли в большей степени, чем значения концентрации воДНК, представляемые по известным из уровня техники способам (табл. 2), и пригодного для мониторинга ответа на терапию и прогрессирования заболевания.
Техническая проблема решается за счет создания набора реагентов, включающего синтетический фрагмент ДНК - биологический агент (представлен отдельными прямой и обратной цепями ДНК с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), используемый в качестве экзогенного контроля эффективности выделения ДНК из биоматериала, последовательность которого не встречается в организме человека и размер которого имитирует средний размер фрагментов воДНК, пару олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченый зонд для детектирования синтетического фрагмента ДНК.
Также техническая проблема решается набором для проведения цифровой полимеразной цепной реакции, включающий заявляемый биологический агент и прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно, а также олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд с последовательностью SEQ ID NO: 5.
Техническая проблема также решается способом нормализации уровня воДНК в биоматериале для жидкостной биопсии, включающим:
- ренатурацию прямой и обратной цепей синтетического фрагмента ДНК путем их смешивания в соотношении 1:1 и последующих нагревания и медленного охлаждения;
- добавление ренатурировавшего синтетического фрагмента ДНК в жидкий биоматериал в заведомо известной концентрации перед процедурой выделения нуклеиновых кислот;
- выделение нуклеиновых кислот из исследуемого образца любого жидкого биоматериала любым известным из уровня техники способом, например, с использованием сорбционной колонки или магнитных частиц [Pandoh P., Corbett R., McDonald H. et al. A high-throughput protocol for isolating cell-free circulating tumor DNA from peripheral blood // Biotechniques. 2019 Vol. 66(2). P. 85-92. DOI: 10.2144/btn-2018-0148];
- проведение любой известной из уровня техники вариации цифровой ПЦР, например, цифровой капельной ПЦР или цифровой ПЦР на чипах [Quan P., Sauzade M., Brouzes E. dPCR: A Technology Review // Sensors. 2018 Vol. 18(4) P. 1271. DOI: 10.3390/s18041271], с количественным определением уровня синтетического фрагмента ДНК в образце, добавленного в биоматериал в качестве экзогенного контроля, с использованием заявляемых в данном документе олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченого зонда, специфичных к заявляемому синтетическому фрагменту ДНК;
- расчет значения коэффициента экстракции (КЭ) ДНК в соответствии со следующей формулой:
КЭ = (СК2 × VЭ/Б) / (СК1 × VБ/М),
где КЭ - коэффициент экстракции ДНК, СК2 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК в растворе ДНК (копии на 1 микролитре раствора ДНК), VЭ/Б - объем элюирующего буфера, использованного при выделении ДНК (микролитры), СК1 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК (копии в 1 миллилитре биоматериала), VБ/М - объем биоматериала, из которого выделялась ДНК (миллилитры);
- определение уровня воДНК в образце любым известным из уровня техники способом, например, при помощи секвенирования нового поколения или цифровой ПЦР [Cisneros-Villanueva, M., Hidalgo-Pérez, L., Rios-Romero, M. et al. Cell-free DNA analysis in current cancer clinical trials: a review // Br J Cancer. 2022. Vol. 126. P. 391-400. DOI: 10.1038/s41416-021-01696-0];
- нормализация определенного уровня воДНК по уровню экзогенного контрольного фрагмента ДНК путем деления уровня воДНК на рассчитанный коэффициент экстракции ДНК.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлены результаты определения линейности количественного анализа уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК. По оси X отложены ожидаемые значения концентрации синтетического фрагмента ДНК, полученные в ходе разведения исходного раствора синтетического фрагмента ДНК. По оси Y отложены экспериментально полученные значения концентрации синтетического фрагмента ДНК в заданных разведениях, определенные по заявляемому способу. Пунктирной линией проведена кривая линейной апроксимации.
На фиг. 2 представлены результаты цифровой капельной ПЦР с целью количественного анализа уровня синтетического фрагмента ДНК в образце ДНК, выделенной из плазмы пациента, полученной за 2 дня до проведения химиотерапии (пример 1). По оси Х отложены капли эмульсии, сгенерированной в ходе цифровой капельной ПЦР. По оси Y отложена интенсивность флуоресценции по каналу FAM, соответствующему флуоресцентно меченому зонду по заявляемому способу. Точки, находящиеся выше порогового значения 2875 ЕД, соответствуют каплям эмульсии, в которые попали синтетические фрагменты ДНК.
На фиг. 3 представлены результаты цифровой капельной ПЦР с целью количественного анализа уровня синтетического фрагмента ДНК в образце ДНК, выделенной из плазмы пациента, полученной через 2 недели после завершения химиотерапии (пример 1). По оси Х отложены капли эмульсии, сгенерированной в ходе цифровой капельной ПЦР. По оси Y отложена интенсивность флуоресценции по каналу FAM, соответствующему флуоресцентно меченому зонду по заявляемому способу. Точки, находящиеся выше порогового значения 2875 ЕД, соответствуют каплям эмульсии, в которые попали синтетические фрагменты ДНК.
На фиг. 4 представлены результаты цифровой капельной ПЦР с целью количественного анализа уровня синтетического фрагмента ДНК в образце ДНК, выделенной из желчи пациента (пример 2). По оси Х отложены капли эмульсии, сгенерированной в ходе цифровой капельной ПЦР. По оси Y отложена интенсивность флуоресценции по каналу FAM, соответствующему флуоресцентно меченому зонду по заявляемому способу. Точки, находящиеся выше порогового значения 2875 ЕД, соответствуют каплям эмульсии, в которые попали синтетические фрагменты ДНК.
Осуществление изобретения
Для разработки способа нормализации уровня воДНК в биоматериале для жидкостной биопсии при онкологических заболеваниях был создан синтетический фрагмент ДНК длинной 88 пар оснований, представленный в виде двух комплементарных друг другу цепей ДНК:
5’-GTA CGA GGA GAA TTG ACC TCC AAA TCC TGA TCG TGA CTA CAG GTC GTC GTT CGG AGC TGT GGA AGA GTT TTG AAA ATC TTC GAC CAT G-3’ (SEQ ID NO: 1);
5’- CAT GGT CGA AGA TTT TCA AAA CTC TTC CAC AGC TCC GAA CGA CGA CCT GTA GTC ACG ATC AGG ATT TGG AGG TCA ATT CTC CTC GTA C-3’ (SEQ ID NO: 2).
Вышеуказанная последовательность синтетического фрагмента ДНК не встречается ни в геноме человека, ни в геномах прочих организмах, чей генетический материал может тем или иным способом попасть в организм человека (от представителей микрофлоры, от патогеных микроорганизмов и т.п.). Размер данного фрагмента ДНК в 88 пар оснований соответствует таковому у фрагментов воДНК (50-150 пар оснований), поэтому эффективность его экстракции из биоматериала будет отражать и эффективность экстракции воДНК из того же биоматериала. Синтетический фрагмент ДНК может быть получен любым из известных из уровня техники способом, например, прямым синтезом на супер-парамагнитных частицах [Jensen M., Akhras M., Fukushima M., et al. Direct oligonucleotide synthesis onto super-paramagnetic beads // J Biotechnol. 2013 Vol. 167(4). P. 448-53. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2013.08.006].
С целью ренатурации заявляемого синтетического фрагмента ДНК из двух комплементарных цепей необходимо смешать равные объемы растворов одноцепочечных молекул ДНК (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), представленных в равных концентрациях, нагреть смесь до температуры 98°С и выдерживать в течение 5 минут, затем охладить до комнатной температуры, полученный раствор двуцепочечного фрагмента ДНК может быть заморожен при температуре от -20°С до -80°С.
Количественный анализ уровня заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК может быть осуществлен при помощи любого известного из уровня техники метода цифровой ПЦР. Для этого были разработаны последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов, специфичных к заявляемому синтетическому фрагменту ДНК, которые могут быть синтезированы и мечены любым известным из уровня техники способом, например, в ходе прямого синтеза с постсинтетическим конъюгированием флуоресцентной метки [Zearfoss N., Ryder S. End-labeling oligonucleotides with chemical tags after synthesis // Methods Mol Biol. 2012. Vol. 941. P. 181-93.DOI: 10.1007/978-1-62703-113-4_14].
Прямой праймер: 5’-GTA CGA GGA GAA TTG ACC-3’ (SEQ ID NO: 3);
Обратный праймер: 5’-CAT GGT CGA AGA TTT TCA AA-3’ (SEQ ID NO: 4);
Зонд: 5’-6-FAM-TC CGA ACG ACG ACC TGT AG-BHQ-1-3’ (SEQ ID NO: 5).
Рекомендуемая концентрация заявляемых олигонуклеотидных праймеров (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) в конечном растворе для цифровой ПЦР составляет по 0,8 мкмоль/л. Рекомендуемая концентрация заявляемого флуоресцентно меченого зонда (SEQ ID NO: 5) в конечном растворе для цифровой ПЦР составляет 0,25 мкмоль/л.
С целью определения наиболее оптимальных температурных условий количественного анализа заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК была проведена серия экспериментов с использованием цифровой капельной ПЦР (Bio-Rad, США). В соответствии с рекомендациями производителя был выбран температурный протокол амплификации: инкубация при 95°С - не менее 5 мин, 40 циклов денатурации при 94°С - 30 с и отжига / элонгации при Т°С - 60 с, инкубация при 98°С - 10 мин, где Т°С соответствует температурному градиенту от лунки к лунке планшета в диапазоне от 50°С до 64°С в шагом в 2°С. Результаты цифровой капельной ПЦР представлены в табл. 1. В качестве наиболее оптимальной температуры отжига / элонгации при цифровой капельной ПЦР с использованием заявляемых олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов, специфичных к заявляемому синтетическому фрагменту ДНК, была избрана температура 52°С.
| Таблица 1 Результаты цифровой капельной ПЦР с температурным градиентом для подбора оптимальный условий амплификации заявляемого синтетического фрагмента ДНК |
|||
| № | Температура отжига / энлонгации | Амплификация | IFAM-ПОРОГ |
| 1 | 64°С | - | н/д |
| 2 | 62°С | - | н/д |
| 3 | 60°С | - | н/д |
| 4 | 58°С | - | н/д |
| 5 | 56°С | + | 2297 ЕД |
| 6 | 54°С | + | 2213 ЕД |
| 7 | 52°С | + | 2875 ЕД* |
| 8 | 50°С | + | 2236 ЕД |
Примечание. IFAM-ПОРОГ - пороговое значение интенсивности флуоресценции по каналу FAM от флуоресцентно меченого зонда (SEQ ID NO: 5) при количественном анализе заявляемого синтетического фрагмента ДНК, разделяющее положительный и отрицательный кластеры капель эмульсии; н/д - нет данных; * - наибольшее значение IFAM-ПОРОГ.
При заданных условиях цифровой капельной ПЦР была определена линейность количественного анализа заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК. Для этого проводилась серия экспериментов с внесением заявляемого синтетического двуцепочечного фрагмента ДНК в разных концентрациях в реакционную смесь для цифровой капельной ПЦР. Результаты определения линейности количественного анализа представлены на фиг. 1. Коэффициент линейности (R2) составил 0,99.
Для валидации заявляемого способа нормализации уровня воДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии он был применен в 35 образцах плазмы от пациентов с протоковой аденокарциномой поджелудочной железы. воДНК выявлялась в ходе цифровой капельной ПЦР по мутациям в гене KRAS в кодонах 12, 13 и 61. Затем проводилось определение корреляции уровня воДНК, представленного в виде абсолютного значения (копии на мл плазмы), фракции (%) и нормализованного значения по уровню экзогенного синтетического фрагмента ДНК по заявляемому способу, с размером опухоли по данным КТ и уровнем биомаркера СА 19-9, определенного методом иммуноферментного анализа. В табл. 2 представлены результаты корреляционного анализа методом Спирмена.
| Таблица 2 Корреляция результатов жидкостной биопсии плазмы с параметрами опухоли |
||||||
| Абс. уровень воДНК (копии/мл) | Фракция воДНК (%) | Нормализ. уровень воДНК (копии/мл) | ||||
| ρ | P | ρ | P | ρ | P | |
| CA 19-9 (ЕД/мл) | 0,402 | <0,05 | 0,286 | >0,05 | 0,425 | <0,05 |
| Размер опухоли (см3) | 0,399 | <0,05 | 0,198 | >0,05 | 0,484 | <0,05 |
Примечание. Абс. - абсолютный, воДНК - внеклеточная опухолевая ДНК, нормализ. - нормализованный (по заявляемому способу).
Ниже представлено более детальное описание заявляемого способа, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.
1) Для ренатурации заявляемого синтетического фрагмента ДНК из двух комплементарных цепей необходимо смешать равные объемы растворов одноцепочечных молекул ДНК (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), представленных в равных концентрациях, нагреть смесь до температуры 98°С и выдерживать в течение 5 минут, затем охладить до комнатной температуры, полученный раствор двуцепочечного фрагмента ДНК может быть использован сразу или заморожен при температуре от -20°С до -80°С.
2) Предпочтительно вносить ренатурировавший синтетический фрагмент ДНК в жидкий биоматериал для последующего выделения нуклеиновых кислот в отношении 1000 копий на 10 мкл элюирующего буфера.
3) Для предотвращения чрезмерного разбавления биоматериала предпочтительно вносить ренатурировавший синтетический фрагмент ДНК в виде раствора с концентрацией не менее 1000 копий/мкл.
4) Нормализацию воДНК по заявляемому способу допустимо проводить в любой биологической жидкости - субстрате для жидкостной биопсии, а также в различных смывах с поверхности слизистой оболочки органов или игл для биопсии.
5) Нормализацию воДНК по заявляемому способу допустимо проводить при выделении нуклеиновых кислот из биоматериала для жидкостной биопсии с использованием любого известного из уровня техники набора реагентов и расходуемых материалов при соблюдении всех рекомендаций производителя.
6) Определение уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК допустимо проводить с использованием любого известного из уровня техники метода цифровой ПЦР.
7) Предпочтительно в реакционную смесь для цифровой ПЦР вносить заявляемые олигонуклеотидные праймеры (SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4) в конечной концентрации 0,8 мкмоль/л, а заявляемый флуоресцентно меченый зонд (SEQ ID NO: 5) в конечной концентрации 0,25 мкмоль/л.
8) Предпочтительно для цифровой ПЦР использовать двуступенчатый протокол амплификации, рекомендуемый производителем, с этапом отжига / элонгации при температуре 52°С в течение 60 с.
9) Расчет значения коэффициента экстракции (КЭ) ДНК необходимо проводить в соответствии со следующей формулой:
КЭ = (СК2 × VЭ/Б) / (СК1 × VБ/М),
где КЭ - коэффициент экстракции ДНК, СК2 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК в растворе ДНК (копии на 1 микролитре раствора ДНК), VЭ/Б - объем элюирующего буфера, использованного при выделении ДНК (микролитры), СК1 - концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК (копии в 1 миллилитре биоматериала), VБ/М - объем биоматериала, из которого выделялась ДНК (миллилитры);
10) Определение уровня воДНК для последующей нормализации по заявляемому способу допустимо проводить любым известным из уровня техники способом.
11) Нормализацию уровня воДНК необходимо проводить путем деления уровня воДНК на рассчитанный коэффициент экстракции ДНК.
Пример 1
Пациент А., женщина, 68 лет, диагноз: протоковая аденокарцинома поджелудочной железы с метастазами. Были собраны образцы периферической крови в объеме 10 мл за 2 дня до начала химиотерапевтического вмешательства и через 2 недели после его завершения. ДНК выделялось из 2 образцов по 5 мл плазмы, в которую предварительно было добавлено по 5 мкл раствора заявляемого синтетического фрагмента ДНК в концентрации 1000 копий/мкл, объем элюирования ДНК составил по 50 мкл. В полученных растворах был проведен количественный анализ уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК методом цифровой капельной ПЦР в соответствии с заявляемым способом.
Концентрация синтетического фрагмента ДНК в образце, полученном до начала химиотерапии, составила 11,52 копий/мкл (фиг. 2), а в образце, полученном после химиотерапии - 6,65 копий/мкл (фиг. 3). Уровень воДНК в обоих образцах оценивался при помощи цифровой капельной ПЦР по мутации гена KRAS в кодонах 12 и 13. Уровень воДНК на единицу объема плазмы составил 51,36 копий/мл в образце, полученном до начала химиотерапии, и 40,21 копий/мл в образце, полученном после химиотерапии. Данные значения для каждого из образцов были подставлены в формулу расчета коэффициента экстракции ДНК по заявляемому способу. Для образца до начала химиотерапии:
КЭ = (11,52 × 50) / (1000 × 5) = 0,115.
Для образца, полученного после химиотерапии:
КЭ = (6,65 × 50) / (1000 × 5) = 0,067.
Уровни воДНК в образцах до и после химиотерапии, измеренные при помощи цифровой капельной ПЦР, в соответствии с заявляемым способом были разделены на соответствующие значения коэффициентов экстракции ДНК. Нормализованные по заявляемому способу уровни воДНК в образцах до и после химиотерапии оказались равными 446,61 копий/мл и 600,15 копий/мл соответственно. Таким образом, после завершения курса химиотерапии произошло увеличение нормализованного по заявляемому способу уровня воДНК, что свидетельствует об отсутствии ответа на химиотерапию и о возможном прогрессировании заболевания. Рутинно применяемые методики мониторинга ответа на химиотерапию, включающие компьютерную томографию и анализ уровня биомаркера СА 19-9 в сыворотке также не выявили успешный ответ на лечение. В то же время использование ненормализованных абсолютных значений уровня воДНК свидетельствовало бы о снижении уровня воДНК после химиотерапии, что бы не согласовалось с результатами рутинно применяемых методик мониторинга ответа на химиотерапию.
Пример 2
Пациент М., женщина, 72 года, диагноз: механическая желтуха, протоковая аденокарцинома поджелудочной желез. Был собран образец желчи в ходе дренирования по медицинским показаниям в объеме 14 мл. ДНК выделялось образца супернатанта желчи объемом 4 мл, в которую предварительно было добавлено 4 мкл раствора заявляемого синтетического фрагмента ДНК в концентрации 1000 копий/мкл, объем элюирования ДНК составил 50 мкл. В полученных растворах был проведен количественный анализ уровня заявляемого синтетического фрагмента ДНК методом цифровой капельной ПЦР в соответствии с заявляемым способом.
Концентрация синтетического фрагмента ДНК в образце составила 8,30 копий/мкл (фиг. 4). Уровень воДНК оценивался при помощи цифровой капельной ПЦР по мутации гена KRAS в кодонах 12 и 13. Уровень воДНК на единицу объема желчи составил 4641 копий/мл. Данные были подставлены в формулу расчета коэффициента экстракции ДНК по заявляемому способу:
КЭ = (3,02 × 50) / (1000 × 4) = 0,037.
Уровень воДНК, измеренный при помощи цифровой капельной ПЦР, в соответствии с заявляемым способом был разделен на соответствующее значение коэффициента экстракции ДНК. Нормализованный по заявляемому способу уровень воДНК в образце оказался равным 125 432 копий/мл. Настолько большая концентрация воДНК в желчи может свидетельствовать о прорастании злокачественного новообразования в желчный проток, а не сдавлению его извне, что было подтверждено данными инструментальных методов визуализации (показана инвазия опухоли в желчный проток по данным компьютерной томографии). В то же время использование ненормализованных абсолютных значений уровня воДНК могло бы замаскировать столь значительное высвобождение воДНК в желчь.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="2022128771_Анализ
опухолевой ДНК.xml" softwareName="WIPO Sequence"
softwareVersion="2.2.0" productionDate="2023-03-15">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022128771</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-11-07</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>57-2022</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022128771</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-11-07</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования
"Московский государственный университет имени
М.В.Ломоносова" (МГУ)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal state budgetary education institution of
higher education "Lomonosov Moscow State University"
(MSU)</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">БИОЛОГИЧЕСКИЙ АГЕНТ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ
АНАЛИЗА УРОВНЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ОПУХОЛЕВОЙ ДНК И СПОСОБ ЕГО
ПРИМЕНЕНИЯ</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>88</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..88</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtacgaggagaattgacctccaaatcctgatcgtgactacaggtcgtcg
ttcggagctgtggaagagttttgaaaatcttcgaccatg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>88</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..88</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>catggtcgaagattttcaaaactcttccacagctccgaacgacgacctg
tagtcacgatcaggatttggaggtcaattctcctcgtac</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtacgaggagaattgacc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>catggtcgaagattttcaaa</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tccgaacgacgacctgtag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (9)
1. Биологический агент для проведения анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала, представляющий собой синтетический фрагмент ДНК длиной 88 пар оснований, представленный в виде двух комплементарных друг другу цепей ДНК с последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 для использования в качестве экзогенного контроля при определении внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала.
2. Набор для проведения цифровой полимеразной цепной реакции, включающий биологический агент по п. 1 и прямой и обратный олигонуклеотидные праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 соответственно, а также олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд с последовательностью SEQ ID NO: 5.
3. Способ анализа уровня внеклеточной опухолевой ДНК в образцах биоматериала для жидкостной биопсии, характеризующийся тем, что добавляют в образец реагенты из набора по п. 2, выделяют ДНК из биоматериала, проводят количественное определение внеклеточной опухолевой ДНК и количественное определение агента по п. 1, проводят расчет коэффициента экстракции ДНК, используемого для нормализации уровня внеклеточной опухолевой ДНК.
4. Способ по п.3, характеризующийся тем, что перед добавлением в образец биологического материала одноцепочечные последовательности ДНК с последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 смешивают в равных концентрациях для получения биологического агента по п. 1.
5. Способ по п.3, характеризующийся тем, что для количественного анализа биологического агента по п. 1 в образце ДНК, выделенной из биоматериала, выполняют цифровую полимеразную цепную реакцию с применением прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, а также олигонуклеотидного флуоресцентно меченого зонда с последовательностью SEQ ID NO: 5, специфичных к последовательности синтетического фрагмента ДНК.
6. Способ по п.3, характеризующийся тем, что для расчета коэффициента экстракции ДНК используют формулу:
КЭ = (СК2 × VЭ/Б) / (СК1 × VБ/М),
где КЭ – коэффициент экстракции ДНК, СК2 – концентрация биологического агента в растворе ДНК (копии на 1 микролитр раствора ДНК), измеренные способом по п.3, VЭ/Б – объем элюирующего буфера, использованного при выделении ДНК (микролитры), СК1 – концентрация экзогенного контрольного фрагмента ДНК (копии в 1 миллилитре биоматериала), VБ/М – объем биоматериала, из которого выделялась ДНК (миллилитры).
7. Способ по п.3, характеризующийся тем, что нормализованный уровень внеклеточной опухолевой ДНК в образце биоматериала получают путем деления уровня внеклеточной опухолевой ДНК на значение коэффициента экстракции, полученного способом по п.6.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2816878C1 true RU2816878C1 (ru) | 2024-04-08 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014043763A1 (en) * | 2012-09-20 | 2014-03-27 | The Chinese University Of Hong Kong | Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma |
| RU2754038C2 (ru) * | 2017-03-08 | 2021-08-25 | Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж | Способы амплификации днк для сохранения статуса метилирования |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014043763A1 (en) * | 2012-09-20 | 2014-03-27 | The Chinese University Of Hong Kong | Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma |
| RU2754038C2 (ru) * | 2017-03-08 | 2021-08-25 | Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж | Способы амплификации днк для сохранения статуса метилирования |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ilyas et al. | Emerging technologies for the diagnosis of perihilar cholangiocarcinoma | |
| CN109609633A (zh) | 一种与乳腺癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用 | |
| CN106834470A (zh) | miRNA在制备癌症诊断试剂盒中的用途 | |
| RU2816878C1 (ru) | Биологический агент для проведения анализа уровня внеклеточной опухолевой днк и способ его применения | |
| US20210310078A1 (en) | Method for early diagnosis of breast cancer and monitoring after treatment using liquid biopsy multi-cancer gene biomarkers | |
| CN111968702A (zh) | 一种基于循环肿瘤dna的恶性肿瘤早期筛查系统 | |
| CN112391478B (zh) | 外泌体mRNA在乳腺疾病诊断中的应用 | |
| CN106498062A (zh) | 一种诊断前列腺癌的产品及其应用 | |
| US20160024592A1 (en) | Single-cell analysis as a sensitive and specific method for early prostate cancer detection | |
| RU2665965C1 (ru) | Способ скрининга злокачественных новообразований у человека | |
| CN104726589A (zh) | 可用于检测与大肠癌相关的cmtm3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用 | |
| RU2813669C1 (ru) | Способ неинвазивной диагностики рака мочевого пузыря на основе выявления опухолевой днк в биологических жидкостях и набор реагентов для его осуществления | |
| CN109182514A (zh) | 肺癌诊断或转移诊断标志物LncRNA Loc729658和试剂盒及其应用 | |
| US11807908B2 (en) | Genetic markers used for identifying benign and malignant pulmonary micro-nodules and the application thereof | |
| CN109022586A (zh) | 一种与宫颈癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用 | |
| KR102363514B1 (ko) | 약물 반응성 예측용 조성물 및 이의 용도 | |
| CN108118091A (zh) | 可用于检测与直肠癌相关的prmt6基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用 | |
| EP3963331B1 (en) | Method for the detection of cancer | |
| Vinokurtseva et al. | It’s All in the Details: Molecular Markers in Cancer Diagnosis | |
| TW202115400A (zh) | 檢測癌症之方法 | |
| Shah et al. | EPV151/# 376 Genetic testing referrals for endometrial cancer patients: can we do better? | |
| Zhu et al. | Analysis of HER2 Gene Amplification and Certain Prognostic Factors in Breast Cancer | |
| Tadros et al. | SAFETY PROFILE ASSESSMENT OF MANDATORY RESEARCH BIOPSIES OF THE PROSTATE: A TEN YEAR MULTI-CENTER EXPERIENCE: S&T-11 | |
| Padovan et al. | BIOM-19. NEXT-GENERATION SEQUENCING (NGS) FOR IDENTIFYING ACTIONABLE MOLECULAR ALTERATIONS IN NEWLY DIAGNOSED AND RECURRENT IDHWT-GLIOBLASTOMA (GBM) PATIENTS: A LARGE MONO INSTITUTIONAL EXPERIENCE | |
| CN205528788U (zh) | 一种肺癌早期诊断fish试剂盒 |