WO2016043170A1 - ｍｉＲＮＡ発現量の比較解析方法及び装置 - Google Patents

ｍｉＲＮＡ発現量の比較解析方法及び装置 Download PDF

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聡子 小園
近藤　哲司
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東レ株式会社
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method and apparatus for comparative analysis of miRNA expression levels contained in a plurality of body fluid samples.
  • MiRNA is transcribed from genomic DNA as hairpin-like RNA (precursor). This precursor is cleaved by a dsRNA cleaving enzyme (Drosha, Dicer) having a specific enzyme RNase III cleavage activity, then changed into a double-stranded form, and then becomes a single strand.
  • a dsRNA cleaving enzyme Rosha, Dicer
  • RNase III RNase III cleavage activity
  • One of the antisense strands is incorporated into a protein complex called RISC and is considered to be involved in mRNA translational suppression.
  • miRNA has different aspects at each stage after transcription, so usually when miRNA is targeted (detection target), such as a hairpin structure, a double-stranded structure, a single-stranded structure, etc.
  • RISC protein complex
  • miRNA has different aspects at each stage after transcription, so usually when miRNA is targeted (detection target), such as a hairpin structure, a double-strand
  • miRNAs are present not only in cells but also in bodily fluids such as serum, plasma, urine, spinal fluid, which are specimens that do not contain cells, and their expression levels are the biologics of various diseases including cancer.
  • bodily fluids such as serum, plasma, urine, spinal fluid, which are specimens that do not contain cells
  • their expression levels are the biologics of various diseases including cancer.
  • the possibility of becoming a marker is suggested.
  • more than 2500 miRNAs exist in humans miRBase release 20
  • a highly sensitive measurement system such as a DNA microarray
  • more than 1000 miRNAs are expressed in serum and plasma. Can be detected simultaneously. Therefore, biomarker search research for body fluids such as serum / plasma, urine, spinal fluid and the like has been carried out using the DNA microarray method.
  • This method includes the global normalization method, the quantile method, the lowess method, and the 75% percentile method.
  • DNA microarrays measure a large number of miRNAs at the same time, so correction using only a limited number of types of housekeeping RNAs is considered to be inaccurate, and the expression level of multiple mRNAs is measured simultaneously with miRNAs. And the method of correcting miRNA using the expression level of these some mRNA is proposed (patent document 3).
  • the miRNA detection result is corrected by performing an operation such that the detection values of a plurality of mRNAs detected simultaneously when miRNA is detected are constant in all samples.
  • Non-Patent Document 1 in measuring the miRNA expression level in mouse serum, endogenous miRNA is used to correct the expression level, and its effectiveness is evaluated.
  • Endogenous miRNA refers to miRNA that is naturally present in the target specimen (in the case of non-patent document 1, mouse serum) and is derived from the organism that provided the specimen. That is, in Non-Patent Document 1, miR-16, miR-31, and miR-223 are used as examples of endogenous miRNAs for correction to try to correct miRNA expression levels in mouse serum. Since the expression level was not constant among individuals, the method of correcting the entire data based on the expression level of endogenous miRNA was not adopted, and the externally added RNA was used as a reference substance for data correction. is suggesting. In short, we conclude that it is not appropriate to correct the miRNA expression level using these endogenous miRNAs.
  • Non-Patent Document 2 proposes that let-7d, let-7g, and let-7i be used in combination as endogenous miRNA for correction when detecting miRNA in human serum by quantitative RT-PCR or sequencing. Yes. That is, the expression level of miRNA to be measured is corrected by performing an operation of making the expression level of let-7d, let-7g, and let-7i constant between samples.
  • a method of correcting the expression level of a gene to be detected by using the expression level of a “housekeeping gene” in which the level of expression varies little between samples is generally used.
  • housekeeping genes include ACTB and GAPDH.
  • these genes are greatly different from miRNA in the length of nucleic acid and the absolute value of the expression level, and it is not preferable to use them for the purpose of correcting the expression level of miRNA.
  • housekeeping RNAs such as U1 snoRNA, U2 snoRNA, U3 snoRNA, U4 snoRNA, U5 snoRNA, U6 snoRNA, 5S rRNA and 5.8S rRNA are mainly used for correction. Has been.
  • body fluid such as serum, plasma, urine, spinal fluid, which is a sample that does not contain cells
  • the expression level can hardly be detected, and miRNA expression in the body fluid It cannot be used as an index for detecting and correcting the quantity.
  • Non-Patent Document 2 proposes that let-7d, let-7g, and let-7i be used in combination when detecting miRNA in human serum by quantitative RT-PCR or sequencing.
  • let-7d, let-7g, and let-7i be used in combination when detecting miRNA in human serum by quantitative RT-PCR or sequencing.
  • correction is generally performed using the total expression level (signal value) of a large number (hundreds to tens of thousands) of genes that can be measured with the DNA microarray. It has been broken. For example, a global normalization method, a quantile normalization method, and the like can be mentioned.
  • the present invention is intended to solve the above-described problems, and in particular, to solve a problem that is extremely important for the practical use of a relatively small number of miRNA measurement DNA microarrays for testing and diagnosis. .
  • a method for comparatively analyzing the expression level of a target miRNA among a plurality of body fluid samples A measurement step of simultaneously measuring the expression level of a target miRNA and the expression level of one or more correction endogenous miRNAs selected from the correction endogenous miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 for a plurality of body fluid samples ;
  • the difference or ratio between the reference value arbitrarily set for the expression level of the endogenous miRNA for correction and the representative value of each bodily fluid sample acquired in the representative value acquisition step is calculated as the target miRNA expression level for each bodily fluid sample.
  • a correction coefficient acquisition step each of which is acquired as a correction coefficient; and a correction step of correcting the expression level of the target miRNA measured in each body fluid sample using the correction coefficient acquired for each body fluid sample, Said method.
  • (2) In the correction step (a) In the correction coefficient acquisition step, when acquiring a value obtained by subtracting the reference value from the representative value as a correction coefficient, subtracting the correction coefficient from the measured value of the expression level of the target miRNA, (b) In the correction coefficient acquisition step, when acquiring a value obtained by subtracting the representative value from the reference value as a correction coefficient, adding a correction coefficient to the measured value of the expression level of the target miRNA, (c) in the correction coefficient acquisition step, when acquiring a value obtained by dividing the representative value by the reference value as a correction coefficient, dividing the measured value of the expression level of the target miRNA by the correction coefficient, or (d) in the correction coefficient acquisition step, when acquiring a value obtained by dividing the reference value by the representative value as a correction coefficient, multiplying the measured
  • the measurement step includes one or a plurality of corrections selected from a nucleic acid probe for capturing a plurality of target miRNAs immobilized on a support and a correction endogenous miRNA shown in SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • a probe for capturing endogenous miRNA and a nucleic acid sample derived from a body fluid sample labeled with a labeling substance are brought into contact with each other for hybridization, and the expression levels of the target miRNA and the one or more correction endogenous miRNAs are determined.
  • the method according to any one of (1) to (3), comprising obtaining each as a signal intensity measurement value.
  • the method according to any one of (1) to (4), wherein the body fluid specimen is blood, serum, or plasma.
  • a miRNA expression analyzer for comparing and analyzing the expression level of a target miRNA in a plurality of body fluid samples, A measured value of the expression level of the target miRNA and a measured value of the expression level of one or more correction endogenous miRNAs selected from the correction endogenous miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 measured for a plurality of body fluid samples
  • Storage means for storing;
  • Representative value acquisition means for acquiring a representative value from the measured value of the expression level of one or more correction endogenous miRNAs selected from the correction endogenous miRNAs shown in SEQ ID NOS: 1 to 10 for each body fluid sample;
  • the target miRNA expression level for each bodily fluid sample is determined by comparing the difference or ratio between the reference value arbitrarily set for the expression level of the endogenous miRNA for correction and the representative value of each bodily fluid sample acquired by the representative value acquisition means.
  • Correction coefficient acquisition means for acquiring the correction coefficient respectively
  • Correction means for correcting the expression level of the target miRNA measured in each body fluid sample using the correction coefficient acquired for each body fluid sample; and at least two body fluid samples according to the corrected target miRNA expression level
  • Output means for outputting a result of comparing the target miRNA expression level between the two.
  • the correction means includes (a) In the correction coefficient acquisition means, when acquiring a value obtained by subtracting the reference value from the representative value as a correction coefficient, subtracting the correction coefficient from the measured value of the expression level of the target miRNA, (b) In the correction coefficient acquisition means, when acquiring a value obtained by subtracting the representative value from the reference value as a correction coefficient, adding a correction coefficient to the measurement value of the expression level of the target miRNA, (c) In the correction coefficient acquisition means, when the value obtained by dividing the representative value by the reference value is acquired as a correction coefficient, the measured value of the expression level of the target miRNA is divided by the correction coefficient, or (d) In the correction coefficient acquisition means, when acquiring a value obtained by dividing the reference value by the representative value as a correction coefficient, multiplying the measured value of the expression level of the target miRNA by the correction coefficient,
  • the apparatus wherein the correction is performed by: (9) One or a plurality of correction values selected from the measured value of the expression level of the target miRNA contained
  • Hybridization is performed by contacting a nucleic acid sample derived from a body fluid specimen labeled with a target miRNA and the expression levels of the one or more correction endogenous miRNAs as signal intensity measurements, respectively.
  • a correction coefficient acquisition step that is acquired as a correction coefficient; and a correction step that corrects the expression level of the target miRNA measured in each body fluid sample using the correction coefficient acquired for each body fluid sample.
  • Program for. (11) In order to compare and analyze the expression level of the target miRNA among a plurality of body fluid samples, Stores the measured value of the expression level of the target miRNA contained in each of the plurality of body fluid samples and the measured value of the expression level of one or more correction endogenous miRNAs selected from the correction endogenous miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 Memory means to do; Representative value acquisition means for acquiring a representative value from the measured value of the expression level of one or more correction endogenous miRNAs selected from the correction endogenous miRNAs shown in SEQ ID NOS: 1 to 10 for each body fluid sample;
  • the target miRNA expression level for each bodily fluid sample is determined by comparing the difference or ratio between the reference value arbitrarily set for the expression level of the endogenous miRNA for correction and the representative value of
  • Correction coefficient acquisition means for acquiring the correction coefficient respectively
  • Correction means for correcting the expression level of the target miRNA measured in each body fluid sample using the correction coefficient acquired for each body fluid sample; and at least two body fluid samples according to the corrected target miRNA expression level
  • a program for functioning as an output means for outputting the result of comparing the expression level of the target miRNA between the two.
  • (12) A computer-readable recording medium on which the program according to (10) or (11) is recorded.
  • a probe for capturing a plurality of target miRNAs and a probe for capturing one or more correction endogenous miRNAs selected from the correction endogenous miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 are immobilized A chip for miRNA expression analysis including a support.
  • the miRNA expression level when comparing and analyzing the expression level of a target miRNA contained in a plurality of body fluid samples, particularly when measuring the expression level of a large number of miRNAs using a microarray or the like, and comparing the miRNA expression levels between samples
  • the miRNA expression level can be corrected more accurately than before.
  • comparative analysis of target miRNA between samples can be performed more accurately.
  • B Correction by hsa-miR-6085
  • C Correction by hsa-miR-1227-5p
  • D Correction by hsa-miR-2861
  • E Correction by hsa-miR-149-3p
  • F Correction by hsa-miR-4463
  • G Correction by hsa-miR-4508
  • the histogram of the miRNA signal value by the DNA microarray detection measured and corrected by the method shown in Example 2 is shown.
  • H Correction by hsa-miR-6090
  • I Correction by hsa-miR-6775-5p
  • J Correction by hsa-miR-6803-5p
  • K Correction by hsa-miR-5787
  • the histogram of the miRNA signal value by the DNA microarray detection measured and corrected by the method shown in Example 2 is shown.
  • the histogram of the miRNA signal value by the DNA microarray detection measured and corrected by the method shown in Comparative Example 1 is shown.
  • the histogram of the miRNA signal value by the DNA microarray detection measured and corrected by the method shown in Comparative Example 2 is shown.
  • the histogram of the miRNA signal value by the DNA microarray detection measured and corrected by the method shown in Example 4 is shown.
  • D correction by combination of hsa-miR-149-3p, hsa-miR-1227-5p, hsa-miR-4463,
  • the histogram of the miRNA signal value by the DNA microarray detection measured and corrected by the method shown in Example 4 is shown.
  • F Correction by combination of hsa-miR-149-3p, hsa-miR-2861, hsa-miR-4463, G: hsa-miR-1227-5p, hsa-miR-2861, hsa-miR -4508 combination correction, H: hsa-miR-1227-5p, hsa-miR-2861, hsa-miR-4463 correction, I: hsa-miR-1227-5p, hsa-miR-4508, hsa Correction by combination of -miR-4463
  • RNA in a body fluid sample is labeled and selected from probes for capturing a plurality of types of target miRNAs (hereinafter also referred to as “target miRNA capture probes”) and miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • targets miRNA capture probes probes for capturing a plurality of types of target miRNAs
  • miRNA capture probes miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10.
  • results of detection with a microarray on which probes for capturing one or more miRNAs hereinafter also referred to as “correction endogenous miRNA”) (hereinafter also referred to as “correction endogenous miRNA capture probe”) are immobilized Is schematically shown by a histogram of signal values that are measured values of the expression level of each miRNA.
  • a probe for capturing a target miRNA or a probe for capturing a correction endogenous miRNA is also collectively referred to as “miRNA capture probe” or simply “probe”.
  • FIG. 1A the results of analyzing the target miRNAs of the specimens extracted from the body fluid specimen A and the body fluid specimen B using a DNA microarray are shown as histograms.
  • amendment of this invention is each shown.
  • the miRNA histograms are greatly shifted. From this, it can be interpreted that there is a large difference in the expression level of miRNA between samples. On the other hand, it can be interpreted that a difference is caused by an experimental error. Which is correct cannot be judged from the miRNA histogram alone.
  • the signal value of the endogenous miRNA for correction should match between samples.
  • the histogram of signal values obtained from the correcting endogenous miRNA capture probe shown in FIG. 1A shows almost the same distribution in the body fluid sample A and the body fluid sample B. That is, it can be determined that the body fluid sample A and the body fluid sample B are correctly subjected to the experiment and there is no experimental error. In this case, there is a large difference in the expression level of miRNA between the body fluid samples AB, and it is not necessary to correct the miRNA signal value when comparing between the body fluid samples.
  • FIG. 1B schematically shows the results of analyzing body fluid specimen C and body fluid specimen D using a DNA microarray. The signal value obtained from the target miRNA capture probe and the signal value obtained from the correcting endogenous miRNA capture probe are shown.
  • miRNA histograms show similar distributions.
  • the histogram of the signal value obtained from the correction endogenous miRNA capture probe is largely shifted between the body fluid sample C and the body fluid sample D. From this, it can be understood that an experimental error has occurred in the detection results of the body fluid sample C and the body fluid sample D for some reason. In such a case, it is necessary to appropriately correct the miRNA signal value when comparing between body fluid samples CD.
  • the histogram after correcting the signal value of the target miRNA according to the present invention is shown in FIG. 1C.
  • a specific method of correction is as described later.
  • the data of the body fluid sample C was corrected so that the histograms of the signal values obtained from the endogenous miRNA capturing probes for correction of the body fluid sample C and the body fluid sample D were matched.
  • the histogram of the signal value obtained from the correction endogenous miRNA capture probe is matched between the body fluid sample C and the body fluid sample D, and the signal value of the target miRNA capture probe corrected using the same correction coefficient.
  • the histogram of is greatly shifted. That is, there is a great difference in the expression level of the target miRNA between the specimen CDs.
  • the method of correcting the miRNA signal value between two body fluid samples is shown, but the number of body fluid samples to be compared is not limited to two, and infinite comparison can be made.
  • the signal value obtained from the correction endogenous miRNA capture probe is assumed to be a constant value (constant) in advance, and each body fluid specimen with respect to this constant is assumed.
  • Calculate the difference or ratio of signal values obtained from the corrective endogenous miRNA capture probe and add or subtract the difference to the signal value of the target miRNA in the body fluid sample, or the inverse of the ratio in the body fluid sample By multiplying or dividing the signal value of the target miRNA, correction between a large number of samples can be easily performed.
  • the expression level of miRNA is comparatively analyzed among a plurality of specimens.
  • the number of specimens may be two, or three or more.
  • RNA is a kind of non-coding RNA (ncRNA) that means a short RNA of about 15 to 25 bases produced in vivo, and is considered to have a function of regulating the expression of mRNA.
  • miRNA is transcribed from genomic DNA as RNA (precursor) with a hairpin-like structure. This precursor is cleaved by a dsRNA cleaving enzyme (Drosha, Dicer) having a specific enzyme RNase III cleavage activity, then changed to a double-stranded form, and then becomes a single strand.
  • RISC protein complex
  • miRNA has different aspects at each stage after transcription, so usually when miRNA is targeted (detection target), such as a hairpin structure, a double-stranded structure, a single-stranded structure, etc. Various forms need to be considered. The presence of miRNA has been confirmed in various organisms.
  • Samples to which the present invention can be applied are body fluid samples separated from a living body, and examples thereof include body fluids such as blood, serum, plasma, urine, spinal fluid, saliva, wipes, and various tissue fluids. It is not limited.
  • the plurality of specimens to be compared and analyzed may be a plurality of specimens derived from different body fluids, or a plurality of body fluid specimens derived from the same type of body fluid separated from different living bodies.
  • RNA is extracted from these specimens, and the expression level of miRNA is measured using this RNA.
  • RNA extraction methods are known (for example, the method of Favaloro et al. (Favaloro et.al., Methods Enzymol.65: 718-749 (1980)), etc.) and various kits therefor are commercially available ( (For example, miRNeasy from Qiagen, "3D-Gene” RNA extraction, reagent, from liquid sample from Toray).
  • endogenous means not naturally added to the specimen but naturally present in the specimen.
  • endogenous miRNA refers to miRNA that is naturally present in the specimen and is derived from the organism that provided the specimen.
  • the expression level of one or more correction endogenous miRNAs is measured simultaneously with the measurement of the expression levels of a plurality of types of target miRNAs in a specimen.
  • the expression level of the endogenous miRNA for correction is used to calculate a correction coefficient for correcting the expression level of the target miRNA, as will be described later.
  • Simultaneous measurement of the expression levels of a plurality of miRNAs can be performed, for example, by a hybridization assay using an array chip such as a microarray in which a probe that specifically binds to a target miRNA is immobilized on a support.
  • an array chip including a support on which a plurality of target miRNA capture probes and one or a plurality of correction endogenous miRNA capture probes are immobilized may be used.
  • Capture probe or “probe for capturing” means a substance capable of binding directly or indirectly, preferably directly and selectively to the miRNA to be captured. , Nucleic acids, proteins, saccharides and other antigenic compounds. In the present invention, a nucleic acid probe can be preferably used. In addition to DNA and RNA, nucleic acid derivatives such as PNA (peptide nucleic acid) and LNA (Locked Nucleic Acid) can be used as the nucleic acid.
  • PNA peptide nucleic acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • a derivative means a labeled derivative with a fluorophore, a modified nucleotide (for example, a nucleotide containing a group such as halogen, alkyl such as methyl, alkoxy such as methoxy, thio, carboxymethyl, etc.)
  • a chemically modified derivative such as a derivative comprising a nucleotide having undergone a constitution, saturation of a double bond, deamination, substitution of an oxygen molecule with a sulfur molecule, and the like.
  • the chain length of the nucleic acid probe is preferably not less than the length of the miRNA to be detected from the viewpoint of ensuring the stability and specificity of hybridization. Usually, when the chain length is about 17 to 25 bases, the probe can sufficiently exhibit selective binding to the target miRNA. Such an oligonucleic acid probe having a short chain length can be easily prepared by a known chemical synthesis method or the like.
  • the nucleic acid probe has a base sequence that is completely complementary to the target miRNA. However, even if there are some differences, the base is highly homologous enough to hybridize with the target miRNA under stringent conditions. Any array can be used as a capture probe.
  • the stringency during hybridization is a function of temperature, salt concentration, probe chain length, GC content of the nucleotide sequence of the probe, and the concentration of the chaotropic agent in the hybridization buffer.
  • the conditions described in Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York can be used. .
  • Stringent temperature conditions are about 30 ° C. or higher.
  • Other conditions include the hybridization time, the concentration of the detergent (eg, SDS), the presence or absence of carrier DNA, and various stringencies can be set by combining these conditions.
  • Those skilled in the art can appropriately determine conditions for obtaining a function as a capture probe prepared for detection of a desired sample RNA.
  • MiRNA sequence information can be obtained from databases such as GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
  • the miRNA sequence information can be obtained from, for example, the miRBase website (http://www.mirbase.org/).
  • the correcting endogenous miRNA capture probe and the target miRNA capture probe can be designed based on the sequence information available from these sites.
  • the number of miRNA capture probes immobilized on the support is not particularly limited.
  • the miRNA expression level may be measured using a number of miRNA capture probes covering all known miRNAs whose sequences have been identified, immobilized on a support, or a desired number of miRNAs may be measured.
  • a miRNA capture probe immobilized on a support may be used.
  • the same support as that used in known microarrays and macroarrays can be used, and for example, a slide glass, a membrane, beads, etc. can be used. .
  • a support having a shape having a plurality of convex portions on the surface described in Japanese Patent No. 4244788 can also be used.
  • the material of the support is not particularly limited, and examples thereof include inorganic materials such as glass, ceramic, and silicon; polymers such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, and silicone rubber.
  • a method for immobilizing a capture probe on a support there are known a method of synthesizing oligo DNA on the surface of the support and a method of dropping oligo DNA synthesized in advance on the surface of the support and immobilizing it.
  • the former method examples include the method of Ronald et al. (US Pat. No. 5,705,610), the method of Michel et al. (US Pat. No. 6,142,266), and the method of Francesco et al. (US Pat. No. 7,037,659).
  • the support since an organic solvent is used during the DNA synthesis reaction, the support is preferably made of a material resistant to the organic solvent.
  • DNA synthesis is controlled by irradiating light from the back surface of the support, and therefore the support is preferably made of a light-transmitting material.
  • Examples of the latter method include the method of Hirota et al. (Japanese Patent No. 3922454) and the method using a spotter.
  • Examples of the spot method include a pin method based on mechanical contact of a pin tip with a solid phase, an ink jet method utilizing the principle of an ink jet printer, and a capillary method using a capillary tube.
  • post-treatment such as cross linking by UV irradiation and surface blocking is performed as necessary.
  • a functional group such as an amino group or SH group is introduced at the end of the oligo DNA.
  • the surface modification of the support is usually performed by treatment with a silane coupling agent having an amino group or the like.
  • a nucleic acid sample labeled with a labeling substance is prepared from RNA extracted from the body fluid sample, and this labeled nucleic acid sample Is carried out by contacting the probe with the probe.
  • the “nucleic acid sample derived from a body fluid specimen” includes not only RNA extracted from the body fluid specimen but also cDNA and cRNA prepared from the RNA by a reverse transcription reaction.
  • the labeled nucleic acid sample derived from a body fluid sample may be one obtained by directly or indirectly labeling a sample RNA with a labeling substance, or directly or indirectly labeling a cDNA or cRNA prepared from the sample RNA. It may be labeled with.
  • a method of binding a labeling substance to a nucleic acid sample derived from a body fluid specimen a method of binding a labeling substance to the 3 ′ end of the nucleic acid sample, a method of binding a labeling substance to the 3 ′ end, a nucleotide bound to the labeling substance to the nucleic acid
  • An enzyme reaction can be used in a method of binding a labeling substance to the 3 'end and a method of binding a labeling substance to the 5' end.
  • T4-RNA Ligase, Terminal Deoxitidil Transferase, Poly A-polymerase, etc. can be used.
  • any labeling method can be referred to the method described in “Shao-YaoYYing, edited by miRNA experiment protocol, Yodosha, 2008”.
  • kits for binding a labeling substance directly or indirectly to the end of RNA are commercially available.
  • “3D-Gene” miRNA labeling kit Toray Industries, Inc.
  • miRCURY miRNA HyPower labeling kit Exicon
  • NCode miRNA Labeling system Life Technologies
  • Co. Ltd.
  • FlashTag Biotin RNA Labeling Kit Genesphere
  • cDNA or cRNA incorporating a labeled substance is prepared by synthesizing cDNA or cRNA from sample RNA in the presence of labeled deoxyribonucleotides or labeled ribonucleotides, and this is arrayed.
  • a method of hybridizing with the above probe is also possible.
  • examples of labeling substances that can be used include various labeling substances that are also used in known microarray analysis. Specific examples include fluorescent dyes, phosphorescent dyes, enzymes, and radioisotopes, but are not limited thereto. Preferred are fluorescent dyes that can be easily measured and signals can be easily detected. Specifically, cyanine (cyanine 2), aminomethylcoumarin, fluorescein, indocarbocyanine (cyanine 3), cyanine 3.5, tetramethylrhodamine, rhodamine red, Texas red, indocarbocyanine (cyanine 5), cyanine Examples include, but are not limited to, 5.5, cyanine 7, and known fluorescent dyes such as oyster.
  • semiconductor fine particles having a light emitting property may be used as the labeling substance.
  • semiconductor fine particles include cadmium selenium (CdSe), cadmium tellurium (CdTe), indium gallium phosphide (InGaP), silver indium zinc sulfide (AgInZnS), and the like.
  • the nucleic acid sample derived from the fluid sample labeled as described above is brought into contact with the miRNA capture probe on the support, and the nucleic acid sample and the probe are hybridized.
  • This hybridization step can be performed in the same manner as in the past.
  • the reaction temperature and time are appropriately selected according to the chain length of the nucleic acid to be hybridized, but in the case of nucleic acid hybridization, it is usually about 30 ° C. to 70 ° C. for 1 minute to several tens of hours.
  • Hybridization is performed, and after washing, the signal intensity from the labeling substance in each probe-immobilized region on the support is detected.
  • the signal intensity is detected using an appropriate signal reader according to the type of labeling substance.
  • a fluorescent dye is used as a labeling substance
  • a fluorescence microscope or a fluorescence scanner may be used.
  • Detected signal value is compared with ambient noise. Specifically, the signal value obtained from the probe-immobilized region is compared with the signal value obtained from other positions, and the case where the former numerical value exceeds is detected (effective determination positive) .
  • the background noise may be subtracted.
  • the ambient noise can be subtracted from the detected signal value as background noise.
  • the measured value of the expression level of the endogenous miRNA for correction and the target miRNA is obtained as the measured value of the signal intensity.
  • a representative value preferably a representative value represented by a logarithmic value
  • the “logarithmic value” in the present invention means a value converted to a logarithm with a base of 2.
  • the representative value is the average or median calculated from the measured values of the expression levels of the multiple corrective endogenous miRNAs, preferably the average expressed as a logarithmic value.
  • the value or median is adopted.
  • a measured value of the expression level of the endogenous miRNA for correction preferably a logarithmic value of the measured value
  • signal measurement values from the plurality of spots are used.
  • the average value or median value preferably the average value or median value expressed in logarithmic values, can be obtained and used as the representative value.
  • Average value expressed as a logarithmic value refers to the measurement of the expression level of multiple endogenous miRNAs for correction (for example, the measurement value of signal intensity obtained using a microarray) converted to a logarithm with a base of 2. Mean value obtained by logarithmic value.
  • the median value expressed in logarithmic values means a measured value of the expression level of a plurality of endogenous miRNAs for correction (for example, a measured value of signal intensity obtained using a microarray) Means the logarithmic value obtained by converting the median of the logarithm values converted into the logarithm of base 2 or the median value of the measured endogenous miRNA expression level for correction to the logarithm of base 2. In the case of the median value, the same value can be obtained whether the logarithmic conversion of the measured value is performed first or later.
  • the average value and the median value may be obtained by using all measured values of a plurality of correction endogenous miRNAs actually measured, or extracted from the plurality of correction endogenous miRNAs. It may be obtained using a part of the measured values. For example, it may be obtained using the measurement values of all the endogenous miRNAs for correction obtained by the endogenous miRNA capture probes for correction mounted on the microarray, or one of all the endogenous miRNA capture probes for correction. (For example, assuming that there are 10 types of endogenous miRNA capture probes for correction mounted on the microarray, 3 types thereof) may be extracted and obtained.
  • it may be a measurement value obtained from a correction endogenous miRNA capture probe that is spotted multiple times for one type of correction endogenous miRNA. For example, it is possible to extract only a correction endogenous miRNA capture probe immobilization region that is positive for an effective determination in common for all the samples to be compared and obtain a representative value of the correction endogenous miRNA.
  • correction coefficient acquisition step using the representative value of the endogenous miRNA for correction of each specimen obtained in the representative value acquisition step and the reference value arbitrarily set for the expression level of the endogenous miRNA for correction, the expression level of the target miRNA A correction coefficient used for correction is acquired (correction coefficient acquisition step).
  • correction coefficient acquisition process-1 or correction coefficient acquisition process-2 can be applied to this correction coefficient acquisition process.
  • the correction coefficient acquisition step-1 is a method that utilizes the difference between the representative value of the endogenous miRNA for correction and the reference value. In this step, the following 1-1. Reference specimen acquisition method, or 1-2. A fixed numerical correction method may be applied.
  • Reference Specimen Acquisition Method One specimen is arbitrarily selected from a plurality of body fluid specimens to be detected by miRNA, and this is used as a “reference specimen”. The remaining one or more samples (second and subsequent samples) are “corrected samples”.
  • the term “second and subsequent samples” includes the second sample. For example, if there are two samples to be compared, only the second sample is corrected, and if there are three samples to be compared, the sample to be corrected is the second sample. And a third specimen.
  • the representative value of the endogenous miRNA for correction of the reference specimen is set as the “reference value”.
  • the difference between the reference value and the representative value of the endogenous miRNA for correction of each of the second and subsequent samples (sample to be corrected) is used as a correction coefficient for each of the second and subsequent samples. As many correction coefficients as the number of specimens to be corrected are acquired.
  • the correction coefficient is obtained by Expression 1 or Expression 1 '.
  • c 1-1 (Representative value of reference miRNA for reference sample correction (reference value)) -(Representative value of the endogenous miRNA for correction of the sample to be corrected)
  • Formula 1 c 1-1 ' (representative value of endogenous miRNA for correction of the sample to be corrected) -(Representative value of reference miRNA for correction of reference sample (reference value)) ... Equation 1 '
  • the correction coefficient for the corrected sample can be obtained by Formula 2 or Formula 2 ′. it can.
  • n is the total number of probe immobilization regions for capturing the corrective endogenous miRNA on the support
  • Aj is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the jth (1 ⁇ j ⁇ n) correction endogenous miRNA in the reference sample
  • Xj is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the j-th (1 ⁇ j ⁇ n) correction endogenous miRNA in the second specimen
  • n is equal to the number of correction endogenous miRNAs targeted by the probe for capturing the correction endogenous miRNA on the support.
  • the correction coefficient is obtained by Expression 3 or 3 '.
  • r 1-2 (Fixed value (reference value)) -(Representative value of endogenous miRNA for correction of the sample to be corrected)
  • Formula 3 r 1-2 ' (representative value of endogenous miRNA for correction of the sample to be corrected) -(Fixed value (reference value)) ... Equation 3 '
  • the correction coefficient for the sample to be corrected can be obtained by Equation 4 or Equation 4 ′.
  • ⁇ is the reference value
  • n is the total number of probe immobilization regions for capturing the corrective endogenous miRNA on the support
  • Yj is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the j-th (1 ⁇ j ⁇ n) correction endogenous miRNA in the specimen, It is.
  • n is equal to the number of correction endogenous miRNAs targeted by the probe for capturing the correction endogenous miRNA on the support.
  • the fixed numerical value used as the reference value in the fixed numerical value correction method may be any numerical value (except 0) as long as the same numerical value is used consistently for all samples in at least one comparative analysis. . If the same expression measurement system is used and the same numerical value is always used as a fixed numerical value, comparative analysis is possible even between body fluid samples whose expression levels were measured on different days.
  • the fixed numerical value may be a numerical value of an expression level that can be generally taken by one or a plurality of correction endogenous miRNAs used for obtaining a correction coefficient. Since such generally possible numerical values may vary depending on the system used to measure the expression level, a fixed numerical value can be freely selected depending on the system used.
  • an average value of the expression levels of the correction endogenous miRNAs in a plurality of body fluid samples to be compared may be obtained and used as a fixed value.
  • an average value of the expression levels of all three types of miRNAs in a plurality of body fluid samples may be obtained and used as a fixed value.
  • a fixed numerical value may be determined in advance using a large number of body fluid samples, and the fixed numerical value may be repeatedly used for subsequent analysis.
  • the correction coefficient acquisition step-2 is a method that uses a ratio between the representative value of the correction endogenous miRNA and the reference value. In this step, the following 2-1. Reference specimen acquisition method, or 2-2. A fixed numerical correction method may be applied.
  • Reference sample acquisition method One sample (first sample) is arbitrarily selected from a plurality of samples to be detected by miRNA, and this is set as a “reference sample”. The remaining second and subsequent samples are “corrected samples”.
  • the representative value of the endogenous miRNA for correction of the reference sample is set as a “reference value”, and the reference value and each representative value of the endogenous miRNA for correction of each of the second and subsequent samples (samples to be corrected) Is used as a correction coefficient for each of the second and subsequent samples. As many correction coefficients as the number of specimens to be corrected are acquired.
  • the correction coefficient is obtained by Expression 5 or Expression 5 '.
  • the correction coefficient for the second specimen can be obtained by Equation 6 or Equation 6 ′. it can.
  • n is the total number of probe immobilization regions for capturing the corrective endogenous miRNA on the support
  • Aj is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the jth (1 ⁇ j ⁇ n) correction endogenous miRNA in the reference sample
  • Xj is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the j-th (1 ⁇ j ⁇ n) correction endogenous miRNA in the second specimen
  • n is equal to the number of correction endogenous miRNAs targeted by the probe for capturing the correction endogenous miRNA on the support.
  • the correction coefficient is obtained by Expression 7 or 7 '.
  • the correction coefficient for the sample to be corrected can be obtained by Expression 8 or 8 '.
  • ⁇ is a fixed value
  • n is the total number of probe immobilization regions for capturing the corrective endogenous miRNA on the support
  • Yj is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the j-th (1 ⁇ j ⁇ n) correction endogenous miRNA in the specimen, It is.
  • n is equal to the number of correction endogenous miRNAs targeted by the probe for capturing the correction endogenous miRNA on the support.
  • the correction step-1 is a method of correcting the expression level of the target miRNA using the correction coefficient obtained in the correction factor acquisition step-1, and the correction factor is added to the expression level of the target miRNA or corrected from the expression level. Correction is performed by subtracting the coefficient.
  • this step there are two correction methods respectively corresponding to the reference specimen acquisition method and the fixed numerical value correction method in the correction coefficient acquisition step-1.
  • Reference Specimen Acquisition Method The correction of the expression level of the target miRNA in the second and subsequent samples is performed using correction coefficients for the second and subsequent samples, respectively. That is, when correcting the expression level of the target miRNA for the second sample, the correction coefficient (c2 1-1 or c2 1-1 ′) for the second sample is used, and the target for the third sample is used. When correcting the miRNA expression level, the correction coefficient (c3 1-1 or c3 1-1 ′) for the third specimen is used.
  • the correction coefficient that is, in the case of the above formula 1
  • the second and subsequent values are used.
  • correction coefficient By adding a correction coefficient to the logarithmic value of the measured value of each target miRNA expression level in each sample, correction of the expression level of the target miRNA for each of the second and subsequent samples is performed.
  • the corrected expression level Ei of the i-th miRNA in a certain “sample to be corrected” can be obtained by the following equation 9.
  • Wi is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the i-th miRNA.
  • the correction coefficient that is, the above equation 1 ′
  • the correction of the expression level of the target miRNA for each of the second and subsequent samples is performed by subtracting the correction coefficient from the logarithmic value of the measurement value of each target miRNA expression level of the second and subsequent samples.
  • the corrected expression level Ei of the i-th target miRNA in a certain “corrected specimen” can be obtained by the following equation 9 ′.
  • Wi Wi
  • c2 is added to the logarithmic value of the measurement value of each target miRNA expression level in the second sample, or c2 ′ is subtracted. Good.
  • the difference between the representative value of the first sample as the reference sample and the reference value is naturally 0, but the calculation of adding or subtracting 0 to the target miRNA expression level of the first sample is made due to the program configuration. It can be done.
  • the target miRNA expression level is corrected using a correction coefficient obtained by the difference between the representative value and a fixed numerical value (reference value). That is, when the target miRNA expression level is corrected for a certain sample, the correction coefficient (r 1-2 or r 1-2 ′) for that sample is used.
  • the correction coefficient that is, in the case of Equation 3
  • the correction is made to the logarithmic value of the measured value of the expression level of each target miRNA in the specimen.
  • the expression level of the target miRNA for each specimen is corrected.
  • the corrected expression level Ei of the i-th target miRNA in a certain “corrected specimen” can be obtained by the following expression 10.
  • Wi is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the i-th miRNA.
  • the correction coefficient that is, in the case of the above formula 3 ′, measurement of the expression level of each target miRNA in the sample
  • the correction coefficient is expressed by an equation
  • the corrected expression level Ei of the i-th target miRNA in a certain “corrected specimen” can be obtained by the following equation 10 ′.
  • Wi Wi is the same as that in Equation 10 above.
  • the correction step-2 is a method of correcting the expression level of the target miRNA using the correction coefficient obtained in the correction coefficient acquisition step-2, and the expression level of the target miRNA is divided by the correction coefficient or is divided into the expression level. Correction is performed by multiplying the correction coefficient.
  • the correction of the expression level of the target miRNA in the second and subsequent samples is performed using correction coefficients for the second and subsequent samples, respectively. That is, when correcting the expression level of the target miRNA for the second sample, the correction coefficient (c2 2-1 or c2 2-1 ′) for the second sample is used, and the target for the third sample is used. When correcting the miRNA expression level, the correction coefficient (c3 2-1 or c3 2-1 ′) for the third specimen is used.
  • the target miRNA expression level for each of the second and subsequent samples is corrected by multiplying the logarithmic value of the measurement value of each target miRNA expression level for the second and subsequent samples by a correction coefficient.
  • the corrected expression level Ei of the i-th target miRNA in a certain “corrected specimen” can be obtained by the following equation 11.
  • Wi is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the i-th miRNA.
  • the target miRNA expression level for each of the second and subsequent samples is corrected by dividing the logarithm of the measured value of each target miRNA expression level in the second and subsequent samples by the correction coefficient.
  • the corrected expression level Ei of the i-th miRNA in a certain “sample to be corrected” can be obtained by the following equation 11 ′.
  • Wi Wi
  • c2 2-1 is divided by the logarithmic value of the measurement value of each target miRNA expression level in the second sample, or c2 2- Multiply 1 '.
  • the value of the expression level Ei of the corrected target miRNA finally obtained is the same in the procedures of Formula 5 and Formula 11 and in the procedures of Formula 5 ′ and Formula 11 ′.
  • the ratio between the representative value of the first sample as the reference sample and the fixed value (reference value) in this method is naturally 1, but the target miRNA expression level of the first sample is set to 1 because of the program configuration. Calculations such as multiplication or division of the target miRNA expression level by 1 may be performed.
  • the target miRNA expression level is corrected using a correction coefficient obtained by a ratio with a fixed numerical value (reference value). That is, when the target miRNA expression level is corrected for a certain sample, the correction coefficient (r 2-2 or r 2-2 ′) for that sample is used.
  • the corrected expression level Ei of the i-th target miRNA in a certain “sample to be corrected” can be obtained by the following equation 12.
  • Wi is a signal measurement value from the probe immobilization region for capturing the i-th miRNA.
  • each target miRNA in the sample is used.
  • the target miRNA expression level for each specimen is corrected by dividing the logarithmic value of the expression level measurement value by the correction coefficient.
  • the corrected expression level Ei of the i-th target miRNA in a certain “corrected specimen” can be obtained by the following equation 12 ′.
  • Wi Wi
  • the target miRNA expression level is compared among a plurality of body fluid samples based on the corrected target miRNA expression level.
  • the target miRNA expression level of the first sample as the reference sample has not been corrected, and thus, for example, a comparison between the first sample and the second sample Is a comparison between the uncorrected first sample target miRNA expression level and the corrected second sample target miRNA expression level, but at least one of the compared samples must be A corrected sample is obtained. Therefore, the phrase “compare target miRNA expression levels among multiple body fluid samples based on corrected target miRNA expression levels” is compared between uncorrected reference samples and other corrected samples. Embodiments are also encompassed.
  • the comparative analysis process itself can be performed in the same manner as the conventional method.
  • the comparison analysis result can be expressed as a scatter diagram of expression level data called a scatter plot.
  • two scatter plots for example, between the first specimen and the second specimen
  • a scatter plot between the first specimen and the third specimen and if necessary, between the remaining two specimens (in the case of the above example, further the first scatter plot).
  • a scatter plot that is comparatively analyzed between the second specimen and the third specimen may be created.
  • a comparative analysis of four or more specimens can be performed in the same manner.
  • the difference in target miRNA expression level between any one specimen and the remaining other specimens is calculated, and the logarithmic change rate (fold-change) ) As a comparative analysis result.
  • the target miRNA expression level in the reference sample in the case of the reference sample acquisition method
  • the corrected target miRNA expression level in the first sample in the case of the fixed numerical value correction method
  • the difference from the expression level of the target miRNA may be calculated.
  • the present invention is not limited to calculating the difference between the first sample and the other sample, and the difference between any one of the second and subsequent samples and the other sample is calculated. It is good.
  • the miRNA expression analysis apparatus of the present invention is an apparatus for performing the comparative analysis method of the present invention, A measured value of the expression level of the target miRNA and a measured value of the expression level of one or more correction endogenous miRNAs selected from the correction endogenous miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 measured for a plurality of body fluid samples Storage means for storing; Representative value acquisition means for acquiring a representative value, preferably a representative value represented by a logarithmic value, from the measured value of the expression level of one or more correction endogenous miRNAs for each body fluid sample; The target miRNA expression level for each bodily fluid sample is determined by comparing the difference or ratio between the reference value arbitrarily set for the expression level of the endogenous miRNA for correction and the representative value of each bodily fluid sample acquired by the representative value acquisition means.
  • Correction coefficient acquisition means for acquiring the correction coefficient respectively
  • Correction means for correcting the expression level of the target miRNA measured in each body fluid sample using each correction coefficient acquired by the correction coefficient acquisition means; and at least two body fluids according to the corrected target miRNA expression level
  • Output means for outputting the result of comparing the target miRNA expression level between the samples is included.
  • the reference value is a representative value of the endogenous miRNA for correction of the arbitrarily selected first specimen (reference specimen), and the expression level of the target miRNA measured in the second and subsequent body fluid specimens Is corrected.
  • the miRNA expression analyzer of the present invention comprises: Storage means for storing a plurality of target miRNA expression levels measured simultaneously and a measurement value of one or more correction endogenous miRNA expression levels for each of a plurality of specimens; Representative value acquisition means for acquiring a representative value, preferably a representative value represented by a logarithmic value, from the measured value of the expression level of the endogenous miRNA for correction for each body fluid sample;
  • the arbitrarily selected first sample is used as a reference sample, and the representative value of the endogenous miRNA for correction of the reference sample is used as the reference value.
  • correction coefficient acquisition means for respectively acquiring the difference or ratio as a correction coefficient for the second and subsequent samples;
  • Correction means for correcting the expression level of the target miRNA measured in the second and subsequent specimens using the correction coefficients for the second and subsequent specimens acquired by the correction coefficient acquisition means;
  • Output means for outputting a result of comparing the target miRNA expression level between at least two body fluid samples according to the corrected target miRNA expression level.
  • the reference value is a fixed value arbitrarily determined with respect to the corrected endogenous miRNA expression level, and the target miRNA expression level is corrected for all the samples including the first sample.
  • the miRNA expression analyzer of the present invention comprises: Storage means for storing a plurality of target miRNA expression levels measured simultaneously and a measurement value of one or more correction endogenous miRNA expression levels for each of a plurality of body fluid samples; Representative value acquisition means for acquiring a representative value, preferably a representative value represented by a logarithmic value, from each measured value of the expression level of the endogenous miRNA for correction; Correction coefficient acquisition means for acquiring a difference or ratio between the reference value and a representative value of the endogenous miRNA for correction of each specimen as a correction coefficient for the specimen, using a fixed numerical value as a reference value; Correction means for correcting the expression level of the target miRNA measured in each sample using the correction coefficient for each sample acquired by the correction coefficient acquisition means; Output means for outputting a result of
  • FIG. 2 is a block diagram showing an outline of the configuration of an example of the analysis apparatus of the present invention.
  • the analysis apparatus 10 of the present invention includes an input unit 110, a display unit 120, an output unit 130, a storage unit 140, a control unit 150, a conversion unit 160, and an analysis unit 170.
  • FIG. 3 shows an example of a flowchart of the correction processing of the expression level of the target miRNA according to the present invention.
  • the input unit 110 is a means for inputting information related to the operation of the analysis apparatus 10.
  • Conventionally known input means such as a keyboard can be preferably used.
  • the expression level data obtained by the hybridization assay using the microarray is read by reading means such as a scanner different from the apparatus of the present invention and converted into numerical data, and then the numerical data is input from the input unit 110. Input to the analyzer 10.
  • reading means such as a scanner may be included in the analysis device 10 of the present invention (not shown).
  • the expression level data input from the input unit 110 or the expression level data read and digitized by the reading means incorporated in the analysis apparatus 10 is stored in the storage unit 140.
  • the storage unit 140 functions as a storage unit that stores, for each of the plurality of specimens, the measurement values of the expression levels of the plurality of target miRNAs and the expression levels of one or more correction endogenous miRNAs measured simultaneously.
  • the measurement value data of the expression level of the target miRNA and the correction endogenous miRNA of each specimen stored in the storage unit 140 is converted into a logarithm with a base of 2 by the conversion unit 160.
  • the analysis unit 170 obtains a representative value of the measured value of the expression level of the corrected endogenous miRNA that has been logarithmically converted for each specimen.
  • the representative value is, for example, an average value or a median value of one or a plurality of correction endogenous miRNA expression levels (even when only one type of correction endogenous miRNA is used for correction, If there are multiple probe immobilization regions on the array to measure it, the representative value can be the average value or the median value), or the measurement value of one specific type of endogenous miRNA for correction obtain.
  • the analysis unit 170 calculates the difference or ratio between the representative value of the endogenous miRNA for correction of the reference specimen and the representative value of the endogenous miRNA for correction of the second and subsequent specimens. Correction coefficients for the second and subsequent samples are respectively acquired. Details of the correction coefficient acquisition are as described in ⁇ Correction coefficient acquisition step> of the comparative analysis method. Note that the configuration of the program may be such that the correction coefficient 0 (when the difference is calculated) or the correction coefficient 1 (when the ratio is calculated) is acquired for the first sample as the reference sample.
  • the selection of the reference sample may be performed by a person operating the apparatus 10 specifying one arbitrary sample from the input unit 110.
  • the apparatus 10 may automatically select one sample as a reference sample.
  • a sample in which data is input from the input unit 110 and data is first stored in the storage unit 140 can be selected as a reference sample by the apparatus 10.
  • This step of selecting or inputting the reference sample is positioned after the representative value acquisition step (S-3) for convenience in FIG. 3, but is not limited to this, and is an earlier step, for example, when storing data. May be executed.
  • the analysis unit 170 corrects the expression data of the target miRNA measured in the second and subsequent samples using the correction coefficients for the second and subsequent samples, respectively.
  • the details of the correction operation are as described in ⁇ Correction process> of the comparative analysis method. Note that the correction coefficient 0 (when calculating the difference) or correction coefficient 1 (when calculating the ratio) is also corrected for the target miRNA expression level data of the first sample that is the reference sample due to the program structure. It is possible to perform the operation.
  • the analysis unit 170 compares the target miRNA expression level of the reference specimen with the corrected target miRNA expression levels of the second and subsequent specimens.
  • the comparison result is output to the display unit 120 by the output unit 130 and displayed.
  • the comparison result can be output to an output device such as a printer or a recording medium.
  • the output unit 130 can be configured to output the comparison analysis result to an external storage device such as a database existing outside the device via a network.
  • the storage unit 140 stores the measurement values of the expression levels of the plurality of target miRNAs and the expression levels of the plurality of endogenous miRNAs for correction, and also appropriately stores the intermediate analysis results generated in each of the above steps.
  • control unit 150 The various operations described above of the apparatus 10 are controlled by the control unit 150. Specifically, as indicated by broken line arrows in FIG. 2, for each unit of the input unit 110, the display unit 120, the output unit 130, the storage unit 140, the control unit 150, the conversion unit 160, and the analysis unit 170, Control information is output from the control unit 150, and each unit operates in cooperation with the control information, and the entire apparatus 10 operates.
  • the analysis apparatus instead of using the intrinsic miRNA representative value for correction of the reference sample as a reference value, a fixed numerical value designated in advance is registered in the conversion unit 160 or the like in the apparatus 10, and the reference sample It may be used as a reference value instead of the representative value of the expression level of endogenous miRNA for correction. Details of the method in this case are as described in ⁇ Correction coefficient acquisition step> and ⁇ Correction step> of the comparative analysis method.
  • the present invention also provides a program for causing a computer to function as the above-described analysis device.
  • the program is a program for causing a computer to function as each of the above-described units (that is, storage unit, representative value acquisition unit, correction coefficient acquisition unit, correction unit, and output unit).
  • the present invention provides a program for causing a computer to execute each step of the above-described comparative analysis method of the present invention.
  • the comparative analysis method includes the measurement step, the representative value acquisition step, the correction coefficient acquisition step, and the correction step described above, and further, the target miRNA expression level between a plurality of body fluid samples is determined by the corrected target miRNA expression level.
  • a comparative analysis step can be included.
  • These programs are programs for causing the computer to correct the expression level of the target miRNA using data of the expression level of the endogenous miRNA for correction measured simultaneously with the expression level of the target miRNA using a microarray or the like.
  • the present invention provides a computer-readable recording medium on which any one of the above programs is recorded.
  • the “recording medium” can be any “portable physical medium” (non-transitory recording medium) such as a flexible disk, magneto-optical disk, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO, DVD, and the like.
  • it may be a “communication medium” that holds a program in a short period of time, such as a communication line or a carrier wave when transmitting a program via a network, represented by a LAN, WAN, or the Internet.
  • Program is a data processing method described in an arbitrary language or description method, and may be in any form such as source code or binary code.
  • the “program” is not necessarily limited to a single configuration, but is distributed in the form of a plurality of modules and libraries, or in cooperation with a separate program represented by an OS (Operating System). Including those that achieve the function. Note that a well-known configuration and procedure can be used for a specific configuration for reading a recording medium, a reading procedure, an installation procedure after reading, and the like in each device described in the embodiment.
  • the present invention provides a miRNA expression analysis chip including a support on which probes for capturing a plurality of target miRNAs and probes for capturing a plurality of correction endogenous miRNAs are immobilized. Preferred conditions for the chip are as described in the comparative analysis method of the present invention.
  • At least one of the miRNAs shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 described below is used as an endogenous miRNA for correction.
  • SEQ ID NO: 1 is the base sequence of hsa-miR-6085 registered in miRBase as Accession No. MIMAT0023710.
  • the term “miR-6085 gene” or “miR-6085” includes hsa-miR-6085 described in SEQ ID NO: 1, other species homologs or orthologs, and the like.
  • the hsa-miR-6085 gene can be obtained by the method described in Voellenkle C et al., 2012, RNA, 18, p.472-484.
  • SEQ ID NO: 2 is the base sequence of hsa-miR-1227-5p registered in miRBase as Accession No. MIMAT0022941.
  • the term “miR-1227-5p gene” or “miR-1227-5p” includes hsa-miR-1227-5p described in SEQ ID NO: 2 and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-1227-5p gene can be obtained by the method described in Berezikov E et al., 2007, Molecular Cell, 28, p.328-336.
  • SEQ ID NO: 3 is the base sequence of hsa-miR-2861 registered in miRBase as Accession No. MIMAT0013802.
  • the term “miR-2861 gene” or “miR-2861” includes hsa-miR-2861 described in SEQ ID NO: 3, and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-2861 gene can be obtained by the method described in Li H et al., 2009, Journal of Clinical Investigation, 119, p.3666-3677.
  • SEQ ID NO: 4 is the base sequence of hsa-miR-149-3p registered with miRBase under Accession No. MIMAT0004609.
  • the term “miR-149-3p gene” or “miR-149-3p” includes hsa-miR-149-3p described in SEQ ID NO: 4 and other species homologues or orthologues.
  • the hsa-miR-149-3p gene can be obtained by the method described in Lagos-Quintana M et al., 2002, Current Biology, 12, p.735-739.
  • SEQ ID NO: 5 is the base sequence of hsa-miR-4463 registered in miRBase under Accession No. MIMAT0018987.
  • the term “miR-4463 gene” or “miR-4463” includes hsa-miR-4463 described in SEQ ID NO: 5 and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-4463 gene can be obtained by the method described in Jima DD et al., 2010, Blood, 116, p.e118-e127.
  • SEQ ID NO: 6 is the base sequence of hsa-miR-4508 registered in miRBase with Accession No. MIMAT0019045.
  • the term “miR-4508 gene” or “miR-4508” includes hsa-miR-4508 described in SEQ ID NO: 6, homologs or orthologs of other species.
  • the hsa-miR-4508 gene can be obtained by the method described in Jima DD et al., 2010, Blood, 116, p.e118-e127.
  • SEQ ID NO: 7 is the base sequence of hsa-miR-6090 registered in miRBase as Accession No. MIMAT0023715.
  • the term “miR-6090 gene” or “miR-6090” includes hsa-miR-6090 described in SEQ ID NO: 7, and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-6090 gene can be obtained by the method described in Yoo JK et al., 2012, Stem Cells and Development, Vol. 21, p.2049-2057.
  • SEQ ID NO: 8 is the base sequence of hsa-miR-6775-5p registered in miRBase under Accession No. MIMAT0027450.
  • the term “miR-6775-5p gene” or “miR-6775-5p” includes hsa-miR-6775-5p described in SEQ ID NO: 8, other species homolog or ortholog, and the like.
  • the hsa-miR-6775-5p gene can be obtained by the method described in Ladewig E et al., 2012, Genome Research, Vol. 22, p.1634-1645.
  • SEQ ID NO: 9 is the base sequence of hsa-miR-6803-5p registered in miRBase as Accession No. MIMAT0027506.
  • the term “miR-6803-5p gene” or “miR-6803-5p” includes hsa-miR-6803-5p described in SEQ ID NO: 9, and other species homologs or orthologs.
  • the hsa-miR-6803-5p gene can be obtained by the method described in Ladewig E et al., 2012, Genome Research, Vol. 22, p.1634-1645.
  • SEQ ID NO: 10 is the base sequence of hsa-miR-5787 registered with miRBase under Accession No. MIMAT0023252.
  • the term “miR-5787 gene” or “miR-5787” includes hsa-miR-5787 described in SEQ ID NO: 10, other species homolog or ortholog, and the like.
  • the hsa-miR-5787 gene can be obtained by the method described in YooH et al., 2011, Biochem Biophys Res Commun, vol.415, p.567-572.
  • sample RNA preparation As sample RNA, RNA extracted from 157 samples of healthy human serum using "3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample kit was used. The obtained sample RNA was labeled using a “3D-Gene” miRNA labeling kit (Toray Industries, Inc.). The labeled sample RNA was hybridized and washed according to the standard protocol of “3D-Gene” miRNA chip (Toray Industries, Inc.). The reacted DNA microarray detected a fluorescent signal using a microarray scanner (Toray Industries, Inc.). The scanner was set to 100% laser output and the photomultiplier voltage was set to AUTO.
  • the miRNA signal value obtained from the DNA microarray was converted into a logarithm with a base of 2, and an experimental error was corrected by an external standard nucleic acid added during RNA extraction and labeling.
  • the miRNA signal values of all 157 samples obtained after correcting the experimental error were extracted with the miRNA between samples by the geNorm method.
  • the GeNorm method is a search method for endogenous housekeeping genes (reference genes) in the quantitative RT-PCR method proposed by Vandesompele et al. (Genome Biology 2002, 3: research0034-research0034.11). It is used as a method for selecting mRNA, which is an endogenous housekeeping gene unique to the target specimen. Specifically, the ratio of the signal values of the two genes is calculated as a round robin for the signal values of all the detection target genes in the same specimen.
  • a and V obtained by the above-described calculation method are smaller values as the signal value is smaller, and seem to be endogenous housekeeping genes that are apparently excellent. Since the DNA microarray used this time comprehensively detects all miRNAs registered in miRBase release 20, miRNAs with small signal values are preferentially selected when the geNorm method is performed using this data. From such a phenomenon, selection of an endogenous housekeeping gene in DNA microarray detection by the geNorm method has been avoided so far.
  • Ten kinds of endogenous housekeeping genes having a low M value, that is, usable as correction miRNAs were selected from 281 kinds of miRNAs to which the geNorm method was actually applied.
  • Table 10 shows the sequence numbers of these 10 corrective miRNAs for correction, miRNA names, MIMAT numbers registered in miRBase, M values calculated by geNorm, nucleotide sequences, and the percentage of guanine / cytosine in the sequence (GC%) It is shown in 1.
  • Detection of miRNA by DNA microarray is performed by hybridization method that forms nucleic acid duplex by target miRNA and probe for capturing the target miRNA, so it contains guanine and cytosine that stabilize nucleic acid duplex It is expected that sequences with high amounts will be detected by DNA microarrays in a particularly stable manner. That is, it is generally assumed that sequences with high guanine and cytosine content are preferentially selected as endogenous housekeeping genes. However, as shown in Table 1, the endogenous housekeeping gene (corrected endogenous miRNA) selected by the geNorm method could not be said to have a high content of guanine and cytosine. On the contrary, the phenomenon that miRNA with a high content of guanine and cytosine preferentially becomes an endogenous housekeeping gene (correcting endogenous miRNA) was not observed.
  • Example 2 Using the selected endogenous miRNAs for correction alone, the expression levels of target RNAs in a plurality of body fluid samples were corrected.
  • RNA expression level due to RNA material instability When measuring RNA expression level due to RNA material instability, absolute expression level comparison is often required between samples with different qualities, that is, with different degrees of RNA degradation. In particular, when the specimen is a body fluid, it is assumed that any result is obtained by measuring the target miRNA expression level in the specimen placed at room temperature for a long time.
  • miRNA expression profile regardless of RNA quality by performing correction according to RNA degradation based on the amount of specific endogenous miRNA for correction contained in serum. It is considered that an absolute comparison between samples can be made with respect to (amount ratio).
  • 2 Let stand at 25 ° C. for 24 hours after serum separation to perform RNA extraction. Total RNA was extracted from serum prepared under each condition using “3D-Gene” RNA extraction reagent from liquid sample kit RNA, and used as sample RNA.
  • Each of the obtained sample RNAs was labeled using “3D-Gene” “miRNA” labeling kit (Toray Industries, Inc.).
  • the labeled sample RNA was subjected to hybridization and washing according to the standard protocol of “3D-Gene” —human miRNA—oligo chip (Toray Industries, Inc.).
  • the reacted DNA microarray detected a fluorescent signal using a microarray scanner (Toray Industries, Inc.). The scanner was set to 100% laser output and the photomultiplier voltage was set to AUTO.
  • FIG. 4A shows a distribution of signal values obtained by converting miRNA signal values obtained from the DNA microarray into logarithms with a base of 2 (ie, uncorrected expression level signal values).
  • FIGS. 4B to 4K show distributions of corrected signal values corrected by the signal values of the endogenous miRNAs for correction shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 and reference values that are fixed values set separately in advance.
  • Day-0 (broken line) is the sample RNA under condition 1
  • Day-1_25 ° C. solid line
  • correction by the signal value of the endogenous miRNA for correction shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 was performed by the method shown below.
  • the signal value of the endogenous miRNA for correction shown in SEQ ID NOs: 1 to 10 is converted into a logarithm with a base of 2, and the ratio of the converted signal value to the reference value is taken as a representative value (reference value) Value / representative value) and correction coefficient.
  • the correction coefficient is set for each of the correction endogenous miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 10. These correction factors were corrected by multiplying all miRNA signal values of each specimen for each correction endogenous miRNA.
  • Example 3 As shown in Example 2, the endogenous miRNAs for correction of SEQ ID NOs: 1 to 10 each have a sufficient effect of correcting the expression level of the target miRNA alone, but further combining these results in inadequate experimentation, etc. It is envisaged that some of the correction endogenous miRNA data can be compensated for by loss. Therefore, the expression level of the target miRNA was corrected using a combination of a plurality of endogenous miRNAs for correction, and the effect of the correction was confirmed. The same sample as in Example 2 was used.
  • the signal value of the endogenous miRNA for correction of SEQ ID NOs: 2, 4 and 5 was converted into a logarithm with a base of 2, and the average value or median value of the signal values after this conversion was obtained as a representative value.
  • a fixed value was used as the reference value.
  • the average value of all the expression levels (signal values after logarithmic transformation) of the three types of endogenous miRNAs for correction in a plurality of serum RNA samples including the two types of samples prepared in Example 2 is obtained, and this average value is fixed. Used as (reference value).
  • the ratio of the representative value of the endogenous miRNA for correction to the reference value was taken (reference value / representative value) and used as a correction coefficient for the specimen.
  • the target miRNA signal value was corrected by multiplying all the target miRNA signal values of each corresponding specimen by this correction coefficient.
  • FIG. 5 shows the distribution of the corrected signal value of the target miRNA when the average value of the signal value after logarithmic conversion is used as a representative value of the expression level of the endogenous miRNA for correction. Similar to Example 2 in which correction was performed using each of the correction endogenous miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 10, even when correction was performed using a combination of a plurality of correction endogenous miRNAs, It was possible to make miRNA expression profiles identical.
  • Example 4 As shown in Example 3, the endogenous miRNAs for correction of SEQ ID NOs: 1 to 10 are useful for correction also by combining them. Regarding this correction effect, it was confirmed that any combination of SEQ ID NOS: 1 to 10 showed the same effect. The same sample as in Example 2 was used.
  • the signal value of the endogenous miRNA for correction of SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5 and 6 is converted into a logarithm with a base of 2, and for each specimen, the signal value after conversion of any of the three types of endogenous miRNA for correction is converted. An average value was obtained and used as a representative value for the sample.
  • the reference value is a fixed value, and the average value of a plurality of serum RNA specimens including the two specimens prepared in Example 2 of the signal values after logarithmic transformation of the three kinds of endogenous miRNAs for correction used for obtaining the representative values. was used as a fixed value (reference value).
  • the ratio between the representative value and the reference value was taken (reference value / representative value) and used as a correction coefficient for the sample.
  • the miRNA expression level of each sample was corrected by multiplying all the target miRNA signal values of each corresponding sample by this correction coefficient.
  • FIG. 8A shows an uncorrected expression level signal value distribution
  • FIGS. 8B to 8I show corrected expression level signal value distributions. Similar to Example 2 in which correction was performed using endogenous correction miRNAs of SEQ ID NOs: 1 to 10 alone, it was possible to make the expression profiles of target miRNAs in each specimen identical.
  • Example 1 When the examination of Example 1 was performed, two types of reference substances to be added from the outside in the step of labeling each sample RNA obtained from serum RNA using the “3D-Gene” miRNA labeling kit (Toray Industries, Inc.) Of synthetic RNA sequences (20 mer, spike control 1 and spike control 2 respectively) were added. These synthetic RNA sequences were fluorescently labeled in the same way as serum-derived miRNA, and the signal amount was detected by "3D-Gene” human miRNA oligo chip (Toray Industries, Inc.). Therefore, signal values obtained from a total of 16 spots of 8 points for spike control 1 and spike control 2 were converted into logarithms with a base of 2, and the median value was obtained as a representative value.
  • a ratio between this representative value and a fixed value (reference value) set in advance (reference value / representative value of each sample) was obtained to obtain a correction coefficient for each sample.
  • This correction factor was corrected by multiplying all miRNA signal values for each specimen.
  • the distribution of signal values before correction is shown in FIG. 6A, and the distribution of signal values after correction is shown in FIG. 6B. It was shown that the signal value of the target miRNA in the sample was not sufficiently corrected by correction with spike control added from the outside during labeling.
  • FIG. 7 shows a distribution of corrected signal values when corrected with hsa-miR-16-5p. The correction by the expression level of hsa-miR-16-5p showed that the signal value of the target miRNA in the sample was not sufficiently corrected.

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Abstract

　複数の体液検体間でｍｉＲＮＡの発現量を比較解析する方法が開示されている。本発明の比較解析方法では、体液検体中の標的ｍｉＲＮＡの発現量と同時に測定された補正用内因性ｍｉＲＮＡの発現量を用いて、当該検体中の標的ｍｉＲＮＡの発現量を補正する。補正用内因性ｍｉＲＮＡとして、特定の１０種の補正用内因性ｍｉＲＮＡから選択される１又は複数のｍｉＲＮＡを用いる。本発明によれば、体液検体間での標的ｍｉＲＮＡの比較解析を従来よりも正確に実施できるようになる。

Description

ｍｉＲＮＡ発現量の比較解析方法及び装置
　本発明は、複数の体液検体に含まれるmiRNAの発現量を比較解析するための方法及び装置に関する。
　miRNA（マイクロRNA）は、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するｄｓRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAをターゲット（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは１５～２５塩基のRNAからなり、様々な生物でその存在が確認されている。
　近年、miRNAは細胞内のみならず、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液にも多く存在し、その発現量が、がんをはじめとした様々な疾患のバイオマーカーとなる可能性が示唆されている。miRNAは２０１４年６月現在、ヒトで2500種以上が存在し（miRBase release 20）、高感度なDNAマイクロアレイ等の測定系を利用した場合、そのうちの1000種を超えるmiRNAが血清・血漿中で発現を同時に検出することが可能である。そこで、DNAマイクロアレイ法を用いて血清・血漿、尿、脊髄液等の体液を対象としたバイオマーカー探索研究が実施されている。
　一方、DNAマイクロアレイを用いて遺伝子発現解析を行う場合には、検体や実験者、実験条件により、得られるデータに誤差が生じる可能性があることが知られている。そのため、誤差を補正するためのデータ補正方法が考案されている。
　補正には、複数の遺伝子の発現データを一塊とし遺伝子発現データ群としてとらえた場合、遺伝子発現データ群全体の発現量には、いかなる検体であっても差がないという原理を前提とした方法が用いられている。この方法にはグローバルノーマライゼーション法、quantile法、lowess法、75 percentile法などが含まれる。
　また、検体間で発現量が同一である特定の遺伝子（ベータアクチンやGAPDHなど）に着目し、その遺伝子の検出値が一定になるように、検体ごとにデータを補正する方法も行われている。
　特定のmiRNAの発現量が一定になるように補正する方法として、検体で発現しているノンコーディングRNAのうち、さまざまな検体において発現量が一定であるとされる、ハウスキーピングRNA（U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNA）を用いて補正する方法が提案されている（特許文献１、特許文献２）。すなわち、特許文献１、特許文献２では、miRNAを検出する際に同時に検出した5S rRNAの検出値が全ての検体で一定となるような操作を行って、miRNAの検出結果を補正している。
　一方で、DNAマイクロアレイでは多数のmiRNAを同時に測定することから、限られた種類のハウスキーピングRNAのみを用いて補正する方法は正確性に欠けるとされ、miRNAと同時に複数のmRNAの発現量も測定し、これらの複数のmRNAの発現量を用いてmiRNAの補正を行うという方法が提言されている（特許文献３）。特許文献３では、miRNAを検出する際に同時に検出した複数のmRNAの検出値が全ての検体で一定となるような操作を行って、miRNAの検出結果を補正している。
　非特許文献１では、マウス血清中のmiRNA発現量の測定において、内因性miRNAを発現量の補正に利用し、その有効性を評価している。なお、内因性miRNAとは、対象とする検体中（非特許文献１の場合はマウス血清）に自然に存在している、その検体を提供した生物に由来するmiRNAであることを示す。すなわち、非特許文献１では、補正用内因性miRNAの例としてmiR-16、miR-31、miR-223を用いて、マウス血清中のmiRNA発現量の補正を試みているが、これらのmiRNAの発現量は個体間で一定していなかったことから、内因性のmiRNAの発現量によって全体のデータ補正を行う方法は採用せず、外部から添加したRNAを基準物質としてデータ補正用に用いることを提案している。要するに、これらの内因性miRNAを用いてmiRNA発現量の補正をすることは適当ではないと結論している。
　非特許文献２では、ヒト血清中のmiRNAを定量RT-PCRやシークエンス法で検出するにあたり、let-7d、let-7g、let-7iを組み合わせて補正用内因性miRNAとして用いることを提唱している。すなわち、let-7d、let-7g、let-7iの発現量を検体間で一定にする操作を行うことで、測定対象とするmiRNAの発現量を補正している。
特開２００７－７５０９５号公報 特開２００７－９７４２９号公報 特開２０１４－７９９５号公報
Roberts, T.C.ら、2014年、PLoS ONE、第9(2)巻、e89237 Chen, X.ら、2013年、PLoS ONE、第8(11)巻、e79652
　上記のように、遺伝子発現を検出する場合、検体間で発現量の変動が少ない「ハウスキーピング遺伝子」の発現量を利用して、検出対象とする遺伝子の発現量を補正する方法が一般に用いられている。特によく知られているハウスキーピング遺伝子としては、ACTB、GAPDHなどが挙げられる。しかし、これらの遺伝子は、miRNAとは核酸長や発現量の絶対値が大きく異なっており、miRNAの発現量を補正する目的で使用することは好ましくない。
　そのため、従来、miRNAの発現量を検出する場合には、U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNAといったハウスキーピングRNAが主に補正用に用いられてきた。しかしながら、体液中のmiRNAの発現量を測定し、そのデータを補正しようとした場合、U1 snoRNA、U2 snoRNA、U3 snoRNA、U4 snoRNA、U5 snoRNA、U6 snoRNA、5S rRNA、5.8S rRNAは、核内や細胞質内に存在するRNAであるため、細胞を含まない検体である血清、血漿、尿、脊髄液等の体液においてはほとんど発現量を検出することができず、これらを体液中のmiRNAの発現量の検出補正のための指標とすることができないとされている。
　定量RT-PCR法によるmiRNAの発現量検出においては、血清や血漿中に存在するmiRNAを個別に解析して、検体間での発現量差がない「体液中ハウスキーピングmiRNA」を見出そうとする試みが実施されている。上記のとおり、非特許文献２では、ヒト血清中のmiRNAを定量RT-PCRやシークエンス法で検出するにあたり、let-7d、let-7g、let-7iを組み合わせて用いることを提唱している。しかしながら、これらのmiRNAがDNAマイクロアレイ法においても補正用内因性miRNAとして機能するか否かは不明である。すなわち、DNAマイクロアレイを用いた体液中のmiRNA解析においては、特定の補正用内因性miRNAを用いた有効な補正方法がなかった。
　一方、DNAマイクロアレイにおいて測定値の補正を実施する場合には、DNAマイクロアレイで測定可能な多数（数百～数万）の遺伝子の全発現量（シグナル値）を用いて補正を行うことが一般に行われている。たとえば、グローバルノーマリゼーション法、クォンタイルノーマリゼーション法などが、その方法として挙げられる。
　ところで、miRNAの発現量から得られる基準値を指標とする場合、基準値を構成するための元データとなるmiRNAがいくつあれば、普遍的な補正用基準値を形成しうるのかという課題がある。特に、測定するmiRNAの数が数個～数十個に限定された、特定用途向けのDNAマイクロアレイにおいては、グローバルノーマライゼーション法などを適用すると、不十分な補正結果をもたらす可能性が大きい。また、検体中の多数のmRNAの発現量を測定して、これを補正のための基準値とする特許文献３の方法は、組織や細胞由来のRNAについては有効であるが、体液中のmRNAの発現量は極めて低く、これらをmiRNAの発現量補正のための指標とすることは難しい。
　以上のとおり、複数の体液検体に含まれるmiRNAの発現量を測定し、比較解析しようとする場合に、その測定値を補正する有効な方法は見出されていない。特にDNAマイクロアレイにより少数の補正用内因性miRNAを用いて有効な補正を行うことができる方法は存在していない。本発明は、以上のような課題を解決しようとするものであり、特に検査・診断用途などの比較的少数のmiRNA測定用DNAマイクロアレイの実用化にきわめて重要な課題を解決しようとするものである。
　本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、以下の発明を完成した。
(１)　複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析する方法であって、
　複数の体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
を含む、前記方法。
(２)　前記補正工程では、
(a)前記補正係数取得工程において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得工程において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得工程において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得工程において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行なう、(１)に記載の方法。
(３)　前記基準値は、補正用内因性miRNA発現量に関して任意に定められた固定数値、又は、前記複数の体液検体から任意に選択された第１の体液検体について取得された補正用内因性miRNA発現量の代表値である、(１)又は(２)に記載の方法。
(４)　前記測定工程が、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するための核酸プローブ及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をそれぞれシグナル強度測定値として得ることを含む、(１)ないし(３)のいずれか１項に記載の方法。
(５)　前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、(１)ないし(４)のいずれか１項に記載の方法。
(６)　前記代表値が、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNA発現量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、(１)ないし(５)のいずれか１項に記載の方法。
(７)　複数の体液検体における標的miRNAの発現量を比較解析するmiRNA発現解析装置であって、
　複数の体液検体について測定された、標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
　補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
を含む、前記装置。
(８)　前記補正手段は、
(a)前記補正係数取得手段において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
(b)前記補正係数取得手段において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
(c)前記補正係数取得手段において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
(d)前記補正係数取得手段において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
により前記補正を行う、(７)に記載の装置。
(９)　前記記憶手段に記憶される、複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値は、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をシグナル強度測定値としてそれぞれ測定された値である、(７)又は(８)に記載の装置。
(１０)　複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターに、
　複数の各体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の各測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
を実行させるためのプログラム。
(１１)　複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターを、
　複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
　補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
として機能させるためのプログラム。
(１２)　(１０)又は(１１)に記載のプログラムを記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
(１３)　複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
　本発明によれば、複数の体液検体に含まれる標的miRNAの発現量を比較解析する場合、特にマイクロアレイ等を用いて多数のmiRNAの発現量を測定し、検体間でmiRNA発現量を比較する場合に、従来よりも正確にmiRNA発現量を補正することができる。本発明により、検体間での標的miRNAの比較解析がより正確に実施できるようになる。
本発明の方法の概念図である。 本発明の解析装置の構成の概略を示すブロック図である。 本発明による標的miRNAの発現量の補正処理のフローチャートの一例である。 実施例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｂ:hsa-miR-6085による補正、Ｃ：hsa-miR-1227-5pによる補正、Ｄ：hsa-miR-2861による補正、Ｅ：hsa-miR-149-3pによる補正、Ｆ：hsa-miR-4463による補正、Ｇ：hsa-miR-4508による補正 実施例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｈ：hsa-miR-6090による補正、Ｉ：hsa-miR-6775-5pによる補正、Ｊ：hsa-miR-6803-5pによる補正、Ｋ：hsa-miR-5787による補正 実施例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。 比較例１に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。 比較例２に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。 実施例４に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｂ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-2861の組合せによる補正、Ｃ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-4508の組合せによる補正、Ｄ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-4463の組合せによる補正、Ｅ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4508の組合せによる補正 実施例４に示す方法で測定、補正されたDNAマイクロアレイ検出によるmiRNAシグナル値のヒストグラムを示す。Ａ：補正前、Ｆ：hsa-miR-149-3p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4463の組合せによる補正、Ｇ：hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4508の組合せによる補正、Ｈ：hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-2861、hsa-miR-4463の組合せによる補正、Ｉ：hsa-miR-1227-5p、hsa-miR-4508、hsa-miR-4463の組合せによる補正
　まず、本発明で行なう標的miRNAの補正方法の概念について、図１に基づいて説明する。図１では、体液検体中のRNAを標識し、複数種類の標的miRNAを捕捉するためのプローブ（以下、「標的miRNA捕捉プローブ」ともいう。）及び配列番号１～１０に示すmiRNAから選択される１又は複数のmiRNA（以下、「補正用内因性miRNA」ともいう。）を捕捉するためのプローブ（以下、「補正用内因性miRNA捕捉プローブ」ともいう。）が固定されたマイクロアレイで検出した結果を、各miRNAの発現量の測定値であるシグナル値のヒストグラムによって模式的に示している。以下、標的miRNAを捕捉するためのプローブ又は補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブを、総じて「miRNA捕捉プローブ」又は単に「プローブ」ともいう。
　図１Ａでは、体液検体Ａ及び体液検体Ｂから抽出した検体の標的miRNAを、それぞれDNAマイクロアレイを用いて解析した結果を、ヒストグラムで示している。マイクロアレイに搭載されている複数の標的miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値、及び本発明の補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムをそれぞれ示している。体液検体Ａと体液検体Ｂでは、miRNAのヒストグラムが大きくずれている。このことから、検体間でmiRNAの発現量に大きな差があると解釈できる。一方、実験誤差により差が生じているとも解釈できる。どちらが正しいか、miRNAのヒストグラムのみからは判断することができない。
　ところで、ここに体液中の存在量が常に一定である補正用内因性miRNAが存在する場合、この補正用内因性miRNAのシグナル値の値は検体間で一致するはずである。
　図１Ａで示した、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムは、体液検体Ａと体液検体Ｂでほぼ同じ分布を示している。すなわち、体液検体Ａと体液検体Ｂは正しく実験に供せられ、実験誤差はないと判断することができる。この場合には、体液検体ＡＢ間でmiRNAの発現量に大きな差があるということになり、体液検体間での比較をするに当たってmiRNAのシグナル値の補正は不要である。
　図１Ｂでは、DNAマイクロアレイを用いて体液検体Ｃ及び体液検体Ｄを解析した結果を模式的に示している。標的miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値、及び補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値をそれぞれ示している。
　体液検体Ｃと体液検体Ｄでは、miRNAのヒストグラムが同じような分布を示している。一方、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムは、体液検体Ｃと体液検体Ｄでは大きくずれている。このことから体液検体Ｃと体液検体Ｄの検出結果には、何らかの原因によって実験誤差が生じていることが分かる。このような場合には体液検体ＣＤ間での比較をするに当たり、miRNAのシグナル値を適切に補正する必要がある。
　本発明に従い、標的miRNAのシグナル値を補正した後のヒストグラムを図１Ｃに示した。補正の具体的な方法は後述の通りである。体液検体Ｃと体液検体Ｄの補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムが一致するよう、体液検体Ｃのデータを補正した。この補正により、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られたシグナル値のヒストグラムは体液検体Ｃと体液検体Ｄで一致するようになり、同じ補正係数を用いて補正された標的miRNA捕捉プローブのシグナル値のヒストグラムは、大きくずれてくる。つまり、検体ＣＤ間でも、標的miRNAの発現量には大きな差があるということになる。
　ここでは２つの体液検体間でのmiRNAのシグナル値を補正する方法を示したが、比較する体液検体は２つに限らず、無限に比較することができる。３つ以上の体液検体を比較する場合には、例えば、あらかじめ補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られるシグナル値を、一定の数値（定数）と仮定しておき、この定数に対する、各体液検体の補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られるシグナル値の差又は比を計算して、その差を体液検体中の標的miRNAのシグナル値に対して加算もしくは減算するか、比の逆数を体液検体中の標的miRNAのシグナル値に対して乗算もしくは除算することで、容易に多数の検体間の補正を行うことができる。
　本発明では、複数の検体間でmiRNAの発現量を比較解析する。検体数は２つでもよいし、３つ以上でもよい。
　「miRNA」とは、生体内で作られる鎖長１５～２５塩基程度の短鎖RNAを意味するノンコーディングRNA（ncRNA）の一種であり、mRNAの発現を調節する機能を有すると考えられている。miRNAは、ゲノムDNAからからヘアピン様構造のRNA（前駆体）として転写されてくる。この前駆体は、特定の酵素RNase III切断活性を有するdsRNA切断酵素（Drosha、Dicer）により切断された後、二本鎖の形態へと変化し、その後一本鎖となる。そして、片方のアンチセンス鎖がRISCと称するタンパク質複合体に取り込まれ、mRNAの翻訳抑制に関与すると考えられている。このように、miRNAは、転写後、各段階においてその態様は異なるので、通常、miRNAをターゲット（検出対象）とする場合は、ヘアピン構造体、二本鎖構造体、一本鎖構造体等の各種形態を考慮する必要がある。miRNAは様々な生物でその存在が確認されている。
　本発明を適用できる検体は、生体から分離された体液検体であり、例えば、血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、ぬぐい液、各種組織液等の体液を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。比較解析する複数の検体は、異なる体液に由来する複数の検体でもよいし、異なる生体から分離された同一種類の体液に由来する複数の体液検体でもよい。
　これらの検体からRNAを抽出し、このRNAを用いてmiRNAの発現量を測定する。そのようなRNAの抽出方法は公知であり（例えば、Favaloroらの方法（Favaloro et.al., Methods Enzymol.65: 718-749 (1980)）等）、そのためのキットも各種市販されている（例えば、キアゲン社のmiRNeasy、東レ社の"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample等）。
　本発明で「内因性」という場合、人工的に検体に添加されたものではなく、検体中に自然に存在することを意味する。たとえば「内因性miRNA」と言った場合、検体中に自然に存在している、その検体を提供した生物に由来するmiRNAを示す。
＜測定工程＞
　本発明の比較解析方法では、検体中の複数種類の標的miRNAの発現量の測定と同時に、1又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定も行なう。補正用内因性miRNAの発現量は、後述する通り、標的miRNAの発現量を補正するための補正係数の算出に使用される。複数のmiRNAの発現量の同時測定は、例えば、対象のmiRNAに特異的に結合するプローブを支持体上に固定化した、マイクロアレイ等のアレイチップを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより行なうことができる。本発明においては、複数の標的miRNA捕捉プローブと1又は複数の補正用内因性miRNA捕捉プローブとが固定化された支持体を含むアレイチップを用いればよい。
　「捕捉プローブ」又は「捕捉するためのプローブ」とは、捕捉対象のmiRNAと直接的又は間接的に、好ましくは直接的に、かつ選択的に結合し得る物質を意味し、代表的な例として、核酸、タンパク質、糖類及び他の抗原性化合物を挙げることができる。本発明においては、核酸プローブを好ましく用いることができる。核酸は、DNAやRNAのほか、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）などの核酸誘導体を用いることができる。ここで誘導体とは、核酸の場合、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド（例えば、ハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド、及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど）を含む誘導体などの化学修飾誘導体を意味する。
　核酸プローブの鎖長は、ハイブリダイゼーションの安定性と特異性を確保する観点から、検出対象とするmiRNAの長さ以上とすることが好ましい。通常、１７～２５塩基程度の鎖長とすれば、プローブが対象とするmiRNAへの選択的結合性を十分に発揮することができる。そのような鎖長の短いオリゴ核酸プローブは、周知の化学合成法等により容易に調製することができる。
　核酸プローブは、対象のmiRNAと完全に相補的な塩基配列とすることが好ましいが、一部に相違があっても、対象のmiRNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度に相同性の高い塩基配列であれば、捕捉プローブとして使用可能である。
　ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プローブの鎖長、プローブのヌクレオチド配列のGC含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載された条件などを用いることができる。ストリンジェントな温度条件は、約３０℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、及びキャリアDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。当業者は、所望する検体RNAの検出のために用意した捕捉プローブとしての機能を得るための条件を適宜決定することができる。
　miRNAの配列情報は、GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等のデータベースから入手することができる。また、miRNAの配列情報は、例えばmiRBaseのウェブサイト（http://www.mirbase.org/）から入手することができる。補正用内因性miRNA捕捉プローブ、及び標的miRNA捕捉プローブは、これらのサイトから入手できる配列情報に基づいて設計することができる。
　支持体上に固定化されるmiRNA捕捉プローブの数は特に限定されない。例えば、配列が同定されている公知のmiRNAの全てを網羅する数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いて、miRNAの発現量を測定してもよいし、所望の数のmiRNA捕捉プローブを支持体上に固定化したものを用いてもよい。
　捕捉プローブが整列固定化される支持体としては、公知のマイクロアレイやマクロアレイ等で使用されている支持体と同様のものを用いることができ、例えばスライドガラスや膜、ビーズなどを用いることができる。特許第4244788号等に記載されている、表面に複数の凸部を有する形状の支持体を用いることもできる。支持体の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料；ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。
　支持体に捕捉プローブを固定化する方法としては、支持体表面上でオリゴDNAを合成する方法と、あらかじめ合成しておいたオリゴDNAを支持体表面へ滴下し固定する方法が知られている。
　前者の方法としては、Ronaldらの方法（米国特許第５７０５６１０号明細書）、Michelらの方法（米国特許第６１４２２６６号明細書）、Francescoらの方法（米国特許第７０３７６５９号明細書）が挙げられる。これらの方法ではDNA合成反応時に有機溶媒を用いるため、支持体は有機溶媒に耐性のある材質であることが望ましい。また、Francescoらの方法では、支持体の裏面から光を照射してDNA合成を制御するため、支持体は透光性を有する材質であることが好ましい。
　後者の方法としては、廣田ら（特許第３９２２４５４号）の方法やスポッターを用いる方法を挙げることができる。スポットの方式としては、固相へのピン先端の機械的な接触によるピン方式、インクジェットプリンターの原理を利用したインクジェット方式、毛細管によるキャピラリー方式等が挙げられる。スポット処理した後は、必要に応じてＵＶ照射によるクロスリンキング、表面のブロッキング等の後処理が行なわれる。表面処理した支持体表面に共有結合でオリゴDNAを固定化させるため、オリゴDNAの末端にはアミノ基やＳＨ基等の官能基が導入される。支持体の表面修飾は、通常、アミノ基等を有するシランカップリング剤処理によって行なわれる。
　支持体上に固定化された各miRNA捕捉プローブとのハイブリダイゼーションは、体液検体から抽出したRNAから、標識物質で標識された核酸試料（体液検体由来の核酸試料）を調製し、この標識核酸試料をプローブと接触させることにより実施する。「体液検体由来の核酸試料」には、体液検体から抽出したRNAのほか、該RNAから逆転写反応により調製されたcDNA及びcRNAが包含される。標識された体液検体由来の核酸試料は、検体RNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよいし、また、検体RNAから調製されたcDNAやcRNAを直接的又は間接的に標識物質で標識したものでもよい。
　体液検体由来の核酸試料に標識物質を結合させる方法としては、核酸試料の３’末端に標識物質を結合させる方法、５’末端に標識物質を結合させる方法、標識物質が結合したヌクレオチドを核酸に取り込ませる方法を挙げることができる。３’末端に標識物質を結合させる方法、５’末端に標識物質を結合させる方法では酵素反応を用いることができる。酵素反応には、T4 RNA LigaseやTerminal Deoxitidil Transferase、Poly A polymeraseなどを用いることができる。いずれの標識方法も「Shao-Yao Ying編、miRNA実験プロトコール、羊土社、２００８年」に記載されている方法を参考にすることができる。また、RNAの末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるためのキットが各種市販されている。例えば、３’末端に直接又は間接的に標識物質を結合させるキットとしては、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）、miRCURY miRNA HyPower labeling kit（エキシコン社）、NCode miRNA Labeling system（ライフテクノロジーズ社）、FlashTag Biotin RNA Labeling Kit（ジェニスフィア社）等を例示することができる。
　このほか、従来法と同様に、標識したデオキシリボヌクレオチド又は標識したリボヌクレオチドの存在下で検体RNAからcDNA又はcRNAを合成することにより、標識物質が取り込まれたcDNA又はcRNAを調製し、これをアレイ上のプローブとハイブリダイズさせる、という方法も可能である。
　本発明では、複数の検体を用いるが、いずれにも同一の標識物質を用いてよい。
　本発明において、使用できる標識物質としては、公知のマイクロアレイ解析においても使用されている各種の標識物質を挙げることができる。具体的には、蛍光色素、りん光色素、酵素、放射線同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいのは、測定が簡便で、シグナルが検出しやすい蛍光色素である。具体的には、シアニン（シアニン２）、アミノメチルクマリン、フルオロセイン、インドカルボシアニン（シアニン３）、シアニン３．５、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、インドカルボシアニン（シアニン５）、シアニン５．５、シアニン７、オイスターなどの公知の蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない。
　また、標識物質としては、発光性を有する半導体微粒子を用いてもよい。このような半導体微粒子としては、例えばカドミウムセレン（CdSe）、カドミウムテルル（CdTe）、インジウムガリウムリン（InGaP）、シルバーインジウム硫化亜鉛（AgInZnS）などが挙げられる。
　上記のようにして標識された体液検体由来の核酸試料を支持体上のmiRNA捕捉プローブと接触させ、核酸試料とプローブをハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーション工程は、従来と全く同様に行うことができる。反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる核酸の鎖長に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、３０℃～７０℃程度で１分間～十数時間である。ハイブリダイゼーションを行ない、洗浄後、支持体上の個々のプローブ固定化領域における標識物質からのシグナル強度を検出する。シグナル強度の検出は、標識物質の種類に応じて適当なシグナル読取装置を用いて行なう。蛍光色素を標識物質として用いた場合には、蛍光顕微鏡や蛍光スキャナー等を用いればよい。
　検出されたシグナル値は、周辺ノイズと比較される。具体的には、プローブ固定化領域から得られたシグナル値と、それ以外の位置から得られたシグナル値を比較し、前者の数値が上回っている場合を検出された（有効判定陽性）とする。
　検出されたシグナル値に、バックグラウンドノイズが含まれている場合には、バックグラウンドノイズを減算してもよい。周辺ノイズをバックグラウンドノイズとして、検出したシグナル値から減算することもできる。その他、「藤淵航、堀本勝久編、マイクロアレイデータ統計解析プロトコール、羊土社、２００８年」に記載されている方法を用いても良い。
　上記の方法によると、補正用内因性miRNA及び標的miRNAの発現量の測定値が、シグナル強度の測定値として得られる。
＜代表値取得工程＞
　本発明の解析方法では、次いで、各検体について、補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する（代表値取得工程）。本発明における「対数値」とは、底が２の対数に変換された値を意味する。
　複数の補正用内因性miRNAを使用する場合、代表値は、それら複数の補正用内因性miRNAの発現量の各測定値から算出された平均値又は中央値、好ましくは対数値で表された平均値又は中央値が採用される。補正用内因性miRNAを１つだけ使用する場合、当該補正用内因性miRNAの発現量の測定値、好ましくは該測定値の対数値がそのまま代表値として採用され得る。あるいは、後述する通り、１種類の補正用内因性miRNAに対して複数の捕捉プローブがスポットされているアレイチップを用いる場合には、それら複数のスポット（プローブ固定化領域）からのシグナル測定値より、平均値又は中央値、好ましくは対数値で表された平均値又は中央値を求め、代表値とすることができる。
　「対数値で表された平均値」とは、複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）を底が２の対数に変換した対数値で求めた平均値を意味する。代表値が中央値の場合、「対数値で表された中央値」とは、複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値（例えば、マイクロアレイを用いて得られたシグナル強度の測定値）を底が２の対数に変換した対数値の中央値、又は補正用内因性miRNA発現量測定値の中央値を底が２の対数に変換した対数値を意味する。中央値の場合は、測定値の対数変換を先に行なっても後に行なっても同じ値が得られる。
　平均値及び中央値は、実際に測定対象とした複数の補正用内因性miRNAの全ての測定値を用いて求めたものであってもよいし、該複数の補正用内因性miRNAのうちから抽出された一部の測定値を用いて求めたものであってもよい。例えば、マイクロアレイに搭載されている補正用内因性miRNA捕捉プローブで得られた全ての補正用内因性miRNAの測定値を用いて求めてもよいし、全補正用内因性miRNA捕捉プローブのうちの一部（例えば、マイクロアレイに搭載されている補正用内因性miRNA捕捉プローブが１０種であったとすると、そのうちの３種）を抽出して求めてもよい。また、１種の補正用内因性miRNAに対して複数スポットされている、補正用内因性miRNA捕捉プローブから得られる測定値であってもよい。例えば、比較解析すべき全ての検体に共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNA捕捉プローブ固定化領域のみを抽出して、補正用内因性miRNAの代表値を取得することができる。
　次いで、代表値取得工程で得られた各検体の補正用内因性miRNAの代表値と、補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値とを用いて、標的miRNAの発現量の補正に用いる補正係数を取得する（補正係数取得工程）。この補正係数取得工程には、下記の補正係数取得工程－１又は補正係数取得工程－２の工程を適用しうる。
＜補正係数取得工程－１＞
　補正係数取得工程－１は、補正用内因性miRNAの代表値と基準値との差を利用する方法である。本工程には、下記の１－１．基準検体取得法、又は１－２．固定数値補正法を適用し得る。
１－１．基準検体取得法
　miRNAの検出対象とする複数の体液検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの１又はそれ以上の検体（第２以降の検体）が、「補正される検体」となる。
　なお、本明細書において、「第２以降の検体」という語には、第２の検体も包含される。例えば、比較すべき複数の検体が２つであれば、補正される検体は第２の検体のみであり、比較すべき複数の検体が３つであれば、補正される検体は第２の検体及び第３の検体の２つである。
　この方法では、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を「基準値」とする。当該基準値と、第２以降の各検体（補正される検体）の補正用内因性miRNAの代表値との差を、当該第２以降の各検体のための補正係数として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。
　具体的には、補正係数は、式１又は式１’で求められる。
　ｃ1-1＝（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））
　　　　－（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）　・・・式１
　ｃ1-1’＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
　　　　　－（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））　・・・式１’
　例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式２又は式２’で求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　ここで、式２、式２’中、
　ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
　Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
　Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
　プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
　式２及び式２’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
１－２．固定数値補正法
　補正用内因性miRNAの代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値と、各検体由来の補正用内因性miRNAの代表値との差を得て、この差を補正係数として利用する。当該方法では、この固定した数値を「基準値」として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。なお、この場合、１－１．に示した「基準検体」は存在しないので、miRNAの検出対象とする複数の検体すべてが、「補正される検体」となる。
　具体的には、補正係数は、式３又は式３’で求められる。
　ｒ1-2＝（固定数値(基準値)）
　　　　－（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）　・・・式３
　ｒ1-2'＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
　　　　－（固定数値(基準値)）　・・・式３’
　例えば、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式４又は式４’で求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　ここで、式４、式４’中、
　αは基準値、
　ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
　Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
　プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
　式２及び式２’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
　固定数値補正法で基準値として用いる固定数値は、少なくとも１回の比較解析において、全ての検体に対して一貫して同一の数値を使用する限り、いかなる数値（ただし０以外）を用いてもよい。同一の発現測定システムを使用し、かつ、常に同一の数値を固定数値として使用することとすれば、別の日に発現量の測定を行なった体液検体の間でも比較解析が可能である。特に限定されないが、固定数値は、補正係数の取得に用いる１又は複数の補正用内因性miRNAが一般的にとり得る発現量の数値を採用し得る。発現量の測定に使用するシステムによってそのような一般的にとり得る数値は変動し得るため、使用するシステムに応じて固定数値は自由に選択できる。
　例えば、１種類の補正用内因性miRNAを用いる場合、比較解析対象の複数の体液検体における当該補正用内因性miRNAの発現量の平均値を求め、これを固定数値として利用してもよい。３種類の補正用内因性miRNAを用いる場合、複数の体液検体におけるこれら３種のmiRNA全ての発現量の平均値を求め、これを固定数値として利用してもよい。また、多数の体液検体を用いて予め固定数値を定めておき、この固定数値をその後の解析に繰り返し使用してもよい。
＜補正係数取得工程－２＞
　補正係数取得工程－２は、補正用内因性miRNAの代表値と基準値との比を利用する方法である。本工程には、下記の２－１．基準検体取得法、又は２－２．固定数値補正法を適用し得る。
２－１．基準検体取得法
　miRNAの検出対象とする複数の検体の中から任意に１検体（第１の検体）を選択し、これを「基準検体」とする。残りの第２以降の検体が、「補正される検体」となる。
　この方法では、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を「基準値」とし、当該基準値と、第２以降の各検体（補正される検体）の補正用内因性miRNAの各代表値との比を、当該第２以降の各検体のための補正係数として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。
　具体的には、補正係数は、式５又は式５’で求められる。
　ｃ2-1＝（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））
　　　　　／（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）　・・・式５
　ｃ2-1'＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
　　　　　　／（基準検体の補正用内因性miRNAの代表値（基準値））　・・・式５’
　例えば、マイクロアレイを用いて発現量の測定を実施し、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、第２の検体のための補正係数は、式６又は式６’で求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
　ここで、式６、式６’中、
　ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
　Ａｊは、基準検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
　Ｘｊは、第２の検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
　プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
　式６及び式６’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
２－２．固定数値補正法
　補正用内因性miRNAの代表値について、すべての検体において一定の数値をとるものとあらかじめ仮定する方法である。すなわち、固定した数値に対する、各検体由来の補正用内因性miRNAの代表値の比を得て、この比を補正係数として利用する。当該方法では、この固定した数値を「基準値」として用いる。補正係数は、補正される検体の数だけ取得されることになる。なお、この場合、２－１．に示した「基準検体」は存在しないので、miRNAの検出対象とする複数の検体すべてが、「補正される検体」となる。
　具体的には、補正係数は、式７又は式７’で求められる。
　ｒ2-2＝（固定数値（基準値））
　　　　／（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）　・・・式７
　ｒ2-2'＝（補正される検体の補正用内因性miRNAの代表値）
　　　　　／（固定数値（基準値））　・・・式７’
　例えば、補正用内因性miRNAの代表値として平均値を用いる場合、補正される検体のための補正係数は、式８又は式８’で求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
　ここで、式８、式８’中、
　αは固定数値、
　ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数、
　Ｙｊは、検体における、ｊ番目（１≦ｊ≦ｎ）の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値、
である。
　プローブが補正用内因性miRNAと１対１対応である場合、ｎは、支持体上の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブがターゲットとする補正用内因性miRNAの数に等しい。
　式８及び式８’においては、ｎに代えて、比較すべき全ての検体で共通して有効判定陽性であった補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域の総数ｎ’を用いることもできる。
　ここで基準値として用いる「固定数値」の詳細は、「１－２．固定数値補正法」における固定数値と同様である。
　次いで、補正係数取得工程－１又は補正係数取得工程－２で得られた補正係数を用いて、補正工程－１又は補正工程－２の方法を利用して、補正される検体における標的miRNAの発現量の補正を行う。
＜補正工程－１＞
　補正工程－１は、補正係数取得工程－１で得られた補正係数を用いて標的miRNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的miRNAの発現量に補正係数を加算又は該発現量から補正係数を減算することによって補正を行なう。本工程には、補正係数取得工程－１の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
１－１．基準検体取得法
　第２以降の検体における標的miRNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的miRNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（ｃ２1-1又はｃ２1-1’）を使用し、第３の検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（ｃ３1-1又はｃ３1-1’）を使用する。
　補正係数として、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値から第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式１の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値に補正係数を加算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目のmiRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式９によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
　これとは逆に、補正係数として、第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値から、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式１’の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値から補正係数を減算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式９’によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　ここで、Ｗｉの定義は上記式９に同じである。
　第２の検体において測定された標的miRNA発現量を補正するのであれば、当該第２の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値にｃ２を加算するか、又はｃ２’を減算すればよい。第３以降の検体についても同様である。なお、基準検体とした第１の検体の代表値と基準値との差は当然０であるが、プログラムの構成上、第１の検体の標的miRNA発現量に０を加算又は減算するという計算を実施しても差し支えない。
１－２．固定数値補正法
　標的miRNA発現量の補正は、代表値と固定数値（基準値）との差によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ1-2又はｒ1-2’）を使用する。
　補正係数として、基準値から検体の補正用内因性miRNAの代表値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式３の場合には、検体における各標的miRNAの発現量の測定値の対数値に補正係数を加算することにより、各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１０によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
　これとは逆に、補正係数として、検体の補正用内因性miRNAの代表値から固定数値を減算した差を用いる場合、すなわち上記式３’の場合には、検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値から補正係数を減算することにより、各検体についての標的miRNA発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１０’によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　Ｗｉの定義は上記式１０に同じである。
＜補正工程－２＞
　補正工程－２は、補正係数取得工程－２で得られた補正係数を用いて標的miRNAの発現量の補正を行なう方法であり、標的miRNAの発現量を補正係数で除算、又は該発現量に補正係数を乗算することによって補正を行なう。本工程にも、補正係数取得工程－２の基準検体取得法と固定数値補正法にそれぞれ対応した２通りの補正方法がある。
２－１．基準検体取得法
　第２以降の検体における標的miRNAの発現量の補正は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、第２の検体について標的miRNAの発現量を補正する場合には、第２の検体のための補正係数（ｃ２2-1又はｃ２2-1’）を使用し、第３の検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、第３の検体のための補正係数（ｃ３2-1又はｃ３2-1’）を使用する。
　補正係数として、補正される第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式５の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値に補正係数を乗算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１１によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000013
　ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
　これとは逆に、補正係数として、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式５’の場合には、第２以降の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値を補正係数で除算することにより、第２以降の各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目のmiRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１１’によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
　ここで、Ｗｉの定義は上記式１１に同じである。
　第２の検体において測定された標的miRNA発現量を補正するのであれば、当該第２の検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値にc22-1を除算するか、又はc22-1'を乗算すればよい。第３以降の検体についても同様である。式５及び式１１の手順でも、式５’及び式１１’の手順でも、最終的に得られる補正済み標的miRNAの発現量Ｅｉの値は同じである。なお、基準検体とした第１の検体の代表値と本方法における固定数値（基準値）との比は当然１であるが、プログラムの構成上、第１の検体の標的miRNA発現量に１を乗算又は該標的miRNA発現量を１で除算するという計算を実施しても差し支えない。
２－２．固定数値補正法
　標的miRNA発現量の補正は、固定数値（基準値）との比によって得られた補正係数をそれぞれ用いて実施する。つまり、ある検体について標的miRNA発現量を補正する場合には、その検体のための補正係数（ｒ2-2又はｒ2-2’）を使用する。
　補正係数として、検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、基準値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式７の場合には、検体における各標的miRNAの発現量の測定値の対数値に補正係数を乗算することにより、各検体についての標的miRNAの発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１２によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
　ここで、Ｗｉは、ｉ番目のmiRNAを捕捉するためのプローブ固定化領域からのシグナル測定値である。
　これとは逆に、補正係数として、検体の補正用内因性miRNAの代表値を分母とし、基準値を分子とした比を用いる場合、すなわち上記式７’の場合には、検体における各標的miRNA発現量の測定値の対数値を補正係数で除算することにより、各検体についての標的miRNA発現量の補正が実施される。この場合の補正を式で表すと、ある「補正される検体」におけるｉ番目の標的miRNAの補正済み発現量Ｅｉは、下記式１２’によって求めることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000016
　ここで、Ｗｉの定義は上記式１２に同じである。
　＜比較解析工程＞
　補正済みの標的miRNA発現量により、複数の体液検体間で標的miRNA発現量を対比する。基準検体取得法により補正が実施される場合には、基準検体とした第１の検体の標的miRNA発現量は補正を受けていないため、例えば第１の検体と第２の検体との間の対比は、補正されていない第１の検体の標的miRNA発現量と、補正済みの第２の検体の標的miRNA発現量との間での対比となるが、対比する検体のうちの少なくとも１つは必ず補正された検体となる。従って、「補正済みの標的miRNA発現量により、複数の体液検体間で標的miRNA発現量を対比する」という語には、補正されていない基準検体と補正された他の検体との間で対比する態様も包含される。
　比較解析工程自体は、従来法と同様に行なうことができる。例えば、スキャッタープロットと呼ばれる発現量データの散布図として比較解析結果を表すことができる。比較すべき検体が３つの場合、例えば、３つのうちのいずれか１つの検体と残りの各検体とを比較解析したスキャッタープロットを２つ（例えば、第１の検体－第２の検体間のスキャッタープロットと第１の検体－第３の検体間のスキャッタープロット）作成すればよく、必要に応じて、さらに残りの２つの検体間（前述の例の場合には、さらに第２の検体－第３の検体間）で比較解析したスキャッタープロットを作成してもよい。４つ以上の検体の比較解析も同様に行なうことができる。なお、３検体の比較解析であれば、３次元的にスキャッタープロットを作成することもできる。基準検体取得法の場合であっても、必ずしも基準検体と他の２検体とをそれぞれ比較しなければならないわけではなく、例えば第２の検体－基準検体間の比較と第２の検体－第３の検体間の比較を行なうこととしてもよい。
　また、補正済みの標的miRNA発現量により、いずれか１つの検体と残りの他の検体との間で標的miRNAの発現量の差を計算し、その差をもって対数化された変化倍率（fold-change）として比較解析結果を表してもよい。例えば、基準検体における標的miRNAの発現量（基準検体取得法の場合）又は第１の検体における補正済みの標的miRNAの発現量（固定数値補正法の場合）と、第２以降の検体における補正済みの標的miRNAの発現量との差を計算してよい。この場合も上述の場合と同様に、第１の検体と他の検体との差を計算することに限定されず、第２以降の検体のいずれか１つと他の検体との差を計算することとしてもよい。
　本発明のmiRNA発現解析装置は、上記本発明の比較解析法を実施する装置であって、
　複数の体液検体について測定された、標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
　各体液検体について、１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段；
　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
　前記補正係数取得手段によって取得された各補正係数を用いて、当該各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
　補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
を含む。
　ある１つの態様において、基準値は、任意に選択された第１の検体（基準検体）の補正用内因性miRNAの代表値であり、第２以降の体液検体において測定された標的miRNAの発現量が補正される。すなわち、この態様において、本発明のmiRNA発現解析装置は、
　複数の検体のそれぞれについて、同時に測定された複数の標的miRNAの発現量及び１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段と；
　各体液検体について、補正用内因性miRNAの発現量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
　任意に選択された第１の検体を基準検体とし、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値を基準値として、当該基準値と残りの第２以降の検体の補正用内因性miRNA代表値との差又は比を、当該第２以降の検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
　補正係数取得手段によって取得された第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて、第２以降の検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段と；
　補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
を含む。
　別の態様において、基準値は、補正用内因性miRNA発現量に関して任意に定められた固定数値であり、第１の検体を含む全ての検体について、標的miRNA発現量の補正が行われる。すなわち、この態様において、本発明のmiRNA発現解析装置は、
　複数の体液検体のそれぞれについて、同時に測定された複数の標的miRNAの発現量及び１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段と；
　各検体について、補正用内因性miRNAの発現量の測定値から、代表値、好ましくは対数値で表された代表値を取得する、代表値取得手段と；
　固定数値を基準値として、当該基準値と各検体の補正用内因性miRNAの代表値との差又は比を、当該検体のための補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段と；
　補正係数取得手段によって取得された各検体のための補正係数をそれぞれ用いて、各検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段と；
　補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段と
を含む。
　本発明の解析装置の一例の構成の概略を示すブロック図を図２に示す。本発明の解析装置１０は、入力部１１０、表示部１２０、出力部１３０、記憶部１４０、制御部１５０、変換部１６０、解析部１７０を具備する。また、図３には、本発明による標的miRNAの発現量の補正処理のフローチャートの一例を示す。
　入力部１１０は、解析装置１０の動作に関わる情報を入力する手段である。キーボード等の従来公知の入力手段を好ましく用いることができる。マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションアッセイにより得られる発現量データは、例えば、本発明の装置とは別のスキャナー等の読取手段で読み取られ、数値データに変換された後、入力部１１０から当該数値データを解析装置１０に入力される。あるいは、スキャナー等の読取手段が、本発明の解析装置１０に含まれていてもよい（図示せず）。
　入力部１１０から入力された発現量データ、又は解析装置１０に組み込まれた読取手段によって読み取られ数値化された発現量データは、記憶部１４０に記憶される。この時、記憶部１４０は、複数の検体のそれぞれについて、同時に測定された複数の標的miRNAの発現量及び１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段として働く。
　記憶部１４０に格納された各検体の標的miRNA及び補正用内因性miRNAの発現量の測定値データは、変換部１６０により、底が２の対数に変換される。次いで、解析部１７０により、各検体について、対数変換された補正用内因性miRNAの発現量の測定値の代表値が取得される。代表値は、比較解析法についての説明で述べた通り、例えば１若しくは複数の補正用内因性miRNA発現量の平均値若しくは中央値（１種類の補正用内因性miRNAのみを補正に用いる場合でも、それを測定するためのプローブ固定化領域がアレイ上に複数個存在する場合には、代表値が平均値又は中央値となり得る）、又は特定の１種類の補正用内因性miRNAの測定値であり得る。
　代表値が取得された後、解析部１７０により、基準検体の補正用内因性miRNAの代表値と第２以降の検体の補正用内因性miRNAの代表値との差又は比が算出され、当該第２以降の検体のための補正係数がそれぞれ取得される。補正係数の取得の詳細は、比較解析法の＜補正係数取得工程＞で述べた通りである。なお、プログラムの構成上、基準検体とされた第１の検体についても補正係数０（差を算出する場合）又は補正係数１（比を算出する場合）を取得する構成としても差し支えない。
　装置１０において、基準検体の選出は、装置１０を操作する者が入力部１１０から任意の１検体を指定することにより行なわれてよい。あるいは、装置１０が自動的に基準検体となる１検体を選出してもよい。例えば、入力部１１０からデータが入力され、記憶部１４０に最初にデータが記憶された検体が、装置１０によって基準検体として選出され得る。この基準検体の選出又は入力のステップは、図３では便宜的に代表値取得工程（Ｓ－３）の後に位置されているが、これに限定されず、より早いステップで、例えばデータの格納時に実行されてもよい。
　次いで、解析部１７０は、第２以降の検体のための補正係数をそれぞれ用いて、第２以降の検体で測定された標的miRNAの発現量データを補正する。補正操作の詳細は、比較解析法の＜補正工程＞で述べた通りである。なお、プログラムの構成上、基準検体とされた第１の検体の標的miRNA発現量データについても、補正係数０（差を算出する場合）又は補正係数１（比を算出する場合）を用いた補正操作を実行することとしても差し支えない。
　次いで、解析部１７０により、基準検体の標的miRNA発現量と、第２以降の検体の補正済み標的miRNA発現量との対比が行なわれる。対比の結果は、出力部１３０によって、表示部１２０に出力され、表示される。さらに、プリンター等の出力装置や記録媒体等に対比結果が出力され得る。さらにまた、出力部１３０は、ネットワークを介して装置外部に存在するデータベース等の外部記憶装置に対比解析結果を出力するように構成することもできる。
　記憶部１４０は、複数の標的miRNAの発現量及び複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶するほか、上記の各工程で生じる中間の解析結果も適宜記憶する。
　装置１０の上記した各種動作は、制御部１５０によって制御される。具体的には、図２の破線矢印で示されるように、入力部１１０、表示部１２０、出力部１３０、記憶部１４０、制御部１５０、変換部１６０、解析部１７０の各手段に対して、制御部１５０から制御情報が出力され、この制御情報に基づいて各手段が連携して動作し、装置１０全体が動作する。
　また、当該解析装置においては、基準検体の補正用内因性miRNA代表値を基準値として利用する代わりに、装置１０において、あらかじめ指定した固定数値を変換部１６０等に登録しておき、基準検体における補正用内因性miRNAの発現量の代表値に代わる基準値として利用してもよい。この場合の方法の詳細は、比較解析法の＜補正係数取得工程＞、＜補正工程＞に述べたとおりである。
　また、本発明は、コンピュータを上記した解析装置として機能させるためのプログラムを提供する。該プログラムは、具体的には、コンピュータを上記した各手段（すなわち、記憶手段、代表値取得手段、補正係数取得手段、補正手段、及び出力手段）として機能させるためのプログラムである。あるいはまた、本発明は、コンピュータに上記した本発明の比較解析方法の各工程を実行させるためのプログラムを提供する。比較解析方法には、上記した測定工程、代表値取得工程、補正係数取得工程、及び補正工程が含まれ、さらに、補正済みの標的miRNA発現量により、複数の体液検体間で標的miRNA発現量を対比する比較解析工程が含まれ得る。これらのプログラムは、マイクロアレイ等により標的miRNAの発現量と同時に測定された補正用内因性miRNAの発現量のデータを用いて、標的miRNAの発現量の補正をコンピュータに実行させるプログラムである。
　さらにまた、本発明は、上記いずれかのプログラムを記録した、コンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。
　「記録媒体」は、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ROM、EPROM、EEPROM、CD-ROM、MO、DVD等の任意の「可搬用の物理媒体」（非一過性の記録媒体）であり得る。あるいは、LAN、WAN、インターネットに代表される、ネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」であり得る。
　「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、OS（Operating System）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
　本発明は、複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブと複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップを提供する。当該チップについての好ましい条件は、本発明の比較解析方法において説明した通りである。
　本発明においては、以下に説明する配列番号１～１０に示すmiRNAの少なくとも１つを、補正用内因性miRNAとして使用する。
　配列番号１は、miRBaseにAccession No. MIMAT0023710で登録されているhsa-miR-6085の塩基配列である。本明細書において、「miR-6085遺伝子」又は「miR-6085」という用語は、配列番号１に記載のhsa-miR-6085やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6085遺伝子は、Voellenkle Cら、2012年、RNA、18巻、p.472-484に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号２は、miRBaseにAccession No. MIMAT0022941で登録されているhsa-miR-1227-5pの塩基配列である。本明細書において、「miR-1227-5p遺伝子」又は「miR-1227-5p」という用語は、配列番号２に記載のhsa-miR-1227-5pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-1227-5p遺伝子は、Berezikov Eら、2007年、Molecular Cell、28巻、p.328-336に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号３は、miRBaseにAccession No. MIMAT0013802で登録されているhsa-miR-2861の塩基配列である。本明細書において、「miR-2861遺伝子」又は「miR-2861」という用語は、配列番号３に記載のhsa-miR-2861やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-2861遺伝子は、Li Hら、2009年、Journal of Clinical Investigation、119巻、p.3666-3677に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号４は、miRBaseにAccession No. MIMAT0004609で登録されているhsa-miR-149-3pの塩基配列である。本明細書において、「miR-149-3p遺伝子」又は「miR-149-3p」という用語は、配列番号４に記載のhsa-miR-149-3pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-149-3p遺伝子は、Lagos-Quintana Mら、2002年、Current Biology、12巻、p.735-739に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号５は、miRBaseにAccession No. MIMAT0018987で登録されているhsa-miR-4463の塩基配列である。本明細書において、「miR-4463遺伝子」又は「miR-4463」という用語は、配列番号５に記載のhsa-miR-4463やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-4463遺伝子は、Jima DDら、2010年、Blood、116巻、p.e118-e127に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号６は、miRBaseにAccession No. MIMAT0019045で登録されているhsa-miR-4508の塩基配列である。本明細書において、「miR-4508遺伝子」又は「miR-4508」という用語は、配列番号６に記載のhsa-miR-4508やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-4508遺伝子は、Jima DDら、2010年、Blood、116巻、p.e118-e127に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号７は、miRBaseにAccession No. MIMAT0023715で登録されているhsa-miR-6090の塩基配列である。本明細書において、「miR-6090遺伝子」又は「miR-6090」という用語は、配列番号７に記載のhsa-miR-6090やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6090遺伝子は、Yoo JKら、2012年、Stem Cells and Development、21巻、p.2049-2057に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号８は、miRBaseにAccession No. MIMAT0027450で登録されているhsa-miR-6775-5pの塩基配列である。本明細書において、「miR-6775-5p遺伝子」又は「miR-6775-5p」という用語は、配列番号８に記載のhsa-miR-6775-5pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6775-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Research、22巻、p.1634-1645に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号９は、miRBaseにAccession No. MIMAT0027506で登録されているhsa-miR-6803-5pの塩基配列である。本明細書において、「miR-6803-5p遺伝子」又は「miR-6803-5p」という用語は、配列番号９に記載のhsa-miR-6803-5pやその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-6803-5p遺伝子は、Ladewig Eら、2012年、Genome Research、22巻、p.1634-1645に記載される方法によって得ることができる。
　配列番号１０は、miRBaseにAccession No. MIMAT0023252で登録されているhsa-miR-5787の塩基配列である。本明細書において、「miR-5787遺伝子」又は「miR-5787」という用語は、配列番号１０に記載のhsa-miR-5787やその他生物種ホモログもしくはオーソログなどを包含する。hsa-miR-5787遺伝子は、Yoo Hら、2011年、Biochem Biophys Res Commun、415巻、p.567-572に記載される方法によって得ることができる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　以下の過程により、本発明で用いる補正用内因性miRNAを選択した。
　（DNAマイクロアレイ）
　東レ株式会社製の"3D-Gene" human miRNA oligo chip（miRBase release 20対応）を用いて以下の実験を行なった。
　（検体RNAの調製）
　検体RNAとして、健常ヒト血清１５７検体より、"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample kitを用いて抽出したRNAを用いた。得られた検体RNAを、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識した。標識した検体RNAは、"3D-Gene" miRNA chip（東レ社）の標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションと洗浄を行った。反応済みのDNAマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナー（東レ社）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。
　（miRNAシグナル値の取得）
　DNAマイクロアレイから得られたmiRNAのシグナル値を、底が２の対数に変換し、RNA抽出及び標識時に添加した外部標準核酸による実験誤差補正を行った。
　（補正用内因性miRNAの取得）
　得られた実験誤差補正済みの全157検体のmiRNAシグナル値について、geNorm法による検体間最少変動miRNAの抽出を行った。GeNorm法は、Vandesompeleらによって提唱された定量RT-PCR法における内因性ハウスキーピング遺伝子（リファレンス遺伝子）の探索法である（Genome Biology 2002, 3:research0034-research0034.11）。対象とする検体に特有の内因性ハウスキーピング遺伝子であるmRNAを選抜する方法として用いられる。具体的には同一の検体における、すべての検出対象の遺伝子のシグナル値について、２つの遺伝子のシグナル値の比を総当たりで計算する。次に、すべての遺伝子の組合せで得られた比の値（Ａ）について検体間での標準誤差を計算する。次に、特定の遺伝子について、他の遺伝子との関係で得られた標準誤差（Ｖ）の総和（Ｍ）を計算する。このＭ値が小さい遺伝子が、すぐれた内因性ハウスキーピング遺伝子とされる。
　一方で、上述の計算法によって得られるＡ及びＶは、シグナル値が小さいほど、小さな値となり、見かけ上すぐれた内因性ハウスキーピング遺伝子となるとされる。今回用いたDNAマイクロアレイは、miRBase release 20に登録された全miRNAを網羅的に検出するため、このデータを用いてgeNorm法を実施すると、シグナル値が小さいmiRNAを優先的に選択してしまう。このような現象から、これまでgeNorm法によってDNAマイクロアレイ検出における内因性ハウスキーピング遺伝子を選択することは避けられてきた。
　本実施例では、DNAマイクロアレイで検出されたmiRNAのうち、シグナル値が全検体の半数以上で６４を超える、安定して検出されるmiRNAのみをgeNorm法の適用の対象として選択した。さらにgeNorm法の特性として、同一検体内での遺伝子発現量比に基づいて内因性ハウスキーピング遺伝子を選択していることから、大きく発現パターンが異なる検体間での安定的発現量を示す遺伝子選択が難しいことを踏まえ、前もって実験誤差補正済みの全157検体の各miRNAシグナル値についてCV（標準誤差／平均値）を得て、CVが0.1以下であるmiRNAのみをgeNorm法の対象として選択した。その結果、2555種のmiRNA検出用プローブから得られたシグナル値のうち、281種のmiRNAを検出するプローブのシグナル値をgeNorm法の対象とすることが適当と考えられた。
　実際にgeNorm法を適用した281種のmiRNAから、M値が小さい内因性ハウスキーピング遺伝子、すなわち補正用内因性miRNAとして利用可能である10種を選択した。この10種の補正用内因性miRNAの配列番号、miRNAの名前、miRBaseに登録されたMIMAT番号、geNormで計算したM値、塩基配列、及び配列中のグアニン・シトシンの割合（GC％）を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　DNAマイクロアレイによるmiRNAの検出は、標的のmiRNAとその標的miRNAを捕捉するためのプローブによる核酸二重鎖を形成するハイブリダイズ法によってなされるため、核酸二重鎖を安定化させるグアニン及びシトシンの含有量が高い配列が、特に安定的にDNAマイクロアレイによって検出されることが予想される。すなわち、グアニン及びシトシンの含有量が高い配列が内因性ハウスキーピング遺伝子として優先的に選択されると一般に想定される。しかしながら、表１に示すように、必ずしもgeNorm法によって選択された内因性ハウスキーピング遺伝子（補正用内因性miRNA）は、グアニン及びシトシンの含有率が高いとは言えなかった。逆にグアニン及びシトシンの含有率が高いmiRNAが優先的に内因性ハウスキーピング遺伝子（補正用内因性miRNA）となるという現象も見られなかった。
　＜実施例２＞
　選択した補正用内因性miRNAをそれぞれ単独で用いて、複数の体液検体の標的RNAの発現量補正を行った。
　RNAの物質的不安定さから、RNA発現量を測定する場合、その品質が違う、すなわちRNAの分解度が異なる検体間での、絶対的な発現量比較を要求される場合がしばしばある。検体が体液の場合は特に、長時間室温に置かれた検体中の標的miRNA発現量を測定することで何等かの結果を得ようとする場合が想定される。
　この時、血清中に含まれる特定の補正用内因性miRNAの量を基準としてRNAの分解度に応じた補正を行うことで、RNA品質に関わらず、miRNAの発現プロファイル（相対的なmiRNAの発現量比）について、絶対的な検体間比較が可能になると考えられる。
　本実施例では、ヒトから採取した血清を各種条件で保存することによって、血清中に含まれるmiRNAの品質がさまざまなレベルにある血清を作成し、これらの血清由来の抽出RNA検体の測定値に対して本発明の補正方法を適用した。
　（DNAマイクロアレイ）
　東レ株式会社製の"3D-Gene" human miRNA oligo chip（miRBase release 20対応、東レ社）を用いて以下の実験を行なった。
　（検体RNAの調製）
　ヒト血清を採血、血清分離後に下記２種の条件に静置し、血清に含まれるRNAの品質を変化させた。２種の条件を以下に示す。１：血清分離後６時間室温に静置し、RNA抽出を行う。２：血清分離後２４時間２５℃に静置し、RNA抽出を行う。それぞれの条件で作成された血清から"3D-Gene" RNA extraction reagent from liquid sample kit RNAを用いて全RNAを抽出し、検体RNAとした。
　得られた検体RNAをそれぞれ、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識した。標識した検体RNAは、"3D-Gene" human miRNA oligo chip（東レ社）の標準プロトコールに従い、ハイブリダイゼーションと洗浄を行った。反応済みのDNAマイクロアレイは、マイクロアレイスキャナー（東レ社）を用いて蛍光シグナルを検出した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をAUTO設定にした。
　（miRNAシグナル値の補正）
　DNAマイクロアレイから得られたmiRNAのシグナル値を、底が２の対数に変換したシグナル値の分布（すなわち未補正の発現量シグナル値）を図４Ａに示す。これに対して、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAのシグナル値と、あらかじめ別に設定した固定数値である基準値によって補正された、補正済みシグナル値の分布を図４Ｂ～Ｋに示す。図中、Day-0（破線）が条件１の検体RNAであり、Day-1_25℃（実線）が条件２の検体RNAである。
　ここで、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAのシグナル値による補正は以下に示される方法によって行った。
　配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAについて、それぞれ基準値として用いる固定数値を設定した。さらに、各検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAのシグナル値を底が２の対数に変換し、この変換後のシグナル値を代表値として基準値との比をとり（基準値／代表値）、補正係数とした。補正係数は、配列番号１～１０の補正用内因性miRNAそれぞれについて設定されたことになる。これらの補正係数を、補正用内因性miRNAごとに、各検体のすべてのmiRNAシグナル値に乗算することによって補正を行った。
　その結果、図４Ｂ～Ｋに示される通り、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAのいずれを単独で用いても、条件を変えた２種の検体の発現プロファイルを同一化させることが可能であった。
　＜実施例３＞
　実施例２に示すように、配列番号１～１０の補正用内因性miRNAは、それぞれ単独でも十分な標的miRNAの発現量の補正効果を持つが、さらにこれらを組み合わせることによって、実験の不備等による一部の補正用内因性miRNAデータの損失が起こった場合によっても、これを補完できることが想定される。そこで、複数の補正用内因性miRNAを組み合わせて用いて標的miRNAの発現量の補正を行ない、補正の効果を確認した。検体は実施例２と同様のものを用いた。
　配列番号２、４及び５の補正用内因性miRNAのシグナル値を底が２の対数に変換し、この変換後のシグナル値の平均値又は中央値を得て、代表値とした。基準値としては固定数値を用いた。実施例２で調製した２種の検体を含む複数の血清RNA検体における３種類の補正用内因性miRNAの全ての発現量（対数変換後シグナル値）の平均値を求め、この平均値を固定数値（基準値）として用いた。各検体について、補正用内因性miRNAの代表値と基準値の比をとり（基準値／代表値）、当該検体のための補正係数とした。この補正係数を、対応する各検体の全ての標的miRNAシグナル値に乗算することにより、標的miRNAシグナル値の補正を行った。
　図５は、補正用内因性miRNAの発現量の代表値として対数変換後シグナル値の平均値を用いた場合の、標的miRNAの補正済みシグナル値の分布である。配列番号１～１０の補正用内因性miRNAをそれぞれ単独で用いて補正を行った実施例２と同様、複数の補正用内因性miRNAを組み合わせて用いて補正を行なった場合でも、各検体の標的miRNAの発現プロファイルを同一化させることが可能であった。
　＜実施例４＞
　実施例３に示すように、配列番号１～１０の補正用内因性miRNAは、これらを組み合わせることによっても補正に有用である。この補正効果について、配列番号１～１０のいずれを組み合わせても同様の効果を示すことを確認した。検体は実施例２と同様のものを用いた。
　配列番号２、３、４、５及び６の補正用内因性miRNAのシグナル値を底が２の対数に変換し、各検体について、任意の３種の補正用内因性miRNA変換後のシグナル値の平均値を得て、当該検体における代表値とした。基準値は固定数値とし、代表値取得に用いた３種の補正用内因性miRNAの対数変換後シグナル値の、実施例２で調製した２種の検体を含む複数の血清RNA検体での平均値を固定数値（基準値）として用いた。各検体について、代表値と基準値の比をとり（基準値／代表値）、当該検体のための補正係数とした。この補正係数を、対応する各検体の全ての標的miRNAシグナル値に乗算することによって、各検体のmiRNA発現量の補正を行った。
　補正済みシグナル値の分布を図８に示す。図８Ａは未補正の発現量シグナル値の分布であり、図８Ｂ～Ｉが補正済み発現量シグナル値の分布である。配列番号１～１０の補正用内因性miRNAをそれぞれ単独で用いて補正を行った実施例２と同様、各検体の標的miRNAの発現プロファイルを同一化させることが可能であった。
　＜比較例１＞
　実施例１の検討を行ったとき、血清RNAから得られた検体RNAをそれぞれ、"3D-Gene" miRNA labeling kit（東レ社）を用いて標識するステップにおいて、外部から添加する基準物質として２種の合成RNA配列（それぞれ20 mer、スパイクコントロール１及びスパイクコントロール２と称する）を添加した。これらの合成RNA配列は、血清由来のmiRNAと同様に蛍光標識され、"3D-Gene" human miRNA oligo chip（東レ社）によってシグナル量が検出された。そこで、スパイクコントロール１及びスパイクコントロール２のそれぞれ８点、計１６点のスポットから得られたシグナル値を底が２の対数に変換し、その中央値を得て、代表値とした。この代表値と、あらかじめ設定した固定数値（基準値）の比をとり（基準値／各検体の代表値）、各検体用の補正係数を得た。この補正係数を、各検体のすべてのmiRNAシグナル値に乗算することによって補正を行った。補正前のシグナル値の分布を図６Ａに、補正後のシグナル値の分布を図６Ｂに示す。標識時に外部より添加されたスパイクコントロールによる補正では、検体中の標的miRNAのシグナル値は十分に補正されていないことが示された。
　＜比較例２＞
　これまで先行例によってmiRNAの発現量補正用として示されている、let-7d-5p、let-7g-5p、let-7i-5p、miR-16、miR-31、miR-223の、実施例２における発現量を表２に示す。has-miR-16-5p以外は、得られたシグナル値を底が２の対数に変換した場合、０～５の範囲のシグナルしか示さず、発現量が十分でないという理由で、全miRNAの発現量を補正するための基準には適していなかった。また、hsa-miR-16-5pで補正した場合の補正シグナル値の分布を図７に示す。hsa-miR-16-5pの発現量による補正では、検体中の標的miRNAのシグナル値は十分に補正されていないことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
１０　　装置
１１０　入力部
１２０　表示部
１３０　出力部
１４０　記憶部
１５０　制御部
１６０　変換部
１７０　解析部

Claims (13)

  1. 　複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析する方法であって、
    　複数の体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
    　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
    　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
    　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
    を含む、前記方法。
  2. 　前記補正工程では、
    (a)前記補正係数取得工程において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
    (b)前記補正係数取得工程において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
    (c)前記補正係数取得工程において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
    (d)前記補正係数取得工程において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
    により前記補正を行なう、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記基準値は、補正用内因性miRNA発現量に関して任意に定められた固定数値、又は、前記複数の体液検体から任意に選択された第１の体液検体について取得された補正用内因性miRNA発現量の代表値である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記測定工程が、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するための核酸プローブ及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をそれぞれシグナル強度測定値として得ることを含む、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記体液検体が、血液、血清又は血漿である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記代表値が、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNA発現量の測定値から算出された、対数値で表された平均値又は中央値である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　複数の体液検体における標的miRNAの発現量を比較解析するmiRNA発現解析装置であって、
    　複数の体液検体について測定された、標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
    　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
    　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
    　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
    　補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
    を含む、前記装置。
  8. 　前記補正手段は、
    (a)前記補正係数取得手段において、前記代表値から前記基準値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値から補正係数を減算すること、
    (b)前記補正係数取得手段において、前記基準値から前記代表値を減算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を加算すること、
    (c)前記補正係数取得手段において、前記代表値を前記基準値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値を補正係数で除算すること、又は
    (d)前記補正係数取得手段において、前記基準値を前記代表値で除算した値を補正係数として取得する場合、標的miRNAの発現量の測定値に補正係数を乗算すること、
    により前記補正を行う、請求項７に記載の装置。
  9. 　前記記憶手段に記憶される、複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値は、支持体上に固定化された複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブと、標識物質で標識された体液検体由来の核酸試料とを接触させてハイブリダイゼーションを行ない、標的miRNA及び前記１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量をシグナル強度測定値としてそれぞれ測定された値である、請求項７又は８に記載の装置。
  10. 　複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターに、
    　複数の各体液検体について、標的miRNAの発現量の測定及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定を同時に行なう、測定工程；
    　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の各測定値から代表値を取得する、代表値取得工程；
    　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、代表値取得工程で取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得工程；及び
    　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正工程
    を実行させるためのプログラム。
  11. 　複数の体液検体間で標的miRNAの発現量を比較解析するために、１又は複数のコンピューターを、
    　複数の各体液検体に含まれる標的miRNAの発現量の測定値及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値を記憶する記憶手段；
    　各体液検体について、配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAの発現量の測定値から代表値を取得する、代表値取得手段；
    　補正用内因性miRNAの発現量に関して任意に設定された基準値と、前記代表値取得手段によって取得された各体液検体の代表値との差又は比を、各体液検体のための標的miRNA発現量の補正係数としてそれぞれ取得する、補正係数取得手段；
    　各体液検体に対して取得された補正係数をそれぞれ用いて、各体液検体において測定された標的miRNAの発現量を補正する、補正手段；及び
    　補正済みの標的miRNA発現量により、少なくとも２つの体液検体の間で標的miRNA発現量を対比した結果を出力する出力手段
    として機能させるためのプログラム。
  12. 　請求項１０又は１１に記載のプログラムを記録した、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
  13. 　複数の標的miRNAを捕捉するためのプローブ及び配列番号１～１０に示す補正用内因性miRNAから選択される１又は複数の補正用内因性miRNAを捕捉するためのプローブが固定化された支持体を含む、miRNA発現解析用チップ。
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