BR112017003608B1 - MÉTODO PARA A ANÁLISE COMPARATIVA DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DE miRNA(S) ALVO(S) E CHIP PARA ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE miRNA - Google Patents

MÉTODO PARA A ANÁLISE COMPARATIVA DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DE miRNA(S) ALVO(S) E CHIP PARA ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE miRNA Download PDF

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Abstract

método para a análise comparativa do nível de expressão de mirna(s) alvo(s), dispositivo de análise da expressão de mirna, programa(s) para uma análise comparativa do(s) nível(eis) de expressão de mirna(s), meio de gravação legível por computador e chip para análise da expressão de mirna. é divulgado um método para a análise comparativa dos níveis de expressão de mirnas alvos entre uma pluralidade de amostras de fluido corporal. no método para a análise comparativa da presente invenção, os níveis de expressão de mirnas alvos em cada amostra de fluido corporal são corrigidos utilizando o(s) nível(eis) de expressão de mirna(s) endógeno(s) de correção que é(são) mensurado(s) simultaneamente com os níveis de expressão dos mirnas alvos na amostra. como mirna(s) endógeno(s) de correção, um ou mais mirnas selecionados a partir de 10 tipos específicos de mirnas endógenos de correção são utilizados. pela presente invenção, a análise comparativa dos mirnas alvos nas amostras de fluido corporal pode ser realizada com uma precisão maior do que por meio das técnicas convencionais.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção diz respeito a um método e um dispositivo para uma análise comparativa do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) contido(s) em uma pluralidade de amostras de fluido corporal.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] Um miRNA (microRNA) é transcrito como um RNA (precursor) que tem uma estrutura semelhante a um grampo de cabelo (hairpin-like) a partir do DNA genômico. Este precursor é clivado por uma enzima específica, a enzima de clivagem do dsRNA (Drosha, Dicer) possui atividade de clivagem de RNAase III, seguido pela conversão na forma de fita dupla e, em seguida, fita simples. Acredita-se que a incorporação da fita antisense, que é uma das fitas, em um complexo proteico denominado RISC ocorra subsequentemente, conduzindo a uma participação na supressão da tradução do mRNA. Assim, o miRNA toma diversas formas nas fases após sua transcrição. Portanto, ao visar (detectar) um miRNA, várias formas, incluindo a estrutura em forma de grampo (hairpin), a estrutura em fita dupla, e a estrutura em fita simples devem ser levadas em consideração. Um miRNA é constituído por um RNA de 15 a 25 bases, e a presença de miRNAs tem sido confirmada em vários organismos.
[0003] Nos últimos anos, foi sugerido que uma grande quantidade de miRNAs estão presentes, não só nas células, mas também nos líquidos corporais, tais como soro, plasma, urina, e líquor, que são amostras que não contém células, e os níveis de expressão de tais miRNAs em tais amostras podem ser biomarcadores para diversas doenças, incluindo os cânceres. Em junho de 2014 existiam, pelo menos, 2.500 tipos de miRNAs em humanos (miRBase release 20), e quando é utilizado um sistema de ensaio altamente sensível, tal como o microarranjo de DNA (DNA microarray), a expressão de mais de 1000 tipos de miRNAs entre estes citados pode ser detectada de maneira simultânea no soro ou plasma. Assim, estão sendo realizados estudos para encontrar biomarcadores em fluidos corporais, tais como soro, urina e líquor usando o método de microarranjo de DNA.
[0004] Por outro lado, sabe-se que, nos casos em que a análise da expressão do gene é realizada usando um microarranjo de DNA, os dados obtidos podem incluir alguns erros, dependendo da amostra, do examinador, e das condições experimentais. Assim, métodos de correção de dados para corrigir tais erros foram concebidos.
[0005] Os métodos utilizados para a correção são baseados no princípio de que, quando os dados de expressão para uma pluralidade de genes são tratados como um único aglomerado (cluster) a ser considerado como um grupo de dados de expressão gênica, o nível de expressão no grupo de dados de expressão gênica inteiro não é diferente entre as amostras. Exemplos de tais métodos incluem o método de normalização global, o método quantil, o método lowess, e o método de percentil 75.
[0006] Existem também métodos nos quais os genes específicos (por exemplo, beta-actina e GAPDH), cujos níveis de expressão são os mesmos entre as amostras, são utilizados para corrigir os dados a partir de cada amostra de tal modo que os valores detectados de tais genes se tornem constantes.
[0007] Como métodos para realizar a correção a fim de que os níveis de expressão de miRNAs específicos se tornem constantes, foram propostos métodos nos quais, entre os RNAs não codificantes expressos em amostras, RNAs constitutivos para controle interno (housekeeping) (U1 snoRNA, U2 snoRNA, U3 snoRNA, U4 snoRNA, U5 snoRNA, U6 snoRNA, 5S rRNA, e 5.8S rRNA), cujos níveis de expressão são referidos como sendo constantes entre as várias amostras, sejam utilizados para a correção (Documento Patentário 1 e Documento Patentário 2). Isto é, no Documento Patentário 1 e Documento Patentário 2, os resultados da detecção de miRNAs são corrigidos pela realização de uma operação na qual o valor detectado de 5S rRNA, cuja detecção é realizada ao mesmo tempo que a detecção do miRNA, torna-se constante entre todos amostras.
[0008] Por outro lado, diz-se que o microarranjo de DNA, um método em que são usados apenas tipos limitados de RNAs housekeeping para corrigir os dados, carece de precisão uma vez que um grande número de miRNAs são mensurados simultaneamente. Assim, foi proposto um método em que os níveis de expressão de uma pluralidade de mRNAs são mensurados ao mesmo tempo que miRNAs, e os níveis de expressão desta pluralidade de mRNAs são utilizados para corrigir os miRNAs (documento patententário 3). No documento patentário 3, os resultados de detecção do miRNA são corrigidos pela realização de uma operação em que os valores detectados de uma pluralidade de mRNAs, cuja detecção é realizada ao mesmo tempo que a detecção dos miRNAs, tornam-se constante entre todas as amostras.
[0009] No Documento não patentário 1, miRNAs endógenos foram usados para a correção dos níveis de expressão de miRNA mensurados em soro de camundongos, e a eficiência da correção foi avaliada. “miRNA endógeno” significa um miRNA que está naturalmente presente na amostra a ser investigada (soro de camundongo, no caso do documento não patentário 1) e derivado do organismo a partir do qual a amostra foi fornecida. Ou seja, no Documento não patentário 1, a correção dos níveis de expressão de miRNA no soro de camundongos foi tentada utilizando miR-16, miR-31 e miR-223 como exemplos de miRNAs endógenos para a correção. No entanto, os níveis de expressão destes miRNAs não eram constantes entre os indivíduos, e assim, o documento não patentário 1 não adota o método em que a correção de todos os dados é realizada com base nos níveis de expressão de miRNAs endógenos, mas propõe o uso de um RNA adicionado externamente como substância de referência para a correção dos dados. Em resumo, o documento patentário 1 concluiu que a correção dos níveis de expressão de miRNA usando estes miRNAs endógenos é inadequada.
[0010] O documento não patentário 2 propõe o uso da combinação de let-7d, let-7g e let-7i como miRNAs endógenos de correção na detecção de miRNAs no soro humano por RT-PCR quantitativo ou por sequenciamento. Ou seja, pela realização de uma operação que faz com que os níveis de expressão de let-7d, let-7g, e let-7i tornem-se constantes entre as amostras, e os níveis de expressão dos miRNAs a serem mensurados foram corrigidos.
DOCUMENTOS DOS ANTECEDENTES DA INVENÇÃO DOCUMENTOS PATENTÁRIOS
[0011] Documento Patentário 1: JP 2007-75095 A; - Documento Patentário 2: JP 2007-97429 A; e - Documento Patentário 3: JP 2014-7995 A.
DOCUMENTOS NÃO PATENTÁRIOS
[0012] Documento não Patentário 1: Roberts, T. C., 2014, PLoS ONE, vol. 9 (2), e89237; e - Documento não Patentário 2: Chen, X. et al., 2013, PLoS ONE, vol. 8 (11), e79652.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO
[0013] Conforme descrito acima, em relação à detecção da expressão gênica, são geralmente empregados métodos nos quais os níveis de expressão de genes a serem detectados são corrigidos utilizando os níveis de “genes housekeeping”, que mostram apenas pequenas variações no nível de expressão entre as amostras. Exemplos de genes housekeeping amplamente conhecidos incluem ACTB e GAPDH. Entretanto, uma vez que os comprimentos de ácidos nucleicos e os níveis de expressão destes genes absolutos são muito diferentes dos miRNAs, a utilização desses genes não é preferida para a correção dos níveis de expressão de miRNAs.
[0014] Assim, convencionalmente, quando os níveis de expressão a serem detectados são de miRNAs, os RNAs housekeeping, tais como U1 snoRNA, U2 snoRNA, U3 snoRNA, U4 snoRNA, U5 snoRNA, U6 snoRNA, 5S rRNA e 5.8S rRNA foram utilizados principalmente para a correção. No entanto, em casos onde os níveis de expressão de miRNAs são mensurados em fluidos corporais e os dados resultantes devem ser corrigidos, os níveis de expressão de U1 snoRNA, U2 snoRNA, U3 snoRNA, U4 snoRNA, U5 snoRNA, U6 snoRNA, 5S rRNA, e 5.8S rRNA dificilmente podem ser detectados em fluidos corporais, como soro, plasma, urina, e líquor, que são amostras que não contém células, uma vez que estes RNAs estão presentes nos núcleos e citoplasmas. Assim, diz-se que estes genes de controle interno não podem ser utilizados como indicadores para a detecção e correção dos níveis de expressão de miRNAs em fluidos corporais.
[0015] Na detecção dos níveis de expressão de miRNAs por RT- PCR quantitativo, são feitas tentativas de encontrar “miRNAs housekeeping no fluido corporal” que não mostram diferença no nível de expressão entre as amostras, analisando individualmente miRNAs presentes no soro e plasma. Conforme descrito acima, o documento não patentário 2 propõe o uso da combinação de let-7d, let-7g e let-7i para detecção de miRNAs no soro humano por RT-PCR quantitativo ou por sequenciamento. No entanto, não está claro se estes miRNAs funcionam com miRNAs endógenos de correção no método de microarranjo de DNA. Isto é, na análise de miRNAs em um fluido corporal usando um microarranjo de DNA, não houve nenhum método de correção eficaz usando miRNAs endógenos de correção específicos.
[0016] Por outro lado, nos casos em que a correção dos valores de medição deve ser realizada no microarranjo de DNA, a correção é geralmente feita usando o nível de expressão total (valor sinal) de um grande número de (várias centenas a várias dezenas de milhares) genes que pode ser medido com o microarranjo de DNA. Exemplos de tal método incluem o método de normalização global e o método de normalização quantil.
[0017] A propósito, nos casos em que um valor de referência obtido a partir dos níveis de expressão de miRNA é utilizado como indicador há um problema: quantos miRNAs devem ser utilizados como dados originais para a construção do valor de referência para que seja possível a obtenção um valor de referência universal para a correção? Em particular, nos microarranjos de DNA para usos específicos em que o número de miRNAs a ser mensurado é tão pequeno quanto dezenas até várias dezenas de aplicação, é altamente provável que o método de normalização global ou método similar resulte em resultados de correção insuficientes. No método divulgado pelo documento patentário 3, os níveis de expressão de um grande número mRNAs em uma amostra são medidos para fornecer um valor de referência para a correção. O método é eficaz para os RNAs obtidos a partir de tecidos e células. Entretanto, os níveis de expressão de mRNA em fluidos corporais são extremamente baixos e, portanto, é de difícil uso como indicadores para a correção dos níveis de expressão de miRNAs em fluidos corporais.
[0018] Assim, na medição e análise comparativa dos níveis de expressão de miRNAs contidos em uma pluralidade de amostras de fluidos corporais, nenhum método eficaz para a correção dos valores mensurados foi descoberto. Em particular, não existe um método que permite a correção eficaz para microarranjos de DNA usando uma pequena quantidade de miRNAs endógenos para correção. A presente invenção tem como objetivo resolver estes problemas. Em particular, a presente invenção tem como objetivo resolver problemas importantes no uso prático de microarranjos de DNA para a medição de um número relativamente pequeno de miRNAs, tais como aqueles para uso em ensaios diagnósticos.
MEIOS PARA RESOLVER OS PROBLEMAS
[0019] Como resultado de um estudo intensivo para resolver os problemas acima, os presentes inventores realizaram as seguintes invenções. (1) Um método para a análise comparativa do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) dentre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais, cujo método compreende: uma etapa de medição para mensurar simultaneamente nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) e nível(eis) de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 nas respectivas amostras de fluido corporal; uma etapa de obtenção de valor representativo para a obtenção de um valor representativo de cada uma da referida pluralidade de amostras de fluido corporal a partir de valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10; uma etapa a obtenção de um fator de correção, tal como um fator de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada amostra de fluido corporal, a diferença ou a relação entre um valor de referência que é arbitrariamente definido em ligação com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor representativo para cada amostra de fluido corporal obtida na etapa de obtenção de valor representativo; e uma etapa de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) mensurado(s) em cada amostra de fluido corporal usando o fator de correção obtido para cada referida amostra de fluido corporal. (2) O método de acordo com (1), em que a correção na etapa de correção é realizada da seguinte forma: (a) no caso quando um valor calculado pela subtração do valor de referência a partir do valor representativo é obtido como um fator de correção na etapa de obtenção do fator de correção, o fator de correção é subtraído do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s); (b) no caso quando um valor calculado pela subtração do valor representativo a partir do valor de referência é obtido como um fator de correção na etapa de obtenção do fator de correção, o fator de correção é adicionado ao(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s); (c) no caso quando um valor calculado pela divisão do valor representativo pelo valor de referência é obtido como um fator de correção na etapa de obtenção do fator de correção, o(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) dividido(s) pelo fator de correção; e (d) no caso quando um valor calculado pela divisão do valor de referência pelo valor representativo é obtido como um fator de correção na etapa de obtenção do fator de correção, o(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) multiplicado(s) pelo fator de correção. (3) O método de acordo com (1) ou (2), em que o valor de referência é um valor fixo definido arbitrariamente em conexão com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, ou um valor representativo para o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção obtido(s) para uma primeira amostra de fluido corporal, sendo a primeira amostra de fluido corporal arbitrariamente selecionada dentre a pluralidade de amostras de fluido corporal. (4) O método de acordo com qualquer um de (1) a (3), em que a etapa de medição compreende a realização da hibridização, colocando sondas de ácidos nucleicos para a captura de uma pluralidade de miRNAs alvos e sonda(s) para capturar a um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10, e as sondas são imobilizadas sobre um suporte, em contato com uma amostra de ácidos nucleicos derivada de cada uma das amostras de fluidos corporais, e a amostra de ácido nucleico é marcada com uma substância de marcação, e a obtenção dos níveis de expressão dos miRNAs alvos e um ou mais miRNAs endógenos de correção como valores de medição da intensidade de sinal. (5) O método de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), em que a amostra de fluido corporal é sangue, soro ou plasma. (6) O método de acordo com qualquer um dentre (1) a (5), em que o valor representativo é uma média ou mediana expressa como um valor logarítmico calculado a partir do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10. (7) Um dispositivo de análise da expressão de miRNA para análise comparativa do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) dentre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais, em que o dispositivo compreende: meios de memória que memorizam valores mensurados do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) e valores mensurados do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) endógeno(s) de correção selecionado(s) a partir dos miRNA(s) endógeno(s) de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10, em que ambos os valores mensurados são obtidos por medições de uma pluralidade de amostras de fluidos corporais; meios de obtenção de valor representativo que obtém um valor representativo para cada uma da pluralidade de amostras de fluido corporal a partir de valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10; meios de obtenção de um fator de correção que obtém, como um fator de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada amostra de fluido corporal, a diferença ou a relação entre um valor de referência que é arbitrariamente definido em ligação com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor representativo para cada amostra de fluido corporal obtida pela etapa de obtenção de valor representativo; meios de correção que corrigem o(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) mensurado(s) em cada amostra de fluido corporal usando o fator de correção obtido para cada referida amostra de fluido corporal; e meios de saída que geram resultado(s) de comparação do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) entre, pelo menos, duas amostras de fluidos corporais com base no(s) nível(eis) de expressão corrigido(s) do(s) miRNA(s) alvo(s). (8) O dispositivo de acordo com (7), em que a correção significa realizar a correção da seguinte forma: (a) no caso quando um valor calculado pela subtração do valor de referência a partir do valor representativo é obtido como um fator de correção nos meios de obtenção do fator de correção, o fator de correção é subtraído do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s); (b) no caso quando um valor calculado pela subtração do valor representativo a partir do valor de referência é obtido como um fator de correção nos meios de obtenção do fator de correção, o fator de correção é adicionado ao(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s); (c) no caso quando um valor calculado pela divisão do valor representativo pelo valor de referência é obtido como um fator de correção nos meios de obtenção do fator de correção, o(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) dividido(s) pelo fator de correção; (d) no caso quando um valor calculado pela divisão do valor de referência pelo valor representativo é obtido como um fator de correção nos meios de obtenção do fator de correção, o(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) multiplicado(s) pelo fator de correção. (9) O dispositivo de acordo com (7) ou (8), em que os valores de medição do(s) nível(eis) de expressão do miRNA(s) alvo(s) contido(s) na pluralidade de amostras de fluidos corporais e os valores de medição do(s) nível(eis) de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 que são memorizados nos meios de memória são valores obtidos através da realização da hibridização, trazendo sondas para a captura de uma pluralidade de miRNAs alvos e sonda(s) para a captura de um ou mais miRNAs endógenos de correção, em que as referidas sondas são imobilizadas sobre um suporte, em contato com uma amostra de ácidos nucleicos derivada de cada uma das amostras de fluido corporal, e a referida amostra de ácido nucleico é marcada com uma substância de marcação, e a obtenção dos níveis de expressão dos miRNAs alvos e um ou mais miRNAs endógenos de correção como valores de medição de intensidade de sinal. (10) Programa(s) para uma análise comparativa do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) dentre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais, em que o(s) programa(s) faz(em)que um ou mais computadores execute: uma etapa de medição para mensurar simultaneamente nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) e nível(eis) de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 nas respectivas amostras de fluido corporal; uma etapa de obtenção de valor representativo para a obtenção de um valor representativo de cada uma da pluralidade de amostras de fluido corporal a partir de valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10; uma etapa a obtenção de um fator de correção, tal como um fator de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada amostra de fluido corporal, a diferença ou a relação entre um valor de referência que é arbitrariamente definido em ligação com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor representativo para cada amostra de fluido corporal obtida na etapa de obtenção de valor representativo; e uma etapa de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) mensurado(s) em cada amostra de fluido corporal usando o fator de correção obtido para cada referida amostra de fluido corporal. (11) Programa(s) para uma análise comparativa do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) dentre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais, em que o(s) programa(s) faz(em)que um ou mais computadores funcione como: meios de memória que memorizam valores mensurados do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) e valores mensurados do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) endógeno(s) de correção selecionado(s) a partir dos miRNA(s) endógeno(s) de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10, em que o(s) miRNA(s) alvo(s) e o um ou mais miRNA(s) endógeno(s) de correção estão contidos em cada uma da pluralidade de amostras de fluidos corporais; meios de obtenção de valor representativo que obtém um valor representativo para cada uma da pluralidade de amostras de fluido corporal a partir de valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10; meios de obtenção de um fator de correção que obtém, como um fator de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada amostra de fluido corporal, a diferença ou a relação entre um valor de referência que é arbitrariamente definido em ligação com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor representativo para cada amostra de fluido corporal obtida pela etapa de obtenção de valor representativo; meios de correção que corrigem o(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) mensurado(s) em cada amostra de fluido corporal usando o fator de correção obtido para cada referida amostra de fluido corporal; e meios de saída que geram resultado(s) de comparação do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) entre, pelo menos, duas amostras de fluidos corporais com base no(s) nível(eis) de expressão corrigido(s) do(s) miRNA(s) alvo(s). (12) Um meio de gravação legível por computador no qual o(s) programa(s) de acordo com (10) ou (11) está(estão) gravado(s). (13) Um chip para análise da expressão de miRNA, que compreende um suporte no qual as sondas de captura de uma pluralidade de miRNA(s) alvo(s) e sonda(s) para a captura de uma ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 são imobilizadas.
EFEITOS DA INVENÇÃO
[0020] De acordo com a presente invenção, quando é realizada a análise comparativa do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) contido(s) em uma pluralidade de amostras de fluidos corporais, especialmente quando os níveis de expressão de um grande número de miRNAs são mensurados usando microarranjo ou método similar e comparados entre amostras, a correção dos níveis de expressão de miRNAs pode ser realizada com maior precisão em comparação com métodos convencionais. A presente invenção permite a análise comparativa mais precisa de miRNA(s) alvo(s) entre as amostras.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0021] A Fig. 1 é um diagrama conceitual que ilustra o método da presente invenção.
[0022] A Fig. 2 é um diagrama de blocos que ilustra um esboço da constituição do dispositivo de análise da presente invenção.
[0023] A Fig. 3 é um diagrama de fluxo exemplar do processo de correção para os níveis de expressão de miRNAs alvos de acordo com a presente invenção.
[0024] A Fig. 4-1 mostra histogramas dos valores de sinal de miRNA obtidos por detecção de microarranjo de DNA, que foram mensurados e corrigidos pelo método descrito no Exemplo 2. A: antes da correção; B: corrigido pelo hsa-miR-6085; C: corrigido pelo hsa-miR-1227-5p; D: corrigido pelo hsa-miR-2861; E: corrigido pelo hsa-miR-149-3p; F: corrigida pelo hsa- miR-4463; G: corrigido pelo hsa-miR-4508.
[0025] A Fig. 4-2 mostra histogramas dos valores de sinal de miRNA obtidos por detecção de microarranjo de DNA, que foram mensurados e corrigidos pelo método descrito no Exemplo 2. A: antes da correção; H: corrigido pelo hsa-miR-6090; I: corrigido pelo hsa-miR-6775-5p; J: corrigido pelo hsa-miR-6803-5p; K: corrigido pelo hsa-miR-5787.
[0026] A Fig. 5 mostra histogramas dos valores de sinal de miRNA obtidos por detecção de microarranjo de DNA, que foram mensurados e corrigidos pelo método descrito no Exemplo 2.
[0027] A Fig. 6 mostra histogramas dos valores de sinal de miRNA obtidos por detecção de microarranjo de DNA, que foram mensurados e corrigidos pelo método descrito no Exemplo Comparativo 1.
[0028] A Fig. 7 mostra histogramas dos valores de sinal de miRNA obtidos por detecção de microarranjo de DNA, que foram mensurados e corrigidos pelo método descrito no Exemplo Comparativo 2.
[0029] A Fig. 8-1 mostra histogramas dos valores de sinal de miRNA obtidos por detecção de microarranjo de DNA, que foram mensurados e corrigidos pelo método descrito no Exemplo 4. A: antes da correção; B: corrigido pela combinação de hsa-miR-149-3p, hsa-miR-1227-5p e hsa-miR- 2861; C: corrigido pela combinação de hsa-miR-149-3p, hsa-miR-1227-5p e hsa-miR-4508; D: corrigido pela combinação de hsa-miR-149-3p, hsa-miR- 1227-5p e hsa-miR-4463; E: corrigido pela combinação de hsa-miR-149-3p, hsa-miR-2861 e hsa-miR-4508.
[0030] A Fig. 8-2 mostra histogramas dos valores de sinal de miRNA obtidos por detecção de microarranjo de DNA, que foram mensurados e corrigidos pelo método descrito no Exemplo 4. A: antes da correção; F: corrigido pela combinação de hsa-miR-149-3p, hsa-miR-2861 e hsa-miR- 4463; L: corrigido pela combinação de hsa-miR-1227-5p, hsa-miR-2861 e hsa- miR-4508; H: corrigido pela combinação de hsa-miR-1227-5p, hsa-miR-2861 e hsa-miR-4463; I: corrigido pela combinação de hsa-miR-1227-5p, hsa-miR- 4508 e hsa-miR-4463.
MODO DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
[0031] Em primeiro lugar, o conceito do método de correção para miRNA(s) alvo(s) que é realizado pela presente invenção é descrito com base na Fig. 1. A Fig. 1 mostra histogramas dos valores de sinal que são valores mensurados dos níveis de expressão de miRNAs. Os histogramas ilustram esquematicamente os resultados de detecção obtidos pela marcação de RNA de uma amostra de fluido corporal e detecção utilizando um microarranjo em que são imobilizadas sondas para a captura de uma pluralidade de tipos de miRNAs alvos (daqui em diante também referidas como “sondas de captura de miRNA-alvo”) e sondas para a captura de um ou mais miRNAs (daqui em diante também referidas como “sonda(s) de captura de miRNA endógeno de correção”) selecionados dentre os miRNAs mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 (daqui em diante também referidas como “sonda(s) de captura de miRNA endógeno de correção”). As sondas para capturar miRNAs alvos e sondas para captar miRNAs endógenos de correção são também referidas coletivamente como “sondas de captura miRNA” ou, simplesmente, “sondas”.
[0032] Fig. 1A mostra histogramas que ilustram os resultados da análise de microarranjo de DNA de miRNAs alvos em amostras extraídas de uma amostra de fluido corporal A e uma amostra de fluido corporal B, respectivamente. São mostrados os histogramas dos valores do sinal obtidos a partir de uma pluralidade de sondas de captura de miRNA alvo carregadas no microarranjo, e os histogramas dos valores do sinal obtidos a partir de uma sonda de captura de miRNA endógeno de correção da presente invenção. As amostras de fluido corporal A e B mostram histogramas de miRNA com grande deslocamento entre si. Deste modo, pode ser interpretado que há uma grande diferença nos níveis de expressão de miRNA entre as amostras. Por outro lado, outra interpretação é possível: a diferença pode ser devido a um erro experimental. É impossível determinar qual a interpretação é correta com base apenas nos histogramas de miRNAs.
[0033] Aqui, assumindo que um miRNA endógeno de correção cuja abundância no fluido corporal é constante está presente, o valor do sinal do miRNA endógeno de correção deve ser o mesmo entre as amostras.
[0034] Na Fig. 1A, a distribuição do histograma do valor(es) de sinal obtido(s) a partir da sonda de captura de miRNA endógeno de correção é quase a mesma entre a amostra de fluido corporal A e a amostra de fluido corporal B. Ou seja, pode-se determinar que a amostra de fluido corporal A e a amostra de fluido corporal B foram corretamente submetidas ao experimento, e, consequentemente não existe erro experimental. Em tal caso, segue-se que há uma grande diferença nos níveis de expressão de miRNAs entre a amostras de fluidos corporais A e B, e que a correção dos valores de sinal de miRNAs é desnecessária para a comparação entre as amostras de fluidos corporais.
[0035] A Fig. 1B mostra, esquematicamente, os resultados da análise de uma amostra de fluido corporal C e uma amostra de fluido corporal D usando um microarranjo de DNA. São mostrados os valores de sinal obtidos a partir de sonda(s) de captura de miRNA-alvo e valores de sinal obtidos a partir de sonda(s) de captura de miRNA endógeno de correção.
[0036] Os histogramas de miRNAs a partir da amostra de fluido corporal C e amostra de fluido corporal D mostram distribuições semelhantes. Por outro lado, os histogramas dos valores de sinal obtidos a partir da(s) sonda(s) de captura de miRNA(s) endógeno(s) de correção mostram um grande desvio entre a amostra de fluido corporal C e a amostra de fluido corporal D. Assim, pode ser entendido que os resultados de detecção da amostra de fluido corporal C e da amostra de fluido corporal D incluem um erro experimental decorrente de alguma razão. Em tal caso, os valores de sinal dos miRNAs precisam ser adequadamente corrigidos para a comparação entre amostras de fluido corporal C e D.
[0037] Histogramas após correção dos valores de sinal dos miRNAs alvos, em conformidade com a presente invenção, são mostrados na Fig. 1C. O método específico de correção é tal como descrito mais adiante. Os dados a partir da amostra de fluido corporal C foram corrigidos de modo que os histogramas dos valores de sinal obtidos a partir da sonda de captura de miRNA(s) endógeno(s) de correção gerados a partir da amostra de fluido corporal C e amostra de fluido corporal D são ajustados entre si. Como resultado desta correção, o fluido corporal de amostra C e o fluido corporal de amostra D têm o mesmo histograma dos valores de sinal obtidos a partir da(s) sonda(s) de captura de miRNA(s) endógeno(s) de correção (s), e os histogramas dos valores de sinal a partir da as sondas de captura de miRNAs alvos corrigidos usando o mesmo fator de correção tornam-se em grande parte deslocados entre si. Ou seja, há uma grande diferença nos níveis de expressão de miRNAs alvos também entre as amostras C e D.
[0038] Embora um método para corrigir os valores de sinal de miRNAs entre duas amostras de fluidos corporais foi mostrado aqui, o número de amostras de fluidos corporais a ser comparado não é limitado a duas amostras, e a comparação pode ser realizada entre um número ilimitado de amostras de fluidos corporais. Por exemplo, nos casos em que a comparação é feita entre três ou mais amostras de fluido corporal, um valor de sinal obtido a partir de uma sonda de captura de miRNA endógeno de correção é preliminarmente hipotetizada como sendo um valor fixo (constante), e a diferença ou razão entre o valor de sinal obtido a partir da sonda de captura de miRNA endógeno de correção em cada uma das amostras de fluido corporal contra esta constante é então calculada. Ao adicionar a diferença, subtrair a diferença dos valores de sinal de miRNAs alvos nas respectivas amostras de fluidos corporais, ou multiplicar ou dividir os valores de sinal de miRNAs alvos nas respectivas amostras de fluidos corporais pelo recíproca de relação, a correção pode ser facilmente realizada entre um grande número de amostras.
[0039] Na presente invenção, a análise comparativa do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) é realizada entre uma pluralidade de amostras. O número de amostras pode ser de dois, ou pode ser de três ou mais.
[0040] “miRNA” é um RNA não codificante (ncRNA), o que significa um RNA de cadeia curta produzida no corpo que possui um comprimento de aproximadamente 15 a 25 bases. Acredita-se que tenha função de regular a expressão de mRNA. Um miRNA é transcrito como um RNA (precursor) que tem uma estrutura semelhante a um grampo de cabelo (hairpin-like) a partir do DNA genômico. Este precursor é clivado por uma enzima específica, a enzima de clivagem de dsRNA (Drosha, Dicer) possuindo atividade de clivagem de RNAase III, e convertido na forma de fita dupla e, então, em fita simples. Acredita-se que a incorporação da fita antisense, que é uma das fitas, em um complexo proteico denominado RISC ocorra subsequentemente, conduzindo a uma participação na supressão da tradução do mRNA. Assim, o miRNA toma diversas formas nas fases após sua transcrição. Portanto, ao visar (detectar) um miRNA, várias formas, incluindo a estrutura em forma de grampo (hairpin), a estrutura de fita dupla, e a estrutura de fita simples devem ser levadas em consideração. A presença de miRNAs foi confirmada em diversos organismos.
[0041] As amostras para as quais a presente invenção é aplicável são amostras de fluidos corporais separadas de corpos vivos, e exemplos de amostras de fluidos corporais incluem, mas não se limitam a, fluidos corporais como sangue, soro, plasma, urina, fluido espinal, saliva, células coletadas com swab, e diversos fluidos teciduais. A pluralidade de amostras submetidas à análise comparativa pode ser uma pluralidade de amostras derivadas de diferentes fluidos corporais, ou pode ser uma pluralidade de amostras de fluidos corporais derivados do mesmo tipo de fluido corporal separado a partir de diferentes organismos vivos.
[0042] O RNA é extraído a partir destas amostras, e o RNA extraído é utilizado para medir os níveis de expressão miRNAs. Os métodos para a extração de RNA são conhecidos (por exemplo, o método de Favaloro et al. (Favaloro et al, Methods Enzymol 65: 718-749 (1980))), e vários kits para tais métodos estão disponíveis comercialmente (por exemplo, miRNeasy, fabricado pela QIAGEN; e reagente de extração de RNA a partir de amostra líquida “Gene-3D”, fabricado por Toray Industries, Inc.).
[0043] O termo “endógeno”, conforme utilizado na presente invenção significa estar naturalmente presente em uma amostra, ao invés de estar presente devido à adição artificial na amostra. Por exemplo, “miRNA endógeno” significa um miRNA que está naturalmente presente na amostra e é derivado do organismo a partir do qual a amostra foi fornecida.
“ETAPA DE MEDIÇÃO”
[0044] No método para a análise comparativa da presente invenção, a medição dos níveis de expressão de uma pluralidade de tipos de miRNAs alvos nas amostras é realizada ao mesmo tempo que a medição do nível de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção. Tal como descrito mais adiante, o nível de expressão do(s) miRNA (s) endógeno(s) de correção é usado para cálculo de um fator de correção para a correção dos níveis de expressão dos miRNAs alvos. A medição simultânea dos níveis de expressão da pluralidade de miRNAs pode ser realizada, por exemplo, pelo ensaio de hibridização utilizando um chip de matriz, tal como um microarranjo, no qual as sondas que se ligam especificamente aos miRNAs alvos são imobilizadas sobre um suporte. Na presente invenção, pode ser utilizado um chip de matriz compreendendo um suporte sobre o qual uma pluralidade de sondas de captura de miRNAs alvos e uma ou mais sondas de captura de miRNAs endógenos de correção são imobilizadas.
[0045] A “sonda de captura”, ou a “sonda para a captura” significa uma substância capaz de se ligar, direta ou indiretamente, de preferência diretamente, de maneira seletiva ao miRNA a ser capturado. Exemplos representativos de tal sonda incluem ácidos nucleicos, proteínas, açúcares e outros compostos antigênicos. Na presente invenção, sondas de ácidos nucleicos podem ser preferencialmente utilizadas. Exemplos dos ácidos nucleicos que podem ser utilizados incluem não apenas o DNA e RNA, como também derivados de ácidos nucleicos como PNA (ácido nucleico peptídico) e LNA (ácido nucleico bloqueado). Em casos de ácidos nucleicos, “derivados” significa derivados quimicamente modificados, tais como derivados marcados preparados utilizando um fluoróforo ou similar; e derivados que compreendem um nucleotídeo modificado (um nucleotídeo contendo halogênio, ou contendo um grupo tal como alquila, incluindo metila; alcóxi, incluindo metoxi; thio; ou carboximetila; um nucleotídeo que foi submetido a reconstrução de base, saturação de ligações duplas, desaminação, substituição de molécula(s) de oxigênio em molécula(s) de enxofre, e/ou similares).
[0046] Do ponto de vista de garantir a estabilidade e especificidade na hibridização, o comprimento da sonda de ácido nucleico é de preferência não inferior do que o comprimento do miRNA a ser detectado. Normalmente, quando o comprimento da cadeia é de cerca 17 a 25 bases, a sonda pode exercer suficientemente a capacidade de ligação seletiva para o miRNA em questão. Tal sonda de ácido oligonucleico possuindo um comprimento de cadeia curta pode ser facilmente preparado por um método de síntese química bem conhecido ou por métodos semelhantes.
[0047] A sonda de ácido nucleico tem, preferencialmente, a sequência de bases completamente complementar com a sequência do miRNA a ser detectado. No entanto, mesmo nos casos em que existe uma diferença parcial, a sonda de ácido nucleico pode ser utilizada como sonda de captura, desde que a sonda de ácido nucleico tenha uma sequência de bases que é suficientemente homóloga para permitir a hibridização com o miRNA a ser detectado sob condições estringentes.
[0048] A estringência da hibridização é conhecida por ser uma função da temperatura, concentração de sal, comprimento da cadeia da sonda, teor de GC na sequência de nucleotídeos da sonda, e concentração do agente caotrópico no tampão de hibridização. Como condições estringentes, podem ser utilizadas àquelas descritas em Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova Iorque, e similares. A condição de temperatura estringente não é inferior a cerca de 30 °C. Exemplos de outras condições incluem o tempo de hibridização, a concentração do agente de lavagem (por exemplo, SDS), e a presença ou ausência de DNA transportador. Ao combinar estas condições, diferentes estringências podem ser definidas. Os peritos na arte podem determinar de forma adequada das condições para a obtenção da função da sonda de captura fornecida para a detecção de uma amostra de RNA desejada.
[0049] A informação da sequência de miRNA pode ser obtida a partir de bases de dados como GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Informações da sequência de miRNA também podem ser obtidas no website miRBase (http://www.mirbase.org/). A(s) sonda(s) de captura de miRNA endógeno de correção e a(s) sonda(s) de captura de miRNAs alvos podem ser concebidas com base em informações disponíveis a partir desses sites.
[0050] O número de sondas de captura de miRNA imobilizadas no suporte não é limitado. Por exemplo, na medição dos níveis de expressão de miRNAs, o número das sondas de captura de miRNA imobilizadas no suporte pode ser um número que cobre exaustivamente todos miRNAs cujas sequências conhecidas foram identificadas. Ou, o número das sondas de captura de miRNA imobilizadas no suporte pode ser um número desejado.
[0051] Como suporte sobre o qual as sondas de captura são alinhadas e imobilizadas, os quais são os mesmos que podem ser utilizados como suportes utilizados em microarranjos conhecidos, macroarranjos e semelhantes. Exemplos de suporte incluem lâminas de vidro, membranas e esferas. O suporte descrito no documento JP 4244788 B, que tem uma pluralidade de porções salientes em sua superfície, também pode ser utilizado. Exemplos do material de suporte incluem, mas não estão limitados a materiais inorgânicos como vidro, cerâmica, e silicone; e polímeros como tereftalato de polietileno, acetato de celulose, policarbonato, poliestireno, polimetacrilato de metila, e borracha de silicone.
[0052] Exemplos de métodos conhecidos para a imobilização de sondas de captura sobre um suporte incluem métodos em que oligo-DNAs são sintetizados na superfície do suporte, e os métodos em que oligo-DNAs preliminarmente sintetizados são adicionados gota a gota à superfície do suporte e, posteriormente, nele fixados.
[0053] Exemplos dos métodos anteriores incluem o método de Ronald et al. (US 5705610 B), o método de Michel et al. (US 6142266 B), e o método de Francesco et al. (US 7037659 B). Nestes métodos, um solvente orgânico é utilizado na reação de síntese do DNA, e, consequentemente, o material do suporte é preferencialmente um material resistente aos solventes orgânicos. No método de Francesco et al., a síntese do DNA é controlada por irradiação com luz a partir do lado de trás do suporte, e, consequentemente, o material do suporte deve ser um material transmissor de luz.
[0054] Exemplos destes últimos métodos incluem o método de Hirota et al. (JP 3922454 B) e métodos usando um spotter. Exemplos de métodos de spotting incluem o método de pino, que se baseia no contato mecânico de uma ponta de pino com uma fase sólida; o método de jato de tinta, que utiliza o princípio de impressoras a jato de tinta; e o método capilar, que utiliza um tubo capilar. Se necessário, após o tratamento de spotting, é realizado um pós-tratamento, tal como a ligação cruzada por irradiação UV e/ou bloqueio da superfície. Para permitir a imobilização do oligo-DNAs por meio de ligações covalentes à superfície do suporte de superfície tratado, grupos funcionais como grupos amino e/ou grupos SH são introduzidos às extremidades dos oligo-DNAs. A modificação da superfície do suporte é geralmente realizada por tratamento com um agente de acoplamento de silano contendo um grupo amino e/ou similar.
[0055] A hibridização com sondas de captura de miRNA imobilizadas sobre o suporte é realizada pela preparação de uma amostra de ácido nucleico (amostra de ácidos nucleicos derivada de uma amostra de fluido corporal) marcada com uma substância de marcação a partir do RNA extraído de uma amostra de fluido corporal, e colocando a amostra de ácido nucleico marcada resultante em contato com as sondas. Exemplos de “amostra de ácido nucleico derivada de uma amostra de fluido corporal” incluem não apenas RNA extraído de uma amostra de fluido corporal, como também cDNAs preparados pela reação de transcrição reversa a partir do RNA, e cRNA. A amostra de ácido nucleico marcada derivada da amostra de fluido corporal pode ser uma amostra preparada pela marcação direta ou indireta do RNA da amostra com uma substância de marcação, ou uma amostra preparada por marcação direta ou indireta de cDNA ou cRNA, preparada a partir do RNA da amostra com uma substância de marcação.
[0056] Os exemplos do método para a ligação da substância de marcação para a amostra de ácido nucleico proveniente da amostra de fluido corporal incluem métodos em que a substância de marcação é ligada à extremidade 3’ da amostra de ácido nucleico, métodos em que a substância de marcação é ligada à extremidade 5’ da amostra de ácido nucleico, e os métodos em que um nucleotídeo ao qual a substância de marcação está ligada é incorporada no ácido nucleico. Nos métodos em que a substância de marcação é ligada na extremidade 3’ e os métodos em que a substância de marcação é ligada na extremidade 5’, a reação enzimática pode ser utilizada. Na reação enzimática, podem ser utilizadas T4 RNA ligase, Terminal Transferase Deoxitidil, Poli A polimerase, ou similares. Qualquer um dos métodos de marcação pode ser realizado por referência com os métodos descritos em “Shao Yao-Ying (ed.), miRNA Experimental Protocols, Yodosha Co., Ltd. (2008). Diversos kits para substâncias de marcação direta ou indireta que se ligam a extremidade do RNA encontram-se comercialmente disponíveis. Exemplos de kits para a ligação direta ou indireta de uma substância de marcação na extremidade 3 ’ incluem o kit de marcação de miRNA “3D-Gene” (Toray Industries, Inc.), kit de marcação miRCURY miRNA HyPower (Exiqon), sistema de marcação NCode miRNA (Life Technologies ), e FlashTag Biotin RNA Labeling Kit (Genisphere).
[0057] Além dos métodos citados acima, também podem ser utilizados os métodos convencionais. Ou seja, cDNA ou cRNA podem ser sintetizados a partir do RNA da amostra na presença de desoxirribonucleotídeos marcados ou ribonucleotídeos marcados para preparar um cDNA ou cRNA no qual uma substância marcada é incorporada, e o cDNA ou cRNA resultante pode ser hibridizado com sonda sobre a matriz.
[0058] Na presente invenção, é utilizada uma pluralidade de amostras. A mesma substância de marcação pode ser usada para todas as amostras.
[0059] Exemplos de substâncias de marcação que podem ser utilizadas na presente invenção incluem várias substâncias de marcação que também são utilizadas nas análises de microarranjo conhecidas. Exemplos específicos de substâncias de marcação incluem, mas não estão limitados a corantes fluorescentes, corantes fosforescentes, enzimas e isótopos radioativos. Corantes fluorescentes são preferidos, uma vez que podem ser facilmente mesurados e seus sinais podem ser facilmente detectados. Exemplos específicos dos corantes fluorescentes incluem, mas não estão limitados a, corantes fluorescentes conhecidos como Cianina (Cianina 2), aminometilcumarina, fluoresceína, indocarbocianina (Cianina 3), Cianina 3,5, tetrametilrodamina, rodamina vermelho, vermelho Texas, indocarbocianina (Cianina 5), Cianina 5.5, Cianina 7 e Oyster.
[0060] Como a substância de marcação, também podem ser utilizadas partículas semicondutoras luminescentes. Exemplos de tais partículas semicondutoras incluem selênio cádmio (CdSe), telúrio de cádmio (CdTe), fosfeto de índio gálio (InGaP) e sulfeto de prata índio zinco (AgInZnS).
[0061] A amostra com ácido nucleico marcado derivada de uma amostra de fluido corporal é colocada em contato com as sondas de captura de miRNA no suporte para permitir a hibridização dos ácidos nucleicos da amostra com as sondas. Esta etapa de hibridização pode ser completamente realizada do mesmo modo que a etapa de hibridização convencional. A temperatura de reação e o tempo de reação são adequadamente selecionados dependendo do comprimento da cadeia do ácido nucleico a ser submetido à hibridização. Em casos de hibridização de ácido nucleico, a hibridização é normalmente realizada a aproximadamente 30 °C a 70 °C durante 1 minuto a dez e várias horas. Após a hibridização e lavagem, a intensidade do sinal a partir da substância de marcação em cada área onde cada uma das sondas é imobilizada sobre o substrato é detectada. A detecção da intensidade de sinal é realizada utilizando um leitor de sinal apropriado, que é selecionado dependendo do tipo da substância de marcação. Quando um corante fluorescente é usado como a substância de marcação, pode ser usado um microscópio de fluorescência ou digitalizador de fluorescência.
[0062] O valor do sinal detectado é comparado com o ruído ambiente. Mais especificamente, o valor do sinal obtido a partir da área da sonda imobilizada e o valor do sinal obtido a partir de uma posição que não seja a área da sonda imobilizada são comparados entre si, e, nos casos em que o valor anterior é maior do que o segundo valor, a intensidade de sinal é considerada como detectada (eficazmente considerada positiva).
[0063] Nos casos em que o ruído de fundo é incluído no valor do sinal detectado, o ruído de fundo pode ser subtraído o valor do sinal detectado. O ruído de fundo pode ser considerado como o ruído de fundo, e pode ser subtraído do valor do sinal detectado. Além disso, pode ser utilizado o método descrito em “Wataru Fujibuchi e Katsuhisa Horimoto (eds.), Microarray data statistical analysis protocols, Yodosha Co., Ltd. (2008)”.
[0064] De acordo com o método descrito acima, os valores medidos dos níveis de expressão de miRNA(s) endógeno(s) de correção e miRNA(s) alvo(s) são obtidos como valores medidos das intensidades de sinal.
“ETAPA DE OBTENÇÃO DE VALOR REPRESENTATIVO”
[0065] Subsequentemente, no método de análise da presente invenção, um valor representativo, preferencialmente um valor representativo expresso como um valor logarítmico, é obtido a partir do valor medido do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção de cada uma das amostras (etapa de obtenção de valor representativo). O “valor logarítmico” na presente invenção significa um valor convertido em um logaritmo com base 2.
[0066] Quando uma pluralidade de miRNAs endógenos de correção é usada, a média ou mediana, preferencialmente a média ou mediana expressa como um valor logarítmico calculadas a partir dos valores de medição dos níveis de expressão da pluralidade de miRNAs endógenos de correção, são utilizadas como valor representativo. Quando apenas um miRNA endógeno de correção é utilizado, o valor de medição, de preferência o valor logarítmico do valor mensurado, do nível de expressão do miRNA endógeno de correção pode ser utilizado como valor representativo. Ou, conforme descrito mais adiante, quando um chip de matriz sobre o qual uma pluralidade de sondas de captura são colocadas para um tipo de miRNA endógeno de correção usado, a média ou mediana, preferencialmente a média ou mediana expressa como um valor logarítmico, pode ser calculada a partir dos valores de medição do sinal desta pluralidade de spots (ou áreas com sondas imobilizadas), para proporcionar o valor representativo.
[0067] A “média expressa como valor logarítmico” significa a média calculada a partir dos valores logarítmicos obtidos pela conversão dos valores de medição dos níveis de expressão da pluralidade de miRNAs endógenos de correção (por exemplo, valores de medição das intensidades de sinal obtidos utilizando um microarranjo) para logaritmos com base 2. Nos casos em que o valor representativo é a mediana, a “média expressa como um valor logarítmico” significa a média dos valores logarítmicos obtidos pela conversão de valores de medição dos níveis de expressão da pluralidade de miRNAs endógenos de correção (por exemplo, valores de intensidades de sinal medidos obtidos utilizando um microarranjo) para logaritmos com base 2, ou significa o valor logarítmico obtido pela conversão da mediana dos valores medidos dos níveis de expressão de miRNAs endógenos de correção em um logaritmo com base 2. No caso da mediana, o mesmo valor pode ser obtido independentemente se a conversão dos valores mensurados em logaritmos é realizada previamente ou não.
[0068] A média ou mediana pode ser calculada utilizando todos os valores de medição da pluralidade de miRNAs endógenos de correção que foram realmente mensurados, ou pode ser calculada utilizando apenas uma parte dos valores mensurados extraídos a partir dos valores mensurados da pluralidade de miRNAs endógenos de correção. Por exemplo, a média ou mediana pode ser calculada utilizando os valores medidos de todos os miRNAs endógenos de correção obtidos a partir das sondas de captura de miRNA endógenos de correção carregados em um microarranjo, ou, uma parte de todas as sondas de captura de miRNA endógenos de correção (por exemplo, no caso em que 10 tipos de sondas de captura de miRNA endógenos de correção são carregadas em um microarranjo, 3 de 10 sondas) pode ser extraída e utilizada para calcular a média ou mediana. Os valores medidos utilizados no cálculo da média ou da mediana também podem ser valores medidos obtidos a partir de uma pluralidade de sondas de captura colocadas em uma pluralidade de pontos (spots) para a medição de um tipo de miRNA endógeno de correção. Por exemplo, apenas área(s) de sondas imobilizadas em que sonda(s) de captura de miRNA endógeno de correção é(são) imobilizada(s) que é(são) efetivamente considerada(s) positiva(s) em todas as amostras a serem submetidas à análise comparativa pode(m) ser extraída(s) e utilizada(s) para obter um valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção.
[0069] Subsequentemente, utilizando o valor representativo para miRNA(s) endógeno(s) de correção obtido(s) na etapa de obtenção de valor representativo para cada amostra e um valor de referência arbitrariamente definido para o nível de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, um fator de correção a ser utilizado para a correção do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) é obtido (etapa de obtenção do fator de correção). Para a etapa de obtenção do fator de correção, a etapa 1 de obtenção do fator de correção ou a etapa 2 de obtenção do fator de correção descritas a seguir podem ser aplicadas.
“ETAPA 1 DE OBTENÇÃO DO FATOR DE CORREÇÃO”
[0070] A etapa 1 de obtenção do fator de correção é um método utilizando a diferença entre o valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor de referência. Para esta etapa, o 1-1. método de obtenção de amostra de referência ou o 1-2. método de correção de valor fixo podem ser aplicados.
1 -1. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE AMOSTRA DE REFERÊNCIA
[0071] Uma amostra (primeira amostra) é arbitrariamente selecionada a partir de uma pluralidade de amostras de fluidos corporais em que miRNAs estão sendo detectados, em que amostra é utilizada como uma “amostra de referência”. A uma ou mais amostras restantes (amostra(s) subsequente(s)) são fornecidas como “amostra(s) para ser(serem) corrigida(s)”.
[0072] Na presente descrição, o termo “amostra(s) subsequente(s)” inclui a segunda amostra. Por exemplo, nos casos em que o número da pluralidade de amostras a ser comparada é dois, a amostra a ser corrigida é apenas a segunda amostra, e, nos casos em que o número da pluralidade de amostras a ser comparadas é três, existem duas amostras a serem corrigidas, ou seja, a segunda amostra e a terceira amostra.
[0073] Neste método, o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência é usado como “valor de referência”. A diferença entre o valor de referência e o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em determinada(s) amostra(s) subsequente(s) (amostra(s) a ser(em) corrigida(s)) é utilizada como o fator de correção para a(s) determinada(s) amostra(s) subsequente(s). Assim, o número de fatores de correção obtidos é o mesmo que o número de amostras a ser corrigido.
[0074] Mais especificamente, o fator de correção é calculado de acordo com a Equação 1 ou a Equação 1’.
[0075] c1-1 = (valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência (valor de referência)): - (Valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida) ... Equação 1; - c1-1’ = (valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida); - (Valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência (valor de referência) ... Equação 1.
[0076] Por exemplo, nos casos em que a medição dos níveis de expressão é realizada utilizando um microarranjo, e a média é utilizada como valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, o fator de correção para a amostra a ser corrigida pode ser calculado de acordo com a equação 2 ou equação 2’.
[0077] Aqui, na Equação 2 e Equação 2 ’, n representa o número total de área(s) de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte; Aj representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o miRNA endógeno de correção jth (1<j<n) na amostra de referência; e Xj representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o miRNA endógeno de correção jth (1<j<n) na segunda amostra.
[0078] Nos casos em que a(s) sonda (s) e o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção tem uma relação de um para um, n é igual ao número do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção direcionada para a(s) sonda(s) de captura do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte.
[0079] Na Equação 2 e Equação 2’, n’, o número total de áreas de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção que foi(foram) efetivamente considerado(s) positivo(s) em todas as amostras comparadas, pode ser utilizado ou invés de n.
1-2. MÉTODO DE CORREÇÃO DE VALOR FIXO
[0080] Este método assume que preliminarmente o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção é constante entre todas as amostras. Isto é, obtém-se a diferença entre um valor fixo e o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção derivada de cada uma das amostras, e esta diferença é utilizada como fator de correção. Neste método, o valor fixo é utilizado como “valor de referência”. Assim, o número de fatores de correção obtidos é o mesmo que o número de amostras a ser corrigido. Neste caso, a “amostra de referência” descrita em 1-1 não existe, e, consequentemente, todas as amostras submetidas a detecção de miRNA são “amostras a serem corrigidas”.
[0081] Mais especificamente, o fator de correção é calculado de acordo com a Equação 3 ou a Equação 3’.
[0082] r1-2 = (valor fixo (valor de referência)): - (valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida) ... Equação 3; - r1-2’ = (valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida); - (valor fixo (valor de referência)) ... Equação 3’.
[0083] Por exemplo, nos casos em que a média é utilizada como valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, o fator de correção para a amostra a ser corrigida pode ser calculado de acordo com a equação 4 ou equação 4’.
[0084] Aqui, na Equação 4 e Equação 4’, - α representa o valor de referência; - n representa o número total de área(s) de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte; e - Xj representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o miRNA endógeno de correção jth (1<j<n) em uma amostra.
[0085] Nos casos em que a(s) sonda (s) e o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção tem uma relação de um para um, n é igual ao número do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção direcionada para a(s) sonda(s) de captura do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte.
[0086] Na Equação 4 e Equação 4’, n’, o número total de áreas de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção que foi(foram) efetivamente considerado(s) positivo(s) em todas as amostras comparadas, pode ser utilizado ou invés de n.
[0087] À medida que o valor fixo para ser utilizado como valor de referência no método de correção de valor fixo, qualquer valor (excluindo 0) pode ser utilizado desde que o mesmo valor seja utilizado de forma consistente para todas as amostras em pelo menos um tempo de análise comparativa. Usando o mesmo sistema de medição de expressão, e utilizando sempre o mesmo valor como o valor fixo, análise comparativa pode ser realizada mesmo entre amostras de fluidos corporais que foram submetidas à medição dos níveis de expressão em dias diferentes. O valor fixo não é limitado, e pode ser um valor de um nível de expressão que pode ser geralmente encontrado para um ou mais miRNAs endógenos de correção para serem utilizados na obtenção do fator de correção. Uma vez que, em geral, um valor que pode ser geralmente encontrado pode variar, dependendo do sistema utilizado para a medição do nível de expressão, o valor fixo pode ser selecionado, sem limitação, dependendo do sistema utilizado.
[0088] Por exemplo, nos casos em que um único tipo de miRNA endógeno de correção é usado, a média dos níveis de expressão do miRNA endógeno de correção em uma pluralidade de amostras de fluidos corporais submetida à análise comparativa pode ser determinada, e a média resultante pode ser utilizada como valor fixo. Nos casos em que são utilizados três tipos de miRNAs endógenos de correção, a média dos níveis de expressão de todos os três tipos de miRNAs em uma pluralidade de amostras de fluido corporal pode ser determinada, e a média resultante pode ser utilizada como valor fixo. Um valor fixo pode ser preliminarmente determinado utilizando um grande número de amostras de fluido corporal, e o valor fixo determinado pode ser repetidamente utilizado em análises posteriores.
“ETAPA 2 DE OBTENÇÃO DO FATOR DE CORREÇÃO”
[0089] A etapa 2 de obtenção do fator de correção é um método que utiliza a relação entre o valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor de referência. Para esta etapa, o 2-1. método de obtenção de amostra de referência ou o 2-2. método de correção de valor fixo pode ser aplicado.
2-1. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE AMOSTRA DE REFERÊNCIA
[0090] Uma amostra (primeira amostra) é arbitrariamente selecionada a partir de uma pluralidade de amostras em que miRNAs estão sendo detectados, em que amostra é utilizada como uma “amostra de referência”. A(s) amostra(s) subsequente(s) é(são) uma “amostra(s) a ser(em) corrigida(s)”.
[0091] Neste método, o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência é usado como um “valor de referência”, e a relação entre o valor de referência e o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em determinada amostra subsequente é utilizado como o fator de correção para a determinada amostra subsequente. Assim, o número de fatores de correção obtidos é o mesmo que o número de amostras a ser corrigido.
[0092] Mais especificamente, o fator de correção é calculado de acordo com a Equação 5 ou a Equação 5’.
[0093]c2-1 = (valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência (valor de referência)): / (valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida) ... Equação 5; - c2-1’ = (valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida); / (Valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência (valor de referência) ... Equação 5’.
[0094] Por exemplo, nos casos em que a medição dos níveis de expressão é realizada utilizando um microarranjo, e a média é utilizada como valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, o fator de correção para a segunda amostra pode ser calculado de acordo com a equação 6 ou equação 6’.
[0095] Aqui, na Equação 6 e Equação 6’, n representa o número total de área(s) de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte; Aj representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o miRNA endógeno de correção jth (1<j<n) na amostra de referência; e Xj representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o miRNA endógeno de correção jth (1<j<n) na segunda amostra.
[0096] Nos casos em que a(s) sonda (s) e o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção tem uma relação de um para um, n é igual ao número do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção direcionada para a(s) sonda(s) de captura do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte.
[0097] Na Equação 6 e Equação 6’, n’, o número total de áreas de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção que foi(foram) efetivamente considerado(s) positivo(s) em todas as amostras comparadas, pode ser utilizado ou invés de n.
2-2. MÉTODO DE CORREÇÃO DE VALOR-FIXO
[0098] Este método assume que preliminarmente o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção é constante entre todas as amostras. Isto é, obtém-se a relação entre um valor fixo e o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção derivada de cada amostra, e esta relação é utilizada como fator de correção. Neste método, o valor fixo é utilizado como “valor de referência”. Assim, o número de fatores de correção obtidos é o mesmo que o número de amostras a ser corrigido. Neste caso, a “amostra de referência” descrita em 2-1 não existe, e, consequentemente, todas amostras submetidas a detecção de miRNA são “amostras a serem corrigidas”.
[0099] Mais especificamente, o fator de correção é calculado de acordo com a Equação 7 ou a Equação 7’.
[0100] r2-2 = (valor fixo (valor de referência)) / (valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida) ... Equação 7; - r2-2’ = (valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra a ser corrigida) / (valor fixo (valor de referência)) ... Equação 7’.
[0101] Por exemplo, nos casos em que a média é utilizada como valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, o fator de correção para a amostra a ser corrigida pode ser calculado de acordo com a equação 8 ou equação 8’.
[0102] Aqui, na Equação 8 e Equação 8’, α representa um valor fixo; n representa o número total de área(s) de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte; e Yj representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o miRNA endógeno de correção jth (1<j<n) em uma amostra.
[0103] Nos casos em que a(s) sonda (s) e o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção tem uma relação de um para um, n é igual ao número do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção direcionada para a(s) sonda(s) de captura do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção sobre o suporte.
[0104] Na Equação 8 e Equação 8’, n’, o número total de áreas de sonda imobilizada para capturar o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção que foi(foram) efetivamente considerado(s) positivo(s) em todas as amostras comparadas, pode ser utilizado ou invés de n.
[0105] Os detalhes do “valor fixo” para ser usado como o valor de referência são os mesmos que os do valor fixo na seção “1-2. Método de correção de valor-fixo”.
[0106] Subsequentemente, usando o fator de correção obtido pela etapa 1 de obtenção do fator de correção ou etapa 2 de obtenção do fator de correção, a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em uma amostra a ser corrigida é realizada utilizando a método da etapa 1 de correção ou etapa 2 de correção.
“ETAPA 1 DE CORREÇÃO”
[0107] A etapa 1 de correção é um processo em que a correção do nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é realizada usando o fator de correção obtido na etapa 1 de obtenção do fator correção, e a correção é realizada pela adição do fator de correção ao nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) ou pela subtração do fator de correção ao nível de expressão. Nesta etapa, há duas formas de realização da correção; uma corresponde ao método de obtenção da amostra de referência, e a outra corresponde ao método de correção de valor fixo, na etapa 1 de obtenção do fator de correção.
1 -1. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE AMOSTRA DE REFERÊNCIA
[0108] A correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) na(s) amostra(s) subsequente(s) é realizada usando um fator de correção obtido para cada uma da(s) amostra(s) subsequente(s). Ou seja, quando o nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) na segunda amostra é(são) corrigidos, é utilizado o fator de correção para a segunda amostra (C21-1 ou C21-1’), e, quando o(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) na terceira amostra é(são) corrigidos, é utilizado o fator de correção para a terceira amostra (C31-1 ou C31-1’).
[0109] No caso em que a diferença calculada pela subtração do valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada amostra subsequente a partir do valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência é usada como o fator de correção, ou seja, no caso da Equação 1 descrita acima, cada fator de correção individual é adicionado ao(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras subsequentes, levando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada amostra subsequente. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Isto é, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 9.
[0110] Aqui, Wi representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o i-ésimo miRNA.
[0111] Em contrapartida, no caso em que a diferença calculada pela subtração do valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência a partir do valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras subsequentes é usada como o fator de correção, ou seja, no caso da Equação 1’ descrita acima, cada fator de correção individual é subtraído do(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras subsequentes, levando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada amostra subsequente. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Ou seja, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA alvo em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 9’.
[0112] Aqui, a definição de Wi é a mesma que na Equação 9 descrita acima.
[0113] Quando o(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s), mensurado(s) na segunda amostra for(em) corrigido(s), c2 pode ser adicionado, ou c2’ pode ser subtraído, a cada valor logarítmico do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) na segunda amostra. O mesmo se aplica à terceira amostra e às amostras seguintes. Deve-se observar que, apesar da diferença entre o valor representativo da primeira amostra, que é utilizada como a amostra de referência, e o valor de referência, obviamente, 0, o(s) programa(s) pode(m) ser constituído(s) de tal maneira que o cálculo da adição de 0, ou subtração de 0, de cada nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) na primeira amostra é realizado.
1-2. MÉTODO DE CORREÇÃO DE VALOR FIXO
[0114] A correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é realizada utilizando cada fator de correção individual obtido a partir da diferença entre o valor representativo e um valor fixo (valor de referência). Isto é, quando o nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em uma determinada amostra é corrigido, é utilizado o fator de correção para a amostra determinada (r1-2 ou r1-2’).
[0115] No caso em que a diferença calculada pela subtração do valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras a partir do valor de referência é usada como o fator de correção, ou seja, no caso da Equação 3 descrita acima, cada fator de correção individual é adicionado ao(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras, levando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Ou seja, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA alvo em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 10.
[0116] Aqui, Wi representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o i-ésimo miRNA.
[0117] Em contraste, no caso em que a diferença calculada pela subtração do valor fixo a partir do valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras é utilizada como fator de correção, ou seja, no caso da Equação 3’ descrita acima, cada fator de correção individual é subtraído do(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras, levando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Ou seja, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA alvo em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 10’.
[0118] A definição de Wi é a mesma que na Equação 10 descrita acima.
“ETAPA 2 DE CORREÇÃO”
[0119] A etapa 2 de correção é um processo em que a correção do nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é realizada usando o fator de correção obtido na etapa 2 de obtenção do fator correção, e a correção é realizada pela divisão do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) pelo fator de correção ou pela multiplicação do(s) nível(eis) de expressão pelo fator de correção. Além disso, nessa etapa, há duas formas de realização da correção; uma corresponde ao método de obtenção da amostra de referência, e a outra corresponde ao método de correção de valor fixo, na etapa 2 de obtenção do fator de correção.
2-1. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE AMOSTRA DE REFERÊNCIA
[0120] A correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) na(s) amostra(s) subsequente(s) é realizada usando o fator de correção obtido para cada uma da(s) amostra(s) subsequente(s). Ou seja, quando o nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) na segunda amostra é(são) corrigidos, é utilizado o fator de correção para a segunda amostra (C221 ou C22-1’), e, quando o(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) na terceira amostra é(são) corrigidos, é utilizado o fator de correção para a terceira amostra (C32-1 ou C32-1’).
[0121] No caso em que a relação usada como fator de correção é calculada pela utilização do valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada amostra subsequente como um denominador e utilização do valor representativo de miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência como um numerador, ou seja, no caso da Equação 5 descrita acima, o(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras subsequentes e(são) multiplicado(s) por cada fator de correção individual, realizando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras subsequentes. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Ou seja, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA alvo em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 11.
[0122] Aqui, Wi representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o i-ésimo miRNA.
[0123] Em contrapartida, no caso em que a relação usada como fator de correção é calculada pela utilização do valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência como um denominador e utilização do valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras subsequentes como um numerador, ou seja, no caso da Equação 5 descrita acima, o(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras subsequentes e(são) dividido(s) por cada fator de correção individual, realizando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras subsequentes. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Isto é, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 11’.
[0124] Aqui, a definição de Wi é a mesma que na Equação 11 descrita acima.
[0125] Quando o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) mensurado(s) na segunda amostra é(são) corrigido(s), cada valor logarítmico do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) na segunda amostra pode ser dividido por c22-1, ou pode ser multiplicado por c22-1’. O mesmo se aplica à terceira amostra e às amostras seguintes. O valor finalmente obtido do nível de expressão corrigido Ei do miRNA alvo é o mesmo entre os procedimentos baseados na Equação 5 e Equação 11 e os procedimentos baseados na Equação 5’ e Equação 11’. Deve-se observar que, apesar da relação entre o valor representativo para a primeira amostra utilizada e o valor de referência é, obviamente, 1, o(s) programa(s) pode(m) ser constituído(s) de tal maneira que o cálculo da multiplicação ou divisão de cada nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) na primeira amostra por 1 seja realizado.
2-2. MÉTODO DE CORREÇÃO DE VALOR FIXO
[0126] A correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é realizada utilizando cada fator de correção individual obtido a partir da relação ao valor fixo (valor de referência). Isto é, quando o nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em uma determinada amostra é corrigido, é utilizado o fator de correção para a amostra determinada (r2-2 ou r2-2’).
[0127] No caso em que a relação é usada como fator de correção utilizando o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras como denominador e o valor de referência como numerador, ou seja, no caso da Equação 7 descrita acima, o(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras é(são) multiplicado(s) por cada fator de correção individual, realizando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Ou seja, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA alvo em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 12.
[0128] Aqui, Wi representa o valor de medição de sinal a partir da área de sonda imobilizada para capturar o i-ésimo miRNA.
[0129] Em contrapartida, no caso em que a relação é usada como fator de correção utilizando o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras como denominador e o valor de referência como numerador, ou seja, no caso da Equação 7’ descrita acima, o(s) valor(es) logarítmico(s) do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras é(são) dividido(s) pelo fator de correção, realizando assim a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) em cada uma das amostras. Neste caso, a correção pode ser expressa como a seguinte equação. Ou seja, o nível de expressão corrigido Ei do i-ésimo miRNA alvo em uma “amostra a ser corrigida” pode ser calculado de acordo com a seguinte Equação 12’.
[0130] Aqui, a definição de Wi é a mesma que na Equação 12 descrita acima.
“ETAPA DE ANÁLISE COMPARATIVA”
[0131] Com base no nível de expressão corrigido dos(s) miRNA(s) alvo(s), o nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) comparado(s) entre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais. Nos casos em que a correção é realizada pelo método de obtenção da amostra de referência, o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) no primeiro ensaio, que é utilizado como amostra de referência, não e(são) submetido(s) à correção. Portanto, por exemplo, a comparação entre a primeira amostra e a segunda amostra é realizada pela comparação do nível de expressão não corrigido de cada miRNA alvo na primeira amostra com o nível de expressão corrigido de cada miRNA alvo na segunda amostra. Assim, pelo menos uma das amostras a ser submetida à comparação é sempre uma amostra corrigida. Consequentemente, o termo “com base no nível de expressão corrigido dos(s) miRNA(s) alvo(s), o nível de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) comparado(s) entre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais” inclui modos em que a comparação é feita entre uma amostra de referência não corrigida e amostra(s) corrigida(s).
[0132] A própria etapa de análise comparativa pode ser realizada da mesma forma como nos métodos convencionais. Por exemplo, os resultados de análises comparativas podem ser representados como um diagrama de dispersão dos dados do nível de expressão, que é chamado de gráfico de dispersão. Por exemplo, ao realizar a comparação entre três amostras, dois gráficos de dispersão com base na análise comparativa entre qualquer uma das três amostras e cada uma das amostras restantes (por exemplo, um gráfico de dispersão com base na análise comparativa entre a primeira amostra e a segunda amostra, e um gráfico de dispersão com base na análise comparativa entre a primeira amostra e a terceira amostra) podem ser preparados, e, se necessário, um gráfico de dispersão adicional com base nas análises comparativas entre as duas amostras restantes (no caso exemplificado acima, seria entre a segunda amostra e a terceira amostra) pode ser preparado. A comparação entre quatro ou mais amostras também pode ser realizada da mesma maneira. No caso da análise comparativa entre três amostras, também pode ser preparado um gráfico de dispersão tridimensional. Mesmo nos casos do método de obtenção da amostra de referência, a comparação entre a amostra de referência e cada uma das duas amostras restantes não é necessariamente necessária, e, por exemplo, pode ser realiza a comparação entre a segunda amostra e a amostra de referência e a comparação entre a segunda amostra e a terceira amostra.
[0133] O resultado da análise comparativa também podem ser representados pelo log fold-change, que pode ser obtido pelo cálculo, com base no nível de expressão corrigido de cada miRNA alvo, a diferença no nível de expressão de cada miRNA alvo entre qualquer uma das amostras e a(s) amostra(s) restante(s). Por exemplo, pode ser calculada a diferença entre o nível de expressão de cada miRNA alvo na amostra de referência (no caso em que o método de obtenção da amostra de referência é utilizado) ou o nível de expressão corrigido de cada miRNA alvo na primeira amostra (no caso em que o método de correção de valor fixo é utilizado) e o nível de expressão de cada miRNA alvo corrigido em cada amostra subsequente. Também, neste caso, de forma semelhante aos casos descritos acima, o cálculo da diferença pode ser realizado não apenas entre a primeira amostra e a(s) amostra(s) restante(s), mas também entre qualquer uma as amostras subsequentes e a(s) a(s) amostra(S) restante(s).
[0134] O dispositivo de análise da expressão de miRNA da presente invenção é um dispositivo que realiza o método de análise comparativa da presente invenção descrito acima, e compreende: meios de memória que memorizam valores mensurados do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) e valores mensurados do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) endógeno(s) de correção selecionado(s) a partir dos miRNA(s) endógeno(s) de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10, em que os valores mensurados são aqueles obtidos por medições em uma pluralidade de amostras de fluidos corporais; meios de obtenção de valor representativo, para cada amostra de fluido corporal, um valor representativo, de preferência, um valor representativo expresso como um valor logarítmico, a partir do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção; meios de obtenção de um fator de correção que obtém, como um fator de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada amostra de fluido corporal, a diferença ou a relação entre um valor de referência que é arbitrariamente definido em ligação com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor representativo para cada amostra de fluido corporal mencionada acima obtida pela etapa de obtenção de valor representativo; meios de correção que corrigem o(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) mensurado(s) em cada amostra de fluido corporal usando cada fator de correção individual obtido pelos meios de obtenção do fator de correção; e meios de saída que geram resultado(s) de comparação do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) entre, pelo menos, duas amostras de fluidos corporais com base no(s) nível(eis) de expressão corrigido(s) do(s) miRNA(s) alvo(s).
[0135] Em um exemplo de realização, o valor de referência é o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na primeira amostra (amostra de referência), que é selecionado arbitrariamente, e os níveis de expressão dos miRNAs alvos mensurados nas amostras subsequentes são corrigidos. Ou seja, neste exemplo de realização, o dispositivo de análise da expressão de miRNAs da presente invenção compreende: meios de memória que memoriza os valores mensurados dos níveis de expressão de uma pluralidade de miRNAs alvos e valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção que foram mensurados simultaneamente em cada uma dentre a pluralidade de amostras; meios de obtenção de valor representativo, para cada amostra de fluido corporal, um valor representativo, de preferência, um valor representativo expresso como um valor logarítmico, a partir do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNAs endógenos de correção; meios de obtenção do fator de correção que obtém, utilizando uma primeira amostra selecionada de maneira arbitrária como amostra de referência e usando o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência como um valor de referência, a diferença ou a relação entre o valor de referência e o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras subsequentes restantes como fator de correção para cada uma das amostras subsequentes mencionadas acima; meios de correção que corrigem os níveis de expressão de miRNAs alvos mensurados em cada amostra subsequente usando o fator de correção para cada amostra subsequente obtida pelos meios de obtenção do fator de correção; e meios de saída que geram resultado(s) de comparação dos níveis de expressão de miRNAs alvos entre pelo menos duas amostras de fluidos corporais com base nos níveis de expressão corrigidos dos miRNAs alvos.
[0136] Em outro exemplo de realização, o valor de referência é um valor fixo arbitrariamente definido em ligação com o nível de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, e a correção dos níveis de expressão dos miRNAs alvos é realizada para todas as amostras, incluindo a primeira amostra. Ou seja, neste exemplo de realização, o dispositivo de análise da expressão de miRNAs da presente invenção compreende: meios de memória que memoriza os valores mensurados dos níveis de expressão de uma pluralidade de miRNAs alvos e valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção que foram mensurados simultaneamente em cada uma dentre a pluralidade de amostras de fluido corporal; meios de obtenção de valor representativo, para cada amostra, um valor representativo, de preferência, um valor representativo expresso como um valor logarítmico, a partir do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNAs endógenos de correção; meios de obtenção do fator de correção, que obtém utilizando um valor fixo como valor de referência, a diferença ou relação entre o valor de referência e o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras como um fator de correção para cada uma das amostras mencionadas acima; meios de correção que corrigem os níveis de expressão de miRNAs alvos mensurados em cada amostra utilizando o fator de correção para cada amostra obtida pelos meios de obtenção do fator de correção; e meios de saída que geram resultado(s) de comparação dos níveis de expressão de miRNAs alvos entre pelo menos duas amostras de fluidos corporais com base nos níveis de expressão corrigidos dos miRNAs alvos.
[0137] A Fig. 2 é um diagrama de blocos que ilustra um esboço da constituição de um exemplo do dispositivo de análise da presente invenção. Um dispositivo de análise da presente invenção 10 compreende uma unidade de entrada 110, unidade de visualização 120, unidade de saída 130, unidade de memória 140, unidade de controle 150, unidade de conversão 160, e unidade de análise 170. A Fig. 3 exibe um diagrama de fluxo exemplar do processo de correção para os níveis de expressão de miRNAs alvos de acordo com a presente invenção.
[0138] A unidade de entrada 110 é o meio para a introdução de informações sobre a operação pelo dispositivo de análise 10. Meios de entrada convencionalmente conhecidos, tais como teclados, podem ser preferencialmente utilizados. Os dados do nível de expressão obtidos por um ensaio de hibridização utilizando um microarranjo são, por exemplo, lidos por meios de leitura, tais como um scanner, que está separado do dispositivo da presente invenção, e, em seguida, são convertidos em dados numéricos. Os dados numéricos resultantes são introduzidos a partir da unidade de entrada 110 para o dispositivo de análise 10. Ou, os meios de leitura, tal como um scanner, podem estar contidos no dispositivo de análise 10 da presente invenção (não mostrado na figura).
[0139] Os dados de entrada do nível de expressão a partir da unidade de entrada 110, ou os dados do nível de expressão lidos e digitalizados pelos meios de leitura incorporados no dispositivo de análise 10, são memorizados na unidade de memória 140. Nesse processo, a unidade de memória 140 age com meio de memória que memoriza os valores mensurados dos níveis de expressão de uma pluralidade de miRNAs alvos e valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção que foram mensurados simultaneamente em cada uma dentre a pluralidade de amostras.
[0140] Os dados de valores mensurados sobre os níveis de expressão dos miRNAs alvos e miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada amostra armazenada na unidade de memória 140 são convertidos em logaritmos de base 2 pela unidade de conversão 160. Subsequentemente, pela unidade de análise 170, um valor representativo do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção convertido em logaritmo é obtido para cada amostra. Tal como descrito na explicação do método de análise comparativa, o valor representativo pode ser, por exemplo, a média ou mediana do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção (mesmo nos casos em que só um miRNA endógeno de correção é usado para a correção, o valor representativo pode ser a média ou mediana quando uma pluralidade de áreas de sondas imobilizadas para a medição de um miRNA endógeno de correção é disposta na matriz), ou pode ser um valor mensurado de um miRNA endógeno de correção específico.
[0141] Depois o valor representativo ser obtido, a diferença ou a relação entre o valor representativo para o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência e o valor representativo para o(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção em cada uma das amostras subsequente é calculada pela unidade de análise 170 para obter o fator de correção para cada uma das amostras subsequentes. Detalhes do processo de obtenção do fator de correção estão descritos na seção “Etapa de Obtenção do fator de correção” para o método de análise comparativa. Deve-se notar que o(s) programa(s) pode(m) ser constituído(s) de maneira que um fator de correção de 0 (no caso em que a diferença é calculada) ou um fator de correção de 1 (no caso em que a relação é calculada) é obtido para a primeira amostra, que é selecionada como a amostra de referência.
[0142] No dispositivo 10, a seleção da amostra de referência pode ser realizada por um operador do dispositivo 10, especificando arbitrariamente uma amostra a partir da unidade de entrada 110. Ou, o dispositivo 10 pode selecionar automaticamente uma amostra como a amostra de referência. Por exemplo, após a entrada dos dados na unidade de entrada 110, uma amostra cujos dados são primeiramente memorizados na unidade de memória 140 pode ser selecionada como amostra de referência pelo dispositivo 10. Na Fig. 3, por conveniência, a etapa de seleção ou entrada da amostra de referência é posicionada após a etapa de obtenção do valor representativo (S-3). No entanto, a posição desta etapa não está limitada a essa posição exemplificada, e a etapa também pode ser realizada como uma etapa anterior, por exemplo, quando os dados são armazenados.
[0143] Em seguida, a unidade de análise 170 corrige os dados dos níveis de expressão de miRNAs alvos mensurados em cada amostra de subsequente utilizando cada fator de correção para cada uma das amostras subsequentes. Os detalhes da operação de correção estão descritos na seção “Etapa de Correção” para o método de análise comparativa. Deve-se notar que o(s) programa(s) pode(m) ser constituído(s) de tal maneira que a operação de correção para os dados dos níveis de expressão de miRNAs alvos na primeira amostra, selecionada como amostra de referência, é realizada usando um fator de correção de 0 (no caso em que a diferença é calculada) ou um fator de correção de 1 (no caso em que a relação é calculada).
[0144] Em seguida, pela unidade de análise 170, é realizada a comparação entre os níveis de expressão dos miRNAs alvos na amostra de referência e os níveis de expressão corrigidos dos miRNAs alvos nas amostras subsequentes. Os resultados da comparação são emitidos pela unidade de saída 130 para a unidade de visualização 120 para serem exibidos. Além disso, o resultado da comparação pode ser emitido para um dispositivo de saída tal como uma impressora; meio de gravação e/ou semelhantes. A unidade de saída 130 também pode ser constituída de tal maneira que apresenta o resultado da análise comparativa por meio de uma rede para um dispositivo de memória externo, tal como uma base de dados presente fora do dispositivo 10.
[0145] A unidade de memória 140 memoriza os valores mensurados dos níveis de expressão de uma pluralidade de miRNAs alvos e níveis de expressão de uma pluralidade de miRNAs endógenos de correção, e também memoriza de forma adequada os resultados intermediários gerados em cada uma das etapas descritas acima.
[0146] As operações descritas acima pelo dispositivo 10 são controladas pela unidade de controle 150. Mais especificamente, conforme indicado pelas setas tracejadas na Fig. 2, as informações de controle são emitidas a partir da unidade de controle 150 para os meios, ou seja, a unidade de entrada 110, unidade de visualização 120, unidade de saída 130, unidade de memória 140, unidade de controle 150, unidade de conversão 160, e unidade de análise 170, e estes meios trabalham em conjunto de acordo com a informação de controle, para permitir a operação de todo o dispositivo 10.
[0147] No dispositivo de análise, em vez de usar o valor representativo do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência, tal como um valor de referência, um valor fixo especificado preliminarmente pode ser registrado na unidade de conversão 160, ou unidade semelhante no dispositivo 10, e pode ser utilizado como um valor de referência que substitui o valor representativo do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção na amostra de referência. Detalhes de tal método estão descritos em “Etapa Obtenção do Fator de Correção” e “Etapa de Correção” para o método de análise comparativa.
[0148] A presente invenção provê também programa(s) para fazer com que um computador funcione como dispositivo de análise descrito acima. Mais especificamente, o(s) programa(s) é(são) um programa(s) para fazer com que computador(es) funcione(m) como os meios descritos acima (ou seja, meios de memória, meios de obtenção do valor representativo, meios de obtenção do fator de correção, meios de correção, e meios de saída). A presente invenção provê também programa(s) para fazer com que um computador(es) execute(m) as etapas do método de análise comparativa descrito acima na presente invenção. O método de análise comparativa pode compreender a etapa de medição descrita acima, a etapa de obtenção do valor representativo, a etapa de obtenção do fator de correção, a etapa de correção, e também pode compreender a etapa de análise comparativa de comparação do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) dentre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais com base em um nível de expressão corrigido do(s) miRNA(s) alvo(s). Estes programas são programas que fazem com que um computador execute a correção do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) utilizando os dados sobre o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção que é(são) simultaneamente mensurado(s) com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s), utilizando um microarranjo ou similar.
[0149] A presente invenção provê ainda um meio de gravação de leitura por computador no qual uma parte do(s) programa(s) descrito(s) acima está(estão) gravado(s).
[0150] O “meio de gravação” pode ser um “meio físico portátil” arbitrário (meio de gravação não transitório), tal como um disco flexível, disco óptico magnético, ROM, EPROM, EEPROM, CD-ROM, MO ou DVD. Ou, o “meio de gravação” pode ser um “meio de comunicação” que mantém o(s) programa(s) por um curto período, tal como uma linha de comunicação ou de uma onda portadora utilizada para transmitir o(s) programa(s) através de uma rede representada pela LAN, WAN ou Internet.
[0151] O “programa” é um método de processamento de dados escrito em uma linguagem arbitrária ou um método de descrição arbitrária, e pode estar em qualquer formato incluindo código fonte e código binário. O “programa” não se limita a uma única configuração, e inclui um programa possuindo uma configuração distribuída como uma pluralidade de módulos e/ou bibliotecas, e um programa que implementa sua função em cooperação com programa(s) separado(s) representado(s) por um sistema operacional (OS). Em cada um dos dispositivos ilustrados no exemplo de realização, uma constituição e procedimento bem conhecidos podem ser usados como constituição específica para a leitura do meio de gravação, um procedimento de leitura, um procedimento de instalação após a leitura, e semelhantes.
[0152] A presente invenção provê um chip para a análise de expressão de miRNA, que compreende um suporte no qual as sondas de captura de uma pluralidade de miRNAs alvos e as sondas de captura de uma pluralidade de miRNAs endógenos de correção são imobilizadas. As condições preferidas para esse chip são àquelas descritas para o método de análise comparativa da presente invenção.
[0153] Na presente invenção, pelo menos um dos miRNAs mostrado nas SEQ ID NOs: 1 a 10 explicado a seguir é utilizado como a miRNA(s) endógeno(s) de correção.
[0154] SEQ ID NO: 1 é a sequência de bases do hsa-miR-6085 depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0023710. Na presente descrição, o termo “gene miR-6085” ou “miR-6085” inclui o hsa-miR-6085 descrito na SEQ ID NO: 1, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-6085 pode ser obtido pelo método descrito em Voellenkle C et al., (2012), RNA., Vol. 18, p. 472-484.
[0155] SEQ ID NO: 2 é a sequência de bases do hsa-miR-1227- 5p depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0022941. Na presente descrição, o termo “gene miR-1227-5p” ou “miR-1227-5p” inclui o hsa-miR- 1227-5p descrito na SEQ ID NO: 2, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-1227-5p pode ser obtido pelo método descrito em Berezikov E et al. (2007), Molecular Cell, vol. 28, pp. 328336.
[0156] SEQ ID NO: 3 é a sequência de bases do hsa-miR-2861 depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0013802. Na presente descrição, o termo “gene miR-2861” ou “miR-2861” inclui o hsa-miR-2861 descrito na SEQ ID NO: 3, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-2861 pode ser obtido pelo método descrito em Li H et al. (2009), Journal of Clinical Investigation, vol. 119, pp. 3666-3677.
[0157] SEQ ID NO: 4 é a sequência de bases do hsa-miR-149-3p depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0004609. Na presente descrição, o termo “gene miR-149-3p” ou “miR-149-3p” inclui o hsa-miR-149- 3p descrito na SEQ ID NO: 4, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-149-3p pode ser obtido pelo método descrito em Lagos-Quintana M et al., (2002), Curr Biol., Vol. 12, p. 735-739.
[0158] SEQ ID NO: 5 é a sequência de bases do hsa-miR-4463 depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0018987. Na presente descrição, o termo “gene miR-4463” ou “miR-4463” inclui o hsa-miR-4463 descrito na SEQ ID NO: 5, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-4463 pode ser obtido pelo método descrito em Jima DD et al. (2010), Blood, vol. 116, pp. e118-e127.
[0159] SEQ ID NO: 6 é a sequência de bases do hsa-miR-4508 depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0019045. Na presente descrição, o termo “gene miR-4508” ou “miR-4508” inclui o hsa-miR-4508 descrito na SEQ ID NO: 6, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-4508 pode ser obtido pelo método descrito em Jima DD et al. (2010), Blood, vol. 116, pp. e118-e127.
[0160] SEQ ID NO: 7 é a sequência de bases do hsa-miR-6090 depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0023715. Na presente descrição, o termo “gene miR-6090” ou “miR-6090” inclui o hsa-miR-6090 descrito na SEQ ID NO: 7, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-6090 pode ser obtido pelo método descrito em Yoo JK et al. (2012), Stem Cells and Development, vol. 21, pp. 2049-2057.
[0161] SEQ ID NO: 8 é a sequência de bases do hsa-miR-6775- 5p depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0027450. Na presente descrição, o termo “gene miR-6775-5p” ou “miR-6775-5p” inclui o hsa-miR- 6775-5p descrito na SEQ ID NO: 8, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-6775-5p pode ser obtido pelo método descrito em Ladewig E et al. (2012), Genome Research, vol. 22, pp.1634-1645.
[0162] SEQ ID NO: 9 é a sequência de bases do hsa-miR-6803- 5p depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0027506. Na presente descrição, o termo “gene miR-6803-5p” ou “miR-6803-5p” inclui o hsa-miR- 6803-5p descrito na SEQ ID NO: 9, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-6803-5p pode ser obtido pelo método descrito em Ladewig E et al. (2012), Genome Research, vol. 22, pp.1634-1645.
[0163] SEQ ID NO: 10 é a sequência de bases do hsa-miR-5787 depositado na miRBase sob o N° de Acesso: MIMAT0023252. Na presente descrição, o termo “gene miR-5787” ou “miR-5787” inclui o hsa-miR-5787 descrito na SEQ ID NO: 10, e seus homólogos e ortólogos em outras espécies de organismos. O gene hsa-miR-5787 pode ser obtido pelo método descrito em Yoo H et al. (2011), Biochem Biophys Res Commun, vol. 415, pp. 567-572.
EXEMPLOS
[0164] A presente invenção é descrita abaixo de maneira concreta por meio de Exemplos. No entanto, a presente invenção não se limita aos Exemplos a seguir.
EXEMPLO 1
[0165] Pelos seguintes processos, os miRNAs endógenas de correção para a utilização na presente invenção foram selecionados.
(MICROARRANJO DE DNA (DNA MICROARRAY))
[0166] Usando um oligo chip de miRNA humano “Gene-3D” (baseado no miRBase release 20), fabricado pela Toray Industries, Inc., o seguinte experimento foi realizado.
(PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE RNA)
[0167] Como amostras de RNAs, foram usados RNAs extraídos de 157 amostras de soro de humanos saudáveis usando o reagente de extração de RNA do “Gene 3D” a partir do kit de amostra líquida. Os RNAs das amostras obtidas foram marcados utilizando o kit de marcação de miRNA “Gene-3D” (Toray Industries, Inc.). As amostras de RNAs marcadas foram submetidas a hibridização e lavagem de acordo com o protocolo padrão para o chip de miRNA “Gene-3D” (Toray Industries, Inc.). O microarranjo de DNA após a reação foi submetido à detecção de sinais de fluorescência, usando um scanner de microarranjo (Toray Industries, Inc.). As configurações do scanner foram as seguintes: saída do laser, 100%; tensão photomultiplier, AUTO.
(OBTENÇÃO DOS VALORES DE SINAL DE MIRNA)
[0168] Os valores de sinal de miRNAs obtidos a partir do microarranjo de DNA foram convertidos em logaritmos base 2, e a correção de erros experimental foi realizada utilizando um ácido nucleico padrão externo adicionado após a extração de RNA e marcação.
(OBTENÇÃO DE MIRNAS ENDÓGENOS DE CORREÇÃO)
[0169] Utilizando os valores de sinal de miRNAs obtidos a partir de um total de 157 amostras, após a correção do erro experimental, miRNAs mostrando variação interamostra mínima foram extraídos pelo método geNorm. O método GeNorm é um método de pesquisa para genes endógenos housekeeping (genes de referência) no método de RT-PCR quantitativo, propostos por Vandesompele et al. (Genome Biology 2002, 3: research 0034 - research 0034.11). Este método é utilizado para a seleção de mRNAs para genes housekeeping endógenos específicos para as amostras a serem investigadas. Mais especificamente, a relação entre o valor do sinal de dois genes é calculada para todas as combinações possíveis de dois genes gerados a partir de todos os genes detectados em cada amostra individual. Subsequentemente, os erros padrão entre as amostras são calculados para os valores (A) da relação obtida para todas as combinações dos genes. Em seguida, o total (H) dos erros padrão (V) obtido entre um gene particular e outros genes é calculado. Os genes que possuem valores M pequenos são considerados como excelentes genes housekeeping endógenos.
[0170] Por outro lado, diz-se que o menor dos valores de sinal, valores A e V mais baixos obtidos pelo método do cálculo descrito acima, são genes com baixos valores de sinal encontrados como genes housekeeping endógenos aparentemente excelentes. Uma vez que o microarranjo de DNA utilizado no presente ensaio detecta exaustivamente todos os miRNAs depositados no miRBase release 20, miRNAs possuindo baixos valores de sinal são preferencialmente selecionados quando o método geNorm é realizado usando estes dados. Devido a este fenômeno, o uso do método geNorm para seleção de genes housekeeping endógenos na detecção dos microarranjos de DNA foi até agora evitado.
[0171] No presente exemplo, entre os miRNAs detectados com o microarranjo de DNA, apenas miRNAs que foram detectados de forma estável e que exibem um sinal de valor maior que 64 em mais de metade das amostras foram selecionados como sujeitos aos quais deve ser aplicado o método geNorm. Além disso, o método geNorm é caracterizado pelo fato de que genes housekeeping endógenos são selecionados com base nas proporções de expressão gênica calculadas dentro de uma amostra, e, consequentemente, um gene que exibe um nível de expressão estável pode ser dificilmente selecionado entre amostras que exibem padrões de expressão largamente diferentes entre si. Em vista disso, obtivemos CV (erro padrão / média) com antecedência para cada um dos valores de sinal de miRNA de um total de 157 amostras cujos erro experimentais haviam sido corrigidos, e apenas miRNAs com um CV não superior a 0,1 foram selecionados como indivíduos para os quais o método geNorm deve ser aplicado. Como resultado, dentre os valores de sinal obtidos a partir de sondas para a detecção de 2555 tipos de miRNAs, os valores de sinal de sondas para a detecção de 281 tipos de miRNAs foram considerados adequados como sujeitos para os quais o método geNorm deve ser aplicado.
[0172] Destes 281 tipos de miRNAs aos quais o método geNorm foi realmente aplicado, nós selecionamos 10 tipos de genes housekeeping endógenos que tinham baixos valores de M, ou seja, que podem ser utilizados como miRNAs endógenos de correção. A SEQ ID NOs destes 10 tipos de miRNAs endógenos de correção, nomes dos miRNAs, números MIMAT depositados na miRBase, valores M calculados pelo geNorm, sequências de bases, e a relação guanina/citosina (GC%) em cada sequência são mostrados na Tabela 1.TABELA 1
[0173] A detecção de miRNAs usando um microarranjo de DNA é realizada pelo método de hibridização, que é dependente da formação de cadeias duplas do ácido nucleico entre miRNAs alvos e as sondas para captura dos miRNA alvo. Portanto, espera-se que as sequências possuindo teores elevados de guanina e citosina, que estabilizam cadeias duplas do ácido nucleico, podem ser detectadas de forma estável, especialmente pelo microarranjo de DNA. Ou seja, pode assumir que as sequências possuindo um elevado teor de guanina e citosina são preferencialmente selecionadas como genes housekeeping endógenos. No entanto, como mostrado na Tabela 1, os genes housekeeping endógenos (miRNAs endógenos de correção) que foram selecionados pelo método geNorm não têm necessariamente teores elevados de guanina e citosina. Além disso, também não se observou o fenômeno de que miRNAs possuindo teores elevados de guanina e citosina, preferencialmente, tornam-se genes housekeeping endógenos (miRNAs endógenos de correção).
EXEMPLO 2
[0174] A correção dos níveis de expressão de RNA alvo em uma pluralidade de amostras de fluidos corporais foi realizada utilizando os miRNAs endógenos de correção selecionados individualmente.
[0175] Devido à instabilidade física do RNA, a medição do nível de expressão de RNA muitas vezes requer a comparação do nível de expressão absoluta entre amostras com diferentes qualidades, ou seja, com diferentes graus de degradação de RNA. Em particular, quando os fluidos corporais são usados como amostras, pode haver uma situação em que é feita uma tentativa de obter um determinado resultado medindo os níveis de expressão de miRNA alvo nas amostras que foram armazenadas em temperatura ambiente durante um longo período de tempo.
[0176] Em tal situação, através da realização de correção, dependendo do grau de degradação de RNA utilizando como referência a(s) quantidade(s) de um determinado miRNA endógeno de correção contido no soro, a comparação absoluta do perfil de expressão de miRNA (relação do nível de expressão de relativa de miRNA) entre as amostras pode se tornar possível, independentemente da qualidade do RNA.
[0177] No presente exemplo, o soro coletado de humano foi armazenado sob diferentes condições para preparar amostras de soro contendo miRNAs em vários níveis de qualidade, e o método de correção da presente invenção foi aplicado aos valores mensurados das amostras de RNA extraídas derivadas destas amostras de soro.
(MICROARRANJO DE DNA (DNA MICROARRAY}}
[0178] Usando um oligo chip de miRNA humano “Gene-3D” (baseado no miRBase release 20), fabricado pela Toray Industries, Inc., o seguinte experimento foi realizado.
(PREPARAÇÃO DA AMOSTRA DE RNA)
[0179] O sangue humano foi coletado e submetido a separação do soro. Em seguida, o soro separado foi deixado repousar sob as duas seguintes condições diferentes para permitir alterações na qualidade do RNA contido no soro. As duas condições diferentes foram as seguintes: 1: Após a separação do soro, o soro foi deixado em repouso em temperatura ambiente durante 6 horas, e a extração do RNA foi então realizada. 2: Após a separação do soro, o soro foi deixado em repouso a 25°C durante 24 horas, e a extração do RNA foi então realizada. A partir do soro preparado sob cada condição, o RNA total foi extraído usando o reagente de extração de RNA “Gene-3D” a partir do kit para extração de RNA em amostra líquida, para proporcionar o RNA da amostra.
[0180] Cada RNA obtido das amostras foi marcado utilizando o kit de marcação de miRNA “Gene-3D” (Toray Industries, Inc.). As amostras de RNAs marcadas foram submetidas a hibridização e lavagem de acordo com o protocolo padrão para o “3D-Gene” human miRNA oligo chip (Toray Industries, Inc.). O microarranjo de DNA após a reação foi submetido à detecção de sinais de fluorescência, usando um scanner de microarranjo (Toray Industries, Inc.). As configurações do scanner foram as seguintes: saída do laser, 100%; tensão photomultiplier, AUTO.
(CORREÇÃO DOS VALORES DE SINAL DE MIRNA)
[0181] Fig. 4A mostra as distribuições dos valores de sinal obtidos por conversão dos valores do sinal de miRNAs obtidos a partir do microarranjo de DNA em logaritmos base 2 (isto é, valores de sinal não corrigidos dos níveis de expressão). Por outro lado, as Figs. 4B a K mostram as distribuições dos valores de sinal corrigidos obtidos pela correção utilizando os valores do sinal dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 e os valores de referência que eram valores fixos separadamente ajustados de maneira antecipada. Nas figuras, Dia-0 (linha tracejada) indica a amostra de RNA obtida pela Condição 1, e Dia-1_25 ° C (linha sólida) indica a amostra de RNA obtida pela Condição 2.
[0182] Aqui, a correção utilizando os valores de sinal dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 foi realizada segundo o método descrito abaixo.
[0183] Para cada um dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10, foi definido um valor fixo para ser usado como valor de referência. Além disso, os valores de sinal dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 em cada uma das amostras foram convertidos em logaritmos base 2, e os valores de sinal convertidos foram utilizados como valores representativos. A relação entre cada valor representativo e cada valor de referência (valor de referência / valor representativo) foi calculada para proporcionar um fator de correção. Assim, o fator de correção foi definido para cada um dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10. Todos os valores de sinal de miRNA em cada amostra foram multiplicadas pelo fator de correção calculado a partir de cada miRNA endógeno de correção, para realizar a correção.
[0184] Como resultado, conforme mostrado nas Figs. 4B a K, os perfis das duas amostras preparadas de acordo com as diferentes condições de expressão poderiam ser acordados entre si pela utilização de qualquer um dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10.
EXEMPLO 3
[0185] Como mostrado no Exemplo 2, os miRNAs endógenos de correção exibidos nas SEQ ID NOs: 1 e 10 têm um efeito suficiente para corrigir os níveis de expressão dos miRNAs alvos, mesmo quando são usados individualmente. Além disso, mesmo que a perda parcial de dados a partir dos miRNAs endógenos para correção ocorra devido a uma falha na experiência ou semelhante, a complementação dos dados perdidos pode ser possível, utilizando-os em combinação. Em vista disto, uma pluralidade de miRNAs endógenos de correção foram usados em combinação para realizar correção dos níveis de expressão de miRNAs alvos, e a eficácia da correção foi verificada. As amostras utilizadas foram as mesmas que do Exemplo 2.
[0186] Os valores de sinal dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 2, 4, e 5 foram convertidos em logaritmos base 2, e a média ou mediana dos valores de sinal convertidos foi obtida para proporcionar um valor representativo. Como um valor de referência, foi usado um valor fixo. A média dos níveis de expressão (valores de sinal logarítmicos convertidos) de todos os três miRNAs endógenos de correção em todos de uma pluralidade de amostras de RNA do soro, incluindo os dois tipos de amostras preparadas no Exemplo 2 foi calculada, e a média calculada foi usada como valor fixo (valor de referência). Em cada amostra, foi calculada a relação entre o valor representativo dos miRNAs endógenos de correção e o valor de referência (valor de referência / valor representativo) para proporcionar um fator de correção para a amostra. Todos os valores de sinal do miRNA alvo em cada amostra correspondente foram multiplicados por cada fator de correção correspondente para executar a correção dos valores de sinal do miRNA alvo.
[0187] A Fig. 5 mostra as distribuições dos valores de sinal corrigido dos miRNAs alvos obtidos, utilizando a média dos valores de sinal convertidos em logaritmo como valor representativo dos níveis de expressão dos miRNAs endógenos de correção. De modo semelhante ao descrito no Exemplo 2, em que a correção foi realizada usando os miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 individualmente, os perfis de expressão dos miRNAs alvos das amostras poderiam ser acordados entre si pela realização da correção usando uma combinação de uma pluralidade de miRNAs endógenos de correção.
EXEMPLO 4
[0188] Conforme mostrado no Exemplo 3, os miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 também são úteis para a correção quando eles são usados em combinação. Dessa forma, foi investigado se qualquer combinação das SEQ ID NOs: 1 a 10 pode ou não apresentar um efeito de correção semelhante. As amostras utilizadas foram as mesmas que do Exemplo 2.
[0189] Os valores de sinal dos miRNAs endógenos de correção mostrados na SEQ ID NOs: 2, 3, 4, 5 e 6 foram convertidos em logaritmos base 2, e a média dos valores dos sinais convertidos de três tipos de correção de miRNAs endógenos arbitrariamente selecionados foi obtida para cada amostra para proporcionar um valor representativo na amostra. Um valor fixo foi usado como valor de referência. A média dos valores de sinal convertidos em logaritmo dos três tipos de miRNAs endógenos de correção, os quais foram utilizados para se obter o valor representativo, em uma pluralidade de amostras de RNA de soro, incluindo os dois tipos de amostras preparadas no Exemplo 2, foi utilizada como valor fixo (valor de referência). Em cada amostra, foi calculada a relação entre o valor representativo e o valor de referência (valor de referência / valor representativo) para proporcionar um fator de correção para a amostra. Todos os valores de sinal dos miRNAs alvos em cada amostra correspondentes foram multiplicados por cada fator de correção correspondente, efetuando assim a correção dos níveis de expressão dos miRNAs nas amostras.
[0190] As distribuições dos valores de sinal corrigidos são mostradas na Fig. 8. Fig. 8A mostra a distribuição dos valores de sinal do nível de expressão não corrigidos, e a Fig. 8B mostra as distribuições dos valores de sinal do nível de expressão corrigidos. De modo semelhante ao descrito no Exemplo 2, em que a correção foi realizada usando os miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 individualmente, os perfis de expressão dos miRNAs alvos das amostras poderiam ser acordados entre si.
EXEMPLO COMPARATIVO 1
[0191] O estudo no Exemplo 1 foi realizado da mesma maneira, exceto que na etapa de identificação de cada amostra de RNA obtida a partir do RNA sérico utilizando o kit de marcação de miRNA “Gene-3D” (Toray Industries, Inc.), dois tipos de sequências de RNAs sintéticos (sendo cada uma sequência de 20-mers; referidas como controle de pico 1 e controle de pico 2) foram adicionados como substâncias de referência que foram adicionadas externamente. As sequências destes RNAs sintéticos foram marcadas por fluorescência de maneira semelhante aos miRNAs derivados do soro, e os seus níveis de sinal foram detectados pelo oligo chip de miRNA humano “Gene-3D” (Toray Industries, Inc.). Os valores de sinal obtidos a partir de um total de 16 spots, isto é, 8 spots para cada um dos controle pico 1 e controle de pico 2, foram convertidos em logaritmo base 2, e a média dos valores de sinal convertidos foi obtida para proporcionar um valor representativo. A razão entre este valor representativo e um valor fixo (valor de referência), que foi pré-definido (valor de referência / valor representativo de cada amostra) foi calculada para proporcionar um fator de correção para cada amostra. Todos os valores de sinal de miRNAs em cada amostra foram multiplicados por este fator de correção para realizar a correção. As distribuições dos valores de sinal não corrigidos são mostradas na Fig. 6A, e as distribuições dos valores de sinal corrigidos são mostradas na Fig. 6B. Foi mostrado que a correção pelos controles de pico adicionados externamente após a marcação não conseguiu corrigir suficientemente os valores de sinal dos miRNAs alvos nas amostras.
EXEMPLO COMPARATIVO 2
[0192] A Tabela 2 mostra os níveis de expressão let-7d-5p, let- 7g-5p, let-7i-5p, miR-16, miR-31 e miR-223 mensurados do mesmo modo que no Exemplo 2, cuja utilização na correção dos níveis de expressão miRNAs foi mostrada nos exemplos da técnica anterior. Com exceção do has-miR-16-5p, esses miRNAs exibiram apenas sinais dentro do intervalo de 0 a 5, em termos dos valores calculados pela conversão dos valores de sinal obtidos em logaritmo base 2. Assim, eles foram considerados como não sendo apropriados como referência para corrigir os níveis de expressão de todos os miRNAs devido aos seus níveis de expressão insuficientes. A Fig. 7 mostra as distribuições dos valores de sinal corrigidos obtidos pela correção com hsa- miR-16-5p. Foi mostrado que a correção usando o nível de expressão do hsa- miR-16-5p não conseguiu corrigir os valores de sinal dos miRNAs alvos nas amostras.TABELA 2 DESCRIÇÃO DOS SÍMBOLOS 10 Dispositivo 110 Unidade de entrada 120 Unidade de visualização 130 Unidade de saída 140 Unidade de memória 150 Unidade de controle 160 Unidade de conversão 170 Unidade de análise

Claims (7)

1. MÉTODO PARA A ANÁLISE COMPARATIVA DO NÍVEL DE EXPRESSÃO DE miRNA(S) ALVO(S) dentre uma pluralidade de amostras de fluidos corporais, caracterizado pelo referido método compreender: uma etapa de medição para mensurar simultaneamente nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s) e nível(eis) de expressão de um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 nas respectivas amostras de fluido corporal; uma etapa de obtenção de valor representativo para a obtenção de um valor representativo de cada uma da referida pluralidade de amostras de fluido corporal a partir de valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10; uma etapa a obtenção de um fator de correção, tal como um fator de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) em cada amostra de fluido corporal, a diferença ou a relação entre um valor de referência que é arbitrariamente definido em ligação com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção e o valor representativo para cada amostra de fluido corporal obtida na etapa de obtenção de valor representativo; e uma etapa de correção para a correção do nível de expressão de miRNA(s) alvo(s) mensurado(s) em cada amostra de fluido corporal usando o fator de correção obtido para cada referida amostra de fluido corporal.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela correção na referida etapa de correção ser realizada da seguinte forma: (a) no caso quando um valor calculado pela subtração do referido valor de referência a partir do referido valor representativo é obtido como fator de correção na referida etapa de obtenção do fator de correção, o fator de correção é subtraído do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s); (b) no caso quando um valor calculado pela subtração do referido valor representativo a partir do referido valor de referência é obtido como um fator de correção na referida etapa de obtenção do fator de correção, o fator de correção é adicionado ao(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão de miRNA(s) alvo(s); (c) no caso quando um valor calculado pela divisão do referido valor representativo pelo referido valor de referência é obtido como um fator de correção na referida etapa de obtenção do fator de correção, o(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) dividido(s) pelo fator de correção; (d) no caso quando um valor calculado pela divisão do referido valor de referência pelo referido valor representativo é obtido como um fator de correção na referida etapa de obtenção do fator de correção, o(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) alvo(s) é(são) multiplicado(s) pelo fator de correção.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo valor de referência ser um valor fixo definido arbitrariamente em conexão com o(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção, ou um valor representativo para do(s) nível(eis) de expressão do(s) miRNA(s) endógeno(s) de correção obtido(s) para uma primeira amostra de fluido corporal, sendo a referida primeira amostra de fluido corporal arbitrariamente selecionada a partir da referida pluralidade de amostras de fluido corporal.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela etapa de medição compreender a realização da hibridização, colocando sondas de ácidos nucleicos para a captura de uma pluralidade de miRNAs alvos e sonda(s) para capturar a um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10, e as referidas sondas serem imobilizadas sobre um suporte, em contato com uma amostra de ácidos nucleicos derivada de cada uma das amostras de fluidos corporais, e a referida amostra de ácido nucleico ser marcada com uma substância de marcação, e a obtenção dos níveis de expressão dos miRNAs alvos e os referidos um ou mais miRNAs endógenos de correção como valores de medição da intensidade de sinal.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela referida amostra de fluido corporal ser sangue, soro ou plasma.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo referido valor representativo ser uma média ou mediana expressa como um valor logarítmico calculado a partir do(s) valor(es) mensurado(s) do(s) nível(eis) de expressão do um ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10.
7. CHIP PARA ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE miRNA,caracterizado por compreender um suporte no qual as sondas de captura de uma pluralidade de miRNA(s) alvo(s) e sonda(s) para a captura de uma ou mais miRNAs endógenos de correção selecionados a partir dos miRNAs endógenos de correção mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 10 são imobilizadas.
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