WO2016034617A1 - Utilisation de l'acide valproïque ou de ses dérivés dans le traitement des insuffisances en hepcidine et de leurs conséquences - Google Patents

Utilisation de l'acide valproïque ou de ses dérivés dans le traitement des insuffisances en hepcidine et de leurs conséquences Download PDF

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WO2016034617A1
WO2016034617A1 PCT/EP2015/070038 EP2015070038W WO2016034617A1 WO 2016034617 A1 WO2016034617 A1 WO 2016034617A1 EP 2015070038 W EP2015070038 W EP 2015070038W WO 2016034617 A1 WO2016034617 A1 WO 2016034617A1
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WO
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valproic acid
derivative
deficiency
hepcidin
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Application number
PCT/EP2015/070038
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Inventor
Marie-Laure ISLAND
Olivier Loreal
Pierre BRISSOT
Original Assignee
Centre Hospitalier Universitaire Pontchaillou
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
Universite De Rennes 1
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Publication date
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    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
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    • A61P7/06—Antianaemics

Definitions

  • the present invention relates to the use of valproic acid or a derivative thereof for treating hepcidino-deficiencies and their consequences.
  • iron overload pathologies involve hepcidin (Ganz, Blood, 201 1, 117: 4425-4433), a peptide synthesized in the liver by hepatocytes and secreted in plasma. This circulating peptide interacts with ferroportin, an iron-exporting protein expressed on the membrane of cells (macrophages, enterocytes), causing its degradation, and therefore limits the iron's exit from cells to the plasma that is mediated by ferroportin. Thus the cellular content of iron and the concentration of iron in the plasma are controlled.
  • iron chelating molecules are limited because of the risk of side effects on cells not overloaded with iron (benefit / risk balance), the chelators being able to extract iron from all the cells. It should be noted that the depletive treatment, whatever its embodiment, is not curative because, if it makes it possible to remove excess iron, it does not prevent the excess of iron being constituted. .
  • the treatment of iron overload secondary to hematological diseases can not use bloodletting because there is anemia and / or risks of intolerance to bleeding. In this case, the use of iron chelators is the rule.
  • the present invention is based on the demonstration that valproic acid, which is a molecule used for a long time in the treatment of epilepsy and as a thymoregulator (Chateautari et al., J. Biomed, Biotechnol, 2010, pii: 479364. doi: 10.1155 / 2010 / 479364. Epub 2010 Jul 29. Review), affects the expression of hepcidin. Indeed, surprisingly and unexpectedly, the present inventors have shown that valproic acid induces the expression of hepcidin in a line of human hepatocyte origin (HepG2) in a dose-dependent manner and for concentrations lower than the therapeutic concentrations. epilepsy. They also observed a similar effect with valpromide, a derivative of valproic acid, which is also used in the treatment of epilepsy.
  • the present invention relates to valproic acid, or a pharmaceutically acceptable derivative thereof, for use in the treatment of hepcidin deficiency or hepcidino deficiencies.
  • the pharmaceutically acceptable derivative is selected from the salts of valproic acid (e.g., sodium valproate, potassium valproate, calcium valproate or divalproex sodium), valproic acid esters.
  • valproic acid e.g., sodium valproate, potassium valproate, calcium valproate or divalproex sodium
  • valproic acid esters e.g valproyl taurinamide, N-methyl valproyl taurinamide, ⁇ , ⁇ -dimethyl valproyl taurinamide, or N-isopropyl valproyl taurinamide
  • thioesters of valproic acid e.g.
  • valpromide 2-hydroxypropyl valpromide, or valrocemide
  • thioamides of valproic acid oligomers of valproic acid, and mixtures thereof.
  • the pharmaceutically acceptable derivative is valpromide.
  • hepcidin deficiency or hepcidino-deficiency is associated with hereditary hemochromatosis.
  • Hereditary hemochromatosis can be type 1 genetic hemochromatosis (so-called classical, which is linked to a mutation in the HFE gene), juvenile hemochromatosis (type 2A, which is linked to a mutation in the hemojuvelin gene (HJV ), or type 2B, which is linked to a mutation in the hepcidin gene (HAMP)), and type 3 hemochromatosis (mutations in the TFR2 gene).
  • type 1 genetic hemochromatosis ser-called classical, which is linked to a mutation in the HFE gene
  • juvenile hemochromatosis type 2A, which is linked to a mutation in the hemojuvelin gene (HJV )
  • type 2B which is linked to a mutation in the hepcidin gene (HAMP)
  • type 3 hemochromatosis mutants in the TFR2 gene
  • hepcidin deficiency or hepcidino-deficiency is associated with iron overload anemia.
  • anemia with iron overload may be thalassemia (eg ⁇ -thalassemia), congenital dyserythropoietic anemia, congenital or acquired sideroblastic anemia, congenital or acquired hypotransferrinemia, congenital or acquired atransferrinemia, or aculoplasminemia congenital.
  • Anemia with iron overload may also be congenital haemolytic anemia, such as stomatocytosis, xerocytosis, spherocytosis, and certain enzymopathies such as pyrimidine nucleotide deficiency, G6PD deficiency type I, pyrimidine deficiency 5 nucleotidase, and pyruvate kinase deficiency).
  • congenital haemolytic anemia such as stomatocytosis, xerocytosis, spherocytosis, and certain enzymopathies such as pyrimidine nucleotide deficiency, G6PD deficiency type I, pyrimidine deficiency 5 nucleotidase, and pyruvate kinase deficiency.
  • Anemia with iron overload can also be a myelodysplastic syndrome, such as refractory cytopenia with unilateral dysplasia, refractory anemia with or without crown sideroblasts, myelodysplastic syndrome with multi-lineage myelodysplasia (CRMD), 5q syndrome -, refractory anemia with excessive blasts (AREB), or unclassifiable myelodysplastic syndrome.
  • myelodysplastic syndrome such as refractory cytopenia with unilateral dysplasia, refractory anemia with or without crown sideroblasts, myelodysplastic syndrome with multi-lineage myelodysplasia (CRMD), 5q syndrome -, refractory anemia with excessive blasts (AREB), or unclassifiable myelodysplastic syndrome.
  • hepcidin deficiency or hepcidino-deficiency is associated with chronic liver disease.
  • Chronic liver disease often cirrhotic, may be, for example, viral hepatitis, particularly chronic hepatitis C and chronic hepatitis B, alcoholic liver disease, or non-alcoholic steatohepatitis.
  • the present invention relates to the use of valproic acid, or a pharmaceutically acceptable derivative thereof, for the manufacture of a medicament useful in the treatment of hepcidin deficiency or hepcidino-deficiency.
  • the pharmaceutically acceptable derivative may be any valproic acid derivative, particularly those described herein.
  • the subject is a human being.
  • the subject suffering from insufficiency in hepcidin or hepcidino-deficiency may be suffering from a disease mentioned above.
  • the therapeutically effective amount of valproic acid, or a pharmaceutically acceptable derivative thereof, or a pharmaceutical composition comprising valproic acid or a pharmaceutically acceptable derivative thereof, administered to the subject is lower than the therapeutic doses usually given in the treatment of epilepsy.
  • the cell is an in vitro cell. In other embodiments, the cell is an in vivo cell. In some embodiments, the cell is a liver cell.
  • the present invention also relates to a method for increasing the expression of hepcidin in a cell comprising contacting the cell with an effective amount of valproic acid or a derivative thereof or a pharmaceutical composition comprising valproic acid or a derivative thereof.
  • the valproic acid derivative can be any derivative, including those described herein.
  • the cell is an in vitro cell. In other embodiments, the cell is an in vivo cell.
  • the cell is a liver cell.
  • the present invention relates to valproic acid, or a pharmaceutically acceptable derivative thereof, for use in the treatment of iron overloads (whether or not the overload is known to be associated with hepcidin deficiency). or a hepcidino-deficiency).
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising valproic acid, or a pharmaceutically acceptable derivative thereof and at least one physiologically acceptable carrier or excipient for use in the treatment of iron overloads, and a method of treatment iron overload in a subject comprising administering to a therapeutically effective amount of valproic acid or a pharmaceutically acceptable derivative thereof or a pharmaceutical composition comprising valproic acid or a one of its pharmaceutically acceptable derivatives.
  • the present invention relates to the use of valproic acid or a derivative thereof to enhance the expression of hepcidin in a cell.
  • the valproic acid derivative can be any derivative, including those described herein.
  • the cell is an in vitro cell. In other embodiments, the cell is an in vivo cell.
  • the cell is a liver cell.
  • the present invention also relates to a method for increasing the expression of hepcidin in a cell comprising contacting the cell with an effective amount of valproic acid or a derivative thereof or a pharmaceutical composition comprising valproic acid or a derivative thereof.
  • the valproic acid derivative can be any derivative, including those described herein.
  • the cell is an in vitro cell. In other embodiments, the cell is an in vivo cell.
  • the cell is a liver cell.
  • valproic acid is meant the compound of formula (I) also called 2-propylpentanoic acid (CsHi 6 0 2 - CAS No. 99-66-1).
  • Valproic acid affects the neurotransmitters GABA (Gamma Amino Butyrate) potentiating its inhibitory activity. Several mechanisms of action are suggested. Valproic acid acts in particular on the metabolism of GABA: it inhibits the degradation of GABA, GABA Transaminobutyratre (ABAT), increases the synthesis of GABA, and modifies its turnover.
  • GABA GABA Transaminobutyratre
  • valproic acid blocks certain ion channels, attenuates the N-Methyl-D-Aspartate mediated excitation, and blocks the activity of certain ion channels including Na + and Ca 2+ (voltage-dependent L type CACNA1 type C, D, N, and F).
  • valproic acid is also a histone deacetylase inhibitor (HDAC) and can also modulate methylases (Chateaucreme et al., J. Biomed Biotechnol., 2010, pI: 479364. doi: 10.1155 / 2010 / 479364. Epub 2010 Jul 29, Che H et al, Eur J Pharmacol 2012 Sep 5; -3): 51-9, doi: 10.1016 / j.ejphar.2012.06.019, Epub 2012 Jun 20).
  • Valproic acid is an anticonvulsant and tranquilizer, used for a long time primarily for the treatment of epilepsy, bipolar disorder, depression, and migraines.
  • Valproic acid is contraindicated in pregnant women, especially during the first trimester of pregnancy because it is responsible for birth defects.
  • valproic acid derivative refers to a chemical substance derived from valproic acid either directly or by partial modification or substitution.
  • a valproic acid derivative may be a pharmaceutically acceptable salt of valproic acid.
  • pharmaceutically acceptable salt of valproic acid is a salt which can be administered to mammals, including humans, and which has the desired pharmacological activity of valproic acid.
  • a "pharmaceutically acceptable salt” of valproic acid may also initially confer an advantageous pharmacokinetic property to valproic acid, which was absent in the non-salified form, and may even have a positive effect on the pharmacodynamics of the valproic acid.
  • valproic acid with regard to its therapeutic activity in the body.
  • valproic acid can form a salt with a mineral or organic base.
  • salts with organic or inorganic bases mention may be made of salts formed with metals and in particular alkali, alkaline-earth and transition metals (such as sodium, potassium, calcium, magnesium, aluminum), or with bases such as ammonia or secondary or tertiary amines (such as diethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, morpholine) or with basic amino acids, or with osamines (such as meglumine) or with amino alcohols (such as 3-amino-butanol and 2-aminoethanol).
  • the salt of the valproic acid used according to the invention is sodium valproate, potassium valproate, calcium valproate or divalproex sodium.
  • solvate refers to the adducts of the compounds with inert solvent molecules that form because of their mutual attractive force.
  • solvent water
  • hydrates When the solvent is water, it is called hydrates.
  • Solvates are, for example, monohydrates, dihydrates and alcoholates.
  • a valproic acid derivative to be used according to the invention may be an ester of valproic acid, a thioester of valproic acid, a valproic acid amide, or a thioamide of valproic acid.
  • the valproic acid derivative may be valpromide (i.e., dipropylacetamide, CAS No. 2430-37-5).
  • Valpromide is an antiepileptic drug used in combination to treat certain epilepsies with psychiatric manifestations. It is also used in the treatment of manic-depressive psychoses or aggressive states.
  • the valproic acid derivative may also be a derivative of valpromide, such as 2-hydroxypropyl valpromide.
  • valproic acid derivatives include, but are not limited to, valrocemide (i.e., N- (2-amino-2-oxoethyl) -2-propylpentanamide, the product of conjugation between valproic acid and glycinamide); valproyl taurinamide (the conjugate product between valproic acid and taurine), and its derivatives: N-methyl valproyl taurinamide, ⁇ , ⁇ -dimethyl valproyl taurinamide, and N-isopropyl valproyl taurinamide, isovaleramide (a similar valproic acid); valnoctamide (a structural isomer of valpromide); propylisopropylacetamide (PID); 2,2,3,3-tetramethylcylcopropylcarboxylic acid (TMCA) (a cyclopropyl analogue of valproic acid); N-methyl-2,2,3,3-te
  • valproic acid derivative also includes oligomers of valproic acid.
  • oligomer refers to a molecule formed by covalent bonding between at least two molecules.
  • an oligomer of valproic acid may be formed by covalent bonding between valproic acid and a derivative thereof, such as, for example, a salt thereof.
  • valproic acid oligomers include, but are not limited to, those described in U.S. Patent Nos. 4,988,731 and 5,212,326, such as, for example, an oligomer comprising valproic acid and sodium valproate in a 1: 1 molar ratio.
  • oligomer comprising valproic acid and sodium valproate in a molar ratio of 1: 1 and containing 4 to 6 units, or an oligomer comprising 1 to 3 moles of valproic acid and 1 to 6 moles a pharmaceutically acceptable salt of valproic acid.
  • Those skilled in the art can determine whether a derivative of valproic acid can be used in the treatment of hepcidin deficiency, for example by first verifying that the derivative in question induces an increase in the expression of mRNA. endogenous ⁇ -hepcidin in liver cells (as described in the Examples below).
  • Valproic acid and its derivatives for use according to the present invention may be prepared by any method of chemical synthesis, the method of preparation not being a limiting factor of the invention. Numerous methods for the preparation of valproic acid and its derivatives have been described.
  • valproic acid (or a derivative thereof) is administered as such or in the form of a pharmaceutical composition.
  • a pharmaceutical composition comprises valproic acid, or one of its derivatives or a mixture thereof, and at least one vehicle or excipient physio logically acceptable.
  • vehicle or excipient means any medium or additive that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient (here valproic acid or its derivative) and which is not excessively toxic to the patient or subject at the concentrations at which it is administered.
  • the physiologically acceptable vehicle or excipient is suitable for veterinary use or for human pharmaceutical use.
  • the pharmaceutical composition to be used according to the invention is an existing valproic acid or valpromide-based drug.
  • based drugs valproic acid or valpromide are sold under the trade names: DEPAKINE ®, DEPAKINE-CHRONO ®, DEPAMIDE ®, ® and Depakote ® LP MICROPAKINE in France; CONVULEX ® , DEPAKINE ® and MERCK-VALPROATE ® in Belgium; CONVULEX ® , DEPAKINE ® and ORIFIL ® in Switzerland; DEPAKENE ® and EPIVAL ® in Canada and the United States. All of these drugs are given orally, and some are also injectable.
  • the pharmaceutical composition to be used according to the invention is a novel formulation (i.e. not currently commercially available).
  • a pharmaceutical composition for use according to the invention may vary depending on the route of administration and dosage for which the composition is intended to be used. After formulation with at least one physiologically acceptable vehicle or excipient, a pharmaceutical composition may be in any form suitable for administration to a mammal, including humans.
  • Valproic acid (or a derivative thereof) can be formulated into a wide variety of dosage forms and carriers for oral administration. Oral administration may be effected for example in the form of tablets, coated tablets, hard and soft gelatin capsules, solutions, emulsions, syrups or suspensions. Valproic acid and its derivatives may be effective when administered by other routes of administration such as continuous parenteral (intravenous infusion), intramuscular, intravenous, suppository, among other routes of administration. The preferred route of administration is in general oral administration, using a convenient daily dosing regimen that can be adjusted according to the degree of the condition and the patient's response to the active ingredient.
  • routes of administration such as continuous parenteral (intravenous infusion), intramuscular, intravenous, suppository, among other routes of administration.
  • the preferred route of administration is in general oral administration, using a convenient daily dosing regimen that can be adjusted according to the degree of the condition and the patient's response to the active ingredient.
  • compositions and dosage unit forms may comprise, in addition to valproic acid (or a derivative thereof), conventional ingredients in conventional proportions, with or without other compounds or active ingredients, and Forms of dosage units may contain any suitable effective amount of the active ingredient, commensurate with the daily dosage to be used.
  • compositions can be used in the form of solid products, such as filled tablets or capsules, semi-solid products, powders, sustained-release formulations, or liquids such as solutions, suspensions, emulsions, elixirs , or capsules loaded for oral use; or in the form of suppositories for rectal administration; or in the form of sterile injectable solutions for parenteral use.
  • a typical preparation will contain from about 5% to about 95% of active compound or active compounds (by weight).
  • preparation or “dosage form” is intended to include both solid and liquid formulations of the active compound and those skilled in the art will appreciate that an active ingredient may exist in different preparations depending on the organ or the target tissue, the desired dose and the pharmacokinetic parameters.
  • Solid form preparations include powders, tablets, pills, capsules, cachets, suppositories, and granules for dispersing.
  • a solid carrier may be one or more substances which may also act as diluents, flavoring agents, solubilizers, lubricants, suspending agents, binders, preservatives, tablet disintegrating agents, or an encapsulant.
  • the carrier is usually a finely divided solid which is mixed with the finely divided active component.
  • the active ingredient is usually mixed with the carrier having the necessary binding capacity in appropriate proportions, and compacted in the desired shape and size.
  • Suitable carriers include, but are not limited to, magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, sugar, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, gum tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, a low melting point wax, cocoa butter, and the like.
  • the preparations under solid form may contain, in addition to the active component, colorants, flavors, stabilizers, buffers, artificial and natural sweeteners, dispersants, thickeners, solubilizers, and the like.
  • Liquid formulations are also suitable for oral administration and include a liquid formulation comprising emulsions, syrups, elixirs, aqueous solutions, and aqueous suspensions. They may include solid form preparations which must be converted to liquid form preparations shortly before use.
  • the emulsions may be prepared in solutions, for example in aqueous propylene glycol solutions, or may contain emulsifiers such as lecithin, sorbitan monooleate or gum arabic.
  • Aqueous solutions can be prepared by dissolving the active ingredient in water and adding suitable colorants, flavors, stabilizers and thickeners.
  • Aqueous suspensions can be prepared by dispersing the finely divided active ingredient in water with a viscous product, such as a natural or synthetic gum, a resin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and other well-known suspending agents.
  • Valproic acid may be formulated for parenteral administration (e.g., by injection, bolus injection, or continuous infusion) and may take the form of dosage units in ampoules, pre-filled syringes, small volume infusions or in multi-dose containers with added preservative.
  • the compositions may take the form of suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous vehicles, for example solutions in aqueous polyethylene glycol.
  • oily or non-aqueous carriers, diluents, solvents or vehicles examples include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils (eg olive oil), and injectable organic esters (e.g., ethyl oleate) and may contain formulating agents such as preservatives, wetting agents, emulsifiers or suspending agents, stabilizers and / or dispersants.
  • Valproic acid (or a derivative thereof) may also be in the form of a powder, obtained by aseptic isolation of the sterile solid product or by lyophilization from a solution for reconstitution before use with a suitable vehicle. for example sterile pyrogen-free water.
  • Valproic acid (or a derivative thereof) can be formulated for administration as suppositories.
  • a wax of low melting point such as a mixture of fatty acid glycerides or cocoa butter
  • the active ingredient is dispersed homogeneously, for example by stirring.
  • the homogeneous mixture obtained is then poured into suitably sized molds and allowed to cool and solidify.
  • enteric coatings suitable for sustained or controlled release administration of the active ingredient.
  • valproic acid, or a derivative thereof may be formulated in transdermal or subcutaneous drug delivery devices.
  • transdermal delivery systems are advantageous when prolonged release of the active ingredient is needed and when acceptance of the treatment regime by the patient is crucial.
  • the active ingredients are often attached to a solid support adhering to the skin.
  • Valproic acid, or a derivative thereof may also be combined with a penetration enhancer, for example azone (1-dodecylazacycloheptan-2-one).
  • Subcutaneous sustained release delivery systems are inserted into the subdermal layer by a surgical procedure or by injection.
  • the subdermal implants encapsulate the compound in a lipid-soluble membrane, for example silicone rubber, or in a biodegradable polymer, for example poly (lactic acid).
  • compositions to be used according to the present invention may further contain at least one additional active pharmaceutical ingredient (i.e., in addition to valproic acid or a derivative thereof).
  • active ingredient any compound or substance the administration of which has a therapeutic effect or an effect beneficial to the health or general condition of a patient or a subject to which it is administered.
  • Hepcidin deficiency which is to be treated by administration of the pharmaceutical composition may be active against a condition or symptom associated with hepcidin deficiency (eg iron accumulation itself or osteoporotic manifestations). articular which are not necessarily related to the excess of the iron stock) or may increase the availability and / or activity of the active ingredient (s) of the pharmaceutical composition
  • an additional active pharmaceutical ingredient may be a molecule iron chelator or another agent potentially inducing hepcidin whether it is peptide (eg BMP6, IL-6), chemical or of any other nature.
  • the pharmaceutical compositions are preferably in dosage unit forms.
  • the subdivided unit dose preparation containing appropriate amounts of the active ingredient (valproic acid or a derivative thereof).
  • the dosage unit form may be a packaged preparation, the package containing discrete quantities of preparation, such as packaged capsules or tablets, powders in vials or ampoules.
  • the dosage unit form may also be a capsule, tablet, cachet or lozenge per se, or may be the appropriate number thereof in packaged form.
  • the invention relates primarily to valproic acid, or a derivative thereof, for use in the treatment of hepcidin deficiency or hepcidino-deficiency in a subject.
  • the term "subject” refers to a human or an animal, in particular a mammal (for example a primate, a dog, a cat, a goat, a horse, a pig, a mouse, a rat, a rabbit, a zebrafish and the like) which may develop a disease or condition associated with hepcidin deficiency or hepcidino-deficiency, but who may or may not have the disease or condition.
  • the subject is a human being.
  • the subject is often called “individual”.
  • the term “individual” does not refer to a particular age, and therefore includes children, adolescents and adults.
  • the term "patient” is more particularly used when the individual suffers from a hepcidin deficiency or a hepcidino-deficiency.
  • treatment means a method that aims to (1) delay or prevent the onset of a disease or clinical condition; (2) to slow or stop the progression, aggravation or deterioration of the symptoms of the disease; (3) to make improvements in the symptoms of the disease; and / or (4) to cure the disease.
  • a treatment can be administered before the onset of the disease for preventive action, or it can be administered after initiation of the disease, for therapeutic action. It may be performed in combination or not with other therapies (including phlebotomies and medications) to reduce the iron stock or to correct the anomaly of iron metabolism.
  • a preferred daily dose is from about 0.1 to about 500 mg / kg body weight, preferably from about 0.1 to about 100 mg / kg body weight, and most preferably from about 1.0 to about 10 mg / kg of body weight. body mass per day. So, for administration to a 70 kg person, the dosage would be about 7 mg to 0.7 g per day.
  • the daily dose may be administered as a single dose or in divided doses, typically between 1 and 5 doses per day, for example 2 to 3 doses per day. In general, treatment is started with small doses that are below the optimal dose of the compound. Then the dose is increased in small increments until the optimal effect for the individual patient is reached.
  • valproic acid one derivatives thereof, a mixture thereof or a pharmaceutical composition comprising valproic acid or a derivative thereof or a mixture thereof for a given disease and patient.
  • the daily dose of valproic acid or a derivative thereof administered to the patient treated according to the invention is lower than the daily dose of the same active ingredient administered to a patient suffering from epilepsy.
  • Those skilled in the art know (or know how to find information on) the average dosages of drugs based on valproic acid or its salts.
  • the average 24-hour dose is 30 mg / kg for infants and children in the form of syrup, oral solution or sustained release granules, and 20 to 30 mg / kg for adolescents and adults in the form of tablets or extended release granules.
  • hepcidin deficiency or hepcidino-deficiency refers to a level of hepcidin expression that is (or a condition associated with a hepcidin expression level) that is, taking into account the body's iron stock, which is less than the average measured for a healthy subject (or group of healthy subjects) of the same age, sex, body weight, and similar martial status. The person skilled in the art knows these data or knows how to determine them. Hepcidin deficiency is present (in almost all cases) in patients with hereditary hemochromatosis.
  • Hereditary hemochromatosis is a genetic disorder of iron metabolism, in which iron overloading of the liver, pancreas, heart, joints or other organs causes functional and anatomical damage. It is a common disease in its form linked to the mutation of the HFE gene, one in 200 or 300 people being genetically predisposed, but rare in other forms, especially those related to mutations in the hemojuvelin and transferrin receptor genes.
  • the osteoarticular manifestations of the disease are at the forefront both at the time of diagnosis and the state phase by their impact on the quality of life. On the one hand, it is hemochromatosis rheumatism which is one of the main complaints of patients and, on the other hand, of osteoporosis which increases the fracture risk.
  • Hereditary hemochromatoses include type 1 (so-called classical) hemochromatosis, juvenile hemochromatosis (type 2A, type 2B), and type 3 hemochromatosis (by TFR2 mutation).
  • Iron overload anemias are clinical conditions in which erythrocytes send a signal that leads to decreased hepcidin levels in the liver, leading to increased iron absorption by the duodenum and iron release. by macrophages. Since iron can not be used by erythrocytes, it accumulates in different organs, causing damage. Frequently, patients need blood transfusions, which only exacerbates iron overload. However, an iron overload exists even before transfusion.
  • Anemia with iron overload includes ⁇ -thalassemias, congenital dyserythropoietic anemias, congenital or acquired sideroblastic anemias, congenital or acquired hypotransferrinemia, congenital or acquired atransferrinemia, and congenital aceruloplasminemia.
  • Iron overload anemias also include congenital hemolytic anemias (such as stomatocytosis, xerocytosis, spherocytosis, and certain enzymopathies such as pyrimidine nucleotide deficiency, G6PD type I deficiency, and pyrimidine 5 'nucleotide deficiency, and deficits in pyruvate kinase).
  • Anemia with iron overload also includes myelodysplastic syndromes (such as refractory cytopenia with unilateral dysplasia, refractory anemia without or with crown sideroblasts, myelodysplastic syndrome with multi-lineage myelodysplasia (CRMD), 5q- syndrome, refractory anemia with excess of blasts (AREB), and unclassifiable myelodysplastic syndromes).
  • myelodysplastic syndromes such as refractory cytopenia with unilateral dysplasia, refractory anemia without or with crown sideroblasts, myelodysplastic syndrome with multi-lineage myelodysplasia (CRMD), 5q- syndrome, refractory anemia with excess of blasts (AREB), and unclassifiable myelodysplastic syndromes).
  • Hepcidin production may be deficient in some chronic liver diseases (or chronic liver diseases).
  • Chronic liver diseases that can be treated by a method according to the invention include, for example, hepatitis, in particular chronic hepatitis C and chronic hepatitis B, alcoholic liver disease, non-alcoholic steatohepatitis, and cirrhosis of the liver. liver (whatever its etiology).
  • the invention can also be used in the treatment of porphyria cutanea tarda. Indeed, a reduction in hepcidin expression has been observed in patients with porphyria cutanea tarda.
  • the methods for the determination of hepcidin include, but are not limited to, the determination of hepcidin in plasma or urine by mass spectrometry (Seldi-TOF MS, MALDI-TOF MS), liquid chromatography, ELISA or by dosage r immunological adio.
  • the invention also relates to the use of valproic acid, or a derivative thereof or a mixture thereof, for increasing the expression of hepcidin in a cell.
  • the invention also relates to a method for increasing the expression of hepcidin in a cell, comprising a step of contacting the cell with an effective amount of valproic acid, or a derivative thereof, or one of their mixtures.
  • the cell is an in vitro cell.
  • the cell may be a liver cell from an established cell line, such as Huh7, Hep3b, HepG2, PLC / PRF / 5, and SkHepI, or may be isolated from a healthy subject or a patient .
  • the cell is an in vivo cell, for example a cell in an animal (eg, an animal model).
  • the contacting of the cell with an effective amount of valproic acid, or one of its derivatives, or one of their mixtures is by administration to the animal.
  • Such applications can in particular be used to specify the mechanisms of action of valproic acid (or of one of its derivatives), or to seek beneficial therapeutic effects in combination with other therapeutics aimed at modulating the metabolism of the drug.
  • iron or the iron stock of the body can in particular be used to specify the mechanisms of action of valproic acid (or of one of its derivatives), or to seek beneficial therapeutic effects in combination with other therapeutics aimed at modulating the metabolism of the drug.
  • iron or the iron stock of the body can in particular be used to specify the mechanisms of action of valproic acid (or of one of its derivatives), or to seek beneficial therapeutic effects in combination with other therapeutics aimed at modulating the metabolism of the drug.
  • Figure 1 Modulation of the expression of hepcidin with valproic acid.
  • Figure 3 Impact of mutations of the hepcidin promoter on the modulation of luciferase activity linked to the hepcidin promoter by valproic acid.
  • Cells of the HepG2 line were transfected with the plasmid containing 2762 bp of hepcidin promoter DNA, either wild-type or mutated in the 2 transcription factor binding sites SMAD, placed upstream of the luciferase reporter gene. The cells were treated for 24 hours with 1 mM valproic acid (VPA). The results represent the number of times of activation (fold activation) by the valproic acid of each plasmid construct used compared to the condition without valproic acid.
  • VPA mM valproic acid
  • Plasmid constructions A 2762 base pair (bp) fragment comprising 2708 bp of the hepticidin promoter upstream of the transcription initiation site and 57 bp of the 5'Untranslated Region (UTR) region was inserted into pGL4.17. (Promega, France) at the KpnI-XhoI restriction sites upstream of the firefly luciferase reporter gene to generate the -2708Hep / Luc plasmid construct (Island et al., Biochem J., 2011, 437: 477-482). Internal mutations of both smad protein binding sites (BMP-
  • the expression level of the hepcidin mRNA was evaluated by quantitative PCR on three biological triplicates and at least three distinct weeks, using the mix: qPCRMasterMixPlus SYBR ® GreenI according to the manufacturer's instructions (Eurogentec, France). The qRT-PCR reaction was performed on ABI PRISM StepOne (Applied Bioscience, France). For each well, the Ct value obtained for the mRNA studied was normalized by the Ct value of the Hprt mRNA (hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase) The sequences of the primers used for amplification of the mRNAs are described in FIG. Table 2.
  • plasmid constructs containing fragments of different sizes of the hepcidin promoter, inserted upstream of the luciferase reporter gene, were generated. These plasmids are transfected into HepG2 cells, which are then treated with 1 mM sodium valproate for 24 hours ( Figure 2).
  • the luciferase activity assay shows that the sodium valproate response is essentially nucleotide-mediated between the -2708 and -90 promoter positions and between -200 and -70bp of DNA.
  • These two promoter regions each contain a BMP-RE binding site known to interact with Smad transcription factors.
  • the expression of the hepcidin gene is activated by the cytokine BMP6 which when it binds to its receptor will induce the phosphorylation of the proteins smad1, 5 and 8 which then associate with Smad4 ( Verga Falzacappa et al, J Mol Med, 2008, 86: 531-541, Truksa et al., Blood, 2009, 113: 688-695, Island et al, Haematologica, 2009, 94: 720-724, Meynard et al, Nature. Genetics, 2009, 41: 478-481).
  • This protein complex enters the nucleus and then binds to the BMP response elements of the hepcidin promoter (BMP-RE) to activate its transcription.
  • a plasmid construct containing the hepcidin promoter mutated in both BMP-RE sites, preventing the attachment of the smad proteins is transfected into HepG2 cells which are then treated for 24 hours with 1 mM sodium valproate (FIG. 3). It is observed that the response to sodium valproate is strongly inhibited when the two BMP-RE sites are mutated. It therefore seems that the activation of the expression of the hepcidin gene by sodium valproate requires, at least in part, the presence of BMP-RE sites.
  • Valpromide is a derivative of valproic acid.
  • HepG2 cells were treated with this component for 24 hours at a dose of 1 mM and the control cells were supplemented with DMSO which is the diluent.
  • DMSO which is the diluent.
  • RT-qPCR experiments show an increase in endogenous hepcidin mRNA level compared to DMSO control.
  • DMSO itself is an inhibitor of hepcidin expression.
  • Valpromide is therefore an activator of hepcidin gene expression in a liver cell model, however with a lesser effect than valproic acid at 1 mM for 24 hours.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés,pour corriger les insuffisances en hepcidine et leurs effets, qu'il s'agisse de ceux qui conduisent à la surcharge en fer ou bien de ceux qui sont associés à l'hepcidino- déficience et qui persistent après déplétion en fer, dont le rhumatisme hémochromatosique pour lequel il n'existe pasactuellement de traitement spécifique.

Description

Utilisation de l'Acide Valproïque ou de ses Dérivés
dans le Traitement des Insuffisances en Hepcidine et de leurs Conséquences
Demande de Brevet Parente
La présente demande de brevet revendique la priorité de la demande de brevet français numéro FR 14 58209 déposée le 2 septembre 2014. Le contenu de la demande de brevet français est incorporé par référence dans sa totalité.
Domaine de l'Invention
La présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés pour traiter les hepcidino-défïciences et leurs conséquences. Contexte de l'Invention
Le métabolisme du fer doit être parfaitement contrôlé pour éviter l'apparition de situations délétères : accumulations anormales de fer dans l'organisme, ou bien carences en fer. Chez l'homme, les accumulations anormales de fer peuvent être systémiques, touchant, en particulier, le foie, le cœur et le pancréas. Ces situations pathologiques entraînent des complications qui ont des conséquences ayant un impact sur l'espérance de vie (cirrhose, cancer du foie, myocardiopathies, diabète) et sur les capacités fonctionnelles (ostéoporose, douleurs articulaires, hypogonadisme, etc ..) (Pietrangelo, N. Engl. J. Med., 2004, 350: 2383-2397).
Ces pathologies de surcharge en fer mettent en jeu l'hepcidine (Ganz, Blood, 201 1, 117: 4425-4433), un peptide synthétisé au niveau du foie par les hépatocytes et sécrété dans le plasma. Ce peptide circulant interagit avec la ferroportine, protéine exportatrice de fer exprimée sur la membrane des cellules (macrophages, entérocytes), provoquant sa dégradation, et limite donc la sortie du fer des cellules vers le plasma que médie la ferroportine. Ainsi le contenu cellulaire en fer et la concentration de fer dans le plasma sont contrôlés.
Des taux anormalement bas d'hepcidine favorisent la sortie du fer des cellules, en particulier des macrophages, des entérocytes et peut-être des hépatocytes, induisant ainsi une augmentation du fer dans le plasma qui entraîne une surcharge en fer cellulaire touchant en particulier le foie, le cœur, le pancréas et l'os. C'est la situation observée au cours des hémochromatoses génétiques liées aux mutations des gènes HFE, TRF2, hémojuvéline et/ou hepcidine (Pietrangelo, Hepatology, 2007, 46: 11291-11301). D'autres surcharges en fer peuvent présenter un tableau similaire sans que la cause ne soit aujourd'hui identifiée. Ainsi, chez la souris, une invalidation du gène BMP6 provoque une déficience en hepcidine, BMP6 induisant l'expression de l'hepcidine lors des surcharges en fer hépatiques. D'autres gènes et/ou situations pathologiques pourraient, dans le futur, être associées à ces situations "d'insuffisance en hepcidine". Au cours des hémochromatoses génétiques, le taux d'hepcidine est anormalement bas en raison d'une anomalie de la régulation transcriptionnelle de l'expression de l'hepcidine du fait de l'atténuation de la signalisation liée en particulier à la voie activatrice BMP/SMAD (Meynard et al., Nature Genêt., 2009, 41 : 478-481). De plus, au cours de certaines anémies d'origine hématologique, une baisse du niveau d'hepcidine, consécutive à l'intensité de l'érythropoiese, peut conduire à la constitution/majoration d'une surcharge en fer. Augmenter le niveau d'hepcidine dans ces situations représenterait donc un traitement étio logique de ces surcharges en fer. Aujourd'hui, le traitement des surcharges en fer génétiques est symptomatique, visant à réduire ou éliminer l'excès de fer (Brissot et al., Trends Mol. Med., 2011, 17: 707-713). Il est le plus souvent réalisé au travers de soustractions sanguines (saignées) régulières qui permettent de retirer le fer présent dans les hématies. Le fer en excès dans les autres organes est alors mobilisé pour reconstituer le stock d'hématies au cours de l'érythropoiese. Les saignées favorisent une aggravation du déficit en hepcidine (van Dijk et al, Br. J. Haematol, 2008, 142(6) : 979-985). Ce déficit est lié, au moins en partie, à la production par les érythroblastes d'un facteur soluble récemment identifié qui limite la production hépatique d'hepcidine (l'érythroferrone) (Kautz et al., Nature Genetics, 2014, 46(7) : 678-684, doi: 10.1038/ng.2996). Dès lors la saignée "encourage" paradoxalement l'absorption digestive du fer, ce qui contraire au but recherché. Dans ces indications, l'utilisation de molécules chélatrices du fer est limitée du fait du risque d'effets secondaires sur les cellules non surchargées en fer (balance bénéfice/risque), les chélateurs pouvant extraire le fer de l'ensemble des cellules. Il faut noter que le traitement déplétif, quel que soit son mode de réalisation, n'est pas curatif car, s'il permet de retirer le fer en excès, il ne permet pas d'éviter que l'excès de fer ne se constitue. Le traitement des surcharges en fer secondaires aux maladies hématologiques ne peut faire appel aux saignées, car il existe une anémie et/ou des risques d'intolérance aux saignées. Dans ce cas, l'utilisation de chélateurs du fer est la règle. Des études sont actuellement réalisées pour générer des hepcidines de synthèse administrables à l'homme et d'autres sont en cours pour identifier des molécules capables de réguler l'expression d'hepcidine (Gaun et al. , Blood Cells, Mol. Dis., 2014, DOI: 10.1016/j.bcmd.2014.06.002; Ruchala and Nemeth, Trends in Pharm. Sci., 2004, 155- 161, DOI: 10.1016/j .tips.2014.01.004). Cependant, ces études n'ont pas encore abouti. Il existe donc toujours, dans l'art, un besoin de disposer de nouveaux outils pour le traitement des déficiences en hepcidine et leurs conséquences sur la santé humaine.
Résumé de l'Invention
D'une façon générale, la présente invention repose sur la mise en évidence que l'acide valproïque, qui est une molécule utilisée depuis longtemps dans le traitement de l'épilepsie et comme thymorégulateur (Chateauvieux et al., J. Biomed. Biotechnol, 2010, pii: 479364. doi: 10.1155/2010/479364. Epub 2010 Jul 29. Review), affecte l'expression de l'hepcidine. En effet, de manière surprenante et inattendue, les présents Inventeurs ont montré que l'acide valproïque induit l'expression d'hepcidine dans une lignée d'origine hépatocytaire humaine (HepG2) de façon dose-dépendante et pour des concentrations inférieures aux concentrations thérapeutiques de l'épilepsie. Ils ont également observé un effet similaire avec le valpromide, un dérivé de l'acide valproïque, qui est également utilisé dans le traitement de l'épilepsie.
En conséquence, dans un premier aspect, la présente invention concerne l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivées pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation dans le traitement des insuffisances en hepcidine ou des hepcidino-défïciences.
Dans certains modes de réalisation, le dérivé pharmaceutiquement acceptable est choisi parmi les sels de l'acide valproïque (par exemple le valproate de sodium, le valproate de potassium, le valproate de calcium ou le divalproex sodique), les esters de l'acide valproïque (par exemple le valproyl taurinamide, le N-méthyl valproyl taurinamide, le Ν,Ν-diméthyl valproyl taurinamide, ou le N-isopropyl valproyl taurinamide), les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque (par exemple le valpromide, le 2-hydroxypropyl valpromide, ou le valrocémide), les thioamides de l'acide valproïque, les oligomères de l'acide valproïque, et leurs mélanges. Dans certains modes de réalisation particuliers, le dérivé pharmaceutiquement acceptable est le valpromide. Dans certains modes de réalisation, l'insuffisance en hepcidine ou l'hepcidino- déficience est associée à une hémochromatose héréditaire. L'hémochromatose héréditaire peut être l'hémochromatose génétique de type 1 (dite classique, qui est liée à une mutation dans le gène HFE), l'hémochromatose juvénile (de type 2A, qui est liée à une mutation dans le gène hémojuvéline (HJV) , ou de type 2B, qui est liée à une mutatioun dans le gène de l'hepcidine (HAMP)), et l'hémochromatose de type 3 (mutations dans le gène TFR2).
Dans certains modes de réalisation, l'insuffisance en hepcidine ou l'hepcidino- déficience est associée à une anémie avec surcharge en fer. Par exemple, l'anémie avec surcharge en fer peut être une thalassémie (par exemple une β-thalassémie), une anémie dysérythropoïétique congénitale, une anémie sidéroblastique congénitale ou acquise, une hypotransferrinémie congénitale ou acquise, une atransferrinémie congénitale ou acquise, ou une acéruloplasminémie congénitale. L'anémies avec surcharge en fer peut également être une anémie hémolytique congénitale, comme par exemple la stomatocytose, la xérocytose, la sphérocytose, et certaines enzymopathies comme les déficits en pyrimidine nucléotidase, les déficits en G6PD de type I, les déficits en pyrimidine 5' nucléotidase, et les déficits en pyruvate kinase). L'anémie avec surcharge en fer peut aussi être un syndrome myélodysplasique, comme par exemple la cytopénie réfractaire avec dysplasie unilignée, l'anémie réfractaire sans ou avec sidéroblastes en couronne, le syndrome myélodysplasique avec myélodysplasie touchant plusieurs lignées (CRMD), le syndrome 5q-, l'anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB), ou un syndrome myélodysplasique inclassable.
Dans certains modes de réalisation, l'insuffisance en hepcidine ou l'hepcidino- défïcience est associée à une hépatopathie chronique. L'hépatopathie chronique, souvent de type cirrhotique, peut être, par exemple, une hépatite virale, en particulier l'hépatite C chronique et l'hépatite B chronique, une maladie alcoolique hépatique, ou une stéatohépatite non-alcoolique.
Dans certains modes de réalisation, l'insuffisance en hepcidine ou l'hepcidino- défïcience est associée à une porphyrie cutanée tardive. La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables et au moins un véhicule ou excipient physio logiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement des insuffisances en hepcidine ou des hepcidino-déficiences. Le dérivé pharmaceutiquement acceptable présent dans la composition pharmaceutique peut être n'importe quel dérivé de l'acide valproïque, en particulier ceux décrits ici.
Dans le même aspect, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivées pharmaceutiquement acceptables, pour la fabrication d'un médicament utile dans le traitement des insuffisances en hepcidine ou des hepcidino-déficiences. Le dérivé pharmaceutiquement acceptable peut être n'importe quel dérivé de l'acide valproïque, en particulier ceux décrits ici.
Toujours dans le même aspect, la présente invention concerne une méthode de traitement d'une insuffisance en hepcidine ou d'une hepcidino-défïcience chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables. Le dérivé pharmaceutiquement acceptable peut être n'importe quel dérivé de l'acide valproïque, en particulier ceux décrits ici.
Dans certains modes de réalisation préférés, le sujet est un être humain. Le sujet souffrant d'insuffisance en hepcidine ou d'hepcidino-défïcience peut être atteint d'une maladie citée ci-dessus.
Dans certains modes de réalisation, la quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, administrée au sujet est inférieure aux doses thérapeutiques habituellement administrées dans le traitement de l'épilepsie.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule. Le dérivé de l'acide valproïque peut être n'importe quel dérivé, y compris ceux décrits ici.
Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Dans d'autres modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo. Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule hépatique. Dans ce même aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule comprenant la mise en contact de la cellule avec une quantité efficace d'acide valproïque ou d'un de ses dérivés ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés. Le dérivé de l'acide valproïque peut être n'importe quel dérivé, y compris ceux décrits ici.
Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Dans d'autres modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo.
Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule hépatique.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivées pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation dans le traitement des surcharges en fer (que la surcharge soit ou non connue pour être associée à une insuffisance en hepcidine ou une hepcidino-défïcience). L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables et au moins un véhicule ou excipient physio logiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement des surcharges en fer, et une méthode de traitement d'une surcharge en fer chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables.
Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule. Le dérivé de l'acide valproïque peut être n'importe quel dérivé, y compris ceux décrits ici. Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Dans d'autres modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo.
Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule hépatique.
Dans ce même aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule comprenant la mise en contact de la cellule avec une quantité efficace d'acide valproïque ou d'un de ses dérivés ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés. Le dérivé de l'acide valproïque peut être n'importe quel dérivé, y compris ceux décrits ici. Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Dans d'autres modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo.
Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule hépatique.
Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous.
Description Détaillée de l'Invention
Comme mentionné ci-dessus, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés, dans le traitement des déficiences en hepcidine et/ou des surcharges en fer et de leurs conséquences sur la santé humaine. I - L'Acide Valproïque et ses Dérivés L 'Acide Valproïque
Par "acide valproïque" on entend le composé de formule (I) encore appelé acide-2- propylpentanoïque (CsHi602 - numéro CAS 99-66-1).
Figure imgf000008_0001
Les activités biologiques de l'acide valproïque sont multiples (revues dans Chateauvieux et al, J. Biomed. Biotechnol, 2010, pii: 479364. doi: 10.1155/2010/479364). L'acide valproïque affecte les neurotransmetteurs GABA (Gamma Amino Butyrate) potentialisant son activité inhibitrice. Plusieurs mécanismes d'actions sont suggérés. L'acide valproïque agit en particulier sur le métabolisme du GABA: inhibe la dégradation du GABA, de la GABA Transaminobutyratre (ABAT), acroissement de la synthèse de GABA, et modifie son turnover. De plus, l'acide valproïque bloque certains canaux ioniques, atténue l'excitation médiée par le N-Methyl- D-Aspartate, et bloque l'activité de certains canaux ioniques notamment Na+ et Ca2+ (voltage-dependent L type CACNA1 type C, D, N, and F).
Aux concentrations correspondant à une utilisation clinique, l'acide valproïque est aussi un inhibiteur des histones désacétylases (HDAC) et peut aussi moduler l'activité des méthylases (Chateauvieux et al., J. Biomed. Biotechnol., 2010, pii: 479364. doi: 10.1155/2010/479364. Epub 2010 Jul 29 ; Che H et al, Eur J Pharmacol. 2012 Sep 5;690(l-3):51-9. doi: 10.1016/j.ejphar.2012.06.019. Epub 2012 Jun 20). L'acide valproïque est un anticonvulsant et calmant, utilisé depuis longtemps essentiellement pour le traitement de l'épilepsie, le trouble bipolaire, la dépression, et les migraines. Ses effets secondaires sont bien connus, les plus communs étant la sédation, la prise de poids, les tremblements et les problèmes gastro -intestinaux. Le dosage des taux sanguins peut aider à limiter les effets secondaires. L'acide valproïque est contre-indiqué chez la femme enceinte, en particulier au cours du premier trimestre de grossesse car il est responsable de malformations congénitales.
Dérivés de Γ Acide Valproïque
Le terme "dérivé de l'acide valproïque", tel qu'utilisé ici, désigne une substance chimique dérivée de l'acide valproïque soit directement soit par modification ou substitution partielle. Ainsi, par exemple, un dérivé de l'acide valproïque peut être un sel de l'acide valproïque pharmaceutiquement acceptable. L'expression "sel pharmaceutiquement acceptable" de l'acide valproïque est un sel qui peut être administré aux mammifères, y compris aux êtres humains, et qui possède l'activité pharmaco logique désirée de l'acide valproïque. Dans certains cas, un "sel pharmaceutiquement acceptable" de l'acide valproïque peut aussi conférer initialement une propriété pharmacocinétique avantageuse à l'acide valproïque, qui était absente dans la forme non salifiée, et peut même avoir un effet positif sur la pharmacodynamique de l'acide valproïque en ce qui concerne son activité thérapeutique dans le corps.
En raison de la présence d'une fonction acide, l'acide valproïque peut former un sel avec une base minérale ou organique. A titre d'exemple de sels avec des bases organiques ou minérales, on peut citer les sels formés avec des métaux et notamment des métaux alcalins, alcalino -terreux et de transition (tels que le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, l'aluminium), ou avec des bases comme l'ammoniac ou des aminés secondaires ou tertiaires (telles que le diéthylamine, la triéthylamine, la pipéridine, la pipérazine, la morpholine) ou avec des acides aminés basique, ou avec des osamines (telles que la méglumine) ou bien encore avec des amino alcools (tels que le 3- amino-butanol et le 2-aminoéthanol). Ainsi, dans certains modes de réalisation, le sel de l'acide valproïque utilisé selon l'invention est le valproate de sodium, le valproate de potassium, le valproate de calcium ou le divalproex sodique.
L'expression "sel pharmaceutiquement acceptable" comprend également toutes les formes d'addition de solvants (solvates et hydrates) ou les formes cristallines (polymorphes) de ce même sel. Le terme "solvate" désigne les adduits des composés avec des molécules de solvant inerte qui se forment en raison de leur force d'attraction mutuelle. Lorsque le solvant est l'eau, on parle d"'hydrates". Les solvates sont, par exemple, les monohydrates, dihydrates et alcoholates.
Alternativement, un dérivé de l'acide valproïque à utiliser selon l'invention peut être un ester de l'acide valproïque, un thioester de l'acide valproïque, un amide de l'acide valproïque, ou un thioamide de l'acide valproïque.
En particulier, le dérivé de l'acide valproïque peut être le valpromide (c'est-à-dire le dipropylacétamide, numéro CAS 2430-37-5). Le valpromide est un médicament antiépileptique utilisé en association pour traiter certaines épilepsies avec manifestations psychiatriques. Il est aussi employé dans le traitement de psychoses maniaco-dépressives ou d'états agressifs. Le dérivé de l'acide valproïque peut aussi être un dérivé du valpromide, comme le 2-hydroxypropyl valpromide.
D'autres exemples de dérivés de l'acide valproïque incluent, sans limitation, le valrocémide (c'est-à-dire le N-(2-amino-2-oxoéthyl)-2-propylpentanamide, le produit de conjugaison entre l'acide valproïque et le glycinamide); le valproyl taurinamide (le produit de conjugaison entre l'acide valproïque et la taurine), et ses dérivés : le N-méthyl valproyl taurinamide, le Ν,Ν-diméthyl valproyl taurinamide, et le N-isopropyl valproyl taurinamide, Pisovaléramide (un analogue de l'acide valproïque); valnoctamide (un isomère structurel du valpromide); le propylisopropylacétamide (PID); l'acide 2,2,3,3- tétraméthylcylcopropylcarboxylique (TMCA) (un analogue cyclopropyl de l'acide valproïque); le N-methyl-2,2,3,3-tétraméthylcyclopropanecarboxamide (MTMCD) et le 2,2,3, 3-tétramethylcyclopropane-carbonylurée (TMCU).
L'expression "dérivé de l'acide valproïque" englobe également les composés désignés comme "prodrugs". Le terme "prodrug" désigne tout composé destiné à l'usage thérapeutique qui doit subir une biotransformation, après administration à un organisme, pour que s'exerce une activité biologique. C'est une forme d'optimisation par modulation moléculaire où la chimie intervient pour modifier non pas les propriétés pharmacodynamiques intrinsèques de la molécule considérée (ici l'acide valproïque), mais pour changer ses propriétés pharmacocinétiques (parfois galéniques). Les prodrugs de l'acide valproïque comprennent les composés selon la formule (I) qui ont été modifiés par exemple avec des groupes alkyle ou acyle, des sucres ou des oligopeptides et qui sont clivés rapidement dans l'organisme pour libérer l'acide valproïque.
L'expression "dérivé de l'acide valproïque" englobe aussi les oligomères de l'acide valproïque. Le terme "oligomère" désigne une molécule formée par liaison covalente entre au moins deux molécules. En particulier, un oligomère de l'acide valproïque peut être formée par liaison covalente entre l'acide valproïque et un de ses dérivées, comme par exemple un de ses sels. Des exemples d'oligomères de l'acide valproïque incluent, sans limitation, ceux décrits dans les brevets américains numéro 4,988,731 et numéro 5,212,326, comme par exemple un oligomère comprenant de l'acide valproïque et du vaproate de sodium dans un rapport molaire 1 : 1 et contenant 4 unités, ou un oligomère comprenant de l'acide valproïque et du valproate de sodium dans un rapport molaire 1 : 1 et contenant 4 à 6 unités, ou un oligomère comprenant 1 à 3 moles d'acide valproïque et 1 à 6 moles d'un sel de l'acide valproïque pharmaceutiquement acceptable.
L'homme du métier sait déterminer si un dérivé de l'acide valproïque peut être utilisé dans le traitement des insuffisances en hepcidine, par exemple en vérifiant tout d'abord que le dérivé en question induit une augmentation de l'expression de l'ARNm endogène de Γ hepcidine dans des cellules hépatiques (comme décrit dans les Exemples ci-dessous).
Préparation de l'Acide Valproïque ou de l'un de ses dérivés
L'acide valproïque et ses dérivés destinés à être utilisés selon la présente invention peuvent être préparés par n'importe quelle méthode de synthèse chimique, la méthode de préparation n'étant pas un facteur limitant de l'invention. De nombreuses méthodes de préparation de l'acide valproïque et de ses dérivés ont été décrites.
Compositions Pharmaceutiques
Dans le contexte de l'invention, l'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) est administré comme tel ou sous forme d'une composition pharmaceutique. Une telle composition pharmaceutique comprend de l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivés ou encore un de leurs mélanges, et au moins un véhicule ou excipient physio logiquement acceptable. Dans le contexte de la présente invention, on entend par "véhicule ou excipient physio logiquement acceptable" tout milieu ou additif qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique du principe actif (ici l'acide valproïque ou son dérivé) et qui n'est pas excessivement toxique pour le patient ou sujet, aux concentrations auxquelles il est administré. Préférablement, le véhicule ou excipient physio logiquement acceptable est approprié pour l'utilisation vétérinaire ou pour l'utilisation pharmaceutique humaine.
Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique à utiliser selon l'invention est un médicament à base d'acide valproïque ou de valpromide déjà existant. Par exemple, des médicaments à base d'acide valproïque ou de valpromide sont vendus sous les noms commerciaux : DEPAKINE®, DEPAKINE-CHRONO®, DEPAMIDE®, DEPAKOTE® et MICROPAKINE® L.P. en France ; CONVULEX®, DEPAKINE® et MERCK- VALPROATE® en Belgique ; CONVULEX®, DEPAKINE® et ORIFIL® en Suisse ; DEPAKENE® et EPIVAL® au Canada et aux Etats-Unis. Tous ces médicaments sont administrés par voie orale, et certains sont aussi injectables.
Dans d'autres modes de réalisation, la composition pharmaceutique à utiliser selon l'invention est une formulation nouvelle (c'est-à-dire qui n'est pas actuellement commercialement disponible).
La formulation d'une composition pharmaceutique à utiliser selon l'invention peut varier en fonction de la voie d'administration et du dosage pour lesquels la composition est destinée à être utilisée. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient physio logiquement acceptable, une composition pharmaceutique peut être sous toute forme appropriée pour l'administration à un mammifère, y compris l'homme.
L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut être formulé en une grande variété de formes galéniques et de supports pour l'administration orale. L'administration orale peut s'effectuer par exemple sous forme de comprimés, de comprimés enrobés, de capsules de gélatine dure et molle, de solutions, d'émulsions, de sirops ou de suspensions. L'acide valproïque et ses dérivés peuvent être efficaces lorsqu'ils sont administrés par d'autres voies d'administration comme l'administration topique parentérale continue (perfusion intraveineuse), intramusculaire, intraveineuse, par suppositoires, entre autres voies d'administration. La voie d'administration préférée est en général l'administration orale, utilisant un schéma posologique journalier pratique qui peut être ajusté selon le degré de l'affection et la réponse du patient à l'ingrédient actif.
Il est possible de mettre un ou plusieurs ingrédients actifs, et un ou plusieurs véhicules, excipients, supports ou diluants classiques, sous forme de compositions pharmaceutiques et d'unités de prise. Les compositions pharmaceutiques et les formes d'unités de prise peuvent comprendre, en plus de l'acide valproïque (ou d'un de ses dérivés), des ingrédients classiques en des proportions classiques, avec ou sans autres composés ou principes actifs, et les formes d'unités de prise peuvent contenir une quantité efficace appropriée quelconque de l'ingrédient actif, proportionnée à la posologie journalière à utiliser. Les compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées sous forme de produits solides, comme des comprimés ou des capsules chargées, de produits semi-solides, de poudres, de formulations à libération prolongée, ou de liquides comme des solutions, des suspensions, des émulsions, des élixirs, ou des capsules chargées à usage oral; ou sous forme de suppositoires pour l'administration rectale; ou sous forme de solutions injectables stériles à usage parentéral. Une préparation typique contiendra d'environ 5 % à environ 95 % de composé actif ou de composés actifs (en masse). L'expression "préparation" ou "forme galénique" est censée comprendre les formulations aussi bien solides que liquides du composé actif et l'homme de l'art se rendra compte qu'un ingrédient actif peut exister dans différentes préparations selon l'organe ou le tissu cible, la dose désirée et les paramètres pharmacocinétiques.
Les préparations sous forme solide comprennent des poudres, des comprimés, des pilules, des capsules, des cachets, des suppositoires, et des granulés à disperser. Un support solide peut être une ou plusieurs substances qui peuvent aussi jouer le rôle de diluants, agents aromatisants, solubilisants, lubrifiants, agents de suspension, liants, conservateurs, agents de désintégration des comprimés, ou un produit d'encapsulation. Dans les poudres, le support est en général un solide finement divisé qui est mélangé avec le constituant actif finement divisé. Dans les comprimés, le constituant actif est en général mélangé avec le support ayant la capacité de liaison nécessaire dans des proportions appropriées, et compacté sous la forme et aux dimensions désirées. Des supports appropriés comprennent, mais sans y être limités, le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le sucre, le lactose, la pectine, la dextrine, l'amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, le carboxyméthylcellulose sodique, une cire de faible point de fusion, du beurre de cacao, et analogues. Les préparations sous forme solide peuvent contenir, en plus du constituant actif, des colorants, des arômes, des stabilisants, des tampons, des édulcorants artificiels et naturels, des dispersants, des agents épaississants, des agents solubilisants, et analogues.
Les formulations liquides conviennent aussi pour l'administration orale et comprennent une formulation liquide comprenant des émulsions, des sirops, des élixirs, des solutions aqueuses, et des suspensions aqueuses. Elles peuvent comprendre des préparations sous forme solide qui doivent être converties en préparations sous forme liquide peu avant l'emploi. Les émulsions peuvent être préparées dans des solutions, par exemple dans des solutions aqueuses de propylèneglycol, ou peuvent contenir des agents émulsionnants comme la lécithine, le monooléate de sorbitane ou la gomme arabique. On peut préparer des solutions aqueuses en dissolvant le constituant actif dans de l'eau et en ajoutant des colorants, des arômes, des stabilisants et des agents épaississants appropriés. On peut préparer des suspensions aqueuses en dispersant le constituant actif finement divisé dans de l'eau avec un produit visqueux, comme une gomme naturelle ou synthétique, une résine, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique, et d'autres agents de suspension bien connus.
L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut être formulé pour l'administration parentérale (par exemple par injection, par injection de bolus, ou par perfusion continue) et peut se présenter sous forme d'unités de prise dans des ampoules, des seringues pré- remplies, des perfusions de petit volume ou dans des récipients multidoses avec un conservateur ajouté. Les compositions peuvent prendre la forme de suspensions, de solutions ou d'émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux, par exemple des solutions dans du polyéthylèneglycol aqueux. Des exemples de supports, diluants, solvants ou véhicules huileux ou non aqueux comprennent le propylèneglycol, le polyéthylèneglycol, des huiles végétales (par exemple l'huile d'olive), et des esters organiques injectables (par exemple l'oléate d'éthyle), et peuvent contenir des agents de formulation comme des conservateurs, des agents mouillants, des émulsionnants ou des agents de suspension, des stabilisants et/ou des dispersants. L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut aussi être sous forme de poudre, obtenue par isolement aseptique du produit solide stérile ou par lyophilisation à partir d'une solution pour la reconstitution avant l'emploi avec un véhicule approprié, par exemple de l'eau apyrogène stérile.
L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut être formulé pour l'administration sous forme de suppositoires. En général, pour la préparation de suppositoires, on fait d'abord fondre une cire de faible point de fusion, comme un mélange de glycérides d'acides gras ou du beurre de cacao, et on disperse le constituant actif de manière homogène, par exemple en agitant. On verse ensuite le mélange homogène obtenu dans des moules de taille appropriée, et on le laisse refroidir et se solidifier. Si désiré, il est possible de préparer des formulations avec des enrobages entériques adaptés pour l'administration à libération prolongée ou régulée de l'ingrédient actif. Par exemple, on peut formuler l'acide valproïque, ou un de ses dérivées, dans des dispositifs de délivrance de médicaments transdermiques ou sous-cutanés. Ces systèmes de délivrance sont avantageux lorsque la libération prolongée du principe actif est nécessaire et lorsque l'acceptation du régime de traitement par le patient est cruciale. Dans les systèmes de délivrance transdermique, les ingrédients actifs sont souvent fixés sur un support solide adhérant à la peau. L'acide valproïque, ou un de ses dérivés, peut aussi être combiné avec un agent favorisant la pénétration, par exemple l'Azone (1- dodécylazacycloheptan-2-one). Des systèmes de délivrance à libération prolongée par voie sous-cutanée sont insérés dans la couche subdermale par une procédure chirurgicale ou par injection. Les implants subdermaux encapsulent le composé dans une membrane soluble dans les lipides, par exemple du caoutchouc silicone, ou dans un polymère biodégradable, par exemple du poly(acide lactique).
Des formulations appropriées et des véhicules, supports, diluants et excipients pharmaceutiques sont décrits dans Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, édité par E. W. Martin, Mack Publishing Company, I9eme édition, Easton, Pennsylvanie. L'homme du métier dans le domaine de la formulation peut modifier les formulation dans les limites de l'enseignement de la description pour fournir de nombreuses formulations destinées à une voie d'administration particulière sans compromettre l'activité thérapeutique du ou des principes actifs.
Il est à la portée de l'homme du métier de modifier la voie d'administration et le schéma posologique d'un composé particulier (acide valproïque ou l'un de ses dérivés) pour exploiter la pharmacocinétique du composé en vue d'un effet bénéfique maximum chez le patient. Les compositions pharmaceutiques à utiliser selon la présente invention peuvent, en outre, contenir au moins un principe actif pharmaceutique supplémentaire (c'est-à-dire, en plus de l'acide valproïque ou d'un de ses dérivés). On entend par "principe actif pharmaceutique", tout composé ou substance dont l'administration a un effet thérapeutique ou un effet bénéfique à la santé ou condition générale d'un patient ou d'un sujet auquel il est administré. Ainsi, un principe actif pharmaceutique peut être actif contre l'insuffisance en hepcidine que l'on veut soigner par administration de la composition pharmaceutique ; peut être actif contre une condition ou un symptôme associé à l'insuffisance en hepcidine (par exemple, l'accumulation de fer elle-même ou les manifestations ostéo-articulaires qui ne sont pas forcément liées à l'excès du stock en fer) ; ou peut accroître la disponibilité et/ou l'activité du ou des principes actifs de la composition pharmaceutique. Par exemple, un principe actif pharmaceutique supplémentaire peut être une molécule chélatrice du fer ou bien un autre agent potentiellement inducteur de l'hepcidine qu'il soit peptidique (ex. BMP6, IL-6), chimique ou bien de toute autre nature.
Les compositions pharmaceutiques sont de préférence sous des formes d'unités de prise. Sous cette forme, la préparation subdivisée en doses unitaires contenant des quantités appropriées du constituant actif (acide valproïque ou un de ses dérivés). La forme d'unité de prise peut être une préparation emballée, l'emballage contenant des quantités discrètes de préparation, comme des capsules ou des comprimés emballés, des poudres dans des fioles ou des ampoules. La forme d'unité de prise peut aussi être une capsule, un comprimé, un cachet ou une pastille en soi, ou peut être le nombre approprié de ceux-ci sous forme emballée.
II - Utilisation de l'Acide Valproïque ou de ses Dérivés dans le Traitement des Insuffisances d'Hepcidine
L'invention concerne principalement l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour son utilisation dans le traitement d'une insuffisance d'hepcidine ou d'une hepcidino- déficience chez un sujet.
De la manière utilisée ici, le terme "sujet" désigne un être humain ou un animal, en particulier un mammifère (par exemple un primate, un chien, un chat, une chèvre, un cheval, un porc, une souris, un rat, un lapin, un poisson zèbre et analogues) qui peut développer une maladie ou une condition associée à une insuffisance en hepcidine ou une hepcidino-défîcience, mais qui peut ou non avoir la maladie ou la condition. Dans de nombreux modes de réalisation de la présente invention, le sujet est un être humain. Dans ces modes de réalisation, le sujet est souvent appelé "individu". Le terme "individu" ne désigne pas un âge particulier, et englobe donc les enfants, les adolescents et les adultes. Le terme "patient" est plus particulièrement utilisé lorsque l'individu souffre d'une insuffisance en hepcidine ou d'une hepcidino-défïcience.
Dans le contexte de la présente invention, on entend par "traitement" une méthode qui a pour but (1) de retarder ou prévenir le début d'une maladie ou d'une condition clinique ; (2) de ralentir ou d'arrêter la progression, l'aggravation ou la détérioration des symptômes de la maladie ; (3) d'apporter des améliorations des symptômes de la maladie ; et/ou (4) de guérir la maladie. Un traitement peut être administré avant le début de la maladie pour une action préventive, ou il peut être administré après initiation de la maladie, pour une action thérapeutique. Il peut être réalisé en association ou non avec d'autres thérapeutiques (notamment phlébotomies et médications) visant à réduire le stock en fer ou bien à corriger l'anomalie du métabolisme du fer.
Une méthode de traitement selon l'invention comprend l'administration au sujet ou au patient d'une quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque (ou de l'un de ses dérivés ou de leurs mélanges), ou d'une composition pharmaceutique contenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés ou l'un de leurs mélanges. L'expression "quantité thérapeutiquement efficace", telle qu'utilisée ici, désigne une quantité qui est suffisante pour atteindre le ou les objectifs prévus, comme par exemple une réponse biologique ou médicale désirée dans une cellule, un tissu, un système ou un sujet. Par exemple, dans certains modes de réalisation de la présente invention, le ou les objectifs peuvent être : augmenter l'expression d'hepcidine et/ou diminuer la concentration en fer dans le plasma et/ou diminuer la surcharge en fer dans les cellules du foie, du cœur, du pancréas, de l'hypophyse, et/ou des os, et/ou prévenir ou traiter une maladie associée à une insuffisance en hepcidine ou à une surcharge en fer. La dose sera ajustée aux besoins individuels dans chaque cas particulier. Cette dose peut varier dans de larges limites en fonction de nombreux facteurs comme la gravité de la maladie à traiter, l'âge et l'état de santé général du patient, les autres médicaments avec lesquels est traité le patient, la voie et la forme d'administration, et les préférences et l'expérience du médecin traitant impliqué. Pour l'administration orale, une dose journalière entre environ 0,01 et environ 1000 mg/kg de masse corporelle et par jour devrait être appropriée. Une dose journalière préférée se situe entre environ 0,1 et environ 500 mg/kg de masse corporelle, de préférence entre 0,1 et environ 100 mg/kg de masse corporelle et au mieux entre 1,0 et environ 10 mg/kg de masse corporelle par jour. Ainsi, pour l'administration à une personne de 70 kg, la posologie serait d'environ 7 mg à 0,7 g par jour. La dose journalière peut être administrée sous forme d'une seule dose ou en des doses divisées, de façon typique entre 1 et 5 doses par jour, par exemple 2 à 3 prises par jour. En général, on commence le traitement avec de petites doses qui sont inférieures à la dose optimale du composé. Ensuite, on augmente la dose par petits paliers jusqu'à ce que l'on atteigne l'effet optimal pour le patient individuel. L'homme du métier est capable, sans expérimentation exagérée et en se basant sur ses connaissances personnelles, sur l'expérience et sur la description de cette demande de brevet, de déterminer une quantité thérapeutiquement efficace de l'acide valproïque, de l'un de ses dérivés, de l'un de leurs mélanges ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés ou l'un des leurs mélanges, pour une maladie et un patient donnés.
Dans certains modes de réalisation, la dose journalière d'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés administrée au patient traité selon l'invention est plus faible que la dose journalière du même principe actif administrée à un patient souffrant d'épilepsie. L'homme du métier connaît (ou sait trouver les informations concernant) les posologies moyennes des médicaments à base d'acide valproïque ou de ses sels. Par exemple, dans le cas de la DEPAKINE®, la posologie moyenne par 24 heures est de 30 mg/kg pour les nourrissons et les enfants sous forme de sirop, de solution buvable ou de granulés à libération prolongée, et de 20 à 30 mg/kg pour les adolescents et les adultes sou forme de comprimés ou de granulés à libération prolongée.
Comme indiqué plus haut, l'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés, ou l'un de leurs mélanges ou encore une composition pharmaceutique comprenant l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés ou l'un de leurs mélanges) peut être utilisé pour le traitement de maladies associées à une insuffisance en hepcidine ou une hepcidino- déficience.
Telle qu'utilisée ici, l'expression "insuffisance en hepcidine ou hepcidino- défïcience" désigne un taux d'expression d'hepcidine qui est (ou une condition associée à un taux d'expression d'hepcidine) qui est, en tenant compte du stock en fer de l'organisme, inférieure à la moyenne mesurée pour un sujet sain (ou un groupe de sujets sains) de même âge, de même sexe, de poids corporel sensiblement identique et présentant un statut martial comparable. L'homme du métier connaît ces données ou sait comment les déterminer. Une insuffisance en hepcidine est présente (dans presque la totalité des cas) chez les patients souffrant d'une hémochromatose héréditaire. L'hémochromatose héréditaire (ou hémochromatose génétique ou primitive) est un trouble génétique du métabolisme du fer, lors duquel une surcharge ferrique des cellules du foie, du pancréas, du cœur, des articulations ou d'autres organes provoque des lésions fonctionnelles et anatomiques. C'est une maladie fréquente dans sa forme liée à la mutation du gène HFE, une personne sur 200 ou 300 étant génétiquement prédisposée, mais rare dans d'autres formes, notamment celles liées aux mutations dans les gènes hémojuvéline et récepteur de la transferrine. Les manifestations ostéoarticulaires de la maladie sont au premier plan tant au moment du diagnostic qu'à la phase d'état par leur retentissement sur la qualité de vie. Il s'agit, d'une part, du rhumatisme hémochromatosique qui constitue une des principales plaintes des patients et, d'autre part, de l'ostéoporose qui augmente le risque fracturaire.
Les hémochromatoses héréditaires (également appelées génétiques ou primaires) incluent l'hémochromatose génétique de type 1 (dite classique), l'hémochromatose juvénile (type 2A, type 2B), et l'hémochromatose de type 3 (par mutation TFR2).
D'autres conditions qui peuvent être traitées par une méthode selon l'invention sont les anémies avec surcharge en fer (ou hémosidérose). Les anémies avec surcharge en fer sont des conditions cliniques dans lesquelles les érythrocytes envoient un signal qui conduit à la diminution des taux d'hepcidine hépatique à l'origine d'une augmentation de l'absorption du fer par le duodénum et une libération de fer par les macrophages. Comme le fer ne peut pas être utilisé par les érythrocytes, il s'accumule dans différents organes, causant des dommages. Fréquemment, les patients ont besoin de transfusions sanguines, ce qui ne fait qu'exacerber la surcharge en fer. Cependant, une surcharge en fer existe avant même transfusion. Les anémies avec surcharge en fer incluent les β- thalassémies, les anémies dysérythropoïétiques congénitales, les anémies sidéroblastiques congénitales ou acquises, l'hypotransferrinémie congénitale ou acquise, l'atransferrinémie congénitale ou acquise, et l'acéruloplasminémie congénitale. Les anémies avec surcharge en fer comprennent aussi les anémies hémolytiques congénitales (comme la stomatocytose, la xérocytose, la sphérocytose, et certaines enzymopathies comme les déficits en pyrimidine nucléotidase, les déficits en G6PD de type I, et les déficits en pyrimidine 5' nucléotidase, et les déficits en pyruvate kinase). Les anémies avec surcharge en fer comprennent également les syndromes myélodysplasiques (comme par exemple la cytopénie réfractaire avec dysplasie unilignée, l'anémie réfractaire sans ou avec sidéroblastes en couronne, le syndrome myélodysplasique avec myélodysplasie touchant plusieurs lignées (CRMD), le syndrome 5q-, l'anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB), et les syndromes myélodysplasiques inclassables).
La production d'hepcidine peut-être déficiente dans certaines maladies chroniques du foie (ou hépatopathies chroniques). Les hépatopathies chroniques qui peuvent être traitées par une méthode selon l'invention incluent, par exemple, les hépatites en particulier l'hépatite C chronique et l'hépatite B chronique, la maladie alcoolique hépatique, la stéatohépatite non-alcoolique, et la cirrhose du foie (quelle que soit son étiologie). L'invention peut aussi être utilisée dans le traitement de la porphyrie cutanée tardive. En effet, une réduction de l'expression d'hepcidine a été observée chez les patients souffrant de porphyrie cutanée tardive.
L'effet d'un traitement selon l'invention peut être évalué par dosage du fer et/ou par dosage de l'hepcidine dans un échantillon biologique du patient traité. Le dosage du fer peut être effectué par n'importe quelle méthode connue dans l'art. Les méthodes de dosage du fer incluent, sans limitation, le dosage de la ferritine sérique, de l'UIBC (unbound iron binding capacity, du fer lié à la transferrine (ou non-transferrin bound iron: NTBI) et du fer plasmique labile (ou labile plasma iron: LPI), la mesure de la concentration hépatique en fer (CHF) par biopsie du foie, IRM hépatique et splénique, biomagnétométrie (SQUID), la mesure de la concentration cardiaque en fer par IRM cardiaque, l'évaluation de la répartition du fer dans le foie (hépatocytes, cellules sinusoïdales, espaces vasculaires, cellules biliaires) par étude histologique utilisant une coloration spécifique révélant le fer en excès. Le dosage de l'hepcidine peut être effectué par n'importe quelle méthode connue dans l'art. Les méthodes de dosage de l'hepcidine incluent, sans limitation, le dosage de l'hepcidine dans le plasma ou l'urine par spectrométrie de masse (Seldi-TOF MS, MALDI-TOF MS), chromatographie liquide, ELISA ou par dosage radio immuno logique.
L'homme du métier comprendra qu'une méthode selon l'invention peut être utilisée dans n'importe quelle condition clinique où une augmentation de l'expression d'hepcidine est désirable. III - Autres Utilisations de l'Acide Valproïque ou de ses Dérivés
L'invention concerne également l'utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivées ou de l'un de leurs mélanges, pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule. L'invention concerne aussi un procédé pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule, comprenant une étape de mise en contact de la cellule avec une quantité efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés, ou de l'un de leurs mélanges.
Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Par exemple, la cellule peut être une cellule hépatique provenant d'une lignée cellulaire établie, comme par exemple les lignées Huh7, Hep3b, HepG2, PLC/PRF/5, et SkHepI ou être isolée d'un sujet sain ou d'un malade.
Dans d'autres modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo, par exemple une cellule dans un animal (ex. un modèle animal). Dans ce cas, la mise en contact de la cellule avec une quantité efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés, ou de l'un de leurs mélanges se fait par administration à l'animal.
De telles applications peuvent notamment servir à préciser les mécanismes d'action de l'acide valproïque (ou de l'un de ses dérivés), ou bien à rechercher des effets thérapeutiques bénéfiques en association avec d'autres thérapeutiques visant à moduler le métabolisme du fer ou le stock en fer de l'organisme.
A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence.
Les exemples suivants et les figures sont présentés pour illustrer certains modes de réalisation des procédures décrites ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention.
Exemples
Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention. Légendes des Figures
Figure 1: Modulation de l'expression de l'hepcidine par l'acide valproïque.
Mise en évidence d'une augmentation de l'expression de l'ARNm endogène de l'hepcidine (HAMP) dans les cellules HepG2 lors de l'exposition à des concentrations croissantes d'acide valproïque (VP A) pendant 24 heures. Les résultats sont exprimés par rapport à la condition contrôle (100%).
Figure 2: Impact de délétions successives du promoteur de l'hepcidine sur la modulation de l'activité luciférase liée au promoteur de l'hepcidine par l'acide valproïque. Des cellules de la lignée HepG2 ont été transfectées par le plasmide contenant 2762 pb d'ADN du promoteur de l'hepcidine, ou différentes délétions, placés en amont du gène rapporteur de la luciférase. Les cellules ont été traitées 24 heures avec 1 mM d'acide valproïque (VPA). Les résultats représentent le nombre de fois d'activation (fold d'activation) par l'acide valproïque de chaque construction plasmidique utilisée par rapport à la condition sans acide valproïque. Figure 3: Impact de mutations du promoteur de l'hepcidine sur la modulation de l'activité luciférase liée au promoteur de l'hepcidine par l'acide valproïque. Des cellules de la lignée HepG2 ont été transfectées par le plasmide contenant 2762 pb d'ADN du promoteur de l'hepcidine, sauvage ou muté dans les 2 sites de fixation des facteurs transcriptionnels SMAD, placés en amont du gène rapporteur de la luciférase. Les cellules ont été traitées 24 heures avec 1 mM d'acide valproïque (VPA). Les résultats représentent le nombre de fois d'activation (fold d'activation) par l'acide valproïque de chaque construction plasmidique utilisée par rapport à la condition sans acide valproïque.
Figure 4: Le valpromide induit l'expression de l'ARNm de l'hepcidine dans les cellules HepG2. Mise en évidence d'une augmentation de l'expression de l'ARNm endogène de l'hepcidine (HAMP) dans les cellules HepG2 lors de l'exposition à 1 mM de valpromide pendant 24 heures. Les cultures contrôles sont entretenues en présence de DMSO utilisé pour dissoudre le valpromide. Les résultats sont exprimés par rapport à la condition contrôle (100%). Matériels et Méthodes
Cultures cellulaires. Des cellules de la lignée humaine HepG2, d'origine hépatocytaire, ont été cultivées dans du milieu essentiel minimum alpha (Invitrogen, France) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (Invitrogen, France), 100UI/ml de pénicilline, 100 μg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Les cellules ont été maintenues à 37°C sous 5% de C02.
Constructions plasmidiques. Un fragment de 2762 paires de bases (bp) comprenant 2708 pb du promoteur de l'hepticidine en amont du site d'initiation de la transcription et 57 pb de la zone 5'Untranslated Région (UTR) a été inséré dans le pGL4.17 (Promega, France) aux sites de restriction Kpnl-Xhol en amont du gène rapporteur de la luciférase de luciole pour générer la construction plasmidique -2708Hep/Luc (Island et al, Biochem. J., 2011, 437 : 477-482). Les mutations internes des deux sites de fixation des protéines smad (Sites BMP-
RE pour Bone Morphogenetic Protein - Responsive Elément ont été réalisées en utilisant le kit Quick change (Stratagene, France) selon les instructions du fabricant en utilisant le plasmide-2708 Hep/Luc en tant que matrice et les amorces internes décrites dans le Tableau 1. Les délétions successives du promoteur de l'hepcidine ont été réalisées par amplification par PCR de la séquence contenue dans le plasmide -2708 Hep/luc à l'aide des primers du tableaul . Les différents produits de PCR obtenus ont été insérés en amont du gène codant la luciférase. Les séquences d'ADN des constructions plasmidiques ont été confirmées par séquençage de 1ADN (Applied biosystems, France).
Tableau 1. Amorces nucléotidiques utilisées pour réaliser les délétions dans le promoteur de l'hepcidine.
Figure imgf000023_0001
Transfection, dosage de la luciférase. 7xl05 cellules HepG2 ont été ensemencées par puits dans des plaques 12 puits. Le lendemain, 100 ng de plasmide pGL4.17- hepcidine/Luciferase ont été co-transfectés dans les cellules avec 50 ng de plasmide normalisateur pGL4.70 (Promega, France. Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois. Les constructions plasmidiques ont été transfectées en utilisant le réactif de transfectine (Bio-Rad, France) selon les instructions du fabricant. Vingt-quatre heures après la transfection, les cellules ont été traitées par 1 mM de valproate de sodium (Sigma, France). Vingt-quatre heures après ce traitement, les cellules ont été lysées et les activités luciférase ont été mesurées dans les lysats cellulaires en utilisant le système de dosage Dual-GLO Luciférase Reporter (Promega, France) et un luminomètre Centra LB 960 (Berthold Technologies, France). Les valeurs de l'activité de la luciférase représentent des taux d'activité de la luciférase de luciole / l'activité luciférase du normalisateur. Le rapport d'activité luciférase de chaque construction plasmidique obtenu est rapporté au rapport d'activité luciférase de la construction -2708 Hep/Luc, qui a été arbitrairement fixée à 100%. Les fold d'activation représentent le rapport des activités luciférases en condition traitée sur le rapport des activités luciférases en condition non traitée.
RT-PCR quantitative. 1x10e cellules HepG2 ont été ensemencées par puits dans des plaques 6 puits. 24 heures après les cellules ont été traitées par des doses croissantes de valproate de sodium (0,125 à ImM) ou par ImM de valpromide (Sigma, France). 24 heures après le traitement les ARN totaux ont été extraits à l'aide du système d'isolation d'ARN total SV (Promega, France). 1 μg d'ARN a été utilisé pour la transcription inverse en suivant le protocole du fabricant (M-MLV-RT, Promega, France). Le niveau d'expression de l'ARNm de l'hepcidine a été évalué par PCR quantitative sur trois triplicats biologiques et au moins trois semaines distinctes, en utilisant le mix: qPCRMasterMixPlus SYBR® GreenI selon les instructions du fabricant (Eurogentec, France). La réaction de qRT-PCR a été exécutée sur ABI PRISM StepOne (Applied Bioscience, France). Pour chaque puits, la valeur de Ct obtenue pour l'ARNm étudié a été normalisée par la valeur du Ct de l'ARNm de Hprt (hypoxanthine guanine phosphoribosyl-transférase. Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification des ARNm sont décrites dans le Tableau 2.
Tableau 2. Amorces utilisées pour réaliser les PCR quantitatives.
Figure imgf000024_0001
Résultats
Activation de l'expression du gène de l'hepcidine par le valproate de sodium.
Afin de déterminer l'effet du valproate de sodium sur l'expression du gène de l'hepcidine, les cellules HepG2 ont été traitées avec des doses croissantes de valproate de sodium (0,125 à 1 mM) pendant 24 heures (Figurel). Des expériences de RT-qPCR montrent une augmentation dose-dépendante du niveau d'ARNm de l'hepcidine endogène. L'acide valproïque est donc un activateur de l'expression du gène de l'hepcidine dans un modèle de cellules hépatiques. L'effet du valproate de sodium pourrait impliquer les sites BMP-RE. Pour caractériser les nucléotides du promoteur de l'hepcidine impliqués dans la réponse à l'acide valproïque, des constructions plasmidiques contenant des fragments de différentes tailles du promoteur de l'hepcidine, insérés en amont du gène rapporteur de la luciférase, ont été générées. Ces plasmides sont transfectés dans les cellules HepG2, qui sont ensuite traitées avec 1 mM de valproate de sodium pendant 24 heures (Figure2). Le dosage de l'activité luciférase montre que la réponse au valproate de sodium est essentiellement médiée par les nucléotides entre les positions du promoteur -2708 et - 1990 et entre -200 et -70pb d'ADN. Ces deux régions du promoteur contiennent chacune un site de fixation de type BMP-RE connu pour interagir avec des facteurs de transcription Smad.
En effet, il est connu que l'expression du gène de l'hepcidine est activée par la cytokine BMP6 qui lorsqu'elle se fixe sur son récepteur va induire la phosphorylation des protéines smadl, 5 et 8 qui s'associent alors avec Smad4 (Verga Falzacappa et al, J Mol Med, 2008, 86: 531-541; Truksa et al, Blood, 2009, 113: 688-695; Island et al, Haematologica, 2009, 94 : 720-724; Meynard et al , Nature Genetics, 2009, 41 : 478-481). Ce complexe protéique entre dans le noyau et se fixe alors sur les éléments de réponse aux BMP du promoteur de l'hepcidine (BMP-RE) pour activer sa transcription.
Afin de tester si les deux sites BMP-RE sont impliqués dans la réponse à l'acide valproïque, une construction plasmidique contenant le promoteur de l'hepcidine muté dans les deux sites BMP-RE, empêchant la fixation des protéines smad, est transfecté dans les cellules HepG2 qui sont alors traitées 24 heures avec 1 mM de valproate de sodium (Figure 3). On observe que la réponse au valproate de sodium est fortement inhibée lorsque les deux sites BMP-RE sont mutés. Il semble donc que l'activation de l'expression du gène de l'hepcidine par le valproate de sodium nécessite, au moins en partie, la présence des sites BMP-RE.
Activation de l'expression du gène de l'hepcidine par le valpromide. Le valpromide est un dérivé de l'acide valproïque. Afin de déterminer si le valpromide avait également un effet sur l'expression du gène de l'hepcidine, des cellules HepG2 sont traitées par ce composant pendant 24 heures à une dose de 1 mM et les cellules contrôle sont additionnées de DMSO qui est le diluant du valpromide (Figure 4) . Des expériences de RT-qPCR montrent une augmentation du niveau d'ARNm de l'hepcidine endogène par rapport au contrôle DMSO. Cependant, le DMSO est lui-même un inhibiteur de l'expression de l'hepcidine. Le valpromide est donc un activateur de l'expression du gène de l'hepcidine dans un modèle de cellules hépatiques cependant avec un effet moindre que l'acide valproïque à 1 mM pendant 24 heures.

Claims

Revendications
Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation dans le traitement d'une insuffisance en hepcidine ou d'une hepcidino-défïcience.
Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication
1, caractérisé en ce que le dérivé pharmaceutiquement acceptable est choisi parmi les sels de l'acide valproïque, les esters de l'acide valproïque, les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque, les thioamides de l'acide valproïque, et les oligomères de l'acide valproïque.
Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication
2, caractérisé en ce que le dérivé est le valpromide.
Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'insuffisance en hepcidine, ou hepcidino-défïcience, est associée à une hémochromatose héréditaire.
Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 4, caractérisé en ce que F hémochromatose héréditaire est F hémochromatose génétique de type 1, l'hémochromatose juvénile de type 2A, F hémochromatose juvénile de type 2B, ou l'hémochromatose de type 3.
Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'insuffisance en hepcidine, ou hepcidino-défïcience, est associée à une anémie avec surcharge en fer.
Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'anémie avec surcharge en fer est une anémie dysérythropoïétique congénitale, une anémie sidéroblastique congénitale ou acquise, une hypotransferrinémie congénitale ou acquise, une atransferrinémie congénitale ou acquise, ou une acéruloplasminémie congénitale.
8. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'anémie avec surcharge en fer est une thalassémie, en particulier une β-thalassémie.
9. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'insuffisance en hepcidine, ou hepcidino-défïcience, est associée à une anémie hémolytique congénitale.
10. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'anémie hémolytique congénitale est une stomatocytose, une xérocytose, une sphérocytose, un déficit en pyrimidine nucléotidase, un déficit en G6PD de type I, un déficit en pyrimidine 5' nucléotidase, ou un déficit en pyruvate kinase.
11. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'insuffisance en hepcidine, ou hepcidino-défïcience, est associée à un syndrome myélodysplasique.
12. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 11, caractérisé en ce que le syndrome myélodysplasique est la cytopénie réfractaire avec dysplasie unilignée, l'anémie réfractaire sans ou avec sidéroblastes en couronne, le syndrome myélodysplasique avec myélodysplasie touchant plusieurs lignées (CRMD), le syndrome 5q-, l'anémie réfractaire avec excès de blastes (AREB), ou un syndrome myélodysplasique inclassable.
13. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'insuffisance en hepcidine, ou hepcidino déficience, est associée à une hépatopathie chronique.
14. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'hépatopathie chronique est une hépatite C chronique, une hépatite B chronique, une maladie alcoolique hépatique, une stéatohépatite non-alcoolique, ou une cirrhose du foie.
15. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'insuffisance en hepcidine, ou hepcidino-défïcience, est associée à une porphyrie cutanée tardive.
16. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, et au moins un véhicule ou excipient physio logiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement d'une insuffisance en hepcidine ou d'une hepcidino-défïcience .
17. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que le dérivé pharmaceutiquement acceptable est choisi parmi les sels de l'acide valproïque, les esters de l'acide valproïque, les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque, les thioamides de l'acide valproïque, et les oligomères de l'acide valproïque.
18. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que le dérivé est le valpromide.
19. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisée en ce que l'insuffisance en hepcidine ou hepcidino-défïcience, est associée à une hémochromatose héréditaire, une anémie avec surcharge en fer, une anémie hémolytique congénitale, un syndrome myélodysplasique, une hépatopathie chronique, ou une porphyrie cutanée tardive.
20. Utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule.
21. Procédé pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule comprenant la mise en contact de la cellule avec de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés.
22. Utilisation selon la revendication 20 ou procédé selon la revendication 21 , caractérisé(e) en ce que la cellule est une cellule in vitro.
23. Utilisation selon la revendication 20 ou la revendication 22 ou procédé selon la revendication 21 ou la revendication 22, caractérisé(e) en ce que la cellule est une cellule hépatique. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 20, 22 et 23 ou procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé(e) en ce que le dérivé de l'acide valproïque est choisi parmi les sels de l'acide valproïque, les esters de l'acide valproïque, les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque, les thioamides de l'acide valproïque, et les oligo mères de l'acide valproïque.
Utilisation selon l'une quelconque des revendications 20, 22 et 23 ou procédé selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, caractérisé(e) en ce que le dérivé de l'acide valproïque est le valpromide.
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