CN101897687A - 丙戊酸钠治疗肝脏炎症相关疾病的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丙戊酸钠治疗肝脏炎症相关疾病的新用途。具体而言，本发明涉及丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合在制备用于治疗或预防对象的与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病(尤其是肝损伤)的药物组合物中的用途。

Description

丙戊酸钠治疗肝脏炎症相关疾病的新用途

技术领域

本发明涉及生物技术和医药领域，更具体而言，涉及丙戊酸类活性物质在疾病治疗中的新用途。

背景技术

本领域中已知多种与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病，例如(但不限于)：肝损伤、肝内胆汁淤积、胆道梗阻、胰腺疾病、甲状腺功能亢进症、急性心肌梗塞、心力衰竭或多发性肌炎。其中，肝损伤是严重危害人类健康的重大疾病。

肝炎从病因看主要有病毒性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎等。肝炎特别是病毒性肝炎在中国的发病率持续在较高水平。就乙型肝炎来说，全世界20亿人感染乙肝病毒，其中6.9亿在中国，全球有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带者3.5亿人，其中三分之一在中国；全世界每年有75万人死于乙肝病毒染引起的疾病，其中28万人来自中国。因此，探索降低血清谷丙转氨酶活性(尤其是肝炎)的新方法和药物一直是医药领域的研究热点。

ConA(伴刀豆蛋白，一种植物凝集素)诱导的肝炎模型(ConA induced hepatitis，CIH)，是一种被广泛接受的T细胞介导的肝炎模型(Tiegs G，Hentschel J，Wendel A.J Clin Invest 1992，90：196-203)。在模型诱导后8到24小时，血清谷丙转氨酶活性急剧增加，HE染色可见肝脏正常结构被破坏，大量的肝实质细胞凋亡死亡，呈TUNEL阳性。在这种模型中，细胞因子TNFα、IFNγ、白介素-12以及白介素-4对肝脏的损伤起了关键作用。目前，CIH主要用于免疫介导的肝脏损伤的机理研究和保肝药物作用机理的研究。

丙戊酸类化合物，是一类抗癫痫药物，目前常用的是丙戊酸、丙戊酸钠、丙戊酸镁、丙戊酰胺或它们的复方制剂。本领域中对此类化合物在药剂学、药代动力学、药效学、毒理学等已有较多的研究，其抗癫痫作用可能与脑内抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的浓度升高有关。例如，其中的代表药物丙戊酸钠在口服后从胃肠道迅速吸收，胶囊剂与普通片约经1～4小时血药浓度可达峰值，肠溶片则需3～4小时，饭后服用延迟吸收。各种剂型的生物利用度近100％。半衰期为7～10小时。有效血药浓度为50～100μg/ml。血浆蛋白结合率高，约80～94％。丙戊酸钠在肝中代谢，包括葡糖醛酸化和某些氧化过程，且主要由肾排泄，少量随粪便提出。

如何利用现有的成熟药物积极有效地治疗与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病，尤其是与肝脏损伤相关的疾病，从而降低开发成本，已成为本领域中迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的之一正是在于开发出已知药物丙戊酸钠在降低谷丙转氨酶活性(尤其是治疗与肝脏损伤相关的疾病)中的新用途。

在本发明的第一方面，提供了丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合在制备用于治疗或预防对象中与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病的药物中的用途。

在本发明的一个实施方式中，所述与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病包括：肝损伤、肝内胆汁淤积、胆道梗阻、胰腺疾病、甲状腺功能亢进症、急性心肌梗塞、心力衰竭或多发性肌炎。

在本发明的另一个实施方式中，所述肝损伤为：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、脂肪肝所致的肝损伤。

在一个优选例中，所述肝损伤为免疫介导的肝损伤，优选为病毒性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。

在本发明的另一个实施方式中，所述药物组合物还降低对象中血清细胞因子的表达。

在一个优选例中，所述血清细胞因子是：肿瘤坏死因子-α和/或γ-干扰素。

在本发明的另一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。

在一个优选例中，所述哺乳动物是人。

在本发明的另一个实施方式中，所述药物组合物中的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合占药物组合物总重量的0.001-99.9wt％。

在一个优选例中，所述药物组合物中的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合占药物组合物总重量的1-95wt％，优选5-90wt％，更优选10-80wt％。

在本发明的另一个实施方式中，所述药物组合物的剂型包括：片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

在一个优选例中，所述药物组合物为单位剂型或多剂型，其中丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合的含量为1-3500mg/剂，优选2-3000mg/剂，更优选3-2000mg/剂。

在另一优选例中，所述药物组合物以5-120mg/kg的剂量给药，优选10-70mg/kg，更优选15-50mg/kg。

在本发明的另一个实施方式中，所述药物组合物还包含缓解或治疗肝脏损伤的其它药物。

在本发明的另一个实施方式中，所述缓解或治疗肝脏损伤的其它药物选自：丹参酮ⅡA、甘草酸制剂、水飞蓟素、粉防己碱或来氟米特。

在本发明的第二方面提供了一种药物组合物，其含有：

(1)有效量的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合；

(2)选自下组的一种或多种物质：丹参酮ⅡA、甘草酸制剂、水飞蓟素、粉防己碱、来氟米特或它们的组合；和

(3)药学上可接受的载体。

在一个优选例中，丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合占组合物总重量的0.001-99.9wt％，优选1-95wt％，较优选为5-90wt％，更优选10-80wt％。

在另一优选例中，组分(1)和组分(2)的重量比为0.01∶100～100∶0.01，优选0.1∶80～80∶0.1，更优选1∶60～60∶1。

在本发明的其它方面，提供了治疗或预防疾病的方法。

在一个优选例中，本发明提供了一种治疗或预防对象肝脏损伤的方法，所述方法包括：给予需要的对象有效量的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合。

在另一优选例中，本发明提供了一种治疗或预防对象与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病的方法，所述方法包括：给予需要的对象有效量的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合。

在另一优选例中，本发明提供了一种降低血清细胞因子表达的方法，所述方法包括：给予需要的对象有效量的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合。

在另一优选例中，本发明提供了一种治疗或预防与血清细胞因子表达过度相关的疾病的方法，所述方法包括：给予需要的对象有效量的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合。

在本发明的一个实施方式中，以5-120mg/kg的剂量，优选10-70mg/kg，更优选15-50mg/kg给予丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合。

在本发明的另一个实施方式中，以片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏的形式给予丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合。

在本发明的另一个实施方式中，与其它缓解或治疗肝脏损伤的药物一起或先后给予丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合。

在本发明的一个优选例中，所述缓解或治疗肝脏损伤的其它药物选自：丹参酮ⅡA、甘草酸制剂、水飞蓟素、粉防己碱或来氟米特。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1：对CIH小鼠实施丙戊酸钠短期治疗的实验流程示意图。

图2：对CIH小鼠实施丙戊酸钠长期治疗的实验流程示意图。

图3：丙戊酸钠在短期治疗实验和长期治疗实验中对CIH小鼠谷丙转氨酶的影响。图中，“**”代表：P＜0.01；“***”代表：P＜0.001。

图4：经丙戊酸钠短期治疗实验和长期治疗实验的CIH小鼠肝脏的H&E染色和TUNEL染色。

图5：丙戊酸钠对血清细胞因子的影响。图中，“*”代表：P＜0.05；“***”代表P＜0.001。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究发现：广泛用来治疗癫痫的丙戊酸类化合物可极显著地降低血清谷丙转氨酶的活性，对免疫介导的肝损伤有显著的保护作用。本发明人进一步明确了其保护作用的机理，由此证实了丙戊酸类活性物质可用于治疗血清谷丙转氨酶活性过高相关疾病，尤其是与肝脏炎症相关的疾病。在此基础上，发明人完成了本发明。

本发明提供了现有成熟药物丙戊酸类化合物在治疗血清谷丙转氨酶活性过高相关疾病，尤其是肝脏疾病(尤其是炎症相关疾病)中的新用途，为降低开发成本和积极有效地治疗肝脏疾病提供了一种新的途径。

丙戊酸类活性物质

如本发明所用，术语“丙戊酸类活性物质”和“丙戊酸类化合物”可互换使用，是指丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物、或它们的混合物，其中包括但不限于：丙戊酸、丙戊酸钠、丙戊酸镁、丙戊酸钙、丙戊酸赖氨酸盐、或丙戊酰胺等。

在本发明中，对于制备丙戊酸类活性物质的方法没有特别的限制，比如其可以采用化学合成、或半化学合成的方法来制备。本发明中所使用的丙戊酸类活性物质可通过市售途径获得，例如可购自Sigma。

丙戊酸类活性物质的新用途

丙戊酸类活性物质在以往研究和临床应用中已作为中枢神经系统药物，被应用于神经系统疾病的治疗和预防，例如其主要用于治疗癫痫，也有报道将其用于偏头痛的预后、顽固性呃逆等疾病的研究中。但是，目前还没有关于丙戊酸类活性物质在防治肝脏损伤方面的研究报道。

本发明人利用本领域广泛接受的T细胞介导的肝炎模型“ConA诱导的肝炎模型”(CIH)，证实了丙戊酸类化合物具有对免疫介导的肝损伤有显著的保护作用，长期和短期注射丙戊酸类化合物可以使CIH小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)的活性显著降低。肝脏的病理分析也显示，在丙戊酸类化合物处理组小鼠肝脏正常结构的破坏和TUNEL阳性的凋亡细胞与对照组相比均明显减少。

发明人深入的工作进一步表明：丙戊酸类化合物对免疫介导的肝损伤的保护作用的机理是其导致介导肝损伤的炎性细胞因子，包括γ-干扰素和肿瘤坏死因子α表达的显著下降，从而保护肝脏免受损伤。

如本文所用，术语“免疫介导的肝损伤”是所有由免疫介导的肝脏损伤的统称，在许多肝炎的发病过程中都起了重要作用。免疫介导的肝损伤包括但不限于：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等肝脏损伤疾病。肝损伤、肝纤维化和肝癌是肝脏损伤的不同病理阶段，免疫介导的肝损伤一般出现在急性期或慢性期的早期，如果由急性期转入慢性期多会导致肝脏的纤维化，而如果肝细胞自我修复系统紊乱，细胞大量的恶性增殖就转变为肝癌。

本发明中提供了丙戊酸类活性物质的新用途，其可用于治疗或预防对象的与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病，包括：治疗或预防对象的肝损伤(尤其是免疫介导的肝损伤)、或降低血清细胞因子(例如肿瘤坏死因子-α和/或γ-干扰素)的表达。所述与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病包括(但不限于)：肝损伤、肝内胆汁淤积、胆道梗阻、胰腺疾病、甲状腺功能亢进症、急性心肌梗塞、心力衰竭或多发性肌炎。其中，肝损伤包括(但不限于)：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、脂肪肝所致的肝损伤。

在一个优选例中，所述肝损伤为免疫介导的肝损伤，优选为病毒性肝炎、酒精性肝炎和自身免疫性肝炎。

相应地，本发明中还提供了丙戊酸类活性物质在制备用于治疗或预防上述疾病的药物组合物中的用途，以及利用丙戊酸类活性物质或其药物组合物来治疗或预防上述疾病的方法。

应理解，本发明中所用术语“缓解”是指使得疾病或失调的征状得到改善，甚至该疾病或失调消失或痊愈。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物在治疗或预防对象与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病(尤其是肝损伤)中的用途，所述的药物组合物含有有效量的丙戊酸类活性物质以及药学上可接受的载体，或任选含有其它本领域已知的对上述疾病具有治疗或预防作用的其它活性成分。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的药物组合物中可含有作为有效成分的：丙戊酸、丙戊酸的药学上可接受的盐、酰胺化物(即丙戊酰胺)或它们的混合物。

本发明的组合物中丙戊酸类活性物质有效成分占组合物总重量的0.001-99.9wt％；优选为组合物总重量的1-95wt％，较优选为5-90wt％，更优选10-80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。

如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本发明的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在本发明的一个优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中丙戊酸类活性物质的含量为1-3500mg/剂，优选2-3000mg/剂，更优选3-2000mg/剂。

在本发明的一个优选例中，所述组合物中含有低剂量的丙戊酸类活性物质，例如1-10mg/剂，更优选2-8mg/剂，进一步优选含有3-6mg/剂。

在本发明的另一个优选例中，所述组合物中含有中剂量的丙戊酸类活性物质，例如其含量为10-1000mg/剂；更优选20-800mg/剂，进一步优选50-600mg/剂，更优选75-500mg/剂。

在本发明的另一个优选例中，所述组合物中含有高剂量的丙戊酸类活性物质，例如其含量为1000-3500mg/剂；更优选1100-3200mg/剂，进一步优选1200-3000mg/剂，更优选1500-2000mg/剂。

在本发明的另一个优选例中，每天施用1-6剂本发明的组合物，优选施用1-3剂；在高剂量时优选每天服用1剂。

本发明的组合物，可以为固态(如颗粒、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、注射液)或其它合适的形式。

应理解，所用丙戊酸类活性物质的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师或营养师可以判断的范围内。

施用方式

本发明的组合物可以通过常规途径施用，其中包括(但并不限于)：口服、肌注、皮下注射等。优选口服施用。组合物形式应与施用方式相匹配。

本领域技术人员可根据需要确定丙戊酸类活性物质的服用量。通常本发明组合物的施用量，按活性物质重量计，通常为每天约0.1-200mg丙戊酸类活性物质/kg体重，较佳地约1-150mg丙戊酸类活性物质/kg体重，优选5-120mg丙戊酸类活性物质/kg体重，更优选10-70mg/kg体重，更优选15-50mg丙戊酸类活性物质/kg体重，最优选2-20mg丙戊酸类活性物质/kg体重。

本发明的组合物可直接使用，也可与其它治疗剂或辅剂联合使用。

在本发明的优选实施方式中，本发明的组合物还可与有效量(如0.0005-0.1克/kg体重/天；优选的，为0.001-0.05克/kg体重/天)的选自下组的物质联合施用：丹参酮ⅡA、甘草酸制剂、水飞蓟素、粉防己碱或来氟米特等。

当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效果。优选地，联合施用的药物或其它制剂不干扰本发明丙戊酸类活性物质有效成分的治疗活性。

本发明的优点

本发明揭示了丙戊酸类活性物质在治疗或预防肝脏损伤中的新用途，具有以下优点：

1.丙戊酸类活性物质在研究和临床应用中仅用于神经系统疾病(尤其是癫痫)的治疗，而本发明人揭示了丙戊酸类活性物质还具有治疗或预防对象的与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病(尤其是治疗或预防肝脏损伤)的作用及其作用机理，从而为相关疾病的治疗和预防提供了新的途径；

2.本发明中采用的丙戊酸类活性物质均是已知的药物，本领域已熟知其药物代谢动力学、毒理学等，因此降低了研发成本；且本领域中已知其生产制备工艺，可根据现有技术条件来制备该药物，因此降低了生产成本。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实验材料和动物

动物：C57小鼠，8～10周，雄性，23～25g，购自斯莱克公司，随机分组；

丙戊酸钠(VPA，购自Sigma公司)；

丙戊酸钠溶液的配制：VPA溶于PBS(pH7.2～7.4的PBS)中，浓度为37.5mg/ml；

ConA(购自Vector公司)，溶于PBS中，浓度为2.25mg/ml。

试验方法：

1.VPA短期治疗实验

VPA短期治疗实验的流程如图1所示：

(1)将小鼠随机分组，经腹腔注射给予PBS(pH 7.2～7.4，200μl/小鼠，对照组)或者丙戊酸钠(VPA给药组)，剂量分别为150mg VPA/kg体重(低剂量VPA组)和300mg VPA/kg体重(高剂量VPA组)；

(2)给药2小时后，各小鼠接受同样的给药处理；

(3)第二次给药后2小时，所有的小鼠由尾静脉注射剂量为15mg/kg体重的ConA；

(4)于注射ConA后不同时间点处死小鼠，获得待测样品。

2.VPA长期治疗实验

VPA长期治疗实验的流程如图2所示：

(1)将小鼠随机分组，经腹腔注射给予PBS(pH 7.2～7.4，200μl/小鼠，对照组)或者丙戊酸钠(VPA给药组)，剂量分别为150mg VPA/kg体重(低剂量VPA组)和300mg VPA/kg体重(高剂量VPA组)；

(2)连续给药4天，每日1次，在最后一次给药结束后2小时，再次给予同样剂量的药物；

(3)第二次给药后2小时，所有的小鼠由尾静脉注射剂量为15mg/kg体重的ConA；

(4)于注射ConA后的不同时间点处死小鼠，获得待测样品。

实施例1.丙戊酸钠对CIH小鼠谷丙转氨酶活性的降低作用

(A)短期治疗：

根据上文“实验方法”部分的记载进行VPA短期治疗实验，在给予ConA 8小时后，获取小鼠的血清，用于测定谷丙转氨酶酶活。

(B)长期治疗：

根据上文“实验方法”部分的记载进行VPA长期治疗实验，在给予ConA 8小时后，获取小鼠的血清，用于测定谷丙转氨酶酶活。

(C)谷丙转氨酶酶活的测定

测量步骤：采用上海伊华医学科技有限公司生产的血清谷丙转氨酶活性测定试剂盒，按照说明书操作。

简要步骤如下：血清适当稀释后，取25微升加至96孔板，加入100微升酶工作液，37摄氏度孵育15分钟，加入150微升终止液，酶标仪492nm读数，根据试剂盒提供的标准血清和稀释倍数计算谷丙转氨酶活性数值。

(D)试验结果及分析

短期治疗实验和长期治疗实验的结果分别如图3A和3B所示，数据以平均数±标准差的形式表示，代表了3次试验的结果(**P＜0.01，***P＜0.001)。

短期治疗和长期治疗的结果均显示：VPA可极显著地降低CIH小鼠血清中谷丙转氨酶的活性，其中高剂量VPA的降低效果优于低剂量VPA。

实施例2.经丙戊酸钠处理后的CIH小鼠肝脏的H&E染色和TUNEL染色观察

(A)短期治疗：

根据上文“实验方法”部分的记载进行VPA短期治疗实验，在给予ConA 8小时后，麻醉后断颈处死小鼠，取肝脏组织进行切片。

(B)长期治疗：

根据上文“实验方法”部分的记载进行VPA长期治疗实验，在给予ConA 8小时后，处死小鼠，取肝脏组织进行切片。

(C)H&E染色

对小鼠肝脏组织的切片进行H&E染色。染色过程如下：

1.小鼠麻醉后，经PBS心脏灌注后除去残留血液后，取肝脏，放入装有4％的多聚甲醛的管子中后固定；

2.脱水：将固定后的组织切成合适大小后依次经过如下步骤：

2.1.70％酒精，30min，

2.2.95％酒精，1h 30min，重复一次，

2.3.100％酒精，1h 30min，重复一次；

3.透明：将脱水好的组织放入二甲苯中，15-20min，重复一次；

4.浸蜡：将透明好的组织放入融化的石蜡中(60℃)，1h，重复一次；

5.包埋；

6.切片：将包埋好的组织块切成5μm厚的薄片；

7.展片：将5μm的组织片铺在40℃的水面上，让组织充分展平；

8.捞片：将展平的组织片捞在多聚赖氨酸处理好的玻片上；

9.将玻片放在37℃的烘台上烘干；

10.脱蜡水合：将烘干的带有组织的玻片经过如下步骤进行脱蜡水合：

10.1.二甲苯，5min，重复一次，

10.2.100％酒精，5min，重复一次，

10.3.95％酒精，5min，重复一次，

10.470％酒精，5min，

10.5水，5min；

11.苏木素中染色7min；

12.流水冲洗；

13.水中反色5min；

14.伊红中染色0.5min；

15.脱水透明化，封片：

15.1.70％酒精，2min，重复一次，

15.2.95％酒精，2min，重复一次，

15.3.100％酒精，2min，重复一次，

15.4.二甲苯，5min，重复一次，

15.5.中性树胶封片。

(D)TUNEL染色

对小鼠肝脏组织的切片进行TUNEL染色。TUNEL染色过程如下：

1.小鼠麻醉后，经PBS心脏灌注除去残留血液，取肝脏，放入装有4％的多聚甲醛的管子中后固定；

2.脱水：将固定后的组织切成合适大小后依次经过如下步骤：

2.1.70％酒精，30min，

2.2.95％酒精，1h30min，重复一次，

2.3.100％酒精，1h30min，重复一次；

3.透明：将脱水好的组织放入二甲苯中，15-20min，重复一次；

4.浸蜡：将透明好的组织放入融化的石蜡中(60C)，1h，重复一次；

5.石蜡包埋；

6.切片：将包埋好的组织块切成5μm厚的薄片；

7.展片：将组织片铺在40℃的水面上，让组织充分展平；

8.捞片：将展平的组织片捞在多聚赖氨酸处理好的玻片上；

9.将玻片放在37℃的烘台上烘干；

10.脱蜡水合：将烘干的带有组织的玻片经过如下步骤进行脱蜡水合：

10.1.二甲苯，5min，

10.2.100％酒精，5min，

10.3.95％酒精，5min，

10.4.90％酒精，5min，

10.5.80％酒精，5min，

10.6.70％酒精，5min，

10.7.水，5min，

10.8.PBS，5min；

11.用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，加入蛋白酶K溶液(20μg/ml)，湿盒中37℃水解15min，去除组织蛋白。用PBS洗两次，每次5min；

12.色缸中加入含6％过氧化氢的甲醇，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min；

13.用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，每标本加入按试剂盒(Roche公司，原位细胞死亡检测试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD kit))说明书配制的TdT酶反应液(5μlTdT酶+45μl标记液每标本，阴性对照只加标记液不加酶液)，parafilm覆盖，湿盒中37℃反应1h，用PBS洗两次，每次5min；

14.用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，每标本加入50μl POD，湿盒中37℃反应30min。用PBS洗两次，每次5min；

15.用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，每标本加入100μl新鲜配置的DAB溶液，显色3-10min；

16.脱水透明化，封片：

16.1.水，2min重复一次，

16.2.70％酒精，2min，重复一次，

16.3.95％酒精，2min，重复一次，

16.4.100％酒精，2min，重复一次，

16.5.二甲苯，5min，重复一次，

16.6.中性树胶封片。

(E)实验结果与讨论

短期治疗和长期治疗后的肝脏组织切片H&E染色或者TUNEL染色结果分别如图4A和4B所示。

短期治疗和长期治疗实验的PBS对照组中均可观察到肝脏组织的出现大面积坏死现象，正常结构被严重破坏，同时的TUNEL染色出现大量的TUNEL阳性的凋亡细胞。丙戊酸钠处理组中，随着丙戊酸钠剂量的增大，小鼠的肝脏组织中未见炎性病灶和坏死区域显著减少，TUNEL阳性的细胞也显著减少，长期高剂量丙戊酸钠处理组几乎看不到炎性病灶和坏死区域。

以上结果表明：丙戊酸钠可显著改善肝脏受损情况，对肝脏起到保护作用，且该改善效果是剂量依赖性的。

实施例3.丙戊酸钠对血清细胞因子的影响

(A)血清中肿瘤坏死因子-α的浓度检测

根据上文“实验方法”部分的记载进行VPA长期治疗，在给予ConA 2小时后，取小鼠血清，按(C)中所述的ELISA(R&D公司试剂盒)方法检测血清中肿瘤坏死因子-α的浓度。

(B)血清中γ-干扰素的浓度检测

根据上文“实验方法”部分的记载进行VPA长期治疗，在给予ConA 2小时后，取小鼠血清，按(C)中所述的ELISA方法检测血清中γ-干扰素的浓度。

(C)ELISA试剂及方法

使用Duoset ELISA试剂盒(R&D，MN，USA)，按照生产商提供的说明书操作，简要步骤如下：

取100微升一抗包板过夜，洗板后300微升封闭缓冲液封闭2小时，洗板后加入100微升样品和标准品，孵育2小时，洗板后加入二抗孵育2小时，洗板后加入酶标链亲和素，加入底物显色，硫酸中止，酶标仪450nm读数(参考波长为540nm)。根据标准曲线计算样品中各细胞因子的浓度。

(D)实验结果与讨论

小鼠血清中肿瘤坏死因子-α的浓度检测实验和γ-干扰素的浓度检测实验结果分别如图5A和5B所示，其中的数据分别代表了3次试验的结果(^*P＜0.05，^***P＜0.0001)。

结果显示：丙戊酸钠处理组小鼠血清中两种炎性细胞因子的均低于对照组，其中高剂量丙戊酸钠处理组的降低作用显著。

该结果表明：丙戊酸钠对免疫介导的肝损伤的保护作用的机理之一是其导致了介导肝损伤的炎性细胞因子，包括γ-干扰素和肿瘤坏死因子α表达的显著下降，从而保护肝脏免受损伤。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合在制备用于治疗或预防对象中与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述与血清谷丙转氨酶活性增加相关的疾病包括：肝损伤、肝内胆汁淤积、胆道梗阻、胰腺疾病、甲状腺功能亢进症、急性心肌梗塞、心力衰竭或多发性肌炎。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述肝损伤为：病毒性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、药物性肝炎、脂肪肝所致的肝损伤。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还降低对象中血清细胞因子的表达。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述对象是哺乳动物。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物中的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合占药物组合物总重量的0.001-99.9wt％。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括：片剂、粉末剂、注射剂、颗粒剂、糖浆、胶囊、溶液剂、栓剂或药膏。

8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还包含缓解或治疗肝脏损伤的其它药物。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述缓解或治疗肝脏损伤的其它药物选自：丹参酮ⅡA、甘草酸制剂、水飞蓟素、粉防己碱或来氟米特。

10.一种药物组合物，其含有：

(1)有效量的丙戊酸、其药学上可接受的盐、酰胺化物或它们的组合；

(2)选自下组的一种或多种物质：丹参酮ⅡA、甘草酸制剂、水飞蓟素、粉防己碱、来氟米特或它们的组合；和

(3)药学上可接受的载体。

Images