JP5798154B2 - ナンセンス突然変異を有するｄｎａからの機能的タンパク質の産生のための方法及びそれと関連した障害の治療 - Google Patents

Description

本出願は、2006年3月30日に出願された米国仮出願第60/787,333号及び2006年6月12日に
出願された米国仮出願第60/813,085号の利益を主張し、これらの開示は、その全体が本明
細書に参照により組み込まれる。
（1.発明の分野）
本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされる機能的タンパク質
に関する。また、本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされる機
能的タンパク質の産生のための方法、及び遺伝子のナンセンス突然変異（群）に関連した
疾患の予防、管理及び／又は治療のための当該タンパク質の使用に関する。

（2.本発明の背景）
細胞における遺伝子発現は、転写及び翻訳の経時的過程に依存する。共に、これらの過
程では、その対応する遺伝子のヌクレオチド配列からタンパク質を産生する。
転写は、RNAポリメラーゼによるDNAからのRNAの合成を含む。転写は、遺伝子のプロモ
ーター領域にて開始し、新生RNAにおけるステム-ループ構造の形成又はrho遺伝子産物の
結合などによって終結が誘導されるまで続く。
次いで、tRNA、tRNAシンセターゼ、並びに種々のその他のタンパク質及びRNA種の助け
をかりて、リボソームで生じる翻訳の過程によって、タンパク質がmRNAから産生される。
翻訳には、開始、伸長及び終結の3つの段階を含む。翻訳は、mRNA上で翻訳を開始するた
めの翻訳機構を指揮するmRNA上のシグナルを認識するタンパク質因子、mRNA、tRNA、補因
子及びリボゾームサブユニットからなる開始複合体の形成によって開始される。

一旦開始複合体が形成されると、ポリペプチド鎖の成長は、リボソームのペプチジルト
ランスフェラーゼ活性、並びにtRNA及びtRNAシンセターゼによるアミノ酸の反復付加によ
って生じる。リボソームのA部位における3つの終止コドン（UAA、UAG、UGA）のうちの1つ
の存在は、ポリペプチド鎖終結因子（RF）にシグナルを送り、終止シグナルに結合し、及
び認識する。その後、リボソームのP部位に位置するtRNAの3'ヌクレオチドと新生ポリペ
プチド鎖との間のエステル結合が加水分解される。完成したポリペプチド鎖は、放出され
て、リボソームサブユニットは、別の翻訳ラウンドのために再利用される。
塩基の数が変化されるDNA配列の突然変異は、挿入又は欠失突然変異（フレームシフト
突然変異）として分類され、主要なゲノムの破壊を生じ得る。1つの塩基が別のものに変
化するDNAの突然変異は、ミスセンス突然変異と分類され、移行（1つのプリンから別のプ
リン、又は一つのピリミジンから別のピリミジン）及び塩基転換（プリンからピリミジン
、又はピリミジンからプリン）の分類に細分される。

挿入、欠失、移行及び塩基転換型突然変異は、全て、塩基突然変異フレームシフト突然
変異又はインフレーム突然変異により、アミノ酸コドンが3つの終止コドンの1つに変わる
ナンセンス突然変異又は鎖終結突然変異を生じ得る。これらの中途の終止コドンは、中途
の翻訳終結の結果として、細胞に異常なタンパク質を産生し得る。遺伝子のナンセンス突
然変異は、少し例を挙げれば、癌、リソソーム貯蔵障害、筋ジストロフィー、嚢胞性線維
症及び血友症などの多数の疾患を生じ得る。
ナンセンス突然変異をもつ細菌株及び真核生物株では、tRNA分子の1つの突然変異の結
果として、ナンセンス突然変異の抑制が生じ得るし、その結果、翻訳過程に関与するタン
パク質の突然変異の結果として、リボソーム（リボソームRNA又はリボソームタンパク質
のいずれか）の突然変異の結果として、又は翻訳過程を変化させる化合物の添加により、
突然変異tRNAがナンセンスコドンを認識し得る。その結果、アミノ酸は、ナンセンス突然
変異の部位にてポリペプチド鎖に組み込まれて、翻訳は、ナンセンスコドンにて中途で終
結しない。挿入されたアミノ酸が、野生型タンパク質の本来のアミノ酸と必ずしも同一で
あるというわけではないが；しかし、多くのアミノ酸置換は、タンパク質構造又は機能に
対して全く効果を有さない。従って、ナンセンス突然変異の抑制によって産生されるタン
パク質は、野生型タンパク質のものと同様の活性を有する可能性が高いであろう。このシ
ナリオは、ナンセンス突然変異の抑制を介して翻訳の中途での終結を回避することによっ
てナンセンス突然変異に関連する疾患を治療する機会を提供する。
ナンセンスコドンの誤読を媒介し、かつ該疾患を治療し、管理し、及び／又は予防する
ために十分な量でインビボにおいて非野生型タンパク質（群）を産生することによって、
ヒトにおける中途での翻訳終結を抑制する化合物を投与することにより、ヒト対象におけ
る遺伝子（群）のナンセンス突然変異（群）に関連した疾患を、治療し、管理し、及び／
又は予防するための方法に対する当該技術分野における需要が残ったままである。

（3.発明の要旨）
本発明は、部分的には、ナンセンスコドンのリードスルー及びナンセンスコドンの位置
にアミノ酸を挿入させるナンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）から転写されたRN
Aにおけるナンセンスコドンを抑制するために対象（ヒトを含む）に対して全身投与する
ことができるナンセンスコドン抑制薬の発見に基づいている。特定の実施態様において、
挿入されるアミノ酸は、機能的リードスルータンパク質を産生するように野生型タンパク
質の対応する位置にて生じるアミノ酸以外のアミノ酸である。ナンセンス突然変異を含む
遺伝子（群）から転写されるRNAにおけるナンセンスコドンの抑制によって産生される機
能的リードスルータンパク質は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異（群）に関連した疾
患を治療し、予防し、及び／又は管理するために有用である。

ナンセンスコドン抑制薬を使用する、ナンセンス突然変異を含む遺伝子（群）から転写
されるRNAにおけるナンセンスコドンの抑制による対象（ヒトを含む）における機能的リ
ードスルータンパク質の産生は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異に関連した疾患の予
防、治療及び／又は管理のために想定されるその他のタイプの療法を上回るいくつかの利
点を有する。例えば、ナンセンスコドン抑制薬を使用する機能的リードスルータンパク質
の産生は、それが遺伝子療法によって行われるような、対象に対する外来遺伝形質の導入
を含まない。従って、染色体のDNAの間違った位置に外来遺伝形質を挿入するリスク、対
象に導入された外来遺伝形質によってコードされるタンパク質を過剰発現するリスク、及
び外来遺伝形質を対象に導入するために使用されるウイルスなどのベクターがその他の対
象に対して伝染するリスクが除去される。

本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスル
ータンパク質（群）の有効量をその必要のある対象（好ましくは、ヒト）において産生す
る方法であって、対象にナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量を投与することを含む、
前記方法を提供する。特に、本発明は、遺伝子（群）におけるナンセンス突然変異に関連
した疾患の治療、管理及び／又は予防のための方法であって、その必要のある対象（好ま
しくは、ヒト）に対してナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量を投与することを含み、
該薬剤（群）の有効量は、ナンセンス突然変異を含む遺伝子によってコードされる機能的
リードスルータンパク質（群）の有効量を産生するために十分である量である、前記方法
を提供する。本発明の方法に従って治療し、管理し、及び／又は予防することができる遺
伝子（群）におけるナンセンス突然変異に関連した疾患の非限定の例には：アミロイド症
、LINCL、血友症、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状
腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、嚢胞性線維症、老化、肥満症、パーキンソン病、ニー
マン・ピック病、家族性高コレステロール血症、網膜色素変性症、筋ジストロフィー（例
えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー）、脊髄筋肉萎縮症及びマルファン症候群を含む。

一つの態様において、本発明は、遺伝子におけるナンセンス突然変異に関連した疾患を
予防し、治療し、及び／又は管理するための対象（好ましくは、ヒト）に経口投与するこ
とができるナンセンスコドン抑制薬を提供する。経口投与されるナンセンスコドン抑制薬
は、機能的リードスルータンパク質の有効量を産生する投薬量（群）にて、全く又はほと
んど（もしあっても）有害な副作用を有さない。具体的実施態様において、ナンセンスコ
ドン抑制薬は、機能的リードスルータンパク質の有効量を産生する投薬量（群）にて対象
（好ましくは、ヒト）に経口投与したときに、腎不全及び／又は難聴を生じない。従って
、ナンセンスコドン抑制薬は、腎不全及び難聴などの毒性を伴わずに長期間全身的に（例
えば、経口的に）投与することができる。

ナンセンスコドン抑制薬の経口投与により、薬剤を投与するために医療専門家を必要と
することなく、対象が彼／彼女の処方されたナンセンスコドン抑制薬の投薬量を摂取する
ことができる。これにより、遺伝子医療専門家が薬剤を投与させる費用が無くなったため
、ナンセンス突然変異に関連した疾患を予防し、治療し、及び／又は管理するのに関連し
た医療費が減少する。また、ナンセンスコドン抑制薬の経口投与により、対象が彼／彼女
のナンセンスコドン抑制薬の投薬量を受けるために医療専門家に会うための約束によって
制限されることなく及び／又は不便を感じなくなるため、対象の生活の質が改善する。更
に、ナンセンスコドン抑制薬の経口投与により、全ての疾患の影響を受ける器官部位に対
する全身療法の送達が可能になる。

別の態様において、本発明は、グラム陰性微生物及び／又はグラム陽性微生物に対して
有意な抗菌活性を示さないナンセンスコドン抑制薬を提供する。抗菌活性をもつナンセン
スコドン抑制薬とは対照的に、グラム陰性微生物及び／又はグラム陽性微生物に対して有
意な抗菌活性を示さないナンセンスコドン抑制薬の使用は、抗菌活性をもつ薬物に対する
細菌耐性の発症に寄与しない。更に、グラム陰性微生物及び／又はグラム陽性生物体に対
して有意な抗菌活性を示さないナンセンスコドン抑制薬の使用は、多くの慢性的に投与さ
れる抗生物質で起こり得る正常な微生物叢の病理学的過成長に関連した合併症を誘導する
可能性がないであろう。
従って、本発明は、対象において十分に許容され、かつグラム陰性微生物及び／又はグ
ラム陽性微生物に対して有意な抗菌活性を有さないナンセンスコドン抑制薬を投与するこ
とを含む方法によって産生されるナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされ
る機能的リードスルータンパク質を提供する。

（5.発明の詳細な記載）
本発明は、部分的には、ナンセンスコドンのリードスルー及びナンセンスコドンの位置
にアミノ酸を挿入させるナンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）から転写されたRN
Aにおけるナンセンスコドンを抑制するために、対象（ヒトを含む）に対して全身投与す
ることができるナンセンスコドン抑制薬の発見に基づいている。特定の実施態様において
、挿入されるアミノ酸は、機能的リードスルータンパク質を産生するように野生型タンパ
ク質の対応する位置にて産生されるアミノ酸以外のアミノ酸である。ナンセンス突然変異
を含む遺伝子（群）から転写されるRNAにおけるナンセンスコドンの抑制によって産生さ
れる機能的リードスルータンパク質は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異（群）に関連
した疾患を治療し、予防し、及び／又は管理するために有用である。

本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスル
ータンパク質（群）の有効量をその必要のある対象（好ましくは、ヒト）において産生す
る方法であって、対象にナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量を投与することを含む、
前記方法を提供する。本発明によれば、機能的リードスルータンパク質（群）は、全長野
生型タンパク質（群）の1つ以上の機能を有する。具体的実施態様において、本発明の方
法によって産生される機能的リードスルータンパク質は、機能的な非野生型タンパク質（
群）である。別の実施態様において、機能的な非野生型タンパク質は、全長である。その
他の実施態様において、機能的な非野生型のタンパク質は、全長でない。機能的リードス
ルータンパク質の産生は、インビトロアッセイ法によって及び／又は動物モデルにおいて
評価してもよい。例えば、リポーターアッセイ法を使用して、機能的リードスルータンパ
ク質（群）が産生されるかどうかについて決定してもよい。或いは、mdxマウスなどの動
物モデルを使用して、機能的リードスルータンパク質が産生されるかどうかを決定しても
よい。

特定の実施態様において、本発明に従って対象に投与されるナンセンスコドン抑制薬の
有効量は、（a）薬剤を、リポーター遺伝子を含む核酸配列を有する細胞と接触させる工
程であって、該リポーター遺伝子は、中途での終止コドンを含む、前記工程；及び（b）
リポーター遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク質の発現及び／又は
活性を検出する工程；を含むリポーター遺伝子アッセイ法におけるナンセンスコドンを抑
制する量と同等である。その他の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬の有効量は
、（a）薬剤を、細胞可溶化物及びリポーター遺伝子を含む核酸配列と接触させる工程で
あって、該リポーター遺伝子は、中途での終止コドンを含む、前記工程；及び（b）リポ
ーター遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク質の発現及び／又は活性
を検出する工程を含むリポーター遺伝子アッセイ法におけるナンセンスコドンを抑制する
量と同等である。これらのアッセイ法に関する詳細は、第5.4節を参照されたい。

一つの態様において、本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列（群）によってコ
ードされる機能的リードスルータンパク質（群）の有効量を、その必要のある対象（好ま
しくは、ヒト）において産生するための方法であって、該対象に対してナンセンスコドン
抑制薬（群）の有効量を経口投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様
において、経口投与されるナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量は、1日あたり0.1mg/k
g〜500mg/kgの間である。一部の実施態様において、経口投与されるナンセンスコドン抑
制薬（群）の有効量は、1回用量、2回用量、3回用量、4回用量又はそれ以上として投与さ
れる0.1mg/kg〜500mg/kgの間である。具体的実施態様において、経口投与されるナンセン
スコドン抑制薬（群）の有効量は、3回用量に分けて1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間で
あり、第1及び第2の用量がそれぞれ投与される総量の25%であり、かつ第3の用量が投与さ
れる総量の50%である。その他の実施態様において、ヒトに経口投与されるナンセンスコ
ドン抑制薬（群）の有効量は、1日あたり35mg/kg未満である。具体的実施態様において、
ヒトに経口投与されるナンセンスコドン抑制薬の有効量は、１日あたり0.1/mg/kg〜30mg/
kgの間である。

別の態様において、本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列（群）によってコー
ドされる機能的リードスルータンパク質（群）の有効量を、その必要のある対象（好まし
くは、ヒト）において産生するための方法であって、該対象に対してナンセンスコドン抑
制薬（群）の有効量を投与することを含み、該薬剤（群）の有効量は、2時間、2.5時間、
3時間以上の間0.5μg/ml〜500μg/mlの薬剤（群）の血漿濃度を生じるために十分である
、前記方法を提供する。特定の実施態様において、薬剤（群）の有効量は、1日あたり0.1
mg/kg〜500mg/kgの間である。具体的実施態様において、薬剤（群）の有効量は、3回用量
に分けて1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間であり、第1及び第2の用量がそれぞれ投与さ
れる総量の25%であり、かつ第3の用量が投与される総量の50%である。特定の実施態様に
おいて、ナンセンスコドン抑制薬（群）は、対象に経口投与される。

別の態様において、本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列（群）によってコー
ドされる機能的リードスルータンパク質（群）の有効量を、その必要のある対象（好まし
くは、ヒト）において産生するための方法であって、該対象にナンセンスコドン抑制薬（
群）の有効量を投与することを含み、該ナンセンスコドン抑制薬（群）は、グラム陰性微
生物及び／又はグラム陽性微生物に対して有意な抗菌活性を示さない、前記方法を提供す
る。一部の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬（群）は、経口投与される。特定
の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量は、1日あたり0.1mg/kg〜5
00mg/kgの間である。具体的実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量
は、3回用量に分けて1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間であり、第1及び第2の用量がそれ
ぞれ投与される総量の25%であり、かつ第3の用量が投与される総量の50%である。特定の
その他の実施態様において、薬剤（群）の有効量は、2時間、2.5時間、3時間以上の間0.1
μg/ml〜500μg/mlの薬剤（群）の血漿濃度を生じるために十分である。

対象に対してナンセンスコドン抑制薬（群）を投与することによる、ナンセンス突然変
異を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスルータンパク質（群）の産生は、
遺伝子（群）におけるナンセンス突然変異に関連した疾患の治療、管理及び／又は予防の
ために有用である。ナンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）によってコードされる
機能的リードスルータンパク質（群）の産生によって治療し、管理し、及び／又は予防す
ることができる疾患の非限定的の例には：アミロイド症、LINCL、血友症、アルツハイマ
ー病、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症
、嚢胞性線維症、老化、肥満症、パーキンソン病、ニーマン・ピック病、家族性高コレス
テロール血症、網膜色素変性症、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロ
フィー）、脊髄筋肉萎縮症及びマルファン症候群を含む。

特定の実施態様において、ナンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）によってコー
ドされる機能的リードスルータンパク質の産生によって治療され、管理され及び／又は予
防される疾患は、胃腸障害ではない。その他の実施態様において、ナンセンス突然変異（
群）を含む遺伝子（群）によってコードされる機能的リードスルータンパク質の産生によ
って治療され、管理され及び／又は予防される疾患は、皮膚障害ではない。一部の実施態
様においてナンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）によってコードされる機能的リ
ードスルータンパク質の産生によって治療され、管理され及び／又は予防される疾患は、
以下の疾患の1つ以上又は全てではない：基底細胞母斑症候群（例えば、PTCH遺伝子）、
散発性基底細胞癌（例えば、PTCH遺伝子）、黒色腫（例えば、CDKN2a遺伝子）、接合部表
皮水泡症（例えば、LAMB3、LAMC2、LAMA3遺伝子）、全般性萎縮性良性表皮水泡症（例え
ば、COL17Al遺伝子）、ジストロフィー性表皮水泡症（例えば、COL7A1遺伝子）、ヘイリ
ー・ヘイリー病（例えば、ATP2C1遺伝子）、ダリエ病（例えば、ATP2A2遺伝子）、葉状魚
鱗癬（例えば、TGMl遺伝子）、X連鎖魚鱗癬（例えば、STS遺伝子）、乾皮症色素変性（例
えば、XPA、XPC、XPG遺伝子）、ブルーム症候群（例えば、BLM遺伝子）、線条体掌蹠角皮
症（例えば、DSP、DSGl遺伝子）、コケイン症候群（例えば、ERCC6遺伝子）、眼皮膚白化
症（例えば、TYR、TYRPl遺伝子）、ヘルマンスキー・プドラック症候群（例えば、HPSl、
HPS4遺伝子）、毛細血管拡張性運動失調（例えば、ATM遺伝子）、グリセリ（Griscelli）
症候群（例えば、RAB27A、MY05A遺伝子）及び外胚葉性異形成症／皮膚脆弱性（例えば、P
KP1遺伝子）。一部の実施態様において、ナンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）
によってコードされる機能的リードスルータンパク質の産生によって治療され、予防され
及び／又はを管理される疾患は、以下の疾患の1つ以上又は全てではない：食道（p53遺伝
子）及び結腸（APC、p53遺伝子）、バレット食道（p53遺伝子）の散発性の癌や、腺腫性
ポリープ症大腸菌（APC遺伝子）、遺伝性非ポリープ性大腸癌（MLHl、MSH2遺伝子）、ポ
イツ-ジェガーズ症候群（STK 11遺伝子）及びカウデン症候群（PTEN遺伝子）などの遺伝
性の癌症候群。

本発明は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異に関連した疾患の治療、管理及び／又は
予防のための方法であって、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）に対してナンセン
スコドン抑制薬（群）の有効量を投与することを含み、該薬剤（群）の有効量は、ナンセ
ンス突然変異を含む遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク質（群）の
有効量を産生するために十分である量である、前記方法を提供する。特定の実施態様にお
いて、機能的リードスルータンパク質（群）の有効量は、疾患若しくはその症候の発病、
発症及び／又は進行を予防するために必要なタンパク質（群）の量である。その他の実施
態様において、機能的リードスルータンパク質（群）の有効量は、疾患若しくはその症候
の期間及び／又は重症度を減少させるために必要なタンパク質（群）の量である。特定の
実施態様において、機能的リードスルータンパク質の有効量は、関心対象の疾患のための
動物モデルにおいて産生される量と同等である。その他の実施態様において、機能的リー
ドスルータンパク質（群）の有効量は、治療的及び／又は予防的利益を有する疾患のため
の動物モデルにおいて産生される量である。

特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク質の有効量は：（a）ナンセン
スコドン抑制薬を、リポーター遺伝子を含む核酸配列を有する細胞と接触させる工程であ
って、該リポーター遺伝子は、中途での終止コドンを含む、前記工程；及び（b）産生さ
れるリポーター遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク質の量を決定す
る工程；を含むリポーター遺伝子アッセイ法において産生される量と同等である。その他
の実施態様において、機能的リードスルータンパク質の有効量は：（a）ナンセンスコド
ン抑制薬を、細胞可溶化物及びリポーター遺伝子を含む核酸配列と接触させる工程であっ
て、該リポーター遺伝子は、中途での終止コドンを含む、前記工程、及び（b）産生され
るリポーター遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク質の量を決定する
工程；を含むリポーター遺伝子アッセイ法において産生される量と同等である。機能的リ
ードスルータンパク質の量は、例えば免疫アッセイ法を使用して機能的リードスルータン
パク質の発現レベルを測定することによって、又は機能的リードスルータンパク質の活性
を測定することによって決定することができる。

特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク質の有効量は、疾患に関連した
遺伝子（群）を含む（すなわち、遺伝子（群）は、疾患に関連したナンセンス突然変異を
含む）細胞によって産生される量である。一部の実施態様において、細胞によって産生さ
れる量は、対応する野生型タンパク質（群）をコードする正常遺伝子（すなわち、ナンセ
ンス突然変異を含まない遺伝子）を含む同じ種及び型の細胞によって産生される量の約0.
1%、約1%、約2%、約5%、約7%又は約10%（その他の実施態様において、約15%、約20%、約2
5%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約75%又は約90%及びその他の実施態様におい
て、0.1〜25%、0.1〜50%、10〜50%、10〜90%、0.1〜98%、5〜98%又は10〜98%）である。
機能的リードスルータンパク質（群）の量及び野生型タンパク質（群）の量は、両方のタ
ンパク質を測定するために使用される方法論が一致する限り、当業者に知られている任意
のアッセイ法を使用して測定することができる。特定の実施態様において、機能的リード
スルータンパク質（群）の量及び野生型タンパク質（群）の量は、免疫アッセイ法（例え
ば、ELISA）によって測定される。具体的実施態様において、細胞は、該遺伝子（群）を
含むように操作される。代わりの実施態様において、細胞は、天然に該遺伝子（群）を含
む。

特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク質の有効量は、ナンセンス突然
変異（群）を含む遺伝子（群）に関連した疾患である患者由来の細胞によって産生される
量である。一部の実施態様において、患者の細胞によって産生される量は、細胞が対応す
る野生型タンパク質（群）をコードする遺伝子（群）を含む、疾患を有さない対象由来の
同じ細胞の種及び型によって産生される量の約1%、約2%、約5%、約7%又は約10%（その他
の実施態様において、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約75
%、約90%及び他の実施態様において、0.1〜25%、0.1〜50%、0.1〜90%、10〜90%、5〜25%
、5〜90%、10〜98%、0.1〜98%又は5〜98%）である。機能的リードスルータンパク質（群
）の量及び野生型タンパク質（群）の量は、両方のタンパク質を測定するために使用され
る方法論が一致する限り、当業者に知られている任意のアッセイ法を使用して測定するこ
とができる。特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク質（群）の量及び野
生型タンパク質（群）の量は、免疫アッセイ法（例えば、ELISA）によって測定される。
具体的実施態様において、患者細胞は、ナンセンスコドン抑制薬（群）の用量を受けてい
るか、又は受けるであろう患者由来である。

本発明は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異（群）に関連した疾患の治療、管理及び
／又は予防のための方法であって、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）にナンセン
スコドン抑制薬（群）の有効量を経口投与することを含み、該薬剤（群）の有効量は、ナ
ンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）によってコードされる機能的リードスルータ
ンパク質（群）の有効量を産生するために十分である、前記方法を提供する。特定の実施
態様において、薬剤（群）の有効量は、1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間である。具体
的実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量は、3回用量に分けて1日あ
たり0.1mg/kg〜500mg/kgの間であり、第1及び第2の用量がそれぞれ投与される総量の25%
であり、かつ第3の用量が投与される総量の50%である。その他の実施態様において、薬剤
（群）の有効量は、少なくとも2時間、少なくとも2.5時間、少なくとも3時間以上の間0.1
μg/ml、2μg/ml以上（いくつかの実施態様において、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20
μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、10
0μg/ml、125μg/ml、150μg/ml、175μg/ml、200μg/ml、225μg/ml、250μg/ml、275μ
g/ml、300μg/ml、325μg/ml、375μg/ml、400μg/ml、425μg/ml、450μg/ml、475μg/m
l又は500μg/ml）の薬剤の血漿濃度を生じる薬剤（群）の量である。特定の実施態様にお
いて、ナンセンスコドン抑制薬（群）は、グラム陰性微生物及び／又はグラム陽性微生物
に対して有意な抗菌活性を示さない。

本発明は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異に関連した疾患の治療、管理及び／又は
予防のための方法であって、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）に対してナンセン
スコドン抑制薬（群）の有効量を投与することを含み、該薬剤（群）の有効量は、2時間
、2.5時間、3時間以上の間0.1μg/ml〜500μg/mlgの薬剤（群）の血漿濃度を生じるため
に十分である、前記方法を提供する。特定の実施態様において、薬剤（群）の有効量は、
1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間である。具体的実施態様において、薬剤（群）の有効
量は、3回用量に分けて1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間であり、第1及び第2の用量がそ
れぞれ投与される総量の25%であり、かつ第3の用量が投与される総量の50%である。特定
のその他の実施態様において、薬剤（群）は、グラム陰性微生物及び／又はグラム陽性微
生物に対して有意な抗菌薬を有さない。

本発明は、遺伝子（群）のナンセンスコドンに関連した疾患の治療、管理及び／又は予
防のための方法であって、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）に対してグラム陰性
微生物及び／又はグラム陽性微生物に対して有意な抗菌活性を示さないナンセンスコドン
抑制薬の有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様において、
薬剤（群）の有効量は、1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間である。具体的実施態様にお
いて、薬剤（群）の有効量は、3回用量に分けて1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間であり
、第1及び第2の用量がそれぞれ投与される総量の25%であり、かつ第3の用量が投与される
総量の50%である。

ナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスルータンパク
質（群）の産生は：（i）対応する野生型タンパク質（群）の十分な量を発現しない対象
において、及び／又は（ii）特定の機能的リードスルータンパク質（群）の発現からの利
益を受けることができる対象において、有用である。一つの態様において、本発明は、ナ
ンセンス突然変異（群）を含む核酸配列でコードされる機能的リードスルータンパク質（
群）を、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）において産生するための方法であって
、対象にナンセンスコドン抑制薬（群）の有効量を投与することを含み、該対象は、核酸
配列を含むように操作されている、前記方法を提供する。具体的実施態様において、機能
的リードスルータンパク質（群）は、対象において有益効果を有する野生型タンパク質に
対応する。特定の実施態様において、薬剤（群）が投与される対象は、機能的リードスル
ータンパク質に対応する野生型タンパク質（群）の十分な量を産生しない。具体的実施態
様において、薬剤（群）が投与される対象は、機能的リードスルータンパク質に対応する
野生型タンパク質（群）の不十分な産生に関連した疾患を有する。本発明の特定の実施態
様において、ナンセンスコドン抑制薬（群）を受けるであろう対象は、薬剤（群）を受け
る前にスクリーニングされる。具体的実施態様において、対象は、薬剤が機能的リードス
ルータンパク質（群）を産生するだろうかどうかを決定するためにスクリーニングされる
。別の実施態様において、対象は、対象に投与する薬剤（群）の有効量を決定するために
スクリーニングされる。下記の第5.6節は、対象をスクリーニングするための方法を提供
する。

本発明は、対応する野生型タンパク質をコードするRNAにおいて見いだされる終止コド
ンと比較して、核酸配列から転写されるRNAにおいて異なる終止コドンを生じる突然変異
を含む核酸配列から機能的リードスルータンパク質を産生するための、ナンセンスコドン
抑制薬の使用を包含する。特に、本発明は、対応する野生型タンパク質をコードするRNA
において見いだされる終止コドンと比較して、遺伝子から転写されるRNAにおいて異なる
終止コドンを生じる突然変異を含む遺伝子に関連した疾患を予防し、管理し、及び／又は
治療する方法であって、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）に対してナンセンスコ
ドン抑制薬の有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様におい
て、ナンセンスコドン抑制薬の有効量は、遺伝子によってコードされる機能的リードスル
ータンパク質の有効量を産生するために十分である量である。一部の実施態様において、
ナンセンスコドン抑制薬の有効量は、1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間である。いくつ
かのその他の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬の有効量が0.1μg/ml〜500μg/
mlの間の血漿濃度を生じる薬剤の量である。

特定の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、アミ
ノ配糖体でない。アミノ配糖体の非限定的な例には、ゲンタマイシン、ストレプトマイシ
ン、アミカシン、カナマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシン、フラ
ミセチン（framycetin）、ネガマイセン（negamycen）、パロマイセン（paromycen）、シ
ソマイシン、G-418並びにその誘導体及び類似体を含む。具体的実施態様において、本発
明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、以下の1、2、3又はそれ以上ではない
：ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、アミカシン、カナマイシン、トブラマイシン、
ネチルマイシン、ネオマイシン、フラミセチン、ネガマイセン、パロマイセン、シソマイ
シン、G418及び／又はその誘導体若しくは類似体。その他の実施態様において、本発明に
従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、クロラムフェニコール及び中途での終止コ
ドンのリードスルーを促進する際に活性を保持するその誘導体又は類似体ではない。その
他の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、オキサゾ
リジノンエステルではない。オキサゾリジノンエステルの非限定的な例には、リネゾリド
、エペルゾリド及びその類似体又は誘導体である。特定の実施態様において、本発明に従
って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、細胞に基づいたアッセイ法、動物モデルアッ
セイ法又は本明細書に記述され、若しくはナンセンスコドン抑制のための技術分野におい
て公知のその他のアッセイ法におけるアミノ配糖体、オキサゾリジノンエステル及び／又
はクロラムフェニコールの同等用量よりも多量の（一部の実施態様において、5%、10%、1
5%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%以上及びその
他の実施態様において、5〜95%、10%〜95%、25%〜95%又は更に10%〜65%）機能的リードス
ルータンパク質を産生する。

特定の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、式I
、式II、式III又は式IVの化合物でない。具体的実施態様において、本発明に従って使用
されるナンセンスコドン抑制因子は、表1、表2、表3又は表4の化合物ではない。その他の
実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式V、式VI、式VII、式VIII又は式IXの
化合物ではない。具体的実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン
抑制因子は、表5、表6、表7、表8または表9の化合物でない。
特定の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、グラ
ム陰性微生物及び／又はグラム陽性微生物に対して有意な抗菌活性を示さない。具体的実
施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、第5.2節に記述
された化合物である。特定の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコ
ドン抑制薬は、式I、式II、式III又は式IVの化合物である。具体的実施態様において、本
発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、表1、表2、表3又は表4の化合物であ
る。その他の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、
式V、式VI、式VII、式VIII又は式XI.の化合物である。具体的実施態様において、本発明
に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、表5、表6、表7、表8又は表9の化合物で
ある。
特定の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、28S
リボソームRNAと相互作用する。具体的実施態様において、本発明に従って使用されるナ
ンセンスコドン抑制薬は、28SリボソームRNAの特異的領域に結合する。その他の実施態様
において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、18SリボソームRNAと相
互作用しない。

本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスル
ータンパク質（群）であって、本明細書に記述した方法によって産生されるタンパク質（
群）を提供する。特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク質は、細胞にお
いて、対応する野生型タンパク質と同じ位置にて局在化されたことが見いだされる。一部
の実施態様において、機能的リードスルータンパク質は、機能的な非野生型タンパク質で
ある。具体的実施態様において、機能的な非野生型タンパク質（群）は、中途での終止コ
ドンによってコードされる位置に挿入された非野生型タンパク質（群）におけるアミノ酸
残基において、対応する野生型タンパク質（群）と異なるだけである。その他の実施態様
において、機能的な非野生型タンパク質（群）は：（i）中途での終止コドンによってコ
ードされる位置に挿入された非野生型タンパク質（群）のアミノ酸残基において；及び（
ii）中途での終止コドンによってコードされるもの以外の非野生型タンパク質（群）にお
けるアミノ酸残基鎖にて、対応する野生型タンパク質（群）と異なる。その他の実施態様
において、非野生型タンパク質は、全長（すなわち、対応する野生型タンパク質と同じ長
さ）である。本発明の方法によって産生される機能的リードスルータンパク質（群）のア
ミノ酸配列は、関心対象の核酸配列（すなわち、関心対象のナンセンス突然変異を含む核
酸配列）を含む細胞によって産生されたタンパク質（群）をシーケンシングすることによ
って決定してもよい。特定の実施態様において、細胞は、天然に核酸配列を含む。具体的
実施態様において、細胞は、ナンセンスコドン抑制薬（群）を受けているか、又は受ける
であろう患者由来の細胞である。その他の実施態様において、細胞は、核酸配列を含むよ
うに操作されている。
従って、本明細書に開示したものは：例示的な、構造的に多様なナンセンスコドン抑制
薬；薬剤を作製するための方法を記載する参照文献；ナンセンスコドン抑制活性について
薬剤をアッセイするための方法；好ましい投薬処方計画及び薬物動態学的プロフィールを
含む、ナンセンスコドン抑制薬を投与するための投与の経路及び投薬製剤；本明細書に詳
述したナンセンス突然変異と疾患との間の関連に関する開示を含む、ナンセンス突然変異
に関連した疾患；患者スクリーニングの方法を含む、開示された治療、管理及び予防の方
法のために適した患者集団；並びにナンセンスコドン抑制薬の有効性を決定するために有
用な治療的指標(therapeutic endpoint）；である。

（5.1 定義）
本明細書に使用される「中途での翻訳終結」という用語は、アミノ酸に対応するコドン
を終止コドンに変える突然変異の結果をいう。
本明細書に使用される「ナンセンスで媒介されるmRNA減衰」という用語は、中途での翻
訳終止コドンを含むmRNAの減衰を媒介する任意のメカニズムをいう。
本明細書に使用される「中途での終止コドン」、「中途での停止コドン」及び「ナンセ
ンスコドン」という用語は、アミノ酸に対応するコドンがあるべきである場所に終止コド
ンが生じることをいう。
本明細書に使用される「ナンセンス突然変異」という用語は、アミノ酸をコードするコ
ドンの終止コドンへ変更する突然変異をいう。
本明細書に使用される「ナンセンスコドン抑制」及び「ナンセンスコドンを抑制するこ
と」という用語は、中途での翻訳及び／若しくはナンセンスを媒介したmRNA減衰の阻害又
は抑制をいう。一つの実施態様において、中途での翻訳及び／若しくはナンセンスを媒介
したmRNA減衰の阻害又は抑制は、インビボのものである。別の実施態様において、中途で
の翻訳及び／若しくはナンセンスを媒介したmRNA減衰の阻害又は抑制は、インビトロのも
のである。

本明細書に使用される、「中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介したmRNA減衰
の調整」という句は、ナンセンスコドン抑制のレベルを変化させることによる遺伝子発現
の制御をいう。例えば、中途での終止コドンをもつ遺伝子によってコードされる機能的リ
ードスルータンパク質の産生を増大すること、すなわちRNAの翻訳を生じることができる
ように疾患遺伝子の中途での終止コドンのリードスルーを可能にすることが望ましい場合
、中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介したmRNA減衰の調整は、ナンセンスコド
ン抑制のアップレギュレーションを伴う。逆に、中途での終止コドンを有するmRNAの分解
を促進することが望ましい場合、中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介したmRNA
減衰の調整は、ナンセンスコドン抑制のダウンレギュレーションを伴う。

本明細書に使用される「対象」及び「患者」という用語は、本明細書において、動物（
例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マ
ウス、ラット、ウサギ、モルモット、その他）、好ましくは非霊長類及び霊長類（例えば
、サル及びヒト）などの哺乳類、最も好ましくはヒトをいうために同義的に使用される。
特定の実施態様において、患者は、胚、胎児、乳児、小児、若者又は成人である。一つの
実施態様において、患者がナンセンス突然変異を有することは、事前のスクリーニングに
よって決定されている。別の実施態様において、患者がどのナンセンス突然変異を有する
か（すなわち、UAA、UGA又はUAG）は、事前のスクリーニングによって決定されている。
別の実施態様において、患者は、細菌細胞（例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）
）に感染している。別の実施態様において、患者の細胞は、ウイルスに感染している。

本明細書に使用される、「グラム陰性微生物及び／又はグラム陽性微生物に対して有意
な抗菌活性を示さない」という句は、グラム陰性微生物の培養液及び／又はグラム陽性微
生物の培養液に添加されたときに、250μg/ml以上（特定の実施態様において、300μg/ml
、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml又は500μg/ml及びその他の実施態様において、約25
0μg/ml〜約1000μg/ml又は250μg/ml〜約500μg/ml）の最小阻止濃度（MIC）を有するナ
ンセンスコドン抑制薬（群）をいう。具体的実施態様において、この句は、250μg/ml以
上（特定の実施態様において、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml又は500μg
/ml及びその他の実施態様において、約250μg/ml〜約1000μg/ml又は250μg/ml〜約500μ
g/ml）のMICを有するナンセンスコドン抑制薬をいう。大腸菌（E. coli）BAS849（浸透性
）の培養液、緑膿菌（P. aeruginosa）27853の培養液、黄色ブドウ球菌（S. aureus）292
13の培養液、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）12228（CNSA）の培養液、フェシウム菌
（Enterococcus faecium）49624の培養液及び／又は大便連鎖球菌（Enterococcus faecal
is）29212の培養液に添加される。
本明細書に使用される「乳」という用語には、特に明記しない限り、標準化された、全
乳、脂肪減少乳（2%）、低脂肪乳（1%）、脱脂乳、無脂肪乳及び乳糖を含まない乳を含む
。「乳」という用語には、ヒト又は家畜化された動物（例えば、ウシ、バッファロ、ヤギ
、ヒツジ又はラクダ）からのもの、並びに豆乳、及び任意の乳に基づくか、又は含む製品
を含む。

本明細書に使用される「置換された」という用語は、特に明記しない限り、以下などの
1〜4又はそれ以上の置換基によって置換された基をいう：ハロ、トリフルオロメチル、ト
リフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、シクロアルキオキシ（cycloalkyoxy）、
ヘテロシクロオキシ、オキソ、アルカノイル、アルキルカルボニル、シクロアルキル、ア
リール、アリールオキシ、アラルキル、アルカノイルオキシ、シアノ、アジド、アミノ、
アルキルアミノ、アリールアミノ、アラルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、ヘテロシ
クロアミノ、アミノ基上の2つの置換基がアルキル、アリール、アラルキル、アルカノイ
ルアミノ、アロイルアミノ、アラルカノイルアミノ、置換されたアルカノイルアミノ、置
換されたアリールアミノ、置換されたアラルカノイルアミノ、チオール、アルキルチオ、
アリールチオ、アラルキルチオ、シクロアルキルチオ、ヘテロシクロチオ、アルキルチオ
ノ、アリールチオノ、アラルキルチオノ、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、ア
ラルキルスルホニル、スルホンアミド（例えば、SO₂NH₂）、置換されたスルホンアミド、
ニトロ、カルボキシ、カルバミル（例えばCONH₂）、置換されたカルバミル（例えば、CON
Hアルキル、CONHアリール、CONHアラルキル、又はアルキル、アリール若しくはアラルキ
ルから選択される窒素上に2つの置換基がある場合の例）、アルコキシカルボニル、アリ
ール、置換されたアリール、グアニジノ、並びにインドリル、イミダゾリル、フリル、チ
エニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジル、その他などのヘテロシクロか
ら選択される一並びに二置換のアミノ。この場合、上記の如く、置換基それ自体は、更に
置換され、このようなさらなる置換基は、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリール及
びアラルキルからなる群から選択される。特定の実施態様において、置換されたという用
語は、シアノを意味しない。

本明細書に使用される「アルキル」という用語は、特に明記しない限り、1〜20炭素原
子、好ましくは1〜10炭素原子、及び最も好ましくは1〜4炭素原子を有する飽和直鎖又は
分枝非環状炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、-メチル、-エチル、-n
-プロピル、-n-ブチル、-n-ペンチル、-n-ヘキシル、-n-ヘプチル、-n-オクチル、-n-ノ
ニル及び-n-デシルを含み；一方、飽和分枝アルキルには、-イソプロピル、-sec-ブチル
、-イソブチル、-tert-ブチル、-イソペンチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2-メ
チルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、2-メチルヘキシル、3-メチルヘキ
シル、4-メチルヘキシル、5-メチルヘキシル、2,3-ジメチルブチル、2,3-ジメチルペンチ
ル、2,4-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルヘキシル、2,4-ジメチルヘキシル、2,5-ジメチ
ルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、2,2-ジメチルヘキシル、3,3-ジメチルペンチル、3,
3-ジメチルヘキシル、4,4-ジメチルヘキシル、2-エチルペンチル、3-エチルペンチル、2-
エチルヘキシル、3-エチルヘキシル、4-エチルヘキシル、2-メチル-2-エチルペンチル、2
-メチル-3-エチルペンチル、2-メチル-4-エチルペンチル、2-メチル-2-エチルヘキシル、
2-メチル-3-エチルヘキシル、2-メチル-4-エチルヘキシル、2,2-ジエチルペンチル、3,3-
ジエチルヘキシル、2,2-ジエチルヘキシル、3,3-ジエチルヘキシル、その他を含む。アル
キル基は、非置換又は置換であることができる。不飽和アルキル基には、アルケニル基及
びアルキニル基を含み、これは後述してある。

本明細書に使用される「アルケニル基」という用語は、特に明記しない限り、2〜20炭
素原子、より好ましくは、2〜10の炭素原子、最も好ましくは2〜6炭素原子を有し、かつ
少なくとも１つの炭素-炭素二重結合を含む直鎖又は分枝の非環状性炭化水素を意味する
。代表的な直鎖及び分枝(C₂-C₁₀)アルケニルには、-ビニル、-アリル、-1-ブテニル、-2-
ブテニル、-イソブチルエニル、-1-ペンテニル、-2-ペンテニル、-3-メチル-1-ブテニル
、-2-メチル-2-ブテニル、-2,3-ジメチル-2-ブテニル、-1-ヘキセニル、-2-ヘキセニル、
-3-ヘキセニル、-1-ヘプテニル、-2-ヘプテニル、-3-ヘプテニル、-1-オクテニル、-2-オ
クテニル、-3-オクテニル、-1-ノネニル、-2-ノネニル、-3-ノネニル、-1-デセニル、-2-
デセニル、-3-デセニル、その他を含む。アルケニル基の二重結合は、別の不飽和基に抱
合しないこと又は抱合することができる。アルケニル基は、非置換又は置換であることが
できる。

本明細書に使用される「アルキニル基」という用語は、特に明記しない限り、2〜20炭
素原子、より好ましくは2〜10炭素原子、最も好ましくは2〜の炭素原子を有し、かつ少な
くとも1つの炭素-炭素三重結合を含む直鎖又は分枝の非環状性炭化水素を意味する。代表
的な直鎖及び枝分(C₂-C₁₀)アルキニルには、-アセチレニル、-プロピニル、-1-ブチニル
、-2-ブチニル、-1-ペンチニル、-2-ペンチニル、-3-メチル-1-ブチニル、-4-ペンチニル
、-1-ヘキシニル、-2-ヘキシニル、-5-ヘキシニル、-1-へプチニル、-2-へプチニル、-6-
へプチニル、-1-オクチニル、-2-オクチニル、-7-オクチニル、-1-ノニニル、-2-ノニニ
ル、-8-ノニニル、-1-デシニル、-2-デシニル、-9-デシニル、その他を含む。アルキニル
基の三重結合は、別の不飽和基に抱合しないこと又は抱合することができる。アルキニル
基は、非置換又は置換であることができる。

本明細書に使用される「ハロゲン」又は「ハロ」という用語は、特に明記しない限り、
フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
本明細書に使用される「ハロアルキル」という用語は、特に明記しない限り、1つ以上
のハロゲン原子で置換された本明細書に記述したようなアルキル基を意味する。
本明細書に使用される「ハロアルコキシ」という用語は、特に明記しない限り、1つ以
上のハロゲン原子で置換された本明細書に記述したようなアルコキシ基を意味する。
本明細書に使用される「アルキルスルホニル」という用語は、特に明記しない限り、式
中アルキルが上の通りに定義される-アルキル-SO₃H又は-SO₃-アルキルを意味し、-SO₂-CH
₃、-SO₂-CH₂CH₃、-SO₂-(CH₂)₂CH₃、-SO₂-(CH₂)₃CH₃、-SO₂-(CH₂)₄CH₃、-SO₂-(CH₂)₅CH₃、
その他を含む。
本明細書に使用される「カルボキシル」及び「カルボキシ」という用語は、特に明記し
ない限り、-COOHを意味する。

本明細書に使用される「アルコキシ」という用語は、特に明記しない限り、式中アルキ
ルが上の通りに定義される-O-(アルキル)を意味し、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-O(CH₂)₂CH₃、-O(
CH₂)₃CH₃、-O(CH₂)₄CH₃、-O(CH₂)₅CH₃、その他を含む。
本明細書に使用される「アルコキシカルボニル」という用語は、特に明記しない限り、
式中アルキルが上の通りに定義される-C（=O)O-（アルキル）を意味し、-C（=O)O-CH₃、-
C(＝O)O-CH₂CH₃、-C(=O）O-(CH₂)₂CH₃、-C(=O)O-(CH₂)₃CH₃、-C(=O)O-(CH₂)₄CH₃、-C(=O)
O-(CH₂)₅CH₃、その他を含む。好ましい実施態様において、エステルは、生物加水分解性
である（すなわち、エステルは、インビトロ又はインビボでカルボン酸に加水分解される
。
本明細書に使用される「アルコキシアルキル」という用語は、特に明記しない限り、式
中それぞれの「アルキル」が独立して上記記載のようなアルキル基である-(アルキレン）
-O-(アルキル)を意味し、-CH₂OCH₃、-CH₂OCH₂CH₃、-(CH₂)₂OCH₂CH₃、-(CH₂)₂O(CH₂)₂CH₃
、その他を含む。

本明細書に使用される「アリール」という用語は、特に明記しない限り、5〜14環原子
を含む炭素環式芳香環を意味する。炭素環式アリール基の環原子は、全て炭素原子である
。アリール環構造は、一、二又は三環式化合物などの1つ以上の環構造、並びに5,6,7,8-
テトラヒドロナフチル、その他などのベンゾ融合された炭素環部分を有する化合物を含む
。好ましくは、アリール基は、単環式の環又は二環式の環である。代表的なアリール基に
は、フェニル、トリル、アントラセニル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、フェ
ナントレニル及びナフチルを含む。炭素環式のアリール基は、非置換又は置換であること
ができる。

本明細書に使用される「ヘテロアリール」という用語は、特に明記しない限り、5〜14
環原子を含む炭素環式の芳香環を意味し、環原子には、独立して窒素、酸素又は硫黄から
選択される少なくとも１つのヘテロ原子（好ましくは1〜3つのヘテロ原子）を含む。ヘテ
ロアリール環構造には、一、二又は三環式化合物などの1つ以上の環構造、並びに縮合複
素環部分を有する化合物を含む。代表的なヘテロアリールには、トリアゾイル、テトラゾ
リル、オキサジアゾリル、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチ
オフェニル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、キノリニル、ピロリル、
インドリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、
チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリ
ダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニリル、フタラジニル、
キナゾリニル、ベンゾキナゾリニル、アクリジニル、ピリミジル及びオキサゾリルがある
。基は、非置換又は置換であることができる。

本明細書に使用される「アリールオキシ」という用語は、特に明記しない限り、式中ア
リールが上で定義したとおりである-O-アリール基を意味する。アリールオキシ基は、非
置換又は置換であることができる。
本明細書に使用される「アリールアルキル」という用語は、特に明記しない限り、式中
アルキル及びアリールが上で定義したとおりである-(アルキル)-(アリール)を特に意味し
、-(CH₂)フェニル、-(CH₂)₂フェニル、-(CH₂)₃フェニル、-CH(フェニル)₂、-CH(フェニル
)₃、-(CH₂)トリル、-(CH₂)アントラセニル、-(CH₂)フルオレニル、-(CH₂)インデニル、-(
CH₂)アズレニル、-(CH₂)ナフチル、その他を含むが限定されない。
本明細書に使用される「ヘテロアリールアルキル」という用語は、特に明記しない限り
、式中アルキル及びヘテロアリールが上で定義したとおりである-(アルキル)-(ヘテロア
リール)を意味し、-(CH₂)ピリジル、-(CH₂)₂ピリジル、-(CH₂)₃ピリジル、-CH(ピリジル)
₂、-C（ピリジル)₃-(CH₂)トリアゾイル、-(CH₂)テトラゾリル、-(CH₂)オキサジアゾリル
、-(CH₂)フリル、-(CH₂)ベンゾフラニル、-(CH₂)チオフェニル、-(CH₂)ベンゾチオフェニ
ル、その他を含むが限定されない。

本明細書に使用される「アリールアルキルオキシ」という用語は、特に明記しない限り
、式中アルキル及びアリールが上で定義したとおりである-O-(アルキル)-(アリール)を意
味し、-O-(CH₂)₂フェニル、-O-(CH₂)₃フェニル、-O-CH(フェニル)₂、-O-CH（フェニル)₃
、-O-(CH₂)トリル、-O-(CH₂)アントラセニル、-O-(CH₂)フルオレニル、-O-(CH₂)インデニ
ル、-O-(CH₂)アズレニル、-O-(CH₂)ナフチル、その他を含む、が限定されない。
本明細書に使用される「シクロアルキル」という用語は、特に明記しない限り、炭素及
び水素原子を含み、かつ炭素-炭素多重結合を有していない単環式又は多環式の飽和環を
意味する。シクロアルキル基は、非置換又は置換であることができる。シクロアルキル基
の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロ
ヘプチルを含む(C₃-C₇)シクロアルキル基、並びに飽和した環状及び二環式テルペンを含
むが、限定されない。シクロアルキル基は、非置換又は置換であることができる。好まし
くは、シクロアルキル基は、単環式の環又は二環式の環である。

本明細書に使用される「ヘテロシクリル」という用語は、特に明記しない限り、炭素及
び水素原子を含み、かつ任意に1〜4個の多重結合を有する単環式又は多環式の環を意味し
、環原子は、独立して窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（
好ましくは1〜3つのヘテロ原子）を含む。ヘテロシクリル環構造は、一、二又は三環式化
合物などの1つ以上の環構造を有する化合物を含む。好ましくは、ヘテロシクリル基は、
単環式の環又は二環式の環である。代表的な複素環には、モルホリニル、ピロリジノニル
、ピロリジニル、ピペリジニル、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オ
キセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、
テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、そ
の他を含むが、限定されない。ヘテロシクリル環は、非置換又は置換であることができる
。

本明細書に使用される「シクロアルキルオキシ」という用語は、特に明記しない限り、
式中シクロアルキルが上で定義したとおりである-O-(シクロアルキル)を意味する。
本明細書に使用される「シクロアルキルアルキルオキシ」という用語は、特に明記しな
い限り、式中シクロアルキル及びアルキルが上で定義されたとおりである-O-(アルキル)-
（シクロアルキル）を意味し、-O-シクロプロピル、-O-シクロブチル、-O-シクロペンチ
ル、-O-シクロヘキシル、-O-シクロヘプチル、その他を含むが限定されない。
本明細書に使用される「アミノアルコキシ」という用語は、特に明記しない限り、式中
アルキルが上で定義されたとおりである-O-(アルキル)-NH₂を意味し、-O-CH₂-NH₂、-O-(C
H₂)₂-NH₂、-O-(CH₂)₃-NH₂、-O-(CH₂)₄-NH₂、-O-(CH₂)₅-NH₂、その他を含むが限定されな
い。
本明細書に使用される「アルキルアミノ」という用語は、特に明記しない限り、式中ア
ルキルが上で定義されたとおりである-NH(アルキル)又は-N(アルキル)(アルキル)を意味
し、NHCH₃、-NHCH₂CH₃、-NH(CH₂)₂CH₃、-NH(CH₂)₃CH₃、-NH(CH₂)₄CH₃、-NH(CH₂)₅CH₃、-N
(CH₃)₂、-N(CH₂CH₃)₂、-N（(CH₂)₂CH₃)₂、-N(CH₃)(CH₂CH₃)、その他を含むが限定されな
い。

本明細書に使用される「アリールアミノ」という用語は、特に明記しない限り、式中ア
リールが上で定義されたとおりである-NH(アリール)を意味し、-NH(フェニル)、-NH(トリ
ル)、-NH(アントラセニル)、-NH(フルオレニル)、-NH(インデニル)、-NH(アズレニル)、-
NH(ピリジニル)、-NH(ナフチル)、その他を含むが限定されない。
本明細書に使用される「アリールアルキルアミノ」という用語は、特に明記しない限り
、式中アルキル及びアリールが上で定義されたとおりである-NH-(アルキル)-(アリール)
を意味し、-NH-CH₂-(フェニル)、-NH-CH₂-(トリル)、-NH-CH₂-(アントラセニル)、-NH-CH
₂-(フルオレニル)、-NH-CH₂-(インデニル)、-NH-CH₂-(アズレニル)、-NH-CH₂-(ピリジニ
ル)、-NH-CH₂-(ナフチル)、-NH-(CH₂)₂-(フェニル)、その他を含むが限定されない。
本明細書に使用される「シクロアルキルアミノ」という用語は、特に明記しない限り、
式中シクロアルキルが上で定義されたとおりである-NH-(シクロアルキル)を意味し、-NH-
シクロプロピル、-NH-シクロブチル、-NH-シクロペンチル、-NH-シクロヘキシル、-NH-シ
クロヘプチル、その他を含むが限定されない。

本明細書に使用される「アミノアルキル」という用語は、特に明記しない限り、式中ア
ルキが上で定義されたとおりである-(アルキル)-NH₂を意味し、-CH₂-NH₂、-(CH₂)₂-NH₂、
-(CH₂)₃-NH₂、-(CH₂)₄-NH₂、-(CH₂)₅-NH₂、その他を含む。
本明細書に使用される「アルキルアミノアルキル」という用語は、特に明記しない限り
、式中それぞれの「アルキル」が独立して上で定義されたアルキル基である(アルキル)-N
H(アルキル)又は-(アルキル)-N(アルキル)(アルキル)を意味し、-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-NHCH
₂CH₃、-CH₂-NH(CH₂)₂CH₃、-CH₂-NH(CH₂)₃CH₃、-CH₂-NH(CH₂)₄CH₃、-CH₂-NH(CH₂)₅CH₃、-(
CH₂)₂-NH-CH₃、-CH₂-N(CH₃)₂-CH₂-N(CH₂CH₃)₂、-CH₂-N（(CH₂)₂CH₃)₂、-CH₂-N(CH₃)(CH₂C
H₃)、-(CH₂）₂-N(CH₃)₂、その他を含む。
本明細書に使用される「ナンセンスコドン抑制活性を有する化合物」、「ナンセンスコ
ドン抑制薬」及び「ナンセンスコドン抑制因子」という用語は、インビトロ又はインビボ
においてナンセンスコドンのリードスルーを生じさせることができる任意の化合物又はそ
の医薬として許容し得る塩、プロドラッグ、溶媒和物、水和物、多形若しくはエナンチオ
マーをいう。

本明細書に使用される「治療プロトコル」は、1つ以上の療法のタイミング及び投薬の
処方計画をいう。
本明細書に使用される「予防プロトコル」は、1つ以上の療法のタイミング及び投薬の
処方計画をいう。
本明細書に使用される「プロトコル」には、投薬スケジュール及び投薬処方計画を含む
。
本明細書に使用される「組み合わせて」とは、複数の療法の使用をいう。「組み合わせ
て」という用語の使用は、療法が疾患をもつ対象に投与される順序を制限しない。第1の
療法は、疾患を有したか、有するか、又は感受性である対象に対する第2の療法の投与の
前に（例えば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24
時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週又は12週前に）、
同時に、又はその後に（例えば、1分、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6
時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週、2週、3週、4週、5週、6週、8週
又は12週後に）投与することができる。療法は、本発明の薬剤が別の療法と共に作用して
、これらが投与されなかった場合よりも利益の増加をもたらすことができるような順序で
及び時間間隔内で対象に投与される。その他のコドン抑制薬と組み合わせて投与すること
ができる療法の非限定的な例には、鎮痛薬、麻酔薬、抗痙攣薬、支持療法、並びに及び米
国薬局方及び／又は医師の机上参照に収載されたその他の任意の療法を含む。

本明細書に使用される、対象に対する療法の投与の文脈における「管理する」、「管理
すること」及び「管理」という用語は、疾患の治癒を生じない、対象が療法から引き出す
有益効果をいう。特定の実施態様において、対象には、疾患若しくはその症候の進行又は
悪化を予防するために疾患を「管理する」ために1つ以上の療法が投与される。
本明細書に使用される「療法」という用語は、障害又はその症候の予防、管理及び／若
しくは治療に使用することができる任意のプロトコル、方法、並びに／又は薬剤をいう。
特定の実施態様において、「療法」という用語は、障害又はその症候の予防、管理及び／
又は治療に有用な生物学的療法、外科手術及び／又は支持療法をいう。具体的実施態様に
おいて、ナンセンスコドン抑制薬は、療法である。
本明細書に使用される、対象に対する療法の投与の文脈における「予防する」、「予防
すること」及び「予防」という用語は、療法の投与により生じる対象における疾患若しく
はその症候の発病、発症、再発、伝播及び／又は悪化の予防をいう。

本明細書に使用される、対象に対する療法の投与の文脈における「治療する」、「治療
すること」及び「治療」という用語は、疾患若しくは疾患に関連した症候の根絶又は寛解
をいう。特定の実施態様において、このような用語は、このような疾患を有する対象に対
する1つ以上の療法の投与により生じる疾患の伝播又は悪化を最小化することをいう。そ
の他の実施態様において、このような用語は、疾患若しくは疾患に関連したの重症度及び
／又は期間の減少症候をいう。
本明細書に使用される、機能的リードスルータンパク質の文脈における「全長」という
用語は、対応する野生型タンパク質と同じアミノ酸残基の数で構成される機能的リードス
ルータンパク質をいう。
本明細書に使用される「非野生型タンパク質」という用語は、対応する野生型タンパク
質とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。特定の実施態様において、非野生
型タンパク質は、中途での終止コドンによってコードされる位置（群）に挿入された非野
生型タンパク質のアミノ酸残基（群）において、対応する野生型タンパク質と異なるだけ
である。その他の実施態様において、非野生型タンパク質は：（i）中途での終止コドン
によってコードされる位置に挿入された非野生型タンパク質（群）のアミノ酸残基におい
て；及び（ii）中途での終止コドンによってコードされるもの以外の非野生型タンパク質
（群）におけるアミノ酸残基鎖にて、対応する野生型タンパク質（群）と異なる。

本明細書に使用される、タンパク質の文脈における「野生型」という用語は、天然にお
いて見いだされ（たいてい（しかし、必然的にではなく）、それは、優性タンパク質であ
る）、かつ標準タンパク質又は参照タンパク質と命名されるタンパク質をいう。
本明細書に使用される「機能的リードスルータンパク質」という句は、遺伝子から転写
されるRNA（例えば、mRNA）のナンセンスコドンのリードスルーの結果として産生される
機能的タンパク質をいう。具体的実施態様において、「機能的リードスルータンパク質」
という句は、ナンセンス突然変異を含む遺伝子から転写されるRNAのナンセンスコドンの
リードスルーの結果として産生される機能的タンパク質をいう。特定の実施態様において
、機能的リードスルータンパク質は、ナンセンス突然変異のない遺伝子によってコードさ
れる対応する野生型タンパク質と同じアミノ酸配列で構成される。その他の実施態様にお
いて、機能的リードスルータンパク質は、機能的な非野生型タンパク質である。

本明細書に使用される「皮膚障害」という用語は、皮膚、特に表皮又は真皮の障害、よ
り詳細には表皮、皮膚の成分の障害をいう。「表皮」には：角質層、透明層、顆粒層、有
棘層及び胚芽層（基底層、基底細胞層）を含む。具体的実施態様において、本発明に従っ
て治療され、予防され及び／又は管理される障害は、皮膚障害ではない。
本明細書に使用される「胃腸障害」という用語は、口、咽頭、食道、胃及び十二指腸（
例えば、小腸、大腸（例えば、結腸））を含む胃腸（GI）路の障害をいう。具体的実施態
様において、本発明に従って治療され、予防され及び／又は管理される障害は、胃腸障害
ではない。
本明細書に使用される「疾患」及び「障害」という用語は、同義的に使用される。

本明細書に使用される「遺伝子（群）におけるナンセンス突然変異に関連した疾患」及
び「遺伝子（群）におけるナンセンス突然変異に関連した障害」という句は、直接又は間
接的に、ナンセンス突然変異（群）が患部細胞における野生型タンパク質の産生を妨げる
遺伝子（群）のナンセンス突然変異（群）によって生じる疾患をいうために同義的に使用
される。ナンセンス突然変異に関連した疾患には、単一遺伝子が1つ、2つ、3つ又はそれ
以上のナンセンス突然変異を含む疾患、並びに2つ、3つ又はそれ以上（複数）の遺伝子が
1つ、2つ、3つ又はそれ以上のナンセンス突然変異を含む疾患を包含する。
本明細書に使用される、機能的リードスルータンパク質の文脈における「機能的な」と
いう用語は、タンパク質をコードする核酸配列（例えば、遺伝子）の突然変異（例えば、
ナンセンス突然変異）の結果として、野生型タンパク質を産生しないか、又は不十分な量
を産生する細胞又は対象において有益効果を有する対応する野生型タンパク質の機能の十
分な量を有するタンパク質をいう。

本明細書に使用される「医薬として許容し得る塩」という用語は、無機酸及び無機塩基
並びに有機酸及び有機塩基を含む医薬として許容し得る無毒の酸又は塩基から調製される
塩をいう。本発明の化合物のために適した医薬として許容し得る塩基付加塩は、アルミニ
ウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から作製さ
れる金属塩、又はリジン、N, N' -ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コ
リン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）及び
プロカインから作製される有機酸塩を含むが、限定されない。適切な無毒の酸には、酢酸
、アルギン酸、アントラニル酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、ショウノウスルホン酸
、クエン酸、エテンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、フロ酸、ガラクツロン酸、グルコン酸
、グルクロン酸、グルタミン酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸
、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモ酸、パン
トテン酸、フェニル酢酸、リン酸、プロピオン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸
、スルファニル酸、硫酸、酒石酸及びp-トルエンスルホン酸などの無機酸及び有機酸を含
むが、限定されない。具体的な非毒性酸には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及びメタ
ン硫酸を含む。従って、具体的な塩の例には、塩酸塩及び溶媒和物塩を含む。その他の塩
の例は、当該技術分野において周知であり、例えばレミントンの医薬品科学（Remington'
s Pharmaceutical Sciences）、第18版、Mack Publishing, Easton PA（1990）を参照さ
れたい。

本明細書に使用されるとおり及び特に明記しない限り、「プロドラッグ」という用語は
、生物学的条件下で（インビトロ又はインビボにおいて）加水分解し、酸化し又はさもな
ければ反応して活性化合物、特に本発明の化合物を提供することができる化合物の誘導体
を意味する。プロドラッグの例には、バイオ加水分解性アミド、バイオ加水分解性エステ
ル、バイオ加水分解性カルバメート、バイオ加水分解性カルボナート、バイオ加水分解性
ウレイド及びバイオ加水分解性ホスフェート類似体などのバイオ加水分解性の部分を含む
本発明の化合物の誘導体及び代謝産物を含むが、限定されない。好ましくは、カルボキシ
ル官能基を有する化合物のプロドラッグは、カルボン酸の低級アルキルエステルである。
カルボン酸エステルは、分子上に存在する任意のカルボン酸部分をエステル化することに
よって都合よく形成される。プロドラッグは、典型的にはバーガーの医薬品化学及び創薬
（Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery）第6版（Donald J. Abraham編、2
001, Wiley）並びにプロドラッグのデザイン及び適用（Design and Application of Prod
rugs） （H.Bundgaard編、1985, Harwood Academic Publishers Gmfh）によって記述され
たものなどの周知の方法を使用して調製することができる。

本明細書に使用されるとおり及び特に明記しない限り、「バイオ加水分解性アミド」、
「バイオ加水分解性エステル」、「バイオ加水分解性カルバメート」、「バイオ加水分解
性カルボナート」、「バイオ加水分解性ウレイド」、「バイオ加水分解性ホスフェート」
という用語は：1）化合物の生物活性を妨げないが、インビボにおいてその化合物に取り
込み、作用の期間又は作用開始などの有利な特性を与えることができるか；又は2）生物
学的に不活性であるが、インビボにおいて生物学的に活性な化合物に変換される；のいず
れかの化合物のアミド、エステル、カルバメート、カルボナート、ウレイド又はホスフェ
ートをそれぞれ意味する。バイオ加水分解性エステルの例には、低級アルキルエステル、
アルコキシアシルオキシエステル、アルキルアシルアミノアルキルエステル及びコリンエ
ステルを含むが、限定されない。バイオ加水分解性アミド例には、低級アルキルアミド、
α-アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド及びアルキルアミノアルキルカルボニルア
ミドを含むが、限定されない。バイオ加水分解性カルバメートの例には、低級アルキルア
ミン、置換されたエチレンジアミン、アミノ酸、ヒドロキシアルキルアミン、複素環及び
複素環式芳香族化合物アミン、並びにポリエーテルアミンを含むが、限定されない。

本明細書に使用されるとおり及び特に明記しない限り、「光学的に純粋な」又は「立体
的に（stereomerically）純粋な」という用語は、その化合物のその他の立体異性体が実
質的にない化合物の立体異性体をいう。例えば、1つのキラル中心を有する立体的に純粋
な化合物は、化合物の反対のエナンチオマーを実質的に含まないであろう。2つのキラル
中心を有する立体的に純粋な化合物は、化合物のその他のジアステレオマーを実質的に含
まないであろう。典型的な立体的に純粋な化合物は、化合物の1つの立体異性体の約80重
量％よりも多く及び化合物のその他の立体異性体の約20重量％よりも少なく、より好まし
くは化合物の1つの立体異性体の約90重量％よりも多く、及び化合物のその他の立体異性
体の約10重量％よりも少なく、更により好ましくは化合物の1つの立体異性体の約95重量
％よりも多く及び化合物のその他の立体異性体の約5重量％よりも少なく、並びに化合物
の1つの立体異性体の約97重量％よりも多く及び化合物のその他の立体異性体の約3重量％
よりも少なく含む。
本明細書に使用されるとおり及び特に明記しない限り、「エナンチオマー的に純粋な」
という用語は、1つのキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物を意味する。

本明細書に使用される「単位剤形（群）」という用語には、錠剤；咀嚼錠；カプレット
；軟弾性ゼラチンカプセルなどのカプセル；サッシェ；カシェ剤；トローチ；ロゼンジ；
分散剤；粉末；溶液；ゲル；懸濁液（例えば、水性又は非水溶液の懸濁液）、乳剤（例え
ば、水中油型乳剤又は油中水型液状乳剤）、溶液及びエリキシルを含む患者に対する経口
又は粘膜投与のために適した液体剤形；並びに患者に対する経口又は非経口的投与のため
に適した液体剤形を提供するために再構成することができる無菌の固体（例えば、結晶性
又は非晶質の固体）；を含む。単位剤形は、必ずしも単一用量として投与される必要があ
るわけではない。
本明細書に使用される、化合物の文脈における「ライブラリー」という用語は、複数の
化合物をいう。ライブラリーは、コンビナトリアルライブラリー、例えばコンビナトリア
ルケミストリー技術を使用して合成される化合物のコレクション、又はそれぞれの独特な
三次元空間を占める低分子量（1000ダルトン未満）の独特の化学物質のコレクションであ
ることができる。
本明細書に使用される「リポーター遺伝子」は、中途での翻訳終結及び／又はナンセン
スを媒介したmRNA減衰の調整が確認される遺伝子をいう。具体的実施態様において、リポ
ーター遺伝子の発現は、容易にアッセイし、及び細胞若しくは翻訳抽出物が得られ又は由
来する生物体において通常見いだされない活性を有する。

本明細書に使用される「ナンセンスを媒介したmRNA減衰」は、中途での翻訳終止コドン
を含むmRNAの減衰を媒介する任意のメカニズムをいう。
本明細書に使用される「前もって決定された参照範囲」という用語は、特定のアッセイ
法の読み出しのための参照範囲をいう。具体的実施態様において、本用語は、特定の細胞
による、若しくは特定の無細胞抽出液における、リポーター遺伝子の発現及び／又はリポ
ーター遺伝子産物の活性に関する参照範囲をいう。一部の実施態様において、それぞれの
研究室が、それぞれの特定のアッセイ法、それぞれの細胞型及びそれぞれの無細胞抽出液
について、独自の参照範囲を確立する。好ましい実施態様において、少なくとも１つの正
の対照及び少なくとも１つの負の対照が、解析される化合物のそれぞれのバッチに含まれ
る。
示された構造とその構造に与えられる名称との間に相違がある場合、示された構造によ
り重きが与えられるべきことに留意すべきである。加えて、構造の立体化学又は構造の一
部が、例えば太字体又は破線で示されていない場合、構造又は構造の一部は、その全ての
立体異性体を包含するものと解釈される。

（5.2 ナンセンス突然変異抑制活性を有する例示的化合物）
一つの実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式Iの化合物又はその医薬と
して許容し得る塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、ラセミ化合物若しくは立体異性体
であり：

式中：
Zは、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは
非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換の
ヘテロシクロ、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロア
リールアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換若しくは非置換の
ヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリールカルボニルであり；

Xは、CH₂、O、S又はNHであり；
R¹は、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若
しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非
置換のヘテロシクロ、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘ
テロアリールアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換若しくは非
置換のヘテロシクロアルキルであり；
R²は、置換若しくは非置換のアルキル、カルボキシ、アミド、アシル、アルキルカルボ
ニル、ハロゲン、バイオ加水分解性基、OP(O)₃ ^2-、O[P(O)₃]₂ ^3-、O[P(O)₃]₃ ^4-、N₃、CH₂-
NR₆R₇又はCH₂-OR⁶であり；

R³、R³'、R⁴及びR⁴'は、それぞれの存在にて、独立して、OR⁷、OR⁸、水素、ハロゲン、
置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換の
ヘテロアリール、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシ
クロ、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリールア
ルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシ
クロアルキル、置換若しくは非置換のアリールカルボニル、置換若しくは非置換のアルキ
ルカルボニル、バイオ加水分解性基であるか、又はR³及びR⁴は共に結合を形成するか、又
はR³及びR⁴は、これらが結合される原子と共になって置換若しくは非置換のヘテロシクロ
を形成するか、又はR³及びR³並びに／若しくはR⁴及びR⁴は、これらが結合される炭素と共
になってC(=O)を形成し；並びに、
R⁶、R⁷及びR⁸は、それぞれの存在にて、独立して、水素、置換若しくは非置換のアルキ
ル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しく
は非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロ、置換若しくは非置換の
アリールアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換若しくは非置換
のシクロアルキルアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは
非置換のアリールカルボニル、置換若しくは非置換のアルキルカルボニル、バイオ加水分
解性基であるか、又はR₃及びR₄は、これらが結合される原子と共になって置換若しくは非
置換のヘテロシクロを形成する。
式Iの好ましい化合物は、下記の表1に記載してある。

式Iの化合物は、標準的な、周知の合成方法論を介して得ることができ、例えばMarch, J.
の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry; Reacti
ons Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの化合物
及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成方法
及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式Iの化合物を調製するための具体的方法は、2004年4月8日に公開されたUS2004-006790
0に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式IIの化合物又はその医薬とし
て許容し得る塩、水和物、クラスレート、多形、プロドラッグ若しくは立体異性体である
：

式中：
Xは、C(=O)、C(=S)、S、S(=O)又はS(O)₂であり；
Yは、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは
非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換の
ヘテロシクロであり；
Rは、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、
置換若しくは非置換のヘテロシクロ、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置
換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若しくは非置換のヘ
テロアリールアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキルアルキル、置換若しくは非
置換のヘテロシクロアルキルであり；

nは、0〜4の範囲の整数であり；
R₁及びR₂は、それぞれ独立して、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは
非置換のアルケニル、置換した又は非置換のアルキニル、-(CH₂)_m-W、カルボキシアルキ
ル、アルキルカルボニル、アルキルオキシアルキル、アルキルオキシカルボニル、アリー
ルアルキル、スルホニル、アミドであるか、又はR₁及びR₂は、これらが結合される原子と
共に任意に置換された5〜7員の複素環、任意に置換された5〜7員のヘテロアリール環を形
成するか、又はR₁及びR₂は、共に：

を形成し；
Wは、それぞれの存在にて、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、カ
ルボキシ、アルデヒド、NH₂、NR¹⁴R¹⁴'、ニトロ、シクロアルキル、ヘテロアリール、ヘ
テロアリールアルキルであり；
式中（i）R¹⁴及びR¹⁴のそれぞれの存在は、独立して、水素、置換若しくは非置換のア
ルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若し
くは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しく
は非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール又はCF₃から選択されるか；
又は（ii）R¹⁴及びR¹⁴は、これらが結合される窒素原子と共に、1〜3個がヘテロ原子であ
る5〜8個の環原子を含む任意に置換された複素環式の環を形成するように連結し；
mは、1〜4の範囲の整数であり；

R³〜R⁶は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、置換若しくは非置換のアルキル、置換
若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、置換若しくは非置換の
シクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロ、置換若しくは非置換のアリール、
置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のアリールアルキル、置換若
しくは非置換のヘテロアリールアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキルアルキル
、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、アル
コキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、シクロアルコキシ、ヘテロシクロアル
キルオキシ、アミド、ハロアルキル（例えば、CF₃）、ハロアルコキシ（例えば、OCF₃又
はOCHF₂）、OH、CN、COOH、COOR¹⁵、SO₂R¹⁵、NO₂、NH₂又はNR¹⁴R¹⁴'であり、及びR¹⁵は、
水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは
非置換のアルキニル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のヘテ
ロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリー
ル又はCF₃から選択される。
式IIの好ましい化合物を、下記の表2に記載してある。

式IIの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMarc
h, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry; R
eactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの化
合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成
方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式IIの化合物を調製するための具体的方法は、2004年1月29日に公開されたWO2004/0095
58 A2に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式IIIの化合物又はその医薬と
して許容し得る塩、水和物、クラスレート、プロドラッグ、多形、エナンチオマー、ジア
ステレオマー、ラセミ化合物若しくは立体異性体の混合物を含む立体異性体である：

式中、
Xは、酸素、硫黄、CO、SO又はS(O)₂であり；
Yは、酸素又は硫黄であり；
Zは、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若
しくは非置換のシクロアルキルであり；
nは、0〜4の整数であり；

R¹は、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換
若しくは非置換のアルキニル；置換若しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置
換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテ
ロアリール、SO₂R⁷、CF₃、CN、COOH、COR⁷又はCOOR⁷であり；
R⁰は、水素であるか、又はR¹及びこれらが結合される原子と共になって、任意に置換さ
れた5〜7員の複素環式又はヘテロアリール環を形成し；
R²、R³、R⁴及びR⁵は、独立して、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは
非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル；置換若しくは非置換のシクロア
ルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、
置換若しくは非置換のヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオ
キシ、ハロゲン、CF₃、OCF₃、OCHF₂、CN、COOH、COOR⁷、SO₂R⁷、NO₂、NH₂又はN(R⁷)₂であ
り；

R⁶は、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、
置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若し
くは非置換のヘテロアリール又は任意のバイオ加水分解性基であり；並びに、
R⁷のそれぞれの存在は、独立して、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しく
は非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル；置換若しくは非置換のシクロ
アルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール
、置換若しくは非置換のヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリール
オキシ、ハロゲン又はCF₃であり；
ただしXがOであるときに、YはOであり、nは0であり、かつR¹は水素であり、及びZは、4
-クロロフェニル、4-メチルフェニル、3-クロロフェニル又は2,4-ジクロロフェニルでな
いことを条件とし；並びに、XがOであるとき、YはOであり、nは0であり、R¹は水素であり
、かつZは、非置換のフェニルであり、R²〜R⁵の少なくとも一つは、水素ではないことを
条件とし；並びに、R₃がCOOHであるときに、R²、R⁴及びR⁵は、全てハロゲンではないこと
を条件とする。
式IIIの好ましい化合物を下記の表3に記載してある。

式IIIの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMar
ch, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry;
Reactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの
化合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合
成方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式IIIの化合物を調製するための具体的方法は、2004年1月29日に公開されたWO2004/009
533 A1に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式IIIの化合物又はその医薬と
して許容し得る塩、水和物、クラスレート、プロドラッグ、多形、エナンチオマー、ジア
ステレオマー、ラセミ化合物若しくは立体異性体の混合物を含む立体異性体である：

式中、
Zは、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若
しくは非置換のシクロアルキル、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換の
アルケニル、置換若しくは非置換の複素環、置換若しくは非置換のアリールアルキルであ
り；

R¹は、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のシクロアルキル、
置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若し
くは非置換のヘテロアリール、-(CH₂CH₂O)_nR⁶又は任意のバイオ加水分解性基であり；
R²、R³、R⁴、R⁵及びR⁶は、独立して、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若し
くは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル；置換若しくは非置換のシク
ロアルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリー
ル、置換若しくは非置換のヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリー
ルオキシ、ハロゲン、CF₃、OCF₃、OCHF₂、CN、COOH、COOR⁷、SO₂R⁷、NO₂、NH₂又はN(R⁷)₂
であり；

R⁷のそれぞれの存在は、独立して、水素、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しく
は非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル；置換若しくは非置換のシクロ
アルキル、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、置換若しくは非置換のアリール
、置換若しくは非置換のヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリール
オキシ；ハロゲン又はCF₃であり；並びに、
nは、1〜7の整数である。
式IVの好ましい化合物を下記の表4に記載してある。

式IVの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMarc
h, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry; R
eactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの化
合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成
方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式IVの化合物を調製するための具体的方法は、2004年10月14日に公開されたUS2004-020
4461 A1に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式IIIの化合物又はその医薬と
して許容し得る塩、水和物、クラスレート、プロドラッグ、多形、エナンチオマー、ジア
ステレオマー、ラセミ化合物若しくは立体異性体の混合物を含む立体異性体である：

式中、
X、Y及びZは、独立して、N、S、O及びCから選択され、X、Y又はZの少なくとも1つは、
ヘテロ原子であり；
R₁は、水素、C₁-C₆アルキル又はNa⁺又はMg²⁺であり；
R²は、独立して、無し；水素；-CH=N-OH基；シアノ基；ヒドロキシ基で任意に置換され
たC₁-C₆アルキル；又は水素、ヒドロキシル若しくはC₁-C₄アルコキシ基で任意に置換され
たカルボニル基であり；
R₃は、独立して、無し、ハロゲン、ヒドロキシ、C₁-C₆アルキル、C₁-C₄アルコキシ又は
ニトロ基であり；
R₄は、独立して、無し、水素、C₁-C₆アルキルであるか、又はWと共になったときは、R₄
は、結合であってもよく、かつW、及びR₄とWが結合される複素環は、11〜13員のヘテロ三
環構造を形成し；

Wは、以下から選択され：

（a）フェニルで任意に置換されたC₂-C₆アルキニル；
（b）以下の独立して選択される基の1つ以上で任意に置換されたC₁-C₈直鎖又は分枝鎖
アルキル：C₁-C₆アルキル；ハロゲン；フェニルが、1つ以上の独立して選択されるハロゲ
ン又はC₁-C₄アルキル基で任意に置換された-C(=O)-NH-フェニル；5〜6員の複素環；独立
してヒドロキシ、ハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロアルキル基、C₁-C₄アルコキシ
基、又は1つ以上のC₁-C₄アルキル基で任意に置換されたアミノ基から選択される、1つ以
上の基で任意に置換されたC₆-C₈アリール；以下の独立して選択される基の1つ以上で任意
に置換されたアリールオキシ：ヒドロキシ、ハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロアル
キル基、C₁-C₄アルコキシ基、又は1つ以上のC₁-C₄アルキル基で任意に置換されたアミノ
基；
（c）C₂-C₈アルケニル；
（d）C₁-C₆アルキルで任意に置換されたC₃-C₈シクロアルキル；

（e）以下の独立して選択される基の1つ以上で任意に置換されたC₆-C₈アリール：ヒド
ロキシ；ハロゲン；1つ以上の独立して選択されるハロゲン又はヒドロキシ基で任意に置
換されたC₁-C₄直鎖又は分枝鎖アルキル；1つ以上の独立して選択されるハロゲン又はフェ
ニル基で任意に置換されたC₁-C₄アルコキシ；1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキ
ル基で任意に置換されたC₃-C₈シクロアルキル；独立して1つ以上の選択されるC₁-C₄アル
キル基で任意に置換されたC₆-C₈アリール；以下の独立して選択される基の1つ以上で任意
に置換されたアリールオキシ：ヒドロキシ、ハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ ハロア
ルキル基、C₁-C₄アルコキシ基、又は1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキル基で任
意に置換されたアミノ基；1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキル、オキソ、又は以
下の独立して選択される基の1つ以上で任意に置換されたC₆-C₈アリール：ヒドロキシ、ハ
ロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロアルキル基、C₁-C₄アルコキシ基、若しくは一つ以
上の独立して選択されるC₁-C₄アルキル基で任意に置換されたアミノ基で任意に置換され
た5〜6員の複素環；アミノ又はアミノアルキル又はアルコキシ基で任意に置換されたナフ
チル基；-C(O)-NR_xR_y基；-C(O)-R_x基；イソインドール-1,3-ジオン基；ニトロ基；シアノ
基；−SO₃H基；アルキルチオ基；アルキルスルホニル基；-NR_x-C(O)-R_z基；-NR_xR_y基；-N
R_x-SO₂-R_z基；-NR_x-C(O)-NR_xR_y基；-NR_x-C(O)O-R_z基；

（f）1つ以上の独立して選択されるハロゲン、アミノ基若しくはアミノアルキル基によ
って任意に置換されたC₁₀-C₁₄アリール基、又はアルコキシ基；
（g）-C(O)-NR_xR_y基；
（h）1つ以上の独立して選択されるオキソ基；ハロゲン；C₁-C₄アルキル基；C₁-C₄アル
コキシ基；C₁-C₄ハロアルキル基；C₁-C₄ハロアルコキシ基；アリールオキシ基；-NR_xR_y基
；アルキルチオ基；-C(O)-R_x基；又は1つ以上の独立して選択されるハロゲン、C₁-C₄アル
キル基、C₁-C₄アルコキシ基で任意に置換されたC₆〜C₈アリール基；で任意に置換された5
又は6員の複素環；
（i）1つ以上の独立して選択されるハロゲン、オキソ基、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロ
アルキル基又はC₁-C₄アルコキシ基で任意に置換された2〜3環構造を有する複素環基；

（j）又は、R₄が結合である場合を含むR₄と一緒になったW、及びR₄とWが結合される複
素環が、11〜13員のヘテロ三環構造を形成する；
式中、R_xは、水素、C₁-C₆アルキル基であるか、又はR_x及びR_yは、これらが結合される
原子と共に4〜7員の炭素環又は複素環を形成し；
R_yは、水素、C₁-C₆アルキル基；1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキル基で任意
に置換されたアリール基であるか、又はR_x及びRは、これらが結合される原子と共に4〜7
員の炭素環又は複素環を形成し；並びに、
R_Zは、アリール又はハロゲンで任意に置換されたC₁-C₆アルキル；又はハロゲン、C₁-C₆
アルキル若しくはC₁-C₆アルコキシで任意に置換されたアリールである。
式Vの好ましい化合物を下記の表5に記載してある。

式Vの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMarch
, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry; Re
actions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの化
合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成
方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式Vの化合物を調製するための具体的方法は、2005年10月13日に出願の国際出願第PCT/U
S05/036673号に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式VIの化合物又はその医薬とし
て許容し得る塩、水和物、クラスレート、プロドラッグ、多形、エナンチオマー、ジアス
テレオマー、ラセミ化合物若しくは立体異性体の混合物を含む立体異性体である：

式中、
W、X、Y及びZは、独立して、N又はC-R_aから選択され、式中R_aは、水素又はC₁-C₄アルキ
ル基であり、式中W、X、Y又はZの少なくとも１つは、Nであり；
nは、0、1、2又は3であり；
R¹は、シアノ基；1つ若しくは2つの C₁-C₄アルキル基で任意に置換されたカルバモイル
；又はヒドロキシ、C₁-C₄アルキル若しくはC-C₄アルコキシ基で置換されたカルボニル基
であり；

Rは、ヒドロキシ基；ハロゲン；1つ以上の独立して選択されるハロゲン又はヒドロキシ
基で任意に置換されたC₁-C₄アルキル；1つ以上の独立して選択されるハロゲン又はフェニ
ル基で任意に置換されたC₁-C₄アルコキシ； 1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキル
基で任意に置換されたC₄-C₈シクロアルキル；-R_b基；-O-R_b基；1つ以上の独立して選択さ
れるC₁-C₄アルキル、オキソ、又は-R_b基で任意に置換された5〜6員の複素環；二環構造を
有する9〜10員の複素環；ヒドロキシ、C₁-C₄アルキル又はC₁-C₄アルコキシ基で置換され
たカルボニル；1つ又は2つのC₁-C₄アルキル基で任意に置換されたカルバモイル；ニトロ
基；シアノ基；ヒドロキシ、C₁-C₄アルキル又は-R_b基で任意に置換されたチオ；ヒドロキ
シ、C₁-C₄アルキル又は-R_b基で任意に置換されたスルホニル；1つ若しくは2つの独立して
選択されるC₁-C₄アルキル、スルホニル又はカルボニル基で任意に置換されたアミノであ
って、式中アミノスルホニル基は、ヒドロキシ、C₁-C₄アルキル又は-R_b基で任意に置換さ
れており、及び式中アミノカルボニルは、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄ハロアルキル、ベンゾオ
キシ、又は-R_b基で任意に置換されたアミノ基で任意に置換されており；又は、2つのR基
は、これらが結合されるフェニル環と共にベンゾ[1,3]ジオキソール若しくは2,3-ジヒド
ロ-ベンゾ[1 ,4]ジオキシニル基を形成し、式中-R_bは、以下の1つ以上で任意に置換され
たC₆-C₈アリールである：ヒドロキシ、ハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロアルキル
基、C₁-C₄アルコキシ基、又は1つ以上のC₁-C₄アルキル基で任意に置換されたアミノ基。
式VIの好ましい化合物を下記の表6に記載してある：

式VIの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMarc
h, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry; R
eactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの化
合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成
方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式VIの化合物を調製するための具体的方法は、2005年10月13日に出願の国際出願第PCT/
US05/036764号に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式VIの化合物又はその医薬とし
て許容し得る塩、水和物、クラスレート、プロドラッグ、多形、エナンチオマー、ジアス
テレオマー、ラセミ化合物若しくは立体異性体の混合物を含む立体異性体である：

式中、
A₁は、C、CH又はNであり；
V及びXは、独立してN又はCから選択され；
Wは、N、C又はCHから選択され；

式中、V、W又はXの少なくとも一つは、Nであり、かつ式中、WがNである場合、V又はXの
少なくとも一つは、またNであり；
Y及びZは、独立して、N、C、C-R_c、C=O、C=Sから選択され、式中、R_cは、H、CH₃又はNH
であり；ただし、Y又はZの一方が、C=O又はC=Sであるときは、他方は、またNH、S又はOか
ら選択されてもよいことを条件とし；
R¹は、カルボキシ、シアノ、又はC₁-C₄アルコキシ基で任意に置換されたカルボニル基
であり、
R²は、無し又はニトロであり；

Ar₁は、R基で任意に置換されたC₁〜C₄アルキル；1、2又は3つの独立して選択されるR基
で任意に置換されたC₆〜C₁₀アリール；1、2又は3つの独立して選択されるR基で任意に置
換された5〜10員の複素環であるか；Ar₂と一緒になったAr_1、及びAr₁とAr₂が結合される
複素環がAr_1-2から選択される環構造を形成するか；又はAr₃と一緒になったAr_1、及びAr₁
とAr₃が結合される複素環がAr_1-3から選択される環構造を形成し；
Ar₂は、無し、又はAr₁と一緒になったAr_2、及びAr₁とAr₂が結合される複素環がAr_1-2か
ら選択される環構造を形成するか；
Ar₃は、無し、又はAr₁と一緒になったAr₃及びAr₁とAr₃が結合される複素環がAr_1-3から
選択される環構造を形成するか；
Ar₄は、無しであるか；又は、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄アルコキシ若しくはC₁-C₄チオアル
キルであるか、又はA₁と共に、4〜7員の炭素環若しくは複素環を形成するいずれかであり
；

Rは、水素；-R_a基；又は2つのR基であり、式中Rは、またオキシ基を含んでいてもよく
：これらが結合されるフェニル又は複素環と共にRRから選択される環構造を形成してもよ
く；
式中、
Ar_1-2及びAr_1-3は、1つ以上のハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロアルキル基、ハ
ロゲン若しくはC₁-C₄アルコキシ基で任意に置換されたC₁-C₄アルコキシ基、C₁-C₄ハロア
ルコキシ基、又はC₁-C₄アルキル基で置換されたカルボニル基で任意に置換されたアミノ
基、で任意に置換された11〜14員のヘテロ三環構造から選択され；
RRは、1つ以上のハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロアルキル基、C₁-C₄アルコキシ
基、オキソ基、又はC₁-C₄ハロアルコキシ基で任意に置換された9〜10員の二環式環構造で
あり；

R_aは：ヒドロキシ基；ハロゲン；1つ以上の独立して選択されるハロゲン又はヒドロキ
シ基で任意に置換されたC₁-C₄アルキル；1つ以上の独立して選択されるハロゲン又はフェ
ニル基で任意に置換されたC₁-C₄アルコキシ；1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキ
ル基で任意に置換されたC₄-C₈シクロアルキル；-R_b基；-O-R_b基；1つ以上の独立して選択
されるC₁-C₄アルキル、オキソ又は-R_b基で任意に置換された4〜6員の複素環；二環構造を
有する9〜10員の複素環；ヒドロキシ、C₁-C₄アルキル又はC₁-C₄アルコキシ基で任意に置
換されたカルボニル；1つ若しくは2つのC₁-C₄アルキル基で任意に置換されたカルバモイ
ル；ニトロ基；シアノ基；ヒドロキシ、C₁-C₄アルキル又は-R_b基で任意に置換されたチオ
；ヒドロキシ、C₁-C₄アルキル又は-R_b基で任意に置換されたスルホニル；又は1つ若しく
は2つの独立して選択されるC₁-C₄アルキル、スルホニル又はカルボニル基で任意に置換さ
れたアミノであって式中アミノスルホニル基は、ヒドロキシ、C₁-C₄アルキル又は-R_b基で
任意に置換されており、及びアミノカルボニル基は、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄ハロアルキル
、ベンゾオキシ、又は-R_b基で任意に置換されたアミノ基で任意に置換されている；から
なる群から選択され、並びに、
式中、-R_bは、以下の1つ以上で任意に置換されたC₆-C₈アリールである：ヒドロキシ、
ハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-C₄ハロアルキル基、C₁-C₄アルコキシ基、又は1つ以上の
C₁-C₄アルキル基で任意に置換されたアミノ基。
式VIIの好ましい化合物は、下記の表7に記載してある：

式VIIの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMar
ch, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry;
Reactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの
化合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合
成方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式VIIの化合物を調製するための具体的方法は、2005年10月13日に出願の国際出願第PCT
/US05/036761号に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式VIIIの化合物又はその医薬と
して許容し得る塩、水和物、クラスレート、プロドラッグ、多形、エナンチオマー、ジア
ステレオマー、ラセミ化合物若しくは立体異性体の混合物を含む立体異性体である：

式中、
Y及びZは、独立してN又はCから選択され；
Wは、N又はCHであり；
nは、0、1、2又は3であり；

R₁は、水素、カルボキシ基で任意に置換されたC₆-C₈アリールであるか、又はZがNであ
るときにR¹は存在せず；
R₂は、水素；1、2又は3つの独立して選択されるR_a基で任意に置換されたC₆〜C₈アリー
ル；1つ以上の独立して選択されるC₁-C₆アルキル基又は3〜7員の複素環で任意に置換され
た4〜7員の複素環であるか；又はYがNであるときに、R²は存在せず；
Rは、独立して以下から選択され：ハロゲン；カルボキシ基；4〜7員の複素環、C₆-C₈ア
リールオキシ基、又はアミノ基で任意に置換されたC₁-C₆アルキル基（式中4〜7員の複素
環、C₆-C₈アリールオキシ基、及びアミノ基は、1つ若しくは2つの独立して選択されるC₁-
C₆アルキル、又はC₆-C₈アリール基が1つ以上のC₁-C₆アルキル基で任意に、かつ独立して
置換されたC₆-C₈アリール基で任意に置換されている）；C₁-C₆アルコキシ；C₆-C₈アリー
ルオキシ；1つ以上の独立して選択されるハロゲン、C₁-C₄アルキル、C₁-C₄ハロアルキル
、オキシ、C₁-C₄アルコキシ又はC₁-C₄ハロアルコキシ基で任意に置換されたC₆-C₈アリー
ル；ヒドロキシ、C₆-C₈アリール、又は二環構造を有する9〜10員の複素環で任意に置換さ
れた、1つ若しくは2つの独立して選択されるC₆-C₈アリール又はC₁-C₆アルキル基で任意に
置換されたアミノ基；5〜6員の複素環基で置換されたカルボニル基；もう１つのC₁-C₄ア
ルキル又はオキソ基で任意に置換された4〜7員の複素環基；二環構造を有する9〜10員の
複素環；又は2つのR基（式中Rは、またオキシ基を含んでいてもよい）が、これらが結合
される複素環と共に、三環構造を有する12〜13員の複素環を形成する；であり、並びに、

式中R_aは、ハロゲン；C₁-C₆アルキル；1つ以上の独立して選択されるハロゲン基で任意
に置換されたC₁-C₆アルコキシ；C₆-C₈アリール；1つ以上の独立して選択されるオキソ基
で任意に置換された4〜7員の複素環；ヒドロキシ若しくはC₁-C₆アルコキシ基で任意に置
換されたカルボニル；カルバモイル；独立して選択されるC₁-C₆アルキル基で任意に置換
されたアミノ（式中C₁-C₆アルキル基は、1つ以上の独立して選択されるハロゲン若しくは
ヒドロキシル基で任意に置換されている）；又は2つのR_a基（式中R_aは、またオキシ基を
含んでいてもよい）が、これらが結合されるC₆-C₈アリール基と共に、二環構造を有する9
〜10員の複素環を形成する）であり、式中二環構造を有する9〜10員の複素環は、1つ以上
の独立して選択されるハロゲンで任意に置換されている。
式VIIIの好ましい化合物を下記の表8に記載してある。

VIIIの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMarc
h, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry; R
eactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの化
合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成
方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式VIIIの化合物を調製するための具体的方法は、2005年10月13日に出願の国際出願第PC
T/US05/036762号に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

別の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子は、式IXの化合物又はその医薬とし
て許容し得る塩、水和物、クラスレート、プロドラッグ、多形、エナンチオマー、ジアス
テレオマー、ラセミ化合物若しくは立体異性体の混合物を含む立体異性体である：

式中、
Xは、ハロゲンであり；
Rは、C₁-C₈アルキル基；C₁-C₄ハロアルキル基；-OR₁基；又は1つ若しくは2つの独立し
て選択されるR₂基で任意に置換されたアミノ基であり；

R₁は、1つ以上の独立して選択されるR_a基で任意に置換されたC₁-C₈アルキル基；-R_b基
；1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキル又はオキソ基で任意に置換されたピロリジ
ニル基；1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキル基、ベンジル基、又は1つ以上のC₁-
C₄アルキル若しくはC₁-C₄アルコキシ基で任意に置換されたカルボキシ基で任意に置換さ
れたピペリジル基；テトラヒドロフリル基；テトラヒドロピラニル基；テトラヒドロナフ
チル基；又はインダニル基;であり
R₂は、水素、C₁-C₆アルキル基；C₁-C₄ハロアルキル基；C₁-C₄アルコキシ基；-R_b基；ピ
リミジニル基；ピリジル基；-R_b基で任意に置換されたスルホニル基であるか；又は2つの
R₂基は、これらが結合されるアミノと共に、フェニル基で任意に置換されたモルホリニル
基、ピロリジニル基、イソインドリニル基又はピペラジニル基を形成し；

式中、R_aは、ハロゲン；C₁-C₄アルコキシ基；1つ若しくは2つの独立して選択されるC₁-
C₄アルキル又はC₁-C₄アルコキシ基で任意に置換されたカルバモイル基；1つ若しくは2つ
の独立して選択されるC₁-C₄アルキル又はC₁-C₄アルコキシ基で任意に置換されたホスフィ
ノイル基；モルホリニル基；ピリジル基；又は-R_b基であり；並びに、
式中R_bは、以下の独立して選択される：ヒドロキシ、ハロゲン、C₁-C₄アルキル基、C₁-
C₄ハロアルキル基、C₁-C₄アルコキシ基、又は1つ以上の独立して選択されるC₁-C₄アルキ
ル基で任意に置換されたアミノ基；の1つ以上で任意に置換されたC₆-C₈アリールである。
式IXの好ましい化合物を下記の表9に記載してある。

式IXの化合物は、標準的な、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例えばMarc
h, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chemistry; R
eactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って、式Iの化
合物及び中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は公知の合成
方法及び試薬を使用して市販の材料から調製することができる。
式IXの化合物を調製するための具体的方法は、2005年10月13日に出願の国際出願第PCT/
US05/037052号に開示されており、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる。

本明細書に記述した化合物のナンセンスコドン抑制因子活性は、第5.4節に記述される
リポーターアッセイ法を使用して測定することができる。具体的実施態様において、本明
細書に記述した化合物のナンセンスコドン抑制因子活性は、293Tヒト胚腎臓細胞に安定に
トランスフェクトされた、UGA中途での終止コドンを含むルシフェラーゼリポーター構築
物を含む細胞に基づいたルシフェラーゼリポーターアッセイ法を使用して測定することが
できる。中途での終止コドンのリードスルーが可能であることが公知の小分子の3-[3-(4-
イソプロピル-フェニル）-2,5-ジオキソ-イミダゾリジン-1-イル]-安息香酸を内部標準と
して使用してもよい。活性測定は、細胞において所与のタンパク質を産生するために必要
とされる化合物の最小濃度（能力）と細胞によって産生されるタンパク質の最大量（有効
性）との間の定性的な関係に基づく。
細胞に基づいたルシフェラーゼアッセイ法においてタンパク質合成の有意な能力若しく
は有効性又は両方がより少ない化合物は、なおも本発明のインビボ法において有用性を有
することが考えられる。

（5.3 例示的化合物の合成及び調製）
本明細書に記述した例示的化合物は、周知の合成の方法論を介して得ることができ、例
えばMarch, J.の文献、上級有機化学；反応メカニズム及び構造（Advanced Organic Chem
istry; Reactions Mechanisms, and Structure）、第4版、1992を参照されたい。従って
、本明細書に記述した例示的化合物及びその中間体を調製するために有用な出発材料は、
市販されているか、又は公知の合成方法及び試薬を使用して市販の材料から調製すること
ができる。
本明細書に記述した例示的化合物を得るための具体的方法は、2004年4月8日に公開され
たUS2004／006790O、2004年1月29日に公開されたWO2004/009558 A2、2004年1月29日に公
開されたWO2004/009533 A1、2004年10月14日に公開されたUS2004-0204461 Al、2005年10
月13日に出願された国際出願番号PCT/US2005/036673、2005年10月13日に出願された国際
出願番号PCT／US2005／037052、2005年10月13日に出願された国際出願番号PCT/US2005/03
6764、2005年10月13日に出願された国際出願番号PCT/US2005/036762及び2005年10月13日
に出願された国際出願番号PCT/US2005/036761において少なくとも記述されており、これ
らのそれぞれは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。

（5.4 ナンセンスコドン抑制薬を同定するための方法）
中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介したmRNA減衰を抑制する化合物は、当業
者に公知の技術を使用して同定することができる。例えば、「中途での翻訳終結及びナン
センスを媒介したmRNA減衰を調整する小分子を同定するための方法」の表題の2005年10月
20日に公開された米国公開公報第2005/0233327号；「中途での翻訳終結及びナンセンスを
媒介したRNA減衰を阻害する化合物をアッセイする方法」の表題の米国特許第6,458,538号
；「中途での翻訳終結及びナンセンスを媒介したRNA減衰を阻害する化合物をアッセイす
る方法」の表題の2003年1月9日に公開された米国公開番号2003/0008317；及び「中途での
翻訳終結及びナンセンスを媒介したRNA減衰を阻害する化合物をアッセイする方法」の表
題の国際出願公開番号WO2004/010106を参照されたい。これらのそれぞれは、その全体が
参照により本明細書に組み込まれる。特に、細胞に基づいたアッセイ法又は無細胞アッセ
イ法は、中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介したmRNA減衰を抑制する化合物の
同定のために使用することができる。

一つの実施態様において、本発明は、中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介し
たmRNA減衰を抑制する化合物を同定するため方法であって：（a）化合物又は化合物のラ
イブラリーのメンバーを、リポーター遺伝子を含む核酸配列を含む細胞と接触させる工程
であって、該リポーター遺伝子は、中途での終止コドンを含む、前記工程；及び（b）前
記リポーター遺伝子の発現を検出する工程；を含み、中途での翻訳終結及び／又はナンセ
ンスを媒介したmRNA減衰を抑制する化合物は、化合物の存在下において前記リポーター遺
伝子の発現及び／又は活性が、前もって決定された参照範囲又は前記化合物の非存在下若
しくは適切な対照（例えば、負の対照）の存在下における前記リポーター遺伝子の発現及
び／又は活性と比較して増加する場合に、同定される、前記方法を提供する。別の実施態
様において、本発明は、中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介したmRNA減衰を抑
制する化合物を同定するため方法であって：（a）化合物又は化合物のライブラリーのメ
ンバーを、無細胞抽出液及びリポーター遺伝子を含む核酸配列と接触させる工程であって
、該リポーター遺伝子は、中途での終止コドンを含む、前記工程；及び（b）前記リポー
ター遺伝子の発現を検出する工程；を含み、中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒
介したmRNA減衰を抑制する化合物は、化合物の存在下における前記リポーター遺伝子の発
現及び／又は活性が、前もって決定された参照範囲又は前記化合物の非存在下若しくは適
切な対照（例えば、負の対照）の存在下における前記リポーター遺伝子の発現及び／又は
活性と比較して増加する場合に同定される、前記方法を提供する。この実施態様によれば
、細胞抽出物は、約O℃〜約10℃にてインキュベートされた細胞及び／又はS10〜S30無細
胞抽出液から単離されてもよい。

本発明によれば、本明細書に記述したリポーター遺伝子に基づいたアッセイ法における
化合物を、細胞、又は無細胞抽出液及び核酸配列と接触させる工程は、好ましくは緩衝液
及び塩の組み合わせ（KCl、NaCl及び／又はMgCl₂など）を含む水溶液中で行われる。水溶
液に使用されるそれぞれの塩の最適濃度は、例えば核酸配列によってコードされるタンパ
ク質、ポリペプチド又はペプチド（例えば、調節タンパク質）及び使用される化合物に依
存し、かつルーチン試験を使用して決定することができる。具体的実施態様において、水
溶液は、生理的条件に近いか、又は似ている。別の特定の実施態様において、水溶液は、
洗浄剤又は界面活性物質を更に含む。

本発明のアッセイ法は、異なるインキュベーション時間を使用して行うことができる。
細胞に基づいた系において、細胞及び化合物又は化合物のライブラリーのメンバーは、リ
ポーター遺伝子の発現及び／又は活性が測定される前に、少なくとも0.2時間、0.25時間
、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時
間、少なくとも1日、少なくとも2日又は少なくとも3日間、共にインキュベートしてもよ
い。無細胞系において、無細胞抽出液及び核酸配列（群）（例えば、リポーター遺伝子）
は、化合物又は化合物のライブラリーのメンバーの添加の前に、共にインキュベートする
ことができる。特定の実施態様において、無細胞抽出液は、化合物又は化合物のライブラ
リーのメンバーの添加の少なくとも0.2時間、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、3時間
、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間又は少なくとも1日前に、核酸
配列（群）（例えば、リポーター遺伝子）と共にインキュベートされる。その他の実施態
様において、無細胞抽出液又は核酸配列（群）（例えば、リポーター遺伝子）は、それぞ
れ核酸配列（群）（例えば、リポーター遺伝子）又は無細胞抽出液の添加の前に、化合物
又は化合物のライブラリーのメンバーと共にインキュベートされる。特定の実施態様にお
いて、化合物又は化合物のライブラリーのメンバーは、それぞれ残りの成分、すなわち無
細胞抽出液又は核酸配列（群）（例えば、リポーター遺伝子）の添加の前に、少なくとも
0.2時間、0.25時間、0.5時間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10
時間、12時間、18時間又は少なくとも1日間、核酸配列（群）（例えば、リポーター遺伝
子）又は無細胞抽出液と共にインキュベートされる。一旦反応器が、成分、すなわち、化
合物又は化合物のライブラリーのメンバー、無細胞抽出液及び核酸配列（群）（例えば、
リポーター遺伝子）を含んだら、反応を少なくとも0.2時間、0.25時間、0.5時間、1時間
、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間又は少なくとも
1日間更にインキュベートしてもよい。

リポーター遺伝子に基づいたアッセイ法における反応の進行は、連続的に測定すること
ができる。或いは、時点を反応の異なる時間にて取って、リポーター遺伝子に基づいたア
ッセイ法の反応の進行度をモニターしてもよい。
本明細書に記述したリポーター遺伝子に基づいたアッセイ法は、リポーター遺伝子を発
現するように遺伝的に操作された細胞において行われてもよい。或いは、本明細書に記述
したリポーター遺伝子に基づいたアッセイ法は、遺伝子のコード領域にナンセンス突然変
異を含むリポーター遺伝子を天然に発現する細胞において行われてもよい。当業者に周知
の任意の種の任意の細胞又は株化細胞を本発明の方法に従って利用してもよい。更に、無
細胞抽出液は、当業者に周知の任意の種の任意の細胞又は株化細胞に由来してもよい。細
胞及び細胞型の例には、ヒト細胞、培養されたマウス細胞、培養されたラット細胞又はチ
ャイニーズハムスター卵巣（「CHO」）細胞を含むが、限定されない。

本明細書に記述したリポーター遺伝子に基づいたアッセイ法に利用されるリポーター遺
伝子構築物は、リポーター遺伝子のコード領域と、中途での翻訳終結及び／又はナンセン
スを媒介したmRNA減衰を生じる中途での終止コドンとを含んでいてもよい。好ましくは、
中途での終止コドンは、リポーター遺伝子の天然の終止コドンに対してN末端にあり、か
つ中途での終止コドンの抑制が容易に検出可能であるように位置する。具体的実施態様に
おいて、本明細書に記述したリポーター遺伝子に基づいたアッセイ法に利用されるリポー
ター遺伝子構築物は、リポーター遺伝子のオープンリーディングフレームに開始コドンか
ら少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは25〜50ヌクレオチド、50〜75ヌクレオチド、75
〜100ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜500ヌクレオチド、100〜750ヌクレオ
チド又は100〜1000ヌクレオチドにおいて中途での終止コドンを含むリポーター遺伝子の
コード領域を含む。別の実施態様において、本明細書に記述したリポーター遺伝子に基づ
いたアッセイ法に利用されるリポーター遺伝子構築物は、リポーター遺伝子のオープンリ
ーディングフレームの天然の終止コドンから少なくとも15ヌクレオチド、好ましくは25〜
50ヌクレオチド、50〜75ヌクレオチド、75〜100ヌクレオチド、100〜150ヌクレオチド、1
50〜300ヌクレオチド、300〜500ヌクレオチド、500〜750のヌクレオチド又は500〜1000ヌ
クレオチドにおいて中途での終止コドンを含むリポーター遺伝子のコード領域を含む。別
の実施態様において、本明細書に記述したリポーター遺伝子に基づいたアッセイ法に利用
されるリポーター遺伝子構築物は、UAG及び／又はUGAの中途での終止コドンを含むリポー
ター遺伝子のコード領域を含む。更に別の実施態様において、本明細書に記述したリポー
ター遺伝子に基づいたアッセイ法に利用されるリポーター遺伝子構築物は、UGAA、UGAC、
UGAG、UGAU、UAGA、UAGC、UAGG、UAGU、UAAA、UAAC、UAAG又はUAAUの前後関係で、中途で
の終止コドンを含むリポーター遺伝子のコード領域を含む。

当業者に周知の任意のリポーター遺伝子を、本明細書に記述したリポーター遺伝子構築
物に利用してもよい。リポーター遺伝子を得てもよく、エレメントのヌクレオチド配列を
当業者に周知の任意の方法によって決定してもよい。リポーター遺伝子のヌクレオチド配
列は、例えばGenBankなどの文献又はデータベースから得ることができる。或いは、リポ
ーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、適切な供与源からの核酸から産生しても
よい。一旦リポーター遺伝子のヌクレオチド配列が決定されると、リポーター遺伝子のヌ
クレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための周知の方法、例えば組換えDNA技術
、部位定方向突然変異誘発、PCR、その他（例えば、Sambrookらの文献、1990、分子クロ
ーニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）、第2版、Col
d Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY及びAusubelらの文献、編、1998
、分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、John W
iley & Sons、NYに記述された技術を参照されたい。これらは、両方ともその全体が本明
細書に参照により組み込まれる）を使用して操作し、異なるアミノ酸配列を有するリポー
ター遺伝子を産生すること、例えばアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を作製することが
できる。

具体的実施態様において、リポーター遺伝子は、中途での終止コドンを有する任意の天
然に存在する遺伝子である。本発明に有用である中途での終止コドンを有する遺伝子は、
本明細書に記述した遺伝子を含むが、限定されない。代わりの実施態様において、リポー
ター遺伝子は、中途での終止コドンを含むことが天然において知られていない任意の遺伝
子である。リポーター遺伝子の例には、ホタルルシフェラーゼをコードする遺伝子、ウミ
シイタケルシフェラーゼをコードする遺伝子、コメツキムシルシフェラーゼをコードする
遺伝子、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、黄色蛍光タンパク質をコードする遺伝
子、赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、シアン蛍光タンパク質をコードする遺伝子
、青色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、β‐ガラクトシダーゼをコードする遺伝子、
β-グルコロニダーゼをコードする遺伝子、β‐ラクタマーゼをコードする遺伝子、クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びアルカリホスファ
ターゼをコードする遺伝子を含むが、限定されない。

本明細書に記述したアッセイ法に利用される化合物は、化合物のライブラリーのメンバ
ーであってもよい。一つの実施態様において、化合物は、ペプトイド；ランダムバイオオ
リゴマー；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドなどのダイバーソーム（dive
rsomers）；ビニローグポリペプチド；非ペプチド性ペプチド擬態；オリゴカルバメート
；ペプチジルホスホナート；ペプチド核酸ライブラリー；抗体ライブラリー；炭水化物ラ
イブラリー；及び小有機分子ライブラリー；を含む化合物の組み合わせライブラリーから
選択される。具体的実施態様において、小有機分子ライブラリーは、ベンゾジアゼピン、
イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ化合物又は
ジアゼピンジオンのライブラリーである。
特定の実施態様において、化合物は、プールにおいてスクリーニングされる。一旦ポジ
ティブプールが同定されたら、そのプールの個別の化合物を別々に試験する。特定の実施
態様において、プールサイズは、少なくとも2つ、少なくとも5つ、少なくとも10、少なく
とも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200
、少なくとも250又は少なくとも500の化合物である。

タンパク質の発現を測定するために当該技術分野において公知の任意の方法を使用して
、本発明に従って産生される機能的リードスルータンパク質の発現を測定してもよい。こ
のような方法の非限定的な例には、ウエスタンブロット、免疫沈降に続くドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）、免疫細胞化学、放射免疫アッ
セイ法、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ法、免疫沈
降アッセイ法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法アッセイ法、凝集アッセイ法、
補体結合アッセイ法、免疫放射線アッセイ法、蛍光免疫法、プロテインA免疫アッセイ法
、及び関心対象の遺伝子によってコードされるポリペプチドに対して特異的である抗体を
使用するエピトープタグなどの免疫アッセイ法を含む。特定の実施態様において、免疫ア
ッセイ法に使用される抗体は、免疫アッセイ法に使用されるポリペプチドのC末端部分に
対して特異的である。このようなアッセイ法には、当該技術分野においてルーチンかつ周
知である（例えば、Ausubelらの文献、編、1994、分子生物学の現在のプロトコル（Curre
nt Protocols in Molecular Biology）、第1巻、John Wiley & Sons社、New Yorkを参照
されたい。これは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる）。例示的な免疫アッ
セイ法を簡単に下記に記述してある（しかし、限定することは意図されない）。

免疫沈降プロトコルには、一般にプロテインホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻
害剤（例えば、EDTA、PMSF、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補ったRIPA緩衝
液（1% NP-40又はTriton X-100、1% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、0.15M NaC
l、pH 7.2にて0.01M リン酸ナトリウム、1% トラジロール）などの溶解緩衝液において細
胞集団を溶解すること、細胞可溶化物に抗原を認識する抗体を添加すること、40℃にてし
ばらくの間（例えば、1〜4時間）インキュベートすること、細胞可溶化物にプロテインA
及び／又はタンパク質Gセファロースビーズを添加すること、40℃にて約1時間以上の間イ
ンキュベートすること、溶解緩衝液注でビーズを洗浄すること、及びSDS／試料緩衝液に
ビーズを再懸濁することを含む。例えば、抗体が特定の抗原を免疫沈降する能力は、ウエ
スタンブロット分析によって評価することができる。当業者であれば、抗原に対する抗体
の結合を増大させ及びバックグランドを減少させるために修飾することができるパラメー
ター（例えば、セファロースビーズでの細胞可溶化物の事前の洗浄）に関して精通してい
るであろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察についてはAusubelらの文献、編
、2003、分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、
第1巻、John Wiley & Sons社、New York、第10章を参照されたい。

ウエスタンブロット分析は、一般に、タンパク質試料を調製すること、ポリアクリルア
ミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて8%〜20% SDS-PAGE）におけるタンパク質試料の
電気泳動、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、PVDF又はナイロンなどの膜へ
タンパク質試料を転写すること、ブロッキング溶液（例えば、3% BSA又は脱脂乳を含むPB
S）中で膜をブロッキングすること、洗浄緩衝液（例えば、PBS-Tween 20）中で膜を洗浄
すること、ブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体（抗原を認識する抗体）で膜をブロ
ッキングすること、洗浄緩衝液で膜を洗浄すること、ブロッキング緩衝液中に希釈した酵
素の基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）又は放射
性分子（例えば、³²P又は¹²⁵I）に抱合された二次抗体（これは、一次抗体、例えば抗ヒ
ト抗体を認識する）で膜をブロッキングすること、洗浄緩衝液で膜を洗浄すること及び抗
原の存在を検出することを含む。当業者であれば、検出されるシグナルを増大するために
及びバックグラウンドノイズを減少させるために修飾することができるパラメーターに関
して精通しているであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる考察につい
ては、Ausubelらの文献、編、2003、分子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols
in Molecular Biology）、第1巻、John Wiley & Sons社、New York、第10章を参照され
たい。

ELISAには、抗原を調製すること、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原
でコーティングすること、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ
ホスファターゼ）などの検出可能な化合物に抱合された一次抗体（これは、抗原を認識す
る）をウェルに添加して及びしばらくの間インキュベートすること、並びに抗原の存在を
検出することを含む。ELISAでは、関心対象の抗体は、検出可能な化合物に抱合されるこ
とが必要ではなく；その代わりに、検出可能な化合物に抱合された第二抗体（これは、一
次抗体を認識する）をウェルに添加してもよい。更に、ウェルを抗原でコーティングする
代わりに、抗体をウェルに被覆させていてもよい。この場合、検出可能な化合物に抱合さ
れた第二抗体を、関心対象の抗原を被覆したウェルに添加した後に添加してもよい。当業
者であれば、検出されるシグナルを増大させるために修飾することができるパラメーター
、並びに当該技術分野において公知のELISAのその他のバリエーションに関して精通して
いるであろう。ELISAに関するさらなる考察については、Ausubelらの文献、編、2003、分
子生物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、第1巻、Joh
n Wiley & Sons社、New York、第10章を参照されたい。

ナンセンス突然変異を含むリポーター遺伝子によってコードされる機能的リードスルー
タンパク質の活性を検出するための方法は、使用されるリポーター遺伝子によって変化す
るであろう。種々のリポーター遺伝子のためのアッセイ法が当業者には周知である。例え
ば、ルシフェラーゼ、β‐ガラクトシダーゼ（「β-gal」）、β-グルクロニダーゼ（「G
US」）、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」
）及びアルカリホスファターゼ（「AP」）は、基質の存在下において解析することができ
、かつハイスループットスクリーニングに適用することができるであろう酵素である。例
えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ（「β-gal」）及びアルカリホスファター
ゼ（「AP」）の反応生成物は、光イメージング（例えば、ルシフェラーゼ）、分光光度計
の吸光度（例えば、β-gal）又は蛍光（例えば、AP）の変化によってアッセイされる。光
出力、吸光度及び／又は蛍光の変化のためのアッセイ法は、ハイスループットスクリーニ
ングのために容易に適応される。例えば、β-gal活性は、マイクロプレートリーダーで測
定することができる。緑色蛍光タンパク質（「GFP」）活性は、蛍光の変化によって測定
することができる。例えば、488nmにて蛍光を発する突然変異体GFPの場合、標準的な蛍光
標示式細胞分取器（「FACS」）を使用して、GFP活性に基づいて細胞を分離することがで
きる。

以下には、細胞に基づいたリポーター遺伝子アッセイ法の具体例を記述する：ルシフェ
ラーゼを媒介した化学発光に基づいた翻訳リードスルーのレベルの定量的評価を可能にす
るリポーター構築物を調製する。培地（例えば、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地）にお
いて培養した細胞（例えば、HEK 293細胞）には、アミノ酸位190に中途での終止コドンを
含む北アメリカホタルルシフェラーゼ遺伝子を安定にトランスフェクトする。通常この部
位にて存在するスレオニンコドン（アデノシン-シチジン-アデノシン（ACA））の代わり
に、3つの可能なナンセンスコドン（UAA、UAG又はUGA）のそれぞれ及びナンセンスコドン
に続く前後関係上重要な下流の+1の位置の4つの可能なヌクレオチド（C、U、A、G）のそ
れぞれを、部位特異的変異誘発によって導入する。図1は、これらの構築物に組み込まれ
た数種類のルシフェラーゼmRNAの図を提供する。種々の濃度の関心対象の化合物、正の対
照（例えば、ゲンタマイシン）又は負の対照（例えば、溶媒単独（例えば、PBS、DMSO又
は水））を細胞に添加して、産生される発光の量をおよそ4時間後に決定する。発光は、V
iewLux CCDイメージャー（Perkin-Elmer、Turku、Finland）を使用して決定する。発光デ
ータを溶媒単独によって産生されるものに対して規準化して、バックグランド以上の抑制
倍数を化合物_光単位／溶媒_光単位として算出する。

対照細胞（溶媒のみで処理した）では、ルシフェラーゼ遺伝子の翻訳は、ルシフェラー
ゼmRNAにおける中途での終止コドンの存在下で中断されて、化学発光反応を効率的に触媒
することができない、切断された機能しないルシフェラーゼタンパク質が産生される。し
かし、中途での終止コドンのリボソームのリードスルーを誘導することができる化合物の
存在下では、全長ルシフェラーゼタンパク質が産生され、対照と比較した対応する発光を
定量化することができる。
以下は、無細胞リポーター遺伝子アッセイ法の具体例を記述する：位置190にて中途で
の終止コドンを有するルシフェラーゼmRNA（+1Aをもつ）をMegaScriptインビトロT7-プロ
モーター転写キット（Ambion、Austin、TX）を使用して調製する。mRNAを、リボソーム及
び翻訳のために必要なその他の細胞因子を含む細胞（例えば、HeLa細胞）から調製した細
胞質抽出物と共にインキュベートする。種々の濃度の関心対象の化合物、正の対照（すな
わち、ナンセンス抑制活性を有する化合物）又は負の対照（例えば、溶媒単独（例えば、
PBS、DMSO又は水））をインビトロでの反応に添加して、産生される発光の量をおよそ4時
間後に決定する。発光は、ViewLux CCDイメージャー（Perkin-Elmer、Turku、Finland）
を使用して決定する。発光データを溶媒単独によって産生されるものに対して規準化して
、バックグランド以上の抑制倍数を化合物_光単位／溶媒_光単位として算出する。

対照細胞（溶媒のみで処理した）では、ルシフェラーゼmRNAの翻訳は、ルシフェラーゼ
mRNAにおける中途での終止コドンの存在下で中断されて、化学発光反応を効率的に触媒す
ることができない、切断された機能しないルシフェラーゼタンパク質が産生される。しか
し、中途での終止コドンのリボソームのリードスルーを誘導することができる化合物の存
在下では、全長ルシフェラーゼタンパク質が産生され、対照と比較した対応する発光を定
量化することができる。核を含まない細胞質抽出物における全長ルシフェラーゼタンパク
質の産生を誘導することができる化合物は、化合物のナンセンスリードスルー活性が転写
レベルよりむしろ翻訳レベルで生じることを示す。
化合物のナンセン抑制活性は、例えばmdxマウスからの細胞などのヒト疾患に関連する
ナンセンス突然変異をもつ遺伝子を含む対象又は動物モデル由来の細胞において評価する
ことができる。mdxマウスは、ジストロフィンmRNAに中途でのUAA（+1A）終止コドンを産
生するジストロフィン遺伝子のエキソン23にナンセンス突然変異を有し（Sicinskiらの論
文、Science 244：1578-1580（1989））、全長タンパク質産生のほとんど完全な喪失を生
じる。

以下は、ヒト疾患に関連するナンセンス突然変異もつ遺伝子を含む動物モデル由来の細
胞を使用するリポーター遺伝子アッセイ法の具体例を記述する：初代筋芽細胞を、確立さ
れた方法を使用して1日令新生児mdxマウスから導き出す（Nevilleらの文献、編、細胞生
物学における方法（Methods in Cell Biology）、52巻、85-116ページ、San Diego、Acad
emic Press（1998）；及びBarton-Davisらの論文、J. Clin. Invest. 104 （4）：375-38
1 （1999））。プラスチックディッシュに接着後、細胞を血清添加培地中で筋管に分化さ
せ、これに関心対象の化合物又は正の対照（すなわち、ナンセンスコドン抑制活性をもつ
化合物）を添加する。培地及び化合物を一日おきに補って、細胞を12日にて免疫蛍光によ
ってジストロフィン及びミオシンについてアッセイする。それぞれの負及び正の対照には
、未処置mdx及び野生型C57／B16マウス初代筋肉培養を含んだ。染色度は、a-、+ 1、+2、
+3及び+4の半定量的スケールを使用して評価した。ナンセンス抑制活性を有する関心対象
の化合物は、全長ジストロフィンの産生を生じるであろう。

ヒト疾患に関連するナンセンス突然変異を有する遺伝子を含む動物モデル系を使用して
、リポーターアッセイ法において同定された化合物のナンセンスコドン抑制因子活性を確
認してもよい。例えば、化合物のナンセンスコドン抑制因子活性は、mdxマウス又はCFTR
マウスモデルにおいて評価してもよい。例えば、ヒト疾患のために動物モデル系のその他
の例については、国際公開WO2004/001010を参照されたい。これは、その全体が参照によ
り組み込まれる。
具体例において：mdxマウスには、2〜12週以上の期間の間、関心対象の化合物、正の対
照（すなわち、ナンセンスコドン抑制活性をもつ化合物）又は負の対照（例えば、媒体単
独）を投与する。全てのマウスには、Peptamen（登録商標）等張性液体成分栄養を摂食さ
せ（ネッスル）、血清CK活性は、市販のNADH連関反応速度アッセイ（Diagnostic Chemica
ls Limited, Oxford, CT）を使用して評価した。血清クレアチンキナーゼ（CK）測定のた
めの血液は、異なる間隔にて収集する。治療期間の終わりに、マウスを屠殺する。血液を
、血清CKレベルを評価するために収集される。前脛骨（TA）筋肉及び長指伸筋（EDL）筋
肉をその後の解析のために除去する。TAは、横紋筋へのジストロフィン組み込みの免疫蛍
光解析のために迅速に凍結させる。EDLは、伸張性収縮傷害に対する強度及び感受性を含
む機能試験のために利用する。

ジストロフィンのための一次抗体は、ヒトジストロフィンのカルボキシル末端の近くの
配列に対応する合成ペプチドに対して産生された市販のウサギポリクローナル抗体（Abea
m 15277）である。この抗体は、マウスジストロフィンと交差反応する。該エピトープは
、mdxマウスにおけるジストロフィン遺伝子のエキソン23によってコードされる中途での
停止の部位よりも、更に下流に（よりジストロフィンタンパク質のカルボキシ末端の方に
）位置する。イメージを落射蛍光顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを使用して取り込み
、・イメージ解析ソフトウェアで処理する。
単離された全筋肉力学系を、この目的のためにデザインされた装置を使用して（Barton
-Davisらの論文、PNA USA 95（26）：15603- 15607 （1998））、EDL筋肉（左右の標品を
作製することができる動物の両方のEDL筋肉を含む）で行った。EDLの比力（横断面領域の
単位あたりの力）を解析する。10%の最適な長さの伸長である一連の5回の伸張性収縮によ
って誘導される機械的傷害に対する保護を評価し；損傷は、最初と最後の伸張性収縮の間
の力の百分率喪失として決定される。
血清CK活性は、市販のNADH連関反応速度アッセイ（Diagnostic Chemicals Ltd., Oxfor
d, CT）を使用して評価される。

ナンセンスコドン抑制活性をもつ化合物で処理されたmdxマウスは、未処置のmdxマウス
からの筋肉と比較して、ジストロフィンのかなりの染色を示すであろう。ナンセンスコド
ン抑制活性をもつ化合物で処理されたmdxマウスは、未処置のmdxマウス又は媒体対照で処
理されたmdxマウスの平均EDL力と比較して、改善された平均EDL比力も有するだろう。ま
た、ナンセンスコドン抑制活性をもつ化合物で処理されたmdxマウスは、伸張性収縮傷害
を保護するであろう。更に、ナンセンスコドン抑制活性をもつ化合物で処理されたmdxマ
ウスは、未処置のmdxマウス又は媒体対照で処理されたmdxマウスと比較して、減少した血
清CKを有するだろう。

別の具体例において：関心対象の化合物のナンセンスコドン抑制（cftr）に対する効果
を評価するために、cftr-/-FABP-hCFTR-G542Xマウスを、該化合物、負の対照又は正の対
照で1週以上の間処理する。負の対照群には、未処置のcftr-/- FABP-hCFTR-G542Xマウス
を含む。正の対照群には、ナンセンスコドン抑制活性を有することが知られている化合物
を受けるcftr-/-FABP-hCFTR-G542Xマウスを含む。CFTR-特異的免疫蛍光の染色を十二指腸
切片に対して行って、CFTRの産生を証明する。また、CFTRを媒介した経上皮クロライド電
流に対する関心対象の化合物の機能的効果を評価することができる。ナンセンスコドン抑
制活性をもつ化合物は、十二指腸の粘膜下腺の上皮の尖端領域に局在化したCFTR 免疫蛍
光染色に対して、陽性を生じるであろう。また、ナンセンス突然変異抑制活性をもつ化合
物は、フォルスコリンの添加に後に経上皮クロライド電流の強力な増大を生じ、環状アデ
ノシン一リン酸(cAMP)を増加させるであろう。
一旦中途での翻訳終結及び／又はナンセンスを媒介したmRNA減衰を抑制する化合物が同
定されたら、化合物の構造を、周知の技術を利用して又は予め定められたコードを参照す
ることによって決定してもよい。例えば、化合物の構造は、質量分析、NMR、振動分光法
又はX線結晶学によって決定してもよい。

本明細書に記述したリポーターアッセイ法に対する化合物の効果の一部がリポーター遺
伝子mRNAレベルの変化を介して媒介されるかどうかを評価するために、リアルタイム逆転
写PCRアッセイ法を使用する（Bustinの論文、J. MoI. Endocrinol. 25（2）: 169-193 （
2000））。培地（例えば、FBSを含む培地）中で培養した細胞（例えば、HEK 293細胞）を
、高濃度の関心対象の化合物で48時間処理する。また、実験には、負の対照細胞（溶媒単
独で処理した）、及び正の対照細胞（以前に、ナンセンス突然変異を含むmRNAを安定化す
ることが示された化合物で処理した）を含む。総RNAを細胞可溶化物から抽出する。定量
的リアルタイムPCRは、リポーター遺伝子mRNAのための及び18SリボソームRNA（rRNA）の
ためのプライマーを使用して行う。対照細胞と比較して、処理した細胞のためのリポータ
ー遺伝子mRNAのレベルを、出発材料の量に対する規準化因子として18SrRNAの測定を使用
して、計算する。

化学フットプリント法を使用して、rRNAと関心対象の化合物の相互作用の部位をマップ
してもよい。これらの実験において、細胞（例えば、HeLa細胞）から調製したリボソーム
を媒体対照又は関心対象の化合物と共にインキュベートし、次いでrRNAの構造を変化させ
る2つの化学修飾薬（ジメチルサルフェート又はケトキサールのいずれか）で処理する。
化学修飾反応に続いて、rRNAを単離して、ヒト28S、18S及び5.8S rRNAの異なる領域にハ
イブリダイズする末端標識したオリゴヌクレオチドを使用してプライマー伸長解析を行う
。プライマー伸長の産物を6%ポリアクリルアミドゲルで分離する。ジメチルサルフェート
又はケトキサールによる化学修飾に対するrRNAのアクセシビリティは、ゲル上のバンドの
強度の外見、消失又は変化として視覚化され；これらのイベントのいずれも、rRNAに対し
て特異的な領域における化合物の電位効果を示すと考えられる。ゲル上のバンドの外見は
、新たに誘導された化学物質修飾薬に対する到達性に一致する（例えば、リボソームRNA
内の高次構造上の変化を生じさせた化合物相互作用の結果として）。逆に、バンドの消失
は、新たに誘導された化学物質修飾薬の近づきにくさと一致する（例えば、化合物結合に
よる部位の保護又はリボソームRNA内の塩基対形成の変化によって生じる）。

関心対象の化合物の、中途での終止コドンの特異的リボソームリードスルーを誘導する
その能力及び正常な終止コドンの非特異的リボソームリードスルーを誘導するその能力が
ないことに対する特異性は、インビトロにおいて評価することができる。例えば、ルシフ
ェラーゼリポーターをさらなるタンパク質（例えば、CD40タンパク質）に連結してもよい
。CD40は、Bリンパ球及びその他の免疫細胞によって発現される細胞表面マーカーであり
；そのmRNAは、便利な3'-UTR配列を提供し、かつ該タンパク質は、潜在的タンパク質伸長
のウエスタンブロット検出のために適したサイズである。
このアッセイ法では、培地（例えば、ウシ胎児血清（FBS）を含む培地）中で培養した
細胞（例えば、HEK 293細胞）を、ルシフェラーゼ-CD40融合タンパク質をコードする遺伝
子で安定にトランスフェクトさせる。通常のスレオニンコドン（ACA）の代わりに、ルシ
フェラーゼの位置190に存在するUGAナンセンスコドンが、部位特異的変異誘発によって導
入される。加えて、CD40タンパク質の3'-UTRがルシフェラーゼUAA終止コドンの下流に導
入される。それぞれの構築物について、細胞可溶化物からの関心対象のタンパク質の精製
を促進するために、6つのヒスチジンアミノ酸（6X-His）がルシフェラーゼ遺伝子の5'末
端に含まれる。加えて、ウエスタンブロット分析時に関心対象のタンパク質の単離を可能
にするために、Xpress（商標）エピトープタグが含まれる。

これらの構築物から転写されるmRNAの特色及び種々の条件及び仮定で予想される結果を
図2に示してある。未処置の細胞では、切断されたルシフェラーゼタンパク質のみが観察
されるはずである（図2A）。正常な終止コドンの特異的リードスルーを有するナンセンス
サプレッサー活性をもつ化合物で処理した細胞では、切断されたルシフェラーゼタンパク
質及び全長ルシフェラーゼタンパク質の両方が作製されるはずである（図2B）。しかし、
化合物が正常終止コドンの非特異的リボソームリードスルーを誘導する能力を有する場合
、位置190における挿入された中途での終止コドンの、及びルシフェラーゼORF末端におけ
る正常終止コドンの両方のリードスルーが予想されるであろう。これにより、CD30 3'-UT
Rによってコードされる84アミノ酸によるルシフェラーゼタンパク質の伸長を生じるだろ
うし、分子量の9kdの増大（66kdから75kdまで）が、ウエスタンブロット法によって検出
されるであろう。これが生じる場合、構築物の分子量が増加するであろうし、全ての3つ
のタンパク質（切断されたもの、ルシフェラーゼ及びルシフェラーゼ-CD40）が産生され
るであろう（図2C）。更に、構築物は、マーカーとして産生される。負の対照構築物は、
全長ルシフェラーゼmRNAのみをコードする（図2D）。負の対照構築物は、全長ルシフェラ
ーゼmRNAのみをコードする（図2D）。正の対照構築物は、伸長したルシフェラーゼ-CD40
mRNAをコードし、ルシフェラーゼORFの末端にてセンス（ノンストップ）突然変異（CAA）
を操作することによって作製される（図2E）。

細胞を関心対象の化合物でしばらくの間（例えば、72時間）処理し、次いで細胞可溶化
物を作製する。細胞可溶化物を6X-His-タグの付いたタンパク質を捕獲するようにデザイ
ンされた磁気ニッケル荷電アガロースビーズと混合する。タンパク質捕獲工程に続いて、
タンパク質を12.5%ポリアクリルアミドゲルで分離して、抗Xpress抗体を使用してウエス
タンブロット解析を行う。
非特異的終止コドンリードスルーの理論的問題に対処するための一般的であるが、より
感受性及び特異性の低いアプローチを、2次元ゲル電気泳動を使用して行ってもよい（O'
Farrellの論文、J. Biol. Chem. 250（10）：4007-421 （1975））。正常終止コドンのリ
ボソームリードスルーを誘導する化合物は、異常に伸長したタンパク質を生じさせ、分子
量の増大及び／又は電荷の変化のために電気泳動移動度パターンを変化させるかもしれな
い。このようなアッセイ法の１つの例では、ルシフェラーゼ-リポーター190アミノ酸位に
UGA（+1A）終止コドンを有する細胞（例えば、HDEK 293細胞）の二つの試料を、関心対象
の化合物で又は媒体で、しばらくの間（例えば、48時間）処理する。細胞の一定分量をア
ッセイして、標準的な細胞に基づいたリポーターアッセイ法で化合物で誘導される、ルシ
フェラーゼのリボソームリードスルーの証拠を確保する。次いで、2次元電気泳動法及びP
horetixソフトウェアを使用するコンピューター解析を行う。

動物の疾患モデルにおける非特異的終止コドンリードスルーの潜在性に対処するために
、より多くの特異的実験を、インビボでの単一の大量のmRNAの翻訳に対する化合物の作用
を評価することによって行ってもよい。例えば、mdxマウスを、関心対象の化合物、正の
対照又は媒体でしばらくの間（例えば、28日）毎日処理し、その後に、筋組織を個々の動
物から収集する。また、未処置の野生型C57／B10マウスからの筋肉も解析する。また、β
-チューブリン（マウス筋肉における大量のタンパク質）mRNAは、ORFの末端にUAA（+1A）
終止コドン及びその3'-UTRの下流に第2のインフレームの終了後UAA（+1A）終止コドンを
有することが知られている。これらの2つの終止コドンの間に、理論的には、マウスβ-チ
ューブリンタンパク質の42アミノ酸伸長をコードし得る126ヌクレオチドの介在配列があ
る。図3は、β-チューブリンmRNAの模式図を提供する。関心対象の化合物が終止コドンの
非特異的リボソームリードスルーを誘導する能力を有する場合、β-チューブリンタンパ
ク質が≧42アミノ酸（〜5kd）までサイズが増加するであろうこと及びこの変化が、ウエ
スタンブロット法によって検出可能であろうことが予想されるでろう。

中途での終止コドン特異的リボソームリードスルーを誘導するその能力及び正常終止コ
ドンの非特異的リードスルーを誘導することができないその能力に対するナンセンスコド
ン抑制薬の特異性は、ナンセンスコドン抑制薬を投与した対象（特に、ヒト）由来の生体
試料において評価することができる。例えば、血液試料は、投薬直前及び投薬後の種々の
時点（例えば、2、4、6、8、12、24、48及び72時間）にて、ナンセンスコドン抑制薬で処
理した対象（例えば、ヒト）から得てもよい。血液試料に由来する血液試料又は試料（例
えば、対象から得られるPBMC及び血漿は、解析前にプールしてもよい。例えば、同じ時点
からの同性の対象からの血液試料又は血液試料に由来する試料を解析前にプールしてもよ
い。或いは、それぞれの対象からの血液試料又は血液試料に由来する試料を個々に解析し
てもよい。

末梢血単核細胞（PBMC）及び血漿を分離し、並びに任意に使用前に凍結しても及び貯蔵
してもよい。PBMC及び血漿を伸長したリードスルータンパク質産物間の最大の分離を得る
ために最適化したポリアクリルアミドゲル上に充填し、電気泳動法に供して、免疫ブロッ
トのためにニトロセルロース膜（又はその他の適切な膜、例えばナイロン膜）に転写する
。C応答性タンパク質（CRP）、B₂ミクログロブリン及びシスタチンCなどのタンパク質を
、正常な終止コドンの非特異的リードスルーについて評価してもよい。対照として、野生
型及び対応する伸長したタンパク質を使用してもよい。免疫ブロットは、評価されるタン
パク質に対して特異的な一次抗体、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体を含む一次抗
体に対して特異的な二次抗体を使用して行ってもよい。

ナンセンスコドン抑制薬を投与した対象には、ナンセンス突然変異を含む遺伝子を有す
ることが知られている対象を含んでいてもよく、これらの場合、遺伝子によってコードさ
れる機能的リードスルータンパク質の産生は、ナンセンスコドンの特異的リードスルーの
ための正の対照として使用されるであろう。また、ナンセンスコドン抑制薬を投与した対
象には、ナンセンス突然変異を含む遺伝子を有することが知られていない対象を含んでい
てもよい。これらの場合において、ナンセンスコドン抑制薬で処理した対象由来の血漿は
、中途での終止コドンを含むリポーター遺伝子（例えば、アミノ酸残基190にてUGA中途で
の終止コドンを含むホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子）が安定にトランスフェクト
された細胞（例えば、HEK 293細胞）の培地に添加してもよく、又は中途での終止コドン
を含む細胞抽出物及びリポーター遺伝子と共にインキュベートしてもよい。処理した細胞
又は抽出される処理した細胞は、正の対照としての中途での終止コドンのリードスルーに
ついてアッセイすることができる。

例えば、本発明に従って同定される化合物の毒性及び／又は有効性は、細胞培養又は実
験動物において、LD50（集団の50%までの致死用量）及びED50（集団の50%において治療的
に有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順によって決定することができる。本
発明に従って同定される化合物の細胞障害性を評価するために使用することができる細胞
及び株化細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）、Caco2細胞及びHuh7細胞を含むが、限定さ
れない。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療係数であり、これは、比LD50／ED50
として表すことができる。大きな治療指数を示す本発明に従って同定される化合物が好ま
しい。毒性副作用を示す本発明に従って同定される化合物を使用してもよいが、非感染細
胞に対する潜在的損傷を最小化し、及びこれにより副作用を減少させるために、患部組織
の部位にこのような薬剤をターゲットする送達系をデザインするために注意がなされるべ
きである。

細胞培養アッセイ法及び動物試験から得られるデータは、ヒトに使用するための本発明
に従って同定された化合物の投薬量の範囲を練るために使用することができる。このよう
な薬剤の投薬量は、好ましくは毒性がほとんど又は全くないED50を含む循環濃度の範囲に
ある。投薬量は、使用される財形及び利用される投与の経路に応じて、この範囲の内で変
更してもよい。本発明の方法に使用される任意の薬剤について、治療的に有効な用量は、
最初に細胞培養アッセイ法から見積もることができる。用量は、細胞培養において決定さ
れたIC50（すなわち、症候の最大の阻害の半分を達成する化合物の濃度）を含む循環血漿
濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方してもよい。このような情報は、ヒ
トにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿における
レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。

毒物学アッセイ法の具体例には、以下を含む：
雌雄SDラットには、媒体又は種々の用量の同定された化合物をしばらくの間毎日（例え
ば、28日）投与する。いくつかのラット／性／群は、しばらくの間（例えば、28日）の後
に終了し、いくつかのその他のラット／性／群は、投薬の期間後にさらなる回復期（例え
ば、4週の回復期）
も続けて、その他のラット・ラット／性／群は、投薬後の多数の時間及び日数（例えば、
投薬後1日及び28日、0.5、1.5、4、8、12及び24時間に）
に毒物動態学の評価に使用する。
雌雄ビーグル犬には、媒体又は種々の用量の同定された化合物をしばらくの間（例えば
、28日）投与する。いくつかのイヌ／性／群は、投薬期間の後に終了する。その他のイヌ
／性／群は、さらなる回復期（例えば、4週の回復期）を続けて、毒物動態学のために、
投薬後数時間及び数日（例えば、投薬後1日及び28日、1、2、4、8、12、16及び24時間に
）試料を収集する。

用量解析をHPLCによって行って、動物が意図された用量を受けたことを検証する。ケー
ジ-態様観察を１日に2回行い、詳細な臨床観察及び体重を毎週記録する。治療期間の間の
摂食量を測定する。検眼鏡検査及び心電図記録法（イヌのみ）を、事前に及び治療期間中
の最終日に行う。血液学、凝固、臨床化学及び検尿パラメーターは、ベースラインにて（
イヌのみ）及び治療期間の最終日に（全ての動物）及び回復動物のための回復期に評価す
る。治療又は回復終了後の手順には、全体の総剖検検査、器官の除去及び秤量、並びに顕
微鏡分析のために保存された組織のホルマリン固定を含む。化合物濃度についての血漿解
析は、HPLC及び直列型質量分析法を使用して、それぞれの動物種について確認する。非区
画法（noncompartmental methods）を使用して、薬物動態学的パラメーターを評価する。
体重、摂食量、臨床病理学及び器官重量は、1元分散分析（ANOVA）によって解析して、そ
れぞれの用量と対照との対での比較をダネット検定によって行う。

好ましい実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、中
途での終止コドンの特異的なリボソームリードスルーを誘導するが、正常な終止コドンの
非特異的リードスルーを誘導しない。当該技術分野において公知の又は本明細書に記述し
た任意のアッセイ法を、関心対象の化合物による中途での終止コドンの特異的なリボソー
ムリードスルーを評価するために行うことができる。
本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、28SリボソームRNA、18Sリボソ
ームRNA及び／又は5.8SリボソームRNAと相互作用し得る。特定の実施態様において、本発
明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、28SリボソームRNAに結合する。その他
の実施態様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、18Sリボソ
ームRNAに結合しない。一部の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬は、別のタン
パク質との相互作用を介して間接的にリボソームRNAに結合する。特定のその他の実施態
様において、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、グラム陰性微生物及
び／又はグラム陽性微生物に対して有意な抗菌活性を示さない。好ましい実施態様におい
て、本発明に従って使用されるナンセンスコドン抑制薬は、対象（好ましくは、ヒト）に
（例えば、経口的に）全身投与されたときに、ほとんど（もしあっても）有害又は望まれ
ない副作用を有さない。具体的実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬は、対象（好
ましくは、ヒト）に経口投与されたときに、腎不全及び／又は聴力問題（例えば、難聴）
を生じさせない。

（5.5 機能的リードスルータンパク質）
本発明は、ナンセンス突然変異を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスル
ータンパク質（群）であって、本明細書に記述した方法によって産生される、前記タンパ
ク質（群）を提供する。特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク質（群）
は、機能的な非野生型タンパク質である。具体的実施態様において、機能的リードスルー
タンパク質（群）は、全長非野生型タンパク質である。その他の実施態様において、機能
的リードスルータンパク質は、対応する野生型タンパク質と同じアミノ酸配列で構成され
る。
本発明は、対応する野生型タンパク質をコードするRNAにおいて見いだされる終止コド
ンと比較して、核酸配列から転写されるRNAに異なる終止コドンを生じる突然変異（例え
ば、欠失、挿入及び／又は置換）を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスル
ータンパク質（群）を提供する。特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク
質（群）は、機能的な非野生型タンパク質である。具体的実施態様において、機能的リー
ドスルータンパク質は、全長非野生型タンパク質である。

具体的実施態様において、本発明は、正常な終止コドン（すなわち、対応する野生型タ
ンパク質をコードするRNAにおいて見いだされる終止コドン）と比較して、核酸配列から
転写されるRNAに異なる終止コドンを生じる突然変異（例えば、欠失、挿入及び／又は置
換）を含む核酸配列によってコードされる機能的リードスルータンパク質を産生する方法
であって、核酸配列を含む細胞をナンセンス抑制薬と接触させることを含む、前記方法を
提供する。或いは、本方法は、無細胞抽出液を、核酸及びナンセンスコドン抑制薬と接触
させることを含む。別の実施態様において、本発明は、正常な終止コドン（すなわち、対
応する野生型タンパク質をコードするRNAにおいて見いだされる終止コドン）と比較して
、遺伝子から転写されるRNAに異なる終止コドンを生じる突然変異（例えば、欠失、挿入
及び／又は置換）を含む遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク質を産
生する方法であって、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）にナンセンスコドン抑制
薬の有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。これらの実施態様によれば、ナ
ンセンスコドン抑制薬は、第2の終止コドンとは異なる終止コドンを読み過ごして、機能
的リードスルータンパク質を産生する。
具体的実施態様において、本発明は、遺伝子（群）のコード領域にナンセンス突然変異
を含む遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク質（群）を産生する方法
であって、遺伝子（群）を含む細胞をナンセンスコドン抑制薬と接触させることを含む、
前記方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、遺伝子（群）のコード領域にお
けるナンセンス突然変異を含む遺伝子によってコードされる機能的リードスルータンパク
質（群）を産生する方法であって、その必要のある対象（好ましくは、ヒト）にナンセン
スコドン抑制薬の有効量を投与することを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様に
おいて、対象は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異に関連した疾患を有し又は疾患にか
かりやすく、若しくは感受性である。

特定の実施態様において、本発明の方法に従って産生される機能的リードスルータンパ
ク質（群）は、対応する野生型タンパク質が見いだされる細胞における同じ位置にて見い
だされる。例えば、特定の実施態様において、機能的リードスルータンパク質（群）及び
対応する野生型タンパク質は、細胞の表面上で見いだされる。その他の実施態様において
、機能的リードスルータンパク質（群）は、対応する野生型タンパク質が見いだされるの
とは異なる細胞における位置で見いだされる。具体的実施態様において、本発明の方法に
従って産生される機能的リードスルータンパク質は、細胞の核において見いだされ、一方
、対応する野生型タンパク質は、細胞質において又は細胞の表面上で見いだされる。別の
実施態様において、本発明の方法に従って産生した機能的リードスルータンパク質は、細
胞質において又は細胞の表面上で見いだされ、一方、対応する野生型タンパク質は、核に
おいて見いだされる。細胞内／上における機能的リードスルータンパク質の局在化は、当
業者に公知の技術を使用して測定／決定することができる。具体的実施態様において、細
胞内／上における機能的リードスルータンパク質の局在化は、免疫蛍光によってを測定／
決定することができる。特定の実施態様において、以下の免疫蛍光プロトコルを使用して
、細胞内／上における機能的リードスルータンパク質の局在化を測定／決定する：
1. 細胞をCoplinジャーにおいてPBSで再水和させる（例えば、5分）。
2. 細胞をしばらくの間（例えば、20分）免疫前マウス血清でブロックする。
3. 一次抗体をしばらくの間適用させる。
4. スライドをPBS中で2〜5回洗浄し、次いでしばらくの間二次抗体と共にインキュベー
トする。
5. 核を染色すること、例えばDAPI染色によって同定する。
6. 細胞をデジタル共焦点蛍光顕微鏡で撮像して、例えば、イメージをIPLabスペクトル
ソフトウェアで取り込む。
7. 染色を（0）なし、（1）核周囲、（2）末梢及び（3）表面として分類し／記録する
。
8. イメージを、例えばステップモーター、フィルタホイール組み立て品（Ludi Electr
onics Products, Hawthorne, NY）及び83,000フィルタセット(CHroma Technology, Bratt
leboro, VT）及びSenSysを冷却電荷結合高解像度カメラ（Photometries, Tucson, Az）を
備えているOlympyus 1X170倒立エピフロレッセンス顕微鏡で取り込む。
9. イメージの部分的な逆重畳積分を、例えばIPLabソフトウェア（Scanalytics、Fairf
ax、VA）を使用して行う。

具体的実施態様において、本発明の方法に従って産生される機能的リードスルータンパ
ク質（群）は、機能的CFTRリードスルータンパク質（群）である。特定の実施態様におい
て、機能的CFTRリードスルータンパク質（群）は、当該技術分野において公知の方法、例
えば免疫蛍光法によって測定／決定すると、核周囲に、末梢に及び／又は鼻細胞の表面に
見いだされる。好ましい実施態様において、機能的CFTRリードスルータンパク質は、免疫
蛍光によって測定／決定すると鼻細胞の表面上に見いだされる。具体例において、核周囲
、末梢及び／又は表面における機能的CFTRリードスルータンパク質の量は、以下の免疫蛍
光プロトコルによって測定／決定される：
1. 鼻細胞をCoplinジャーにおいてPBSで再水和させる（例えば、5分）。
2. 細胞をしばらくの間（例えば、20分）免疫前マウス血清でブロックする。
3. 一次抗体（例えば、全長CFTRのカルボキシ末端の4アミノ酸に向けたマウスモノクロ
ーナル抗-CFTR 24-1）、例えば1：100の希釈で、しばらくの間（例えば、2時間）適用す
る。
4. スライドをPBS中で3回洗浄し、次いでしばらくの間（例えば、1時間）二次抗体（例
えば、ヤギ抗マウスIgG5AlexaFluor 596、Molecular probes、Portland、Oregon）と共に
インキュベートする。
5. 核をDAPI染色によって同定する。
6. 細胞をデジタル共焦点蛍光顕微鏡で撮像して、イメージを、例えばIPLabスペクトル
ソフトウェアで取り込む。
7. CFTR染色を（0）なし、（1）核周囲、（2）末梢及び（3）表面として分類し／記録
する。具体的実施態様において、それぞれのスライドのランダムな領域からの少なくとも
50個の上皮細胞を評価し、及び記録する。
8. イメージを、例えばステップモーター、フィルタホイール組み立て品（Ludi Electr
onics Products, Hawthorne, NY）及び83,000フィルタセット(CHroma Technology, Bratt
leboro, VT）及びSenSysを冷却電荷結合高解像度カメラ（Photometries, Tucson, Az）を
備えているOlympyus 1X170倒立エピフロレッセンス顕微鏡で取り込む。
9. イメージの部分的な逆重畳積分を、例えばIPLabソフトウェア（Scanalytics、Fairf
ax、VA）を使用して行う。

特定の実施態様において、本発明の方法に従って産生される機能的リードスルータンパ
ク質（群）は、中途での終止コドンによってコードされる位置に挿入された機能的リード
スルータンパク質（群）のアミノ酸残基にて、対応する野生型タンパク質と異なるだけで
ある。その他の実施態様において、本発明の方法に従って産生される機能的リードスルー
タンパク質（群）は：（i）中途での終止コドンによってコードされる位置に挿入された
機能的リードスルータンパク質（群）のアミノ酸残基にて；及び（ii）中途での終止コド
ンによってコードされるもの以外の機能的リードスルータンパク質（群）のアミノ酸残基
鎖にて；対応する野生型タンパク質（群）と異なる。
本発明の方法によって産生される機能的リードスルータンパク質（群）のアミノ酸配列
は、関心対象の核酸配列（すなわち、関心対象のナンセンス突然変異（群）を含む核酸配
列）を含む細胞によって産生されるタンパク質（群）をシーケンシングすることによって
決定してもよい。特定の実施態様において、細胞は、天然の核酸配列を含む。具体的実施
態様において、細胞は、ナンセンスコドン抑制薬（群）を受けている患者又は受けるであ
ろう患者由来の細胞である。その他の実施態様において、細胞は、核酸配列を含むように
操作されている。

特定の実施態様において、本発明の方法に従って産生される機能的リードスルータンパ
ク質（群）は、タンパク質が翻訳されるRNAにおけるナンセンスコドンに対応する位置に
てチロシン、システイン又はトリプトファンを含む。具体的実施態様において、本発明の
方法に従って産生される機能的リードスルータンパク質（群）は、タンパク質が翻訳され
るRNAにおけるUAA又はUAGナンセンスコドンに対応する位置にてチロシンを含む。その他
の実施態様において、本発明の方法に従って産生される機能的リードスルータンパク質（
群）は、タンパク質が翻訳されるRNAにおけるUGAナンセンスコドンに対応する位置にてシ
ステイン又はトリプトファンを含む。
下記の表10は、遺伝子（群）のナンセンス突然変異に関連した疾患の一覧を提供する。
表は、疾患に関連した遺伝子の名称、少なくとも遺伝子のコード領域の核酸のGenBankア
クセッション番号、遺伝子によってコードされるタンパク質のGenBankアクセッション番
号、疾患に関連した遺伝子において見いだされる代表的なナンセンス突然変異及び遺伝子
のナンセンス突然変異と関連した疾患に関する参照（群）を提供する。特定の実施態様に
おいて、本発明の方法に従って産生される機能的リードスルータンパク質は、遺伝子のナ
ンセンス突然変異が疾患に関連している表10において同定されるアミノ酸残基の位置を除
いて、対応する野生型タンパク質のアミノ酸配列を含む。この実施態様によれば、その位
置におけるアミノ酸残基は、対応する野生型タンパク質において見いだされる1つのアミ
ノ酸残基ではなく及びその他の19アミノ酸残基のいずれか1つである。従って、例えば3M
症候群の場合、機能的リードスルータンパク質は、位置1445においてアルギニンを除いて
、その他の任意のアミノ酸残基も含むことができる。

（5.6患者集団）
（5.6.1好ましい標的及び遺伝的プロフィール）
本発明の方法及び組成物は、本明細書に記述したものなどの遺伝子のナンセンス突然変
異に関連した疾患を有するか、又は疾患にかかりやすく、若しくは有することに感受性の
（例えば、環境及び／又は遺伝的要因のため）患者（例えば、胚、胎児、乳児（ヒトでは
新生児〜1歳）、子供（ヒトでは1歳〜18歳）、成人（ヒトでは18歳以上）及び高齢者（ヒ
トでは65歳以上））の予防、治療及び／又は管理のために有用である。一つの実施態様に
おいて、患者は、小児又は若者（ヒトでは5歳〜13歳）ある。別の実施態様において、患
者は、男性である。特定の実施態様において、患者は、男性の小児又は若者（（ヒトでは
5歳〜13歳）である。具体的実施態様において、患者は、筋ジストロフィー（例えば、デ
ュシェンヌ型筋ジストロフィー）を有する男性の小児又は若者（ヒトでは5歳〜13歳）で
ある。別の実施態様において、患者は、女性である。具体的実施態様において、患者は、
女性の小児又は若者で（ヒトでは5歳〜13歳）ある。

具体的実施態様において、本発明の方法及び組成物は、本明細書に記述したものなどの
遺伝子のナンセンス突然変異に関連した疾患を有するか、又は疾患にかかりやすく、若し
くは感受性の胚又は胎児の治療、予防及び／又は管理のために有用である。この実施態様
によれば、妊娠女性には、胚又は胎児に胎盤を通過するナンセンスコドン抑制薬が投与さ
れる。
上記の表10は、遺伝子のナンセンス突然変異に関連した疾患、並びに遺伝子のナンセン
ス突然変異の代表例の一覧を提供する。特定の実施態様において、ナンセンスコドン抑制
薬（群）が投与された患者は、疾患に関連した遺伝子の代表的なナンセンス突然変異の1
つ以上を有する表10に収載された疾患をもつ患者である。
特定の実施態様において、本発明に従ってナンセンスコドン抑制薬（群）が投与される
患者は、最近の数日、1週、2週、1月、3月、6月又は1年以内に別の療法を受けていない。
具体的実施態様において、本発明に従ってナンセンスコドン抑制薬（群）が投与される患
者は、別の療法を決して受けない。その他の実施態様において、本発明に従ってナンセン
スコドン抑制薬が投与される患者は、最近の数分、数時間又は数日以内に別の療法を受け
ている。

本発明は、支持療法及び／又は抗痙攣薬などの別のタイプの療法と組み合わせたナンセ
ンスコドン抑制薬（群）の投与を包含する。嚢胞性線維症について、支持療法の例には、
膵酵素置換（例えば、リパーゼ）、粘液溶解薬（例えば、ドルナーゼα）、気管支拡張薬
、副腎皮質ステロイド及び抗生物質を含む。デュシェンヌ型筋ジストロフィーについて、
支持療法の例には、副腎皮質ステロイド及び抗生物質を含む。具体的実施態様において、
患者は、ナンセンスコドン抑制薬（群）と組み合わせて抗菌薬としてアミノ配糖体、オキ
サゾリジノンエステル及び／又はクロラムフェニコールを投与されていない。この実施態
様によれば、ナンセンスコドン抑制薬（群）は、アミノ配糖体、オキサゾリジノンエステ
ル及び／又はクロラムフェニコールではない。
特定の実施態様において、本発明に従ってナンセンスコドン抑制薬が投与される患者は
、アミノ配糖体、オキサゾリジノンエステル及び／又はクロラムフェニコールのナンセン
スコドン抑制活性に対して不応性である。この実施態様によれば、このような薬剤に対し
て不応性である患者は、このようなアミノ配糖体、オキサゾリジノンエステル又はクロラ
ムフェニコール患者由来の細胞を接触させて、例えばナンセンス突然変異を含む疾患に関
連した遺伝子の活性及び／又は発現を測定することによって、決定することができる。

また、本発明の方法及び組成物は、対応する野生型タンパク質をコードするRNAにおい
て見いだされる終止コドンと比較して、遺伝子から転写されるRNAに異なる終止コドンを
生じる遺伝子の突然変異に関連した疾患を有するか、又は疾患にかかりやすく、若しくは
有することに感受性の（例えば、環境及び／又は遺伝的要因のため）患者（例えば、胚、
胎児、乳児（ヒトでは新生児〜1歳）、子供（ヒトでは1歳〜18歳）、成人（ヒトでは18歳
以上）及び高齢者（ヒトでは65歳以上））の提示、治療及び／又は管理のために有用であ
る。このような疾患の非限定的な例には、脊髄筋肉萎縮症及び嚢胞性線維症を含む（例え
ば、CFTR遺伝子の突然変異3849 + 10kb C→Tにより生じる嚢胞性線維症。これは、84塩基
対挿入を生じ、イントロン19の領域がエキソンとして認識されることにより生じ、翻訳さ
れるときに、84塩基対挿入は、UAAナンセンス突然変異を有する28アミノ酸ペプチドを産
生する（Highsmithらの論文、New England Journal of Medicine 331（1）：974 （1994
））。

更に、本発明の方法及び組成物は、患者がタンパク質の十分な量を発現しない疾患及び
／又は特定のタンパク質（群）の発現による利益を受けることができる疾患を有するか、
又は疾患にかかりやすく、若しくは有することに感受性の（例えば、環境及び／又は遺伝
的要因のため）患者（例えば、胚、胎児、乳児（ヒトでは新生児〜1歳）、子供（ヒトで
は1歳〜18歳）、成人（ヒトでは18歳以上）及び高齢者（ヒトでは65歳以上））の予防、
治療及び／又は管理のために有用である。これらの患者には、遺伝子療法を経由して（遺
伝子療法の方法論については、第5.11節を参照されたい）コード領域にナンセンス突然変
異を含む核酸配列（特定の実施態様において、ナンセンス突然変異は、コード領域（例え
ば、アミノ末端から最初の50、75、100、125、150、175、200、225、250、300又は350ア
ミノ酸の範囲内）の5'領域にある）が投与されており、ナンセンスコドン抑制薬の投与に
より、核酸配列によってコードされる機能的リードスルータンパク質が産生されるように
、核酸配列から転写されるRNAのナンセンスコドンを抑制する。ナンセンスコドン抑制薬
の投与により、産生される機能的リードスルータンパク質の量を調節することができる。
言い換えると、ナンセンスコドン抑制薬の非存在下では、例えばELISAなどの免疫アッセ
イによって決定すると、ほとんど又は全く測定可能な機能的リードスルータンパク質は産
生されない。産生される機能的リードスルータンパク質は、患者において十分なレベルに
て発現されない及び／又は患者に対して有益である野生型タンパク質に対応する。このよ
うな療法からの利益を受けることができる患者の集団の非限定的な例は、以下の障害であ
る患者を含む：

本発明によって包含される方法によって予防、治療及び/又は管理することができる癌
の具体例には、頭部、頚部、眼、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立
腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓及び脳の癌を含むが、限定されない。更なる癌には、
以下を含むが、限定されない：骨髄芽球性、前骨髄性球、骨髄単性球、単球性、赤白血性
の白血病及び骨髄異形成症候群などの急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血
病、慢性的骨髄球性（顆粒球）白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病など
の、しかし限定されない慢性白血病などの、しかし限定されない白血病；真性多血症；ホ
ジキン病、非ホジキン病などの、しかし限定されないリンパ腫；くすぶり型多発性骨髄腫
、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫及び延髄外の
プラズマ細胞腫などの、しかし限定されない多発性骨髄腫；ワルデンストローム型マクロ
グロブリン血症；未決定の有意性のモノクローナル免疫グロブリン増多症；良性モノクロ
ーナルγグロブリン異常；重鎖病；骨肉腫、骨髄腫骨疾患、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイン
グ肉腫、骨パジェット病、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜性肉腫、軟部組織肉
腫、血管肉腫（angiosarcoma）（血管肉腫（hemangiosarcoma））、線維肉腫、カポジ肉
腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの、し
かし限定されない骨癌及び結合組織肉腫；神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣細胞
腫、乏突起細胞腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、ピネオサ
イトーマ、松果体芽細胞腫、一次脳リンパ腫などの、しかし限定されない脳腫瘍；腺癌、
小葉（小細胞）癌腫、分泌管内癌、延髄乳癌、粘液性乳癌、管状乳癌、乳頭乳癌、パジェ
ット病（若年性パジェット病を含む）及び炎症性乳癌を含むが、限定されない乳癌；褐色
細胞腫及び副腎皮質性癌腫などの、しかし限定されない副腎癌；乳頭又は濾胞性甲状腺癌
、延髄甲状腺癌及び未分化甲状腺癌などの、しかし限定されない甲状腺癌；膵島細胞腺腫
、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍及びカルチノイ
ド又は島細胞腺腫などの、しかし限定されない膵癌；クッシング病、プロラクチン分泌腫
瘍、末端肥大症及び糖尿病尿崩症などの、しかし限定されない下垂体癌；虹彩黒色腫、脈
絡叢黒色腫及び毛様体黒色腫などの眼黒色腫及び網膜芽細胞腫などの、しかし限定されな
い眼癌；扁平上皮癌、腺癌及び黒色腫などの膣癌；扁平上皮癌、黒色腫、腺癌、基底細胞
癌、肉腫及びパジェット病などの外陰部癌；扁平上皮癌及び腺癌などの、しかし限定され
ない子宮頚癌；子宮内膜癌及び子宮肉腫などの、しかし限定されない子宮癌；卵巣上皮性
癌腫、境界線腫瘍、胚細胞腫瘍及び間質性腫瘍などの、しかし限定されない卵巣癌；扁平
上皮癌、腺癌、腺様嚢胞性癌腫（adenoid cyctic carcinoma）、粘表皮癌、腺扁平上皮癌
、肉腫、黒色腫、プラズマ細胞腫、疣状癌及びカラスムギ細胞（小細胞）癌腫などの、し
かし限定されない食道癌；腺癌、カビ状（fangating）（ポリポイド）、破潰性、表在性
伝播、散在性伝播、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫及び癌肉腫などの、しかし限定さ
れない胃癌；大腸癌；直腸癌；腺癌、扁平上皮癌、カルチノイド、リンパ腫、胃の間質性
の腫瘍及び神経内分泌腫瘍などの胃癌；肝細胞癌及び肝芽腫、腺癌などの胆嚢癌などの、
しかし限定されない肝臓癌；乳頭性、結節状及び散在性のものであるがなどの、しかし限
定されない胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞型癌腫及び小
細胞型肺癌などの、しかし限定されない肺癌；胚腫瘍、精上皮腫、未分化の、古典的（典
型的）、精母細胞の（spermatocytic）、非精上皮腫、胚性癌腫、奇形腫癌腫、絨毛癌（
卵黄嚢腫瘍）などの、しかし限定されない精巣癌；腺癌、平滑筋肉腫及び横紋筋肉腫など
の、しかし限定されない前立腺癌；陰茎癌；経扁平細胞癌などの、しかし限定されない口
癌；基底癌；腺癌、粘表皮癌及び腺様嚢胞癌などの、しかし限定されない唾液腺癌；扁平
細胞癌及びいぼ状のものなどの、しかし限定されない咽頭癌；基底細胞癌、扁平上皮癌及
び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、黒子悪性黒色腫、末端性黒子性黒色腫など
の、しかし限定されない皮膚癌；腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盂
及び/又は子宮（uterer））などの、しかし限定されない腎臓癌；ウィルム腫瘍；移行細
胞癌、扁平細胞癌、腺癌、癌肉腫などの、しかし限定されない膀胱癌。加えて、癌には、
粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上
皮性癌腫、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、乳頭状癌及び乳頭状腺癌を含む（
このような障害の総説については、Fishmanらの文献、1985, Medicine, 第2版、J.B. Lip
pincott Co., Philadelphia及びMurphyらの文献、1997, Informed Decisions: The Compl
ete Book of Cancer Diagnosis, Treatment and Recover1y, Virking Penguin, Penguin
Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照されたい）。アポトーシスにおけ
る異常によって生じる癌が、本発明の方法及び組成物によって予防、治療及び/又は管理
することができることも考えられる。このような癌には、濾胞性リンパ腫、p53突然変異
を有する癌腫、乳房、前立腺及び卵巣ホルモン依存性腫瘍、並びに家族性大腸ポリープ症
及び骨髄異形成症候群などの前癌性病変を含み得るが、限定されない。

（5.6.2 患者のスクリーニング及び株化細胞）
一つの実施態様において、患者又は患者の親族が遺伝病と関連する遺伝子にてナンセン
ス突然変異（すなわち、UAA、UGA又はUAGである）を有することが、プレスクリーニング
を介して決定された。
特定の実施態様において、本発明は、ナンセンスコドン抑制薬での療法に応答する可能
性が高い患者を同定するための、患者をスクリーニングするための方法を提供する。
（5.6.2.1 短期治療チャレンジ）
本発明は、ナンセンスコドン抑制薬に応答する患者可能性について、遺伝子のナンセン
ス突然変異に関連した疾患をもつ患者をスクリーニングする方法であって、患者にナンセ
ンスコドン抑制薬を投与し、続いて予防、管理及び/又は治療されるべき疾患に関連した1
つ以上の薬力学的マーカーを測定することを含む、前記方法を提供する。薬力学的マーカ
ーの測定が、患者がナンセンスコドン抑制薬に応答する可能性が高いことを示す場合、薬
剤の投与を再開することができる。

特定の実施態様において、スクリーニング法には、患者に対するナンセンスコドン抑制
薬の短期投与、続いて予防、治療及び/又は管理される疾患に関連した薬力学的マーカー
の測定、及び任意に、続いてナンセンスコドン抑制薬の長期投与を含む。特定の実施態様
において、ナンセンスコドン抑制因子の短期投与は、約5日、約10日、約14日、約21日又
は約28日の間持続する。その他の実施態様において、ナンセンスコドン抑制因子の長期投
与は、約30日、約45日、約60日、約80日、約120日、約240日、約1年、又は療法が中断さ
れるべきであることを医師が決定するまで持続する。特定の実施態様において、ナンセン
スコドン抑制薬TEPDの短期投与及び長期投与と肺機能評価の間に、約1日、約3日、約5日
、約7日、約10日、約14日、約21日又は約28日の非治療期間がある。具体的実施態様にお
いて、ナンセンスコドン抑制薬の投与は、経口である。
当業者によって認識される、本明細書に開示された疾患に関連した任意の薬力学的マー
カーは、本発明の方法と共に使用することができる（例えば、Politanoらの論文、Acta M
yologica XXII: 15-21（2003）を参照されたい。その全体が本明細書に参照により組み込
まれる）。

嚢胞性線維症に関連した例示的薬力学的マーカーは、鼻部における経上皮電位差（例え
ば、Standaertらの論文、Pediatric Pulmonology 37：385-392（2004）及びDuらの論文、
J. Mol. Med. 80: 595-604 （2002）（それぞれ、その全体が本明細書に参照により組み
込まれる）及び以下の実施例13を参照されたい）、鼻部から収集した細胞におけるCFTRタ
ンパク質染色及び測定（例えば、Wilschanskiらの論文、N. Engl. J. Med. 349：1433-14
41（2003）（参照により本明細書にその全体が組み込まれる）及び実施例14を参照された
い）、汗の塩素濃度の変化（例えば、実施例16を参照されたい）及び肺機能の変化（例え
ば実施例15を参照されたい）を含むが、限定されない。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連した例示的薬力学的マーカーには、血清クレア
チンキナーゼレベル（例えば、血清クレアチンキナーゼレベルの測定については、下記の
実施例20における方法論を参照されたい）、染色による筋肉ジストロフィン測定（例えば
、Politanoらの論文、Acta Myologica XXII：15-21（2003）（参照により本明細書にその
全体が組み込まれる）及び実施例17を参照されたい）。

アミロイド症に関連した例示的薬力学的マーカーには：アミロイドβタンパク質のクリ
アランス；重量増加、糸球体濾過速度、中隔の厚み、アミロイドタンパク質及び心臓アミ
ロイド負荷の経壁組織分布、血清における免疫グロブリンに関連した遊離軽鎖（FLC）の
カッパ/ラムダ比、並びに心臓トロポニンT及びIの非存在（cTnT、cTnI）を含むが、限定
されない。
血友症に関連した例示的薬力学的マーカーには：凝固活性化、組織因子で誘導されるフ
ィブリン形成及びtPAを媒介した線維素溶解の血餅溶解時間の減少を含むが、限定されな
い。
アルツハイマー病に関連した例示的薬力学的マーカーには；アミロイド前駆体タンパク
質（APP）アイソフォームの血小板比の変化；全体的、認知（心理測定的な検査、例えば
、修飾されたミニ精神状態検査（MMSE）又は改変されたHachinski虚血性スコアによって
測定されるとおり）、機能的及び行動的測定（日常生活動作及び挙動、特に動揺、脳減容
の減少（例えば、MRIを使用して測定される）を含む）を含むが、限定されない。また、C
aban-Holtらの論文、Geriatrics. 2005 Jun；Suppl：3-8を参照されたい。

パーキンソン病に関連した例示的薬力学的マーカーには、統合パーキンソン病級別スケ
ール（Unified Parkinson's Disease Rating Scale：UPDRS）でのスコア、MMSE、Hamilto
n-17鬱病、NPI、「オン」への合計の毎日の時間（total daily time to "on"：TTON）、
運動性試験、運動異常評価、患者の日記及び （18）F-dopa取り込みを含むが、限定され
ない。
アテローム性動脈硬化症及び家族性高コレステロール血症に関連した例示的薬力学的マ
ーカーは、コレステロールレベルの減少、例えばMDA-LDLレベルの減少及び/又は高密度リ
ポタンパク質コレステロールの増加；血清脂肪酸プロフィール、血漿リポタンパク質及び
血管炎症マーカー、血漿ホモシステイン濃度の減少、アテローム硬化型血管におけるプラ
ーク形成（MRI又は血管内超音波（IVUS）による）、例えば電子ビームコンピューター断
層撮影法によって測定される冠動脈石灰化（CAC）、並びに例えば総頚動脈（CCA）、内頚
動脈（ICA）及び頚動脈球根状セグメントの頚動脈内膜中膜肥厚（IMT）測定によって測定
される動脈封鎖の減少を含むが、限定されない。
小人症及び巨人症に関連した例示的薬力学的マーカーには、成長ホルモン及びプロラク
チンの高さ並びにレベルを含むが、限定されない。

甲状腺機能低下症及び甲状腺機能亢進症に関連した例示的薬力学的マーカーには、TT3
、TT4及びTSH血清レベル、甲状腺形態及びサイズ、骨年齢、成長発達及び発達指数（DQ）
の評価を含むが、限定されない。
網膜色素変性症に関連した例示的薬力学的マーカーには、ドコサヘキサエン酸（DHA）
レベル、Humphrey Field Analyzer視野感受性、30Hz網膜電図振幅及び視力によって測定
される眼機能を含むが、限定されない。
後期乳児神経セロイドリポフスチン症に関連した例示的薬力学的マーカーには、LINCL
臨床評価スケール及び脳の磁気共鳴映像法/磁気共鳴分光法評価に基づいた神経学的評価
を含むが、限定されない。

脊髄筋肉萎縮症に関連した例示的薬力学的マーカーには、筋力、運動機能及び検査イン
デックス（IFM）の合計、呼吸筋麻痺インデックス（IMR）、並びに背側臥位強制生命許容
量/理論的インデックス（the dorsal decubitus forced vital capacity/theoretical in
dex）（ICV／CT）、携帯筋力計での最大自発的等尺性収縮及び腕メガスコア（合計の肘屈
曲、ハンドグリップ及び三点ピンチスコア）及び肢メガスコア（合計の膝屈曲、膝伸長及
び足伸長スコア）の計算、総運動機能測定、肺機能検査、定量的筋肉試験、並びに生活の
質を含むが、限定されない。
血管拡張性失調症に関連した例示的薬力学的マーカーには：α胎児タンパク質の減少、
免疫機能の改善及び神経機能の改善を含むが、限定されない。
バーター症候群に関連した例示的薬力学的マーカーには：増加した血液カリウムレベル
、成長の増加及び精神的機能の改善を含むが、限定されない。

（5.6.2.2 培養された組織細胞のインビトロでの曝露）
本発明は、ナンセンスコドン抑制薬に応答する患者の可能性について、遺伝子のナンセ
ンス突然変異に関連した疾患を有する患者をスクリーニングするための方法であって、患
者由来の細胞試料をナンセンスコドン抑制薬と接触させること、及びナンセンスコドン抑
制薬が疾患に関連した遺伝子におけるナンセンス突然変異のリードスルーを誘導するとき
に産生される機能的リードスルータンパク質の発現及び/又は活性を測定することを含む
、前記方法を提供する。細胞試料の非限定的な例には、有核血液細胞（例えば、末梢血リ
ンパ球）、皮膚細胞（例えば、経皮線維芽細胞）、神経細胞、グリア細胞及び筋細胞を含
む。特定の実施態様において、細胞試料には、遺伝子のナンセンス突然変異の存在により
影響を受ける細胞の試料である。測定される活性は、正常遺伝子によってコードされる野
生型タンパク質の機能に依存するだろう。例えば、上記第5.5節に記述したアッセイ法を
参照されたい。

特定の実施態様において、本発明は、ナンセンスコドン抑制薬に応答する患者の可能性
について、遺伝子のナンセンス突然変異に関連した疾患である患者をスクリーニングする
ための方法であって、細胞を関心対象の組織（例えば、筋細胞）に変換させる条件下で患
者由来の細胞試料（例えば、経皮線維芽細胞などの皮膚細胞試料）をナンセンスコドン抑
制薬と接触させること、及びその応答を測定することを含む、前記方法を提供する。ナン
センスコドン抑制薬に応答する可能性が高い患者由来の細胞試料は、遺伝子から転写され
るRNAにおけるナンセンスコドンの抑制の結果として、機能的リードスルータンパク質を
産生するだろう。具体的実施態様において、使用される細胞は、患者から単離されている
線維芽細胞である。このような細胞は、MyoD遺伝子を含むベクターで細胞をトランスフェ
クトすることによって筋細胞に分化させることができる。

また、本発明は、ナンセンスコドン抑制薬に応答する患者の可能性について、遺伝子の
ナンセンス突然変異に関連した疾患である患者をスクリーニングするための方法であって
、疾患に関連した遺伝子をシーケンスすること、同じナンセンス突然変異を含む遺伝子を
含む細胞試料をナンセンスコドン抑制薬と接触させること、及びナンセンスコドン抑制薬
が疾患に関連した遺伝子から転写されるRNAにおけるナンセンスコドンのリードスルーを
誘導するときに産生される機能的リードスルータンパク質の発現及び/又は活性を測定す
ることを含む、前記方法を提供する。特定の実施態様において、使用される細胞試料は、
細胞試料のライブラリーの一部であり、それぞれの細胞試料は、疾患と関連した遺伝子の
ナンセンス突然変異（群）を含む。例えば、嚢胞性線維症の細胞試料ライブラリーは、例
えば、CFTR遺伝子における表10にリストされたナンセンス突然変異を有する細胞試料を含
む。細胞試料は、必要とされるまで-70℃にて貯蔵させていてもよく、細胞試料を解凍し
た時点で、細胞が成長することができる条件下で培養する。

（5.6.2.3 ルシフェラーゼアッセイ法における人工的な遺伝子構築物）
本発明は、ナンセンスコドン抑制薬に応答する患者の可能性について、遺伝子のナンセ
ンス突然変異に関連した疾患である患者をスクリーニングするための方法であって、該疾
患に関連した遺伝子をシーケンスすること、ナンセンス突然変異を含む疾患に関連した遺
伝子の領域を含むナンセンスコドン抑制薬をルシフェラーゼなどのリポーター遺伝子を含
むように操作された細胞と接触させること、及びナンセンスコドン抑制薬が遺伝子から転
写されるRNAにおけるナンセンスコドンのリードスルーを誘導するときに産生される機能
的リードスルータンパク質の発現及び/又は活性を測定することを含む、前記方法を提供
する。特定の実施態様において、リポーター遺伝子は、ナンセンス突然変異を含む、ナン
センス突然変異を含む関心対象の遺伝子の領域から6ヌクレオチド（特定の実施態様にお
いて、9、12、15、21、24、27、30又は33ヌクレオチド）を含む。リポーター遺伝子は、
ナンセンス突然変異を含む関心対象の遺伝子の領域を含むように操作され、その結果、リ
ポーター遺伝子のオープンリーディングフレームが維持され、リポーター遺伝子によって
コードされるタンパク質は、ナンセンスコドン抑制薬が遺伝子から転写されるRNAにおけ
るナンセンスコドンのリードスルーを誘導するときに機能的リードスルータンパク質を生
じるであろう。リポーター遺伝子の例は、上記の第5.5節に提供してある。任意の細胞を
、リポーター遺伝子を含むように操作することができる。非限定的な例には、線維芽細胞
、リンパ球、グリア細胞、神経細胞、筋細胞及びマクロファージを含む。標準的な分子及
び細胞生物学の方法を、リポーター遺伝子を産生するために（部位特異的突然変異誘発を
含む）、リポーター遺伝子を含むように細胞を操作するために（リン酸カルシウム沈殿、
電気穿孔法及びリポソームを含む）使用してもよい。

（5.6.3 疾患）
中途での翻訳終結及び/又はナンセンスコドンを媒介したmRNA減衰の抑制によって予防
され、治療され、及び/又は管理される疾患には：遺伝病、癌、自己免疫疾患、血液病、
膠原病、糖尿病、神経変性疾患、増殖性疾患、心臓血管疾患、肺疾患、炎症性疾患及び中
枢神経系疾患を含むが、限定されない。
本発明の方法の範囲内の具体的遺伝病には、アミロイド症、血友症、アルツハイマー病
、テイ・サックス病、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲
状腺機能亢進症、老化、肥満症、パーキンソン病、ニーマン・ピック病、嚢胞性線維症、
筋ジストロフィー、心疾患、腎結石、毛細血管拡張性運動失調、家族性高コレステロール
血症、網膜色素変性症、リソソーム蓄積症、結節硬化症、デュシェンヌ型筋ジストロフィ
ー、脊髄筋肉萎縮症及びマルファン症候群を含むが、限定されない。固形腫瘍及びその他
の癌の両方が、本発明の方法の範囲内に含まれる。

別の実施態様において、遺伝病は、自己免疫疾患である。好ましい実施態様において、
自己免疫疾患は、リウマチ様関節炎又は移植片対宿主病である。
別の実施態様において、遺伝病は、血液病である。好ましい実施態様において、血液病
は、血友症、フォンビルブランド病、毛細血管拡張性運動失調、b-地中海貧血症又は腎結
石である。
別の実施態様において、遺伝病は、膠原病である。実施態様において、膠原病は、骨形
成不全症又は肝硬変である。
別の実施態様において、遺伝病は、糖尿病である。
別の実施態様において、遺伝病は、炎症性疾患である。好ましい実施態様において、炎
症性疾患は、関節炎である。

別の実施態様において、遺伝病は、中枢神経系疾患である。一つの実施態様において、
中枢神経系疾患は、神経変性疾患である。好ましい実施態様において、中枢神経系疾患は
、多発性硬化症、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄の筋肉萎縮
症、アルツハイマー病、テイ・サックス病、後期乳児の神経セロイドリポフスチン症（LI
NCL）又はパーキンソン病である。
別の実施態様において、遺伝病は、癌である。好ましい実施態様において、癌は、頭頸
部、眼、皮膚、口、咽喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、S字結腸、直腸、胃、前立腺、乳
房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓、脳、小腸、心臓又は副腎のものである。
別の好ましい実施態様において、癌は、腫瘍抑制遺伝子に関連した（例えばGarinisら
の論文、2002, Hum Gen 111：115-117；Meyersらの論文、1998, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 95：15587-15591；Kungらの論文、 2000, Nature Medicine 6（12）：1335-1340を
参照されたい）。このような腫瘍抑制遺伝子は、APC、ATM、BRACl、BRAC2、MSHl、pTEN、
Rb及びp53を含むが、限定されない。

特に好ましい実施態様において、腫瘍抑制遺伝子は、p53遺伝子である。ナンセンス突
然変異は、p53遺伝子において同定され、かつ癌に関係していた。p53遺伝子において、い
くつかのナンセンス突然変異が同定された（例えば、Masudaらの論文、2000, Tokai J Ex
p Clin Med. 25（2）：69-77；Ohらの論文、2000, Mol Cells 10（3）：275-80；Liらの
論文、2000, Lab Invest. 80（4）：493-9；Yangらの論文、1999, Zhonghua Zhong Liu Z
a Zhi 21（2）：114-8；Finkelsteinらの論文、1998, Mol Diagn. 3（1）：37-41；Kajiy
amaらの論文、1998, Dis Esophagus. 11（4）：279-83；Kawamuraらの論文、1999, Leuk
Res. 23（2）：115-26；Radigらの論文、1998, Hum Pathol. 29（11）：1310-6；Schuyer
らの論文、1998, Int J Cancer 76（3）：299-303；Wang-Gohrkeらの論文、1998, Oncol
Rep. 5（l）：65-8；Fulopらの論文、1998, J Reprod Med. 43（2）：119-27；Ninomiya
らの論文、1997, J Dermatol Sci. 14（3）：173-8；Hsiehらの論文、1996, Cancer Lett
.100（l-2）：107-13；Rallらの論文、1996, Pansreas. 12（l）：10-7；Fukutomiらの論
文、1995, Nippon Rinsho. 53（11）：2764-8；Frebourgらの論文、1995, Am J Hum Gene
t. 56（3）：608-15；Doveらの論文、1995, Cancer Surv. 25：335-55；Adamsonらの論文
、1995, Br J Haematol. 89（l）：61-6；Graysonらの論文、1994, Am J Pediatr Hemato
l Oncol. 16（4）：341-7；Lepelleyらの論文、1994, Leukemia. 8（8）：1342-9；Mclnt
yreらの論文、1994 J Clin Oncol. 12（5）：925-30；Horioらの論文、1994, Oncogene.
9（4）：1231-5；Nakamuraらの論文、1992, Jpn J Cancer Res. 83（12）：1293-8；Davi
doffらの論文、1992, Oncogene. 7（l）：127-33；及びIshiokaらの論文、1991, Biochem
Biophys Res Commun. 177（3）：901-6を参照されたい；これらの開示は、その全体が参
照により本明細書に組み込まれる）。上で引用された参照に記述されるナンセンス突然変
異を含むが、限定されない、中途での翻訳コドンをコードするp53遺伝子に関連した任意
の疾患は、本発明の方法によって治療し、管理し、及び/又は予防することができる。

本発明の方法によって治療され、管理され、及び/又は予防される更なる疾患には、固
形腫瘍、肉腫、癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、
血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉
腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、
基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気
管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮
頚癌、睾丸腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮性の癌腫、神経膠腫、星細胞腫
、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、カポジ肉腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、
乏突起細胞腫、月経血管腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、血液由来腫瘍（bloo
d-born tumor）、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性B細胞白血病、急性リンパ
芽球性T細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性単芽球性白血
病、急性赤白血病性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リン
パ球性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリ
ーセル白血病又は多発性骨髄腫を含む。例えば、ハリソンの体内医学の原理（Harrison's
Principles of Internal Medicine）、Eugene Braunwaldらの文献、編、 pp. 491-762（
第15版、2001）を参照されたい。

一部の実施態様において、本発明の方法によって予防され、治療され、及び/又は管理
される疾患には、上記の表10に収載された疾患を含む。特定の実施態様において、予防さ
れ、治療され、及び/又は管理される疾患は、胃腸の障害及び/又は皮膚の障害でない。一
部の実施態様において、予防され、治療され及び/又は管理される疾患は、以下の疾患の1
つ以上ではない：基底細胞母斑症候群（例えば、PTCH遺伝子）、散発性基底細胞癌（例え
ば、PTCH遺伝子）、黒色腫（例えば、CDKN2a遺伝子）、接合部表皮水泡症（例えば、LAMB
3、LAM2、LAMA3遺伝子）、全般性萎縮性良性表皮水泡症（例えば、COL17Al遺伝子）、ジ
ストロフィー性表皮水泡症（例えば、COL7A1遺伝子）、ヘイリー・ヘイリー病（例えば、
ATP2C1遺伝子）、ダリエ病（例えば、ATP2A2遺伝子）、葉状魚鱗癬（例えば、TGMl遺伝子
）、X連鎖魚鱗癬（例えば、STS遺伝子）、乾皮症色素変性（例えば、XPA、XPC、XPG遺伝
子）、ブルーム症候群（例えば、BLM遺伝子）、線条体掌蹠角皮症（例えば、DSP、DSGl遺
伝子）、コケイン症候群（例えば、ERCC6遺伝子）、眼皮膚白化症（例えば、TYR、TYRPl
遺伝子）、ヘルマンスキー・プドラック症候群（例えば、HPSl、HPS4遺伝子）、毛細血管
拡張性運動失調（例えば、ATM遺伝子）、グリセリ（Griscelli）症候群（例えば、RAB27A
、MYO5A遺伝子）及び外胚葉性異形成症／皮膚脆弱性（例えば、PKP1遺伝子）。一部の実
施態様において、ナンセンス突然変異（群）を含む遺伝子（群）によってコードされる機
能的リードスルータンパク質の産生によって治療され、予防され及び／又はを管理される
疾患は、以下の疾患の1つ以上ではない：食道（p53遺伝子）及び結腸（APC、p53遺伝子）
、バレット食道（p53遺伝子）の散発性の癌や、腺腫性ポリープ症大腸菌（APC遺伝子）、
遺伝性非ポリープ性大腸癌（MLHl、MSH2遺伝子）、ポイツ-ジェガーズ症候群（STK 11遺
伝子）及びカウデン症候群（PTEN遺伝子）などの遺伝性の癌症候群。

（5.7 製剤）
ナンセンスコドン抑制薬の有効量を含む医薬組成物及び単一の単位剤形は、本発明の方
法に使用することができる。個々の剤型は、経口、粘膜（舌下腺、頬側、直腸、経鼻又は
膣を含む）又は非経口的（皮下、筋肉内、丸薬投与、動脈内又は静脈内を含む）投与のた
めに適切であってもよい。好ましい医薬組成物及び単一の単位剤形は、経口投与に適切で
ある。一つの実施態様において、医薬組成物又は単一の単位剤形は、1つ以上の有効量の
ナンセンスコドン及びナンセンスコドン抑制薬を調製するために使用される合成経路の1
つ以上の不純物を含む。
一つの実施態様において、医薬組成物は、固体経口剤形である。一つの実施態様におい
て、医薬組成物は、液体経口剤形である。特定の実施態様において、本発明の方法は、ナ
ンセンスコドン抑制薬が経口的に生物利用可能である、用量、単位投薬量製剤又は医薬組
成物の投与を含む。経口投与の利点には、投与の容易さ、投薬処方計画でのより高い患者
のコンプライアンス、臨床的有効性、より少ない合併症、より短い入院及び全体の費用削
減を含むことができる。

別の実施態様において、本発明の方法は、約35mg〜約1400mg、約125mg〜約1000mg、約2
50mg〜約1000mg又は約500mg〜約1000mgの間のナンセンスコドン抑制薬を含む単位投薬量
製剤の投与を含む。一つの実施態様において、単位投薬量製剤は、ボトルに、ナンセンス
コドン抑制薬及び医薬として許容し得る溶媒（例えば、水、乳、炭酸飲料、ジュース、ア
ップルソース、乳児食又は乳児用処方）における懸濁のために適した1つ以上の担体又は
賦形剤を含む。
別の実施態様において、本発明の方法は、35mg、50mg、70mg、100mg、125mg、140mg、1
75mg、200mg、250mg、280mg、350mg、500mg、560mg、700mg、750mg、1000mg又は1400mgの
ナンセンスコドン抑制薬を含む単位投薬量製剤の投与を含む。好ましい単位投薬量製剤は
、約125mg、約250又は約1000mgのナンセンス突然変異抑制薬を含む。一つの実施態様にお
いて、単位投薬量製剤は、ボトルに、ナンセンスコドン抑制薬及び医薬として許容し得る
溶媒（例えば、水、乳、炭酸飲料、ジュース、アップルソース、乳児食又は乳児用処方）
における懸濁のために適した1つ以上の担体又は賦形剤を含む。好ましい単位投薬量製剤
は、粉末及び小さい包みである。

本明細書に記述した単位投薬量製剤は、約2℃〜約8℃の間にて貯蔵されることが推奨さ
れると共に、単位投薬量製剤は、再構成の前に約48時間室温で貯蔵させることができる。
一つの実施態様において、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イ
ル]-安息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒若しくは水和物の250mgの単位投薬
量製剤の再構成は、約10mlの水を3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール
-3-イル]-安息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒若しくは水和物を含むボトル
に直接添加することによって実施して、懸濁液の総容積において約25mg/mlの濃度を達成
する。3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はそ
の医薬として許容し得る塩、溶媒若しくは水和物の1000mgの単位投薬量製剤については、
約20mlの水を3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒若しくは水和物を含むボトルに直接添加して、懸
濁液の総容積において約50mg/mlの濃度を達成する。水が添加された直後に、ボトルには
キャップがかぶせ、均一な懸濁液を達成するために少なくとも約30秒間、手で穏やかに振
盪される。再構成された懸濁液が、摂取の24時間前まで本来のプラスチックボトルに残っ
ていてもよいが、薬物は、再構成の直後に摂取されることが推奨される。再構成と投薬と
の間に約15分を超える遅延がある場合、ボトルは、少なくとも約30秒間、手で穏やかに再
振盪をさせるべきであることが推奨される。懸濁液は、ボトルから直接投与されることが
推奨される。粉末がボトルに残されていないことを保証するために、ボトルを一度水です
すいで、このすすいだ水を摂取することが更に推奨される。

患者に対する経口投与のための単一の単位剤形には、以下を含むが、限定されない：サ
ッシェ；カシェ剤；錠剤；咀嚼錠；カプレット；軟弾性ゼラチンカプセルなどのカプセル
；トローチ；ロゼンジ；分散剤；粉末；溶液；懸濁液（例えば、水性又は非水溶液体の懸
濁液）；乳剤（例えば、水中油乳剤又は油中水型液状乳剤）；及びエリキシルを含む液体
剤形。一つの実施態様において、本発明の方法は、飽和濃度を上回るコロイド溶液又はさ
らなる活性薬剤との溶液の投与を含む。本発明の方法に有用な具体的剤形が互いに異なっ
ているであろうこれらの及びその他の方法は、当業者に直ちに明らかであろう。例えば、
レミントンの医薬品科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）、第18版、Mack、Eas
ton PA（1990）を参照されたい。

本発明の方法は、ナンセンスコドン抑制薬を含む無水の医薬組成物及び剤形の投与を更
に含む。無水の医薬組成物及び剤形は、無水又は低水分含有成分及び低水分又は低湿度条
件を使用して調製することができる。
典型的な経口剤形は、ナンセンスコドン抑制活性を有する化合物を均質な混合物におい
て、従来の薬学的混合技術に従った少なくとも１つの担体又は賦形剤と組み合わせること
によって調製される。賦形剤は、投与のために望まれる製剤の形態に応じて多種多様な形
態を採用することができる。例えば、経口液体又はエアロゾル剤形に使用するために適し
た賦形剤には、水、グリコール、油、アルコール、香料（例えば、バニラ抽出物）、防腐
剤及び着色剤を含むが、限定されない。固体経口剤形（例えば、粉末、錠剤、咀嚼錠、小
さい包み、カプセル及びカプレット）に使用するために適した賦形剤の例には、デンプン
、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤及び崩壊剤を含むが、限定
されない。
特に好ましい単位投薬量製剤は、医薬として許容し得る溶媒（例えば、水、乳、炭酸飲
料、ジュース、アップルソース、乳児食又は乳児用処方）における再構成及びその後の経
口投与のために適しているナンセンスコドン抑制薬の有効量を含む粉末製剤である。特定
の実施態様において、粉末は、ナンセンスコドン抑制薬と組み合わせて1つ以上の担体又
は賦形剤を任意に含むことができる。別の実施態様において、粉末は、投与又は再構成の
前に密封容器に貯蔵することができる。更に別の実施態様において、粉末は、カプセル化
することができる（例えば、ゼラチンカプセルに）。

経口投与のための液状製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとってもよく
、又はこれらは、使用前に水若しくはその他の適切な媒体との構成のための乾燥製品（例
えば、粉末又は顆粒）として存在してもよい。このような液状製剤は、懸濁剤（例えば、
ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素付加された食用脂）；乳化剤（例えば
、レシチン又はアカシア）；非水溶媒体（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコ
ール又は分画された植物油）；及び防腐剤（例えば、メチル又はプロピル-p-ヒドロキシ
ベンゾアート又はソルビン酸）；などの、医薬として許容し得る添加物と共に従来の手段
によって調製してもよい。また、調剤は、適切な場合、緩衝塩、香料、着色料及び甘味料
を含んでいてもよい。
固体経口剤形に使用することができる賦形剤の例には、結合剤、充填剤、崩壊剤及び滑
剤を含むが、限定されない。医薬組成物及び剤形に使用するために適した結合剤には、コ
ーンスターチ、ジャガイモデンプン又はその他のデンプン、ゼラチン、アカシアなどの天
然及び合成ゴム、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、その他のアルギン酸塩、トラガン
ト末、ガーゴム、セルロース及びその誘導体（例えば、エチルセルロース、酢酸セルロー
ス、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシルメチルセルロースナトリウム
）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース（例えば、番号2208、2906、2910）、微結晶質セルロース、並びにこ
れらの混合物を含むが、限定されない。
好ましい賦形剤は、Litesse（登録商標）Ultra（精製したポリデキストロース）、マン
ニトール、界面活性物質薬剤（ポリエチレングリコール3350及びLutrol（登録商標）micr
o F127（ポロキサマー407粉末））、崩壊剤（クロスポビドン）、cab-o-sil、Carbopol（
登録商標）、ポリアクリル酸及びその他の賦形剤（ヒドロキシエチルセルロース、バニラ
香料、ステアリン酸マグネシウム（非ウシ）及びコロイドシリカ）を含む。

本明細書に開示される、医薬組成物及び固体の剤形に使用するために適した充填剤の例
には、乳糖、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒又は粉末）、微結晶性セルロース、
粉末セルロース、デキストレート（dextrates）、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソ
ルビトール、デンプン、アルファ化デンプン及びこれらの混合物を含むが、限定されない
。本発明の医薬組成物における結合剤又は充填剤は、典型的に医薬組成物又は剤形の約50
〜約99重量パーセントで存在する。
微結晶性セルロースの適切な形態には、AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-58
1、AVICEL-PH-105（FMC Corporation、American Viscose Division、Avicel Sales、Marc
us Hook、PAから入手可能）として販売される材料及びこれらの混合物を含むが、限定さ
れない。具体的な結合剤は、AVICEL RC-581として販売された微結晶性セルロース及びカ
ルボキシルメチルセルロースナトリウムの混合物である。適切な無水若しくは低水分賦形
剤又は添加物には、AVICEL-PH-103（商標）及びStarch 1500 LMを含む。

（5.8 投薬及び投薬処方計画）
理論によって限定されないが、本発明の方法は、部分的には、中途での翻訳終結及び/
又はナンセンスを媒介したmRNA減衰の抑制を最適化するナンセンスコドン抑制薬のための
特異的な用量及び投薬処方計画を包含する。
本発明の方法は、中途での翻訳終結及び/若しくはナンセンスを媒介したmRNA減衰の抑
制により治療可能、予防可能及び/若しくは管理可能な疾患又はその症候の治療、予防及
び管理、と共に、有害な、若しくは望まれない効果、例えば毒性若しくは副作用を減少又
は回避させることを包含する。本明細書に記述した用量及び投薬処方計画の好ましい投与
の経路は、経口である（すなわち、活性薬剤の飽和濃度を上回るさらなる活性薬剤との溶
液、コロイド溶液又は溶液の摂取）。一つの実施態様において、本明細書に記述した用量
及び投薬処方計画の投与経路は、局所的（例えば、皮膚）である。
本明細書に記述した用量及び投薬処方計画は、ナンセンスコドン抑制活性を有する化合
物の望ましい血漿濃度を達成し、かつ維持するこれらの能力のために有用であると考えら
れる。理論によって限定されないが、例えば24時間又はより長い間にわたって、ナンセン
ス突然変異抑制薬の比較的一定の血漿濃度を達成し、かつ維持することにより、有益な治
療効果を患者に提供すると考えられる。本明細書に記述した用量及び投薬処方計画は、ナ
ンセンスコドン抑制活性を有する化合物のこのような治療的血漿濃度を達成し、かつ維持
するために有用である。

一つの実施態様において、本発明の方法は、ナンセンスコドン抑制薬を投与することを
含み、化合物は、その必要のある患者に12又は24時間の間に1、2又は3回投与され、それ
ぞれの投与は、好ましくは約4〜14時間まで離される。特定の実施態様において、ナンセ
ンスコドン抑制薬は、朝に一度、午後に一度及び夜に一度投与される。別の実施態様にお
いて、ナンセンスコドン抑制薬は、朝に一度及び夜に一度投与される。別の実施態様にお
いて、ナンセンスコドン抑制薬は、朝に一度、午後に一度又は夜に一度投与される。投薬
の好ましい間隔は、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及び14時間を含む。
一つの実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬の用量は、24時間の期間を通じて増
大される。特定の実施態様において、投与される第2の用量は、第1の用量と比較して増大
される（例えば、2倍になる）。別の実施態様において、投与される第1及び第2の用量は
、一定に保たれ、投与される第3の用量は増大される（例えば、2倍になる）。理論によっ
て限定されないが、ナンセンスコドン抑制薬の投与に伴う日中の変動があると考えられ、
夜に投与される用量の血漿濃度は、朝又は午後に投与される用量のものより多くなる。更
に理論によって限定されないが、以前に投与した用量と比較して夜に投与した用量を倍に
することは、ナンセンスコドン抑制薬に対する総曝露を減らすとともに、標的血漿濃度を
至適に持続するであろうと考えられる。

特定の実施態様において、24時間の間に3用量が、式：1X、1X、2Xに従って投与され、
ここでXは、特定の初回用量（例えば、4mg/kg、7mg/kg又は10mg/kg）である。別の実施態
様において、ナンセンスコドン抑制薬は、食事をとっている患者の約10、15、30、45又は
60分以内に（すなわち、前か後に）投与される。一つの実施態様において、ナンセンスコ
ドン抑制薬の有効量は、食物に振り掛けらえる、又は混合される。一つの実施態様におい
て、ナンセンスコドン抑制薬の投与の前、同時に又は後に消費される食べ物は、高脂肪及
び/又は高カロリー及び/又は高タンパク質である。
一つの実施態様において、用量限定であるとみなされる治療のサイクルの間に有害事象
が発症する場合、投与される第2の又は第3の用量（例えば、夕方用量）は、治療のサイク
ルの残りの間又は有害事象が静まるまで、約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、4
5%、50%、75%に減少され、又は全く投与されない。
特に好ましい投薬処方計画は、およそ6、6及び12時間の間隔での食事の後に30分以内に
、ナンセンスコドン抑制薬が患者に投与されるものである（例えば、〜午前7時の朝食の
後、〜午後1時の昼食の後及び〜午後7時の夕食の後）。

更に別の実施態様において、本発明の方法は、その必要のある患者に0.1mg/kg〜500mg/
kg、1mg/kg〜250mg/kg、1mg/kg〜150mg/kg、1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜50mg/kg、1mg/k
g〜25mg/kg、1mg/kg〜20mg/kg、1mg/kg〜10mg/kg又は2mg/kg〜10mg/kgの間の単一の又は
分割（例えば、24時間の間に3回）用量のナンセンスコドン抑制薬の投与を含む。特定の
実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬は、約2〜6mg/kg、約5〜9mg/kg、約6〜10mg/
kg、約8〜12mg/kg、約12〜16mg/kg又は約18〜22mg/kgの用量で投与される。特定の実施態
様において、ナンセンスコドン抑制薬は、約3mg/kg、約4mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約
8mg/kg、約10mg/kg、約14mg/kg、約20mg/kg、約30mg/kg、約50mg/kg、約100mg/kg、約200
mg/kg又は約300mg/kgの用量で投与される。別の実施態様において、前述の実施態様にお
いて記述されたナンセンスコドン抑制薬の任意の用量は、24時間の間に1、2又は3回投与
される。

別の実施態様において、本発明の方法は、ナンセンスコドン抑制薬が、一定期間（例え
ば、5、7、10、14、20、24、28、60又は120日又はそれ以上）その必要のある患者に毎日
投与される連続療法を含む。一つの実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬が、24時
間の期間あたり1、2又は3回連続投与される。別の実施態様において、ナンセンスコドン
抑制薬は、毎日、毎週、毎月又は毎年、連続投与される。具体的実施態様において、ナン
センスコドン抑制薬は、何日も、何週も、何月も又は何年もの間、約4mg/kg、約4mg/kg〜
約8mg/kgの用量にて24時間の期間あたり1、2又は3回連続投与される。具体的実施態様に
おいて、ナンセンスコドン抑制薬は、何日も、何週も、何月も又は何年もの間、約7mg/kg
、約7mg/kg〜約14mg/kgの用量にて24時間の期間あたり3回連続投与される。具体的実施態
様において、ナンセンスコドン抑制薬は、何日も、何週も、何月も又は何年もの間、約10
mg/kg、約10mg/kg〜約20mg/kgの用量にて24時間の期間あたり3回連続投与される。別の特
定の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬は、何日も、何週も、何月も又は何年も
の間、約8mg/kgの用量にて24時間の期間あたり2回連続投与される。

別の特定の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬は、第1のサイクルにおいて、
何日も、何週も、何月も又は何年もの間、約4mg/kg、約4mg/kg〜約8mg/kgの用量にて24時
間の期間あたり3回連続投与され、続いて第2のサイクルにおいて、何日も、何週も、何月
も又は何年もの間、約8mg/kgの用量にて24時間の期間あたり2回連続投与される。別の特
定の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬は、第1のサイクルにおいて何日も、何
週も、何月も又は何年もの間、約8mg/kgの用量にて24時間の期間あたり2回連続投与され
、続いて第2のサイクルにおいて、何日も、何週も、何月も又は何年もの間、約4mg/kg、
約4mg/kg〜約8mg/kgの用量にて24時間の期間あたり3回連続投与される。これらの実施態
様では、第1及び第2のサイクルは、ナンセンスコドン抑制薬が投与されない休止期によっ
て分離され、又は休止期が続く。休止期は、何日も、何月も又は何年もの間持続すること
ができる。

ナンセンスコドン抑制薬が投与されるそれぞれの24時間の期間において、好ましくはお
よそ6、6及び12時間の間隔にて3回投与される（例えば、〜午前7時の朝食の後、〜午後1
時の昼食の後及び〜午後7時の夕食の後）。
療法の経過のための治療期間は、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10
週、11週、12週、13週、14週、4月、5月、6月、7月、8月、9月、10月、11月、1年、2年、
3年、4年、5年又はそれ以上にわたることができる。具体的実施態様において、療法の経
過のための治療期間は、対象の生涯にわたる。治療期間は、1日、1週、2週、3週、4週、5
週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、4月、5月、6月、7月、8月、9
月、10月、11月、1年、2年、3年、4年、5年又はそれ以上にわたり得る休止期間によって
中断され得る。このような決定は、当業者（例えば、医師）によってなされ得る。
その必要のある患者に投与されるナンセンスコドン抑制薬の量は、問題の患者の実際の
体重又は問題の患者集団（例えば、胚、胎児、乳児、子供、成人及び高齢者を含む白人男
性、白人女性、アフリカ系アメリカ人男性、アフリカ系アメリカ人女性、アジア男性又は
アジア女性）の平均体重に基づいて算出され、又は算出することができることが理解され
よう。

（5.9 血漿濃度）
一つの実施態様において、本発明の方法は、0.1μg/ml〜500μg/ml、0.1μg/ml〜400μ
g/ml、0.1μg/ml〜300μg/ml、0.1μg/ml〜200μg/ml、0.1μg/ml〜100μg/ml又は2μg/m
l〜10μg/mlのナンセンスコドン抑制薬の血漿濃度を約1〜72時間、2〜48時間又は2〜24時
間、患者において維持することを含み、その必要のある患者にナンセンスコドン抑制薬の
有効量を投与することを含む。別の実施態様において、本発明の方法は、約0.1μg/ml、
約1μg/ml、約2μg/ml、約5μg/ml、約10μg/ml、約15μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml
、約30μg/ml、約40μg/ml、約50μg/ml、約75μg/ml、約100μg/ml、約125μg/ml、約15
0μg/ml、約175μg/ml、約200μg/ml、約225μg/ml、約250μg/ml、約275μg/ml、約300
μg/ml、約325μg/ml、約350μg/ml、約375μg/ml又は約400μg/ml以上のナンセンスコド
ン抑制薬の血漿濃度を少なくとも約2、4、6、8、12、24、36又は48時間患者において維持
することを含み、その必要のある患者にナンセンスコドン抑制薬の有効量を投与すること
を含む。特定の実施態様において、投与は、経口である。

別の実施態様において、本発明の方法は、約0.1μg/ml〜約400μg/mlのナンセンスコド
ン抑制薬の血漿濃度を少なくとも約2、4、6、8、12又は24時間患者において維持すること
を含み、その必要のある患者に1日あたり3回まで同量又は増量にてナンセンスコドン抑制
薬の有効量を投与することを含む（例えば、本明細書に記述したように1X、1X、2X）。特
定の実施態様において、投与は、経口である。
特定の実施態様において、ナンセンスコドン抑制薬の患者の血漿レベルは、その必要の
ある患者に1日あたり3回ナンセンスコドン抑制薬を投与することにより、少なくとも約2
、4、6、8、12又は24時間約0.1μg/ml〜約400μg/mlより上に維持される。特定の実施態
様において、投与は、経口である。
一つの実施態様において、本発明の方法は、血漿濃度T_maxが、投与後約1〜約3時間又は
約2〜約4時間で生じるようにナンセンス突然変異抑制薬を投与することを含む。
一つの実施態様において、本発明の方法は、血漿濃度平均値の半減期t_1/2が、約2〜約6
時間又は約3〜約6時間であるようにナンセンス突然変異抑制薬を投与することを含む。
特定の実施態様において、本発明の方法は、健常人において産生される対応する野生型
タンパク質の量と比較してインビボにおける機能的リードスルータンパク質を1%以上、2%
以上、3%以上、4%以上、5%以上、7%以上、10%以上、12%以上、15%以上、17%以上、20%以
上、22%以上、25%以上、27%以上、30%以上、32%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%
以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上又は80%以上産生するのに有効な量
でナンセンスコドン抑制薬を投与することを含む。一部の実施態様において、本発明の方
法は、健常人における対応する野生型タンパク質の活性のおよそ1%、およそ2%、およそ3%
、およそ4%、およそ5%、およそ10%、およそ15%、およそ20%、およそ25%、およそ30%、お
よそ35%、およそ40%、およそ45%、およそ50%、およそ55%、およそ60%又はそれ以上を生じ
るのに十分な機能的リードスルータンパク質を産生するため有効な量でナンセンスコドン
抑制薬を投与することを含む。
具体的実施態様において、本発明の方法は、健常人において産生されるCFTRタンパク質
の量と比較して、インビボにおける機能的リードスルーCFTRタンパク質の少なくとも約1%
以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、7%以上、10%以上、12%以上、15%以上、17%以上
、20%以上、22%以上、25%以上、27%以上、30%以上、32%以上、35%以上、40%以上、45%以
上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上又は80%を産生するための
有効な量でナンセンスコドン抑制薬を投与することを含む。
別の実施態様において、本発明の方法は、健常人において産生されるジストロフィンタ
ンパク質の量と比較して、インビボにおける機能的リードスルージストロフィンタンパク
質の約1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、7%以上、10%以上、12%以上、15%以上
、17%以上、20%以上、22%以上、25%以上、27%以上、30%以上、32%以上、35%以上、40%以
上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上又は80%を産生す
るための有効な量でナンセンスコドン抑制薬を投与することを含む。

（5.10 治療指標）
当業者によって認識される本明細書に開示した疾患のための任意の治療指標又は結果を
、本発明の方法と関連して使用することができる（例えば、Politanoらの論文、2003, Ac
ta Myologica XXII：15-21を参照されたい、その全体が本明細書に参照により組み込まれ
る）。代表的な治療指標は、実施例に記載したものを含む本明細書に記述したものを含む
が、限定されない。
デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための代表的な指標には：別のジストロフィンを産
生することができないであろう筋肉におけるジストロフィンの産生（例えば、骨格筋細胞
の筋細胞膜におけるジストロフィンの再発現）；筋肉MRI関与のパターン及び治療される
筋肉対反対側の未処置の筋肉の筋肉体積；肘及び膝の屈筋及び伸筋及び握力の個々のQMT
スコア及び医学研究会議（Medical Research Council：MRC）の筋力評価法を使用して測
定されるマニュアル筋力試験スコアを含む筋力及び筋パフォーマンス；を含むが、限定さ
れない。

定量的筋力は、例えば、小児科の定量的測定系（PQMS）を使用することによって測定す
ることができる。主要な一強度マーカーは、対の屈筋/伸筋グループからなる、上肢及び
下肢の定量的ミオメトリー（QMT）スコアを含む。
嚢胞性線維症のための代表的な指標には：経鼻の経上皮電位差（TEPD）によって評価さ
れるCFTR活性；副作用、CFTRタンパク質及びmRNAの存在、並びに肺機能を；含むが、限定
されない。
アミロイド症のための代表的な指標には：アミロイドβタンパク質のクリアランス；体
重増加、糸球体濾過速度、中隔の厚み、アミロイドタンパク質及び心臓アミロイド負荷の
経壁組織分布、血清における免疫グロブリンに関連した遊離軽鎖（FLC）のカッパ/ラムダ
比、並びに心臓トロポニンT及びIの非存在（cTnT、cTnI）の非存在を含むが、限定されな
い。

血友症のための代表的な指標には：凝固活性化、組織因子で誘導されるフィブリン形成
及びtPAを媒介した線維素溶解の血餅溶解時間の減少を含むが、限定されない。
アルツハイマー病のための代表的な指標にはアミロイド前駆体タンパク質（APP）アイ
ソフォームの血小板比の変化；全体的、認知（心理測定的な検査、例えば、修飾されたミ
ニ精神状態検査（MMSE）又は改変されたHachinski虚血性スコアによって測定されるとお
り）、機能的及び行動的測定（日常生活動作及び挙動、特に動揺、脳容の減少（例えば、
MRIを使用して測定される）を含む）を含むが、限定されない。また、Caban-Holtらの論
文、Geriatrics. 2005 Jun；Suppl：3-8を参照されたい。
パーキンソン病のための代表的な指標には、統合パーキンソン病級別スケール（Unifie
d Parkinson's Disease Rating Scale：UPDRS）でのスコア、MMSE、Hamilton-17鬱病、NP
I、「オン」への合計の毎日の時間（total daily time to "on"：TTON）、運動性試験、
運動異常評価、患者の日記及び（18）F-dopa取り込みを含むが、限定されない。

アテローム性動脈硬化症及び家族性高コレステロール血症のための代表的な指標には、
コレステロールレベルの減少、例えばMDA-LDLレベルの減少及び/又は高密度リポタンパク
質コレステロールの増加；血清脂肪酸プロフィール、血漿リポタンパク質及び血管炎症マ
ーカー、血漿ホモシステイン濃度の減少、アテローム硬化型血管におけるプラーク形成（
MRI又は血管内超音波（IVUS）による）、例えば電子ビームコンピューター断層撮影法に
よって測定される冠動脈石灰化（CAC）、並びに例えば総頚動脈（CCA）、内頚動脈（ICA
）及び頚動脈球根状セグメントの頚動脈内膜中膜肥厚（IMT）測定によって測定される動
脈封鎖の減少を含むが、限定されない。
小人症及び巨人症のための代表的な指標には、成長ホルモン及びプロラクチンの高さ及
びレベルを含むが、限定されない。

甲状腺機能低下症及び甲状腺機能亢進症のための代表的な指標には、TT3、TT4及びTSH
血清レベル、甲状腺形態及びサイズ、骨年齢、成長発達及び発達指数（DQ）の評価を含む
が、限定されない。
網膜色素変性症のための代表的な指標には、ドコサヘキサエン酸（DHA）レベル、Humph
rey Field Analyzer視野感受性、30Hzの網膜電図振幅及び視力によって測定される眼機能
を含むが、限定されない。
後期乳児神経セロイドリポフスチン症のための代表的な指標には、LINCL臨床評価スケ
ール及び脳の磁気共鳴映像法/磁気共鳴分光法評価に基づいた神経学的評価を含むが、限
定されない。

脊髄筋肉萎縮症のための代表的な指標には、筋力、運動機能及び検査インデックス（IF
M）の合計、呼吸筋麻痺インデックス（IMR）、並びに背側臥位強制生命許容量/理論的イ
ンデックス（the dorsal decubitus forced vital capacity/theoretical index）（ICV
／CT）、携帯筋力計での最大自発的等尺性収縮及び腕メガスコア（合計の肘屈曲、ハンド
グリップ及び三点ピンチスコア）及び肢メガスコア（合計の膝屈曲、膝伸長及び足伸長ス
コア）の計算、総運動機能測定、肺機能検査、定量的筋肉試験、並びに生活の質を含むが
、限定されない。
血管拡張性失調症のための代表的な指標には、α胎児タンパク質の減少、免疫機能の改
善及び神経学的機能の改善を含むが、限定されない。
バーター症候群のための代表的な指標には、血液カリウムレベルの増加、成長の増加及
び精神的機能の改善を含むが、限定されない。

（5.11 遺伝子療法）
遺伝子療法は、発現された、又は発現可能な核酸配列を対象に投与することによって行
われる療法をいう。当該技術分野に利用可能な遺伝子療法のための任意の方法を、本発明
に従って使用することができる。例示的な方法を下記に記述してある。
遺伝子療法の方法の一般的な総説については、Goldspielらの論文、1993, Clinical Ph
armacy 12：488-505；WuおよびWuの論文、1991, Biotherapy 3：87-95；Tolstoshevの論
文、1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32：573-596；Mulliganの論文、Science 260
：926-932（1993）；及びMorganおよびAndersonの論文、1993, Ann. Rev. Biochem. 62：
191-217；1993年5月、TIBTECH 11（5）：155-215を参照されたい。使用することができる
組換えDNA技術の当該技術分野において公知の方法は、Ausubelらの文献、（編）、分子生
物学の現在のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、John Wiley & S
ons NY（1993）； 及びKrieglerの文献、遺伝子導入及び発現、実験室マニュアル（Gene
Transfer and Expression, A Laboratory Manual）、Stockton Press, NY（1990）に記述
されている。

一つの態様において、核酸配列は、適切な宿主において核酸配列を発現する発現ベクタ
ーの一部である。特に、このような核酸配列は、タンパク質のコード領域に作動可能に連
結したプロモーター（異種のプロモーターを含む）を含み、前記プロモーターは、誘導性
又は構成的及び任意に組織特異的である。別の詳細な実施態様において、核酸配列は、タ
ンパク質をコードする配列及び任意の他の所望の配列が、ゲノムにおける所望の部位で相
同的組換えを引き起こす領域によって隣接し、従ってタンパク質をコードする核酸配列の
染色体内発現を提供するように使用される（KollerおよびSmithiesの論文、1989, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 86：8932-8935；Zijlstraらの論文、1989, Nature 342：435-438
）。
対象への核酸配列の送達は、直接的に、対象が直接核酸配列又は核酸配列を運ぶベクタ
ーにさらされる直接的か、又は間接的に、細胞を最初にインビトロで核酸で形質転換して
、次いで対象内に移植される、のいずれであってもよい。これらの2つのアプローチは、
それぞれインビボ又はエキソビボ遺伝子療法として知られている。

具体的実施態様において、核酸配列は、インビボで直接投与され、この場合、それはコ
ードされた産物を産生するように発現される。これは、当該技術分野において公知の多数
の方法のいずれかによって、例えば適切な核酸発現ベクターの一部としてこれらを構築し
て、これらが細胞内になるようにそれを投与することによって、例えば欠陥若しくは減弱
レトロウイルス又はその他のウイルスベクター（米国特許第4,980,286号を参照されたい
）を使用する感染によって、又は裸のDNAの直接注射によって、又は微小粒子照射を使用
することによって（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）、又は核酸配列が含まれる
インサイチューの足場を有するマトリックスによって（例えば、欧州特許番号EP 0 741 7
85 B1及び米国特許第5,962,427号を参照されたい）、又は脂質、細胞表面受容体又はトラ
ンスフェクトする薬剤とのコーティング、すなわちリポソーム、微小粒子若しくはマイク
ロカプセルにおけるカプセル化によって、又は核に入ることが知られているペプチドに結
合してこれらを投与することによって、受容体依存性エンドサイトーシスを受けやすいリ
ガンドに結合してこれを投与すること（例えば、Wu及びWuの論文、1987, J. Biol. Chem.
262：4429-4432を参照されたい）（これは、受容体を特異的に発現する標的細胞型に使
用することができる）などによって達成することができる。別の実施態様において、核酸
-リガンド複合体は、リガンドがエンドソームを崩壊させる膜融合ウイルスのペプチドを
含んで、核酸がリソソームの分解を回避することを可能にするように形成することができ
る。更に別の実施態様において、核酸配列は、特異的受容体をターゲットすることによっ
て、細胞特異的取り込み及び発現のためにインビボでターゲットすることができる（例え
ば、PCT公報WO92/06180；WO92/22635；WO92/203 16；WO93/14188、WO93/20221を参照され
たい）。或いは、核酸配列は、細胞内に導入して、相同的組換えによる発現のために宿主
細胞のDNA内に組み込むことができる（Koller及びSmithiesの論文、1989, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA 86：8932-8935；及びZijlstraらの論文、1989, Nature 342：435-438）。

具体的実施態様において、予防薬又は治療薬をコードする核酸配列を含むウイルスベク
ターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Millerら
の論文、1993, Meth. Enzymol. 217：581-599を参照されたい）。これらのレトロウイル
スベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージング及び宿主細胞DNAへの組込みのた
めに必要な成分を含む。遺伝子療法に使用される核酸配列は、対象への遺伝子の送達を促
進する1つ以上のベクターにクローン化される。レトロウイルスベクターについてのより
多くの詳細は、Boesenらの論文、1994, Biotherapy 6：291-302において見いだすことが
でき、これは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にさせるために、造血幹細胞にmdr 1
遺伝子を送達するためのレトロウイルスのベクターの使用を記述する。遺伝子療法におけ
るレトロウイルスベクターの使用を例証するその他の参照は：Clowesらの論文、1994, J.
Clin. Invest. 93：644-651；Kleinらの論文、1994, Blood 83：1467-1473；Salmons及
びGunzbergの論文、1993, HGuman Gene Therapy 4：129-141；及びGrossman及びWilsonの
論文、1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3：110-114。

アデノウイルスは、遺伝子療法に使用することができるその他のウイルスベクターであ
る。アデノウイルスは、特に呼吸器上皮に遺伝子を送達するための魅力的な媒体である。
アデノウイルスは、本来、呼吸器上皮に感染し、そこでこれらは、軽度の疾患を生じさせ
る。アデノウイルスに基づいた送達系のその他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞及
び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点がある
。Kozarsky及びWilsonの論文、1993, Current Opinion in Genetics and Development 3
：499-503は、アデノウイルスに基づいた遺伝子療法の総説を示している。Boutらの論文
、1994, Human Gene Therapy 5：3-10は、アカゲザルの呼吸器上皮へ遺伝子を導入するた
めのアデノウイルスベクターの使用を証明した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使
用のその他の例は、Rosenfeldらの論文、1991, Science 252：431-434；Rosenfeldらの論
文、1992, Cell 68：143-155；Mastrangeliらの論文、1993, J. Clin. Invest. 91：225-
234；PCT公報W094/12649；及びWangらの論文、1995, Gene Therapy 2：775-783に見いだ
すことができる。好ましい実施態様において、アデノウイルスベクターが使用される。

また、アデノ随伴ウィルス（AAV）も、遺伝子療法における使用のために提唱されてき
た（Walshらの論文、1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204：289-300；及び米国特許第
5,436,146号）。
遺伝子療法に対する別のアプローチは、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カルシ
ウムを媒介したトランスフェクション又はウイルス感染などの方法によって遺伝子を組織
培養における細胞へ移すことを含む。通常、導入方法には、選別可能なマーカーを細胞に
導入することを含む。次いで、細胞を、導入された遺伝子を取り込み、かつ発現している
細胞を単離するための選択下に置く。次いで、これらの細胞を対象に送達する。
本実施態様において、核酸は、生じる組換え細胞のインビボにおける投与の前に細胞に
導入される。このような導入は、当該技術分野において公知の任意の方法によって実施す
ることができ、トランスフェクション、電気穿孔法、微量注入、核酸配列を含むウイルス
又はバクテリオファージベクターでの感染、細胞融合、染色体を媒介した遺伝子移入、ミ
クロセル介在遺伝子導入、スフェロプラスト融合などを含むが、限定されない。細胞への
外来遺伝子の導入について、多数の技術が当該技術分野において公知であり（例えば、Lo
effler及びBehrの論文、1993, Meth. Enzymol. 217：599-618；Cohenらの論文、1993, Me
th. Enzymol. 217：618-644；Clin. Pharma. Ther. 29：69-92 （1985）を参照されたい
）、本発明に従って使用してもよいが、宿主細胞の必要な発達及び生理学的な機能を妨げ
ないことを条件とする。本技術は、細胞への核酸の安定な導入を提供するはずであり、そ
の結果、核酸は、細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性で、かつその細胞子孫
によって発現可能である。

生じる組換え細胞は、当該技術分野において公知の種々の方法によって対象に送達する
ことができる。組換え血液細胞（例えば、造血性幹細胞又は前駆細胞）は、好ましくは静
脈内に投与される。使用のために想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに
依存し、及び当業者が決定することができる。
遺伝子療法のために核酸を導入することができる細胞は、任意の所望する、入手可能な
細胞タイプを包含し、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細
胞；例えばTリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー（NK）細胞、単球、マクロファージ
、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；種々の幹細胞又は前駆細胞、特に、
例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児の肝臓などから得られる造血性幹細胞又は前駆細胞；
などを含むが、限定されない。
好ましい実施態様において、遺伝子療法のために使用される細胞は、対象に対して自己
由来である。

組換え細胞が遺伝子療法に使用される実施態様において、タンパク質をコードする核酸
配列は、これらが細胞又はこれらの子孫によって発現可能となり、次いで、組換え細胞が
予防又は治療効果のためにインビボで投与されるように、細胞に導入される。具体的実施
態様において、幹細胞又は前駆細胞が使用される。インビトロにおいて単離すること、及
び維持することができる任意の幹細胞及び/又は前駆細胞を、本発明のこの実施態様に従
って潜在的に使用することができる（例えば、PCT公報WO94/08598；Stemple及びAnderson
の論文、1992, Cell 71：973-985；Rheinwaldの論文、1980, Meth. Cell Bio. 21A：229
；及びPittelkow及びScotの論文、1986, Mayo Clinic Proc. 61：771を参照されたい）。
具体的実施態様において、遺伝子療法のために導入される核酸は、コード領域に作動可
能に連結された構成的又は組織特異的プロモーターを含む。

（6. 実施例）
以下の実施例は、ナンセンス突然変異抑制活性を有する化合物を同定するために使用す
ることができる方法論を使用する。
（6.1 実施例1；ナンセンス突然変異抑制を促進し及び/又は翻訳終結を調整する化合物
の同定、並びに特性付け）
中途での翻訳終結及び/又はナンセンスを媒介したmRNA減衰を調整する化合物は、多数
の技術によって同定することができる。例えば、中途での翻訳終止コドンを有する任意の
遺伝子の転写後の発現を調整する化合物をスクリーニングするための方法は、国際出願公
開番号WO01/44516 A2に記述されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれる
。一つの例において、中途での終止コドンをもつmRNAをインビトロで翻訳し、試験化合物
のライブラリーをスクリーニングするために使用する。別の例において、中途での終止コ
ドンをもつmRNAは、中途での終止コドンを有するリポーター遺伝子である。

ナンセンス突然変異抑制を促進する小分子を同定するためのハイスループットスクリー
ニングに使用するために、2つのアッセイ法が開発された。それぞれのアッセイ法は、ル
シフェラーゼを利用し、なぜなら、これは、機能的リポーター遺伝子アッセイ法であり（
タンパク質が機能的である場合、光が産生されるだけである）、かつこれは、極めて感度
がよい（光強度は、nM範囲のルシフェラーゼ濃度に比例する）。第1のアッセイ法は、細
胞に基づいたルシフェラーゼリポーターアッセイ法であり、第2のものは、ウサギ網状赤
血球可溶化液及びナンセンス含有ルシフェラーゼリポーターmRNAを含む生化学的アッセイ
法である。細胞に基づいたアッセイ法では、UGA中途での終止コドンを含むルシフェラー
ゼリポーター構築物を293Tヒト胚腎臓細胞に安定にトランスフェクトさせる。生化学的ア
ッセイ法では、UGA中途での終止コドンを含むmRNAが、tRNA、ヘミン、クレアチンキナー
ゼ、アミノ酸、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム及びクレアチンリン酸を補ったウサギ網
状赤血球可溶化液を使用するインビトロでの翻訳反応におけるリポーターとして使用され
る。該mRNAの翻訳は、ウイルス由来リーダー配列内で開始される。合成mRNAは、T7プロモ
ーター及びMegaScript インビトロ転写キット（Ambion）を使用して、インビトロにおい
て調製される。生化学的及び細胞に基づいたアッセイ法の両方において、中途での終止コ
ドンのリードスルーを可能にすることが知られている小分子である3-[3-（4-イソプロピ
ルフェニル)-2,5-ジオキソ-イミダゾリジン-1-イル]-安息香酸が内部標準として使用され
る。

（6.2 実施例2：ナンセンス突然変異抑制を増加させ、及び機能的タンパク質を産生す
る化合物の特性付け）
活性をインビボで決定するために、UGA ナンセンスを含むルシフェラーゼ遺伝子を収容
する安定な株化細胞を試験化合物で処理する。細胞を1%のペニシリン-ストレプトマイシ
ン（P/S）及び10%のウシ胎児血清（FBS）を補った標準的な培地において70%の集密度まで
培養し、処理の前日に1：1に分ける。次の日に、細胞をトリプシン処理して、40,000細胞
を、96ウェル組織培養ディッシュのそれぞれのウェルに添加する。2logにわたる（30μM
〜0.3μM）6点の用量反応曲線を作製するために、それぞれの化合物の段階希釈を調製す
る。DMSO溶媒の終濃度は、それぞれのウェルにおいて1%で一定のままである。1%のDMSOで
処理した細胞は、バックグラウンド標準として役立ち、ゲンタマイシンで処理した細胞は
、正の対照として役立つ。

（6.3 実施例3：ナンセンス抑制因子は、28SRRNAにおける特異的なヌクレオチドに対す
る化学修飾薬の到達性を変化させる）
以前の研究では、翻訳の忠実度を減少させるゲンタマイシン及びその他のアミノグリコ
シド系ファミリーが、16S rRNAのA部位に結合することを証明した。化学的フットプリン
ト法、UV架橋及びNMRによって、ゲンタマイシンが、ヌクレオチド1406、1407、1494及び1
496にてrRNAのA部位にて結合することが示された（大腸菌（E. coli）番号付けの、ヌク
レオチド1400-1410及び1490-1500を含む）（Moazed及びNollerの論文、1987, Nature 327
（6121）：389-394；Woodcockらの論文、1991, EMBO J. 10（10）：3099-3103；及びSchr
oederらの論文、2000, EMBO J. 19：1-9）。
HeLa細胞から調製したリボソームを試験化合物（100μMの濃度にて）と共にインキュベ
ートし、続いて化学修飾薬（ジメチル硫酸[DMS]及びケトキサール[KE]）で処理する。化
学修飾後、rRNAをフェノール-クロロホルム抽出して、エタノール沈殿し、3つのrRNAの異
なる領域にハイブリダイズする末端標識したオリゴヌクレオチドを使用するプライマー伸
長反応において解析し、6%ポリアクリルアミドゲルで分離する。プライマー伸長のために
使用されるプローブは、18S（7つのオリゴヌクレオチドプライマー）、28S（24のオリゴ
ヌクレオチドプライマー）及び5S（1つのプライマー）のrRNAの全体をカバーする。これ
らの実験における対照は、DMSO（DMSOによって誘導されるrRNAの到達性の変化のための対
照）、パロモマイシン（18S rRNA結合のためのマーカー）及びアニソマイシン（28S rRNA
結合のためのマーカー）を含む。

（6.4 実施例4；細胞に基づいた疾患モデルにおける中途での終止コドンのリードスル
ー）
特異的な遺伝性疾患において変化するmRNAに対するナンセンス抑制化合物の効果に対処
するために、アミノ酸1282（W1282X）にてナンセンスコドンを有する気管支上皮株化細胞
を試験化合物（20μM）で処理して、CFTR機能を、SPQアッセイ法を使用してcAMPで活性化
された塩素イオンチャネルとしてモニターする（Yangらの論文、1993, Hum Mol Genet 2
（8）：1253-1261及びHowardらの論文、1996, Nat Med. 2（4）：467-469）。これらの
実験は、これらの細胞のcAMP処理が、CFTRを媒介したハライド流出の刺激と一致して、SP
Q蛍光の増大を生じたことを証明する。細胞が試験化合物で処理されないときに、又は細
胞がcAMPによって刺激されない場合、蛍光の増大は、観察されない。これらの結果は、試
験化合物処理後の、このナンセンスを含む対立遺伝子から発現される全長CFTRがcAMPで刺
激される陰イオンチャンネルとしても機能することを証明し、従って嚢胞性線維株化細胞
が、試験化合物で処理されたときに、塩素イオンチャネル活性を増大させることを証明す
る。

（6.5 実施例5： MDXナンセンスを含むマウス由来の初代細胞は、ナンセンスサプレッ
サーで処理したときに、全長ジストロフィンタンパク質を発現する）
427kDaのジストロフィンポリペプチドの中途での終結を生じさせるmdxマウスの突然変
異は、エキソン23の位置3185にてC からTへ遷移することを示した（Sicinskiらの論文、1
989, Science 244（4912）：1578-1580）。1日齢のmdxマウス由来のマウス初代骨格筋培
養は、先に記述されたように調製する（Barton-Davisらの論文、1999, J Clin Invest. 1
04 （4）：375-381）。細胞を試験化合物（20μM）の存在下において10日間培養する。培
養液を4日毎に置き換えて、筋芽細胞培養におけるジストロフィンの存在を先に記述した
ように免疫染色によって検出する（Barton-Davisらの論文、1999, J Clin Invest. 104
（4）：375-381）。ジストロフィンタンパク質のC末端に対する一次モノクローナル抗体
（F19Al2）を希釈せずに使用して、ローダミン抱合抗マウスIgGを二次抗体として使用す
る。F19A12抗体は、ナンセンスコドンの抑制によって産生される全長タンパク質を検出す
るであろう。染色は、ライカDMR顕微鏡、デジタルカメラ及び関連するペンシルベニア大
学のイメージングソフトウェアを使用して観察される。

（6.6 実施例6；MDXマウスにおける中途での終止コドンのリードスルー）
先に記述したように（Barton-Davisらの論文、1999, J Clin Invest. 104（4）：375-3
81）、試験化合物は、麻酔下のマウスの皮膚下に移植されたAlzet浸透圧ポンプによって
送達させる。2用量の試験化合物が投与される。ゲンタマイシンは、正の対照として役立
ち、溶媒のみで満たされたポンプは、負の対照として役立つ。ポンプには、組織が曝露さ
れる算出用量が10μM及び20μMであるように、適切な化合物を充填する。ゲンタマイシン
濃度は、およそ200μMの組織への曝露を達成するように算出される。初期の実験では、マ
ウスを14日間処理して、その後動物をケタミンで麻酔して、全採血する。次いで実験動物
の前脛骨（TA）筋肉を摘出し、凍結し、横紋筋へのジストロフィンの組み込みの免疫蛍光
解析のために使用する。TA筋肉におけるジストロフィンの存在は、先に記述したように免
疫染色によって検出される（Barton-Davisらの論文、1999, J Clin Invest. 104（4）：3
75-381）。

（6.7 実施例7：3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息
香酸の調製）

3-シアノ安息香酸（44.14g、300mmol）のDMF（0.6L）溶液に、K₂CO₃（62.19g、450mmol
）を添加し、次いで室温で30分間撹拌した。懸濁液に、20分にわたってヨウ化メチル（28
mL、450mmol）を添加し、反応混合物を室温で4時間更に撹拌した。反応混合物を1.2Lの氷
水に注ぎ、30分間撹拌し、沈殿物を濾過した。白いケークをメタノール（70ml）に溶解し
、次いで冷水で再沈殿した。所望の生成物が79%の収率（38g、LC/UVによる99%の純度）で
白色粉末として得られた。¹H-NMR（CDCl₃）δ8.85（2H）、8.28（1H）、8.02（1H）、4.1
7（3H）。
3-シアノ安息香酸メチルエステル（5Og、310mmol）のエタノール（500ml）溶液に、50%
のヒドロキシルアミン水溶液（41ml、620mmol）を室温で添加した。反応混合物を100℃に
て1時間撹拌し、溶媒を減圧下で除去した。油状残渣を20/80エタノール/トルエン（50ml
×2）に溶解して、次いで再び濃縮した。所望のエステル（61g定量分析、収量）が98%の
純度（LC/UV）で白色粉末として得られた。¹H-NMR（CDCl₃）δ9.76（1H）、8.24（1H）、
7.82（2H）、7.51（1H）、5.92（2H）、3.82（3H）。

ここから開始。3-（N-ヒドロキシカルバミミドイル）安息香酸メチルエステル（6Og、3
10mmol）のTHF無水物（200mL）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（75mL、434mmol）
を5℃にて添加し、次いで該混合物に2-フルオロベンゾイルクロライド（48.1mL、403mmol
）を20分にわたって添加した。反応混合物を室温で1時間撹拌した。沈殿物を濾過除去し
、濾液を減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチル（400mL）に溶解して、次いで水（200mL×
2）で洗浄した。溶媒を減圧下で除去し、所望の生成物をヘキサン中の60%の酢酸エチルに
おいて結晶化させ、白色固体として所望の生成物を得た（81g、83%収量）。¹H-NMR（CDCl
₃）δ8.18（1H）、8.03（3H）、7.48（2H）、7.18（2H）、5.61（2H）、3.82（3H）。
44gの3-（N-2-フルオロベンゾイルカルバミミドイル）-安息香酸メチルエステルのトル
エン（500ml）溶液を、Dean-Stark装置を使用して130℃で4時間還流した。反応混合物を5
℃にて18時間撹拌した。白色沈殿を濾過除去し、濾液を濃縮し、トルエン中で再び結晶化
した。所望のオキサジアゾール（38g、92%収量）が99%の純度（LC/UV）で白色固体として
得られた。¹H-NMR（CDCl₃）δ8.91（1H）、8.38（1H）、8.15（2H）、7.62（2H）、7.35
（2H）、3.95（3H）。

3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸メチルエス
テル（3.3g、11mmol）のTHF（40ml）溶液に、1.5MのNaOH水溶液（10mL、14mmol）を添加
した。反応混合物を100℃にて2時間還流した。有機溶媒を除去し、水溶液を水（50mL）で
希釈し、次いでHCl水溶液で酸性化した。白色沈殿を濾過除去し、白い沈殿を冷水で洗浄
して、次いで凍結乾燥機を使用して乾燥させた。所望の酸（3.Og、96%収量）が98%の純度
（LC/UV）で白色粉末として得られた。融点242℃；IR□3000（芳香族C-H）、1710（C=O）
；¹H-NMR（D₆-DMSO）δ8.31（1H）、8.18（2H）、8.08（1H）、7.88（2H）、7.51（2H）
；¹³C-NMR（D 6-DMSO）δ172.71、167.38、166.48、161.25、135.80、132.24、131.79、1
31.79、131.08、130.91、129.81、127.76、125.48、117.38、111.70；¹⁹F-NMR（D₆-DMSO
）δ109.7。
3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸の医薬とし
て許容し得る塩は、当業者に公知の方法を使用して調製することができる。ナトリウム塩
は、以下の通りに調製することができる。3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジ
アゾール-3-イル]-安息香酸メチルエステル（33g、111mol）のTHF（400mL）溶液に、1.5M
のNaOH水溶液（100mL、144mmol）を添加した。反応混合物を100℃にて2時間還流した。有
機溶媒を減圧下で除去し、水溶液を5℃にて2時間撹拌した。白色沈殿を濾過除去し、濾液
を濃縮して、水に再び沈殿した。白い沈殿を冷水で洗浄して、次いで凍結乾燥機を使用し
て乾燥させた。所望の塩（33g、96%収量）が98.6%の純度（LC/UV）で白色粉末として得ら
れた。

（6.8 実施例8：ナンセンス突然変異が媒介する嚢胞性線維症の経口治療）
本実施例は、ナンセンス突然変異が媒介する嚢胞性線維症の治療のために有用な例示的
投薬処方計画を記載する。
3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はその医
薬として許容し得る塩、溶媒和物又は水和物は、懸濁液のためのバニラ風味の粉末として
提供される。薬物は、現行の優良製造規範条件（cGMP）下で製造される。製剤は、結合剤
及び懸濁剤、界面活性物質及び製造過程において助けとなる種々の軽微な賦形剤を含むこ
とができる。混合物は、箔シール及び白いプラスチック、子供に安全なキャップで封着さ
れる40mLのプラスチック（高密度ポリエチレン[HDPE]）ボトルにおいてパックすることが
できる。それぞれのボトルには、125、250又は1000mgの薬剤物質を含むことができ、これ
は、総製剤重量の25.0%である。或いは、混合物は、実施例12に記載されるようにサッシ
ェ製剤で提供することができる。賦形剤（及び総製剤重量のうちのこれらの比率）は、懸
濁剤（Litesse（登録商標）Ultra [精製したポリデキストロース]−25.7%）、味を隠すよ
うにまた提供される結合剤（マンニトール-25.0%）、界面活性剤（ポリエチレングリコー
ル3350-12.8%及びLutrol（登録商標）micro F127[ポロキサマー407粉末]-3.7%）、崩壊剤
（クロスポビドン-5.0%）及びその他の賦形剤を含み、それぞれ2%未満（ヒドロキシエチ
ルセルロース、バニラ香料、ステアリン酸マグネシウム[非ウシ]及びコロイドシリカ）が
存在することができる。ボトルラベルは、薬剤物質の一致、ロット番号、薬剤物質の量及
び貯蔵条件（例えば、室温又は5〜8℃での冷蔵）を示す。

薬剤物質の投薬は、患者の体重のキログラムあたりの薬物のミリグラムに基づく。薬剤
物質の用量は、入手可能なボトルサイズと一致しておおよそであり得る。投薬スキームは
、与えられる総実際用量が、50mgを下回らず、又は250mgを上回らない意図された用量を
保証する（すなわち、常に割り当てられた服用レベルの5mg/kg以内にある）。例えば、4m
g/kgの用量で処理した40kgの体重の患者は、160mgの算出用量を有するであろう。この患
者は、1つの250mgのボトル（合計250mg）又は6.25mg/kg/用量を受けるであろう。夕方に8
mg/kgの用量で処理したときの同じ患者は、320mgの算出用量を有し、2つの250mgのボトル
（合計500mg）又は12.5mg/kgを受けるであろう。10mg/kg/用量で処理した同じ患者は、40
0mgの算出用量を有し、2つの250mgのボトル（合計500mg）又は12.5mg/kgを受けるであろ
う。夕方に20mg/kgの用量で処理したときの同じ患者は、800mgの算出用量を有し、1つの1
000mgのボトル（合計1000mg）又は25mg/kgを受けるであろう。

薬剤製品の再構成及び投薬は、室温でなされる。薬剤製品の特異的な加温は、再構成の
前に必要ではない。薬剤製品は、任意の医薬として許容し得る溶媒（例えば、水、乳、炭
酸飲料、ジュース、アップルソース、乳児食又は乳児用処方）で再構成することができる
。提供されるそれぞれの250mgのボトルについては、〜10mlの水又はその他の医薬として
許容し得る溶媒を、懸濁液の総容積において約25mg/mlの濃度を達成するように添加する
。提供されるそれぞれの1000mgのボトルについては、〜20mlの水又はその他の医薬として
許容し得る溶媒を、懸濁液の総容積において約50mg/mlの濃度を達成するように添加する
。また、約150mg/mlの懸濁液を調製することができる。水又はその他の医薬として許容し
得る溶媒を乾燥研究用薬物に添加したすぐ後に、ボトルをキャップし、懸濁液の均質性を
達成するために約60秒間手で勢いよく振盪する。懸濁液は、摂取前の24時間までの間、元
のプラスチックボトルに残っていてもよいが、薬物は、再構成の直後に摂取されることが
推奨される。再構成及び投薬の間に15分を超える遅延がある場合、ボトルは約60秒間、手
により勢いよく再振盪するべきである。

治療は、嚢胞性線維症を有するか、又は疑いのある患者に対して必要な期間、連続投与
される。表11は、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息
香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物のための例示的な1日の
投薬処方計画を記載し、この場合、投与は、食物と共に6、6及び12時間の間隔にて1日あ
たり3回生じる（例えば、〜午前7時、〜午後1時及び〜午後7時）。特定の実施態様におい
て、患者は、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸
又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物を、表11に記載したように連
続的に14日間投与し、続いて処理無しの14日、続いてさらなる14日の投与、さらなる処理
無しの14日が続く。別の詳細な実施態様において、患者は、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)
-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和
物若しくは水和物を、表11に記載したように連続的に14日間、4mg/kg、4mg/kg及び8mg/kg
の3回の１日量にて投与され、続いて処理無しの14日、続いて10mg/kg、10mg/kg及び20mg/
kgの3回の１日量にてさらなる14日の投与、さらなる処理無しの14日が続く。特定の実施
態様において、表11に記載した単一の１日の投薬処方計画は、毎日行われる。その他の実
施態様において、表11に記載した異なる投薬処方計画が異なる日に行うことができる。

患者は、好ましくは食後30分以内に薬物を摂取する；理想的には、薬物は、およそ6-、
6及び12時間の間隔で摂取されるであろう（例えば、朝食後の〜午前7時、昼食後の〜午後
1時及び夕食後の〜午後7時）。患者は、それぞれのボトルを必要とされる量の水又はその
他の医薬として許容し得る溶媒で満たし、キャップし、約60秒間それぞれのボトルを振盪
し、次いで用量あたり必要とされるボトルの数及びサイズの含量を摂取することにより、
薬物を摂取する。再構成された薬物の全ての用量は、一度に摂取されるべきである。摂取
後、それぞれの投薬ボトルは、水又は別の医薬として許容し得る溶媒で半分満たして、キ
ャップし、振盪して、ボトル由来のこの水又はその他の医薬として許容し得る溶媒を患者
によって摂取させる。このリンス手順は、一度実施される。特定の実施態様において、薬
物は、サッシェとして提供される。これらの実施態様では、薬物の適切な量を計量し、又
は測定して、投与前に適切な医薬として許容し得る溶媒と合わせることができる。

（6.9 実施例9：ナンセンス突然変異が媒介するデュシェンヌ型筋ジストロフィーの経
口治療）
本実施例は、ナンセンス突然変異を媒介したデュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に
有用な例示的投薬処方計画を記載する。
3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はその医
薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物は、懸濁液のためのバニラ風味の粉末と
して提供される。薬物は、現行の優良製造規範条件（cGMP）下で製造される。製剤は、結
合剤及び懸濁剤、界面活性物質及び製造過程において助けとなる種々の軽微な賦形剤を含
むことができる。混合物は、箔シール及び白いプラスチック、子供に安全なキャップで封
着される40mLのプラスチック（高密度ポリエチレン[HDPE]）ボトルにおいてパックするこ
とができる。それぞれのボトルには、125、250又は1000mgの薬剤物質を含むことができ、
これは、総製剤重量の25.0%である。或いは、混合物は、実施例12に記載されるようにサ
ッシェ製剤で提供することができる。賦形剤（及び総製剤重量のうちのこれらの比率）は
、懸濁剤（Litesse（登録商標）Ultra [精製したポリデキストロース]−25.7%）、味を隠
すようにまた提供される結合剤（マンニトール-25.0%）、界面活性剤（ポリエチレングリ
コール3350-12.8%及びLutrol（登録商標）micro F127[ポロキサマー407粉末]-3.7%）、崩
壊剤（クロスポビドン-5.0%）及びその他の賦形剤を含み、それぞれ2%未満（ヒドロキシ
エチルセルロース、バニラ香料、ステアリン酸マグネシウム[非ウシ]及びコロイドシリカ
）が存在することができる。ボトルラベルは、薬剤物質の一致、ロット番号、薬剤物質の
量及び貯蔵条件（例えば、室温又は5〜8℃での冷蔵）を示す。

薬物の投薬は、患者の体重のキログラムあたりの薬物のミリグラムに基づく。患者に投
与される薬物の総ミリグラム量に対応する総容積が算出されるべきである。例えば、30kg
の患者が4mg/kgを得る場合、送達される用量は、30×4 =120mgであるだろう。この患者は
、250mgの用量ボトルを使用して投薬されるべきである。250mgの用量ボトルにおける懸濁
液のそれぞれのmlは、250/10 = 25mgの薬物を含むので、この患者は、それぞれの4mg/kg
の用量のための懸濁液の120/25 = 〜5 mlを得るべきである。夕方に8mg/kgの用量で処理
したときの同患者は、240mgの算出用量を有し、1つの250mgのボトル（10mlの懸濁液）を
受けるであろう。それぞれの用量についての懸濁液のこれらの体積は、プラスチック経口
投薬注射器を使用して薬物ボトルから抜き取られるべきである。250mgのボトルについて1
0mL又は1000mgのボトルについて20mLより少ないわずかな体積を移すために、所望の量が
研究薬剤ボトルから適切な型及びサイズの投薬注射器へと抜き取られ（例えば、Baxa、Ex
acta-Med、較正済、ラテックスを含まない、プラスチックの経口投薬注射器）、同じ注射
器を使用して投薬されるべきである。再構成後の同じ24時間の間に、＞1回より多い用量
を懸濁液の同じボトルから摂取してもよいが；しかし、再構成された薬物は、同じ患者に
多回投与するために、再びこの材料を使用する意図で24時間を越えて貯蔵されるべきでは
ない。1日に摂取される薬物の総量が、再構成された薬物の10mL（250mgのボトルについて
）又は20mL（1000mgのボトルについて）を上回る場合、薬物の新たなボトルが、それぞれ
の投薬のために使用されるべきである。

TID投薬処方計画については、薬物用量の以下の繰り返しを続くことができる：

BID投薬処方計画については、薬物用量の以下の繰り返しを続くことができる：

製剤の再構成及び投薬は、室温でなされる。薬剤製品の特異的な加温は、再構成の前に
必要でない。薬剤は、任意の医薬として許容し得る溶媒（例えば、水、乳、炭酸飲料、ジ
ュース、アップルソース、乳児食又は乳児用処方）で再構成することができる。提供され
るそれぞれの250mgのボトルについては、〜10mlの水又はその他の医薬として許容し得る
溶媒を、懸濁液の総容積において約25mg/mlの濃度を達成するように添加する。提供され
るそれぞれの1000mgのボトルについては、〜20mlの水又はその他の医薬として許容し得る
溶媒を、懸濁液の総容積において約50mg/mlの濃度を達成するように添加する。水又はそ
の他の医薬として許容し得る溶媒を乾燥研究用薬物に添加した直後に、ボトルをキャップ
し、懸濁液の均質性を達成するために約60秒間手で勢いよく振盪する。懸濁液は、摂取前
の24時間までの間に、本来のプラスチックボトルに残っていてもよいが、薬物は、再構成
の直後に摂取されることが推奨される。再構成及び投薬の間に15分を超える遅延がある場
合、ボトルは、約60秒間手により勢いよく再振盪するべきである。

治療は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを有する又は疑いのある患者に対して必要な
期間、連続投与される。表12は、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール
-3-イル]-安息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物のための
例示的な１日の投薬処方計画を記載し、この場合、投与は、食物と共に12時間の間隔にて
1日あたり2回（例えば、〜午前7時及び〜午後7時）又は6、6及び12時間の間隔にて1日あ
たり3回（例えば、〜午前7時、〜午後1時及び〜午後7時）生じる。特定の実施態様におい
て、患者には、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香
酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物を、表12に記載した投薬処
方計画の一つにおいて、14又は28日間連続投与する。特定の実施態様において、表12に記
載した単一の１日の投薬処方計画は、毎日行う。その他の実施態様において、表12に記載
した異なる投薬処方計画は、異なる日に行うことができる。

患者は、食後30分以内に薬物を投与される；理想的には、薬物は、およそ6、6及び12時
間の間隔で摂取されるであろう（例えば、朝食後の〜午前7時、昼食後の〜午後1時及び夕
食後の〜午後7時）。患者は、それぞれのボトルに必要とされる量の水又はその他の医薬
として許容し得る溶媒で満たし、キャップして、約60秒間それぞれのボトルを振盪し、経
口投薬注射器を使用してボトルから適切な量の体積を抜き取り、投薬注射器から直接内容
物を摂取することにより、薬物を摂取する。用量に対応する再構成された薬物の全ての算
出体積は、一度に摂取される。薬物の摂取後、投薬注射器を水又は別の医薬として許容し
得る溶媒で、用量体積と同じ体積で満たして、患者によって摂取されるべきである。この
リンス手順は、一度実施される。特定の実施態様において、薬物は、サッシェとして提供
される。これらの実施態様では、薬物の適切な量を計量し、又は測定して、投与前に適切
な医薬として許容し得る溶媒と合わせることができる。
治療の有効性は、足筋短指伸筋（EDB）の生検におけるジストロフィンレベルのベース
ライン測定からの変化を測定することによって決定することができる。

（6.10 実施例10：3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安
息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物の味付けされていない
製剤の調製）
3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はその医
薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物は、懸濁液のための粉末として提供され
る。薬物は、現行の優良製造規範条件（cGMP）下で製造する。薬剤は、結合剤及び懸濁剤
、界面活性物質及び製造過程において助けとなる種々の軽微な賦形剤と均質に混ぜ合わせ
ることができる。混合物は、箔シール及び白いプラスチック、子供に安全なキャップによ
って封着される40mLのプラスチック（高密度ポリエチレン[HDPE]）ボトルにパックするこ
とができる。それぞれのボトルは、約35mg、約70mg、約125mg、約140mg、約175mg、約250
mg、約280mg、約350mg、約560mg、約700mg、約1000mg又は約1400mgの3-[5-(2-フルオロ-
フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はその医薬として許容し得る塩
、溶媒和物若しくは水和物を含むことができる。賦形剤（及び総製剤重量のうちのこれら
の比率）は、懸濁剤（Litesse（登録商標）Ultra [精製したポリデキストロース]−25.7%
）、味覚遮蔽をも提供することができる結合剤（マンニトール-25.0%）、界面活性剤（ポ
リエチレングリコール3350-12.8%及びLutrol（登録商標）micro F127[ポロキサマー407粉
末]-3.7%）、崩壊剤（クロスポビドン-5.0%）及びその他の賦形剤を含み、それぞれ2%未
満（cab-o-sil、ヒドロキシエチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム[非ウシ]及び
コロイドシリカ）が存在することができる。次いで、ボトルを、薬剤物質の一致、ロット
番号、薬剤物質の量及び貯蔵条件（例えば、5〜8℃での冷蔵）を示すためにラベルする。
投与前に、薬剤製品を医薬として許容し得る溶媒（例えば、水、乳、炭酸飲料、液、アッ
プルソース、乳児食又は乳児用処方）の適切な体積に再構成させる。

（6.11 実施例11：3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安
息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物の味を付けた製剤の調
製）
3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はその医
薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物は、懸濁液のためのバニラ風味の（例え
ば、バニラ抽出物の添加によって）粉末として提供される。薬物は、現行の優良製造規範
条件（cGMP）下で製造する。薬剤は、結合剤及び懸濁剤、界面活性物質及び製造過程にお
いて助けとなる種々の軽微な賦形剤と親密に混ぜ合わせることができる。混合物は、箔シ
ール及び白いプラスチック、子供に安全なキャップによって封着される40mLのプラスチッ
ク（高密度ポリエチレン[HDPE]）ボトルにパックすることができる。それぞれのボトルは
、約35mg、約70mg、約125mg、約140mg、約175mg、約250mg、約280mg、約350mg、約560mg
、約700mg、約1000mg又は約1400mgの3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾ
ール-3-イル]-安息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物を含
むことができる。賦形剤（及び総製剤重量のうちのこれらの比率）は、懸濁剤（Litesse
（登録商標）Ultra[精製したポリデキストロース]-25.7%）、味覚遮蔽をも提供すること
ができる結合剤（マンニトール-25.0%）、界面活性剤（ポリエチレングリコール3350-12.
8%及びLutrol（登録商標）micro F127[ポロキサマー407粉末]-3.7%）、崩壊剤（クロスポ
ビドン-5.0%）及びその他の賦形剤を含み、それぞれ2%未満（cab-o-sil、ヒドロキシエチ
ルセルロース、バニラ香料、ステアリン酸マグネシウム[非ウシ]及びコロイドシリカ）が
存在することができる。次いで、ボトルを、薬剤物質の一致、ロット番号、薬剤物質の量
及び貯蔵条件（例えば、5〜8℃での冷蔵）を示すためにラベルする。投与前に、薬剤製品
を医薬として許容し得る溶媒（例えば、水、乳、炭酸飲料、液、アップルソース、乳児食
又は乳児用処方）の適切な体積に再構成させる。

（6.12 実施例12；3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安
息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物のサッシェ製剤）
混合物を、紙層、アルミ箔層及びサーリン（surlyn）層を含んでいてもよい複数の積層
された層で構成されたポーチ又はサッシェを使用してパックする。それぞれのサッシェに
は、約125mg、約250mg、約500mg又は約1000mgの3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オ
キサジアゾール-3-イル]-安息香酸又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは
水和物を含むことができる。賦形剤（及び総製剤重量のこれらの比率）は、表13及び表14
にて説明したように、任意に以下のいずれかを含む。

次いで、サッシェを、薬剤物質の一致、ロット番号、薬剤物質の量及び貯蔵条件（例え
ば、5〜8℃での冷蔵）を示すためにラベルする。投与前に、適切な量の薬剤製品を、医薬
として許容し得る溶媒（例えば、水、乳、炭酸飲料、液、アップルソース、乳児食又は乳
児用処方）の適切な体積に再構成させる。

（6.13 実施例13：経上皮電位差（TEPD）アッセイ）
経鼻の電位差としても知られる経上皮の電位差（TEPD）測定は、経上皮生体電気特性の
評価により、分泌性の上皮細胞におけるナトリウム及びクロライド輸送の直接的な感度の
良い評価を提供する（Knowlesらの論文、1981, N. Engl. J. Med. 305（25）：1489-95；
Knowlesらの論文、1995, Hum. Gene Ther. 6：445）。TEPDは、標準化された技術を使用
して、それぞれの外鼻孔において行われる（Standaertらの論文、2004, Ped. Pulm. 57：
385-92）。手順において、小さなプラスチックのカテーテルを使用して、外鼻孔の鼻粘膜
細胞の外側の細胞膜を横切る電気的な相違を評価する。TEPD値は、ミリボルト又はmVにお
いて表わされる。-5.0mVと同等の又はより電気的に陰性なクロライドのコンダクタンスは
、一般に正常範囲にあるとみなされる。TEPDの評価は、下鼻甲介を裏打ちする経鼻の上皮
細胞でなされ、なぜなら、これらの細胞は、下部気道を裏打ちする呼吸器上皮細胞よりも
容易に到達でき、同じイオン輸送特徴を有することが示されたためである（Knowlesらの
論文、1981, Am. Rev. Respir. Dis. 124（4）：484-90）。また、TEPDの評価は、直腸の
上皮細胞及び下部呼吸器上皮細胞で行うことができる。細胞膜全体のクロライド輸送にお
けるCFTRタンパク質の役割のため、及びこのタンパク質の非存在のため、嚢胞性線維症患
者は、異常なTEPDのクロライドコンダクタンスを有する。指標として、TEPDは、それが存
在の定量的積分、機能的な活性及び気道細胞におけるCFTRの頂端位置であるクロライド輸
送変化を検出することができるという利点を有する。更に、これは、CFのための支持療法
又は軽減治療によって影響を受ける可能性がないCFTR活性の直接的な測定である（全身投
与されたアミノグリコシド抗生物質の可能性を除く）。TEPD値が肺機能障害及びX線撮影
異常の程度と相関し得るという証拠は、重要である（Hoらの論文、1997, Eur. Respir. J
. 10（9）：2018-22；Fajacらの論文、1998, Eur. Respir. J. 12（6）：1295-300；Serm
et-Gaudelusらの論文、2005, Am. J. Respit. Crit. Care Med. 171（9）：1026-1031）
。特に、イソプロテレノールで誘導されたCFTRクロライド活性のTEPDの評価は、FEV1及び
放射線スコアを決定する際の遺伝子型よりも優れた予測値を証明した（Hoらの論文、1997
, Eur Respir J. 10（9）：2018-22）。ベースライン条件下で、TEPDで評価したクロライ
ド活性は、CF患者において自然に規準化する可能性は非常に低く；TEPDで評価したクロラ
イド活性における任意の観察された改善は、CFTR修正療法の薬理活性を特異的に示すと予
想される。従って、これは、CFTR機能障害を修正することを狙った第1-2相の薬理学的及
び遺伝子置換研究における一次エンドポイントになった（Peckhamらの論文、1995, AJ. C
lin Sci（London）. 89 （3）：277-84；Wilschanskiらの論文、2003, N. Engl. J. Med.
349（15）：1433-41）。

（6.14 実施例14；CFTR免疫蛍光）
免疫蛍光による、及びCFTR mRNAの定量によるCFTRタンパク質の測定のための患者のそ
れぞれの外鼻孔からの鼻粘膜掻爬の収集及び処理を、標準化された技術を使用して行った
（Clancyらの論文、2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163（7）：1683-92；Amaral
らの論文、2004, J. Cyst. Fibros. 3 Suppl 2：17-23）。正常上皮細胞（例えば、鼻粘
膜の切屑から）の免疫蛍光染色により、頂端面における大部分のCFTRタンパク質の存在が
明らかになる。ナンセンス突然変異で媒介されるCFの動物モデルにおいて、又はナンセン
ス突然変異で媒介されるCF患者において、CFTR染色は、存在しないか（例えば、中途での
停止突然変異のためのホモ接合性患者において）又は主に核周囲の領域において観察され
る（例えば、正常CFTRの細胞内輸送を妨げるΔF508突然変異を有する患者において）。動
物モデル及び患者の両方における機能的な野生型又は非野生型CFTRタンパク質の良好な産
生は、免疫蛍光によって評価すると頂端上皮CFTRタンパク質の再現と関連していた（Clan
cyらの論文、2001, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163（7）：1683-92；Wilschanski
らの論文、2003, N. Engl. J. Med.（5）：1433-41）。

（6.15 実施例15：肺機能検査）
FEV1、FVC及びMEF25-75を含む肺機能試験は、標準的な肺活量測定手順を使用して測定
される。肺機能の評価（MEF25-75、FVC及び特に、FEV1を含む）は、CF患者における決定
的な臨床的指標として承認されてきる（食品医薬品局、第62回抗感染薬諮問委員会。嚢胞
性線維症患者の管理のための吸入法（Tobi（登録商標））のためのトブラマイシン溶液に
ついてのNDAの考察。1997年11月；Tiddensの論文、2002 Pediatr. Pulmonol. 34（3）：2
28-31）。FEV1及びその他の肺機能の試験測定は、重症度、健康管理利用の点からの予測
罹患率及びIV型抗生物質の使用と相関し、CFに関連した死亡率のリスクを示すことが示さ
れた（食品医薬品局、第62回抗感染薬諮問委員会。嚢胞性線維症患者の管理のための吸入
法（Tobi（登録商標））のためのトブラマイシン溶液についてのNDAの考察。1997年11月
）。肺機能試験は、実施するのが簡単で（7歳くらいの若い患者においてさえ）、広く利
用できる標準化された設備及び技術を使用する。解釈は、患者の年齢、背丈及び性を考慮
した、確立された規範的方程式を使用して行われる。FEV1の改善は、CFにおける意味のあ
る臨床的利益を定量的に証明すると認められ、ドルナーゼα及び吸入トブラマイシンの規
制承認の基礎として役立った（食品医薬品局、第62回抗感染薬諮問委員会。嚢胞性線維症
患者の管理のための吸入法（Tobi（登録商標））のためのトブラマイシン溶液についての
NDAの考察。1997年11月）。

（6.16 実施例16：ナンセンス突然変異で媒介される嚢胞性線維症のための経口治療と
しての3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸の第2相
研究）
患者は、研究への登録のために適格であるとされる以下の条件の全てを満たさなければ
ならない：
1. 決定的に異常な汗試験の考証された証拠に基づいたCFの診断（ピロカルピンイオン
泳動により、汗クロライドが60mEq/リットルよりも多い、（LeGrysの文献、汗試験：試料
収集及び定量分析：承認された指針、第2版。20：14臨床病理検査用標準物質の全国委員
会；2000；vol 20：14））；
2. TEPDにより測定される異常なクロライド分泌（クロライドを含まないアミロライド
及びイソプロテレノールを伴うクロライド分泌の、-5mVより陽性のTEPD評価）；
3. cftr遺伝子の対立遺伝子の1つにおけるナンセンス突然変異の存在；
4. cftr遺伝子シーケンシングが行われたという証拠文献；
5. 18歳以上の年齢；
6. 40kg以上の体重；
7. 年齢、性及び背丈（Knudson標準）について予測される40%以上のFEV1（Knudsonの論
文、1983, Am. Rev. Respi.r Dis. 127：725-734）；
8. 部屋の空気における92%以上の酸素飽和度（パルス酸素測定によって測定されるもの
）；
9. 外科手術で不妊処理していない場合、研究薬物投与及び追跡調査期間の間に性交を
慎むか、又は避妊のバリア若しくは医学的方法を使用する、男女患者の意志；
10. 妊娠試験陰性（出産可能な女性について）；
11.予定の来診、薬物投与計画、研究手順（TEPD測定、臨床検査室試験及びPKサンプリ
ングを含む）及び研究制限に応ずる意志並びに能力；
12. 書面にしたインフォームドコンセントを提供する能力；並びに
13. 患者が治験の全ての妥当な態様を知らせたことを含む個人的に署名し日付の入った
インフォームドコンセント文書の証拠

以下の条件のいずれかが存在すると、研究における登録から患者を除外した：
1. 研究者の意見において、患者の安全に悪影響を与え得る医学的状態（例えば、随伴
性疾病、精神医学的状態、アルコール中毒症、薬物乱用）、病歴、理学的所見、ECG知見
又は研究室データの異常の前又はその進行中に、治療又は追跡調査の経過が完了しそうか
、又は研究結果の評価を障することがありそうにない；
2. 研究治療の開始前の2週間以内に、急性上位又は下位呼吸器の感染を含む急性疾病を
進行中；
3. 研究治療の開始前の2月以内に、肺疾患（最近の大量の喀血又は気胸を含む）の主要
な合併症の病歴；
4. CF以外の臨床的に有意な活性のある肺疾患を示唆する胸部X線をスクリーニング時の
異常又はCFに付随する臨床的に有意な活性のある肺関与を示し得る無気肺又は胸水などの
新たな有意な異常；
5. B型肝炎表面抗原、C型肝炎抗体試験又はヒト免疫不全症ウイルス（HIV）試験に陽性
；
6. 10g/dLよりも少ないヘモグロビン；
7. 2.5g/dLよりも少ない血清アルブミン；
8. 異常な肝機能（血清総ビリルビンが正常の上限を超えるか、又は血清ALT、AST若し
くはGGTが正常の上限の2.0倍を超える）；
9. 異常な腎機能（血清クレアチニンが正常な上限の1.5倍を超える）；
10. 妊娠又は母乳養育中；
11. 実質性器官又は血液学的移植の病歴；
12. 研究治療の開始前の14日以内の別の治験薬に対する曝露；
13.任意のその他の治療的な臨床試験における進行中の関与；
14.チアゾリジンジオンペルオキシゾーム増殖因子で活性化される受容体γ（PPARγ）
アゴニスト、例えばロシグリタゾン（Avandia（登録商標）又は同等品）又はピオグリタ
ゾン（Actos（登録商標）又は同等品）の進行中の使用；
15. 研究治療の開始前の14日以内の鼻腔内薬物適用の変更（副腎皮質ステロイド、クロ
モリン、臭化イプラトロピウム、フェニレフリン又はオキシメタゾリンの使用を含む）；
16. 研究治療の開始前の14日以内の全身性又は吸入副腎皮質ステロイドでの治療の変更
；
17. 研究治療の開始前の14日以内の、又は研究治療の間の、吸入ゲンタマイシン又はア
ミカシンについての使用又は要求；又は
18. 研究治療の開始前の14日以内の全身性アミノグリコシド抗生物質のための要求。

3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸を、本明細
書に記述した製剤で提供した。15人の患者（イスラエルにおいて行われている第2相試験
からの12人、及び米国において行われている第2相試験からの3人；7人の患者は、男性で
、8人は、女性であった；患者は、22歳の年齢中央値を有した；及び全ての患者（ある程
度の肺機能障害を含む嚢胞性線維症の複数の徴候及び症候を有した）には、以下の56日の
スケジュールに従って、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]
-安息香酸を経口投与した：14日間、4mg/kg、4mg/kg及び8mg/kgにて1日あたり3回（TID）
、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸を投与、続
いて14日間治療無し（28日からなるサイクル1）、続いて14日間、10mg/kg、10mg/kg及び2
0mg/kgにて1日あたり3回（TID）、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾー
ル-3-イル]-安息香酸を投与、続いて14日間治療無し（28日で構成されるサイクル2）。

臨床指標は、上に記載した手順を使用して評価した。TEPD測定は、治療前及びサイクル
1及びサイクル2の14日及び28日に行った。鼻粘膜の掻爬は、治療前、並びにサイクル1及
びサイクル2の14日及び28日に、それぞれの患者のそれぞれの外鼻孔から収集した。FEV₁
、FVC及びMEF_25-75を含む肺試験は、イスラエルにおいて行われている研究において、治
療前、サイクル2の-1日、サイクル1の13日又は14日、及びサイクル2の13日又は14日に測
定し、同じパラメーターを、米国において行われている研究において、治療前及びサイク
ル2の13日又は14日に測定した。
TEPDクロライドコンダクタンスにおける平均変化。これは、それぞれの研究参加者内の
TEPDクロライドコンダクタンスの治療期間の最初から終わりまでの変化の平均である。例
えば、それぞれの3人の参加者内のTEPDクロライドコンダクタンスの変化が、-7.0mV、-2.
0mV及び-9.0mVである場合、これらの参加者内のTEPDクロライドコンダクタンスの平均変
化は、-6.0mVであるだろう。

クロライドコンダクタンス応答がある患者の割合。これは、3-[5-(2-フルオロ-フェニ
ル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸による治療終了後に、TEPDクロライドコ
ンダクタンス応答を示した患者の割合である。治験の目的のために、クロライドコンダク
タンス応答は、少なくとも-5mVのTEPDクロライドコンダクタンスの改善として定義される
。例えば、ベースラインにて+ 1.0mVのTEPDクロライドコンダクタンス値、及び治療終了
後に-6.0 mVのTEPDクロライドコンダクタンス値を有する患者において、TEPDクロライド
コンダクタンスの改善は、-7.0mVであり、クロライドコンダクタンス応答を表す。
TEPDクロライドコンダクタンス値の正常範囲への改善がある患者の割合。上記の如く、
-5.0mVと同等又はより電気的に陰性のクロライドコンダクタンスは、正常範囲にあると、
一般にみなされる。従って、ベースラインにて+1.0mVのTEPDクロライドコンダクタンス値
である患者は、その値が-5.0mVよりも電気的に陽性であるため、異常値を有するとみなさ
れる。治療終了時に、その患者のTEPDクロライドコンダクタンス値が、-6.0mVまで改善し
た場合、改善された値が-5.0mVよりも電気的に陰性であるので、これは、正常範囲へ改善
したことを表すであろう。

患者の性、年齢及び背丈に基づいて、研究登録時の平均のFEV₁値は、正常の66%であり
、研究登録時の平均FVC値は、正常の80%であった。解析に含めた15人の患者のうちの14人
は、重い肺炎を引き起こし得る嚢胞性線維症患者に共通の細菌感染である緑膿菌（Pseudo
monas aeruginosa）による気道定着を有した。また、15人の患者のうちの14人は、膵不全
を有し、慢性膵臓酵素補充療法を必要とした。患者は、低体重を有し、研究登録時に58.3
kgの平均重量であった。
表15は、15人の患者についてのTEPDの結果を示している。それぞれの測定について、結
果は、外鼻孔の最高及び両方の外鼻孔の平均値基準で示してある。歴史的に、TEPD試験の
結果は、最高の外鼻孔基準で典型的にされてきた。しかし、嚢胞性線維症治療開発ネット
ワークによって確立された最近の指針では、TEPDの結果が両方の基準で示されることを推
奨する。CFTR遺伝子内のナンセンス突然変異の異なる型をもつ患者におけるTEPDクロライ
ドコンダクタンスの改善が記された。

より低い及びより高い3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]
-安息香酸の用量レベルでの治療効果は、統計学的に有意でなく、そのさらなる用量の増
大は必要ではないこと、及び3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-
イル]-安息香酸の低用量でさえも、TEPDクロライドコンダクタンスを改善するのに有効で
あろうことを示唆する。また、二次指標についても統計学的に有意な結果及び陽性傾向が
、観察された。特に、治験は、二次指標において統計的に有意な変化を検出するように促
進されなかったが、より高用量治療サイクルの研究登録から終わりまでに、患者の平均の
FEV₁ 、FVC及び重量における、統計学的に有意な改善が観察された。表16は、結果を示す
。肺機能の変化については、一人の患者は、その患者が高用量治療サイクル終了後に測定
される肺機能を有さなかったので、含めなかった。

これらの15人の患者からの3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-
イル]-安息香酸の暫定PKパラメーターを表17に記述してある。性によるPKパラメーターの
相違は、明らかでなかった。

更に、患者の症候の変化は、生活の質の質問表を用いることにより形式的に測定されな
かったが、治験研究者には、患者の嚢胞性線維症症候の変化について尋ねるよう求めた。
暫定的解析に含まれる15人の患者において、6人は、満足な一般的な改善が報告され、6人
は、咳の減少が報告され、10人は、粘液厚の減少及び粘液のより簡単な除去が報告された
。
ナンセンス突然変異で媒介される嚢胞性線維症のための経口治療としての3-[5-(2-フル
オロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸の使用のための第2の第2相
研究の手順は、以下の通りである。
治療は、2回の28日サイクルで投与されるであろう。それぞれのサイクルは、14日の連
続的な毎日の3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸
による治療、続いて研究薬物無しの予定の14日を含む。必要に応じて、サイクル2におけ
る治療は10日早く開始することができ、又はサイクル1における3-[5-(2-フルオロ-フェニ
ル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸の最後の投薬の28日後程度に遅くするこ
とができる。

集団1の患者には、サイクル1において、6、6及び12時間（±〜30分）間隔にて、4mg/kg
、4mg/kg及び8mg/kgの用量にてTID、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾ
ール-3-イル]-安息香酸がそれぞれ投与されるであろう。理想的には、それぞれの用量は
、食後〜30分以内に摂取されるべきである（例えば、朝食後の〜午前7時、昼食後の〜午
後1時及び夕食後の〜午後7時）。計画的な用量処方計画の変更を第2のサイクルで行い、
その結果、この集団のそれぞれの患者は、サイクル2においてBID、8mg/kgの用量にて、3-
[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸を受けることと
なる。理想的には、それぞれの用量は、食後〜30分以内に摂取されるべきである（例えば
、朝食後の〜午前7時及び夕食後の〜午後7時）。
集団2の患者には、サイクル1において、12-時間（±〜30分）間隔にて、8mg/kgの用量
にてBID、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸がそ
れぞれ投与されるであろう。理想的には、それぞれの用量は、食後〜30分以内に摂取され
るべきである（例えば、朝食後の〜午前7時及び夕食後の〜午後7時）。計画的な用量処方
計画の変更を第2のサイクルで行い、その結果、この集団のそれぞれの患者は、サイクル2
において4mg/kg、4mg/kg及び8mg/kgの用量にてTID、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4
]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸を受けることとなる。理想的には、それぞれの用量
は、食後〜30分以内に摂取されるべきである（例えば、朝食後の〜午前7時、昼食後の〜
午後1時及び夕食後の〜午後7時）。

（6.17 実施例17：免疫蛍光及びウエスタンブロット法によるジストロフィン、サルコ
グリカン及びジストログリカンの発現）
一方の足からのEDB筋肉及び覆っている皮膚の生検を、治療の前に、局所麻酔及び意識
がある鎮静状態下で行い（場合によっては、全身麻酔が必要とされるであろう）、治療の
最終日には他方の足から該生検を行う。生検手順は、標準化された技術を使用して行う（
Stedmanの論文、2000, Human Gene Therapy 11：777-90）。全ての筋肉腹部（muscle bel
ly）が（可能な限りいつでも）、その手順で除去される。治療前の生検の収集時に、筋肉
検体を少なくとも3つの断片に分け、治療の最終日に収集される生検材料は、少なくとも2
つの断片に分ける。生検材料は、リンゲルの生理食塩水で湿らせたtelfaガーゼスポンジ
の上に置く。生検材料を立体解剖顕微鏡下で低出力にて見て、線維の方向を確立する。次
いで、筋肉を、可能な限りいつでも、断面様式に（線維の方向に対して垂直に）、鋭い小
刀を使用して横切して、痙攣を停止させるために2分間静置させる。次いで、試料を液体
窒素で冷却したイソペンタンで凍結し、液体窒素のリザーバーへ移し、液体窒素に液浸前
に、液体/蒸気界面より1インチ（約2.54cm）上に2分間の徐冷及びイソペンタン蒸発に保
持して、研究番号、部位番号、患者番号、日付、患者のイニシャル及び足の側（右足又は
左足）をラベルした予め冷却した（液体窒素中及びドライアイス上で保存した）ホイルに
巻きつけた。

全ての試料容器には、対象及び収集日付を同定する様式において、はっきりラベルして
ある。ラベルは、ラベルが剥がれることを予防する様式で、試料容器に固定してある。手
順を行った後、試料を即時に解析/培養/集中調査（central review）のために出荷する。
ジストロフィンの検出については、タンパク質のC末端、N末端及びロッドドメインを認識
する3つの市販の抗体を使用する。サルコグリカン及びジストログリカンの複合体の検出
については、α-、β-、γ-及びδ-サルコグリカン、並びにβ-ジストログリカンに対す
る市販の抗体を、可能な場合に使用する。蛍光顕微鏡観察を解析に使用する；正常筋肉検
体に対する蛍光強度の規準化の後、イメージをCCDカメラによって捕捉する。イメージは
、デジタルで蓄積して、将来の調査及び研究完了時の最終評価のために保存する。また、
組織を、同じ抗体を使用したウエスタンブロット法により、ジストロフィン、サルコグリ
カン及びβ-ジストログリカンの検出のために処理する。顕微鏡学的イメージを捕捉して
、将来の調査及び研究完了時の最終評価のために保存する。残りの筋肉組織試料は、DMD
に含まれるmRNA及びタンパク質の確認アッセイのために保存する。免疫染色及びウエスタ
ンブロットをタンパク質検出のために使用する。

筋生検は、診断の構成要素として、及び探索研究に関連した治療効果の計測としてDMD
対象で共通に行われる。EDBは、日々の活動に必須な筋肉でなく、従ってこの筋肉をサン
プリングすることは、対象について有害な機能的結果を有さないので、これを選択した、
ほとんど使用されないので、EDB筋肉は、筋肉の実質的線維性置換を示す可能性が低く、
従って、ジストロフィン産生の検出に適した組織を提供する。EDB筋肉のサンプリングは
、同定しやすく、局所麻酔下で解剖することができ、かつ必要とされる解析を実行するた
めに十分な量の組織を提供するので、さらなる実用的な利点を提供する。免疫蛍光及びウ
エスタンブロットは、全長ジストロフィンの有無を確認するために、筋生検に対して行わ
れるルーチン試験である。ジストロフィンの非存在は、DMDの診断の確認として調べられ
る。筋膜への局在化を伴うジストロフィンの回復は、前臨床的及び臨床的な薬力学的活性
の直接的な測定とみなされてきた（Barton-Davisの論文、1999, J. Clin. Invest. 104（
4）：375-8l；Politano, 2003, Acta Myol. 22（1）：15-21）。

（6.18 実施例18：上肢及び下肢のミオメトリー）
上肢及び下肢のミオメトリーは、標準化された手順に従って、携帯筋力計を使用して行
われる（Beenakkerの論文、2001, Neuromuscul. Disord. 11（5）：441-6；Hyde, 2001,
Neuromuscul.Disord. 11（2）：165-70）。評価筋肉群には、臀部外転筋、膝伸筋、肘屈
筋及び伸筋、並びに手の握力を含むことが推奨される（対象のベースライン機能状態に応
じて）。左右の評価をすることができ、それぞれの側のそれぞれの筋肉群から、3回の測
定を記録することができる。これらのパラメーターは、治療前、治療の最終日の2日前及
び治療後の経過期間の間モニターする。治療前及び治療期間の間に、ミオメトリーの手順
は、筋生検の前に行う。
携帯筋力計を使用したミオメトリーの評価は、歩行できる対象及び歩行できない対象に
おいて、感度良く、かつ再現性のある筋力の測定である（Beenakkerの論文、2001, Neuro
muscul.Disord. 11（5）：441-6；Hydeの論文、2001, Neuromuscul. Disord. 11（2）：1
65-70）。筋ジストロフィーである対象における評価者間の信頼性は、高い（Stubergの論
文、1988, Phys. Ther. 1988 68（6）：977-82；Hydeの論文、2001, Neuromuscul. Disor
d. 11（2）：165-70）。手動の筋力試験と比較すると、ミオメトリーは、筋肉機能のより
感度よく、かつより複雑でない測定である（McDonaldの論文、1995, Am. J. Phys. Med.
Rehabil.（5 Suppl）：S70-92）。試験は、評価者（例えば、医師又は理学療法士）が容
易に行うことができる。

（6.19 実施例19：経時機能試験（Timed function tests））
経時機能試験は、仰向けの姿勢から立つまでにかかる時間、10メートルを歩くのにかか
る時間、及び4段の標準サイズの階段を登るのにかかる時間を含む（Mendellの論文、1989
, N. Engl. J. Med. 320（24）：1592-7；Griggsの論文、1991. Arch. Neurol. 48（4）
：383-8）。これらのパラメーターは、治療前、治療の最終日の2日前及び治療後の経過期
間の間モニターする。治療前及び治療期間の間に、経時機能試験は、筋生検の前に行われ
る。
これらの試験（仰向けの姿勢から立つまでにかかる時間、10メートルを歩くのにかかる
時間、及び4段の標準サイズの階段を登るのにかかる時間）は、歩行できる対象における
機能的能力のさらなる測定法を提供する。試験は、再現でき、一般に行われ、管理が行い
やすく、かつステロイドでの治療的介入に対する反応を考証した（Mendellの論文、1989,
N. Engl. J. Med. 320（24）：1592-7；Griggsの論文、1991, Arch. Neurol. 48（4）：
383-8）。

（6.20 実施例20：血清CKレベル）
血清CK活性は、市販のNADHとリンクした反応速度アッセイ法（Diagnostic Chemicals L
td., Oxford, CT）を使用して評価される。血清CKレベルは、治療の前に、治療期間の間
の1日目（第1の用量の前に）、7日目、14日目、21日目及び27日目、並びに治療後の42日
目及び56日目に測定する。血清CKは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおいて増加し、
従って疾患のための容易に測定可能な診断マーカーであり、薬物の薬理活性のための潜在
性生物マーカーとして役立つであろう（Mendellらの論文、1989, New Eng. J. Med. 320
（24）：1592-l597）。
血清CKは、全身筋肉完全性の測定法を提供する。血清におけるこの酵素の濃度は、DMD
である対象において50〜100倍増加し、そのレベルの測定は、疾患の早期診断を行う際に
使用される（Wortonの文献、筋ジストロフィー（The muscular dystrophies）、In：Scri
ver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D,編、遺伝性疾患の代謝的及び分子的基礎（
The metabolic and molecular basis of inherited disease.）、第8版、第4巻、New Yor
k：McGraw-Hill, 2001：5493-523）。血清CKのレベルは、疾患の進行をモニターするため
に測定され、筋肉損傷のためのマーカーとして役立つ。運動で誘導される変化は、ばらつ
きを生じるが（Politanoの論文、2003, Acta. Myol. 22（1）：l5-2l）、本マーカーは、
広く利用でき、信頼できるアッセイ法によって容易に、繰り返し、頻繁に評価することが
できるので、これは、利点を有する。前臨床研究では、ステロイドでの治療の間の筋力の
改善と一致して血清CKの減少を示した（Reitterの論文、1995, Brain Dev. 17 Suppl：39
-43）。

（6.21 実施例21；皮膚の線維芽細胞及び筋肉細胞培養）
患者からの初代筋培養におけるジストロフィン産生がインビボにおけるジストロフィン
産生と一致するかどうかを決定するために、患者からの筋組織及び皮膚で研究を行う。こ
れらの実験は、患者から皮膚線維芽細胞が、Myo-Dを産生する発現構築物をトランスフェ
クションすることによってインビトロで筋細胞に分化したときに（Wangの論文、2001, De
velopment 128：4623-33）、治療に応答してジストロフィン産生を示すかどうかを評価す
る。臨床活性と皮膚細胞応答の相関は、治療のための、又はDMDの治療のための新たな薬
剤をスクリーニングするための将来の患者を選択する際に、入手しやすい予測試験を提供
するであろう。細胞を以下のように培養する。生検材料は、輸送の間にヒト増殖培地（又
はPBS）中に貯蔵して、より長い時間のためには、必要に応じて氷上で貯蔵する。組織が2
4時間以内に調製されない場合、材料を、10%のDMSOを含むヒト増殖培地中で凍結し、液体
窒素（又はドライアイス）中に貯蔵することができる。筋芽細胞培養を準備するために組
織を調製する時に、生検材料をPBS中で洗浄される。組織の湿性を保持するために十分なP
BSを培養皿に添加する。ほぼ均一な懸濁液になるように、生検材料をかみそりの刃で徹底
的に細かく切り刻む。組織1グラムあたりおよそ2mlのコラゲナーゼ/ディスパーゼ/塩化カ
ルシウム溶液を添加し、数分間、細かく切り刻み続ける（例えば、5×5×5mmの筋生検の
ためには、1mlの酵素溶液を使用する）。懸濁液を無菌のチューブに移し、混合物が十分
なスラリーになるまで（例えば約20〜30分）、水浴中で37℃にてインキュベートする。懸
濁液をインキュベーションの間に、数回上下にピペット操作することよって更にホモジナ
イズさせる。注射器による上下のピペット操作によるさらなる再懸濁サイクルを、必要に
応じて行うことができる。8mlのヒト増殖培地を懸濁液に添加して、混合する。混合物を1
200rpmにて10分間遠心分離する。細胞ペレットを3mlのヒト増殖培地に再懸濁する。細胞
を、コラーゲンコートした6-ウェルプレートに、又は材料の量に応じてT25コラーゲンコ
ートしたフラスコにまく。細胞を48時間、37℃及び5%CO₂にて培養する。非接着細胞を除
去し、別のコラーゲンコートしたウェルに移す（バックアップとして）。新鮮な増殖培地
を第1のウェル（3ml）に添加する。細胞は、第1のウェルからコンフルエントにまで、及
び2つのコンフルエントなT75-フラスコが得られるまで培養する。貯蔵のためには、細胞
を1つのT75フラスコから1mlの凍結培地を含む4つの冷凍チューブに凍結することができる
。培養の筋原細胞含量は、デスミン染色を行うことによって決定する。デスミン陽性細胞
の割合があまりに低い場合、培養のプレプレーティングが必要になる。

（6.22 実施例22：デュシェンヌ型筋ジストロフィーのための経口治療としての3-[5-(2
-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸の第2相研究）
対象は、研究への登録のために適格であるとされる以下の条件の全てを満たさなければ
ならない：
1. 血清CKの増加及び筋生検におけるジストロフィンの非存在を伴う、5歳までに示す臨
床表現型に基づいたデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）の診断（ジストロフィンタ
ンパク質のC末端部分に対する抗体による陰性の筋細胞膜染色）；
2. ジストロフィン遺伝子のナンセンス突然変異の存在；
3. ジストロフィンシーケンシングのが行われたというが証拠文献、又はシーケンシン
グがすでに行われなかった場合、血液試料が確証的なジストロフィンシーケンシングのた
めに送られたという証拠文献；
4. 両足における理学的検査又はEDB筋肉のX線撮影の画像証拠；
5. 歩けること；
6. 男性；
7. 5歳以上の年齢；
8. 性的にアクティブであることが知られている対象において、研究薬物投与及び追跡
調査期間の間に性交を慎むか、又は避妊のバリア若しくは医学的方法を使用する意志；
9. 予定の来診、薬物投与設計、臨床検査、研究制限及び研究手順（筋生検、ミオメト
リー及びPKサンプリングを含む）に応ずる意志及び能力；
10. 18歳以上である場合、書面にしたインフォームドコンセントを提供することができ
る能力、又は7歳以上の場合、書面での情報に基づいた同意（親/保護者の同意を伴う）を
提供することができる能力。対象が7歳より小さい場合、親/法定後見人の同意のみが得ら
れるであろう；並びに
11. 対象/親/法定後見人が、行われるべき治験の全ての妥当な態様を知らされたことを
示す個人的に署名し日付の入ったインフォームドコンセント文書の証拠（また、7歳以上
の子供については、同意が必要）。

以下の条件のいずれかが存在すると、研究における登録から対象を除外するであろう：
1. 研究者の意見において、患者の安全に悪影響を与え得る医学的状態（例えば、随伴
性疾病、精神医学的条件、アルコール中毒症、薬物乱用）、病歴、理学的所見、ECG知見
又は研究室データの異常の前又はその進行中に、治療又は追跡調査の経過が完了しそうか
、又は研究結果の評価を障することがありそうにない；
2. 鬱血性心不全の臨床症状及び徴候（American College of Cardiology/American Hea
rt Association 段階C 又は段階D）（Huntの論文、2001, J. Am. Coll. Cardiol. 35：21
01-13）；
3. B型肝炎表面抗原、C型肝炎抗体試験又はヒト免疫不全症ウイルス（HIV）試験に陽性
；
4. 10g/dlよりも少ないヘモグロビン；
5. 2.5g/dlよりも少ない血清アルブミン；
6. 異常なGGT又は総ビリルビン（正常研究室の上限値を越える）；
7. 異常な腎機能（正常研究室の上限値の1.5倍を超える血清クレアチニン）；
8. 実質性器官又は血液学的移植の病歴；
9. 進行中の免疫抑制療法（副腎皮質ステロイド以外）；
10. 研究治療の開始前の28日以内における、別の治験薬に対する曝露；
11. 任意のその他の治療的な臨床試験における進行中の関与；
12. チアゾリジンジオンペルオキシゾーム増殖因子で活性化される受容体γ（PPARγ）
アゴニスト、例えばロシグリタゾン（Avandia（登録商標）又は同等品）又はピオグリタ
ゾン（Actos（登録商標）又は同等品）の進行中の使用；
13. 研究治療の開始前の3月以内の全身性コルチコステロイド治療の変更（例えば、治
療の開始；治療の停止；ステロイドの用量、スケジュール又はタイプの変更）；又は
14. 研究治療の開始前の3月以内の全身アミノグリコシド抗生物質での治療。

3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸は、本明細
書に記述した製剤で提供する。治療は、それぞれの治療集団に対して28日以上投与する。
患者の初期集団には、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-
安息香酸で28日間、1日3回、所与の服用レベル（例えば、4、4及び8mg/kg）にて毎日治療
する。初期患者が薬物に耐性がある場合、患者の第2集団は、1日3回、より高い服用レベ
ル（例えば、10、10及び20mg/kg）にて、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジ
アゾール-3-イル]-安息香酸を受ける。従って、それぞれの患者は、合計84用量の3-[5-(2
-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸を受ける。28日の治療
の終了後、それぞれの患者は、治療の無いさらなる28日が続く。
それぞれの服用レベルにて、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3
-イル]-安息香酸は、6、6及び12時間（-30分±）間隔で1日3回摂取されることが推奨され
る。理想的には、それぞれの用量は、食後〜30分以内に摂取されるべきである（例えば、
朝食後の〜午前7時、昼食後の〜午後1時及び夕食後の〜午後7時）。投薬スケジュールの
変更が、外来患者の状況では生じるかもしれないことが理解されるが、処方される処方計
画（投薬間隔及び食事に対する投薬の関係を含む）は、PK試料の収集日の近くに行われる
ことが推奨される。臨床指標は、上に記載した手順を使用して評価する。
6人の患者には、16mg/kgの総1日量のために、朝食と共に4mg/kg、昼食と共に4mg/kg及び
夕食と共に8mg/kgからなる処方計画で、1日3回、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オ
キサジアゾール-3-イル]-安息香酸を投与した。全ての患者は、歩行可能であったが、あ
る程度の筋肉機能障害及び高い血清CK濃度を含むDMDの特徴徴候及び症候を有した。深刻
な薬物に関連した有害事象は、報告されなかった。予備的結果は、全ての潜在的な薬物に
関連した有害事象の重症度が軽度であったことを示唆する。これらの有害事象には、1人
の患者の下痢；1人の患者の腹痛；及び2人の患者の鼓腸を含んだ。患者の理学的検査、生
命徴候測定又は心電図において同定される安全懸念はなかった。血清肝酵素、ビリルビン
、クレアチニン又は血中尿素窒素の臨床的に有意な上昇は、示されなかった。治療コンプ
ライアンスは優れており、患者は、より低い服用レベルにて28日間の意図された総薬物治
療の95%以上を摂取した。患者は、有害事象により治療を中断することはなかった。
これらの6人の患者からの3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イ
ル]-安息香酸による暫定PKパラメーターを表18に記述してある。DMDの第2相研究における
サンプリング期間の間の27日の治療間隔の間に、薬物蓄積の証拠も代謝の誘導による薬物
濃度の減少の証拠もなかった。

ナンセンス突然変異で媒介されるDMDである患者における、3-[5-(2-フルオロ-フェニル
)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸の安全性、コンプライアンス、PK、全長筋
肉ジストロフィンタンパク質の発現に対する効果及び臨床活性を評価するために、さらな
る第2相研究を以下の通りに実施した。
3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸は、朝食、
昼食及び食事の後にそれぞれ4、4、8mg/kg（低用量）；10、10、20mg/kg（中用量）；及
び20、20、40mg/kg（高用量）の服用レベルにて28日間経口投与した。26人の少年（年齢
：5〜13歳；終止コドン：15人がUGA、6人がUAG、5人がUAA；ベースライン血清CK：8,645
〜49,500 IU；ステロイド使用：19/26）は、低（n=6）又は中（n=20）服用レベルにて3-[
5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸を完了した。全て
の有害事象及び研究室データの異常は、軽度から中程度で、用量に関連した頻度又は重症
度の変化はなかった。コンプライアンスは、両服用レベルにおいて98%よりも高かった。1
日目及び28日目のPKは、時間とともに安定な血漿曝露を示すが；しかし、曝露は、3-[5-(
2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸で治療した健康な成
人ボランティア及び嚢胞性線維症患者においてより低かった。治療前の筋生検からの筋管
培養では、24/24（100%）の評価できる患者におけるインビトロでの3-[5-(2-フルオロ-フ
ェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸処理で、ジストロフィン発現の用量
依存的増大を示した。ベースラインと比較して、インビボでのジストロフィン発現の治療
後の増大は、低及び中用量にて、それぞれ4/6（67%）（90%CI 27〜94%）及び10/20（50%
）（90%CI 30〜70%）の少年で生じた。血清CKレベルは、3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1
,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸の投与の間に有意に減少した。治療の28日間以
内に、筋力及び経時機能の変化は、小さく、有意でなかった。

3-[5-(2-フルオロ-フェニル)-[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸は、問題な
くインビトロ及びインビボで全長ジストロフィン発現を誘導して、ナンセンス突然変異で
媒介されるDMDを有する少年における血清CKレベルを減少させる。低及び中用量の3-[5-(2
-フルオロ-フェニル)[1,2,4]オキサジアゾール-3-イル]-安息香酸レベルは、活性であっ
たが、これらは、最大前臨床活性に関連した血漿曝露を達成しなかった。12人のさらなる
少年における高服用レベルでの評価は、進行中である。

（7. 均等）
当業者であれば、本明細書に記述した本発明の具体的実施態様に対する多くの均等を認
識するであろうし、又はルーチン実験のみを使用して確認することができるであろう。こ
のような均等は、特許請求の範囲によって包含されることが意図される。本明細書におい
て言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも、それぞれの個々の刊行物、特
許又は特許出願が具体的かつ個々に参照により本明細書に組み込まれることが示されてい
るのと同程度に、本明細書において、参照により明細書に組み込まれる。

１ルシフェラーゼリポーター構築物に由来するmRNAの概略。 図2A-2E。mRNA構築物のルシフェラーゼ-CD40リポーターに由来するmRNA。 マウスβ-チューブリンmRNAの概略。

Claims (4)

1. CFTRの位置414、493、1316、553、542、1162、122、1455、822、60、764、1291、849、434、88、1158又は6542にてナンセンス突然変異を有する対象における嚢胞性線維症の治療のために該対象において使用するための薬剤の製造における下記式を有する化合物又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物の使用であって：
   

   

   該薬剤が、24時間の間に、1×の第1用量、1×の第2用量、及び2×の第3用量の３用量で該対象に投与されるものであり、当該×が0.1mg/kg〜500mg/kgである、前記使用。
2. 嚢胞性線維症を有する対象における機能的リードスルータンパク質の産生のための薬剤の製造における下記式を有する化合物又はその医薬として許容し得る塩、溶媒和物若しくは水和物の使用であって、
   

   

   該対象における機能的リードスルータンパク質が、CFTRの位置414にてグルタミン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置493にてグルタミン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置1316にてトリプトファン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置553にてアルギニン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置542にてグリシン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置1162にてアルギニン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置122にてチロシン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置1455にてセリン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置822にてグルタミン酸以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置60にてグルタミン酸以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置764にてアルギニン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置1291にてグルタミン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置849にてチロシン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置434にてセリン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置88にてロイシン以外の任意のアミノ酸残基、CFTRの位置1158にてアルギニン以外の任意のアミノ酸残基、又はCFTRの位置6542にてグリシン以外の任意のアミノ酸残基を有し；かつ、
   該薬剤が、24時間の間に、1×の第1用量、1×の第2用量、及び2×の第3用量の３用量で該対象に投与されるものであり、当該×が0.1mg/kg〜500mg/kgである、前記使用。
3. 前記化合物が有効量で存在し、該化合物が下記式を有し、
   

   

   該化合物又はその医薬として許容し得る塩の有効量が、3回用量に分けて1日あたり0.1mg/kg〜500mg/kgの間であり、該第1及び第2の用量がそれぞれ該投与される総量の25%であり、かつ該第3の用量が投与される総量の50%である、請求項1又は2記載の使用。
4. 前記対象は、CFTRの位置414、493、1316、553、542、1162、122、1455、822、60、764、1291、849、434、88、1158又は6542にてナンセンス突然変異を有することがプレスクリーニングを介して決定されている、請求項1又は2記載の使用。

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