FR3025105A1 - Utilisation de l'acide valproique ou de ses derives dans le traitement des insuffisances en hepcidine et de leurs consequences - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés, pour corriger les insuffisances en hepcidine et leurs effets, qu'il s'agisse de ceux qui conduisent à la surcharge en fer ou bien de ceux qui sont associés à l'hepcidino-déficience et qui persistent après déplétion en fer, dont le rhumatisme hémochromatosique pour lequel il n'existe pas actuellement de traitement spécifique.

Description

Utilisation de l'Acide Valproïque ou de ses Dérivés dans le Traitement des Insuffisances en Hepcidine et de leurs Conséquences Domaine de l'Invention La présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés pour traiter les hepcidino déficiences et leurs conséquences. Contexte de l'Invention Le métabolisme du fer doit être parfaitement contrôlé pour éviter l'apparition de situations délétères : accumulations anormales de fer dans l'organisme, ou bien carences en fer. Chez l'homme, les accumulations anormales de fer peuvent être systématiques, touchant, en particulier, le foie, le coeur et le pancréas. Ces situations pathologiques entraînent des complications qui ont des conséquences ayant un impact sur l'espérance de vie (cirrhose, cancer du foie, myocardiopathies, diabète) et sur les capacités fonctionnelles (ostéoporose, rhumatisme hémochromatosique, hypogonadisme, etc...) (Pietrangelo, N. Engl. J. Med., 2004, 350: 2383-2397).

Ces pathologies de surcharge en fer mettent en jeu l'hepcidine (Ganz, Blood, 2011, 117: 4425-4433), un peptide synthétisé au niveau du foie par les hépatocytes et secrété dans le plasma. Ce peptide circulant interagit avec la ferroportine, protéine exportatrice de fer exprimée sur la membrane des cellules (macrophages, entérocytes), provoquant sa dégradation, et limite donc la sortie du fer des cellules vers le plasma que médie la ferroportine. Ainsi le contenu cellulaire en fer et la concentration de fer dans le plasma sont contrôlés. Des taux anormalement bas d'hepcidine favorisent la sortie du fer des cellules, en particulier des macrophages, des entérocytes et des hépatocytes, induisant ainsi une augmentation du fer dans le plasma qui entraîne une surcharge en fer cellulaire touchant en particulier le foie, le coeur, le pancréas et l'os. C'est la situation observée au cours des hémochromatoses génétiques liées aux mutations des gènes HFE, TRF2, hémojuvéline et/ou hepcidine (Pietrangelo, Hepatology, 2007, 46: 11291-11301). D'autres surcharges en fer peuvent présenter un tableau similaire sans que la cause ne soit aujourd'hui identifiée. Ainsi, chez la souris, une invalidation du gène BMP6 provoque une déficience en hepcidine, BMP6 induisant l'expression de l'hepcidine lors des surcharges en fer hépatiques. D'autres gènes et/ou situations pathologiques pourraient, dans le futur, être 3025105 2 associées à ces situations "d'insuffisance en hepcidine". Au cours des hémochromatoses génétiques, le taux d'hepcidine est anormalement bas en raison d'une anomalie de la régulation transcriptionnelle de l'expression de l'hepcidine du fait de l'atténuation de la signalisation liée en particulier à la voie activatrice BMP/SMAD (Meynard et al., Nature 5 Genet., 2009, 41: 478-481). De plus, au cours de certaines anémies d'origine hématologique, une baisse du niveau d'hepcidine, consécutive à l'intensité de l'érythropoïèse peut conduire à la constitution/majoration d'une surcharge en fer. Augmenter le niveau d'hepcidine dans ces situations représenterait donc un traitement étiologique de ces surcharges en fer.

10 Aujourd'hui, le traitement des surcharges en fer génétiques est symptomatique, visant à réduire ou éliminer l'excès de fer (Brissot et al., Trends Mol. Med., 2011, 17: 707-713). Il est le plus souvent réalisé au travers de soustractions sanguines (saignées) régulières qui permettent de retirer le fer présent dans les hématies. Le fer en excès dans les autres organes est alors mobilisé pour reconstituer le stock d'hématies au cours de 15 l'érythropoïèse. Les saignées favorisent une aggravation du déficit en hepcidine (van Dijk et al., Br. J. Haematol., 2008, 142(6) : 979-985). Ce déficit est probablement lié, au moins en partie, à la production par les érythroblastes d'un facteur soluble récemment identifié qui limite la production hépatique d'hepcidine (l'érythroferrone) (Kautz et al., Nature Genetics, 2014, 46(7) : 678-684, doi: 10.1038/ng.2996). Dès lors la saignée 20 "encourage" paradoxalement l'absorption digestive du fer, ce qui n'est pas le but recherché. Dans ces indications, l'utilisation de molécules chélatrices du fer est limitée du fait du risque d'effets secondaires sur les cellules non surchargées en fer (balance bénéfice/risque), les chélateurs pouvant extraire le fer de l'ensemble des cellules. Il faut noter que le traitement déplétif, quel que soit son mode de réalisation, n'est pas curatif car 25 s'il permet de retirer le fer en excès, il ne permet pas d'éviter que l'excès de fer ne se constitue. Le traitement des surcharges en fer secondaires aux maladies hématologiques ne peut faire appel aux saignées, car il existe une anémie et/ou des risques d'intolérance aux saignées. Dans ce cas, l'utilisation de chélateurs du fer est la règle. Des études sont actuellement réalisées pour générer des hepcidines de synthèse 30 administrables à l'homme et d'autres sont en cours pour identifier des molécules capables de réguler l'expression d'hepcidine (Gaun et al., Blood Cells, Mol. Dis., 2014, DOL 10.1016/j.bcmd.2014.06.002; Ruchala and Nemeth, Trends in Pharm. Sci., 2004, 155161, DOL 10.1016/j .tips.2014.01.004). Cependant, ces études n'ont pas encore abouti. Il 3025105 3 existe donc toujours, dans l'art, un besoin de disposer de nouveaux outils pour le traitement des déficiences en hepcidine et leurs conséquences sur la santé humaine. Résumé de l'Invention D'une façon générale, la présente invention repose sur la mise en évidence que 5 l'acide valproïque, qui est une molécule utilisée depuis longtemps dans le traitement de l'épilepsie et comme thymorégulateur (Chateauvieux et al., J. Biomed. Biotechnol., 2010, pii: 479364. doi: 10.1155/2010/479364. Epub 2010 Jul 29. Review), affecte l'expression de l'hepcidine. En effet, de manière surprenante et inattendue, les présents Inventeurs ont montré que l'acide valproïque induit l'expression d'hepcidine dans une lignée d'origine 10 hépatocytaire humaine (HepG2) de façon dose-dépendante et pour des concentrations inférieures aux concentrations thérapeutiques de l'épilepsie. Ils ont également observé un effet similaire avec le valpromide, un dérivé de l'acide valproïque, qui est également utilisé dans le traitement de l'épilepsie. En conséquence, dans un premier aspect, la présente invention concerne l'acide 15 valproïque, ou l'un de ses dérivées pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation dans le traitement des insuffisances en hepcidine. Dans certains modes de réalisation, le dérivé pharmaceutiquement acceptable est choisi parmi les sels de l'acide valproïque (par exemple le valproate de sodium, le valproate de potassium, le valproate de calcium ou le divalproex sodique), les esters de 20 l'acide valproïque (par exemple le valproyl taurinamide, le N-méthyl valproyl taurinamide, le N,N-diméthyl valproyl taurinamide, ou le N-isopropyl valproyl taurinamide), les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque (par exemple le valpromide, le 2-hydroxypropyl valpromide, ou le valrocémide), les thioamides de l'acide valproïque, les oligomères de l'acide valproïque, et leurs mélanges.

25 Dans certains modes de réalisation particuliers, le dérivé pharmaceutiquement acceptable est le valpromide. Dans certains modes de réalisation, l'insuffisance en hepcidine est associée à une hémochromatose héréditaire ou à une anémie chronique. L'anémie chronique peut être due à un syndrome myélodysplasique, à une hémoglobinopathie (thalassémies, qu'elles 30 soient dépendantes ou non des transfusions) ou à d'autres formes rares d'anémies.

3025105 4 La présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables et au moins un véhicule ou excipient physiologiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement des insuffisances en hepcidine. Le dérivé pharmaceutiquement acceptable 5 présent dans la composition pharmaceutique peut être n'importe quel dérivé de l'acide valproïque, en particulier ceux décrits ici. Dans le même aspect, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivées pharmaceutiquement acceptables, pour la fabrication d'un médicament utile dans le traitement des insuffisances en hepcidine. Le dérivé 10 pharmaceutiquement acceptable peut être n'importe quel dérivé de l'acide valproïque, en particulier ceux décrits ici. Toujours dans le même aspect, la présente invention concerne une méthode de traitement d'une insuffisance en hepcidine chez un sujet comprenant l'administration au sujet d'une quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque ou de l'un de ses 15 dérivés pharmaceutiquement acceptables ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables. Le dérivé pharmaceutiquement acceptable peut être n'importe quel dérivé de l'acide valproïque, en particulier ceux décrits ici. Dans certains modes de réalisation préférés, le sujet est un être humain. Le sujet 20 souffrant d'insuffisance en hepcidine peut être atteint d'une hémochromatose héréditaire ou d'une anémie chronique. L'anémie chronique peut être une anémie sidéroblastique, une thalassémie, ou une anémie hémolytique. Dans certains modes de réalisation, la quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables ou d'une 25 composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, administrée au sujet est inférieure aux doses thérapeutiques habituellement administrées dans le traitement de l'épilepsie Dans un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une 30 cellule. Le dérivé de l'acide valproïque peut être n'importe quel dérivé, y compris ceux décrits ici.

3025105 5 Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Dans d'autres modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo. Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule hépatique. Dans ce même aspect, la présente invention concerne aussi un procédé pour 5 augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule comprenant la mise en contact de la cellule avec une quantité efficace d'acide valproïque ou d'un de ses dérivés ou d'une composition pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés. Le dérivé de l'acide valproïque peut être n'importe quel dérivé, y compris ceux décrits ici. Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Dans d'autres 10 modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo. Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule hépatique. Une description plus détaillée de certains modes de réalisation préférés de l'invention est donnée ci-dessous. Description Détaillée de l'Invention 15 Comme mentionné ci-dessus, la présente invention concerne l'utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés, dans le traitement des déficiences en hepcidine et de leurs conséquences sur la santé humaine. I - L'Acide Valproïque et ses Dérivés L'Acide Valproïque 20 Par "acide valproïque" on entend le composé de formule (I) encore appelé acide-2- propylpentanoïque (C8H1602 - numéro CAS 99-66-1). (I) Les activités biologiques de l'acide valproïque sont multiples (revues dans 25 Chateauvieux et al., J. Biomed. Biotechnol., 2010, pii: 479364. doi: 10.1155/2010/479364). L'acide valproïque affecte les neurotransmetteurs GABA 3025105 6 (Gamma Amino Butyrate) potentialisant son activité inhibitrice. Plusieurs mécanismes d'actions sont suggérés. L'acide valproïque agit en particulier sur le métabolisme du GABA: inhibe la dégradation du GABA, de la GABA Transaminobutyratre (ABAT), acroissement de la synthèse de GABA, et modifie son turnover. De plus l'acide 5 valproïque bloque certains canaux ioniques, attenue l'excitation médiée par le N-Methyl- D-Aspartate, et bloque l'activité de certains canaux ioniques notamment Na+ et Ca2+ (voltage-dependent L type CACNA1 type C, D, N, and F). Aux concentrations correspondant à une utilisation clinique, l'acide valproïque est aussi un inhibiteur des histones désacétylases (HDAC) et peut aussi moduler l'activité 10 des méthylases (Chateauvieux et al., J. Biomed. Biotechnol., 2010, pii: 479364. doi: 10.1155/2010/479364. Epub 2010 Jul 29 ; Che H et al., Eur J Pharmacol.

2012 Sep 5;690(1-3):51-9. doi: 10.1016/j.ejphar.2012.06.019. Epub 2012 Jun 20). L'acide valproïque est un anticonvulsant et calmant, utilisé depuis longtemps essentiellement pour le traitement de l'épilepsie, le trouble bipolaire, la dépression, et les migraines. Ses 15 effets secondaires sont bien connus, les plus communs étant la sédation, la prise de poids, les tremblements et les problèmes gastro-intestinaux. Le dosage des taux sanguins peut aider à limiter les effets secondaires. L'acide valproïque est contre-indiqué chez la femme enceinte, en particulier au cours du premier trimestre de grossesse car il est responsable de malformations congénitales.

20 Aux concentrations correspondant à une utilisation clinique, l'acide valproïque est aussi un inhibiteur des histones désacétylases (HDAC) et peut aussi moduler l'acivité des méthylases (Chateauvieux et al., J. Biomed. Biotechnol., 2010, pii: 479364. doi: 10.1155/2010/479364. Epub 2010 Jul 29 ; Che H et al., Eur J Pharmacol.

2012 Sep 5;690(1-3):51-9. doi: 10.1016/j.ejphar.2012.06.019. Epub 2012 Jun 20). L'acide 25 valproïque est un anticonvulsant et calmant, utilisé depuis longtemps essentiellement pour le traitement de l'épilepsie, le trouble bipolaire, la dépression, et les migraines. Ses effets secondaires sont bien connus, les plus communs étant la sédation, la prise de poids, les tremblements et les problèmes gastro-intestinaux. Le dosage des taux sanguins peut aide à limiter les effets secondaires. L'acide valproïque est contre-indiqué chez la femme 30 enceinte, en particulier au cours du premier trimestre de grossesse car il est responsable de malformations congénitales.

3025105 7 Dérivés de l'Acide Valproïque Le terme "dérivé de l'acide valproïque", tel qu'utilisé ici, désigne une substance chimique dérivée de l'acide valproïque soit directement soit par modification ou 5 substitution partielle. Ainsi, par exemple, un dérivé de l'acide valproïque peut être un sel de l'acide valproïque pharmaceutiquement acceptable. L'expression "sel pharmaceutiquement acceptable" de l'acide valproïque est un sel qui peut être administré aux mammifères, y compris aux êtres humains, et qui possède l'activité pharmacologique désirée de l'acide 10 valproïque. Dans certains cas, un "sel pharmaceutiquement acceptable" de l'acide valproïque peut aussi conférer initialement une propriété pharmacocinétique avantageuse à l'acide valproïque, qui était absente dans la forme non salifiée, et peut même avoir un effet positif sur la pharmacodynamique de l'acide valproïque en ce qui concerne son activité thérapeutique dans le corps.

15 En raison de la présence d'une fonction acide, l'acide valproïque peut former un sel avec une base minérale ou organique. A titre d'exemple de sels avec des bases organiques ou minérales, on peut citer les sels formés avec des métaux et notamment des métaux alcalins, alcalino-terreux et de transition (tels que le sodium, le potassium, le calcium, le magnésium, l'aluminium), ou avec des bases comme l'ammoniac ou des 20 amines secondaires ou tertiaires (telles que le diéthylamine, la triéthylamine, la pipéridine, la pipérazine, la morpholine) ou avec des acides aminés basique, ou avec des osamines (telles que la méglumine) ou bien encore avec des amino alcools (tels que le 3- amino-butanol et le 2-aminoéthanol). Ainsi, dans certains modes de réalisation, le sel de l'acide valproïque utilisé selon l'invention est le valproate de sodium, le valproate de 25 potassium, le valproate de calcium ou le divalproex sodique. L'expression "sel pharmaceutiquement acceptable" comprend également toutes les formes d'addition de solvants (solvates et hydrates) ou les formes cristallines (polymorphes) de ce même sel. Le terme "solvate" désigne les adduits des composés avec des molécules de solvant inerte qui se forment en raison de leur force d'attraction 30 mutuelle. Lorsque le solvant est l'eau, on parle d'"hydrates". Les solvates sont, par exemple, les monohydrates, dihydrates et alcoholates.

3025105 8 Alternativement, un dérivé de l'acide valproïque à utiliser selon l'invention peut être un ester de l'acide valproïque, un thioester de l'acide valproïque, un amide de l'acide valproïque, ou un thioamide de l'acide valproïque. En particulier, le dérivé de l'acide valproïque peut être le valpromide (c'est-à-dire le 5 dipropylacétamide, numéro CAS 2430-37-5). Le valpromide est un médicament antiépileptique utilisé en association pour traiter certaines épilepsies avec manifestations psychiatriques. Il est aussi employé dans le traitement de psychoses maniaco-dépressives ou d'états agressifs. Le dérivé de l'acide valproïque peut aussi être un dérivé du valpromide, comme le 2-hydroxypropyl valpromide.

10 D'autres exemples de dérivés de l'acide valproïque incluent, sans limitation, le valrocémide (c'est-à-dire le N-(2-amino-2-oxoéthyl)-2-propylpentanamide, le produit de conjugaison entre l'acide valproïque et le glycinamide); le valproyl taurinamide (le produit de conjugaison entre l'acide valproïque et la taurine), et ses dérivés : le N-méthyl valproyl taurinamide, le N,N-diméthyl valproyl taurinamide, et le N-isopropyl valproyl 15 taurinamide, l'isovaléramide (un analogue de l'acide valproïque); valnoctamide (un isomère structurel du valpromide); le propylisopropylacétamide (PID); l'acide 2,2,3,3- tétraméthylcylcopropylcarboxylique (TMCA) (un analogue cyclopropyl de l'acide valproïque); le N-methy1-2,2,3,3-tétraméthylcyclopropanecarboxamide (MTMCD) et le 2,2,3,3 -tetramethyl cy cl oprop ane-carb onylurée (TMCU).

20 L'expression "dérivé de l'acide valproïque" englobe également les composés désignés comme "prodrugs". Le terme "prodrug" désigne tout composé destiné à l'usage thérapeutique qui doit subir une biotransformation, après administration à un organisme, pour que s'exerce une activité biologique. C'est une forme d'optimisation par modulation moléculaire où la chimie intervient pour modifier non pas les propriétés 25 pharmacodynamiques intrinsèques de la molécule considérée (ici l'acide valproïque), mais pour changer ses propriétés pharmacocinétiques (parfois galéniques). Les prodrugs de l'acide valproïque comprennent les composés selon la formule (I) qui ont été modifiés par exemple avec des groupes alkyle ou acyle, des sucres ou des oligopeptides et qui sont clivés rapidement dans l'organisme pour libérer l'acide valproïque.

30 L'expression "dérivé de l'acide valproïque" englobe aussi les oligomères de l'acide valproïque. Le terme "oligomère" désigne une molécule formée par liaison covalente entre au moins deux molécules. En particulier, un oligomère de l'acide valproïque peut 3025105 9 être formée par liaison covalente entre l'acide valproïque et un de ses dérivées, comme par exemple un de ses sels. Des exemples d'oligomères de l'acide valproïque incluent, sans limitation, ceux décrits dans les brevets américains numéro 4,988,731 et numéro 5,212,326, comme par exemple un oligomère comprenant de l'acide valproïque et du 5 vaproate de sodium dans un rapport molaire 1:1 et contenant 4 unités, ou un oligomère comprenant de l'acide valproïque et du valproate de sodium dans un rapport molaire 1:1 et contenant 4 à 6 unités, ou un oligomère comprenant 1 à 3 moles d'acide valproïque et 1 à 6 moles d'un sel de l'acide valproïque pharmaceutiquement acceptable. L'homme du métier sait déterminer si un dérivé de l'acide valproïque peut être 10 utilisé dans le traitement des insuffisances en hepcidine, par exemple en vérifiant tout d'abord que le dérivé en question induit une augmentation de l'expression de l'ARNm endogène de l'hepcidine dans des cellules hépatiques (comme décrit dans les Exemples ci-dessous). Préparation de l'Acide Valproïque ou de l'un de ses dérivés 15 L'acide valproïque et ses dérivés destinés à être utilisés selon la présente invention peuvent être préparés par n'importe quelle méthode de synthèse chimique, la méthode de préparation n'étant pas un facteur limitant de l'invention. De nombreuses méthodes de préparation de l'acide valproïque et de ses dérivés ont été décrites. Compositions Pharmaceutiques 20 Dans le contexte de l'invention, l'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) est administré comme tel ou sous forme d'une composition pharmaceutique. Une telle composition pharmaceutique comprend de l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivés ou encore un de leurs mélanges, et au moins un véhicule ou excipient physiologiquement acceptable. Dans le contexte de la présente invention, on entend par "véhicule ou 25 excipient physiologiquement acceptable" tout milieu ou additif qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique du principe actif (ici l'acide valproïque ou son dérivé) et qui n'est pas excessivement toxique pour le patient ou sujet, aux concentrations auxquelles il est administré. Préférablement, le véhicule ou excipient physiologiquement acceptable est approprié pour l'utilisation vétérinaire ou pour l'utilisation pharmaceutique 30 humaine.

3025105 10 Dans certains modes de réalisation, la composition pharmaceutique à utiliser selon l'invention est un médicament à base d'acide valproïque ou de valpromide déjà existant. Par exemple, des médicaments à base d'acide valproïque ou de valpromide sont vendus sous les noms commerciaux : DEPAKINE®, DEPAKINE-CHRONO®, DEPAMIDE®, 5 DEPAKOTE® et MICROPAKINE® L.P. en France ; CONVULEX®, DEPAKINE® et MERCK-VALPROATE® en Belgique ; CONVULEX®, DEPAKINE® et ORIFIL® en Suisse ; DEPAKENE® et EPIVAL® au Canada et aux Etats-Unis. Tous ces médicaments sont administrés par voie orale, et certains sont aussi injectables. Dans d'autres modes de réalisation, la composition pharmaceutique à utiliser selon 10 l'invention est une formulation nouvelle (c'est-à-dire qui n'est pas actuellement commercialement disponible). La formulation d'une composition pharmaceutique à utiliser selon l'invention peut varier en fonction de la voie d'administration et du dosage pour lesquels la composition est destinée à être utilisée. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient 15 physiologiquement acceptable, une composition pharmaceutique peut être sous toute forme appropriée pour l'administration à un mammifère, y compris l'homme. L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut être formulé en une grande variété de formes galéniques et de supports pour l'administration orale. L'administration orale peut s'effectuer par exemple sous forme de comprimés, de comprimés enrobés, de 20 capsules de gélatine dure et molle, de solutions, d'émulsions, de sirops ou de suspensions. L'acide valproïque et ses dérivés peuvent être efficaces lorsqu'ils sont administrés par d'autres voies d'administration comme l'administration topique parentérale continue (perfusion intraveineuse), intramusculaire, intraveineuse, par suppositoires, entre autres voies d'administration. La voie d'administration préférée est 25 en général l'administration orale, utilisant un schéma posologique journalier pratique qui peut être ajusté selon le degré de l'affection et la réponse du patient à l'ingrédient actif. Il est possible de mettre un ou plusieurs ingrédients actifs, et un ou plusieurs véhicules, excipients, supports ou diluants classiques, sous forme de compositions pharmaceutiques et d'unités de prise. Les compositions pharmaceutiques et les formes 30 d'unités de prise peuvent comprendre, en plus de l'acide valproïque (ou d'un de ses dérivés), des ingrédients classiques en des proportions classiques, avec ou sans autres composés ou principes actifs, et les formes d'unités de prise peuvent contenir une quantité 3025105 11 efficace appropriée quelconque de l'ingrédient actif, proportionnée à la posologie journalière à utiliser. Les compositions pharmaceutiques peuvent être utilisées sous forme de produits solides, comme des comprimés ou des capsules chargées, de produits semi-solides, de poudres, de formulations à libération prolongée, ou de liquides comme 5 des solutions, des suspensions, des émulsions, des élixirs, ou des capsules chargées à usage oral; ou sous forme de suppositoires pour l'administration rectale; ou sous forme de solutions injectables stériles à usage parentéral. Une préparation typique contiendra d'environ 5 % à environ 95 % de composé actif ou de composés actifs (en masse). L'expression "préparation" ou "forme galénique" est censée comprendre les formulations 10 aussi bien solides que liquides du composé actif et l'homme de l'art se rendra compte qu'un ingrédient actif peut exister dans différentes préparations selon l'organe ou le tissu cible, la dose désirée et les paramètres pharmacocinétiques. Les préparations sous forme solide comprennent des poudres, des comprimés, des pilules, des capsules, des cachets, des suppositoires, et des granulés à disperser. Un 15 support solide peut être une ou plusieurs substances qui peuvent aussi jouer le rôle de diluants, agents aromatisants, solubilisants, lubrifiants, agents de suspension, liants, conservateurs, agents de désintégration des comprimés, ou un produit d'encapsulation. Dans les poudres, le support est en général un solide finement divisé qui est mélangé avec le constituant actif finement divisé. Dans les comprimés, le constituant actif est en 20 général mélangé avec le support ayant la capacité de liaison nécessaire dans des proportions appropriées, et compacté sous la forme et aux dimensions désirées. Des supports appropriés comprennent, mais sans y être limités, le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le sucre, le lactose, la pectine, la dextrine, l'amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, le carboxyméthylcellulose sodique, une 25 cire de faible point de fusion, du beurre de cacao, et analogues. Les préparations sous forme solide peuvent contenir, en plus du constituant actif, des colorants, des arômes, des stabilisants, des tampons, des édulcorants artificiels et naturels, des dispersants, des agents épaississants, des agents solubilisants, et analogues. Les formulations liquides conviennent aussi pour l'administration orale et 30 comprennent une formulation liquide comprenant des émulsions, des sirops, des élixirs, des solutions aqueuses, et des suspensions aqueuses. Elles peuvent comprendre des préparations sous forme solide qui doivent être converties en préparations sous forme liquide peu avant l'emploi. Les émulsions peuvent être préparées dans des solutions, par 3025105 12 exemple dans des solutions aqueuses de propylèneglycol, ou peuvent contenir des agents émulsionnants comme la lécithine, le monooléate de sorbitane ou la gomme arabique. On peut préparer des solutions aqueuses en dissolvant le constituant actif dans de l'eau et en ajoutant des colorants, des arômes, des stabilisants et des agents épaississants appropriés.

5 On peut préparer des suspensions aqueuses en dispersant le constituant actif finement divisé dans de l'eau avec un produit visqueux, comme une gomme naturelle ou synthétique, une résine, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique, et d'autres agents de suspension bien connus. L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut être formulé pour l'administration 10 parentérale (par exemple par injection, par injection de bolus, ou par perfusion continue) et peut se présenter sous forme d'unités de prise dans des ampoules, des seringues pré-remplies, des perfusions de petit volume ou dans des récipients multidoses avec un conservateur ajouté. Les compositions peuvent prendre la forme de suspensions, de solutions ou d'émulsions dans des véhicules huileux ou aqueux, par exemple des 15 solutions dans du polyéthylèneglycol aqueux. Des exemples de supports, diluants, solvants ou véhicules huileux ou non aqueux comprennent le propylèneglycol, le polyéthylèneglycol, des huiles végétales (par exemple l'huile d'olive), et des esters organiques injectables (par exemple l'oléate d'éthyle), et peuvent contenir des agents de formulation comme des conservateurs, des agents mouillants, des émulsionnants ou des 20 agents de suspension, des stabilisants et/ou des dispersants. L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut aussi être sous forme de poudre, obtenue par isolement aseptique du produit solide stérile ou par lyophilisation à partir d'une solution pour la reconstitution avant l'emploi avec un véhicule approprié, par exemple de l'eau apyrogène stérile. L'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés) peut être formulé pour l'administration 25 sous forme de suppositoires. En général, pour la préparation de suppositoires, on fait d'abord fondre une cire de faible point de fusion, comme un mélange de glycérides d'acides gras ou du beurre de cacao, et on disperse le constituant actif de manière homogène, par exemple en agitant. On verse ensuite le mélange homogène obtenu dans des moules de taille appropriée, et on le laisse refroidir et se solidifier.

30 Si désiré, il est possible de préparer des formulations avec des enrobages entériques adaptés pour l'administration à libération prolongée ou régulée de l'ingrédient actif. Par exemple, on peut formuler l'acide valproïque, ou un de ses dérivées, dans des dispositifs de délivrance de médicaments transdermiques ou sous-cutanés. Ces systèmes de 3025105 13 délivrance sont avantageux lorsque la libération prolongée du principe actif est nécessaire et lorsque l'acceptation du régime de traitement par le patient est cruciale. Dans les systèmes de délivrance transdermique, les ingrédients actifs sont souvent fixés sur un support solide adhérant à la peau. L'acide valproïque, ou un de ses dérivés, peut aussi 5 être combiné avec un agent favorisant la pénétration, par exemple l'Azone (1- dodécylazacycloheptan-2-one). Des systèmes de délivrance à libération prolongée par voie sous-cutanée sont insérés dans la couche subdermale par une procédure chirurgicale ou par injection. Les implants subdermaux encapsulent le composé dans une membrane soluble dans les lipides, par exemple du caoutchouc silicone, ou dans un polymère 10 biodégradable, par exemple du poly(acide lactique). Des formulations appropriées et des véhicules, supports, diluants et excipients pharmaceutiques sont décrits dans Remington: The Science and Practice of Pharmacy 1995, édité par E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19ème édition, Easton, Pennsylvanie. L'homme du métier dans le domaine de la formulation peut modifier les 15 formulation dans les limites de l'enseignement de la description pour fournir de nombreuses formulations destinées à une voie d'administration particulière sans compromettre l'activité thérapeutique du ou des principes actifs. Il est à la portée de l'homme du métier de modifier la voie d'administration et le schéma posologique d'un composé particulier (acide valproïque ou l'un de ses dérivés) 20 pour exploiter la pharmacocinétique du composé en vue d'un effet bénéfique maximum chez le patient. Les compositions pharmaceutiques à utiliser selon la présente invention peuvent, en outre, contenir au moins un principe actif pharmaceutique supplémentaire (c'est-à-dire, en plus de l'acide valproïque ou d'un de ses dérivés). On entend par "principe actif 25 pharmaceutique", tout composé ou substance dont l'administration a un effet thérapeutique ou un effet bénéfique à la santé ou condition générale d'un patient ou d'un sujet auquel il est administré. Ainsi, un principe actif pharmaceutique peut être actif contre l'insuffisance en hepcidine que l'on veut soigner par administration de la composition pharmaceutique ; peut être actif contre une condition ou un symptôme 30 associé à l'insuffisance en hepcidine (par exemple, l'accumulation de fer elle-même ou les manifestations ostéo-articulaires qui ne sont pas forcément liées à l'excès du stock en fer) ; ou peut accroître la disponibilité et/ou l'activité du ou des principes actifs de la composition pharmaceutique. Par exemple, un principe actif pharmaceutique 3025105 14 supplémentaire peut être une molécule chélatrice du fer ou bien un autre agent potentiellement inducteur de l'hepcidine qu'il soit peptidique (ex. BMP6, IL-6), chimique ou bien de toute autre nature. Les compositions pharmaceutiques sont de préférence sous des formes d'unités de 5 prise. Sous cette forme, la préparation subdivisée en doses unitaires contenant des quantités appropriées du constituant actif (acide valproïque ou un de ses dérivés). La forme d'unité de prise peut être une préparation emballée, l'emballage contenant des quantités discrètes de préparation, comme des capsules ou des comprimés emballés, des poudres dans des fioles ou des ampoules. La forme d'unité de prise peut aussi être une 10 capsule, un comprimé, un cachet ou une pastille en soi, ou peut être le nombre approprié de ceux-ci sous forme emballée. II - Utilisation de l'Acide Valproïque ou de ses Dérivés dans le Traitement des Insuffisances d'Hepcidine L'invention concerne principalement l'acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, 15 pour son utilisation dans le traitement d'une insuffisance d'hepcidine chez un sujet. De la manière utilisée ici, le terme "sujet" désigne un être humain ou un animal, en particulier un mammifère (par exemple un primate, un chien, un chat, une chèvre, un cheval, un porc, une souris, un rat, un lapin, un poisson zèbre et analogues) qui peut développer une maladie ou une condition associée à une insuffisance en hepcidine, mais 20 qui peut ou non avoir la maladie ou la condition. Dans de nombreux modes de réalisation de la présente invention, le sujet est un être humain. Dans ces modes de réalisation, le sujet est souvent appelé "individu". Le terme "individu" ne désigne pas un âge particulier, et englobe donc les enfants, les adolescents et les adultes. Le terme "patient" est plus particulièrement utilisé lorsque l'individu souffre d'une insuffisance en 25 hepcidine. Dans le contexte de la présente invention, on entend par "traitement" une méthode qui a pour but (1) de retarder ou prévenir le début d'une maladie ou d'une condition clinique ; (2) de ralentir ou d'arrêter la progression, l'aggravation ou la détérioration des symptômes de la maladie ; (3) d'apporter des améliorations des symptômes de la 30 maladie ; et/ou (4) de guérir la maladie. Un traitement peut être administré avant le début de la maladie pour une action préventive, ou il peut être administré après initiation de la maladie, pour une action thérapeutique. Il peut être réalisé en association ou non avec 3025105 15 d'autres thérapeutiques (notamment phlébotomies et médications) visant à réduire le stock en fer ou bien à corriger l'anomalie du métabolisme du fer. Une méthode de traitement selon l'invention comprend l'administration au sujet ou au patient d'une quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque (ou de l'un de 5 ses dérivés ou de leurs mélanges), ou d'une composition pharmaceutique contenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés ou l'un de leurs mélanges. L'expression "quantité thérapeutiquement efficace", telle qu'utilisée ici, désigne une quantité qui est suffisante pour atteindre le ou les objectifs prévus, comme par exemple une réponse biologique ou médicale désirée dans une cellule, un tissu, un système ou un sujet. Par 10 exemple, dans certains modes de réalisation de la présente invention, le ou les objectifs peuvent être : augmenter l'expression d'hepcidine et/ou diminuer la concentration en fer dans le plasma et/ou diminuer la surcharge en fer dans les cellules du foie, du coeur, du pancréas, de l'hypophyse, et/ou des os, et/ou prévenir ou traiter une maladie associée à une insuffisance en hepcidine. La dose sera ajustée aux besoins individuels dans chaque 15 cas particulier. Cette dose peut varier dans de larges limites en fonction de nombreux facteurs comme la gravité de la maladie à traiter, l'âge et l'état de santé général du patient, les autres médicaments avec lesquels est traité le patient, la voie et la forme d'administration, et les préférences et l'expérience du médecin traitant impliqué. Pour l'administration orale, une dose journalière entre environ 0,01 et environ 1000 mg/kg de 20 masse corporelle et par jour devrait être appropriée. Une dose journalière préférée se situe entre environ 0,1 et environ 500 mg/kg de masse corporelle, de préférence entre 0,1 et environ 100 mg/kg de masse corporelle et au mieux entre 1,0 et environ 10 mg/kg de masse corporelle par jour. Ainsi, pour l'administration à une personne de 70 kg, la posologie serait d'environ 7 mg à 0,7 g par jour. La dose journalière peut être administrée 25 sous forme d'une seule dose ou en des doses divisées, de façon typique entre 1 et 5 doses par jour, par exemple 2 à 3 prises par jour. En général, on commence le traitement avec de petites doses qui sont inférieures à la dose optimale du composé. Ensuite, on augmente la dose par petits paliers jusqu'à ce que l'on atteigne l'effet optimal pour le patient individuel. L'homme du métier sera capable, sans expérimentation exagérée et en 30 se basant sur ses connaissances personnelles, sur l'expérience et sur la description de cette demande de brevet, de déterminer une quantité thérapeutiquement efficace de l'acide valproïque, de l'un de ses dérivés, de l'un de leurs mélanges ou d'une composition 3025105 16 pharmaceutique comprenant de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés ou l'un des leurs mélanges, pour une maladie et un patient donnés. Dans certains modes de réalisation, la dose journalière d'acide valproïque ou de l'un de ses dérivés administrée au patient traité selon l'invention est plus faible que la 5 dose journalière du même principe actif administrée à un patient souffrant d'épilepsie. L'homme du métier connaît (ou sait trouver les informations concernant) les posologies moyennes des médicaments à base d'acide valproïque ou de ses sels. Par exemple, dans le cas de la DEPAKINE®, la posologie moyenne par 24 heures est de 30 mg/kg pour les nourrissons et les enfants sous forme de sirop, de solution buvable ou de granulés à 10 libération prolongée, et de 20 à 30 mg/kg pour les adolescents et les adultes sou forme de comprimés ou de granulés à libération prolongée. Comme indiqué plus haut, l'acide valproïque (ou l'un de ses dérivés, ou l'un de leurs mélanges ou encore une composition pharmaceutique comprenant l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés ou l'un de leurs mélanges) peut être utilisé pour le 15 traitement de maladies associées à une insuffisance en hepcidine. Telle qu'utilisée ici, l'expression "insuffisance en hepcidine" désigne un taux d'expression d'hepcidine qui est, en tenant compte du stock en fer de l'organisme, inférieure à la moyenne mesurée pour un sujet sain (ou un groupe de sujets sains) de même âge, de même sexe, de poids corporel sensiblement identique et présentant un 20 statut martial comparable. L'homme du métier connaît ces données ou sait comment les déterminer. Une insuffisance en hepcidine est présente (dans presque la totalité des cas) chez les patients souffrant d'une hémochromatose héréditaire. L'hémochromatose héréditaire (ou hémochromatose génétique ou primitive) est un trouble génétique du métabolisme du fer, 25 lors duquel une surcharge ferrique des cellules du foie, du pancréas, du coeur, des articulations ou d'autres organes provoque des lésions fonctionnelles et anatomiques. C'est une maladie fréquente dans sa forme liée à la mutation du gène HFE, une personne sur 200 ou 300 étant génétiquement prédisposée, mais rare dans d'autres formes, notamment celles liées aux mutations dans les gènes hémojuvéline et récepteur de la 30 transferrine. Les manifestations ostéoarticulaires de la maladie sont au premier plan tant au moment du diagnostic qu'à la phase d'état par leur retentissement sur la qualité de vie.

3025105 17 Il s'agit, d'une part, du rhumatisme hémochromatosique qui constitue une des principales plaintes des patients et, d'autre part, de l'ostéoporose qui augmente le risque fracturaire. Toutes les anémies chroniques par insuffisance de production ou par destruction excessive des globules rouges se compliquent par une suppression de la sécrétion 5 d'hepcidine résultant en une surcharge en fer, ou hémosidérose. Les maladies concernées sont diverses, certaines étant très fréquentes, tels les syndromes myélodysplasiques, les thalassémies et autres anomalies de l'hémoglobine. A elles-seules, les thalassémies affectent des millions de personnes à travers le monde surtout dans les pays méditerranéens, au Moyen-Orient et en Asie du Sud-Est.

10 Les méthodes de traitement selon l'invention peuvent donc être utilisées pour le traitement de l'hémochromatose héréditaire, y compris le rhumatisme hémochromatosique, et les anémies chroniques comme les anémies sidéroblastiques, syndromes myélodysplasiques, les thalassémies et les anémies hémolytiques. L'effet d'un traitement selon l'invention peut être évalué par dosage du fer et/ou par 15 dosage de l'hepcidine dans un échantillon biologique du patient traité. Le dosage du fer peut être effectué par n'importe quelle méthode connue dans l'art. Les méthodes de dosage du fer incluent, sans limitation, le dosage de la ferritine sérique, de l'UIBC, du fer lié à la transferrine (ou non-transferrin bound iron: NTBI) et du fer plasmique labile (ou labile plasma iron: LPI), la mesure de la concentration hépatique en fer (CHF) par biopsie 20 du foie, IRM hépatique et splénique, biomagnétométrie (SQUID), la mesure de la concentration cardiaque en fer par IRM cardiaque, l'évaluation de la répartition du fer dans le foie (hépatocytes, cellules sinusoidales, espaces vascularies, cellules biliaires) par étude histologique utilisant une coloration spécifique révélant le fer en excès. Le dosage de l'hepcidine peut être effectué par n'importe quelle méthode connue dans l'art. Les 25 méthodes de dosage de l'hepcidine incluent, sans limitation, le dosage de l'hepcidine dans le plasma ou l'urine par spectrométrie de masse (Seldi-TOF MS, MALDI-TOF MS), chromatographie liquide, ELISA ou par dosage radioimmunologique. L'homme du métier comprendra qu'une méthode selon l'invention peut être utilisée dans n'importe quelle condition clinique où une augmentation de l'expression 30 d'hepcidine est désirable.

3025105 18 III - Autres Utilisations de l'Acide Valproïque ou de ses Dérivés L'invention concerne également l'utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivées ou de l'un de leurs mélanges, pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule. L'invention concerne aussi un procédé pour augmenter l'expression d'hepcidine 5 dans une cellule, comprenant une étape de mise en contact de la cellule avec une quantité efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés, ou de l'un de leurs mélanges. Dans certains modes de réalisation, la cellule est une cellule in vitro. Par exemple, la cellule peut être une cellule hépatique provenant d'une lignée cellulaire établie, comme par exemple les lignées Huh7, Hep3b, HepG2, PLC/PRF/5, et SkHepI ou être isolée d'un 10 sujet sain ou d'un malade. Dans d'autres modes de réalisation, la cellule est une cellule in vivo, par exemple une cellule dans un animal (ex. un modèle animal). Dans ce cas, la mise en contact de la cellule avec une quantité efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés, ou de l'un de leurs mélanges se fait par administration à l'animal.

15 De telles applications peuvent notamment servir à préciser les mécanismes d'action de l'acide valproïque (ou de l'un de ses dérivés), ou bien à rechercher des effets thérapeutiques bénéfiques en association avec d'autres thérapeutiques visant à moduler le métabolisme du fer ou le stock en fer de l'organisme. A moins qu'ils ne soient définis d'une autre manière, tous les termes techniques et 20 scientifiques utilisés ici ont la même signification que celle couramment comprise par un spécialiste ordinaire du domaine auquel appartient cette invention. De même, toutes les publications, demandes de brevet, tous les brevets et toutes autres références mentionnés ici sont incorporés par référence. Les exemples suivants et les figures sont présentés pour illustrer certains modes 25 de réalisation des procédures décrites ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Exemples Les exemples suivants décrivent certains modes de réalisation de la présente invention. Cependant, il est entendu que les exemples ne sont présentés qu'à titre 30 illustratif seulement et ne limitent en aucun cas la portée de l'invention.

3025105 19 Légendes des Figures Figure 1: Modulation de l'expression de l'hepcidine par l'acide valproïque. Mise en évidence d'une augmentation de l'expression de l'ARNm endogène de l'hepcidine (HAMP) dans les cellules HepG2 lors de l'exposition à des concentrations 5 croissantes d'acide valproïque (VPA) pendant 24 heures. Figure 2: Impact de délétions successives du promoteur de l'hepcidine sur la modulation de l'activité luciférase liée au promoteur de l'hepcidine par l'acide valproïque. Des cellules de la lignée HepG2 ont été transfectées par le plasmide contenant 2762 pb d'ADN du promoteur de l'hepcidine, ou différentes délétions, placés 10 en amont du gène rapporteur de la luciférase. Les cellules ont été traitées 24 heures avec 1 mM d'acide valproïque (VPA). Les résultats représentent les fold d'activation par l'acide valproïque de chaque construction plasmidique utilisée par rapport à la condition sans acide valproïque. Figure 3: Impact de mutations du promoteur de l'hepcidine sur la modulation 15 de l'activité luciférase liée au promoteur de l'hepcidine par l'acide valproïque. Des cellules de la lignée HepG2 ont été transfectées par le plasmide contenant 2762 pb d'ADN du promoteur de l'hepcidine, sauvage ou muté dans les 2 sites de fixation des facteurs transcriptionnels SMAD, placés en amont du gène rapporteur de la luciférase. Les cellules ont été traitées 24 heures avec 1 mM d'acide valproïque (VPA). Les 20 résultats représentent les fold d'activation par l'acide valproïque de chaque construction plasmidique utilisée par rapport à la condition sans acide valproïque. Figure 4: Le valpromide induit l'expression de l'ARNm de l'hepcidine dans les cellules HepG2. Mise en évidence d'une augmentation de l'expression de l'ARNm endogène de l'hepcidine (HAMP) dans les cellules HepG2 lors de l'exposition à 1 mM de 25 valpromide pendant 24 heures. Les cultures contrôles sont entretenues en présence de DMSO utilisé pour dissoudre le valpromide. Matériels et Méthodes Cultures cellulaires. Des cellules de la lignée humaine HepG2, d'origine hepatocytaire, ont été cultivées dans du milieu essentiel minimum alpha (Invitrogen, 30 France) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (Invitrogen, France), 100UI/m1 de pénicilline, 100 lag / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine. Les cellules ont été maintenues à 37°C sous 5% de CO2.

3025105 20 Constructions plasmidiques. Un fragment de 2762 paires de bases (bp) comprenant 2708 pb du promoteur de l'hepticidine en amont du site d'initiation de la transcription et 57 pb de la zone 5'Untranslated Region (UTR) a été inséré dans le pGL4.17 (Promega, France) aux sites de restriction Kpnl-Xhol en amont du gène rapporteur de la luciférase 5 de luciole pour générer la construction plasmidique -2708Hep/Luc (Island et al., Biochem. J., 2011, 437 : 477-482). Les mutations internes des deux sites de fixation des protéines smad (Sites BMPRE pour Bone Morphogenetic Protein - Responsive Element ont été réalisées en utilisant le kit Quick change (Stratagene, France) selon les instructions du fabricant en utilisant le 10 plasmide-2708 Hep/Luc en tant que matrice et les amorces internes décrites dans le Tableau 1. Les délétions successives du promoteur de l'hepcidine ont été réalisées par amplification par PCR de la séquence contenue dans le plasmide -2708 Hep/luc à l'aide des primers du tableaul. Les différents produits de PCR obtenus ont été insérés en amont du gène codant la luciférase. Les séquences d'ADN des constructions plasmidiques ont 15 été confirmées par séquençage de l'ADN (Applied biosystems, France). Tableau 1. Amorces nucléotidiques utilisées pour réaliser les délétions dans le promoteur de l'hepcidine. Hep.Nhel.R cctcgaggctagccgtgccgtctgtctggct SEQ ID NO: 1 -1990.Hep.Kpnl.F actggccggtacccccatctgaggccatcttta SEQ ID NO: 2 -200.Hep.Kpnl.F cggggtaccaccccgtctgccccacc SEQ ID NO: 3 -70.Hep.Kpnl.F cggggtaccgcaaaggggagggggctc SEQ ID NO: 4 Transfection, dosage de la luciférase. 7x105 cellules HepG2 ont été ensemencées 20 par puits dans des plaques 12 puits. Le lendemain, 100 ng de plasmide pGL4.17- hepcidine/Luciferase ont été co-transfectés dans les cellules avec 50 ng de plasmide normalisateur pGL4.70 (Promega, France. Chaque expérience a été réalisée au moins trois fois. Les constructions plasmidiques ont été transfectées en utilisant le réactif de transfectine (Bio-Rad, France) selon les instructions du fabricant. Vingt-quatre heures 25 après la transfection, les cellules ont été traitées par 1 mM de valproate de sodium (Sigma, France). Vingt-quatre heures après ce traitement, les cellules ont été lysées et les activités luciférase ont été mesurées dans les lysats cellulaires en utilisant le système de 3025105 21 dosage Dual-GLO Luciferase Reporter (Promega, France) et un luminomètre Centro LB 960 (Berthold Technologies, France). Les valeurs de l'activité de la luciférase représentent des taux d'activité de la luciférase de luciole / l'activité luciférase du normalisateur. Le rapport d'activité luciférase de chaque construction plasmidique 5 obtenu est rapporté au rapport d'activité luciférase de la construction -2708 Hep/Luc, qui a été arbitrairement fixée à 100%. Les fold d'activation représentent le rapport des activités luciférases en condition traitée sur le rapport des activités luciférases en condition non traitée. RT-PCR quantitative. 1x106 cellules HepG2 ont été ensemencées par puits dans 10 des plaques 6 puits. 24 heures après les cellules ont été traitées par des doses croissantes de valproate de sodium (0,125 à 1mM) ou par 1mM de valpromide (Sigma, France). 24 heures après le traitement les ARN totaux ont été extraits à l'aide du système d'isolation d'ARN total SV (Promega, France). 1 1.1g d'ARN a été utilisé pour la transcription inverse en suivant le protocole du fabricant (M-MLV-RT, Promega, France). Le niveau 15 d'expression de l'ARNm de l'hepcidine a été évalué par PCR quantitative sur trois triplicats biologiques et au moins trois semaines distinctes, en utilisant le mix: qPCRMasterMixPlus SYBR® Greenl selon les instructions du fabricant (Eurogentec, France). La réaction de qRT-PCR a été exécutée sur ABI PRISM StepOne (Applied Bioscience, France). Pour chaque puits, la valeur de Ct obtenue pour l'ARNm étudié a 20 été normalisée par la valeur du Ct de l'ARNm de Hprt (hypoxanthine guanine phosphoribosyl-transférase. Les séquences des amorces utilisées pour l'amplification des ARNm sont décrites dans le Tableau 2. Tableau 2. Amorces utilisées pour réaliser les PCR quantitatives. Hepcidine F cacttccccatctgcattttc SEQ ID NO: 5 Hepcidine R gtcttgcagcacatcccaca SEQ ID NO: 6 HPRT F gctttccttggtcaggcagta SEQ ID NO: 7 HPRT R aagcttgcgaccttgaccat SEQ ID NO: 8 25 Résultats Activation de l'expression du gène de l'hepcidine par le valproate de sodium. Afin de déterminer l'effet du valproate de sodium sur l'expression du gène de 3025105 22 l'hepcidine, les cellules HepG2 ont été traitées avec des doses croissantes de valproate de sodium (0,125 à 1 mM) pendant 24 heures (Figurel). Des expériences de RT-qPCR montrent une augmentation dose-dépendante du niveau d'ARNm de l'hepcidine endogène. L'acide valproïque est donc un activateur de l'expression du gène de 5 l'hepcidine dans un modèle de cellules hépatiques. L'effet du valproate de sodium pourrait impliquer les sites BMP-RE. Pour caractériser les nucléotides du promoteur de l'hepcidine impliqués dans la réponse à l'acide valproïque, des constructions plasmidiques contenant des fragments de différentes tailles du promoteur de l'hepcidine, insérés en amont du gène rapporteur de la luciférase, 10 ont été générées. Ces plasmides sont transfectés dans les cellules HepG2, qui sont ensuite traitées avec 1 mM de valproate de sodium pendant 24 heures (Figure2). Le dosage de l'activité luciférase montre que la réponse au valproate de sodium est essentiellement médiée par les nucléotides entre les positions du promoteur -2708 et 1990 et entre -200 et -70pb d'ADN. Ces deux régions du promoteur contiennent chacune 15 un site de fixation de type BMP-RE connu pour interagir avec des facteurs de transcription Smad. En effet, il est connu que l'expression du gène de l'hepcidine est activée par la cytokine BMP6 qui lorsqu'elle se fixe sur son récepteur va induire la phosphorylation des protéines smadl, 5 et 8 qui s'associent alors avec Smad4 (Verga Falzacappa et al., J Mol 20 Med, 2008, 86: 531-541; Truksa et al., Blood, 2009, 113: 688-695; Island et al., Haematologica, 2009, 94 : 720-724; Meynard et al., Nature Genetics, 2009, 41: 478-481). Ce complexe protéique entre dans le noyau et se fixe alors sur les éléments de réponse aux BMP du promoteur de l'hepcidine (BMP-RE) pour activer sa transcription. Afin de tester si les deux sites BMP-RE sont impliqués dans la réponse à l'acide 25 valproïque, une construction plasmidique contenant le promoteur de l'hepcidine muté dans les deux sites BMP-RE, empêchant la fixation des protéines smad, est transfecté dans les cellules HepG2 qui sont alors traitées 24 heures avec 1 mM de valproate de sodium (Figure 3). On observe que la réponse au valproate de sodium est fortement inhibée lorsque les deux sites BMP-RE sont mutés. Il semble donc que l'activation de 30 l'expression du gène de l'hepcidine par le valproate de sodium nécessite, au moins en partie, la présence des sites BMP-RE.

3025105 23 Activation de l'expression du gène de l'hepcidine par le valpromide. Le valpromide est un dérivé de l'acide valproïque. Afin de déterminer si le valpromide avait également un effet sur l'expression du gène de l'hepcidine, des cellules HepG2 sont traitées par ce composant pendant 24 heures à une dose de 1 mM et les cellules contrôle 5 sont additionnées de DMSO qui est le diluant du valpromide (Figure 4) . Des expériences de RT-qPCR montrent une augmentation du niveau d'ARNm de l'hepcidine endogène par rapport au contrôle DMSO. Cependant, le DMSO est lui-même un inhibiteur de l'expression de l'hepcidine. Le valpromide est donc un activateur de l'expression du gène de l'hepcidine dans un modèle de cellules hépatiques cependant avec un effet 10 moindre que l'acide valproïque à 1 mM pendant 24 heures. 24

Claims (13)

1. REVENDICATIONS1. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation dans le traitement d'une insuffisance en hepcidine.
2. 2. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé pharmaceutiquement acceptable est choisi parmi les sels de l'acide valproïque, les esters de l'acide valproïque, les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque, les thioamides de l'acide valproïque, et les oligomères de l'acide valproïque.
3. 3. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que le dérivé est le valpromide.
4. 4. Acide valproïque, ou l'un de ses dérivés, pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'insuffisance en hepcidine est associée à une hémochromatose héréditaire ou à une anémie chronique.
5. 5. Composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés pharmaceutiquement acceptables, et au moins un véhicule ou excipient physiologiquement acceptable pour une utilisation dans le traitement d'une insuffisance en hepcidine.
6. 6. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le dérivé pharmaceutiquement acceptable est choisi parmi les sels de l'acide valproïque, les esters de l'acide valproïque, les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque, les thioamides de l'acide valproïque, et les oligomères de l'acide valproïque.
7. 7. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que le dérivé est le valpromide.
8. 8. Composition pharmaceutique pour l'utilisation selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que l'insuffisance en hepcidine est associée à une hémochromatose héréditaire ou à une anémie chronique.
9. 9. Utilisation de l'acide valproïque, ou de l'un de ses dérivés pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule in vitro. 25 3025105
10. 10. Procédé pour augmenter l'expression d'hepcidine dans une cellule in vitro comprenant la mise en contact de la cellule avec de l'acide valproïque ou l'un de ses dérivés.
11. 11. Utilisation selon la revendication 9 ou procédé selon la revendication 10, caractérisé(e) en ce que la cellule est une cellule hépatique.
12. 12. Utilisation selon la revendication 9 ou la revendication 11 ou procédé selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisé(e) en ce que le dérivé de l'acide valproïque est choisi parmi les sels de l'acide valproïque, les esters de l'acide valproïque, les thioesters de l'acide valproïque, les amides de l'acide valproïque, les thioamides de l'acide valproïque, et les oligomères de l'acide valproïque.
13. 13. Utilisation selon la revendication 9 ou la revendication 11 ou procédé selon la revendication 10 ou la revendication 11, caractérisé(e) en ce que le dérivé de l'acide valproïque est le valpromide. - 25 -