WO2016013540A1 - ヒストンを除去する吸着材及び生体由来液浄化デバイス - Google Patents

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histone
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polymer
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健太郎 桐山
覚 井上
畑中　美博
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Definitions

  • the present invention relates to an adsorbent that adsorbs histone in a biological fluid and a biological fluid purification device using the same.
  • SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome
  • Non-Patent Documents 1 and 2 More recently, research results have been disclosed that histone is very important as a pathogenic substance of SIRS (for example, see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Histone is a major protein that constitutes eukaryotic chromatin, and since it contains many basic proteins, it has a positive charge, and the deoxyribonucleic acid (DNA) chain with a negative charge derived from a phosphate group is wound about twice, and is long. It has the role of folding DNA molecules and storing them in the nucleus. Histones are classified into four types, H2A, H2B, H3, and H4, and those in which DNA is wound around histone octamers that form two octamers each bonded together are called nucleosomes. On the other hand, histones that bind to DNA between nucleosomes (linker DNA) are called linker histones, and a typical one is called histone H1.
  • histones originally have functions necessary for the living body, but in a pathological condition such as sepsis, the histone is a substance that is excessively released extracellularly to cause pathological deterioration and cause the living body to die.
  • histones are the main proteins that make up eukaryotic chromatin, and have a very important role in folding DNA molecules and storing them in the nucleus.
  • administration of a drug that inhibits histone activity may cause serious side effects on the living body. Therefore, a means for selectively removing extracellular histones that are undesirable for a living body from the body is desired.
  • histone removal by extracorporeal circulation can be considered, there is a problem that it is difficult to efficiently remove histones in a state of good biocompatibility, that is, without thrombus formation.
  • sulfated cellulose used in the adsorbent described in Patent Document 2 factor XII is activated due to its strong anionic property, and the blood coagulation cascade is activated, thereby causing thrombus formation. It is possible.
  • hydroxyapatite used in the adsorbent described in Patent Document 3 is known for its strong protein adsorptivity, and it is thought that it can adsorb and remove even useful proteins in the blood. It may be caused.
  • antithrombogenicity is essential as one of biocompatibility for medical materials used for blood purification applications.
  • the adsorbents described in Patent Documents 2 and 3 are antithrombogenic. However, it is unsuitable for blood purification use and is not considered to have biocompatibility.
  • the present inventors conducted extensive studies to provide a device for blood purification therapy that selectively adsorbs and removes histones in a biological fluid and has excellent biocompatibility. As a result, it was revealed that when the histone adsorbent has a biocompatible polymer, histones can be removed with good biocompatibility without inhibiting blood cell adhesion and without generating thrombus.
  • a device for blood purification therapy having such a histone adsorbent can be used for treatment of SIRS or the like caused by histones.
  • histones in the biological fluid can be adsorbed to the histone adsorbent with good biocompatibility, and histones can be removed from the biological fluid. Undesirable extracellular histones can be removed.
  • the present invention is a histone adsorbent and a biological fluid purification device as shown in the following (1) to (15).
  • An adsorbent that removes histone from a biological fluid comprising a water-insoluble carrier and a biocompatible polymer, wherein the carrier comprises activated carbon, polyester, polysulfone, or a cationic functional group.
  • Adsorbent that is either.
  • the adsorbent according to (1), wherein the biocompatible polymer has a cationic functional group.
  • the adsorbent according to any one of (1) and (2), wherein the shape of the carrier is a particle shape, a nonwoven fabric shape, or a hollow fiber membrane shape.
  • a biological fluid purification device that removes histone from biological fluid, the housing having a body fluid inlet and outlet, and the housing according to any one of (1) to (10) accommodated in the housing A biological fluid-purifying device comprising: an adsorbent; wherein histone is removed from the biological fluid by circulating the biological fluid in the housing.
  • a histone adsorbent and a biological fluid purification device that can suppress thrombus formation and can remove histones.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view illustrating one embodiment of a device.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view illustrating another embodiment of a device.
  • the adsorbent according to the present embodiment is an adsorbent that removes histone from a biological fluid, and includes a water-insoluble carrier and a biocompatible polymer.
  • the adsorbent carrier consists essentially of activated carbon, polyester, or polysulfone, or comprises cationic functional groups.
  • the biological fluid purification device according to the present embodiment is a biological fluid purification device for removing histones from biological fluid, and includes a housing having an inlet and an outlet for biological fluid, and a housing. A biological fluid-purifying device that removes histone from the biological fluid when the biological fluid is circulated in the housing. .
  • Water-insoluble carrier The carrier provided in the adsorbent according to the present embodiment is insoluble in water. Since the carrier is insoluble in water, it is possible to prevent the carrier from eluting into the blood when the adsorbent comes into contact with blood.
  • water-insoluble means a weight loss of 10% after the adsorbent in a dried state dried for 24 hours is immersed in pure water for 24 hours and then taken out and dried at 60 ° C. for 24 hours. It means 0 wt% or less.
  • activated carbon As materials for the carrier insoluble in water, activated carbon (simply referred to as “activated carbon”), polyester (simply referred to as “polyester”), and polysulfone (simply referred to as “polysulfone”) are used. It can be used. When activated carbon, polyester, and polysulfone are used, the productivity of industrial products tends to be excellent.
  • the material of the carrier is activated carbon, styrene divinylbenzene, polyamide, polyester, polyurethane, polysulfone, polystyrene, polyethylene, polypropylene, cellulose Polymers, cellulose acetates, poly (meth) acrylates, celluloses, cellulose acetates, polyacrylonitriles, polymethylmethacrylates, ethylene vinyl alcohol copolymers and other vinyl compound polymers, cellulose gels Any known polymer that can have a porous structure, such as dextran gel, agarose gel, polyacrylamide gel, and porous glass, can be used as long as it is insoluble in water.
  • polyester such as polyethylene terephthalate (PET), polysulfone, and styrene divinylbenzene (also simply referred to as “styrene divinylbenzene”) are used, the productivity of industrial products tends to be excellent. It is in.
  • the polyester is a polycondensate of polyvalent carboxylic acid (dicarboxylic acid) and polyalcohol (diol).
  • polyvalent carboxylic acid dicarboxylic acid
  • diol polyalcohol
  • PET polybutylene terephthalate
  • PBT polytrimethylene terephthalate
  • polyethylene naphthalate polyethylene naphthalate.
  • PET and PBT are particularly preferable from the viewpoint of productivity of industrial products.
  • the polysulfone-based polymer refers to a polyaryl ether sulfone polymer characterized by a structure including a repeating unit represented by the following chemical formula (1).
  • a polymer composed of a repeating unit represented by the following chemical formula (1) and a polymer composed of a repeating unit represented by the following chemical formula (2) are exemplified as polysulfone.
  • the styrene divinylbenzene system is a copolymer obtained by mixing and copolymerizing styrene and divinylbenzene, and is a styrene divinylbenzene copolymer having a styrene skeleton crosslinked by divinylbenzene.
  • polymers composed of repeating units represented by the following chemical formulas (3) and (4) are exemplified as styrenedivinylbenzene.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and may be any of a particle shape, a hollow fiber shape, a nonwoven fabric shape, a fiber shape, a sheet shape, and a sponge shape.
  • the particulate carrier tends to have a good contact surface area with the biological fluid.
  • the material for the particulate carrier all of the above carriers can be used, but activated carbon and styrene divinylbenzene beads are easy to control the pore size and surface area, and are resistant to sterilization when used as a medical device. Tend to ensure safety such as safety.
  • the material for the non-woven carrier all of the above carriers can be used.
  • the PET non-woven fabric and the PBT non-woven fabric are easy to ensure safety such as sterilization resistance when used as a medical device. As a result, productivity and the like tend to be good.
  • the material for the hollow fiber carrier all of the above carriers can be used.
  • the polysulfone, ethylene vinyl alcohol copolymer, and polymethyl methacrylate polymer are resistant to sterilization when used as a medical device. It is easy to ensure safety, etc., and the productivity as industrial products tends to be good.
  • the particulate carrier preferably has an average particle size of 50 to 1500 ⁇ m in consideration of its specific surface area and the flowability of the biological fluid, and more preferably 100 to 1000 ⁇ m for the purpose of allowing whole blood to pass through.
  • the particle diameter means the length of the longest straight line among straight lines connecting any two points on the outline of the carrier when observed with a microscope.
  • the average particle diameter means an arithmetic average value of the particle diameters of 100 particulate carriers selected at random.
  • the surface area is preferably at least 1 m 2 / g of the particle carrier, or 5 m 2 / g is particularly preferred.
  • the surface area of the carrier can be measured after removing the coat polymer from the adsorbent, as will be described later.
  • the surface area of the adsorbent was calculated using a BET (JIS Z 8830; method for measuring the specific surface area of powder (solid) by gas adsorption) analysis method after measuring the nitrogen adsorption isotherm at liquid nitrogen temperature (77K). Point to.
  • BET JIS Z 8830; method for measuring the specific surface area of powder (solid) by gas adsorption) analysis method after measuring the nitrogen adsorption isotherm at liquid nitrogen temperature (77K). Point to.
  • the inner diameter of the hollow fiber is preferably 10 to 1000 ⁇ m, more preferably 100 to 300 ⁇ m, from the viewpoint of flowing blood inside the hollow fiber.
  • the hollow fiber inner diameter is an average diameter measured from a photograph obtained by sampling a part of the hollow fiber constituting the filter carrier and observing it with an electron microscope.
  • the average fiber diameter can be 0.3 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably 0.3 ⁇ m to 3 ⁇ m, and more preferably 0.5 ⁇ m to 1.8 ⁇ m. .
  • the average fiber diameter is 0.3 ⁇ m or more, the pressure loss when the blood is filtered tends to be moderate, and red blood cells tend not to be hemolyzed.
  • the average fiber diameter is an average diameter measured from a photograph obtained by sampling a part from a nonwoven fabric or a woven fabric constituting the filter carrier and observing with an electron microscope.
  • Examples of these carriers include Diaion (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), Asahi Kasei Microcarrier (Asahi Kasei Co., Ltd.), CM-Cellulofine (registered trademark).
  • Cellulose-based carriers such as CH (exclusion limit protein molecular weight: about 3 ⁇ 10 6, sold by Seikagaku Corporation), a completely porous activated gel described in JP-B-1-44725, and CM-Toyopearl (registered trademark)
  • Polyvinyl alcohol carrier such as 650C (exclusion limit protein molecular weight: 5 ⁇ 106, manufactured by Tosoh Corporation), CM-Trisacryl M (exclusion limit protein molecular weight: 1 ⁇ 107, Pharmacia-LKB, Sweden) (Manufactured by Pharmacia-LKB)] and other polyacrylamide carriers, Sepharose CL-4B (Seph arose CL-4B) [exclusion limit protein molecular weight: 2 ⁇ 107, manufactured by
  • hollow fiber carriers examples include APS (manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), KF-C (manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), Trelite NV (manufactured by Toray Industries, Inc.), YHF (manufactured by Yuasa Membrane System Co., Ltd.), And Stella Pore (manufactured by Mitsubishi Rayon Aqua Solutions Co., Ltd.).
  • APS manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.
  • KF-C manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.
  • Trelite NV manufactured by Toray Industries, Inc.
  • YHF manufactured by Yuasa Membrane System Co., Ltd.
  • And Stella Pore manufactured by Mitsubishi Rayon Aqua Solutions Co., Ltd.
  • non-woven carriers examples include Sepacel (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), Benise (Asahi Kasei Fibers Co., Ltd.), Ertas (Asahi Kasei Fibers Co., Ltd.), Microweb (Asahi Kasei Fibers Co., Ltd.), and Axter (Toray Industries, Inc.) Clarex (manufactured by Kuraray Co., Ltd.), Delpore (manufactured by Sanki Co., Ltd.), and Shyfine (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • the adsorbent surface has biocompatibility so as not to cause unnecessary reactions in the blood as much as possible.
  • the adsorbent preferably has a biocompatible polymer coating layer.
  • the biocompatibility means a state where blood does not recognize the adsorbent as a foreign substance, for example.
  • the adsorbent of this embodiment has a carrier and a biocompatible polymer.
  • the “biocompatible polymer” in the present embodiment refers to a polymer that improves the biocompatibility of the adsorbent by being present on the surface of the adsorbent carrier. More specifically, the anti-thrombosis of the carrier can be compared to the carrier before the biocompatible polymer is applied by physically coating or chemically bonding the biocompatible polymer to the carrier of the adsorbent. It refers to a polymer with improved properties.
  • Whether or not at least a part of the polymer contained in the adsorbent is a biocompatible polymer can be evaluated by the following procedure.
  • the contained polymer is dissolved in a suitable solvent such as dimethyl sulfoxide.
  • a suitable solvent such as dimethyl sulfoxide.
  • the polymer is removed from the adsorbent, and the obtained carrier is dried in a dryer at 60 ° C. for 1 hour or longer, and then left in a desiccator for 1 hour or longer. Thereafter, the antithrombogenicity of the carrier from which the polymer has been removed from the adsorbent is measured.
  • Antithrombogenicity of adsorbent is a biocompatible polymer.
  • the antithrombogenicity is measured by observing the surface of the adsorbent with the naked eye or a scanning electron microscope, and directly counting the number of platelets adhering to the adsorbent surface, or adhering to the adsorbent surface. It can be evaluated by a method of measuring LDH activity of blood cells.
  • the polymer contained in the adsorbent is a biocompatible polymer.
  • the polymer contained in the adsorbent is identified by conducting proton nuclear magnetic resonance ( 1 H-NMR) measurement after dissolving the polymer contained in the adsorbent in an appropriate solvent such as dimethyl sulfoxide.
  • 1 H-NMR proton nuclear magnetic resonance
  • a polymer that corresponds to the biocompatible polymer exemplified later it can also be determined as a biocompatible polymer.
  • the method for identifying a polymer is not limited to 1 H-NMR, and all known identification methods can be used.
  • the adsorbent is immersed in a strong acid and / or strong alkali for a certain time to remove the polymer. Whether the biocompatible polymer has been removed from the surface of the adsorbent can be confirmed by measuring the contact angle before and after the treatment, or by performing surface analysis such as X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). it can.
  • XPS X-ray photoelectron spectroscopy
  • the polymer contained in the adsorbent is a biocompatible polymer.
  • composition of the polymer can be estimated by comprehensively judging the results of XPS, time-of-flight mass spectrometer (TOF-SIMS), etc., but the measurement method is not limited to this.
  • the adsorbent according to the present embodiment does not have a histone adsorptivity originally, as long as the adsorbent according to the present embodiment has a histone adsorbability after imparting a biocompatible polymer.
  • those that express histone adsorption ability by adding a biocompatible polymer are also included.
  • a method for producing an adsorbent containing a biocompatible polymer a known technique such as a method of imparting a biocompatible polymer to the surface of a carrier can be used.
  • biocompatible polymers include monomers having a polyalkylene glycol chain, a polymer or graft copolymer, ethylene-vinyl alcohol, polyester, poly-2-methoxyethyl acrylate (p-MEA), and poly- Examples include 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (PMPC) and polyvinylpyrrolidone (PVP).
  • PMPC 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the HEMA system refers to a polymer containing HEMA in the polymer component, and any other component can be used as the other component.
  • the biocompatible polymer contains 10 mol% or more of dimethylaminoethyl methacrylate as a monomer unit containing a basic nitrogen-containing moiety, the histone removal rate tends to increase.
  • the biocompatible polymer preferably has a cationic functional group. The cationic functional group will be described later.
  • Biocompatible polymer amount The amount of polymer contained in the adsorbent is calculated by the following procedure.
  • the carrier before supporting the biocompatible polymer is dried in a drier set at 60 ° C. for 1 hour or longer, then left in a desiccator for 1 hour or longer, and the weight is measured.
  • the carrier carrying the biocompatible polymer was dried in a dryer at 60 ° C. for 1 hour or longer and left in the desiccator for 1 hour or longer, the weight was measured.
  • the unit of A and B is gram.
  • the amount of polymer can also be calculated by the following procedure.
  • the adsorbent is dried in a drier set at 60 ° C. for 1 hour or longer, then left in a desiccator for 1 hour or longer, and then the weight is measured.
  • a suitable solvent such as dimethyl sulfoxide
  • Is D The unit of C and D is gram.
  • the molar ratio of each monomer unit contained in the biocompatible polymer containing multiple components is the peak of 1 H-NMR obtained after 1 H-NMR measurement after dissolving the coating polymer in an appropriate solvent such as dimethyl sulfoxide. It can be calculated from the ratio.
  • Antithrombotic Antithrombogenicity can be examined by observing the surface of the adsorbent with the naked eye or a scanning electron microscope (SEM), and directly counting the number of platelets adhering to the adsorbent surface, or quantifying it by image analysis. .
  • SEM scanning electron microscope
  • antithrombogenicity can be evaluated by the following procedure. First, a healthy person's blood is circulated for a certain period of time using a peristaltic pump to a device including an adsorbent filled with physiological saline. Thereafter, the blood inside the device containing the adsorbent is washed with physiological saline, the device is disassembled, and the internal adsorbent is taken out. The adsorbent taken out is freeze-dried, and an SEM sample obtained by vapor deposition by ion sputtering is observed to evaluate antithrombogenicity.
  • the antithrombogenicity can be measured using the amount of platelets adhering to the adsorbent surface as an index, for example, adhering to the adsorbent after contacting PRP (platelet-rich plasma) with the material for a certain period of time in vitro.
  • PRP platelet-rich plasma
  • the obtained platelets are treated with a surfactant, and the platelet lactate dehydrogenase (LDH) activity is measured. This is because there is a strong correlation between the number of platelets adhering to the material and the LDH activity, so that the number of adhering platelets can be measured by the LDH activity.
  • the whole blood and the adsorbent are brought into contact with each other for a certain period of time, and then washed with a buffer such as physiological saline or PBS to remove red blood cell components and By treating the components other than the remaining red blood cells (mainly platelet and white blood cell components) with a surfactant, the eluted LDH activity can be measured, and the antithrombogenicity of the adsorbent can be measured.
  • a buffer such as physiological saline or PBS
  • mini-module refers to a small-scale module created on a scale such as 1/200 of the actual product in order to evaluate the adsorbent with a small blood volume.
  • a 5 mL capacity laboratory column (Mobitech) filled with an adsorbent can be used.
  • LDH produces lactic acid when pyruvic acid is used as a substrate in the presence of ⁇ -Nicotinamide adenine reduced reduced form ( ⁇ -NADH)
  • ⁇ -NADH ⁇ -Nicotinamide adenine reduced reduced form
  • mini-module means using a column or the like prepared by adhering both ends with an epoxy adhesive so that a hollow fiber adsorbent has an effective length of 15 cm and an inner surface area of 50 mm 2. it can. 2) Pass physiological saline through the mini-module and wash it. 3) After passing human blood with heparin added to the mini-module, it is washed with physiological saline. 4) The hollow fiber adsorbent is taken out from the washed minimodule, and LDH is eluted from platelets in a Triton-X100 solution as a surfactant.
  • the adsorbent preferably has a cationic functional group on the surface.
  • the carrier material may have a cationic functional group
  • the biocompatible polymer may have a cationic functional group.
  • the cationic functional group introduced on the surface of the carrier include functional groups such as a primary amino group, a secondary amino group, a tertiary amino group, an imino group, and a quaternary ammonium group. An ammonium group is used.
  • the secondary amino group, the tertiary amino group, and the quaternary amino group are also referred to as a monoalkyl-substituted amino group, a dialkyl-substituted amino group, and a trialkyl-substituted amino group, respectively.
  • the adsorbent surface may be rendered cationic by coating the carrier with a polymer containing the above cationic functional group.
  • a carrier coated with a biocompatible polymer may be further coated with a polymer for introducing a cationic functional group, or a carrier coated with a polymer for introducing a cationic functional group may be further coated with a biocompatible polymer. May be coated. However, if it is coated in stages, it is possible that the coating polymer in one step will elute during the second coating, so coat the polymer with both biocompatibility and cationic functional group properties. Is preferred.
  • amino group examples include aminohexane, monomethylaminohexane, aminooctane, aminododecane, aminodiphenylmethane, 1- (3-aminopropyl) imidazole, 3-amino-1-propene, aminopyridine, aminobenzenesulfonic acid, tris (2-aminoethyl) amine, dimethylamine or diaminoethane, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, dipropylenetriamine, polyethyleneimine, N-methyl-2,2′-diaminodiethylamine, N-acetylethylenediamine, and Examples include amino groups derived from compounds such as 1,2-bis (2-aminoethoxyethane), and any amino group can be used.
  • the quaternary ammonium group is a positively charged substituent represented as NR 4 +, and examples thereof include groups represented by the following chemical formulas (5) and (6).
  • exchange capacity and zeta potential As one of the indicators showing the cationic strength, exchange capacity is used.
  • the exchange capacity of the adsorbent having a cationic functional group is preferably 0.05 mEq or more, more preferably 0.5 mEq or more per mL of the water-insoluble carrier, from the viewpoint of obtaining high adsorption performance.
  • a zeta potential can also be suitably used as a cationic evaluation index. When the zeta potential is used as an evaluation index, it may be 0 mV or more.
  • the exchange capacity can be measured by the following procedure. First, the adsorbent is weighed, transferred to a filter tube with demineralized water, 1 mol / L-NaOH and demineralized water are sequentially flowed through the filter tube, the resin is regenerated and washed, and then 5% NaCl is flowed. Receive the solution in a 200 mL volumetric flask and make a constant volume. This can be determined by titrating with 0.1 mol / L-HCl using a methyl red / methylene blue mixed indicator, but the measurement method is not limited to this.
  • the method of measuring the zeta potential on the surface of the adsorbent can be measured, for example, by the streaming potential measurement method, which is a method of filling a solid sample such as powder or fiber between a pair of streaming potential measurement electrodes.
  • the zeta potential is obtained by measuring the potential difference generated between the electrodes when the fluid is permeated through the packed bed, that is, the streaming potential, but the measuring method is not limited to this.
  • Histone Histone is a DNA-binding protein present in a biological fluid, and includes histone H1, histone H2A, histone H2B, histone H3, and histone H4. It is preferable that histone H3 and histone H4 are removed from the inside.
  • the biological fluid includes all liquids derived from biological materials or liquids containing biological components, and specifically includes body fluids such as blood, plasma, serum, and ascites, cell culture fluid, and the like.
  • adsorbent of the present invention Various forms of contact between the biological fluid and the adsorbent of the present invention can be considered.
  • a method of adsorbing blood or ascites collected from a patient's blood in a blood bag filled with the adsorbent of the present invention, and adsorbing histones in the patient's blood or ascites, or blood in a device filled with the adsorbent of the present invention And a method of circulating the gas.
  • the processed blood can be returned to the patient or stored in a blood bag or the like as needed.
  • the collected culture solution is placed in a bag filled with the adsorbent of the present invention, in which the histone in the culture solution is adsorbed, and the adsorbent of the present invention is filled. And a method of circulating a culture solution through the device.
  • the culture solution may be processed after the cells are separated.
  • the treated culture solution can be used again for cell culture.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view illustrating one embodiment of a device.
  • the device 100 is a module connected to, for example, an extracorporeal blood circuit.
  • a cap 150 having an inlet port 140 is screw-fitted into an opening at one end of the cylinder 110 via a packing 130 with a filter 120 on the inside, and a filter 120 ′ is stretched on the inside at the other end opening of the cylinder 110.
  • a cap 170 having an outlet port 160 is screwed through 130 'to form a container.
  • the histone adsorbent layer 180 is formed by filling and holding the adsorbent in the gap between the filters 120 and 120 ′.
  • the histone adsorbent layer 180 may be filled with the adsorbent according to the present embodiment alone, or may be mixed or laminated with other adsorbents.
  • adsorbents for example, adsorbents of other malignant substances such as cytokines, adsorbents having a wide range of adsorption ability, and the like can be used. As a result, a wide range of clinical effects due to the synergistic effect of the adsorbent can be expected.
  • the volume of the histone adsorption carrier layer 180 can be 5 mL to 3000 mL, but is preferably 50 mL to 1000 mL, more preferably 100 mL to 500 mL, from the viewpoint of histone adsorption capacity and extracorporeal blood volume during extracorporeal circulation of blood.
  • the module connected to the blood extracorporeal circuit is disposed in the blood extracorporeal circuit so as to come into contact with the biological fluid to be treated, and can be used for the treatment of systemic inflammatory diseases and the like.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing another embodiment of the device.
  • the device 200 is a module connected to, for example, a blood extracorporeal circuit.
  • Hollow fiber adsorbents 220 are held by potting agents 230 at both ends of the cylinder 210. Both end faces of the hollow fiber-shaped adsorbent 220 are open.
  • a cap 250 having an inlet port 240 and a cap 250 ′ having an outlet port 260 are fitted into the cylinder 210 to fill and hold the hollow-fiber adsorbent 220.
  • a dialysate inlet 270 and a dialysate outlet 280 are provided on the side surface of the cylinder 210.
  • blood derived from the body of the treatment target is introduced from the inlet port 240, passed through the hollow fiber-like adsorbent 220, and passed through the outlet port 260 through the body of the treatment target.
  • the blood purification method by extracorporeal blood circulation can be performed by returning to the state.
  • dialysis is performed during extracorporeal blood circulation by introducing the dialysate from the dialysate inlet 270, leading out the dialysate from the dialysate outlet 280, and circulating the dialysate in the device 200. Can do.
  • dialysate may not be circulated, and the dialysate inlet 270 and the dialysate outlet 280 may be opened. In this case, blood is filtered. Further, by blocking the dialysate inlet 270 and the dialysate outlet 280 with a stopper or the like, it is possible to suppress blood filtration and perform a blood purification method by extracorporeal blood circulation.
  • the adsorbent and the device according to the present embodiment described above can be effectively used for suppressing or treating systemic inflammation in a disease mediated by histones.
  • Specific diseases include sepsis, septic shock, disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), toxin shock syndrome, ischemia reperfusion disorder, adult respiratory distress syndrome (ARDS), Paget's disease, osteoporosis, multiple bone marrow Tumor, acute and chronic myeloid leukemia, pancreatic beta cell destruction, inflammatory bowel disease, psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, anaphylaxis, contact dermatitis, asthma, myopathies, cachexia, Reiter syndrome, I Type II diabetes, bone resorption, graft-versus-host reaction, atherosclerosis, brain trauma, multiple sclerosis, cerebral malaria, fever, and muscle pain due to infection.
  • DIC disseminated intravascular coagulation syndrome
  • ischemia reperfusion disorder ischemia reperfusion disorder
  • Method of treatment As a treatment method using the adsorbent and the biological fluid purification device according to the present embodiment, for example, the biological fluid purification device of the present invention and the patient are connected by a blood circuit, and blood taken out from the patient is treated according to the present invention.
  • the systemic inflammatory response syndrome can be treated by passing it through a biological fluid purification device, reducing the histone content in the blood, and returning it to the patient.
  • the separated plasma is passed through the biological fluid purification device of the present invention to reduce the histone content from the plasma.
  • the systemic inflammatory response syndrome can be treated.
  • adsorbent and device according to the present embodiment described above may be used in combination with other body fluid treatment methods and medical devices.
  • Other bodily fluid treatment methods and medical devices include, for example, continuous slow blood filtration (CRRT), plasma exchange, peritoneal dialysis, plasma separator, hemofilter, heart-lung machine, and ECMO.
  • CRRT continuous slow blood filtration
  • plasma exchange plasma exchange
  • peritoneal dialysis plasma separator
  • hemofilter hemofilter
  • heart-lung machine and ECMO
  • the adsorbent and the device according to the present embodiment described above are suitably used in a processing method for allowing a biological fluid containing histone to pass therethrough and obtaining a biological fluid with reduced histone content discharged from the device outlet. be able to.
  • Histone adsorption rate (%) (C 0 ⁇ C) / C 0 ⁇ 100
  • C 0 histone concentration in the solution before treatment
  • C histone concentration in the solution after treatment
  • lipopolysaccharide (LPS) derived from Escherichia coli is added to blood collected from a healthy volunteer.
  • LPS lipopolysaccharide
  • PP polypropylene
  • E As a method of contacting with a full module of the same scale as the product, E. Examples thereof include a method in which a lipopolysaccharide derived from E. coli is added and blood shaken using a shaker is circulated using a peristaltic pump to a device as shown in FIG. 1 filled with an adsorbent. At this time, in order to reduce the amount of blood used, it is preferable to reduce the capacity of the entire circulation circuit including the device.
  • Example 1 Ultrafiltration (UF) water is added to a strongly basic anion exchange resin having a trimethylammonium group (diaion; manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) containing a styrenedivinylbenzene copolymer, heated to 95 ° C., 22 Washed with hot water for more than an hour.
  • a coating solution of p-HEMA as a biocompatible polymer dissolved in ethanol so that the polymer concentration is 0.75% is immersed in a strongly basic anion exchange resin for 4 hours to perform primary coating. It was.
  • the primary coating strongly basic anion exchange resin cooled by air blowing was subjected to a secondary coating with a p-HEMA coating solution in the same procedure as the primary coating.
  • the strongly coated basic anion exchange resin subjected to the secondary coating was cooled by blowing to obtain an adsorbent A.
  • Escherichia coli 0127 B8-derived lipopolysaccharide (LPS) (manufactured by Sigma-Aldrich) was added to blood collected from healthy volunteers to a concentration of 0.1 ⁇ g / ml, and the mixture was shaken for 24 hours. Shake at 39 ° C. Thereafter, the mixture was centrifuged at 2000 g for 10 minutes using a centrifuge, and the supernatant was obtained as a plasma sample. 3 ml of the obtained plasma sample and 0.5 ml of the adsorbent A were mixed in a polypropylene (PP) tube and shaken at 39 ° C. for 1 hour using a shaker. The PP tube after shaking was centrifuged at 2000 g for 1 minute using a centrifuge, and the supernatant was obtained as a plasma sample after contacting the carrier.
  • PP polypropylene
  • Histone H3 removal performance evaluation The histone H3 adsorption rate of the adsorbent A was calculated using the obtained plasma sample after contact with the carrier.
  • Histone H3 adsorption rate (%) A adsorbent pretreatment histone H3 concentration C 0, the histone H3 concentration after the adsorbent treated as C A, it shows the histone H3 adsorption calculating equation below.
  • the same histone H3 adsorption rate calculation formula was used.
  • the concentration of histone H3 was measured using EpiQuik (registered trademark) Total Histone H3 Quantification Kit (manufactured by EPIENTEK). The results are shown in Table 1.
  • Antithrombogenicity was determined using the amount of blood cells adhering to the adsorption carrier surface as an index. Specifically, the blood of a healthy person obtained by adding heparin to a final concentration of 1 IU / ml is added to 0.5 ml of a resin moistened with physiological saline, and then at 37 ° C. for 30 minutes. Then, the adsorbent was separated, washed with physiological saline, and then visually observed. The results are shown in Table 1.
  • Example 2 (Synthesis of biocompatible polymers) Ethanol was used as a polymerization solvent, and an ethanol solution in which a polymerizable monomer and a diazo initiator were dissolved was dropped while stirring at 78 ° C. in a nitrogen atmosphere to carry out polymerization.
  • the charge of each polymerizable monomer was as follows: methyl methacrylate (hereinafter abbreviated as “MMA”) 25 mol% as a hydrophobic polymerizable monomer, and dimethylaminoethyl methacrylate (hereinafter “DM”) as a polymerizable monomer containing a basic nitrogen-containing moiety.
  • MMA methyl methacrylate
  • DM dimethylaminoethyl methacrylate
  • HEMA 2-hydroxyethyl methacrylate
  • the polymerization solution was purified with excess water and dried under reduced pressure to obtain a synthetic polymer A.
  • UF water was added to a strongly basic anion exchange resin (Diaion; manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), heated to 95 ° C., and washed with hot water for 22 hours or more.
  • the synthetic polymer A coating solution was immersed in a strongly basic anion exchange resin for 4 hours to perform primary coating.
  • Example 3 (Synthesis of biocompatible polymers) Polymerization, purification and drying were carried out under the same conditions as in Example 2 with the charge ratio of each polymerization monomer being 3 mol% DM and 97 mol% HEMA, and a synthetic polymer B was obtained.
  • UF water was added to a strongly basic anion exchange resin (Diaion; manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), heated to 95 ° C., and washed with hot water for 22 hours or more.
  • the synthetic polymer B coating solution was immersed in a strongly basic anion exchange resin for 4 hours to perform primary coating. Then, hot air drying was performed overnight at 70 ° C., and hot air heating crosslinking was performed at 120 ° C.
  • Example 4 (Adsorbent preparation and evaluation) The beaded activated carbon (manufactured by Kureha Co., Ltd.) was washed with 0.1N hydrochloric acid, further washed with UF water, and then washed with warm water at 60 to 65 ° C. for 40 hours or more. Next, a p-HEMA coating solution dissolved in ethanol so that the polymer concentration was 0.75% was immersed in beaded activated carbon for 4 hours to perform primary coating. Then, hot air drying was performed overnight at 70 ° C., and hot air heating crosslinking was performed at 120 ° C. for 2 hours.
  • Example 5 (Adsorbent preparation and evaluation)
  • the beaded activated carbon (manufactured by Kureha Co., Ltd.) was washed with 0.1N hydrochloric acid, further washed with UF water, and then washed with warm water at 60 to 65 ° C. for 40 hours or more.
  • the synthetic polymer A coating solution was immersed in beaded activated carbon for 4 hours to perform primary coating.
  • hot air drying was performed overnight at 70 ° C., and hot air heating crosslinking was performed at 120 ° C. for 2 hours.
  • the secondary coating of the synthetic polymer A coating solution was performed on the primary coating bead-like activated carbon cooled by air blowing in the same procedure as the primary coating.
  • the secondary coated bead-shaped activated carbon was blown and cooled to obtain an adsorbent E.
  • Table 1 shows the results of an adsorption experiment similar to that of Example 1 using this adsorbent E.
  • Example 6> (Adsorbent preparation and evaluation)
  • the beaded activated carbon (manufactured by Kureha Co., Ltd.) was washed with 0.1N hydrochloric acid, further washed with UF water, and then washed with warm water at 60 to 65 ° C. for 40 hours or more.
  • the synthetic polymer B coating solution was immersed in beaded activated carbon for 4 hours to perform primary coating.
  • hot air drying was performed overnight at 70 ° C., and hot air heating crosslinking was performed at 120 ° C. for 2 hours.
  • the secondary coating of the synthetic polymer B coating solution was performed on the primary coating bead-like activated carbon cooled by blowing air in the same procedure as the primary coating.
  • the secondary coated bead-shaped activated carbon was blown and cooled to obtain an adsorbent F.
  • Table 1 shows the results of an adsorption experiment similar to Example 1 performed using this adsorbent F.
  • Example 7 (Adsorbent preparation and evaluation) The synthetic polymer A was coated on a PET non-woven fabric having an average fiber diameter of 1.3 ⁇ m as a material to obtain an adsorbent G. Table 1 shows the results of the same adsorption test as in Example 1 using the adsorbent G.
  • Example 8> Synthesis of biocompatible polymers
  • Polymerization, purification, and drying were carried out under the same conditions as in Example 2 with MMA 30 mol%, DM 10 mol%, and HEMA 60 mol% as the charge ratio of each polymerization monomer, to obtain a synthetic polymer C.
  • the synthetic polymer C was coated on a non-woven fabric made of polyethylene terephthalate (PET) as a raw material to obtain an adsorbent H.
  • PET polyethylene terephthalate
  • Table 1 shows the results of the same adsorption test as in Example 1 using the adsorbent H.
  • Example 9 (Adsorbent preparation and evaluation)
  • the synthetic polymer B was coated on a nonwoven fabric made of polyethylene terephthalate (PET) as a raw material to obtain an adsorbent I.
  • PET polyethylene terephthalate
  • Table 1 shows the results of the same adsorption test as in Example 1 using the adsorbent I.
  • Table 1 shows the results of an adsorption test using the same adsorption carrier L as in Example 1 except that the same strongly basic anion exchange resin as in Example 1 was not coated with P-HEMA.
  • Table 1 shows the results of an adsorption test using the same adsorption carrier M as in Example 4 except that the same beaded activated carbon as in Example 4 was not coated with P-HEMA.
  • Table 1 shows the results of the adsorption test using the same adsorption carrier N as in Example 7 except that the same PET non-woven fabric as in Example 7 was not coated with the synthetic polymer A solution.
  • Example 10> (Production and evaluation of hollow fiber adsorbent) A hollow fiber membrane made of polysulfone and polyvinylpyrrolidone with an effective length of 17 cm and an inner surface area of 100 mm 2 (100 filaments because a hollow fiber membrane with an inner diameter of 185 ⁇ m was used) was prepared by bonding both ends with an epoxy adhesive. did.
  • the synthetic polymer A was circulated from the blood inlet port of this device at 5 [mL / min] for 20 seconds, and the inner surface of the hollow fiber was coated with the synthetic polymer A to produce a device including the adsorbent J.
  • Escherichia coli 0127 B8-derived lipopolysaccharide (LPS) (manufactured by Sigma-Aldrich) was added to blood collected from healthy volunteers at a concentration of 0.1 ⁇ g / ml, and the mixture was shaken for 24 hours. And shaken at 39 ° C. Thereafter, the mixture was centrifuged at 2000 g for 10 minutes using a centrifuge, and the supernatant was obtained as a plasma sample. 10 ml of the obtained plasma sample was circulated through the device containing the adsorbent J at a flow rate of 1.2 ml / min for 60 minutes at 39 ° C. using a peristaltic pump. Thereafter, the circulated plasma was obtained as a plasma sample after contacting the carrier.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the histone H3 adsorption rate (%) is A H
  • the histone H3 concentration after treatment with the uncoated hollow fiber is C H0
  • the histone H3 concentration after treatment with the coated hollow fiber is C HA and the histone H3 adsorption rate is calculated.
  • the formula is shown below. In the following Example 11 and Comparative Examples 4 and 5, the same histone H3 adsorption rate calculation formula was used.
  • the concentration of histone H3 was measured using EpiQuik (registered trademark) Total Histone H3 Quantification Kit (manufactured by EPIENTEK). The results are shown in Table 2.
  • Antithrombogenicity was determined by the amount of blood cells attached to the hollow fiber carrier surface as an index.
  • a peristaltic pump is used for a device including the adsorbent J in a state in which the blood of a healthy person obtained by adding heparin to a final concentration of 1 IU / ml is filled with physiological saline. Circulate at 37 ° C. for 60 minutes at a flow rate of 1.2 ml / min, then wash the blood inside the hollow fiber with physiological saline, disassemble the device, take out the hollow fiber inside and remove it to 2.5% glutaraldehyde It was immersed and blood cells were immobilized.
  • the hollow fibers were sequentially immersed in 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ethanol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), dehydrated, and then t- It was immersed in butyl alcohol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries). After sufficiently removing t-butyl alcohol from the hollow fiber, it was frozen and lyophilized overnight. After this hollow fiber was sliced diagonally, vapor deposition by ion sputtering was performed to obtain a hollow fiber SEM sample. Thereafter, SEM observation was performed to evaluate blood cell adhesion. The results are shown in Table 2.
  • Example 11 A hollow fiber membrane made of polysulfone and polyvinylpyrrolidone with an effective length of 17 cm and an inner surface area of 100 mm 2 (100 filaments because a hollow fiber membrane with an inner diameter of 185 ⁇ m was used) was prepared by bonding both ends with an epoxy adhesive. did.
  • the synthetic polymer B was circulated from the blood inlet port of this device, and the inner surface of the hollow fiber was coated with the synthetic polymer B to produce a device including the adsorbent K.
  • Table 2 shows the results of an adsorption test using a device including the adsorbent K.
  • the device containing the adsorbents J and K coated with the biocompatible polymer on the carrier surface removed histone H3 with good antithrombotic properties.
  • a device including the adsorbent O that is not coated with a biocompatible polymer has a lot of blood cell adhesion (low antithrombogenicity), and does not satisfy the minimum biocompatibility to be satisfied as a histone removal device.
  • the device including the adsorbent P coated with PVP having no cationic functional group has high antithrombogenicity but does not adsorb histones.
  • Example 12 Water-based histone H4 adsorption test
  • 0.2 mL of a solution in which a standard product (histone H4 (initial concentration: 50 ⁇ g / mL) attached to EpiQuik (registered trademark) Total Histone H4 Quantification Kit (manufactured by EPIENTEK) was added to physiological saline was added to a PP tube.
  • 0.1 mL of adsorbent A was added thereto, and the mixture was shaken using a shaker for 1 hour at 39 ° C. After the shake, the PP tube was 1 at 2000 g using a centrifuge. The supernatant was obtained as a plasma sample after contacting the carrier.
  • the histone H4 adsorption rate of the adsorbent A was calculated using the obtained plasma sample after contact with the carrier.
  • the histone H4 adsorption rate (%) is A 4
  • the histone H3 concentration before adsorbent treatment is C 40
  • the histone H3 concentration after adsorbent treatment is C 4A
  • the histone H4 adsorption rate calculation formula is shown below.
  • the same histone H4 adsorption rate calculation formula was used.
  • the concentration of histone H4 was measured using EpiQuik (registered trademark) Total Histone H4 Quantification Kit (manufactured by EPIENTEK). The results are shown in Table 3.
  • Table 3 shows the results of the same adsorption test as in Example 12 using the adsorbent D.
  • Table 3 shows the results of the same adsorption test as in Example 12 using the adsorbent G.
  • the adsorbent and the biological fluid purification device can remove histone H3 from the biological fluid with good biocompatibility, and can be used for treatment of diseases that develop or worsen due to histones typified by SIRS. Useful.
  • This biological fluid purification device can be used to treat SIRS caused by histones.
  • a biological fluid By contacting the adsorbent according to the present embodiment with a biological fluid, histones in the biological fluid can be adsorbed to the adsorbent with good biocompatibility, and histones can be removed from the biological fluid. It can be effectively used to suppress or treat systemic inflammation in diseases mediated by histones, since it can remove non-extracellular histones.
  • Specific diseases include sepsis, septic shock, disseminated intravascular coagulation syndrome (DIC), toxin shock syndrome, ischemia reperfusion disorder, adult respiratory distress syndrome (ARDS), Paget's disease, osteoporosis, multiple bone marrow Tumor, acute and chronic myeloid leukemia, pancreatic beta cell destruction, inflammatory bowel disease, psoriasis, Crohn's disease, ulcerative colitis, anaphylaxis, contact dermatitis, asthma, myopathies, cachexia, Reiter syndrome, I Type II diabetes, bone resorption, graft-versus-host reaction, atherosclerosis, brain trauma, multiple sclerosis, cerebral malaria, fever, and muscle pain due to infection.
  • SIRS systemic inflammatory response syndrome
  • the adsorbent and the device according to the present embodiment described above are suitably used in a processing method for allowing a biological fluid containing histone to pass therethrough and obtaining a biological fluid with reduced histone content discharged from the device outlet. be able to.
  • a method in which patient blood or ascites collected in a blood bag filled with the adsorbent of the present invention, and histones in the patient blood and ascites are adsorbed therein Even if the blood is not whole blood, the plasma may be processed after separating the plasma. The processed blood can be returned to the patient or stored in a blood bag or the like as needed.
  • this biological fluid purification device can be suitably used for the purpose of removing histones having cytotoxicity from a cell culture solution.
  • the culture solution collected in the bag filled with the adsorbent of the present invention is put, and the histone in the culture solution is adsorbed therein, the method of circulating the culture fluid to the device filled with the adsorbent of the present invention, Etc.
  • the culture solution may be processed after the cells are separated.
  • the treated culture solution can be used again for cell culture.
  • the industrially applicable fields of the present invention are not limited to the above.

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Abstract

　生体由来液中よりヒストンを除去する吸着材であって、水溶性の担体と、生体適合性ポリマーと、を有する吸着材が提供される。担体は、活性炭、ポリエステル、ポリスルホン、又はカチオン性官能基を備える。また、生体由来液中よりヒストンを除去する為の生体由来液浄化デバイスであって、生体由来液の入口及び出口を備えたハウジングと、ハウジング内に収容された上記吸着材と、を備える生体由来液浄化デバイスが提供される。生体由来液浄化デバイスのハウジング内に生体由来液が流通することにより、生体由来液からヒストンが除去される。

Description

ヒストンを除去する吸着材及び生体由来液浄化デバイス
　本発明は、生体由来液中等のヒストンを吸着する吸着材及びそれを用いた生体由来液浄化デバイスに関する。
　全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）は、感染等が引き金となりサイトカイン等の物質が過剰に放出され全身の炎症状態が亢進した状態と定義され、世界的には１８００万人が毎年亡くなっているが、有効な治療法が無い病態である。
　現在までにＳＩＲＳを伴う疾患に対して、過剰に産生された炎症性サイトカインを中和することを目的に抗ＴＮＦ－α抗体、ＩＬ－１Ｒａなどの臨床試験が試みられてきたが、有効性を証明するには至っていない。
　単独の炎症性サイトカインをターゲットとした治療の試みが有効な結果を示せてない理由は、ＳＩＲＳの背景及び症状がさまざまであり、またＳＩＲＳを引き起こしているサイトカインは１種類のみではなく、非常に複雑なサイトカインネットワークを形成しているためであると考えられている。
　従来、血液中よりこれら病因物質を網羅的に除去する血液濾過等の血液浄化療法が注目され、中分子領域のサイトカインを含むタンパク質を除去する技術が提案されている。例えば、濾過・透析による血液浄化療法により、複雑なサイトカインネットワークに関与するメディエータすべてを除去することが試みられている。しかし、多臓器不全に対するサイトカインのモノクローナル抗体投与とは異なった機序による有効性も考えられているが、除去できる量には限界がある。
　そこで、近年これらの炎症性サイトカインを血中から吸着除去することにより、ＳＩＲＳの治療を行うことを目的とした、炎症性サイトカイン吸着材に関しての報告がなされている（例えば、特許文献１参照。）。
　さらに最近、ＳＩＲＳの病因物質として新たにヒストンが非常に重要であるとの研究結果が開示されている（例えば、非特許文献１、２参照。）。
　このことは、ＳＩＲＳ患者の血中ヒストン濃度が健常人と比較して数十倍～数百倍のレベルにある事、また、炎症モデルマウスがヒストン抗体の投与により回復したことからも検証できる（例えば、非特許文献３参照。）。
　ヒストンは真核生物のクロマチンを構成する主要なタンパクであり、塩基性タンパク質を多く含むため正電荷を帯び、リン酸基由来の負電荷をもつデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鎖が約二回巻き付き、長いＤＮＡ分子を折り畳んで核内に収納する役割をもつ。ヒストンは、Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３，Ｈ４の４種類に分類され、各々２つずつ結合した八量体を形成したヒストン八量体にＤＮＡが巻き付いたものをヌクレオソームと呼ぶ。一方、ヌクレオソーム間のＤＮＡ（リンカーＤＮＡ）に結合するヒストンはリンカーヒストンと呼ばれ、その代表的なものはヒストンＨ１と呼ばれる。
　これらヒストンについては、カチオン性であることが知られており、実際、特許文献２、３に開示されている様に、硫酸化セルロースやヒドロキシアパタイト等の塩基性吸着材による除去ターゲットタンパク質の一つである。
特表２０１３－５２３７７２号公報 特開２００７－９２０３４号公報 特開平８－７１４１２号公報
Ｘｕ　Ｊ１，　Ｚｈａｎｇ　Ｘ，　Ｐｅｌａｙｏ　Ｒ，　Ｍｏｎｅｓｔｉｅｒ　Ｍ，　Ａｍｍｏｌｌｏ　ＣＴ，　Ｓｅｍｅｒａｒｏ　Ｆ，　Ｔａｙｌｏｒ　ＦＢ，　Ｅｓｍｏｎ　ＮＬ，　Ｌｕｐｕ　Ｆ，　Ｅｓｍｏｎ　ＣＴ、「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｈｉｓｔｏｎｅｓ　ａｒｅ　ｍａｊｏｒ　ｍｅｄｉａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｄｅａｔｈ　ｉｎ　ｓｅｐｓｉｓ」、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００９年１１月、１５，１３１８-１３２１，１ 射場敏明、村井美和、長岡功、田部陽子、「敗血症におけるｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔｒａｐｓ（ＮＥＴｓ），ｄａｍａｇｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｐａｔｔｅｒｎｓ（ＤＡＭＰｓ），そして細胞死」、日救急医会誌、２０１３年、２４、８２７－３６ 伊藤隆史、丸山征郎、科学研究費助成事業（学術研究助成基金助成金）研究成果報告書「敗血症の新規メディエーター"細胞外Ｈｉｓｔｏｎｅ"のダイナミズムの解析」
　このように、ヒストンは本来生体に必要な機能を有するものであるが、敗血症のような病態においては細胞外に過剰に放出されて病態悪化を引き起こし、生体を死に至らしめる物質である。しかし、ヒストンは真核生物のクロマチンを構成する主要なタンパクであり、ＤＮＡ分子を折り畳んで核内に収納する非常に重要な役割をもっており、細胞内で生体に必要な機能を有することを考えると、ヒストン活性を阻害する薬剤の投与は、生体に重大な副作用を引き起こす懸念がある。したがって、生体に好ましくない細胞外のヒストンを、選択的に体内から除去する手段が望まれる。そこで、体外循環によるヒストン除去が考えられるが、生体適合性が良好な状態で、つまり、血栓生成が起きることなく、ヒストンを効率的に除去することが難しいという課題がある。
　例えば、特許文献２に記載の吸着材に利用されている硫酸化セルロースに関しては、その強いアニオン性のために、第ＸＩＩ因子が活性化され、血液凝固カスケードが活性化され、血栓形成を惹起することが考えられる。また、特許文献３に記載の吸着材に利用されているヒドロキシアパタイトに関しては、強いタンパク質吸着性が知られており、血中の有用なタンパク質まで吸着除去してしまうことが考えられ、血栓形成を惹起してしまうことが考えられる。いうまでもなく、血液浄化用途に用いられる医療材料には、生体適合性の一つとして抗血栓性が必須であるが、このように、特許文献２，３記載の吸着材は、抗血栓性において、血液浄化用途には不適であり、生体適合性を有していないと考えられる。
　そこで本発明者らは、生体由来液中のヒストンを選択的に吸着除去し、生体適合性に優れた、血液浄化療法用デバイスを提供する為に鋭意検討を行った。その結果、ヒストン吸着材が生体適合性ポリマーを有すると、血球の付着を抑制し、血栓を生成することなく、ヒストンを生体適合性よく除去できることが明らかとなった。このようなヒストン吸着材を有する血液浄化療法用デバイスは、ヒストンを原因とするＳＩＲＳ等の治療に使用できる。また、このようなヒストン吸着材を生体由来液と接触させることにより、生体由来液中のヒストンがヒストン吸着材に生体適合性良く吸着され、生体由来液からヒストンを除去することができ、生体に好ましくない細胞外のヒストンを除去することができる。
　すなわち、本発明は、以下の（１）～（１５）に示すとおりのヒストン吸着材及び生体由来液浄化デバイスである。
　（１）生体由来液中よりヒストンを除去する吸着材であって、水不溶性の担体と、生体適合性ポリマーと、を備え、担体が、活性炭、ポリエステル、ポリスルホン、又はカチオン性官能基を備える担体のいずれかである吸着材。
　（２）生体適合性ポリマーが、カチオン性官能基を備える、（１）に記載の吸着材。
　（３）担体の形状が、粒子状、不織布状、又は中空糸膜状である、（１）又は（２）のいずれかに記載の吸着材。
　（４）担体が、カチオン性官能基と、ポリエチレンテレフタレート又はスチレンジビニルベンゼン系共重合体のいずれかと、を備える、（１）に記載の吸着材。
　（５）カチオン性官能基がアミノ基である、（４）に記載の吸着材。
　（６）アミノ基が第４級アンモニウム基である、（５）に記載の吸着材。
　（７）生体適合性ポリマーが親水性ポリマーである、（１）～（６）のいずれかに記載の吸着材。
　（８）親水性ポリマーがヒドロキシエチルメタクリレート系重合体である、（７）に記載の吸着材。
　（９）生体適合性ポリマーがジメチルアミノエチルメタクリレートを１０モル％以上含むポリマーである、（１）～（７）のいずれかに記載の吸着材。
　（１０）ヒストンがヒストンＨ３である、（１）～（９）のいずれかに記載の吸着材。
　（１１）生体由来液中よりヒストンを除去する生体由来液浄化デバイスであって、体液入口、出口を備えたハウジングと、ハウジング内に収容された（１）～（１０）のいずれかに記載の吸着材と、を備え、ハウジング内に生体由来液が流通されることにより、生体由来液からヒストンが除去される、生体由来液浄化デバイス。
　（１２）生体由来液が体液である、（１１）に記載の生体由来液浄化デバイス。
　（１３）体液が血液である、（１２）に記載の生体由来液浄化デバイス。
　（１４）（１１）～（１３）のいずれかに記載のデバイスを用いて生体由来液からヒストンを除去するヒストン除去方法。
　（１５）（１１）～（１３）のいずれかに記載のデバイスを用いて、血液あるいは血漿を通過させ、血液あるいは血漿中からヒストン含有量を減量させ、全身性炎症反応症候群を治療する治療方法。
　本発明によれば、血栓の生成を抑制可能であり、ヒストンを除去できるヒストン吸着材及び生体由来液浄化デバイスが提供される。
デバイスの一実施形態を示す断面図である。 デバイスの別の実施形態を示す断面図である。
　以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す本実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
　本実施形態に係る吸着材は、生体由来液中よりヒストンを除去する吸着材であって、水不溶性の担体と、生体適合性ポリマーと、を備える。吸着材の担体は、活性炭、ポリエステル、又はポリスルホンから本質的になるか、あるいはカチオン性官能基を備える。また、本実施形態に係る生体由来液浄化デバイスは、生体由来液中よりヒストンを除去する為の生体由来液浄化デバイスであって、生体由来液の入口及び出口を備えたハウジングと、ハウジング内に収容された、生体由来液中よりヒストンを除去する上記の吸着材と、を備え、ハウジング内に生体由来液が流通することにより、生体由来液からヒストンを除去する、生体由来液浄化デバイスである。
　（水不溶性の担体）
　本実施形態に係る吸着材が備える担体は、水に不溶性である。担体が水に不溶性であることにより、吸着材が血液に接触した際に担体が血液中へ溶出することを防止することができる。本実施形態において、「水不溶性」とは、２４時間乾燥させた乾燥状態の吸着材を２４時間、純水に浸漬させ、その後、取り出して、６０℃で２４時間乾燥した後の重量減が１０．０ｗｔ％以下であることをいう。　
（担体の材料）
　水に不溶性の担体の材料としては、活性炭系（単に、「活性炭」ともいう。）、ポリエステル系（単に、「ポリエステル」ともいう。）、及びポリスルホン系（単に、「ポリスルホン」ともいう。）が使用可能である。活性炭系、ポリエステル系、及びポリスルホン系を用いると、工業製品の生産性等に優れる傾向にある。
　また、担体がカチオン性官能基で修飾されている場合、担体の材料としては、活性炭、スチレンジビニルベンゼン系、ポリアミド系、ポリエステル系、ポリウレタン系、ポリスルホン系、ポリスチレン系、ポリエチレン系、ポリプロピレン系、セルロース系、セルロールアセテート系、ポリ（メタ）アクリレート系、セルロース系、セルロールアセテート系、ポリアクリルニトリル系、ポリメタクリル酸メチル系、エチレンビニルアルコール共重合体などのビニル化合物の重合体、セルロース系ゲル、デキストラン系ゲル、アガロース系ゲル、ポリアクリルアミド系ゲル、及び多孔質ガラス等、多孔性構造をとりうる公知の重合体であって、水不溶性であればいずれも用いることができる。これらのうち、活性炭系、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル系、ポリスルホン系、及びスチレンジビニルベンゼン系（単に、「スチレンジビニルベンゼン」ともいう。）を用いると、工業製品の生産性等に優れる傾向にある。
　ここでポリエステル系とは、多価カルボン酸（ジカルボン酸）とポリアルコール（ジオール）との重縮合体のことであり、例えば、ＰＥＴ、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンナフタレート等が挙げられるが、工業製品の生産性等から、ＰＥＴ、ＰＢＴが特に好ましい。
　ポリスルホン系とは、下記化学式（１）で表わされる繰り返しユニットを含む構造によって特徴づけられるポリアリールエーテルスルホンポリマーのことをいう。例えば、下記化学式（１）で表わされる繰り返しユニットからなるポリマー、及び下記化学式（２）で表わされる繰り返しユニットからなるポリマーがポリスルホン系として挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　スチレンジビニルベンゼン系とは、スチレンとジビニルベンゼンを混合し、共重合させることで得られる共重合体であり、ジビニルベンゼンにより架橋されたスチレン骨格を有するスチレンジビニルベンゼンコポリマーである。例えば、下記化学式（３）、（４）で表される繰り返しユニットからなるポリマー等が、スチレンジビニルベンゼン系として挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　（担体の形状）
　担体の形状は特に限定されず、粒子状、中空糸状、不織布状、繊維状、シート状、及びスポンジ状のいずれでもよい。粒子状の担体は、生体由来液との接触表面積が良好な傾向にある。
　粒子状の担体の材料としては、上記の担体を全て用いることができるが、活性炭、及びスチレンジビニルベンゼン系ビーズが、細孔径や表面積の制御をしやすく、また、医療用具とする際の耐滅菌性等の安全性を確保しやすい傾向にある。
　不織布状の担体の材料としては、上記の担体を全て用いることができるが、ＰＥＴ不織布、及びＰＢＴ不織布が、医療用具とする際の耐滅菌性等の安全性を確保しやすく、また、工業製品としての生産性等がよい傾向にある。
　中空糸状の担体の材料としては、上記の担体を全て用いることができるが、ポリスルホン系、エチレンビニルアルコール共重合体、及びポリメタクリル酸メチル系の重合体が、医療用具とする際の耐滅菌性等の安全性を確保しやすく、また、工業製品としての生産性等がよい傾向にある。
　粒子状の担体は、その比表面積と生体由来液の流通性を考慮すると、平均粒径５０～１５００μｍのものが好ましく、全血を通過させる用途の場合、１００～１０００μｍのものが更に好ましい。ここで、粒径とは、顕微鏡で観察した場合の担体の輪郭上の任意の２点を結ぶ直線のうち最も長い直線の長さをいう。また、平均粒径とは、無作為に選択した１００個の粒子状担体の粒径の算術平均値をいう。
　十分なヒストン吸着性能を確保する観点で、粒子担体の表面積は１ｍ２／ｇ以上が好ましく、５ｍ２／ｇ以上が特に好ましい。担体の表面積は、後述するように、吸着材からコートポリマーを除去した後で測定することができる。
　吸着材の表面積は、液体窒素温度（７７Ｋ）における窒素吸着等温線を測定した後に、ＢＥＴ（ＪＩＳ　Ｚ　８８３０;気体吸着による粉体（固体）の比表面積測定方法）解析法を用いて算出した表面積を指す。窒素吸着等温線の測定法には、セル内に充填した窒素ガスの圧力低下により担体へ吸着した窒素の量を算出する容量法、担体の重量変化を測定する重量法の２種があるが、どちらを用いて測定してもよい。なお、表面積を測定することができる方法であれば、全て用いることができる。
　中空糸状の担体を用いる場合には、中空糸内部に血液を流す観点から、中空糸の内径は１０～１０００μｍが好ましく、１００～３００μｍが更に好ましい。
　ここで中空糸内径とは、フィルター担体を構成する中空糸から一部をサンプリングし、電子顕微鏡で観察した写真より測定した平均直径である。
　担体が、不織布又は織布の場合、その平均繊維直径は０．３μｍ～１０μｍとすることができ、０．３μｍ～３μｍであることが好ましく、０．５μｍ～１．８μｍであることが更に好ましい。平均繊維直径が０．３μｍ以上である場合、血液を濾過する際の圧力損失が適度となり、また赤血球が溶血しにくくなる傾向にある。
　ここで平均繊維直径とは、フィルター担体を構成する不織布又は織布から一部をサンプリングし、電子顕微鏡で観察した写真より測定した平均直径である。
　これらの担体を例示すると、粒子状の担体の例としては、ダイヤイオン（三菱化学（(株)）社製）、 旭化成マイクロキャリア（旭化成（株）社製）、ＣＭ－セルロファイン（登録商標）ＣＨ（排除限界タンパク質分子量：約３×１０６、生化学工業（株）販売）などのセルロース系担体、特公平１－４４７２５号公報記載の全多孔質活性化ゲルや、ＣＭ－トヨパール（登録商標）６５０Ｃ（排除限界タンパク質分子量：５×１０６、東ソー（株）製）などのポリビニルアルコール系担体、ＣＭ－トリスアクリルＭ（ＣＭ－Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　Ｍ）〔排除限界タンパク質分子量：１×１０７、スウェーデン国ファルマシア－ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ－ＬＫＢ）社製〕などのポリアクリルアミド系担体、セファロースＣＬ－４Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ）〔排除限界タンパク質分子量：２×１０７、スウェーデン国ファルマシア－ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ－ＬＫＢ）社製〕などのアガロース系担体などの有機質担体、及びＣＰＧ－１０－１０００〔排除限界タンパク質分子量：１×１０８、平均細孔径：１００ｎｍ、米国エレクトロ－ニュークレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ－ｎｕｃｌｅｏｎｉｃｓ）社製〕などの多孔性ガラスなどの無機質担体が挙げられる。
　中空糸状の担体の例としては、ＡＰＳ（旭化成メディカル株式会社製）、ＫＦ－Ｃ（旭化成メディカル株式会社製）、トレライトＮＶ（東レ株式会社製）、ＹＨＦ（（株）ユアサメンブレンシステム社製）、及びステラポアー（三菱レイヨンアクア・ソリューションズ株式会社製）などが挙げられる。
　不織布状の担体の例としては、セパセル（旭化成メディカル株式会社製）、ベンリーゼ（旭化成せんい株式会社製）、エルタス（旭化成せんい株式会社製）、マイクロウェッブ（旭化成せんい株式会社製）、アクスター（東レ株式会社製）、クラレックス（（株）クラレ社製）、デルポア（三晶株式会社製）、及びシャイファイン（東洋紡績株式会社製）などが挙げられる。
　（生体適合性ポリマー）
　血液浄化用途に用いる吸着材は、血液との接触を避けることができないため、極力、血液中の無用な反応を惹起してしまわないように、吸着材表面に生体適合性を有することが好ましく、吸着材が生体適合性ポリマーの被覆層を有することが好ましい。ここでいう生体適合性とは、例えば、血液が吸着材を異物として認識しない状態を意味する。吸着材の表面が生体適合性であると、例えば、血小板や白血球の付着などが抑制され、血栓が生成しづらいという効果を得られる。
　本実施態様の吸着材は、担体と生体適合性ポリマーとを有する。本実施形態における「生体適合性ポリマー」とは、吸着材の担体表面に存在することで、吸着材の生体適合性が向上するポリマーのことをいう。より具体的には、生体適合性ポリマーを吸着材の担体に物理的にコーティングしたり、化学的に結合させたりすることによって、生体適合性ポリマーを付与する前の担体に比べ、担体の抗血栓性が向上するポリマーのことをいう。
　吸着材に含まれるポリマーの少なくとも一部が生体適合性ポリマーであるかどうかは、以下の手順によって評価できる。
１）ポリマーが物理的にコーティングされている場合
　吸着材の抗血栓性を測定した後、含まれるポリマーをジメチルスルホキシド等の適切な溶媒へ溶解させる。吸着材からポリマーを除去し、得られた担体を６０℃の乾燥機中で１時間以上乾燥させた後、デシケーター内に１時間以上放置する。その後、吸着材からポリマーを除去した担体の抗血栓性を測定する。吸着材の抗血栓性と担体の抗血栓性を比較したとき、
　　　　吸着材の抗血栓性＞吸着材からポリマーを除去した担体の抗血栓性
　となる場合、吸着材に含まれるポリマーは、生体適合性ポリマーである。なお、抗血栓性の測定は、後述するように、吸着材表面を肉眼あるいは走査型電子顕微鏡により観察し、吸着材表面に付着した血小板付着数を直接カウントする、あるいは、吸着材表面に付着した血球のＬＤＨ活性を測定する方法等により、評価することができる。抗血栓性を測定できるいずれかの方法によって、担体よりも吸着材の抗血栓性が向上していると評価できる場合、当該吸着材に含まれるポリマーは生体適合性ポリマーである。
　また、吸着材に含まれるポリマーをジメチルスルホキシド等の適切な溶媒へ溶解後、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ－ＮＭＲ）測定等を行い、吸着材に含まれるポリマーを同定した時、同定されたポリマーが後に例示する生体適合性ポリマーに該当するポリマーである場合、生体適合性ポリマーと判別することもできる。ポリマーを同定する方法は１Ｈ－ＮＭＲに限定されず、公知の同定方法を全て用いることができる。
２）ポリマーが化学的に結合されている場合
　吸着材の抗血栓性を測定した後、例えば、強酸及び／又は強アルカリに吸着材を一定時間浸漬させ、ポリマーを除去する。生体適合性ポリマーが吸着材表面から除去されたかどうかは、処理の前後で接触角を測定したり、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）等の表面解析等を行ったりしたりすることで確認することができる。その後、上述の方法を用いて、抗血栓性を評価し、
　　　　吸着材の抗血栓性＞吸着材からポリマーを除去した担体の抗血栓性
が成り立つ場合、吸着材に含まれるポリマーは、生体適合性ポリマーである。
　なお、ポリマーの組成は、ＸＰＳ、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ－ＳＩＭＳ）等の結果を総合的に判断する事により推定することができるが、測定方法はこれに限定されるものではない。
　また、本実施形態に係るヒストン吸着材においては、生体適合性ポリマーを付与した後にヒストン吸着能を有しておればよく、本実施形態に係る吸着体は、元来ヒストン吸着能を持たない担体に、生体適合性ポリマーを付与することによってヒストン吸着能を発現するようにしたものも含む。
　生体適合性ポリマーを含む吸着材を製造する方法は、担体表面に生体適合性ポリマーを付与する方法などの公知技術を利用可能である。
　生体適合性ポリマーの例としては、ポリアルキレングリコール鎖を有する単量体、重合体又はグラフト共重合体、エチレン－ビニルアルコール、ポリエステル、ポリ－２－メトキシエチルアクリレート（ｐ－ＭＥＡ）、並びにポリ－２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＰＭＰＣ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が挙げられる。この中で、重合体中にヒドロキシル基を有していることが、特に血小板の過剰な捕捉を防止できるため好ましく、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐ－ＨＥＭＡ）などのＨＥＭＡ系親水性ポリマーが特に好ましい。ＨＥＭＡ系とは、ポリマー成分中にＨＥＭＡを含むポリマーを指し、その他の成分は、任意の成分も用いることができる。例えば、生体適合性ポリマーが、塩基性含窒素部分を含むモノマー単位として、ジメチルアミノエチルメタクリレートを１０モル％以上含むと、ヒストン除去率が高くなる傾向にある。また、ヒストン等を吸着する観点から、生体適合性ポリマーはカチオン性の官能基を有することが好ましい。カチオン性の官能基については、後述する。
　（生体適合性ポリマー量）
　吸着材に含まれるポリマーの量は、以下の手順により算出される。
　生体適合性ポリマーを担持させる前の担体を６０℃に設定した乾燥機中で１時間以上乾燥させた後、デシケーター内に１時間以上放置した後に重量を測定し、これをＡとする。また、生体適合性ポリマーを担持させた担体を同様に６０℃の乾燥機中で１時間以上乾燥させた後、デシケーター内に１時間以上放置した後に重量を測定し、これをＢとする。ＡとＢの単位はグラムである。ポリマー量は以下の算出式により算出される。
　　　　ポリマー量（ｍｇ／ｇ担体）＝（Ｂ－Ａ）×１０００／Ａ
　また、ポリマーの量は、以下の手順によっても算出できる。
　吸着材を６０℃に設定した乾燥機中で１時間以上乾燥させた後、デシケーター内に１時間以上放置した後に重量を測定し、これをＣとする。また、生体適合性ポリマーをジメチルスルホキシド等の適切な溶媒へ溶解後、同様に６０℃の乾燥機中で１時間以上乾燥させた後、デシケーター内に１時間以上放置した後に重量を測定し、これをＤとする。ＣとＤの単位はグラムである。ポリマー量は以下の算出式により算出される。
　　　　ポリマー量（ｍｇ／ｇ担体）＝（Ｃ－Ｄ）×１０００／Ｄ
　多成分を含む生体適合性ポリマーに含まれる各モノマー単位のモル比は、コーティングポリマーをジメチルスルホキシド等の適切な溶媒へ溶解後、１Ｈ－ＮＭＲ測定を行い、得られた１Ｈ－ＮＭＲのピークの比から算出できる。
　（抗血栓性）
　抗血栓性は、吸着材表面を肉眼あるいは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察し、吸着材表面に付着した血小板付着数を直接カウントする、あるいは画像解析で定量化することによって調べることができる。
　ＳＥＭ観察を行う場合には、以下の手順によって、抗血栓性の評価を行うことができる。まず、健常人の血液を、ペリスタポンプを用いて、生理食塩水にて充填させた状態の吸着材を含むデバイスに一定時間循環させる。その後吸着材を含むデバイス内部の血液を生理食塩水で洗浄後、デバイスを解体し、内部の吸着材を取り出す。取り出した吸着材を、凍結乾燥させた後、イオンスパッターによる蒸着を行うことで得られたＳＥＭサンプルを観察し、抗血栓性の評価を行うことができる。
　あるいは、抗血栓性は、血小板の吸着材表面への付着量を指標として測定することができ、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＲＰ（多血小板血漿）と材料を一定時間接触させた後の吸着材に付着した血小板を界面活性剤で処理し、血小板内乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を測定することにより求められる。これは、材料付着血小板数とＬＤＨ活性の間に強い相関があるため、付着した血小板数をＬＤＨ活性により測定できる。また、全血を用いた抗血栓性の評価においては、全血と吸着材を一定時間接触させた後、生理食塩水あるいはＰＢＳ等バッファーで洗浄することによって、赤血球成分を除去し、材料表面に残った赤血球以外の成分（主に血小板と白血球成分）を界面活性剤で処理することによって、溶出してくるＬＤＨ活性を測定し、吸着材の抗血栓性を測定することができる。
　具体的には、以下の方法により行う。
　不織布、粒子状の吸着材の評価の場合は、
１）吸着材量をそろえたミニモジュールを複数作製する。ここで、「ミニモジュール」とは、少ない血液量で吸着材の評価をするために、実製品の１／２００等のスケールで作成された、小スケールのモジュールを言い、例えば、内径９ｍｍの２．５ｍＬ容量のラボラトリーカラム（モビテック）に吸着材を充填し作成した吸着材充填カラム等を用いることができる。
２）該ミニモジュールに生理食塩水を通液して洗浄する。
３）該ミニモジュールにヘパリンを加えたヒト血液を通液した後、生理食塩水で洗浄する。
４）洗浄後のミニモジュールから吸着材を取り出し、界面活性化剤であるＴｒｉｔｏｎ―Ｘ１００溶液中で血小板からＬＤＨを溶出させる。
５）ＬＤＨが、β―Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ（β―ＮＡＤＨ）の存在下でピルビン酸を基質とするとき乳酸を生成するので、この際のＮＡＤＨの減少速度を吸光度変化から測定し、ＬＤＨ活性を算出し血小板数に換算する。本方法では、この減少幅が大きいほどＬＤＨ活性が高い、すなわち吸着材表面への血球（主に血小板と白血球）の付着量が多いことを意味するものとして評価する。
　中空糸状の吸着材の評価の場合は、
１）膜内表面積をそろえたミニモジュールを複数作製する。ここで、「ミニモジュール」とは、中空糸の吸着材を、有効長１５ｃｍ、膜内表面の面積が５０ｍｍ2となるように両端をエポキシ接着剤で接着し、作成したカラム等を用いることができる。
２）該ミニモジュールに生理食塩水を通液して洗浄する。
３）該ミニモジュールにヘパリンを加えたヒト血液を通液した後、生理食塩水で洗浄する。
４）洗浄後のミニモジュールから中空糸状の吸着材を取り出し、界面活性化剤であるＴｒｉｔｏｎ―Ｘ１００溶液中で血小板からＬＤＨを溶出させる。
５）ＬＤＨが、β―Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｆｏｒｍ（β―ＮＡＤＨ）の存在下でピルビン酸を基質とするとき乳酸を生成するので、この際のＮＡＤＨの減少速度を吸光度変化から測定し、ＬＤＨ活性を算出し血小板数に換算する。本方法では、この減少幅が大きいほどＬＤＨ活性が高い、すなわち吸着材表面への血球（主に血小板と白血球）の付着量が多いことを意味するものとして評価する。　
　（カチオン性の官能基）
　ヒストンはカチオン性であり、従来、アニオン性吸着材による分離精製ターゲットタンパク質の一つと考えられている。しかし、本発明者らは、カチオン性の材料にヒストンが吸着されることを見出した。そのため、吸着材はカチオン性の官能基を表面に有するのが好ましい。例えば、担体の材料がカチオン性の官能基を有していてもよいし、生体適合性ポリマーがカチオン性の官能基を有していてもよい。担体表面に導入されるカチオン性の官能基としては、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、イミノ基、４級アンモニウム基などの官能基が挙げられるが、好ましくは、４級アンモニウム基が用いられる。なお、２級アミノ基、３級アミノ基、及び４級アミノ基は、それぞれ、モノアルキル置換アミノ基、ジアルキル置換アミノ基、及びトリアルキル置換アミノ基ともいう。また、上記のカチオン性の官能基を含むポリマーを担体にコートすることによって吸着材表面にカチオン性を付与してもよい。生体適合性ポリマーをコートした担体に、さらにカチオン性官能基を導入するためのポリマーをコートしてもよいし、カチオン性官能基を導入するためのポリマーをコートした担体に、さらに生体適合性ポリマーをコートしてもよい。ただし、段階的にコートした場合、２段階目のコート時に、１段階のコートポリマーが溶出してしまうことが考えられるため、生体適合性とカチオン性官能基の両性質を有するポリマーをコートすることが好ましい。
　（アミノ基）
　アミノ基としては、例えば、アミノヘキサン、モノメチルアミノヘキサン、アミノオクタン、アミノドデカン、アミノジフェニルメタン、１－（３－アミノプロピル）イミダゾール、３－アミノ－１－プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス（２－アミノエチル）アミン、ジメチルアミン又はジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、ポリエチレンイミン、Ｎ－メチル－２，２’－ジアミノジエチルアミン、Ｎ－アセチルエチレンジアミン、及び１，２－ビス（２－アミノエトキシエタン）等の化合物由来のアミノ基が挙げられるが、アミノ基であれば全て用いることができる。
　（第４級アンモニウム基）
　第４級アンモニウム基とは、ＮＲ4 ＋と表される正電荷を持った置換基であり、例えば、下記化学式（５）、（６）で表される基等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　（交換容量及びゼータ電位）
　上記カチオン性の強度を示す指標の一つとして、交換容量が用いられる。カチオン性の官能基を有する吸着材の交換容量は、高い吸着性能を得る観点で、水不溶性担体１ｍＬ当たり０．０５ｍＥｑ以上が好ましく、０．５ｍＥｑ以上がより好ましい。また、カチオン性の評価指標としてゼータ電位も好適に用いることができ、ゼータ電位を評価指標とする場合は０ｍＶ以上であればよい。
　交換容量は以下の手順で測定することができる。まず、吸着材を計量し、それを脱塩水でろ過管に移し、このろ過管に１ｍｏｌ／Ｌ－ＮａＯＨ、脱塩水を順次流し、樹脂を再生、洗浄し、次いで、５％ＮａＣｌを流し、流出液を２００ｍＬメスフラスコに受け定容とする。これを、メチルレッド・メチレンブルー混合指示薬を用いて０．１ｍｏｌ／Ｌ－ＨＣｌで滴定することにより求めることができるが、測定方法はこれに限定されるものではない。
　吸着材の表面のゼータ電位の測定方法は、例えば、流動電位測定法により測定することができ、流動電位測定法とは、一対の流動電位測定電極間に粉体や繊維等の固体試料を充填し、その充填層に流動液を透過させたときに電極間に発生する電位差すなわち流動電位を測定することによりゼータ電位を求める方法であるが、測定方法はこれに限定されるものではない。
　（ヒストン）
　ヒストンとは、生体由来液中に存在するＤＮＡ結合タンパクであり、ヒストンＨ１，ヒストンＨ２Ａ，ヒストンＨ２Ｂ，ヒストンＨ３，ヒストンＨ４が挙げられるが、ＳＩＲＳ等の治療を目的とする場合は、生体由来液中からヒストンＨ３及びヒストンＨ４が除去されることが好ましい。
　（生体由来液）
　生体由来液は、生体に由来する液体ないし生体由来成分を含む液体を全て包含し、具体的には血液、血漿、血清、及び腹水などの体液や、細胞培養液などを含む。
　生体由来液と、本発明の吸着材との接触は、種々の形態が考えられる。例えば、本発明の吸着材が充填された血液バッグに採血した患者血液又は腹水を入れ、この中で患者血液中、腹水中のヒストンを吸着する方法、本発明の吸着材を充填したデバイスに血液を循環させる方法、などが挙げられる。血液は、全血でなくとも、血漿を分離した後、血漿を処理してもよい。処理された血液は患者に戻されるか、必要に応じて血液バッグ中などに保存することもできる。
　また、細胞培養液の場合は、例えば、本発明の吸着材が充填されたバッグに採取した培養液を入れ、この中で培養液中のヒストンを吸着する方法、本発明の吸着材を充填したデバイスに培養液を循環させる方法、などが挙げられる。培養液は、細胞を分離した後、細胞培養液上澄みを処理してもよい。処理された培養液は、再度細胞培養に用いることもできる。
　（デバイス）
　図１は、デバイスの一実施形態を示す断面図である。デバイス１００は、例えば血液体外循環回路に接続するモジュールである。円筒１１０の一端開口部に、内側にフィルター１２０を張ったパッキン１３０を介して入口ポート１４０を有するキャップ１５０をネジ嵌合し、円筒１１０の他端開口部に内側にフィルター１２０’を張ったパッキン１３０’を介して出口ポート１６０を有するキャップ１７０をネジ嵌合して容器を形成している。さらに、フィルター１２０及び１２０’の間隙に吸着材を充填保持させて、ヒストン吸着材層１８０を形成している。
　ヒストン吸着材層１８０には、上記の本実施形態に係る吸着材を単独で充填してもよく、他の吸着材を混合又は積層してもよい。他の吸着材としては、例えばサイトカイン等の他の悪性物質の吸着材や、幅広い吸着能を有する吸着材等を用いることができる。これにより吸着材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。ヒストン吸着担体層１８０の容積は、５ｍＬ～３０００ｍＬとすることができるが、ヒストン吸着容量と血液の体外循環の際の体外血液量の観点から、５０ｍＬ～１０００ｍＬが好ましく、１００ｍＬ～５００ｍＬがより好ましい。
　血液体外循環回路に接続するモジュールは、血液体外循環回路に、治療対象の生体由来液と接触するように配置され、全身炎症性疾患治療用途等で利用可能である。
　図２は、デバイスの別の実施形態を示す断面図である。デバイス２００は、例えば血液体外循環回路に接続するモジュールである。円筒２１０の両端に、中空糸状の吸着材２２０がポッティング剤２３０によって保持されている。中空糸状の吸着材２２０の両端面は、開口している。入口ポート２４０を有するキャップ２５０及び出口ポート２６０を有するキャップ２５０’を円筒２１０に嵌合し、中空糸状の吸着材２２０を充填保持させている。また、円筒２１０の側面には、透析液導入口２７０と透析液導出口２８０が具備されている。
　血液体外循環による血液浄化法に使用する際には、治療対象の体内から導出させた血液を入口ポート２４０から導入させ、中空糸状の吸着材２２０を通過させ、出口ポート２６０を通して、治療対象の体内へと戻すことで、血液体外循環による血液浄化法を行うことができる。その際に、透析液導入口２７０から透析液を導入させ、透析液導出口２８０から透析液を導出して、デバイス２００内の透析液を循環させることによって、血液体外循環中に透析を行うことができる。また、この透析液の循環は行わなくてもよく、透析液導入口２７０、透析液導出口２８０を開放してもよい。この場合、血液の濾過が行われる。また、透析液導入口２７０と透析液導出口２８０を栓等で塞ぐことによって、血液の濾過を抑制して血液体外循環による血液浄化法を行うこともできる。
　上記の本実施態様に係る吸着材及びデバイスは、ヒストンが介在する疾患において、全身炎症を抑制又は治療するために有効に使用することができる。具体的な疾患名としては、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、毒素ショック症候群、虚血再還流障害、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、パジェット病、骨粗鬆症、多発性骨髄腫、急性及び慢性骨髄性白血病、膵臓β細胞破壊、炎症性腸疾患、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、アナフィラキシー、接触性皮膚炎、喘息、筋変性症、悪液質、ライター症候群、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、骨吸収症、移植片対宿主反応、アテローム性動脈硬化、脳外傷、多発性硬化症、大脳マラリア、発熱、並びに感染による筋肉痛等が挙げられる。
　（治療方法）
　本実施形態に係る吸着材及び生体由来液浄化デバイスを用いた治療方法としては、例えば、本発明の生体由来液浄化デバイスと患者とを血液回路で接続し、患者から取り出した血液を本発明の生体由来液浄化デバイスに通過させ、血液中よりヒストン含有量を減量させ、これを患者に戻すことにより、全身性炎症反応症候群を治療することができる。
　また、患者から体外に取り出した血液を血漿分離膜により、血球成分と血漿成分に分離した後、分離した血漿を本発明の生体由来液浄化デバイスに通過させ、血漿中よりヒストン含有量を減量させ、これを患者に戻すことにより、全身性炎症反応症候群を治療することができる。
　上記の本実施態様に係る吸着材及びデバイスは、他の体液処理方法や医療機器と併用しても構わない。他の体液処理方法や医療機器としては、例えば、持続緩徐式血液濾過（ＣＲＲＴ）、血漿交換、腹膜透析、血漿分離機、ヘモフィルター、人工心肺、ＥＣＭＯが挙げられる。
　また、上記の本実施態様に係る吸着材及びデバイスは、ヒストンを含む生体由来液を通過させ、デバイス出口より排出された、ヒストン含有量を減量した生体由来液を取得する処理方法に好適に用いることができる。　
　本実施態様に係るヒストン吸着材を、生体由来液等と一定時間接触させる時、処理前後のヒストンの吸着率は以下の式により算出される。
　　　　ヒストン吸着率（％）＝（Ｃ０－Ｃ）／Ｃ０×１００
　　　　　Ｃ０：　処理前溶液中のヒストン濃度
　　　　　Ｃ：　処理後溶液中のヒストン濃度
　本実施態様に係る吸着材によるヒストン吸着率を評価するために、生体由来液等と接触させる方法としては、健常ボランティアから採血した血液に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を添加し、振とう機を用いて振とうさせ、遠心機を用いて遠心し、上清を血漿サンプルとして取得し、取得した血漿サンプルと、吸着材をポリプロピレン（ＰＰ）製のチューブ内で混合し、振とう機を用いて振とうさせる方法が挙げられる。
　また、健常ボランティアから採血した血液に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリポポリサッカライドを添加し、振とう機を用いて振とうさせた血液を、吸着材を内径９ｍｍの２．５ｍＬ容量のラボラトリーカラム（モビテック）に充填し作成した吸着材充填カラムに、シリンジポンプを用いて通液させる方法が挙げられる。
　さらに、製品と同じスケールのフルモジュールと接触させる方法としては、健常ボランティアから採血した血液に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリポポリサッカライドを添加し、振とう機を用いて振とうさせた血液を、吸着材を充填した図１のようなデバイスに、ペリスタポンプを用いて循環させる方法などが挙げられる。この際、使用する血液量を少なくするために、デバイスを含めた循環回路全体の容量を少容量化することが好ましい。
　以下、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
　＜実施例１＞
　（吸着材作製及び評価）
　スチレンジビニルベンゼン系共重合体を含む、トリメチルアンモニウム基を有する強塩基性陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン；三菱化学株式会社製）に限外ろ過（ＵＦ）水を加え、９５℃に加熱し、２２時間以上熱水洗浄を行った。次に、ポリマー濃度が０．７５％になるようにエタノールに溶解した、生体適合性ポリマーとしてのｐ－ＨＥＭＡのコート液を、強塩基性陰イオン交換樹脂に４時間浸漬させ、一次コーティングを行った。その後、７０℃で一晩熱風乾燥を行い、１２０℃で２時間熱風加熱架橋を行った。送風冷却した一次コーティング強塩基性陰イオン交換樹脂に、一次コーティングと同様の手順で、ｐ－ＨＥＭＡコート液の二次コーティングを行った。二次コーティングした強塩基性陰イオン交換樹脂を、送風冷却し、吸着材Ａとした。
　（血漿ヒストンＨ３吸着試験）
　健常ボランティアから採血した血液に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ０１２７：Ｂ８由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．１μｇ／ｍｌ濃度になるように添加し、振とう機を用いて２４時間、３９℃で振とうさせた。その後、遠心機を用いて２０００ｇで１０分間遠心し、上清を血漿サンプルとして取得した。取得した血漿サンプル３ｍｌと、吸着材Ａ　０．５ｍｌをポリプロピレン（ＰＰ）製のチューブ内で混合し、振とう機を用いて１時間、３９℃で振とうさせた。振とうさせた後のＰＰ製チューブを、遠心機を用いて２０００ｇで１分間遠心し、上清を担体接触後血漿サンプルとして取得した。
　（ヒストンＨ３除去性能評価）
　取得した担体接触後血漿サンプルを用いて、吸着材ＡのヒストンＨ３吸着率を算出した。ヒストンＨ３吸着率（％）をＡ、吸着材処理前ヒストンＨ３濃度をＣ０、吸着材処理後ヒストンＨ３濃度をＣＡとして、ヒストンＨ３吸着率算出式を以下に示す。以下の実施例２から９及び比較例１から３においても、同一のヒストンＨ３吸着率算出式を用いた。ヒストンＨ３の濃度は、ＥｐｉＱｕｉｋ（登録商標）　Ｔｏｔａｌ　Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ社製）を用いて測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
　（抗血栓性の測定）
　抗血栓性は、血球の吸着担体表面への付着量を指標とした。具体的には、終濃度が１ＩＵ／ｍｌになるようにヘパリンを添加して得た健常人の血液を、生理食塩水にて湿潤させた状態の樹脂０．５ｍｌに添加し３７℃で３０分間放置し、その後、吸着材を分離し、生理食塩水で洗浄後、肉眼観察を行った。結果を表１に示す。
　＜実施例２＞
　（生体適合性ポリマーの合成）
　重合溶媒としてエタノールを用い、窒素雰囲気下、７８℃で攪拌を行いながら、重合性モノマーとジアゾ系開始剤を溶解したエタノール溶液を滴下して、重合を行った。各重合性モノマーの仕込みは、疎水性重合性モノマーとしてメチルメタクリレート（以下、「ＭＭＡ」と略す）２５モル％、塩基性含窒素部分を含む重合性モノマーとしてジメチルアミノエチルメタクリレート（以下、「ＤＭ」と略す）１３モル％、プロトン性中性親水性部分を含むモノマーとして２－ヒドロキシエチルメタアクリレート（以下、「ＨＥＭＡ」と略す）６２モル％であった。重合液を過剰の水にて精製し、減圧乾燥し、合成ポリマーＡとした。
　（吸着材作製及び評価）
　強塩基性陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン；三菱化学株式会社製）にＵＦ水を加え、９５℃に加熱し、２２時間以上熱水洗浄を行った。次に、上記合成ポリマーＡコート液を、強塩基性陰イオン交換樹脂に４時間浸漬させ、一次コーティングを行った。その後、７０℃で一晩熱風乾燥を行い、１２０℃で２時間熱風加熱架橋を行った。送風冷却した一次コーティング強塩基性陰イオン交換樹脂に、一次コーティングと同様の手順で、合成ポリマーＡコート液の二次コーティングを行った。二次コーティングした強塩基性陰イオン交換樹脂を、送風冷却し、吸着材Ｂとした。この吸着材Ｂを用いて、実施例１と同様の吸着実験を行った結果を表１に示す。
　＜実施例３＞
　（生体適合性ポリマーの合成）
　各重合モノマーの仕込み比をＤＭ３モル％、ＨＥＭＡ９７モル％として実施例２と同様の条件で重合、精製、乾燥し、合成ポリマーＢを得た。
　（吸着材作製及び評価）
　強塩基性陰イオン交換樹脂（ダイヤイオン；三菱化学株式会社製）にＵＦ水を加え、９５℃に加熱し、２２時間以上熱水洗浄を行った。次に、上記合成ポリマーＢコート液を、強塩基性陰イオン交換樹脂に４時間浸漬させ、一次コーティングを行った。その後、７０℃で一晩熱風乾燥を行い、１２０℃で２時間熱風加熱架橋を行った。送風冷却した一次コーティング強塩基性陰イオン交換樹脂に、一次コーティングと同様の手順で、合成ポリマーＢコート液の二次コーティングを行った。二次コーティングした強塩基性陰イオン交換樹脂を、送風冷却し、吸着材Ｃとした。この吸着材Ｃを用いて、実施例１と同様の吸着実験を行った結果を表１に示す。
　＜実施例４＞
　（吸着材作製及び評価）
　ビーズ状活性炭（株式会社クレハ社製）に０．１Ｎ塩酸で洗浄を行い、ＵＦ水でさらに洗浄を行った後、６０－６５℃の温水で４０時間以上の洗浄を行った。次に、ポリマー濃度が０．７５％になるようにエタノールに溶解したｐ－ＨＥＭＡコート液を、ビーズ状活性炭に４時間浸漬させ、一次コーティングを行った。その後、７０℃で一晩熱風乾燥を行い、１２０℃で２時間熱風加熱架橋を行った。送風冷却した一次コーティングビーズ状活性炭に、一次コーティングと同様の手順で、ｐ－ＨＥＭＡコート液の二次コーティングを行った。二次コーティングしたビーズ状活性炭を、送風冷却し、吸着材Ｄとした。この吸着材Ｄを用いて、実施例１と同様の吸着実験を行った結果を表１に示す。
　＜実施例５＞
　（吸着材作製及び評価）
　ビーズ状活性炭（株式会社クレハ社製）に０．１Ｎ塩酸で洗浄を行い、ＵＦ水でさらに洗浄を行った後、６０－６５℃の温水で４０時間以上の洗浄を行った。次に、上記合成ポリマーＡコート液を、ビーズ状活性炭に４時間浸漬させ、一次コーティングを行った。その後、７０℃で一晩熱風乾燥を行い、１２０℃で２時間熱風加熱架橋を行った。送風冷却した一次コーティングビーズ状活性炭に、一次コーティングと同様の手順で、合成ポリマーＡコート液の二次コーティングを行った。二次コーティングしたビーズ状活性炭を、送風冷却し、吸着材Ｅとした。この吸着材Ｅを用いて、実施例１と同様の吸着実験を行った結果を表１に示す。
　＜実施例６＞
　（吸着材作製及び評価）
　ビーズ状活性炭（株式会社クレハ社製）に０．１Ｎ塩酸で洗浄を行い、ＵＦ水でさらに洗浄を行った後、６０－６５℃の温水で４０時間以上の洗浄を行った。次に、上記合成ポリマーＢコート液を、ビーズ状活性炭に４時間浸漬させ、一次コーティングを行った。その後、７０℃で一晩熱風乾燥を行い、１２０℃で２時間熱風加熱架橋を行った。送風冷却した一次コーティングビーズ状活性炭に、一次コーティングと同様の手順で、合成ポリマーＢコート液の二次コーティングを行った。二次コーティングしたビーズ状活性炭を、送風冷却し、吸着材Ｆとした。この吸着材Ｆを用いて、実施例１と同様の吸着実験を行った結果を表１に示す。
　＜実施例７＞
　（吸着材作製及び評価）
　上記合成ポリマーＡを、素材である平均繊維径１．３μｍのＰＥＴ製不織布にコーティングし、吸着材Ｇを得た。吸着材Ｇを用いて、実施例１と同様の吸着試験を行った結果を、表１に示す。
　＜実施例８＞ 
　（生体適合性ポリマーの合成）
　各重合モノマーの仕込み比をＭＭＡ３０モル％、ＤＭ１０モル％、ＨＥＭＡ６０モル％として実施例２と同様の条件で重合、精製、乾燥し、合成ポリマーＣを得た。
（吸着材作製及び評価）
　上記合成ポリマーＣを、素材であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製不織布にコーティングし、吸着材Ｈを得た。吸着材Ｈを用いて、実施例１と同様の吸着試験を行った結果を、表１に示す。
　＜実施例９＞
　（吸着材作製及び評価）
　上記合成ポリマーＢを、素材であるポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製不織布にコーティングし、吸着材Ｉを得た。吸着材Ｉを用いて、実施例１と同様の吸着試験を行った結果を、表１に示す。
　＜比較例１＞
　実施例１と同じ強塩基性陰イオン交換樹脂にＰ－ＨＥＭＡコートを施していないこと以外は実施例１と同様の吸着担体Ｌを用いて吸着試験を行った結果を、表１に示す。
　＜比較例２＞
　実施例４と同じビーズ状活性炭にＰ－ＨＥＭＡコートを施していない以外は実施例４と同様の吸着担体Ｍを用いて吸着試験を行った結果を、表１に示す。
　＜比較例３＞
　実施例７と同じＰＥＴ製不織布に合成ポリマーＡ液コートを施していない事以外は実施例７と同様の吸着担体Ｎを用いて吸着試験を行った結果を、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表１の結果から、担体表面に生体適合性ポリマーをコートされている吸着担体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉの抗血栓性が良好で、かつヒストンＨ３を除去したことが示された。一方で、生体適合性ポリマーがコートされていない吸着担体Ｌ、Ｍ、Ｎはいずれも血球の付着が多く（抗血栓性が低く）、ヒストン除去デバイス用の吸着担体として最低限満たすべき生体適合性を満たしていないことが示された。
　＜実施例１０＞
　（中空糸状の吸着材作製及び評価）
　ポリスルホン及びポリビニルピロリドンからなる中空糸膜有効長１７ｃｍ、膜内表面の面積が１００ｍｍ2（内径１８５μｍの中空糸膜を使用したため１００フィラメント）となるように両端をエポキシ接着剤で接着してデバイスを作製した。このデバイスの血液の入口ポートより上記合成ポリマーＡを５［ｍＬ／分］で２０秒間流通させて、中空糸内表面に合成ポリマーＡをコーティングし、吸着材Ｊを含むデバイスを作製した。
　（血漿ヒストンＨ３吸着試験）
　健常ボランティアから採血した血液に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ０１２７：Ｂ８由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を０．１μｇ／ｍｌ濃度になるように添加し、振とう機を用いて２４時間、３９℃で振とうさせた。その後、遠心機を用いて２０００ｇで１０分間遠心し、上清を血漿サンプルとして取得した。取得した血漿サンプル１０ｍｌを、ペリスタポンプを用いて、吸着材Ｊを含むデバイスに流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで、６０分間、３９℃で循環させた。その後、循環させた血漿を担体接触後血漿サンプルとして取得した。
　（ヒストンＨ３除去性能評価）
　取得した担体接触後血漿サンプルを用いて、処理後のヒストンＨ３吸着率についてそれぞれ算出した。ヒストンＨ３吸着率（％）をＡＨ、コーティングされていない中空糸で処理した後のヒストンＨ３濃度をＣＨ０、コーティングした中空糸で処理した後ヒストンＨ３濃度をＣＨＡとして、ヒストンＨ３吸着率算出式を以下に示す。以下の実施例１１及び比較例４、５においても、同一のヒストンＨ３吸着率算出式を用いた。ヒストンＨ３の濃度は、ＥｐｉＱｕｉｋ（登録商標）　Ｔｏｔａｌ　Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ社製）を用いて測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　（抗血栓性の測定）
　抗血栓性は、血球の中空糸担体表面への付着量を指標とした。具体的には、終濃度が１ＩＵ／ｍｌになるようにヘパリンを添加して得た健常人の血液を、生理食塩水にて充填させた状態の吸着材Ｊを含むデバイスに、ペリスタポンプを用いて１．２ｍｌ／ｍｉｎの流速で、３７℃で６０分間循環させ、その後中空糸内部の血液を生理食塩水で洗浄後、デバイスを解体し、内部の中空糸を取り出し、２．５％グルタルアルデヒドに浸漬させ、血球の固定化を行った。その中空糸を、２５％，５０％，６０％，７０％，８０％，９０％，９９％エタノール（和光純薬工業製）溶液に、順々に浸漬させ、脱水を行った後、ｔ－ブチルアルコール（和光純薬工業製）に浸漬させた。中空糸からｔ－ブチルアルコールを十分に取り除いた後、凍結させ、一晩凍結乾燥させた。この中空糸を斜めにスライスした後、イオンスパッターによる蒸着を行い、中空糸ＳＥＭサンプルを得た。その後、ＳＥＭ観察を行い、血球付着を評価した。結果を表２に示す。
　＜実施例１１＞　
　ポリスルホン及びポリビニルピロリドンからなる中空糸膜有効長１７ｃｍ、膜内表面の面積が１００ｍｍ2（内径１８５μｍの中空糸膜を使用したため１００フィラメント）となるように両端をエポキシ接着剤で接着してデバイスを作製した。このデバイスの血液の入口ポートより上記合成ポリマーＢを流通させて、中空糸内表面に合成ポリマーＢをコーティングし、吸着材Ｋを含むデバイスを作製した。この吸着材Ｋを含むデバイスを用いて吸着試験を行った結果を、表２に示す。
　＜比較例４＞
　（中空糸状の吸着材作製及び評価）
　ポリスルホン及びポリビニルピロリドンからなる中空糸膜有効長１７ｃｍ、膜内表面の面積が１００ｍｍ2（内径１８５μｍの中空糸膜を使用したため１００フィラメント）となるように両端をエポキシ接着剤で接着してデバイスを作製した。この作製した吸着材Ｏを含むデバイスを用いて吸着試験を行った結果を、表２に示す。
　＜比較例５＞ 
　（中空糸状の吸着材作製及び評価）
　ポリスルホン及びポリビニルピロリドンからなる中空糸膜有効長１７ｃｍ、膜内表面の面積が１００ｍｍ2（内径１８５μｍの中空糸膜を使用したため１００フィラメント）となるように両端をエポキシ接着剤で接着してデバイスを作製した。この吸着材Ｐを含むデバイスを用いて吸着試験を行った結果を、表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表２の結果から、担体表面に生体適合性ポリマーをコートされている吸着材Ｊ，Ｋを含むデバイスが、抗血栓性良くヒストンＨ３を除去したことが示された。一方で、生体適合性ポリマーがコートされていない吸着材Ｏを含むデバイスは血球の付着が多く（抗血栓性が低く）、ヒストン除去デバイスとして最低限満たすべき生体適合性を満たしていない。さらに、カチオン性官能基を有しないＰＶＰでコートされた吸着材Ｐを含むデバイスは、抗血栓性は高いが、ヒストンを吸着しない。
　＜実施例１２＞
　（水系ヒストンＨ４吸着試験）
　生理用食塩水に、ＥｐｉＱｕｉｋ（登録商標）　Ｔｏｔａｌ　Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ４　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ社製）付属の標準品（ヒストンＨ４（初期濃度：５０μｇ／ｍＬ）を添加した溶液を、ＰＰ製チューブ内で０．２ｍＬ調整した。ここへ吸着材Ａを０．１ｍＬ加え、振とう機を用いて１時間、３９℃で振とうさせた。振とうさせた後のＰＰ製チューブを、遠心機を用いて２０００ｇで１分間遠心し、上清を担体接触後血漿サンプルとして取得した。
　（ヒストンＨ４除去性能評価）
　取得した担体接触後血漿サンプルを用いて、吸着材ＡのヒストンＨ４吸着率を算出した。ヒストンＨ４吸着率（％）をＡ４、吸着材処理前ヒストンＨ３濃度をＣ４０、吸着材処理後ヒストンＨ３濃度をＣ４Ａとして、ヒストンＨ４吸着率算出式を以下に示す。以下の実施例１３、１４及び比較例６においても、同一のヒストンＨ４吸着率算出式を用いた。ヒストンＨ４の濃度は、ＥｐｉＱｕｉｋ（登録商標）　Ｔｏｔａｌ　Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ４　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ社製）を用いて測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
　＜実施例１３＞
　吸着材Ｄを用いて、実施例１２と同様の吸着試験を行った結果を表３に示す。
　＜実施例１４＞
　吸着材Ｇを用いて、実施例１２と同様の吸着試験を行った結果を表３に示す。
　＜比較例６＞
　（水系ヒストンＨ４吸着試験）
　生理用食塩水に、ＥｐｉＱｕｉｋ（登録商標）　Ｔｏｔａｌ　Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ４　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ社製）付属の標準品（ヒストンＨ４（初期濃度：５０μｇ／ｍＬ）を添加した溶液を、ＰＰ製チューブ内で０．２ｍＬ調整した。ここに吸着材を加えずに、振とう機を用いて１時間、３９℃で振とうさせた。振とうさせた後のＰＰ製チューブを、遠心機を用いて２０００ｇで１分間遠心し、上清を血漿サンプルとして取得した。
　（ヒストンＨ４除去性能評価）
　取得した血漿サンプルを用いて、処理後のヒストンＨ４吸着率についてそれぞれ算出した。ヒストンＨ４吸着率算出式を以下に示す。ヒストンＨ４の濃度は、ＥｐｉＱｕｉｋ（登録商標）　Ｔｏｔａｌ　Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ４　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＥＰＩＧＥＮＴＥＫ社製）を用いて測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表３の結果から、担体表面に生体適合性ポリマーをコートされている吸着材Ａ、Ｄ、Ｇを含むデバイスが、ヒストンＨ４を除去したことが示された。なお、比較例６においては、ヒストンＨ４は、ＰＰ製チューブに非特異的に吸着したものと考えられる。
　本実施形態に係る吸着材及び生体由来液浄化デバイスは、生体由来液中よりヒストンＨ３を生体適合性よく除去でき、ＳＩＲＳに代表されるヒストンが介在して発症又は悪化する疾患の治療用途等に有用である。
　この生体由来液浄化用デバイスにより、ヒストンを原因とするＳＩＲＳ等の治療に使用できる。本実施形態に係る吸着材を生体由来液と接触させることにより、生体由来液中のヒストンが該吸着材に生体適合性良く吸着され、生体由来液からヒストンを除去することができ、生体に好ましくない細胞外のヒストンを除去することができるので、ヒストンが介在する疾患において、全身炎症を抑制又は治療するために有効に使用することができる。具体的な疾患名としては、敗血症、敗血症性ショック、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、毒素ショック症候群、虚血再還流障害、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、パジェット病、骨粗鬆症、多発性骨髄腫、急性及び慢性骨髄性白血病、膵臓β細胞破壊、炎症性腸疾患、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、アナフィラキシー、接触性皮膚炎、喘息、筋変性症、悪液質、ライター症候群、Ｉ型及びＩＩ型糖尿病、骨吸収症、移植片対宿主反応、アテローム性動脈硬化、脳外傷、多発性硬化症、大脳マラリア、発熱、並びに感染による筋肉痛等が挙げられる。特に、敗血症など全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の病態を改善させる用途に好適に用いられる。
　より具体的には、血液体外循環による方法として患者から血液を脱血した後、全血をそのまま、あるいは、血漿分離（１次）膜や遠心分離法を用いて分離された血漿を、例えば、図１のデバイスの入口ポート１４０に導入させ、出口ポート１６０から導出させることで、ヒストン含有量が減量した血液あるいは血漿を患者体内に戻す体外循環療法に好適に用いることができる。
　また、上記の本実施態様に係る吸着材及びデバイスは、ヒストンを含む生体由来液を通過させ、デバイス出口より排出された、ヒストン含有量を減量した生体由来液を取得する処理方法に好適に用いることができる。
　例えば、本発明の吸着材が充填された血液バッグに採血した患者血液又は腹水を入れ、この中で患者血液中、腹水中のヒストンを吸着する方法、などが挙げられる。血液は、全血でなくとも、血漿を分離した後、血漿を処理してもよい。処理された血液は患者に戻されるか、必要に応じて血液バッグ中などに保存することもできる。
　ヒストンは細胞障害性を有することが報告されており、この生体由来液浄化用デバイスは、細胞培養液中から細胞障害性を持つヒストンを除去する用途に好適に使用することができる。
　例えば、本発明の吸着材が充填されたバッグに採取した培養液を入れ、この中で培養液中のヒストンを吸着する方法、本発明の吸着材を充填したデバイスに培養液を循環させる方法、などが挙げられる。培養液は、細胞を分離した後、細胞培養液上澄みを処理してもよい。処理された培養液は、再度細胞培養に用いることもできる。なお、本発明の産業上の利用可能分野は、上記に限られないことはもちろんである。
　１００，２００…デバイス、１１０，２１０…円筒、１２０，１２０’…フィルター、１３０，１３０’…パッキン、１４０，２４０…入口ポート、１５０，１７０，２５０，２５０’…キャップ、１６０，２６０…出口ポート、１８０…全身炎症抑制用担体層、２２０…担体（吸着担体）、２３０…ポッティング剤、２７０…透析液導入口、２８０…透析液導出口。

Claims (15)

  1. 　生体由来液中よりヒストンを除去する吸着材であって、水不溶性の担体と、生体適合性ポリマーと、を備え、前記担体が、活性炭、ポリエステル、ポリスルホン、又はカチオン性官能基を備える担体のいずれかである吸着材。
  2. 　前記生体適合性ポリマーが、カチオン性官能基を備える、請求項１に記載の吸着材。
  3. 　前記担体の形状が、粒子状、不織布状、又は中空糸膜状である、請求項１又は２のいずれかに記載の吸着材。
  4. 　前記担体が、前記カチオン性官能基と、ポリエチレンテレフタレート又はスチレンジビニルベンゼン系共重合体のいずれかと、を備える、請求項１に記載の吸着材。
  5. 　前記カチオン性官能基がアミノ基である、請求項４に記載の吸着材。
  6. 　前記アミノ基が第４級アンモニウム基である、請求項５に記載の吸着材。
  7. 　前記生体適合性ポリマーが親水性ポリマーである、請求項１～６のいずれかに記載の吸着材。
  8. 　前記親水性ポリマーがヒドロキシエチルメタクリレート系重合体である、請求項７に記載の吸着材。
  9. 　前記生体適合性ポリマーがジメチルアミノエチルメタクリレートを１０モル％以上含むポリマーである、請求項１～７のいずれかに記載の吸着材。
  10. 　前記ヒストンがヒストンＨ３である、請求項１～９のいずれかに記載の吸着材。
  11. 　生体由来液中よりヒストンを除去する生体由来液浄化デバイスであって、体液入口、出口を備えたハウジングと、前記ハウジング内に収容された請求項１～１０のいずれかに記載の吸着材と、を備え、前記ハウジング内に前記生体由来液が流通されることにより、前記生体由来液から前記ヒストンが除去される、生体由来液浄化デバイス。
  12. 　前記生体由来液が体液である、請求項１１に記載の生体由来液浄化デバイス。
  13. 　前記体液が血液である、請求項１２に記載の生体由来液浄化デバイス。
  14. 　請求項１１～１３のいずれかに記載のデバイスを用いて生体由来液からヒストンを除去するヒストン除去方法。
  15. 　請求項１１～１３のいずれかに記載のデバイスを用いて、血液あるいは血漿を通過させ、血液あるいは血漿中からヒストン含有量を減量させ、全身性炎症反応症候群を治療する治療方法。
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