WO2016052519A1 - ケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１の吸着材、並びに吸着器 - Google Patents

ケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１の吸着材、並びに吸着器 Download PDF

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WO2016052519A1
WO2016052519A1 PCT/JP2015/077541 JP2015077541W WO2016052519A1 WO 2016052519 A1 WO2016052519 A1 WO 2016052519A1 JP 2015077541 W JP2015077541 W JP 2015077541W WO 2016052519 A1 WO2016052519 A1 WO 2016052519A1
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WO
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blood
adsorbent
hmgb1
adsorption
cytokines
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PCT/JP2015/077541
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English (en)
French (fr)
Inventor
覚 井上
健太郎 桐山
畑中　美博
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旭化成メディカル株式会社
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/36—Other treatment of blood in a by-pass of the natural circulatory system, e.g. temperature adaptation, irradiation ; Extra-corporeal blood circuits

Definitions

  • the present invention relates to an adsorbent for adsorbing and removing chemokines, cytokines and high mobility group box 1 (HMGB1) in blood, and an adsorber for adsorbing and removing cytokines and HMGB1 in blood using the adsorbent.
  • HMGB1 high mobility group box 1
  • Sepsis and systemic inflammation syndrome are caused by trauma or bacterial infection.
  • immune-competent cells such as macrophages respond as body defense reactions and attempt to protect the human body.
  • immunocompetent cells such as macrophages are known to produce various active substances.
  • Some of these active substances are proteins known as cytokines, and have recently been recognized as important mediators in controlling the pathology of sepsis and systemic inflammatory syndrome (SIRS).
  • cytokines are indispensable for maintaining the defense response and homeostasis of the living body, but if they are produced excessively in situations such as trauma or bacterial infection, they have adverse effects such as invasion of self cells and promotion of inflammation. It is known to affect. In pathological conditions such as sepsis and SIRS, cytokines are in an excessively produced state, and removal or inactivation of these cytokines is one option for treatment.
  • Patent Document 1 discloses a technique for imparting cationicity by introducing a hydrophilic amino group onto the surface of an adsorbent and removing cytokines from blood together with leukocytes.
  • Patent Document 2 by introducing a quaternary ammonium group or a linear amino group, the zeta potential on the adsorbent surface is set within a certain range to impart cationicity to the adsorbent surface.
  • Patent Document 3 discloses a technique for adsorbing cytokines by introducing a cationic substance or a physiologically active substance onto the surface of an anionic adsorbent such as polyethyleneimine.
  • chemokines having a molecular weight of about 8 kDa to 10 kDa are also attracting attention among cytokines as important factors affecting the pathology of sepsis and SIRS.
  • chemokines play a very important role in the cytokine network that causes excessive inflammatory conditions.
  • Patent Document 4 discloses a technique for adsorbing a chemokine, which is a kind of protein that is generally cationic under physiological conditions, by immobilizing an anionic functional group on the surface of an adsorbent by electrical interaction. .
  • Patent Document 5 discloses a technique for adsorbing a chemokine having a negative charge under physiological conditions by using a styrene-divinylbenzene copolymer as an adsorbent.
  • Patent Document 6 discloses a technique for adsorbing chemokines by hydrophobic interaction by immobilizing a compound having a logP (octanol-water partition count) of a certain value or more to the adsorbent to increase the hydrophobicity on the adsorbent surface. Disclosure.
  • high mobility group box 1 (HMGB1) with a molecular weight of 30 kDa has been found to be important in sepsis and SIRS inflammatory conditions.
  • Patent Documents 7 and 8 disclose an adsorbent for removing HMGB1 from the blood by extracorporeal circulation.
  • Patent Document 7 discloses a technique for removing HMGB1 by electrical or hydrophobic interaction by introducing a cationic, anionic functional group or hydrophobic functional group into an adsorbent.
  • Patent Document 8 discloses a technique for adsorbing and removing HMGB1 by hydrophobic interaction by increasing the hydrophobicity of the adsorbent surface.
  • Patent Document 9 discloses a cytokine removal technique using a porous adsorbent.
  • Patent Document 9 discloses a technique for reducing the blood concentration of an inflammatory substance by administering a necessary amount of a porous adsorbent into blood as a method for treating inflammation.
  • Non-patent documents 1, 2, and 3 disclose studies on the adsorption ability of cytokines using activated carbon that has been used for a long time as a porous adsorbent.
  • Non-Patent Documents 2 and 3 disclose techniques for removing specific cytokines from a buffer solution by using pores larger than mesopores among porous materials.
  • the present invention relates to an adsorbent for simultaneously adsorbing and removing chemokines, cytokines and HMGB1, while suppressing loss of useful proteins from the blood, and a chemokine, cytokine and HMGB1 adsorption / removal device using the adsorbent, and
  • An object of the present invention is to provide a method for removing chemokines, cytokines and HMGB1 while suppressing loss of useful proteins in blood by extracorporeal circulation using the adsorption remover.
  • septicemia and inflammation caused by SIRS are caused by trauma, bacterial infection, etc., and immunocompetent cells such as macrophages respond as a defense reaction, and chemokines are produced to infiltrate immune cells into somatic cells. Thereafter, a complex cytokine network is formed. Inflammatory states caused by these cytokines lead to self-tissue damage and organ failure, and nuclear proteins represented by HMGB1 are released. HMGB1 has also been found to exacerbate inflammatory conditions by invading tissues, and has attracted attention as a mediator that controls inflammation, which is very important together with cytokines.
  • HMGB1 In an inflammatory state in which HMGB1 is released as a result of the destruction of self tissue caused by cytokine release, it is generally said that a therapeutic effect cannot be expected only by inactivation or removal of a specific cytokine. This is presumably because various cytokines and HMGB1 are released in a complex manner in the inflammatory state and affect each other.
  • Patent Document 4 discloses a technique for adsorbing and removing chemokines from blood by immobilizing an anionic functional group on the surface of an adsorbent material by electrical interaction.
  • Patent Document 4 discloses only MIP-1a as a removable chemokine, and does not disclose the ability to adsorb and remove other chemokines.
  • Patent Document 5 discloses an adsorbent using a styrene-divinylbenzene copolymer for adsorbing and removing not only cationic chemokines but also anionic chemokines.
  • Patent Document 5 as in Patent Document 4, only MIP-1a exhibits the adsorption removal performance, whether or not other chemokines are adsorbed, and the concentration of chemokines in inflammatory conditions such as sepsis and SIRS. There is no disclosure of the ability to adsorb and remove plasma from plasma.
  • Patent Document 6 discloses a technique for adsorbing and removing chemokines by hydrophobic interaction by making the adsorbent surface hydrophobic.
  • the disclosure of the adsorption removal performance is only MIP-1a, and adsorption / removal of other chemokines, and chemokines at concentrations in inflammatory conditions such as sepsis and SIRS are removed by adsorption from plasma. The performance is not disclosed.
  • the conventional technique for removing HMGB1 from the blood with an adsorbent is to introduce an anionic, cationic, or hydrophobic functional group on the surface of the adsorbent. Is removed by adsorption. Also in these techniques, each functional group is optimized for the removal of HMGB1, and in the first place, there is no idea of removing cytokines at the same time, and in fact, it is unsuitable for simultaneous removal of cytokines.
  • Patent Documents 7 and 8 are not disclosed about techniques for adsorbing useful proteins in blood, which are important elements required for an adsorber that removes HMGB1 from blood. Not.
  • Patent Document 9 discloses a technique for removing unnecessary substances including blood cytokines by orally administering various polymer materials and porous materials.
  • the porous material disclosed in Patent Document 9 is a technique for removing many types of pathogenic substances including cytokines by mesopores and macropores, and the principle of cytokine adsorption is non-specific surface adsorption. Since the molecular weight of the cytokine is 8 to 51 kDa, it can be removed by pores in the mesopore region. However, in the examples, there is no description of which cytokine was adsorbed and removed by the adsorbent described in Patent Document 9, and HMGB1 Is not subject to removal.
  • Non-Patent Document 1 discloses the results of studies on the adsorption ability of cytokines such as IL-1b, IL-6, and TNF-a by activated carbon, but does not describe chemokine HMGB1. Moreover, there is no description about the detailed pore structure of mesopores and the adsorption characteristics of cytokines.
  • Non-Patent Document 2 discloses a study result that TNF- ⁇ , IL-6, IL-8, and IL-1 ⁇ in a phosphate buffer solution can be removed by an adsorbent having many pores having a pore diameter of 30 nm.
  • Non-Patent Document 3 discloses a study result that the adsorption ability of IL-1 ⁇ in a phosphate buffer solution is changed by changing the degree of activation of activated carbon and controlling the pore structure of activated carbon.
  • these research results do not mention that a useful protein in blood, which is an important element for an adsorbent for adsorbing and removing cytokines from blood, is not adsorbed.
  • the present inventors have found that the pore volume of pores having a pore diameter of 1 nm to 20 nm is 0.5 mL / g or more, and the surface area is 1000 to 1500 m 2 / g.
  • the present inventors have found that chemokines, cytokines and HMGB1 can be removed from blood while suppressing the above. That is, the present invention relates to the following inventions.
  • the adsorbent according to [1], comprising: a porous body provided with the above-mentioned pores; and a poorly blood-adherent polymer coated on the porous body.
  • An adsorber comprising the adsorbent according to any one of [4].
  • [6] A method for removing chemokines, cytokines and HMGB1 from blood, wherein the chemokines, cytokines and HMGB1 are removed by circulating blood through the adsorber according to [5].
  • an adsorbent and an adsorber that remove chemokines, cytokines, and HMGB1 while suppressing loss of useful proteins from inflammatory blood.
  • the adsorbent according to the present embodiment is an adsorbent having a porous solid structure for removing cytokines and high mobility group box 1 (HMGB1) from blood, and at least the surface thereof is difficult to adhere to blood.
  • the surface area is in the range of 1000 to 1500 m 2 / g, of which the outer surface area is 150 m 2 / g or more, and pores with a diameter of 1 to 20 nm are provided. g or more adsorbent.
  • an outer surface area means an area other than a pore part among the surface areas of an adsorbent. A method for measuring the surface area, outer surface area, and pore volume will be described later.
  • Cytokines and HMGB1 typified by interleukin (IL) -8, IL-1 ⁇ , and IL-6 are described in Rajarathnam, K. et al. (See Rajarathnam K. et al., Biochemistry, 34, 12983-12990, 1997).
  • IL interleukin
  • the molecular diameter increases according to the molecular weight
  • the cytokine having a molecular weight of 10 kDa or less such as IL-8 is 4 to 5 nm
  • the molecular weight such as IL-1 ⁇ is 10 to 10
  • a 20 kDa cytokine has a molecular diameter of 5 to 7 nm
  • a molecular weight such as IL-6 and HMGB1 of 20 kDa to 30 kDa and HMGB1 has a molecular diameter of 10 nm or more.
  • the pore volume is 0.5 mL / g or more.
  • the adsorbent has a surface area of 1000 to 1500 m 2 / g.
  • the present inventors limited the adsorption of the porous body to pores having a pore diameter of 1 to 20 nm for cytokines having a molecular weight of 30 kDa or more, such as IL-12 and tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ .
  • cytokines having a molecular weight of 30 kDa or more
  • TNF tumor necrosis factor
  • the outer surface area of the porous body is 150 m 2 / g or more.
  • the surface area of the adsorbent is, for example, a ratio of BET (Brunauer, Emmett, Teller; JIS Z 8830; powder (solid) by gas adsorption after measuring a nitrogen adsorption isotherm at a liquid nitrogen temperature (77 K) as shown in FIG. Surface area measurement method) It can be calculated using an analysis method. This method is commonly used for characterizing the surface of porous solids having micropores or mesopores. There are two methods for measuring the nitrogen adsorption isotherm: a volumetric method for calculating the amount of nitrogen adsorbed on the carrier due to a pressure drop of the nitrogen gas filled in the cell, and a gravimetric method for measuring the weight change of the carrier. There is no problem with either measurement.
  • the pore volume can be determined, for example, by using the nitrogen adsorption isotherm by the BJH method (Barrett-Joyner-Halenda; JIS Z 8831-2; pore size distribution and pore characteristics of powder (solid)-Part 2: Mesofine by gas adsorption
  • BJH method Barrett-Joyner-Halenda; JIS Z 8831-2; pore size distribution and pore characteristics of powder (solid)-Part 2: Mesofine by gas adsorption
  • the pore diameter distribution as shown in FIG. 2 is calculated by performing an analysis based on the measurement method of the pores and macropores, and the pore volume with respect to each pore diameter can be obtained by integration.
  • the external surface area is the area of a portion other than the portion provided with pores in the porous solid.
  • the t-plot method JIS8831-3; pore size of powder (solid) Distribution and pore characteristics--Part 3: Determination of micropores by gas adsorption, and Lippens (BC), de Boer (J. H., J Catalysis, 4, 319, 1965).
  • the adsorbent according to the present embodiment includes a porous body provided with pores and a blood poor adhesion polymer coated on the porous body, the surface area, the pore volume, and the outer surface area are , Measured against coated porous body.
  • the shape of the adsorbent is not limited as long as it has the above-mentioned pore structure, and may be any of particles, hollow fibers, fibers, nonwoven fabrics, sheets, etc., but from the viewpoint of contact area with blood Therefore, it is preferably in the form of particles or fibers.
  • the adsorbent When the adsorbent is in the form of particles, those having an average particle diameter of 100 to 1000 ⁇ m are preferable from the viewpoint of ensuring damage to blood and blood flowability.
  • the particle size is measured using, for example, a microwatcher such as a microscope or VHX900 manufactured by Keyence Corporation.
  • the particle diameter is arbitrary on the outline of the adsorbent when, for example, the particle adsorbent is dispersed in a petri dish or the like and observed with a microscope or a microwatcher at a magnification at which about 50 particles can be seen in one field of view. The length of the longest straight line between the two points.
  • the average particle size is, for example, a particle size of 25 randomly selected particles out of about 50 particles that can be seen in one field of view.
  • the fiber diameter is preferably 10 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less. This is because by setting the fiber diameter to 10 ⁇ m or more, it is possible to secure blood flowability and reduce damage to blood while maintaining mechanical strength.
  • the material of the adsorbent is not particularly limited as long as it is a material that does not elute upon contact with blood.
  • carbon materials such as cellulose, silica, and activated carbon can be used.
  • carbon materials such as activated carbon are preferably used from the viewpoint of controlling the pore diameter and surface area, and from the viewpoint of safety such as sterilization resistance when used as a medical device.
  • Measures for improving blood compatibility include a method in which a blood poor adhesion polymer is coated on the surface of activated carbon or the like.
  • the polymer to be coated for improving blood compatibility may be a hydrophilic polymer.
  • a hydrophilic polymer is a polymer which has hydrophilic groups, such as a hydroxyl group, a carbonyl group, and an aldehyde group, in a polymer, for example.
  • Examples of the hydrophilic polymer include polyalkylene glycol, ethylene vinyl alcohol, methyl betaine methacrylate, and polyester.
  • polyhydroxyethyl methacrylate p-HEMA
  • polyhydroxypropyl methacrylate p-HPMA
  • the coating polymer is polyhydroxybutyl methacrylate (p-HBMA)
  • 2-methoxyethyl (meth) acrylate MEMA
  • CMB methyl betaine methacrylate
  • the adsorption rate of albumin by an adsorbent that can be employed as a blood compatibility evaluation index can be calculated by measuring changes in albumin concentration in blood before and after contact with the adsorbent.
  • a detection method by the BCG method Bromcresol Green method
  • a detection kit using the BCG method measurement can be easily performed.
  • the adsorbent used in the blood purification field does not have a clear standard for albumin adsorption rate, but the adsorption blood purifier currently used in the blood purification field (Hemosorba CHS, manufactured by Asahi Kasei Medical) In general, it is required to be less than 10%, which is an albumin adsorption rate on activated carbon used in the above.
  • Cytokines are proteins with a molecular weight of 6 kDa to 100 kDa, but there are many types. For example, in order to verify the adsorption ability of the adsorbent according to the present embodiment for cytokines in a wide molecular weight region, the adsorption removal performance may be verified for the following six types of cytokines and HMGB1 (30 kDa).
  • IL-8 (8 kDa); IL-1 ⁇ (17 kDa); IL-6 (24.5 kDa); Vascular endothelial growth factor (VEGF, 38 kDa); TNF- ⁇ (single 17 kDa, but forms a trimer, so use 51 kDa as the molecular weight); IL-12 (70 kDa)
  • adsorption removal ability of cytokine and HMGB1 is evaluated by calculating the adsorption rate according to the following formula.
  • C B is the concentration of each cytokine and HMGB1 in plasma prior to contact with the adsorbent
  • C A is the concentration of each cytokine and HMGB1 in plasma after contact with the adsorbent.
  • Chemokines are cytokines that act on receptors of immune cells such as leukocytes during inflammation to induce migration of immune cells, and are relatively small proteins having a molecular weight of 8 kDa to 10 kDa. There are 50 types of chemokines that have just been identified. These chemokines are classified into two types, CC chemokines and CXC chemokines, based on their roles.
  • CC chemokines act on monocytes, lymphocytes, and eosinophils.
  • Ten receptors, CCR1-CCR10, have been identified as receptors for transmitting CC chemokine information, but CCR1 is a receptor involved in the main roles of monocytes, lymphocytes, eosinophil T cells, and NK cell migration. -CCR5.
  • CXC chemokines act on neutrophils. Although six types of CXCR1-CXCR6 have been identified as receptors for transmitting CXC chemokine information, CXCR1-CXC3 is a receptor involved in neutrophils, effector T cell mobilization, and platelet aggregation, which are major functions. . When evaluating chemokine adsorbents, the removal performance of the seven types of chemokines described in Table 1 below from the viewpoint of completeness of the types of immune cells on which chemokines act and the types of receptors related to the main functions. May be verified.
  • the removal rate of chemokine can be calculated by the same formula as the above formula used when obtaining the adsorption rate of cytokine and HMGB1.
  • Method for measuring blood chemokine, cytokine, and HMGB1 concentration examples include, for example, contacting each blood or plasma with a container in which antibodies against the respective chemokines, cytokines, and HMGB1 are immobilized, so that each of the chemokines, cytokines, and HMGB1 is specifically determined by antigen-antibody reaction
  • an ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) method can be used to measure blood concentration by fluorescence intensity by reacting the captured chemokines, cytokines, and HMGB1 with fluorescently labeled antibodies. Can be used.
  • cytokines and HMGB1 and 6 types of chemokines dedicated ELISA kits are sold, and they may be individually measured using them.
  • the same principle as the ELISA method can be used by immobilizing each antibody on a bead surface distinguished by a fluorescent label, such as human cytokine GI assay kit (Bio Rat Laboratories), and using mixed beads. A method for simultaneously measuring various cytokine concentrations may be used.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing an embodiment of the adsorber.
  • the device 100 is an adsorber module that connects to an extracorporeal circuit.
  • a cap 150 having an inlet port 140 is screwed into one end opening of the cylinder 110 via a packing 130 in which the filter 120 is pasted inside the one end opening of the cylinder 110.
  • a cap 170 having an outlet port 160 is screw-fitted into the multi-end opening of the cylinder 110 via a packing 130 ′ in which a filter 120 ′ is pasted inside the multi-end opening of the cylinder 110 to form a container.
  • the adsorbent is held in the gap between the filters 120 and 120 ′ of the container to form the cytokine and HMGB1 adsorbent layer 180.
  • the chemokine, cytokine and HMGB1 adsorbent layer 180 may be filled with the adsorbent according to the present embodiment alone, or may be mixed or laminated with other base materials.
  • the other base material for example, a base material that removes activated leukocytes or an adsorbent that adsorbs alarmin or the like that has recently attracted attention as an inflammatory mediator can be used. As a result, a wide range of clinical effects due to the synergistic effect of the base material can be expected.
  • the volume of the chemokine, cytokine and HMGB1 adsorbing substrate layer 180 can be 5 to 3000 mL.
  • the adsorber according to the present embodiment which can be connected to the blood extracorporeal circuit, is arranged in contact with the blood to be treated in the extracorporeal circuit, and can be used for systemic inflammatory disease treatment and the like.
  • chemokine, cytokine and HMGB1 adsorber can be effectively used to suppress or treat organ inflammation in diseases mediated by chemokine, cytokine and HMGB1.
  • Specific diseases include sepsis, septic shock, toxic shock syndrome, ischemia-reperfusion injury, adult respiratory distress syndrome (ARDS), rheumatoid arthritis, ventilatory arthritis, psoriasis, idiopathic pulmonary fibrosis, inflammatory Bowel disease, immune vasculitis, urinary tract infection, ulcerative colitis, contact dermatitis, asthma, muscle degeneration, Reiter's syndrome, diabetes, bone resorption, atherosclerosis, brain trauma, multiple sclerosis Muscular pain due to cerebral malaria, fever and psoriasis.
  • the adsorber according to the embodiment is not only a blood extracorporeal circulation method, but also a method that is not premised on returning to the same person who collected blood for treatment, for example, a method for producing a blood product, etc. Can also be used.
  • blood may be stored in the container.
  • the adsorber according to the embodiment can be used for a blood circulation method of an organ taken out for transplantation to another person. At this time, chemokines and cytokines in the blood of the organ are circulated by connecting the blood vessel of the organ and the adsorber according to the embodiment until the organ taken out for transplantation to the other person is transplanted. And HMGB1 can be removed.
  • Chemokines, cytokines, and HMGB1 are specifically produced when inflammation occurs in the human body, but are hardly produced in the normal state, and therefore are hardly present in the blood of a healthy person. Therefore, in order to evaluate the adsorption ability of the chemokine, cytokine and HMGB1 by the adsorbent, for example, inflammatory state blood equivalent to the blood of a patient in an inflammatory state is prepared.
  • Inflammatory state blood can be prepared by adding human genetically modified chemokines, cytokines, and HMGB1 to a blood concentration higher than that in the patient's blood, or adding endotoxin to the blood To release chemokines, cytokines and HMGB1 from leukocytes.
  • chemokines, cytokines and HMGB1 As a method for verifying the adsorption capacity of the adsorbent, there is no problem even if any method is adopted.
  • an inflammation model blood obtained by adding endotoxin to blood collected from a healthy person and then incubating for a certain period of time is filled with an adsorbent according to this embodiment, and the laboratory column has an inner diameter of 9 mm and a volume of 2.5 mL.
  • the adsorbent may be evaluated by passing the solution through a syringe pump (Mobitech Co., Ltd.).
  • Example 1 (Adsorbent preparation) The petroleum pitch-derived activated carbon (manufactured by Kureha) was impregnated and washed with 1N hydrochloric acid for 24 hours or more, then washed with hot water at 95 ° C. for 40 hours or more, and then dried. Further, primary coating was performed by immersing activated carbon in a p-HEMA coating solution prepared by dissolving p-HEMA (Eiko Co., Ltd.) in ethanol so that the polymer concentration was 1.1% for 4 hours or more. . Thereafter, the primary coated activated carbon was dried under reduced pressure, and then subjected to heat crosslinking treatment at 120 ° C. for 2 hours or more. Thereafter, the activated carbon was again subjected to secondary coating in the same manner as the primary coating, and then cooled with air to obtain an adsorbent.
  • p-HEMA coating solution prepared by dissolving p-HEMA (Eiko Co., Ltd.) in ethanol so that the polymer concentration was 1.1% for
  • Preparation of inflammation model plasma Lipopolysaccharide derived from Escherichia coli O-127 (manufactured by SIGMA-ALDRICH) was added to blood collected from healthy volunteers so that the blood concentration was 1.0 ⁇ 10 ⁇ 4 mg / mL. Thereafter, the mixture was incubated at 37 ° C. for 24 hours while mixing with shaking to prepare an inflammation model blood. After 24 hours of incubation, the sample was quickly centrifuged to collect plasma, which was used as sample plasma (hereinafter referred to as “pre-adsorption plasma sample B”).
  • adsorbent was added to a polypropylene tube. Before the addition, the adsorbent was weighed in a polypropylene tube so that the plasma / adsorbent ratio was 6 with respect to 3 mL of plasma. After the addition, the mixture was incubated for 1 hour with shaking and mixing at 37 ° C., and then plasma (hereinafter referred to as “post-adsorption plasma sample A”) was quickly collected.
  • HMGB1 concentration measurement test The pre-adsorption plasma sample B and post-adsorption plasma sample A were measured using HMGB1 ELISA KIT II (manufactured by Sinotest Co., Ltd.). As a result, the removal rate of HMGB1 by the prepared adsorbent was 60%.
  • Example 2 Using the same adsorbent as in Example 1 except that the pore volume of 1-20 nm pores determined by the BJH method is 0.8 mL / g and the BET surface area by the nitrogen adsorption method is 1250 m 2 / g, An adsorption test and blood compatibility evaluation were performed.
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 98%, IL-1 ⁇ ; 92%, IL-6; 80%, VEGF; 55%, TNF- ⁇ ; 55% IL-12; 48%, Eotaxin; 95%, IP-10; 97%, MCP-1; 95%, MIP-1a; 99%, MIP-1b; 98%, RANTES; 96%, HMGB1; 60% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.2 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 4.6%.
  • Example 3 Adsorption using the same adsorbent as in Example 1 except that the pore volume of 1-20 nm pores determined by the BJH method is 0.5 mL / g and the BET surface area by the nitrogen adsorption method is 1500 m 2 / g. Tests and blood compatibility evaluations were performed.
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 98%, IL-1 ⁇ ; 95%, IL-6; 80%, VEGF; 55%, TNF- ⁇ ; 55% IL-12; 47%, Eotaxin; 95%, IP-10; 96%, MCP-1; 97%, MIP-1a; 95%, MIP-1b; 96%, RANTES; 95%, HMGB1; 60% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.1 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 6.8%.
  • Example 4 Example 1 except that the coating polymer on the adsorbent surface is ethylene vinyl alcohol (Kuraray Co., Ltd. EVAL (registered trademark) F104B) and the outer surface area determined by the t-plot method is 150 m 2 / g. Adsorption tests and blood compatibility evaluations were performed using similar adsorbents and methods.
  • EVAL registered trademark
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 95%, IL-1 ⁇ ; 90%, IL-6; 75%, VEGF; 58%, TNF- ⁇ ; 50% IL-12; 45%, Eotaxin; 98%, IP-10; 97%, MCP-1; 95%, MIP-1a; 95%, MIP-1b; 96%, RANTES; 97%, HMGB1; 55% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.2 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 4.6%.
  • Example 5 Example 2 except that the coating polymer on the adsorbent surface is ethylene vinyl alcohol (Kuraray Co., Ltd. EVAL (registered trademark) F104B) and the outer surface area determined by the t-plot method is 150 m 2 / g. Adsorption tests and blood compatibility evaluations were performed using similar adsorbents and methods.
  • EVAL registered trademark
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 98%, IL-1 ⁇ ; 93%, IL-6; 82%, VEGF; 56%, TNF- ⁇ ; 50% IL-12; 46%, Eotaxin; 95%, IP-10; 97%, MCP-1; 96%, MIP-1a; 98%, MIP-1b; 99%, RANTES; 97%, HMGB1; 55% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.2 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 4.6%.
  • Example 6 Example 3 except that the coating polymer on the adsorbent surface is ethylene vinyl alcohol (Kuraray Co., Ltd. EVAL (registered trademark) F104B) and the outer surface area determined by the t-plot method is 150 m 2 / g. Adsorption tests and blood compatibility evaluations were performed using similar adsorbents and methods.
  • EVAL registered trademark
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 97%, IL-1 ⁇ ; 95%, IL-6; 80%, VEGF; 54%, TNF- ⁇ ; 50% IL-12; 45%, Eotaxin; 96%, IP-10; 97%, MCP-1; 97%, MIP-1a; 95%, MIP-1b; 96%, RANTES; 95%, HMGB1; 55% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.1 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 6.8%.
  • Example 7 The adsorption test and blood compatibility evaluation were performed using the same adsorbent and method as in Example 1 except that the coating polymer on the adsorbent surface was p-HPMA.
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 95%, IL-1 ⁇ ; 91%, IL-6; 74%, VEGF; 57%, TNF- ⁇ ; 51% IL-12; 45%, Eotaxin; 98%, IP-10; 97%, MCP-1; 95%, MIP-1a; 95%, MIP-1b; 96%, RANTES; 96%, HMGB1; 61% Met.
  • the plasma albumin concentrations before and after adsorption were 4.4 g / dL and 4.2 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 4.6%.
  • Example 8 An adsorption test and blood compatibility evaluation were performed using the same adsorbent and method as in Example 1 except that the coating polymer on the adsorbent surface was p-HBMA.
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 96%, IL-1 ⁇ ; 90%, IL-6; 74%, VEGF; 56%, TNF- ⁇ ; 50% IL-12; 46%, Eotaxin; 99%, IP-10; 96%, MCP-1; 95%, MIP-1a; 95%, MIP-1b; 96%, RANTES; 99%, HMGB1; 60% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.2 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 4.6%.
  • Example 9 The coating polymer on the adsorbent surface is a copolymer of 2-methoxyethyl (meth) acrylate (MEMA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and methyl betaine methacrylate (CMB, Osaka Organic Chemical Industries, Ltd.) Except that, the same adsorbent as in Example 1 was produced.
  • MEMA 2-methoxyethyl (meth) acrylate
  • CMB methyl betaine methacrylate
  • the copolymer of MEMA and CMB was synthesized by ordinary solution polymerization.
  • a polymerization reaction was performed at 60 ° C. for 8 hours in an ethanol solution having a monomer concentration of 1 mol / L in the presence of 0.0025 mol / L of azoisobutyronitrile (AIBN) as an initiator.
  • AIBN azoisobutyronitrile
  • the obtained polymer polymerization solution was dropped into water, and the precipitated polymer was collected.
  • the recovered polymer was pulverized and then dried under reduced pressure for 24 hours to obtain a coating polymer.
  • the chemokine, cytokine and HMGB1 adsorption rate by the prepared adsorbent was IL-8; 95%, IL-1 ⁇ ; 91%, IL-6; 73%, VEGF; 59%, TNF- ⁇ ; 51% IL-12; 46%, Eotaxin; 97%, IP-10; 97%, MCP-1; 96%, MIP-1a; 95%, MIP-1b; 97%, RANTES; 96%, HMGB1; Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.2 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 4.6%.
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 30%, IL-1 ⁇ ; 20%, IL-6; 20%, VEGF; 20%, TNF- ⁇ ; 10% , IL-12; 10%, Eotaxin; 25%, IP-10; 30%, MCP-1; 30%, MIP-1a; 25%, MIP-1b; 30%, RANTES; 30%, HMGB1; 20% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 3.7 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 15.9%.
  • the adsorption rate of cytokine and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 85%, IL-1 ⁇ ; 65%, IL-6; 60%, VEGF; 55%, TNF- ⁇ ; 55%, IL -12; 45%, HMGB1; 58%.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 3.7 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 15.9%.
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 95%, IL-1 ⁇ ; 89%, IL-6; 70%, VEGF; 55%, TNF- ⁇ ; 50% IL-12; 45%, Eotaxin; 94%, IP-10; 96%, MCP-1; 95%, MIP-1a; 95%, MIP-1b; 94%, RANTES; 95%, HMGB1; 60% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 3.5 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 20.5%.
  • the adsorption rate of cytokine and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 80%, IL-1 ⁇ ; 70%, IL-6; 65%, VEGF; 55%, TNF- ⁇ ; 55%, IL -12; 48%, HMGB1; 55%.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 3.8 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 13.6%.
  • the adsorption rate of cytokine and HMGB1 by the prepared adsorbent was IL-8; 98%, IL-1 ⁇ ; 92%, IL-6; 80%, VEGF; 30%, TNF- ⁇ ; 25%, IL -12; 20%, HMGB1; 30%.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 4.2 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 4.6%.
  • Nonporous carbon black # 32 (Mitsubishi Chemical Corporation) having a pore volume of 1 to 20 nm determined by the BJH method of 0 mL / g and a BET surface area of 85 m 2 / g by the nitrogen adsorption method was used. Because of the non-porous carbon black, the outer surface area was 85 m 2 / g, the same as the BET surface area. Otherwise, the adsorption test and blood compatibility evaluation were performed using the same methods as in Example 1.
  • the adsorption rate of chemokines, cytokines and HMGB1 by the adsorbent used was IL-8; 15%, IL-1 ⁇ ; 15%, IL-6; 15%, VEGF; 20%, TNF- ⁇ ; 20% , IL-12; 15%, Eotaxin; 10%, IP-10; 10%, MCP-1; 10%, MIP-1a; 15%, MIP-1b; 10%, RANTES; 10%, HMGB1; 15% Met.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the adsorbent used were 4.4 g / dL and 3.8 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 13.6%.
  • Example 9 Except that the pore volume of 1-20 nm pores determined by the BJH method is 0.4 mL / g, the BET surface area by the nitrogen adsorption method is 1000 m 2 / g, the outer surface area is not measurable, and the polymer is not coated.
  • the same adsorbent and method as in Example 1 were used for the adsorption test and blood compatibility evaluation.
  • the chemokine adsorption rate by the produced adsorbent was IL-8; 65%, Eotaxin; 70%, IP-10; 65%, MCP-1; 70%, MIP-1a; 70%, MIP-1b 70%, RANTES; 75%.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 3.5 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 20.5%.
  • Example 10 Except that the pore volume of 1-20 nm pores determined by the BJH method is 0.4 mL / g, the BET surface area by the nitrogen adsorption method is 1600 m 2 / g, the outer surface area is not measurable, and the polymer is not coated
  • the same adsorbent and method as in Example 1 were used for the adsorption test and blood compatibility evaluation.
  • the chemokine adsorption rate by the produced adsorbent was IL-8; 65%, Eotaxin; 70%, IP-10; 65%, MCP-1; 70%, MIP-1a; 70%, MIP-1b 70%, RANTES; 75%.
  • the albumin concentrations in plasma before and after adsorption by the produced adsorbent were 4.4 g / dL and 3.5 g / dL, respectively, and the adsorption rate was 20.5%.
  • FIG. 4 and FIG. 5 show the evaluation results of the pore structure, chemokine, cytokine and HMGB1 adsorption rate, and albumin adsorption rate of the adsorbents in Examples and Comparative Examples.

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Abstract

　血液難付着性であり、細孔径１ｎｍ～１０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ以上であり、表面積が１０００ｍ2／ｇ以上１５００ｍ2／ｇ以下であり、外表面積が１５０ｍ2／ｇ以上である多孔性構造を有する吸着材を提供する。また、当該吸着材を用いたケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着器であって、血液中の有用成分の濃度の低下を抑制しながら、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する除去器を提供する。

Description

ケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１の吸着材、並びに吸着器
　本発明は、血液中のケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を吸着除去するための吸着材、並びに当該吸着材を用いた血液中のサイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着除去用吸着器に関する。本出願は、日本国に２０１４年９月２９日に出願された特願２０１４－１９９２１９号、及び日本国に２０１４年９月２９日に出願された特願２０１４－１９９２２２号に基づく優先権を主張し、当該日本出願に記載された全ての記載内容を援用するものである。
　敗血症や全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）は、外傷や細菌感染等によって引き起こされる。これらの全身炎症状態では、体の防御反応としてマクロファージ等の免疫担当細胞が応答し、人体を防御しようと試みる。このような免疫応答の際に、マクロファージ等の免疫担当細胞は種々の活性物質を産生する事が知られている。これら活性物質の一部はサイトカインとして知られるタンパク質であり、近年、敗血症や全身炎症性症候群（ＳＩＲＳ）の病態を制御する上で重要なメディエイターとして認識されるようになってきた。
　これらサイトカインは、生体の防御反応や恒常性の維持に必要不可欠なものであるが、外傷や細菌感染等の事態に際して過剰に産生されると、自己細胞への侵襲や炎症の促進等の悪影響を及ぼすことが知られる。敗血症やＳＩＲＳ等の病態では、サイトカインが過剰に産生された状態にあり、これらのサイトカインを除去や失活させることが治療方法の一つの選択肢となっている。
　敗血症やＳＩＲＳの際にサイトカインを失活させる治療方法として、特定のサイトカイン抗体を敗血症やＳＩＲＳ患者へ投与することが試みられている。
　血中サイトカインを除去する吸着材についての検討は数多くなされている。特許文献１においては、吸着剤表面上へ親水性アミノ基を導入する事でカチオン性を付与し、白血球と共にサイトカインを血液中より除去する技術が開示されている。特許文献２においても同様に、第４級アンモニウムや直鎖状アミノ基を導入することにより吸着材表面上のゼ－タ電位を一定範囲にする事で吸着材表面にカチオン性を付与し、単球、及び顆粒球と共にサイトカインを血液中より除去する技術が開示されている。特許文献３においては、ポリエチレンイミン等のアニオン性の吸着材の表面へカチオン性物質や生理活性物質を導入する事で、サイトカインを吸着する技術が開示されている。
　また、近年、敗血症やＳＩＲＳの病態を左右する重要な因子として、サイトカインの中でも分子量が約８ｋＤａ－１０ｋＤａであるケモカインについても注目されている。
　生体が外傷や細菌等による侵襲を受けると、生体防御反応として炎症が引き起こされ、白血球の炎症部位への浸潤が生じる。炎症部位への白血球の浸潤はケモカインにより引き起こされることが知られており、過剰な炎症状態を引き起こすサイトカインネットワークにおいてケモカインが非常に重要な役割を果たしている事が明らかになってきている。
　ケモカインを血中より体外循環により除去する方法として、前述するサイトカインを除去する方法と同様に吸着材表面にカチオン性を持たせることで、電気的相互作用によりケモカインを除去する技術が数多く開示されている。
　特許文献４は、吸着材表面上へアニオン性官能基を固定することにより、一般に生理的条件下ではカチオン性であるタンパク質の一種であるケモカインを電気的相互作用により吸着する技術を開示している。
　特許文献５は、吸着材のスチレン－ジビニルベンゼン共重合体を用いることで、生理的条件下において負電荷をもつケモカインを吸着する技術を開示している。
　特許文献６は、吸着材へｌｏｇＰ（オクタノール－水系の分配計数）が一定値以上の化合物を固定して吸着材表面上の疎水性を上げることで、疎水性相互作用によりケモカインを吸着する技術を開示している。
　サイトカインやケモカインに加え、近年では、放出されたサイトカインが自己組織を侵襲、破壊した結果、細胞内部より放出される核タンパク質の一種であるハイモビリティグループタンパクが炎症状態の増悪に寄与している事が明らかになり、重要なメディエイターとして注目されている。
　ハイモビリティグループタンパクの中でも、分子量が３０ｋＤａのハイモビリティグル－プボックス１（ＨＭＧＢ１）が、敗血症やＳＩＲＳの炎症状態において重要である事が明らかになっている。
　特許文献７、８は、ＨＭＧＢ１を血中より体外循環により除去するための吸着剤を開示している。特許文献７では、カチオン性、アニオン性官能基若しくは疎水性官能基を吸着材へ導入することによって、電気的若しくは疎水性相互作用によりＨＭＧＢ１を除去する技術が開示されている。特許文献８においては、吸着材表面の疎水性を高めることによって、疎水性相互作用によりＨＭＧＢ１を吸着除去する技術が開示されている。
　また、これら電気的相互作用や疎水性相互作用によりサイトカインを除去する方法に加え、特許文献９には多孔性の吸着材によるサイトカイン除去技術が開示されている。特許文献９では、炎症を治療する方法として、多孔性の吸着材を必要量血中へ投与することにより炎症性物質の血中濃度を低下させる技術が開示されている。
　多孔性の吸着材として古くから活用されている活性炭を用いた、サイトカインに関する吸着能についての研究は、非特許文献１、２、３に開示されている。
　非特許文献２、３については、多孔性体の中でもメソ細孔よりも大きな細孔を用いることで緩衝液中より特定のサイトカインを除去する技術を開示している。
特開２００７－２２２５９６号公報 特開２００６－３１２８０４号公報 特開２００４－１８９７２４号公報 特開平９－２５３２００号公報 特開平９－２５３２０１号公報 特開平９－３１３６０４号公報 国際公開第０１／０７４４２０号 特開２００７－２９５１１号公報 特表２０１３－５２３７７２号公報
S.Yachamaneni et al., "Mesoporous Carbide-derived Carbon for Cytokine removal from blood plasma", Biomaterials, 31 4789-4794, 2010(DOI: 10.1016/j.biomaterials.2010.02.054) S. R. Sandeman et al., "Inflammatory cytokine removal by an activated carbon device in a flowing system", Biomaterials, 29,1633-1644, 2008(DOI:10.1016/j.biomaterials.2007.12.013) D. J. Malik et al., "Preparation of novel mesoporous carbons for the adsorption of an inflammatory cytokine (IL-1b)", Biomaterials, 25, 2933-2940, 2004 (DOI: 10.1016/j.biomaterials.2003.09.076)
　本発明は、血液中より、有用タンパク質の損失を少なく抑えつつ、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を同時に吸着除去するための吸着材、並びに当該吸着材を用いたケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着除去器、及び前記吸着除去器を用いて体外循環により血液中の有用タンパク質の損失を少なく抑えつつ、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する方法を提供することを目的とする。
　上述の様に、敗血症やＳＩＲＳによる炎症状態は、外傷や細菌感染等により引き起こされ、防御反応としてマクロファージ等の免疫担当細胞が応答し、免疫細胞を体細胞内に浸潤させるためにケモカインが産生され、その後に、複雑なサイトカインネットワークが形成される。これらサイトカインによって引き起こされる炎症状態により自己組織損傷や臓器不全に至り、ＨＭＧＢ１に代表される核タンパク質が放出される。ＨＭＧＢ１もまた組織を侵襲する事で、炎症状態を増悪させることが分かってきており、サイトカインと共に非常に重要な炎症を制御するメディエイターとして注目を集めている。
　サイトカイン放出により引き起こされた、自己組織の破壊の結果としてＨＭＧＢ１が放出された炎症状態においては、特定のサイトカインの失活や除去だけでは治療効果が望めないことが一般的にいわれている。これは、炎症状態では、様々なサイトカインやＨＭＧＢ１が複雑に放出され、お互いに影響を及ぼしているためと考えられている。
　サイトカインを吸着材により血液中から除去する従来技術は、特許文献１～３に開示されているように、吸着材表面にアニオン性、カチオン性、又は疎水性官能基や、生理活性物質を導入する事で、電気的作用、疎水性相互作用、あるいは抗原抗体相互作用で、サイトカインを吸着除去する。しかしながら、これらの官能基や生理活性物質を導入した吸着材は、特定のサイトカインに対しては特異性が高く吸着能力が高いが、サイトカインの電荷や疎水性が様々であるため、多種のサイトカインを同時に除去することはできず、全身炎症状態の治療法としては、不適であった。またサイトカインと同時にＨＭＧＢ１も除去するという考えもなかった。
　更にケモカインについても、特許文献４において吸着材表面にアニオン性官能基を固定させることにより、電気的相互作用により、血液中からのケモカインを吸着除去する技術が特許文献４に開示されている。しかしながら、特許文献４中には、除去可能なケモカインとしてＭＩＰ－１ａのみしか開示されておらず、他のケモカインの吸着除去能については開示されていない。
　また、特許文献５では、カチオン性のケモカインだけではなく、アニオン性のケモカインをも吸着除去するために、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体を用いた吸着材を開示している。しかしながら、特許文献５も、特許文献４と同様に、吸着除去性能を示しているのはＭＩＰ－１ａのみであり、他のケモカインについての吸着可否、及び敗血症やＳＩＲＳなどの炎症状態における濃度のケモカインを血漿から吸着除去する性能については開示していない。
　特許文献６においては、吸着剤表面を疎水性にすることにより、疎水性相互作用によりケモカインを吸着除去する技術を開示している。しかしながら、特許文献４、５と同様に吸着除去性能についての開示はＭＩＰ－１ａのみであり、他のケモカインについての吸着可否、及び敗血症やＳＩＲＳなどの炎症状態における濃度のケモカインを血漿から吸着除去する性能については開示していない。
　ＨＭＧＢ１を吸着材により血中から除去する従来技術は、特許文献７、８に開示されているように、吸着材の表面にアニオン性、カチオン性、又は疎水性官能基を導入することにより、ＨＭＧＢ１を吸着除去するものである。これらの技術においても、ＨＭＧＢ１の除去のために各官能基を最適化しており、そもそもサイトカインを同時に除去する考えは無く、また実際、サイトカインの同時除去には不適である。
　加えて、特許文献７、８に開示されている吸着剤については血液中からＨＭＧＢ１を除去する吸着器に要求される重要な要素である血中の有用なタンパク質などを吸着させない技術については開示されていない。
　特許文献９では、血液のサイトカインを含む不要物を様々なポリマー材料や多孔性材料を経口投与することで取り除く技術が開示されている。特許文献９に開示される多孔性体はメソ細孔、マクロ細孔によりサイトカインを含む多種類の病原物質を除去する技術であり、サイトカインの吸着原理は非特異的表面吸着であるとし、大半のサイトカインの分子量が８～５１ｋＤａである事からメソ細孔領域の細孔で除去できるとしているが、実施例において特許文献９記載の吸着剤に何れのサイトカインが吸着除去されたかは記載がなく、ＨＭＧＢ１については除去対象になっていない。
　また、非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３には、多孔性固体によりサイトカインを除去する研究が開示されている。非特許文献１では活性炭によるＩＬ－１ｂやＩＬ－６、ＴＮＦ－ａといったサイトカインの吸着能の研究結果を開示しているが、ケモカインＨＭＧＢ１についての記載はない。また、メソ細孔の詳細な細孔構造とサイトカインの吸着特性についての記載はない。非特許文献２には、細孔径が３０ｎｍの細孔を多く有する吸着剤によりリン酸緩衝液中のＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－８，ＩＬ－１βが除去できる研究結果を開示している。非特許文献３においては、活性炭の賦活化度を変えて、活性炭の細孔構造を制御することで、リン酸緩衝液中のＩＬ－１βの吸着能が変化する研究結果を開示している。しかし、これら研究結果においても血液中からサイトカインを吸着除去する吸着剤にとって重要な要素である血中有用タンパク質を吸着させない点については言及していない。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、細孔径１ｎｍ～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ以上であり、表面積が１０００～１５００ｍ2／ｇであり、外表面積が１５０ｍ2／ｇ以上であるように多孔性吸着剤の構造を制御し、かつ、多孔性吸着材の表面を血液難付着性とすることによって、血液中の有用なタンパクの損失を抑えつつ、血液中からケモカイン、サイトカインとＨＭＧＢ１を除去できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下の各発明に関する。
　［１］血液中からケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を除去するための多孔性構造を有する吸着材であって、少なくとも表面が血液難付着性であり、表面積が１０００ｍ2／ｇ以上１５００ｍ2／ｇ以下であり、外表面積が１５０ｍ2／ｇ以上であり、径が１ｎｍ～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ以上である吸着材。
　［２］上記の細孔が設けられた多孔性体と、多孔性体にコートされた血液難付着性ポリマーと、を備える、［１］に記載の吸着材。
　［３］多孔性体が活性炭である、［２］に記載の吸着材。
　［４］血液難付着性ポリマーが、ポリヒドロキシエチルメタクリレートである、［２］又は［３］に記載の吸着材。
　［５］血液中よりケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を除去するための血液浄化用吸着器であって、血液の入口と出口とを有するハウジングと、ハウジングに収容された［１］ないし［４］のいずれかに記載の吸着材とを備える吸着器。
　［６］血液中よりケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する方法であって、［５］に記載の吸着器へ血液を流通させる事により、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する方法。
　［７］血液が容器に収納されている、［６］に記載の方法。
　［８］血液が人体より取り出された移植用臓器の血液である、［６］に記載の方法。
　［９］血液中よりケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する方法であって［５］に記載の吸着器を用いて血液を体外循環することにより、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する方法
　本発明によれば、炎症状態の血液より、有用タンパク質を損失を少なく抑えつつ、ケモカイン、サイトカイン、及びＨＭＧＢ１を除去する吸着材、並びに吸着器を提供することができる。
本発明の実施形態及び実施例１に係るコーティングされた活性炭を備える吸着材の窒素吸着等温線を示すグラフである。 図１に示す窒素吸着等温線よりＢＪＨ法により求めた、コーティングされた活性炭を備える吸着材の細孔径分布を示すグラフである。 本発明の実施形態に係るサイトカイン吸着器の断面図である。 本発明の実施例の結果を示す表である。 本発明の比較例の結果を示す表である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　（多孔性吸着材）
　本実施形態に係る吸着材は、血液中からサイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を除去するための多孔性固体構造を有する吸着材であって、少なくとも表面が血液難付着性であり、その表面積が１０００～１５００ｍ2／ｇの範囲にあり、このうち外表面積が１５０ｍ2／ｇ以上であり、径が１～２０ｎｍの細孔が設けられており、当該細孔の容量が０．５ｍＬ／ｇ以上ある吸着材である。なお、外表面積とは、吸着材の表面積のうち、細孔部分の以外の面積をいう。表面積、外表面積、及び細孔容量の測定方法は後に記す。
　インターロイキン（ＩＬ）－８、ＩＬ－１β、及びＩＬ－６に代表されるサイトカインやＨＭＧＢ１は、Rajarathnam, K.ら(Rajarathnam K. et al., Biochemistry, 34, 12983-12990, 1997参照。)、Hinterdorfer, P.ら（Hinterdorfer P., et al., Proc Natl Acad Sci USA,93, 3477-3481,1996参照。）、及びEinspahr H.ら（Einspahr H. et al., J Cryst Growth, 90,180-187,1988参照。）の解析結果によると、分子量に応じて分子直径が大きくなり、ＩＬ－８のような分子量が１０ｋＤａ以下のサイトカインは４～５ｎｍ、ＩＬ－１βのような分子量が１０～２０ｋＤａのサイトカインでは５～７ｎｍ、ＩＬ－６やＨＭＧＢ１のような分子量が２０ｋＤａ～３０ｋＤａのサイトカインやＨＭＧＢ１では１０ｎｍ以上の分子直径を有している。このことから、吸着材に細孔径が１ｎｍ未満のミクロ孔が多く存在しても、サイトカイン分子自体が細孔よりも大きいために、吸着材に吸着することが出来ない。実際、薬物中毒治療用の活性炭を用いてのサイトカイン吸着能を検討した結果では、活性炭に存在する細孔のほとんどが細孔径１ｎｍ未満のミクロ孔であるため低い吸着率しか示していない（Nagaki M. et al., Circulatory Shock, 38, 182-188, 1992参照）。
　本実施形態に係る多孔性の吸着材においては、分子量６ｋＤａ～３０ｋＤａ程度の多種のサイトカイン及びＨＭＧＢ１を吸着除去するという観点から、ミクロ孔とメソ細孔領域に属する細孔径１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ以上である。また、細孔径１～２０ｎｍの細孔の数の観点から、吸着材の表面積が１０００～１５００ｍ2／ｇである。
　さらに、本発明者らは、ＩＬ－１２や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αのような分子量が３０ｋＤａ以上のサイトカインについては、多孔性体の細孔径１～２０ｎｍの細孔への吸着は限定的であるが、多孔性体の外表面積を１５０ｍ2／ｇ以上とすることで、多孔性体の吸着能を確保することができることを見出した。そのため、本実施形態に係る多孔性の吸着材においては、外表面積が１５０ｍ2／ｇ以上である。
　（吸着材細孔構造）
　吸着材の表面積は、例えば図１に示すような液体窒素温度（７７Ｋ）における窒素吸着等温線を測定した後に、ＢＥＴ（Ｂｒｕｎａｕｅｒ，Ｅｍｍｅｔｔ，Ｔｅｌｌｅｒ；ＪＩＳ　Ｚ　８８３０；気体吸着による紛体（固体）の比表面積測定方法）解析法を用いて算出することができる。当該方法は、ミクロ孔やメソ細孔を有する多孔性固体の表面のキャラクタリゼーションに一般的に用いられている。窒素吸着等温線の測定法には、セル内に充填した窒素ガスの圧力低下により担体へ吸着した窒素の量を算出する容量法、担体の重量変化を測定する重量法の２種があるが、どちらを用いて測定しても問題はない。
　細孔容量は、例えば、上記窒素吸着等温線をＢＪＨ法（Ｂａｒｒｅｔｔ－Ｊｏｙｎｅｒ－Ｈａｌｅｎｄａ；ＪＩＳ　Ｚ　８８３１－２；紛体（固体）の細孔径分布及び細孔特性－第２部：ガス吸着によるメソ細孔及びマクロ細孔の測定方法）に依る解析を行うことで図２に示すような細孔径分布を算出し、各細孔径に対する細孔容量を積算して求めることができる。
　外表面積とは、多孔性固体において細孔が設けられた部分以外の部分の面積であり、例えば、上記窒素吸着等温線に基づいてｔ－ｐｌｏｔ法（ＪＩＳ８８３１－３；紛体（固体）の細孔径分布及び細孔特性-第３部ガス吸着によるミクロ細孔の測定方法、及びLippens B.C., de Boer J. H., J Catalysis, 4, 319, 1965参照）によって求めることができる。
　なお、本実施形態に係る吸着材が、細孔が設けられた多孔性体と、多孔性体にコートされた血液難付着性ポリマーと、を備える場合、表面積、細孔容量、及び外表面積は、コートされた多孔性体に対して測定される。
　（吸着材の形状）
　吸着材の形状は、上記の細孔構造を有していれば限定はされず、粒子状、中空糸状、繊維状、不織布状、及びシート状などいずれでもよいが、血液との接触面積の観点から、粒子状又は繊維状であることが好ましい。
　吸着材が粒子状である場合には、血液へ与えるダメージや血液の流れ性の確保の観点から平均粒子径１００～１０００μｍのものが好ましい。粒子径は、例えば、顕微鏡やキーエンス社製ＶＨＸ９００のようなマイクロウォッチャーを用いて測定する。粒子径は、例えば、シャーレ等に粒子状吸着材を分散させた後、顕微鏡やマイクロウォッチャーで１視野に５０個程度の粒子が見える倍率に設定して観察した場合の吸着材の輪郭上の任意の２点を結ぶ直線の内、もっとも長い直線の長さをいう。また、平均粒子径とは、例えば、１視野に見える５０個程度の粒子の内、無作為に選択した２５個の粒子の粒子径を測定し、無作為に選択した重複しない４視野分、計１００個の粒子径の算術平均をいう。
　吸着材が繊維状である場合には、繊維径が１０μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましい。繊維径を１０μｍ以上とすることで、機械的強度を維持しつつ血液の流れ性の確保や血液へ与えるダメージを低減できるためである。
　（吸着材の材質）
　吸着材の材質は、血液と接触して溶出しない材質であれば特に限定されない。例えば、セルロース、シリカ、及び活性炭等の炭素材料などが用いられうる。これらのうち、細孔径や表面積の制御の観点、医療用具とする際の耐滅菌性等の安全性の観点から、好ましくは活性炭等の炭素材料が用いられる。
　活性炭等の炭素材料表面は疎水性が高いため、血液中の有用なタンパク質との相互作用が強く、材料表面に付着することにより血中濃度の低下の可能性がある。吸着材表面に有用なタンパクを付着させないためには、表面の血液適合性を上げることにより、血液難付着性とする。
　血液適合性を向上させる手段として、血液難付着性ポリマーを活性炭等の表面上へコートしておく方法が挙げられる。血液適合性を向上させるためにコートするポリマーは、親水性のポリマーであればよい。親水性のポリマーとは、例えば、重合体中にヒドロキシル基、カルボニル基、及びアルデヒド基等の親水基を有しているポリマーである。親水性のポリマーの例としては、ポリアルキレングリコール、エチレンビニルアルコール、メタクリル酸メチルベタイン、及びポリエステル等が挙げられる。より具体的には、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐ－ＨＥＭＡ）、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート（ｐ－ＨＰＭＡ）、コートポリマーがポリヒドロキシブチルメタクリレート（ｐ－ＨＢＭＡ）、並びに２－メトキシエチル（メタ）アクリレート（ＭＥＭＡ）とメタクリル酸メチルベタイン（ＣＭＢ）の共重合体等が挙げられる。これらのうち、経済性、取扱の簡便性から、親水性の水不溶高分子材料であるｐ－ＨＥＭＡを用いることが好ましい。
　（血液適合性評価手法）
　吸着材の血液適合性を反映する指標として、血液中の有用タンパク質濃度の変化が挙げられる。血液中には、生体の維持のために不可欠なタンパク質が多数存在し、吸着材との接触によりこれら有用タンパク質の濃度が大きく変化することは好ましくない。アルブミン、及びフィブリノーゲン等が血液中の有用タンパク質の代表的な例であり、吸着材にこれらのタンパク質が吸着することは抑制されることが好ましい。
　例えば、血液適合性評価指標として採用することが可能である吸着材によるアルブミンの吸着率は、吸着材に接触させた前後の血液中のアルブミン濃度変化を測定して算出することができる。血液中のアルブミン濃度の測定方法としてはＢＣＧ法（ブロムクレゾールグリーン法）による検出方法を用いることができる。ＢＣＧ法を利用した検出キットとしてＡ／Ｇ　Ｂテストワコー（和光純薬工業株式会社製）等の市販品キットを用いることで簡便に測定が可能である。
　血液浄化分野で使用される吸着材について、アルブミンの吸着率に関する明確な規格基準は定められていないが、血液浄化分野で現在使用されている吸着型血液浄化器（ヘモソーバＣＨＳ、旭化成メディカル社製）に用いられている活性炭へのアルブミン吸着率である１０％を下回る事が、一般に要求されている。
　（サイトカイン及びＨＭＧＢ１）
　サイトカインは分子量が６ｋＤａ～１００ｋＤａのタンパク質であるが、その種類は多数に及ぶ。例えば、幅広い分子量領域のサイトカインに対する本実施形態に係る吸着材の吸着能を検証するために、以下の６種のサイトカインとＨＭＧＢ１（３０ｋＤａ）について吸着除去性能を検証してもよい。
　ＩＬ－８（８ｋＤａ）；
　ＩＬ－１β（１７ｋＤａ）；
　ＩＬ－６（２４．５ｋＤａ）；
　血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ、３８ｋＤａ）；
　ＴＮＦ－α（単体では１７ｋＤａであるが、３量体を形成しているため、分子量としては５１ｋＤａを用いる）；
　ＩＬ－１２（７０ｋＤａ）
　サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着除去能は、下記の計算式により吸着率を算出し評価する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
  
　上記式において、ＣBは、吸着材との接触前の血漿中の各サイトカイン及びＨＭＧＢ１の濃度であり、ＣAは、吸着材との接触後の血漿中の各サイトカイン及びＨＭＧＢ１の濃度である。
　（ケモカイン）
　ケモカインは、炎症時に白血球をはじめとする免疫細胞のレセプターに作用し、免疫細胞の遊走を誘導するサイトカインであり、８ｋＤａ～１０ｋＤａの分子量を持つ比較的小さなタンパク質である。ケモカインの種類は、現在同定されているだけでも５０種に及ぶ。これらケモカインは、その役割からＣＣケモカインとＣＸＣケモカインの２つに分類される。
　ＣＣケモカインは、単球、リンパ球、好酸球に作用する。ＣＣケモカインの情報を伝達するレセプターとしてＣＣＲ１－ＣＣＲ１０の１０種が確認されているが、主要な役割である単球、リンパ球、好酸球のＴ細胞、及びＮＫ細胞遊走に関与するレセプターはＣＣＲ１－ＣＣＲ５である。
　ＣＸＣケモカインは、好中球に作用する。ＣＸＣケモカインの情報を伝達するレセプターとしてＣＸＣＲ１－ＣＸＣＲ６の６種が確認されているが、主要な機能である好中球、エフェクターＴ細胞の動員、及び血小板凝集に関与するレセプターはＣＸＣＲ１－ＣＸＣ３である。ケモカイン吸着材を評価する際には、ケモカインの作用する免疫細胞の種類、及び主要な機能に関係するレセプターの種類に対する網羅性の観点から、以下の表１に記載の７種類のケモカインの除去性能について検証してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　ケモカインの除去率は、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率を求める時に用いる上記計算式と同じ式で算出することができる。
（血中ケモカイン、サイトカイン、及びＨＭＧＢ１濃度測定方法）
　血中ケモカイン、サイトカイン、及びＨＭＧＢ１濃度の測定方法としては、例えば、各ケモカイン、サイトカイン、及びＨＭＧＢ１に対する抗体を固定化した容器へ、血液又は血漿を接触させることで、抗原抗体反応により特異的に各ケモカイン、サイトカイン、及びＨＭＧＢ１を捕捉した後、捕捉されたケモカイン、サイトカイン、及びＨＭＧＢ１に蛍光標識した抗体を反応させることで、蛍光強度により血中濃度を測定できるＥＬＩＳＡ(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法を用いることができる。
　上記６種のサイトカイン及びＨＭＧＢ１と、６種のケモカインと、については、各々専用のＥＬＩＳＡキットが販売されており、それらを用いて個別に測定してもよい。また、例えば、ヒトサイトカインＧＩ　アッセイキット（バイオラットラボラトリーズ株式会社）などの様に蛍光標識により区別したビーズ表面上にそれぞれの抗体を固定し、混合したビーズを用いる事で、ＥＬＩＳＡ法と同様の原理により多種のサイトカイン濃度を同時に測定する方法を用いてもよい。
　（吸着器）
　図３は、吸着器の一実施形態を示す断面図である。図３において、デバイス１００は血液体外循環回路に接続する吸着器モジュールである。円筒１１０の一端開口部内側にフィルター１２０を貼ったパッキン１３０を介して、円筒１１０の一端開口部に入口ポート１４０を有するキャップ１５０をねじ嵌合している。さらに、円筒１１０の多端開口部内側にフィルター１２０’を貼ったパッキン１３０’を介して、円筒１１０の多端開口部に出口ポート１６０を有するキャップ１７０をねじ嵌合して容器を形成している。また、当該容器のフィルター１２０及び１２０’の間隙に吸着材を保持させて、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着材層１８０を形成している。
　ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着材層１８０には、上記本実施形態に係る吸着材を単独で充填してもよく、あるいは、他の基材を混合、又は積層してもよい。他の基材としては、例えば、活性化白血球を除去する基材や近年炎症性メディエイターをして新たに注目が集まるアラーミンなどを吸着する吸着材などを用いることができる。これにより基材の相乗効果による広範な臨床効果が期待できる。ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着基材層１８０の容積は５～３０００ｍＬとすることができるが、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着容量と血液の体外循環の際の体外の血液量の観点から、５０ｍＬ～１０００ｍＬが好ましく、１００ｍＬ～５００ｍＬがより好ましい。
　血液体外循環回路に接続可能な本実施形態に係る吸着器は、体外循環回路において、治療対象の血液と接触する様に配置され、全身炎症性疾患治療用途等で利用可能である。
　上記のケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着器は、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１が介在する疾患において、臓器炎症を抑制又は治療するために有効に使用することができる。具体的な疾患名として、敗血症、敗血症性ショック、毒素ショック症候群、虚血再灌流障害、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、慢性関節リュウマチ、通風性関節炎、乾癬、突発性肺腺維症、炎症性腸疾患、免疫性血管炎、尿路感染症、潰瘍性大腸炎、接触性皮膚炎、ぜんそく、筋変性症、ライター症候群、糖尿病、骨吸収症、アテローム性動脈硬化、脳外傷、多発性硬化症、大脳マラリア、発熱及び乾癬による筋肉痛が挙げられる。
　なお、実施形態に係る吸着器は、血液体外循環方法のみならず、血液を採取した人間と同一人に治療のために戻すことを前提にしていない方法、例えば血液製剤を製造するための方法等にも使用可能である。この場合、血液が容器に収納されていてもよい。またあるいは、実施形態に係る吸着器は、他人への移植用に取り出された臓器の血液循環方法にも使用可能である。この際、他人への移植用に取り出された臓器が他人へ移植されるまでの間、臓器の血管と実施形態に係る吸着器を接続して循環することにより、臓器の血液中のケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去することが可能である。
　（炎症状態の血液）
　ケモカイン、サイトカインやＨＭＧＢ１は人体内で炎症が発生している際に特異的に産生されるが、健常時にはほとんど産生されないため、健常人の血液中にはほとんど存在しない。そのため、吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着能を評価するためには、例えば、炎症状態にある患者の血液と同等の炎症状態血液を用意する。
　炎症状態血液の作成方法としては、健常人より採血した血液へヒト遺伝子組み換えケモカイン、サイトカインやＨＭＧＢ１を患者血液中の濃度以上となるように添加する方法や、採血した健常人血液へエンドトキシン等を添加することにより白血球からケモカイン、サイトカインやＨＭＧＢ１を放出させる方法等がある。吸着材の吸着能を検証する方法としては、いずれの方法を採用しても問題はない。
　（評価方法）
　本実施形態に係る吸着材のケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着性能を評価する方法においては、上記したように、炎症状態の血液を再現した血液として、健常ボランティアより採血した血液へ、エンドトキシンを添加し、一定時間インキュベートした炎症モデル血液を用いることが出来る。例えば、炎症モデル血液を、遠心機を用いて、血漿を分離した後に、血漿サンプルと、吸着材と、を、ポリプロピレン（ＰＰ）製のチューブ内部で混合し、一定時間振盪接触させることで、吸着材を評価することが可能である。
　また、健常人より採取した血液へエンドトキシンを添加した後に、一定時間インキュベートして得られた炎症モデル血液を、本実施形態に係る吸着材が充填された、内径９ｍｍ、容量２．５ｍＬのラボラトリーカラム（モビテック社製）にシリンジポンプを用いて通液させて、吸着材を評価してもよい。
　さらに実際の臨床に用いるスケールの吸着器として評価する方法としては、図３に示した断面図を有するようなデバイスに、ペリスタポンプを用いて、炎症モデル血液を循環させる方法などがある。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
　［実施例１］
　（吸着材作製）
　石油ピッチ由来の活性炭（クレハ社製）を１Ｎ塩酸で２４時間以上含浸洗浄した後に、９５℃の熱水で４０時間以上洗浄した後、乾燥させた。さらに、ポリマー濃度が１．１％になるようにｐ－ＨＥＭＡ（（株）エイコー）をエタノールに溶解して調製したｐ－ＨＥＭＡコート液に活性炭を４時間以上浸漬させ、１次コーティングを行った。その後、１次コーティングされた活性炭を減圧乾燥後、１２０℃で２時間以上の加熱架橋処理を行った。その後、再び１次コーティングと同様の方法で活性炭に２次コーティングを行った後、送風冷却をして吸着材とした。
　（炎症モデル血漿の調製）
　健常人ボランティアより採血した血液へ、血液中濃度が１．０×１０-4ｍｇ／ｍＬとなるように大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃｏｌｉ）Ｏ－１２７由来のリポポリサッカライド（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を添加した後、振盪混和しながら、３７℃で２４時間インキュベートし、炎症モデル血液を調製した。２４時間のインキュベートの後、速やかに遠心分離を行い血漿を回収してサンプル血漿（以下、「吸着前血漿サンプルＢ」という。）とした。
　（ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着試験）
　作製した吸着材を、ポリプロピレンチューブ中に添加した。添加前に、吸着材は、ポリプロピレンチューブ内において、血漿３ｍＬに対して、血漿／吸着材比が６となるように秤量された。添加後、３７℃の条件下において振盪混和しながら１時間インキュベートした後、速やかに血漿（以下、「吸着後血漿サンプルＡ」という。）を回収した。
　（活性炭物性評価）
　作製した吸着材を１ｇ秤量し、自動吸着測定装置Ｔｒｉｓｔｅｒ　ＩＩ　３０２０　（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．　ＵＳＡ）を用いて窒素温度（７７Ｋ）における吸着等温線を測定した。吸着等温線測定に際し、２５０℃で１５時間乾燥処理を行った。窒素吸着等温線の結果（図１）から、ＢＥＴの方法により表面積を算出したところ、１０００ｍ2／ｇであった。ＢＪＨの方法により細孔径分布（図２）を求め、細孔径が１～２０ｎｍの細孔容量の積算値を算出したところ、０．５ｍＬ／ｇであった。また、ｔ－ｐｌｏｔ法により算出した外表面積は１６０ｍ2／ｇであった。
　（ケモカイン、サイトカイン濃度測定試験）
　吸着前血漿サンプルＢと吸着後血漿サンプルＡについて、ヒトサイトカインＧＩアッセイキット２７Ｐｌｅｘパネル（バイオラットラボラトリー株式会社）を用いて、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ　２００システムにて測定した結果、作製した吸着材による各ケモカイン及びサイトカインの除去率は、ＩＬ－８；９５％，ＩＬ－１β；８９％，ＩＬ－６；７４％，ＶＥＧＦ；５７％，ＴＮＦ－α；５０％，ＩＬ－１２；４５％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９９％，ＩＰ－１０；９６％，ＭＣＰ－１；９４％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９６％，ＲＡＮＴＥＳ；９９％であった。
　（ＨＭＧＢ１濃度測定試験）
　吸着前血漿サンプルＢと吸着後血漿サンプルＡについて、ＨＭＧＢ１　ＥＬＩＳＡＫ　Ｋｉｔ　ＩＩ（株式会社　シノテスト製）を用いて測定した結果、作製した吸着材によるＨＭＧＢ１の除去率は６０％であった。
　（血液適合性評価）
　吸着前後の血漿中のアルブミン濃度をＡ／Ｇ　Ｂテストワコーを用いて測定した結果、作製した吸着材による吸着試験前後でのアルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［実施例２］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．８ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１２５０ｍ2／ｇであること以外は実施例１と同様の吸着材を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９８％，ＩＬ－１β；９２％，ＩＬ－６；８０％，ＶＥＧＦ；５５％，ＴＮＦ－α；５５％，ＩＬ－１２；４８％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９５％，ＩＰ－１０；９７％，ＭＣＰ－１；９５％，ＭＩＰ－１ａ；９９％，ＭＩＰ－１ｂ；９８％，ＲＡＮＴＥＳ；９６％，ＨＭＧＢ１；６０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［実施例３］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１５００ｍ2／ｇであること以外は実施例１と同様の吸着材を用いて吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９８％，ＩＬ－１β；９５％，ＩＬ－６；８０％，ＶＥＧＦ；５５％，ＴＮＦ－α；５５％，ＩＬ－１２；４７％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９５％，ＩＰ－１０；９６％，ＭＣＰ－１；９７％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９６％，ＲＡＮＴＥＳ；９５％，ＨＭＧＢ１；６０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．１ｇ／ｄＬであり、吸着率は６．８％であった。
　［実施例４］
　吸着材表面へのコートポリマーがエチレンビニルアルコール（クラレ株式会社　エバール（登録商標）　Ｆ１０４Ｂ）であること、及びｔ－ｐｌｏｔ法により求めた外表面積が１５０ｍ2／ｇであること以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９５％，ＩＬ－１β；９０％，ＩＬ－６；７５％，ＶＥＧＦ；５８％，ＴＮＦ－α；５０％，ＩＬ－１２；４５％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９８％，ＩＰ－１０；９７％，ＭＣＰ－１；９５％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９６％，ＲＡＮＴＥＳ；９７％，ＨＭＧＢ１；５５％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［実施例５］
　吸着材表面へのコートポリマーがエチレンビニルアルコール（クラレ株式会社　エバール（登録商標）　Ｆ１０４Ｂ）であること、及びｔ－ｐｌｏｔ法により求めた外表面積が１５０ｍ2／ｇであること以外は実施例２と同様の吸着材、方法を用いて吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９８％，ＩＬ－１β；９３％，ＩＬ－６；８２％，ＶＥＧＦ；５６％，ＴＮＦ－α；５０％，ＩＬ－１２；４６％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９５％，ＩＰ－１０；９７％，ＭＣＰ－１；９６％，ＭＩＰ－１ａ；９８％，ＭＩＰ－１ｂ；９９％，ＲＡＮＴＥＳ；９７％，ＨＭＧＢ１；５５％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［実施例６］
　吸着材表面へのコートポリマーがエチレンビニルアルコール（クラレ株式会社　エバール（登録商標）　Ｆ１０４Ｂ）であること、及びｔ－ｐｌｏｔ法により求めた外表面積が１５０ｍ2／ｇであること以外は実施例３と同様の吸着材、方法を用いて吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９７％，ＩＬ－１β；９５％，ＩＬ－６；８０％，ＶＥＧＦ；５４％，ＴＮＦ－α；５０％，ＩＬ－１２；４５％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９６％，ＩＰ－１０；９７％，ＭＣＰ－１；９７％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９６％、ＲＡＮＴＥＳ；９５％，ＨＭＧＢ１；５５％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．１ｇ／ｄＬであり、吸着率は６．８％であった。
　［実施例７］
　吸着材表面へのコートポリマーがｐ－ＨＰＭＡであること以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９５％，ＩＬ－１β；９１％，ＩＬ－６；７４％，ＶＥＧＦ；５７％，ＴＮＦ－α；５１％，ＩＬ－１２；４５％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９８％，ＩＰ－１０；９７％，ＭＣＰ－１；９５％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９６％，ＲＡＮＴＥＳ；９６％，ＨＭＧＢ１；６１％であった。また、吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［実施例８］
　吸着材表面へのコートポリマーがｐ－ＨＢＭＡであること以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９６％，ＩＬ－１β；９０％，ＩＬ－６；７４％，ＶＥＧＦ；５６％，ＴＮＦ－α；５０％，ＩＬ－１２；４６％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９９％，ＩＰ－１０；９６％，ＭＣＰ－１；９５％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９６％，ＲＡＮＴＥＳ；９９％，ＨＭＧＢ１；６０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［実施例９］
　吸着材表面へのコートポリマーが２－メトキシエチル（メタ）アクリレート（ＭＥＭＡ、和光純薬工業（株））とメタクリル酸メチルベタイン（ＣＭＢ、大阪有機化学工業（株））の共重合体であること以外は実施例１と同様の吸着材を作製した。
　ＭＥＭＡとＣＭＢの共重合体は、通常の溶液重合によって合成した。重合条件は、各モノマー濃度が１モル／Ｌのエタノール溶液に、開始剤としてアゾイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．００２５モル／Ｌ存在下、６０℃で８時間重合反応を行った。得られたポリマー重合液を水中に滴下し、析出したポリマーを回収した。回収したポリマーは粉砕した後、減圧条件下で２４時間乾燥してコーティングポリマーを得た。
　作製した吸着材を用い、実施例１と同様の方法を用いて吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９５％，ＩＬ－１β；９１％，ＩＬ－６；７３％，ＶＥＧＦ；５９％，ＴＮＦ－α；５１％，ＩＬ－１２；４６％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９７％，ＩＰ－１０；９７％，ＭＣＰ－１；９６％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９７％，ＲＡＮＴＥＳ；９６％，ＨＭＧＢ１；６０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［比較例１］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．２ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１８００ｍ2／ｇ、及びｔ－ｐｌｏｔにより算出した外表面積が１００ｍ2／ｇであり、ポリマーコートをしていないこと以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；３０％，ＩＬ－１β；２０％，ＩＬ－６；２０％，ＶＥＧＦ；２０％，ＴＮＦ－α；１０％，ＩＬ－１２；１０％，Ｅｏｔａｘｉｎ；２５％，ＩＰ－１０；３０％，ＭＣＰ－１；３０％，ＭＩＰ－１ａ；２５％，ＭＩＰ－１ｂ；３０％，ＲＡＮＴＥＳ；３０％，ＨＭＧＢ１；２０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．７ｇ／ｄＬであり、吸着率は１５．９％であった。
　［比較例２］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．３ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１０００ｍ2／ｇ、及びｔ－ｐｌｏｔにより算出した外表面積が１８０ｍ2／ｇであること以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるサイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；４０％，ＩＬ－１β；２５％，ＩＬ－６；２５％，ＶＥＧＦ；５５％，ＴＮＦ－α；５０％，ＩＬ－１２；４５％，ＨＭＧＢ１；６０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［比較例３］
　吸ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１６００ｍ2／ｇ、及びｔ－ｐｌｏｔにより算出した外表面積が１５０ｍ2／ｇであり、ポリマーコートをしていないこと以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるサイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；８５％，ＩＬ－１β；６５％，ＩＬ－６；６０％，ＶＥＧＦ；５５％，ＴＮＦ－α；５５％，ＩＬ－１２；４５％，ＨＭＧＢ１；５８％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．７ｇ／ｄＬであり、吸着率は１５．９％であった。
　［比較例４］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１０５０ｍ2／ｇ、及びｔ－ｐｌｏｔにより算出した外表面積が１６０ｍ2／ｇであり、吸着材表面へポリマーコートしないこと以外は実施例１と同様の吸着材を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９５％，ＩＬ－１β；８９％，ＩＬ－６；７０％，ＶＥＧＦ；５５％，ＴＮＦ－α；５０％，ＩＬ－１２；４５％，Ｅｏｔａｘｉｎ；９４％，ＩＰ－１０；９６％，ＭＣＰ－１；９５％，ＭＩＰ－１ａ；９５％，ＭＩＰ－１ｂ；９４％，ＲＡＮＴＥＳ；９５％，ＨＭＧＢ１；６０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．５ｇ／ｄＬであり、吸着率は２０．５％であった。
　［比較例５］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が９００ｍ2／ｇ、及びｔ－ｐｌｏｔ法により求めた外表面積が１５０ｍ2／ｇであり、ポリマーコートしていないこと以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるサイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；８０％，ＩＬ－１β；７０％，ＩＬ－６；６５％，ＶＥＧＦ；５５％，ＴＮＦ－α；５５％，ＩＬ－１２；４８％，ＨＭＧＢ１；５５％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．８ｇ／ｄＬであり、吸着率は１３．６％であった。
　［比較例６］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．６ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１０００ｍ2／ｇ、及びｔ－ｐｌｏｔ法により求めた外表面積が１３０ｍ2／ｇであること以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるサイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；９８％，ＩＬ－１β；９２％，ＩＬ－６；８０％，ＶＥＧＦ；３０％，ＴＮＦ－α；２５％，ＩＬ－１２；２０％，ＨＭＧＢ１；３０％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、４．２ｇ／ｄＬであり、吸着率は４．６％であった。
　［比較例７］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が８５ｍ2／ｇである非多孔性カーボンブラック＃３２（三菱化学株式会社）を用いた。非多孔性カーボンブラックである為、外表面積はＢＥＴ表面積と同じ８５ｍ２／ｇであった。その他においては実施例１と同様の方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、用いた吸着材によるケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１の吸着率は、ＩＬ－８；１５％，ＩＬ－１β；１５％，ＩＬ－６；１５％，ＶＥＧＦ；２０％，ＴＮＦ－α；２０％，ＩＬ－１２；１５％，Ｅｏｔａｘｉｎ；１０％，ＩＰ－１０；１０％，ＭＣＰ－１；１０％，ＭＩＰ－１ａ；１５％，ＭＩＰ－１ｂ；１０％，ＲＡＮＴＥＳ；１０％，ＨＭＧＢ１；１５％であった。また、用いた吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．８ｇ／ｄＬであり、吸着率は１３．６％であった。
　［比較例８］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が９００ｍ2／ｇ、外表面積が測定不能であり、ポリマーをコートしていないこと以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカインの吸着率は、ＩＬ－８；８０％，Ｅｏｔａｘｉｎ；８５％，ＩＰ－１０；８０％，ＭＣＰ－１；８５％，ＭＩＰ－１ａ；８５％，ＭＩＰ－１ｂ；８５％，ＲＡＮＴＥＳ；８５％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．７ｇ／ｄＬであり、吸着率は１５．９％であった。
　［比較例９］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．４ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１０００ｍ2／ｇ、外表面積が測定不能であり、ポリマーをコートしていないこと以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカインの吸着率は、ＩＬ－８；６５％，Ｅｏｔａｘｉｎ；７０％，ＩＰ－１０；６５％，ＭＣＰ－１；７０％，ＭＩＰ－１ａ；７０％，ＭＩＰ－１ｂ；７０％，ＲＡＮＴＥＳ；７５％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．５ｇ／ｄＬであり、吸着率は２０．５％であった。
　［比較例１０］
　ＢＪＨ法で求めた１～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．４ｍＬ／ｇ、窒素吸着法によるＢＥＴ表面積が１６００ｍ2／ｇ、外表面積が測定不能であり、ポリマーをコートしていないこと以外は実施例１と同様の吸着材、方法を用いて、吸着試験、及び血液適合性評価を行った。その結果、作製した吸着材によるケモカインの吸着率は、ＩＬ－８；６５％、Ｅｏｔａｘｉｎ；７０％、ＩＰ－１０；６５％，ＭＣＰ－１；７０％、ＭＩＰ－１ａ；７０％，ＭＩＰ－１ｂ；７０％、ＲＡＮＴＥＳ；７５％であった。また、作製した吸着材による吸着前後の血漿中アルブミン濃度は、それぞれ４．４ｇ／ｄＬ、３．５ｇ／ｄＬであり、吸着率は２０．５％であった。
　［評価結果］
　実施例、及び比較例における吸着材の細孔構造、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１吸着率、並びにアルブミン吸着率の評価結果を図４及び図５に示す。
　細孔を有する吸着材の細孔構造を制御し、かつ、表面へポリマーをコートすることによって血液難付着表面とすることにより、有用タンパク質であるアルブミンの損失を抑えつつ、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を網羅的に吸着除去できることが示された。
１００，２００…デバイス、１１０，２１０…円筒、１２０，１２０’…フィルター、１３０，１３０’…パッキン、１４０，２４０…入口ポート、１５０，１７０，２５０，２５０’…キャップ、１６０，２６０…出口ポート、１８０…サイトカインＨＭＧＢ１吸着材、２２０…吸着材

Claims (9)

  1. 　血液中からケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を除去するための多孔性構造を有する吸着材であって、少なくとも表面が血液難付着性であり、表面積が１０００ｍ2／ｇ以上１５００ｍ2／ｇ以下であり、外表面積が１５０ｍ2／ｇ以上であり、径が１ｎｍ～２０ｎｍの細孔の細孔容量が０．５ｍＬ／ｇ以上である吸着材。
  2. 　前記細孔が設けられた多孔性体と、前記多孔性体にコートされた血液難付着性ポリマーと、を備える、請求項１に記載の吸着材。
  3. 　前記多孔性体が活性炭である、請求項２に記載の吸着材。
  4. 　前記血液難付着性ポリマーがポリヒドロキシエチルメタクリレートである、請求項２又は３に記載の吸着材。
  5. 　血液中よりケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を除去するための血液浄化用吸着器であって、前記血液の入口と出口とを有するハウジングと、前記ハウジングに収容された請求項１ないし４のいずれか１項に記載の吸着材と、を備える吸着器。
  6. 　血液中よりケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を除去する方法であって、請求項５に記載の吸着器へ血液を流通させる事により、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する方法。
  7. 　前記血液が容器に収納されている、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記血液が人体より取り出された移植用臓器の血液である、請求項６に記載の方法。
  9. 　血液中よりケモカイン、サイトカイン及びハイモビリティグループボックス１（ＨＭＧＢ１）を除去する方法であって請求項５に記載の吸着器を用いて前記血液を体外循環することにより、ケモカイン、サイトカイン及びＨＭＧＢ１を除去する方法。
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