WO2015158031A1

WO2015158031A1 - 用于毕赤酵母重组质粒和表达耐辐射球菌ppri蛋白的毕赤酵母重组菌的dna分子

Info

Publication number: WO2015158031A1
Application number: PCT/CN2014/078900
Authority: WO
Inventors: 杨占山; 吴伟; 乔惠萍; 文玲; 施怡; 任丽丽; 于冬
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2014-04-16
Filing date: 2014-05-30
Publication date: 2015-10-22
Anticipated expiration: 2016-10-16
Also published as: US10000761B2; CN103937814A; US20170016009A1

Abstract

包含SEQ ID NO：1所示序列的DNA分子，及插入所述DNA分子的毕赤酵母重组质粒和转化所述毕赤酵母重组质粒到毕赤酵母感受态细胞并高效表达耐辐射球菌PprI蛋白的毕赤酵母重组菌。

Description

用于毕赤酵母重组质粒和表达耐辐射球菌 Pprl蛋白的毕赤酵母重组菌的 DNA分子本申请要求于 2014 年 4 月 16 日提交中国专利局、申请号为 201410153614.3、发明名称为 "一种 DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌 Pprl蛋白的毕赤酵母重组菌" 的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种 DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌 Pprl蛋白的毕赤酵母重组菌。

在核事故、核恐怖以及核战争等核突发事件中，电离辐射可引起人体严重的急性放射损伤（acute radiation injury, ARI)。辐射损伤的救治与防护关系到原子能的和平利用与国家核安全，因此，该领域研究已成为世界各国政府和学者高度关注与重点投入的研究领域。

耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans, DR )是迄今在地球上发现的辐射抗性最强的原核细菌，该菌极强的抗辐射能力与其本身具有完善而高效的 DNA修复系统有关，多种 DNA修复基因及其蛋白质对其特异的辐射抗性起着至关重要的作用。 White等人于 1999年首次公布了 DR菌的基因序歹' J , 其中促 DNA修复多效蛋白诱导因子 (inducer of pleiotropic proteins promoting DNA repair, ;?/?r/)是耐辐射球菌中一种具有重要调控作用的辐射抗性基因，它含有 987bp , 编码 328个 AA , 其产物 Pprl蛋白质是由 DR— 0167编码，分子量为 37KD。近年研究表明， pprl基因是耐辐射球菌控制 DNA修复和保护途径的总开关基因，耐辐射球菌受照后 Pprl蛋白通过多种信号通路调控 210多种基因的上调表达，其中包括 21中与 DNA修复和复制相关的基因【 H Lu, H Chen, G Xu, et al. DNA Repair,2012,l l(2): 139-145】。耐辐射球菌发现 50余年来，世界各国学者对耐辐射球菌基因、蛋白质功能及其机理开展了深入细致的研究。然而，迄今为止，这些研究只局限于原核细胞内，即耐辐射球菌自身或大肠杆菌。

申请号为 200910003512.2的中国专利首次构建了一种耐辐射球菌;? pr/ 基因的真核表达重组质粒 pCMV-HA-/?pr/,将其转入人胚肾 293T细胞和受照哺乳动物体内，成功表达了 Pprl蛋白质，对动物致死性急性放射损伤具有非常显著的防治作用，表明 Pprl蛋白质有望成为用于急性放射损伤防治的一种新的生物制剂。然而，该专利真核表达重组质粒 pCMV-HA-/?pr/通过人体细胞工程目前尚难以获得高效大量表达和纯化的 Pprl蛋白质。

应用原核表达系统大肠杆菌可高效表达和纯化 Pprl蛋白【张永芹，周辉，陈洁，杨占山. 辐射研究与辐射工艺学报， 201 1 , 29(2): 1 17-122.】，然而，该种技术存在许多缺陷： 1. 表达的蛋白质没有经过糖基化等翻译后修饰，导致活性降低； 2. 表达的蛋白质以包涵体形式存在，变性提取时也会导致蛋白质活性降低； 3. 大肠杆菌本身内毒素和有毒蛋白可混杂在目的蛋白产物中，导致应用受限。

酵母是基因工程常用的真核表达系统之一，其中巴斯德毕赤酵母

( Pichia pastoris )是以曱醇为唯一碳源的酵母工程菌的一种。该酵母具有如下优点， 1. 该酵母遗传操作简单，基因组高度稳定，可高水平表达外源基因； 2. 能进行蛋白质翻译后的修饰行为，如糖基化，二硫键形成，信号肽切除等； 3. 表达载体不含酵母复制原点，外源基因同源重组到酵母细胞染色体中稳定存在，整合后的外源基因随酵母的生长可稳定传代。

如果能够通过真核表达系统毕赤酵母表达纯化耐辐射球菌 Pprl蛋白，那么现有技术中通过人体细胞或原核表达系统大肠杆菌表达纯化 Pprl蛋白的缺陷将会得到改善或解决。但是，耐辐射球菌属于原核生物，其与真核生物毕赤酵母在种系进化上存在巨大差异，例如基因和蛋白质组成与功能、蛋白质氨基酸密码子偏爱性等方面显著不同。所以，若直接将耐辐射球菌 pprl基因通过基因工程构建到毕赤酵母表达系统中，预实验研究证实不可能并且也不利于高效表达耐辐射球菌 Pprl蛋白，按照本领域一般的基因改造技术很难成功解决这一难题。因此，本发明提供一种通过真核表达系统毕赤酵母成功表达纯化耐辐射球菌（ Deinococcus radiodurans Rl ) Pprl蛋白的技术，为进一步研究该蛋白质的功能、机制和应用奠定了厚实的基础，填补了国际辐射损伤救治和防护领域尚无抗放原核蛋白质药物的空白，在辐射防护剂原创蛋白质药物的研究跻身国际先进行列。发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种新合成的 DNA分子，使得所述 DNA分子能够通过巴斯德毕赤酵母成功高效表达和纯化 Pprl蛋白。

此外，本发明还提供同样能够实现发明目的的包含所述 DNA分子的重组质粒和高效表达耐辐射球菌 Pprl蛋白的毕赤酵母重组菌。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种 DNA分子，其包含 SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列。

本发明在保持 Pprl蛋白质氨基酸序列不变的前提下，对耐辐射球菌 ( Deinococcus radiodurans Rl ) pprl基因 ( DR O 167 , Gene ID: 1798483 ) 开放阅读才匡 ( Open Reading Frame, ORF )序列进行优化改造，编码合成新的；? pr/基因，即 SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列，为区别原有； ?pr/基因，将 SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列命名为 Pi-pprl 。

本发明所述包含 SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列的 DNA分子是指在 SEQ ID NO: l所示核苷酸序列之外可以增加一些便于分离纯化蛋白诸如 6 His标签序列等序列，本领域技术人员能够利用现有技术将这些不影响 Pi-pprl基因正常表达的序列与 Pi-pprl基因序列连接到一起，这对于技术人员来说是能够实现的。

此外，本领域技术人员可以根据实际要插入的质粒的酶切位点在所述 DNA分子的两端增加相对应的酶切位点，也可以选择其他合适的标签序列，不仅限于本发明提到的 6 X His标签序列，这些选择在本发明提供了关键的基因序列后均可以依靠现有技术实现，同样未超出本发明的核心技术范畴。

作为优选， SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列由 SEQ ID NO:2-41所示核苷酸序列的引物通过 Overlapping PCR扩增得到。本发明利用 SEQ ID NO:2-41所示核苷酸序列的一系列互相重叠（OVERLAP ) 引物（以下简称 p-1 至 p-40 ) 的重叠部分进行互补退火形成模板 DNA , 再通过 Overlapping PCR 方法合成得到 SEQ ID NO: 1 所示核苷酸序列。 Overlapping PCR扩增示意图参见图 1。

作为优选，上述制备方法可分别用 SEQ ID NO:2-17所示核苷酸序列的引物 ( p-1至 p-16 )、 SEQ ID NO: 16-29所示核苷酸序列的引物 ( p-15 至 p-28 ) 以及 SEQ ID NO:28-41所示核苷酸序列的引物 ( p-27至 p-40 ) 合成得到三个片段，进而再用 SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物（p-1 ) 和 SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的引物（ p-40 )扩增形成整个 DNA分子。

作为优选，所述 Overlapping PCR方法合成的条件为： 98°C 30 s, 58 °C 30 s, 72 °C l min, 共 25个循环，最后 72°C 7 min。反应体系为： p-1 (10 μπιοΐ/l) 1 μΐ ρ-η (10 μπιοΐ/ΐ) 1 μΐ ρ-2至 ρ- (η-1)(1 μπιοΐ/ΐ) 各 1.5 μΐ

5 xPrimeSTAR® Buffer 10 μΐ dNTPs (2.5 mmol/1) 4 μΐ

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.5 μΐ ddH₂0 加至总体积 50 μΐ 作为优选，本发明所述 DNA分子包含 SEQ ID NO:l所示核苷酸序列和 6 X His标签序列 ,所述 6 His标签序列位于 SEQ ID ΝΟ:1所示核苷酸序列的 5' 端，其制备方法如下：

以包含 SEQ ID ΝΟ:1所示核苷酸序列的 DNA分子为模板，利用带有 6 ffis 标签序列的 SEQ ID NO:42 所示核苷酸序列的引物和 SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的引物进行 PCR扩增，得到包含 SEQ ID NO:l所示核苷酸序列和 6 X His标签序列的 DNA分子。

所述 PCR扩增条件为： 95°C 5 min, 94 °C 30 s, 50 °C 30 s, 72°C90 s, 共进行 30次循环，最后 72 °C lO min, 4°C保温。同时，本发明还提供一种毕赤酵母重组质粒，由毕赤酵母表达质粒插入包含 SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列的 DNA分子获得。

作为优选，所述毕赤酵母重组质粒由 pHBM-905A质粒在 Cpo I和 Not I酶切位点间插入包含 SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列和 6 χ His标签序列组成的 DNA分子获得，所述 6 X His标签序列位于 SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的 5，端。本发明所述毕赤酵母重组质粒构建示意图参见图 2。

此外，本发明还提供一种毕赤酵母重组工程菌，由本发明任意一种毕赤酵母重组质粒转化到毕赤酵母感受态细胞中获得。

作为优选，所述毕赤酵母重组工程菌由毕赤酵母重组质粒经 Sal I酶切线性化后，电转化到毕赤酵母 GS 115感受态细胞中获得。

经凝胶电泳检测和测序，本发明所述毕赤酵母重组质粒能够成功扩增出大小和序列与 SEQ ID ΝΟ: 1 所示核苷酸序列一致的片段，利用 SDS-PAGE 电泳、 Western blotting和质谱检测，证实其编码的氨基酸序列与耐辐射球菌的 Pprl蛋白序列一致，相对分子质量为 43KD。同时，所述毕赤酵母重组工程菌经过曱醇诱导表达，在诱导 24 h即可检出 Pprl蛋白分泌表达的条带。作为优选，在诱导蛋白表达时曱醇终浓度为 1% , 温度 30 °C , pH6.0 , 诱导 120h时目的蛋白表达量最高，为 0.35mg/ml。以上检测试验结果表明，本发明所提供的 DNA分子、毕赤酵母重组质粒以及毕赤酵母重组工程菌能够成功地在毕赤酵母中分泌表达 Pprl蛋白，也就证明其能够应用于制备毕赤酵母重组质粒、毕赤酵母重组工程菌以及抗辐射损伤药物中。

由以上技术方案可知，本发明在保持 Pprl蛋白质氨基酸序列不变的前提下，对耐辐射球菌；?pr/基因序列进行优化改造，编码合成了新的 pprl 基因，能够成功构建毕赤酵母重组质粒和毕赤酵母重组工程菌，并分泌表达 Pprl蛋白，为进一步利用酵母发酵系统大量高效制备抗辐射损伤蛋白质药物奠定了坚实的基础。附图说明图 1所示为 Overlapping PCR扩增示意图；

图 2所示为毕赤酵母重组质粒构建示意图；

图 3所示为所述 DNA分子琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道 A-B为片段 1、片段 2; 泳道 C-J为片段 3 ; 泳道 K-0为全长 Pi-pprl基因，箭头所指处为 DNA分子量标准条带的大小（bp );

图 4所示为引入 6 X His标签序列的所述 DNA分子琼脂糖凝胶电泳图，其中 1为 PCR扩增产物， M为 Maker;

图 5所示为大肠杆菌重组子 ΡΖ-;^ΓΙ基因的 PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道 A为阴性对照，即不加转化后的大肠杆菌模板；泳道 B-L 为以转化后的大肠杆菌为模板的 PCR产物；泳道 N为以 Pi-pprl的基因为模板的 PCR产物（阳性对照）；

图 6所示为大肠杆菌重组子质粒 DNA的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道 1为 pHBM905A质粒（阴性对照 ), 该质粒的多克隆位点填充片段为 1200bp; 泳道 2-12为图 5中 B-L对应的单菌落的质粒；

图 7所示为 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/及其 Sal I酶切图，其中泳道 A为重组质粒 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/; 泳道 B-D为重组质粒 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/经 Sal I酶切图；图 8所示为 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/毕赤酵母转化子 PCR验证琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道 1为 ρΗΒΜ905Α质粒为模板的 PCR产物（阴性对照）；泳道 2为重组质粒 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/为模板的 PCR产物（阳性对照）；泳道 3-16 为 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/毕赤酵母转化子为模板的 PCR产物；

图 9 所示为 ρΗΒΜ-Ρ -/?;?Γ/毕赤酵母转化子 Pprl蛋白的诱导表达 SDS-PAGE图，其中泳道对照为 pHBM905A毕赤酵母转化子培养上清液作为阴性对照；泳道 1-7为分别诱导 1-7天的 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/毕赤酵母转化子培养上清液，每个泳道上样量为 30 ul (相当于 24 ul培养上清液）；泳道 M为 Maker;

图 10所示为 ρΗΒΜ-Ρ -/?ρΓ/毕赤酵母转化子 Western Blot检测，其中 1为第一个阳性毕赤酵母转化子诱导 2天的发酵上清； 2为第二个阳性毕赤酵母转化子诱导 2天的发酵上清； 3为第一个阳性毕赤酵母转化子诱导 1天的发酵上清； M为 Maker, 上样量为每泳道 16ul发酵上清；图 11所示为 ρΗΒΜ-Ρ -/?ρΓ/毕赤酵母转化子 Ultraflex II TOF/TOF质谱仪的肽质量指紋图谱（PMF )。具体实施方式

本发明公开了一种 DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌 Pprl蛋白的毕赤酵母重组菌，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的 DNA分子、赤酵母重组质粒和毕赤酵母重组菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例中所用试验材料如下：

1、菌株与质粒

大肠杆菌菌株 E. coli XL10-GOLD 和巴斯德毕赤酵母菌株 (Pichia pastoris) GS115购自 Invitrogen公司，毕赤酵母表达载体 pHBM-905A( 8923 bp )由湖北大学马立新教授惠赠（马立新，赵西选，陈晚苹，李晔星，付玲，姚永兰。一种离体高效构建多拷贝毕赤酵母表达载体的方法。专利申请号： 201210591987.X ), 质粒图语参见图 2。

2、试剂和培养基

Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、 T4 DNA连接酶等均为大连宝生物工程公司产品。质粒 DNA提取试剂盒和 DNA片段凝胶回收试剂盒均为杭州爱思进生物技术公司产品。 DNA分子量标准购自北京赛百盛公司。蛋白分子量标准购自 Bio-Rad公司。酵母基础氮源（ YNB )为 DIFCO 公司产品。鼠源 anti-His tag抗体为 SIGMA公司产品。 HRP交联的兔抗鼠抗体为 Invitrogen公司产品。 ECL化学发光试剂盒购自 Millipore公司。其他试剂均为国产化学纯或分析纯产品。

大肠杆菌培养基： LB: 1%蛋白胨， 0.5% 酵母提取物， l% NaCl , pH 7.0。

酵母培养基： YPD平板（每 100ml双蒸水溶液含酵母提取物 lg、蛋白胨 2g、葡萄糖 2g、琼脂粉 2g ), BMGY (每 100ml双蒸水溶液含酵母提取物 lg、蛋白胨 2g、 YNB 1.34g、甘油 1ml ), BMMY (每 100ml双蒸水溶液含酵母提取物 lg、蛋白胨 2g、葡萄糖 2g、曱醇 lml ), 购自上海根生生物科技公司。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例 1: 本发明所述 DNA分子的优化和合成

本发明在保持 Pprl蛋白质氨基酸序列不变的前提下，对耐辐射球菌 ( Deinococcus radiodurans Rl ) r/基因 ( DR 0167 , Gene ID: 1798483 ) 开放阅读框（ Open Reading Frame, ORF )序列进行优化改造，编码合成了新的 pprl基因—Pi-pprl基因，即 SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列，以期高效表达目的蛋白。

1、合成方法

本发明根据人工设计的基因，设计并合成了 SEQ ID NO:2-41 所示核苷酸序列的一系列互相重叠（ OVERLAP )引物，通过 Overlapping PCR合成得到包含 SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列并带有 Cpo I限制性内切酶位点和 Not I限制性内切酶位点 (便于后续重组质粒的构建）的 DNA 分子。具体方法如下：

分别用 SEQ ID NO:2-17所述核苷酸序列的引物（ p-1至 p-16 , 404bp )、 SEQ ID NO: 16-29所述核苷酸序列的引物（ p-15至 p-28 , 370bp )以及 SEQ ID NO:28-41 所述核苷酸序列的引物（p-27 至 p-40 , 330bp ) 进行 Overlapping PCR合成得到三个片段，依次为片段 1、片段 2和片段 3。

三个片段合成后，以这三个片段为模板，用 SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的引物 ( -1 )和 SEQ ID NO:41所示核苷酸序列的引物 ( p-40 )扩增形成整个 DNA分子。

经琼脂糖凝胶电泳检测，所述 DNA分子大小与预期一致，琼脂糖凝胶电泳图参见图 3。

其中， Overlapping PCR方法合成的条件为： 98°C 30 s, 58 °C 30 s, 72 °C 1 min, 共 25个循环，最后 72 °C 7 min。反应体系为（50 μΐ): p-1 (10 μπιοΐ/ΐ)

p-n (10 μπιοΐ/ΐ)

p-2至 p- (n-l)(l μπιοΐ/ΐ) 各 1.5 μ1

PrimeSTAR® Buffer 10 μΐ dNTPs (2.5 mmol/1) 4μ1

PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.5 μΐ ddH₂0 加至总体积 50 μΐ

PCR扩增条件为： 95°C预变性 5min, 94°C变性 30 s, 50°C退火 30 s, 72 °C延伸 90s, 共进行 30次循环，最后 72 延伸 10111^1, 4°C保温。实施例 2: 本发明所述 DNA分子（引入 6xffis标签序列）的合成以实施例 1 得到的 DNA 分子为模板，用带有 6xffis 标签序列 ( CATCATCACCACCATCAT ) 的 SEQ ID NO:42所示核苷酸序列的引物和 SEQIDNO:41所示核苷酸序列的引物进行 PCR扩增便得包含 SEQ ID ΝΟ:1所示核苷酸序列和 6xffis标签序列的 DNA分子（带有 Cpo I限制性内切酶位点、 Not I限制性内切酶位点 )。其中，引物 SEQ ID NO:42即在引物 P- 1基础上引入 6 xffis标签序列。

PCR扩增条件为： 95°C预变性 5min, 94°C变性 30 s, 50°C退火 30 s, 72 °C延伸 90s, 共进行 30次循环，最后 72 延伸 10111^1, 4°C保温。

取 3μ1 PCR扩增产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明 PCR扩增产物的大小（1005 bp)与预期一致，琼脂糖凝胶电泳图参见图 4。实施例 3: 毕赤酵母重组质粒的构建

将毕赤酵母表达载体 pHBM905A( 8923 bp )用 Cop I和 Not I双酶切，经琼

DNA聚合酶处理，然后与割胶回收大片段进行连接，获得毕赤酵母重组表达质粒 ρΗΒΜ-905Α-Ρ-/?/?Γ/ ( 8706 bp ), 简称 ρΗΒΜ-Ρ-/?/?Γ/, 构建流程图示于图 2。实施例 4: 大肠杆菌转化子的鉴定

为了验证所构建的毕赤酵母重组质粒是否成功构建，将其转化至大肠杆菌中，然后进行鉴定。

1、煮菌 PCR鉴定

从大肠杆菌转化平板上随机挑选 11个转化子菌落，分别转接入装有 20μ1无菌水的 1.5 ml Eppendorf管中，置于沸水浴 3分钟，水浴冷却。高速离心（ 14,000 rpm ) 1 min。取上清 1-2μ1为模板，用引物 ρ-1和 ρ-40进行 PCR扩增反应。将 PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检查，见图 5。结果显示 11个转化子中有 10个转化子都能得到实施例 2所合成的基因。

2、转化子质粒 DNA的琼脂糖凝胶电泳

将挑选的 11个转化子菌落用 AXYGEN微量质粒抽提试剂盒提取质粒 DNA, 进行琼脂糖凝胶电泳检查，见图 6。结果显示， 11个转化子中有 10个为分子量大小一致的重组质粒。

3、转化子质粒 DNA的测序鉴定

随机挑取 3个经菌落 PCR鉴定和质粒大小比对正确的重组质粒进行测序。结果表明，插入的 pprl基因编码序列与人工设计合成的 SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列完全一致。本发明设计合成的 Pi-pprK SEQ ID ΝΟ: 1 所示核苷酸序列）基因编码序列与原有耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans Rl ) pprl基因编码序列（ DR 0167 , SEQ ID NO:43所示核苷酸序列 ) 完全不同。

4、生物信息学软件分析结果

利用生物信息学软件 ( www.bio-soft.net/sms/index.html )分析 Pi-pprl ( SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列）基因序列，结果表明，其编码的氨基酸序列与耐辐射球菌 (De "ococc^ radiodurans Rl ) pprl基因编码的 Pprl蛋白 (NP— 293891.1)的氨基酸序列完全一致（氨基酸序列如 SEQ ID NO:44所示）。

由上述检测结果可知，毕赤酵母重组质粒转化大肠杆菌能够提出质粒，条带位置正确、大小正确，且测序结果与 Pz-^pr/ ( SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列）基因序列一致，基因序列能够正确表达 Pprl蛋白，说明该质粒已经构建成功。实施例 5: 毕赤酵母重组工程菌的建立

将鉴定正确的毕赤酵母重组质粒 pHBM-Pi-pprl经 Sal I酶切线性化后

(电泳图见图 7 ), 电转化毕赤酵母 GS115感受态细胞，获得毕赤酵母重组工程菌（pHBM-Pz-^pr/毕赤酵母转化子）。毕赤酵母感受态细胞制备方法按照 Invitrogen公司的操作手册进行 (见 www.pdffactory.com )。

电转化实验的相关参数分别为： Voltage Booster: 4 kQ , Capacitance: 50 μΈ , DC VOLTS: 410 , Charge Rate: Fast。

将电转化后的毕赤酵母细胞涂布 MD 平板（MD : 1.34% YNB ;； 4x 10-5% 生物素； 2%葡萄糖）， 28。C培养 2-3天后，随机挑取 MD平板上的酵母转化子菌落进行煮菌 PCR鉴定。煮菌 PCR釆用的引物为 p-1和 p-40。 PCR结果显示 14个毕赤酵母转化子中都能扩增出 987 b 的 Pi-pprl ( SEQ ID ΝΟ: 1所示核苷酸序列）基因序列（电泳图见图 8 ), 表明转化成功。实施例 6: 毕赤酵母重组工程菌（pHBM-Pz-^pr/毕赤酵母转化子） Pprl蛋白的诱导表达

挑取经鉴定为阳性的 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/毕赤酵母转化子，进行摇瓶培养诱导表达。阴性对照菌株为空载体质粒 ρΗΒΜ-905Α经 Sal I酶切线性化后转化毕赤酵母 GS115菌株获得的转化子。方法如下：

(1)挑取一个 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/毕赤酵母转化子单菌落，接种至 50 ml BMGY液体培养基中（按 10%装瓶，即 50 ml培养基装在 500 ml培养瓶中），在 28 -30°C摇床中培养，摇床转速为 250-300 rpm , 当菌体生长至 OD600=20-30时收获；

(2) 室温离心 5,000 rpm , 5 min , 去除上清，收集细胞，用 50 ml BMMY(BMMY： 2%蛋白胨， 1% 酵母提取物， 1%硫酸铵， 0.34% YNB , 100 mmol/L PBS H 6.0 ; ) 重新悬浮细胞，在 28-30°C摇床中继续培养，摇床转速为 250-300 rpm;

(3)每隔 24 h, 向摇瓶中加入曱醇至终浓度为 1%进行诱导表达；

(4)在下列的各个时间点 (24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168h) 取 1 ml培养液至 1.5 ml离心管，室温离心 5,000 rpm, 5 min, 收集上清液保存 4°C水箱备用。

(5)待连续培养 7天的样品都收齐之后，将每个时间点的样品各取 40 ul培养上清液分别转入新的 1.5 ml Eppendorf管中，各加入 10 ul蛋白样品处理液（ 5xSDS-PAGE Loading buffer 100ml: lmol/L Tris-HCl H 6.8 ： 25 ml; 甘油： 50 ml; SDS: 10 g ；溴酚蓝： 0.5 g; 巯基乙醇： 5.0 ml ；双蒸水：定容至 100ml ), 混勾后置于沸水浴中变性 10 min。每个样品各取用 30 ul上样进行 SDS-PAGE电泳观察表达情况。

(6) 电泳条件：浓缩胶 4 % ,分离胶 12 % ,电泳液为 Tris-Glycine Buffer ( 5 TGB 1L: Tris base 15.1 g, Glycine 94 g, SDS 5 g,溶于 800 ml dd¾0, 再定容至 1L )。染色液为考马斯亮蓝，脱色液为 95%乙醇:水乙酸：水 = 4.5:0.5:5(V:V:V)。

结果显示，诱导 24 h即可检出 Pprl蛋白分泌表达的条带，随着诱导时间的延长， Pprl蛋白表达量也逐渐增加，至诱导到 120 h时表达量达到最高，之后趋于稳定（电泳图见图 9 )。图中 Pprl蛋白的分子量约为 43kD, 提示该蛋白可能存在糖基化修饰。实施例 7: 毕赤酵母重组工程菌（pHBM-Pz-^pr/毕赤酵母转化子）表达产物的 Western Blot检测

为了判断毕赤酵母重组工程菌（ρΗΒΜ-Ρζ - r/毕赤酵母转化子）培养上清液中的特异性表达蛋白是否确实为 6xffis-PprI 融合蛋白，本发明随机选取其中 2个阳性 pHBM-Pz-^pr/毕赤酵母转化子的曱醇诱导培养上清液进行 Western Blot检测，见图 10。结果显示，抗 6xffis的标签抗体能与这 2个阳性 ρΗΒΜ-Ρ -/?/?Γ/毕赤酵母转化子培养清液中 43 kDa位置附近的蛋白条带发生特异性结合反应，而且反应强度随曱醇诱导时间的增加而相应增强，表明 pHBM-Pz - r/毕赤酵母转化子培养上清液中的特异性蛋白为 6xffis-PprI融合蛋白。实施例 8: 毕赤酵母重组工程菌（pHBM-Pz-^pr/毕赤酵母转化子）表达产物的质谱鉴定

为了进一步验证 pHBM-Pz-^r/毕赤酵母转化子表达上清液中的蛋白是否为耐辐射球菌的 Pprl蛋白，本发明割取了实施例 6中的 SDS-PAGE 电泳胶上分离的目的蛋白条带，用 Ultraflex II TOF/TOF 质谱仪进行了肽质量指紋图谱（Peptide Mass Fingerprinting, PMF ) 的检测，并将检测结果输入美国国家生物技术信息中心 (The National Center for Biotechnology Information, NCBI)的 OMOSSA数据库进行分析。

目的蛋白的处理方法：

1) 用切胶笔切下目的条带，置于离心管中。

2) 用 50 μΐ双蒸水洗两次，每次 10 min。

3)加 50 μΐ脱色液 (50mM NH₄HC0₃ ： CH₃CN = 1:1), 37°C脱色 20 min。

4) 重复步骤 3 , 直至蓝色褪去。

5)加 ⁵0 μΐ CH₃CN使胶条脱水至白色，真空干燥 10 min。

6)加 10 mM DTT (13用 25mM NH₄HC0₃配制） 50 μΐ, 56 °C水浴 1 h。

7) 样品冷至室温，去除溶液，快速加 30-40 mM IAA (用 25 mM 丽 ₄HC0₃配制） 50 μ1, 置于暗室 45 min。

8)依次用 25 mM NH4HCO3, 25 mM NH₄HCO₃+50% CH₃CN各清洗胶条两次，每次 lO min,再用 CH₃CN脱水至胶条变白，真空干燥 10 min。

9)将 0.1 g l Trypsin液用 25 mM NH₄HC0₃稀释 10-20倍，每管加 2-3 μΐ, 短暂离心，让酶液与胶条充分接触， 4 °C放置 30 min。待酶解液被完全吸收，加 25 mM NH₄HC0₃至总体积 10-15 μΐ, 37。C过夜。

10)加入 2 μΐ 0.1%TFA终止反应，振荡混匀，离心收集酶解液，点靶。肽质量指紋图谱 (Peptide Mass Fingerprinting, PMF)分析，检测肽段的分子量（m/z, z为一个单位正电荷）范围在 900-4000范围内（见图 11)。登陆美国国家生物信息中心网站（ www.ncbi.nlm.nih.gov )的 NCBI nr 数据库，选择物种为 bacteria, 对质谱测得的 PMF结果进行搜索分析。结果显示，该蛋白序列确实是来源于耐辐射球菌（ Deinococcus radiodurans ) 的蛋白 (NP— 293891.1)。表明含有基因序列的毕赤酵母重组工程菌成功分泌表达了耐辐射球菌 Pprl蛋白。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学张家港工业技术研究院

<120> 一种 DNA分子及毕赤酵母重组质粒和高效表达耐辐射球菌 Pprl 蛋白的毕赤酵母重组菌

<130> OP140354

<160> 42

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> 人工合成 <400> 1

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