WO2015133411A1 - 結晶性３'，５'－サイクリックジグアニル酸 - Google Patents

結晶性３'，５'－サイクリックジグアニル酸 Download PDF

Info

Publication number
WO2015133411A1
WO2015133411A1 PCT/JP2015/055975 JP2015055975W WO2015133411A1 WO 2015133411 A1 WO2015133411 A1 WO 2015133411A1 JP 2015055975 W JP2015055975 W JP 2015055975W WO 2015133411 A1 WO2015133411 A1 WO 2015133411A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
crystal
cyclic diguanylic
acid
diguanylic acid
cyclic
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/055975
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
寿基 田中
和也 石毛
Original Assignee
ヤマサ醤油株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ヤマサ醤油株式会社 filed Critical ヤマサ醤油株式会社
Priority to CA2941353A priority Critical patent/CA2941353C/en
Priority to CN201580010888.XA priority patent/CN106061988B/zh
Priority to EP15759144.7A priority patent/EP3121188B1/en
Priority to KR1020167025780A priority patent/KR101946808B1/ko
Priority to JP2016506468A priority patent/JP6392320B2/ja
Priority to US15/123,328 priority patent/US20170101432A1/en
Publication of WO2015133411A1 publication Critical patent/WO2015133411A1/ja
Priority to US16/441,484 priority patent/US10787479B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C07H19/207—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids the phosphoric or polyphosphoric acids being esterified by a further hydroxylic compound, e.g. flavine adenine dinucleotide or nicotinamide-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C07H19/213—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids containing cyclic phosphate

Definitions

  • the present invention relates to a crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid considered to be a useful substance as an adjuvant and a method for producing the crystal.
  • 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid is a signaling substance involved in bacterial biofilm formation and the like, and in recent years, its application as an adjuvant, antiviral agent, and anticancer agent is expected ( Non-patent document 1).
  • a method for producing 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid for example, an enzymatic synthesis method using diguanylate cyclase derived from the genus Geobacillus is known (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Conventionally, 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid has been obtained as a freeze-dried product or a co-crystal with cobalt or magnesium metal salt (Non-patent Documents 2 and 3).
  • 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid has been provided as a co-crystal containing a metal salt such as cobalt, and there are problems such as safety when the crystal is used as a pharmaceutical raw material. There was a risk of occurrence.
  • 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid free acid crystals that do not contain these metal salts have not been known at all, including the method for obtaining them.
  • all of the conventional crystal acquisition methods employ the vapor diffusion method, they are not suitable for acquiring a large amount of crystals in a short period of time. It was desired.
  • the method for producing the crystal is compared with the conventional method for producing a co-crystal with a metal salt in which an acid is added to a 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid aqueous solution and the pH is lowered to 1 to 3.
  • a metal salt in which an acid is added to a 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid aqueous solution and the pH is lowered to 1 to 3.
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal obtained by the method of the present invention exhibits inferior stability compared to existing crystals and does not contain extra metal ions, so it is easy to handle in various applications. It is useful as a pharmaceutical raw material.
  • FIG. 1 shows a crystal photograph of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystals.
  • FIG. 2 shows a crystal photograph of the magnesium co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 3 shows a crystal photograph of a cobalt co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 4 shows the results of thermogravimetry / differential thermal analysis of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystals.
  • FIG. 5 shows the results of thermogravimetry / differential thermal analysis of a magnesium co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 1 shows a crystal photograph of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystals.
  • FIG. 2 shows a crystal photograph of the magnesium co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 3 shows a crystal photograph of a cobalt
  • FIG. 6 shows the results of thermogravimetry / differential thermal analysis of a cobalt co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 7 shows an infrared absorption spectrum of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal.
  • FIG. 8 shows an infrared absorption spectrum of a magnesium co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 9 shows an infrared absorption spectrum of a cobalt co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 10 shows an X-ray diffraction spectrum of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal.
  • FIG. 11 shows the X-ray diffraction spectrum of a magnesium co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • FIG. 12 shows the X-ray diffraction spectrum of a cobalt co-crystal of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid.
  • the present invention provides a 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal represented by the following structural formula.
  • the 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention is a free acid crystal containing no metal salt obtained without using any metal such as cobalt or magnesium in the crystallization step.
  • “3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal” refers to a free acid crystal that does not contain the metal salt, unless otherwise specified.
  • the 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention has a purity of 97% or more, more preferably 99% or more, when the purity is tested by a high performance liquid chromatography method.
  • the water content of the 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention is 9.3 to 13.9% as measured by the Karl Fischer method. That is, the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention has 4 to 6 molecules, more specifically 3.9 to 6.3, per molecule of 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid. Two water molecules are bound or attached.
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention has an endotherm of 213 to 217 ° C. when analyzed with a thermogravimetric / differential thermal analysis (TG / DTA) apparatus (heating rate 5 ° C./min). Has a peak. The temperature is lower than that of a co-crystal with a known metal.
  • TG / DTA thermogravimetric / differential thermal analysis
  • the 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention is obtained as a cubic crystal.
  • conventionally known cocrystals with metals are hexagonal flat plates or biquadratic crystals, and the crystals of the present invention and conventionally known metals differ in their structures.
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention has a characteristic around 3163, 1712, 1637, 1601, 1530, 1470, 1386, 1339 (cm ⁇ 1 ) when an infrared absorption spectrum is measured. Has a peak.
  • Infrared absorption spectrum measurement generally includes an error range of less than 2 (cm ⁇ 1 ). Therefore, in addition to the crystal in which the above numerical value and the peak position in the infrared absorption spectrum completely coincide, the peak is 2 cm ⁇ . crystal matching in less than one error is also, 3 'of the present invention are included in the crystal of the 5'-cyclic di-guanylate. For example, when an infrared absorption spectrum is measured, 3163 ⁇ 1.9, 1712 ⁇ 1.9, 1637 ⁇ 1.9, 1601 ⁇ 1.9, 1530 ⁇ 1.9, 1470 ⁇ 1.9, 1386 ⁇ 1. 9, with a characteristic peak at 1339 ⁇ 1.9 (cm ⁇ 1 ),
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention has a characteristic peak in powder X-ray analysis.
  • the crystal of the present invention is analyzed by a powder X-ray diffractometer using Cu—K ⁇ rays. Then, as shown in Examples described later, the diffraction angles (2 ⁇ ) are 8.1, 8.3, 10.8, 11.8, 16.9, 19.1, 19.5, 22.4, 25. 0.0, 26.7, 27.0, and 27.7 (°) are characteristic peaks (see FIG. 10).
  • the diffraction angle (2 ⁇ ) in powder X-ray diffraction may include an error range of less than 5%. Therefore, in addition to crystals in which the diffraction angle of the peak in powder X-ray diffraction completely matches, Crystals that match with an error of less than 5% are also included in the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystals of the present invention.
  • the diffraction angle (2 ⁇ ) is 8.1 ⁇ 0.4, 8.3 ⁇ 0.4, 10.8 ⁇ 0.5, 11.8 ⁇ 0.5, 16.9. ⁇ 0.8, 19.1 ⁇ 0.9, 19.5 ⁇ 0.9, 22.4 ⁇ 1.1, 25.0 ⁇ 1.2, 26.7 ⁇ 1.3, 27.0 ⁇ 1 .3, 27.7 ⁇ 1.3 (°) with characteristic peaks.
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention has a purity reduction rate of less than 1% as measured by high performance liquid chromatography when stored at 50 ° C. for 167 days in a desiccator containing saturated saline. It is a very stable crystal.
  • the 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention can be obtained by adding an acid to a 3', 5'-cyclic diguanylic acid aqueous solution and lowering the pH to 1-3.
  • the 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid used for crystallization may be synthesized by a known method such as an enzyme synthesis method or a chemical synthesis method, but is preferably synthesized by an enzyme synthesis method.
  • a known method may be followed.
  • the method described in Patent Document 1 can be used.
  • 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid generated in the reaction solution can be isolated and purified by a usual chromatography method using activated carbon, ion exchange resin or the like.
  • an acid is added to a 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid aqueous solution, and the pH is lowered to pH 1 to 3, preferably pH 1.5 to 2.0.
  • the acid to be used include hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid and the like.
  • the addition is preferably performed slowly in order to prevent amorphization and rapid crystal precipitation due to the rapid addition of acid.
  • (1) a process of heating an isolated and purified 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid aqueous solution to 50 to 70 ° C., (2) an acid is added to the solution, and the pH is adjusted to 1 to 3
  • it may be carried out by a method comprising a step of lowering the pH to 1.5 to 2.0, and (3) a step of cooling the solution to 1 to 10 ° C., preferably 4 to 8 ° C.
  • the cooling of (3) is preferably performed slowly. Specifically, it is preferable to cool at a temperature gradient of ⁇ 3 to ⁇ 11 ° C./hr.
  • the steps (1) and (2) and the steps (2) and (3) can be performed simultaneously.
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal obtained by the above production method can be made into a product by filtering and then drying at 30 to 70 ° C. for 1 to 10 hours.
  • drying a method such as drying under reduced pressure can be appropriately used.
  • Example 1 Production of 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid crystals
  • Patent Document 1 3', 5'-cyclic diguanylic acid is enzymatically synthesized and purified. It was.
  • the 59.9 mM 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid solution (191 ml) obtained by purification was heated to 60 ° C. in an incubator, and 27.5 ml of 1N hydrochloric acid solution was stirred for 2 hours with stirring. Over a pH of 1.9.
  • the solution was cooled to a temperature of 5 ° C. with a temperature gradient of ⁇ 7 ° C./hr using a program incubator to precipitate crystals.
  • the crystals thus precipitated were collected through a glass filter (17G3) to obtain wet crystals.
  • the wet crystals were dried for 9 hours at 30 ° C. to obtain 8.095 g of dry crystals.
  • the crystallization start liquid was concentrated with an evaporator under heating at 55 ° C., and when turbidity was observed, it was filled up to 500 mL again, and heated at 55 ° C. for 30 minutes for complete dissolution. When this was re-concentrated and clarified and allowed to stand at 25 ° C. overnight, precipitation of hexagonal plate crystals was observed. Therefore, the crystals were sufficiently grown by vapor diffusion, and co-crystals with magnesium were formed. Obtained.
  • Example 2 Physical Properties of 3 ′, 5′-Cyclic Diguanylic Acid Crystal Results of instrumental analysis performed on the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal prepared in Example 1 above are as follows. Show.
  • FIGS. 1 Crystal form 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal prepared in Example 1 and co-crystal of 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid and magnesium prepared in Reference Example and cobalt Representative photographs of the co-crystal are shown in FIGS.
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention is a cubic crystal
  • the co-crystal with magnesium is a hexagonal plate crystal, as shown in FIGS.
  • the co-crystal with cobalt is a double quadrangular pyramid crystal, and the crystal of the present invention showed a completely different crystal form from the conventional crystal.
  • Table 1 shows the characteristic peak (cm ⁇ 1 ) values observed for each crystal. Further, the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention and the reference 3 ′, 5′-cyclic diguanylate magnesium cocrystal and 3 ′, 5′-cyclic diguanylate cocrystal The infrared absorption spectra are shown in FIGS. 7, 8, and 9, respectively.
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystals of the present invention had characteristic peaks in the vicinity of 3163, 1712, 1637, 1601, 1530, 1470, 1386, 1339 (cm ⁇ 1 ).
  • the co-crystal with magnesium has characteristic peaks around 3226, 1702, 1634, 1597, 1531, 1477, 1345 (cm ⁇ 1 )
  • the co-crystal with cobalt has 3179, 1638, 1576, 1534, 1487, and 1383 (cm ⁇ 1 ).
  • the 3 ′, 5′-cyclic diguanylic acid crystal of the present invention has a diffraction angle (2 ⁇ ) of 8.1, 8.3, 10.8, 11.8, Characteristic peaks were observed in the vicinity of 16.9, 19.1, 19.5, 22.4, 25.0, 26.7, and 27.0.27.7 (°).
  • FIG. 11 and Table 3 the results of 3 ′, 5′-cyclic diguanylate magnesium co-crystal are shown in FIG. 4 shows.
  • the 3 ', 5'-cyclic diguanylic acid of the present invention had an HPLC purity reduction rate of less than 1% when 167 days at 50 ° C., and was extremely stable. This value is comparable to that of conventional co-crystals with metals, and it has been clarified that it can be used practically.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

コバルトやマグネシウム等の金属塩を含有しない３'，５'－サイクリックジグアニル酸の遊離酸結晶。また、当該結晶を簡便かつ大量に取得できる方法を探索する。　３'，５'－サイクリックジグアニル酸水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させる工程を含む製造法によって、ｃｙｃｌｉ３'，５'－サイクリックジグアニル酸結晶を簡便かつ大量に取得することができる。当該結晶はコバルトやマグネシウムなどとの金属塩を含まない遊離酸結晶である。

Description

結晶性３’，５’－サイクリックジグアニル酸
　本発明はアジュバントとして有用な物質であると考えられる３’，５’－サイクリックジグアニル酸の結晶および当該結晶の製造法に関するものである。
３’，５’－サイクリックジグアニル酸は細菌のバイオフィルム形成などに関与するシグナル伝達物質であり、近年になってアジュバント、抗ウイルス剤、抗がん剤としての応用が期待されている（非特許文献１）。これまでに３’，５’－サイクリックジグアニル酸の製造方法としては、たとえばＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に由来するジグアニレートシクラーゼを用いた、酵素による合成法などが知られている（特許文献１）。
　また従来、３’，５’－サイクリックジグアニル酸は、凍結乾燥品またはコバルトやマグネシウム金属塩との共結晶として取得されている（非特許文献２、３）。
ＷＯ２０１３－１２９４２７
Ｖａｃｃｉｎｅ，　２８，　３０８０－３０８５（２０１０） Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７，　３２３５－３２３９（１９９０） ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，　２６４，　２２３－２２７（１９９０）
　従来３’，５’－サイクリックジグアニル酸は、コバルトなどの金属塩を含有する共結晶として提供されており、当該結晶を医薬品原料等に利用しようとした場合には、安全性等の問題が生じる恐れがあった。しかしながら、これらの金属塩を含有しない３’，５’－サイクリックジグアニル酸の遊離酸結晶については、その取得方法も含め従来全く知られていなかった。また、従来の結晶取得方法は、いずれも蒸気拡散法を採用していることから、短期間に大量の結晶を取得するには向いておらず、簡便に大量の結晶を取得できる方法の開発が望まれていた。
　本発明者らは、３’，５’－サイクリックジグアニル酸の結晶化に関して鋭意研究を重ねた結果、３’，５’－サイクリックジグアニル酸の遊離酸結晶を初めて得た。
　また、その結晶の製造法についても、３’，５’－サイクリックジグアニル酸水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させるという、従来の金属塩との共結晶の製造法と比較して、きわめて簡易な工程で作製可能であることを新たに見出した。
　本発明方法により得られた３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、既存の結晶と比べて遜色ない安定性を示し、余分な金属イオンを含まないことから様々な用途にて取り扱いやすく、医薬品原料等として有用である。
図１は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の結晶写真を示す。 図２は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のマグネシウム共結晶の結晶写真を示す。 図３は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のコバルト共結晶の結晶写真を示す。 図４は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の熱重量測定／示差熱分析結果を示す。 図５は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のマグネシウム共結晶の熱重量測定／示差熱分析結果を示す。 図６は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のコバルト共結晶の熱重量測定／示差熱分析結果を示す。 図７は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の赤外線吸収スペクトルを示す。 図８は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のマグネシウム共結晶の赤外線吸収スペクトルを示す。 図９は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のコバルト共結晶の赤外線吸収スペクトルを示す。 図１０は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶のＸ線回折スペクトルを示す。 図１１は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のマグネシウム共結晶のＸ線回折スペクトルを示す。 図１２は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸のコバルト共結晶のＸ線回折スペクトルを示す。
　本発明は、下記の構造式で示される３’，５’－サイクリックジグアニル酸の結晶を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、結晶化の工程において、コバルトやマグネシウムなどの金属を全く利用することなく得られる、金属塩を含まない遊離酸結晶である。なお、本発明における「３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶」は、特に限定しない場合、当該金属塩を含まない遊離酸結晶のことをいう。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、高速液体クロマトグラフィー法にて純度検定したとき、９７％以上、より好ましくは９９％以上の純度を有する。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶について、カールフィッシャー法にて測定したときの水分９．３～１３．９％である。すなわち本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶には、３’，５’－サイクリックジグアニル酸１分子に対し４～６分子の、より詳細には３．９～６．２分子の水分子が結合または付着する。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したとき、２１３～２１７℃に吸熱ピークを有する。当該温度は、公知の金属との共結晶のものに比べて低い。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、立方体結晶として得られる。これに対し、従来知られる金属との共結晶は六角平板または双四角錐結晶であり、本発明の結晶と従来知られる金属との共結晶は、その構造において相違するものである。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１６３、１７１２、１６３７、１６０１、１５３０、１４７０、１３８６、１３３９（ｃｍ-１）付近に特徴的なピークを有する。
　なお、赤外線吸収スペクトル測定では、一般に２（ｃｍ－１）未満の誤差範囲を含む場合があることから、上記数値と赤外線吸収スペクトルにおけるピークの位置が完全に一致する結晶のほか、ピークが２ｃｍ－１未満の誤差で一致する結晶も、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸の結晶に包含される。例えば、赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１６３±１．９、１７１２±１．９、１６３７±１．９、１６０１±１．９、１５３０±１．９、１４７０±１．９、１３８６±１．９、１３３９±１．９（ｃｍ-１）に特徴的なピークを有する、
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、粉末Ｘ線分析において特徴的なピークを有し、たとえば本発明の結晶をＣｕ－Ｋα線を用いた粉末Ｘ線回折装置で分析すると、後述実施例に示すように、回折角（２θ）が、８．１、８．３、１０．８、１１．８、１６．９、１９．１、１９．５、２２．４、２５．０、２６．７、２７．０、２７．７（°）付近に特徴的なピークを示す（図１０参照）。
　なお一般に、粉末Ｘ線回折における回折角（２θ）は、５％未満の誤差範囲を含む場合があることから、粉末Ｘ線回折におけるピークの回折角が完全に一致する結晶のほか、ピークの回折角が５％未満の誤差で一致する結晶も、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸の結晶に包含される。例えば、粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ）は、８．１±０．４、８．３±０．４、１０．８±０．５、１１．８±０．５、１６．９±０．８、１９．１±０．９、１９．５±０．９、２２．４±１．１、２５．０±１．２、２６．７±１．３、２７．０±１．３、２７．７±１．３（°）に特徴的なピークを有する。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、飽和食塩水を入れたデシケーター内にて、５０℃で１６７日間保存したときの高速液体クロマトグラフィー測定値における純度低下率１％未満であり、きわめて安定性の高い結晶である。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、３’，５’－サイクリックジグアニル酸水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させることによって得ることができる。
　結晶化に用いる３’，５’－サイクリックジグアニル酸は、酵素合成法や化学合成法など公知の方法によって合成すればよいが、酵素合成法によって合成したものが好ましい。酵素合成を行うに当たっては既知の方法に従えばよく、たとえば特許文献１に記載の方法を用いることができる。反応後、反応液中に生成した３’，５’－サイクリックジグアニル酸は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いた通常のクロマトグラフィー処理法により単離精製することができる。
　結晶化では、３’，５’－サイクリックジグアニル酸水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３、好ましくはｐＨ１．５～２．０まで低下させる。使用する酸としては、塩酸、硫酸、硝酸などを例示することができる。酸を急激に添加することによるアモルファス化や急激な結晶析出を防ぐため、添加はゆっくり行うことが好ましい。なお、結晶の取得収率が低い場合には、上記結晶の濾液から、上記した晶析処理を実施することで、２番結晶を回収してもよい。
　また、結晶化においては、（１）単離精製した３’，５’－サイクリックジグアニル酸水溶液を５０～７０℃まで加熱する工程、（２）当該溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３、好ましくはｐＨ１．５～２．０まで低下させる工程、（３）当該溶液を１～１０℃、好ましくは４～８℃となるまで冷却する工程、から成る方法によって行っても良い。より確実に結晶を析出させるため、（３）の冷却はゆっくりと行うことが好ましい。具体的には、温度勾配－３～－１１℃／ｈｒで冷却することが好ましい。さらに、（１）（２）の工程、（２）（３）の工程は、同時に行うこともできる。
　上記製法によって得られた３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、濾取した後、３０～７０℃で１～１０時間乾燥させることで、製品とすることができる。乾燥させる際には、減圧乾燥等の方法を適宜利用することができる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。
（実施例１）３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の製造
公知の方法（特許文献１）に従って、酵素的に３’，５’－サイクリックジグアニル酸を合成し、精製を行った。
　精製して得られた５９．９ｍＭの３’，５’－サイクリックジグアニル酸溶液（１９１ｍｌ）を、インキュベーターにて６０℃に加温し、撹拌しながら１Ｎの塩酸溶液　２７．５ｍｌを２時間かけて添加し、ｐＨ１．９とした。
塩酸溶液添加の後、プログラムインキュベーターを用いて、温度勾配－７℃／ｈｒで、液温が５℃になるまで冷却し、結晶を析出せしめた。このようにして析出した結晶はグラスフィルター（１７Ｇ３）にて濾取し、湿結晶を得た。湿結晶は９時間、３０℃乾燥して、乾燥結晶８．０９５ｇを得た。
（参考例）３’，５’－サイクリックジグアニル酸金属共結晶の製造
　非特許文献２、３の記載を参考に、下記のように３’，５’－サイクリックジグアニル酸とマグネシウムまたはコバルトとの共結晶を得た。
（参考例１）３’，５’－サイクリックジグアニル酸とマグネシウムとの共結晶
結晶化開始液（２ｍＭ　３’，５’－サイクリックジグアニル酸、２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．１）、７％（ｖ／ｖ）　２－ＭＰＤ）５００ｍＬを調製した。
当該結晶化開始液を５５℃の加温下、エバポレーターで濃縮し、白濁が観察された時点で再度５００ｍＬにフィルアップし、５５℃で３０分加温して完全溶解させた。これを再度濃縮し、清澄化させたものを２５℃で一晩静置すると、六角平板結晶の析出が観察されたことから、蒸気拡散法にて結晶を十分育成し、マグネシウムとの共結晶を得た。
（参考例２）３’，５’－サイクリックジグアニル酸とコバルトとの共結晶
結晶化開始液（２ｍＭ　３’，５’－サイクリックジグアニル酸，１１ｍＭ　ＣｏＣｌ２，２０ｍＭ　ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．１），７％（ｖ／ｖ）　２－ＭＰＤ）５００ｍｌを調製した。
当該結晶化開始液を５５℃の加温下、エバポレーターで濃縮した後、２５℃で一晩静置すると、双四角錐結晶の析出が観察されたことから、蒸気拡散法での結晶育成を行った。蒸気拡散法では、密閉容器（ＴＬＣ展開槽）に８００ｍＬの５０％２－ＭＰＤ（水：ＭＰＤ＝１：１）を張り、両ビーカーを６ヶ月静置することで、コバルトとの共結晶を得た。
（実施例２）３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の物性
　上記実施例１で調製した３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶に対して実施した機器分析の結果について以下に示す。
（機器分析）
（Ａ）純度検定
実施例１で得られた３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の純度を、高速液体クロマトグラフィー法で分析した結果、３’，５’－サイクリックジグアニル酸純度は９９．０％であった。なお、高速液体クロマトグラフィー法は以下の条件で行った。
（条件）
カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（ＹＭＣ社製）
溶出液：０．１Ｍ　ＴＥＡ－Ｐ（ｐＨ６．０）
検出法：ＵＶ２６０ｎｍによる検出
（Ｂ）結晶形
実施例１で調製した３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶ならびに参考例で調製した３’，５’－サイクリックジグアニル酸とマグネシウムとの共結晶およびコバルトとの共結晶の代表的な写真を図１～３に示す。図１に示すように、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸の結晶は立方体結晶であるのに対し、図２および３に示すようにマグネシウムとの共結晶は六角平板結晶、コバルトとの共結晶は双四角錐結晶であり、本発明の結晶は、従来の結晶とは全く異なる結晶形を示した。
（Ｃ）水分
実施例１で調製した３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶について、カールフィッシャー法により結晶の水分含量を測定した結果、水分含量は９．３～１３．９％であった。すなわち、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶では、３’，５’－サイクリックジグアニル酸１分子に対し約４～６分子、より詳細には３．９～６．２分子の水分子が結合又は付着していることが明らかとなった。
（Ｄ）示差走査熱量分析
　熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置（昇温速度５℃／分）で分析したところ、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、２１３～２１７℃において特徴的吸熱ピークを示した（図４）。これに対し、３’，５’－サイクリックジグアニル酸とマグネシウムとの共結晶は２２１℃付近、コバルトとの共結晶は２３９℃付近に特徴的な吸熱ピークを示した（それぞれ図５、６）。
（Ｅ）赤外線吸収スペクトル
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶ならびに参考例の３’，５’－サイクリックジグアニル酸とマグネシウムの共結晶および３’，５’－サイクリックジグアニル酸とコバルトの共結晶について、フーリエ変換赤外分光光度計Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｏｎｅ（Ｐｅｒｋｉｎ 　Ｅｌｍｅｒ）を用いてＡＴＲ（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　Ｔｏｔａｌ　Ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ、減衰全反射）法によって赤外線吸収スペクトルを測定した。
　それぞれの結晶で観察された特徴的なピーク（ｃｍ－１）の値を表１に示す。また、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶ならびに参考例の３’，５’－サイクリックジグアニル酸マグネシウム共結晶および３’，５’－サイクリックジグアニル酸コバルト共結晶の赤外吸収スペクトルをそれぞれ図７、図８、図９に示す。
　本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸の結晶は、３１６３、１７１２、１６３７、１６０１、１５３０、１４７０、１３８６、１３３９（ｃｍ-１）付近に特徴的なピークを有していた。これに対し、マグネシウムとの共結晶は３２２６、１７０２、１６３４、１５９７、１５３１、１４７７、１３４５（ｃｍ-１）付近に特徴的なピークを有し、コバルトとの共結晶は３１７９、１６３８、１５７６、１５３４、１４８７、１３８３（ｃｍ-１）付近に特徴的なピークを有していた。これらの結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（Ｆ）粉末Ｘ線回折
本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶ならびに参考例の３’，５’－サイクリックジグアニル酸とコバルトの共結晶および３’，５’－サイクリックジグアニル酸とマグネシウムの共結晶について、Ｘ線回折装置Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ ＭＰＤ（スペクトリス）を用い、下記の測定条件でＸ線回折スペクトルを測定した。
（測定条件）
ターゲット：Ｃｕ
Ｘ線管電流：４０ｍＡ
Ｘ線管電圧：４５ｋＶ
走査範囲：２θ＝４．０～４０．０°
前処理：めのう製乳鉢を用いて粉砕
　図１０および表２に示すように、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶は、回折角（２θ）が、８．１、８．３、１０．８、１１．８、１６．９、１９．１、１９．５、２２．４、２５．０、２６．７、２７．０．２７．７（°）付近に特徴的なピークを示した。なお、比較データとして３’，５’－サイクリックジグアニル酸マグネシウム共結晶の結果を図１１と表３に、３’，５’－サイクリックジグアニル酸コバルト共結晶の結果を図１２と表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（Ｇ）安定性
本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶ならびに参考例のコバルトとの共結晶およびマグネシウムとの共結晶を、飽和食塩水を入れたデシケーター内に入れ５０℃で保存し、保存開始から０、７、３１、８４、１６７日目後にそれぞれＨＰＬＣ純度を測定した。ＨＰＬＣ純度（％）の測定結果を下記表５に、また、測定０日目のＨＰＬＣ純度を１００％としたときの、各測定日における保存開始からの残存率（％）を表６示す。
　結果、本発明の３’，５’－サイクリックジグアニル酸は、５０℃で１６７日間したときのＨＰＬＣ純度低下率が１％未満であり、きわめて安定性が高いものであることが判明した。この値は、従来の金属との共結晶と比べても遜色ないものであり、実用的に使用可能なものであることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007

Claims (9)

  1. 　３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶。
  2. 　高速液体クロマトグラフィーで測定したとき９７％以上の純度を有する請求項１記載の結晶。
  3. 　高速液体クロマトグラフィーで測定したとき９９％以上の純度を有する請求項１または２記載の結晶。
  4. 　３’，５’－サイクリックジグアニル酸１分子に対し約４～６分子の水分子が結合又は付着している、請求項１から３のいずれかに記載の結晶。
  5. 　熱重量測定／示差熱分析（ＴＧ／ＤＴＡ）装置により測定したとき、２１３～２１７℃に吸熱ピークを示す、請求項１から４のいずれかに記載の結晶。
  6. 　赤外線吸収スペクトルを測定したとき、３１６３、１７１２、１６３７、１６０１、１５３０、１４７０、１３８６、１３３９（ｃｍ-１）付近に特徴的なピークを有する、請求項１から５のいずれかに記載の結晶。
  7. 　粉末Ｘ線分析において、回折角（２θ）が、８．１、８．３、１０．８、１１．８、１６．９、１９．１、１９．５、２２．４、２５．０、２６．７、２７．０．２７．７（°）付近に特徴的なピークを示す、請求項１から６のいずれかに記載の結晶。
  8. 　３’，５’－サイクリックジグアニル酸水溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させる工程を含む、３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の製造法。
  9. 　下記（１）～（３）の工程を含む３’，５’－サイクリックジグアニル酸結晶の製造法。
    （１）３’，５’－サイクリックジグアニル酸水溶液を５０～７０℃まで加熱する工程、
    （２）３’，５’－サイクリックジグアニル酸溶液に酸を添加し、ｐＨ１～３まで低下させる工程、
    （３）３’，５’－サイクリックジグアニル酸溶液を１～１０℃になるまで冷却する工程。
PCT/JP2015/055975 2014-03-03 2015-02-27 結晶性３'，５'－サイクリックジグアニル酸 WO2015133411A1 (ja)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2941353A CA2941353C (en) 2014-03-03 2015-02-27 Crystalline 3',5'-cyclic diguanylic acid
CN201580010888.XA CN106061988B (zh) 2014-03-03 2015-02-27 结晶性3’,5’-环二鸟苷酸
EP15759144.7A EP3121188B1 (en) 2014-03-03 2015-02-27 Crystalline 3',5'-cyclic diguanylic acid
KR1020167025780A KR101946808B1 (ko) 2014-03-03 2015-02-27 결정성 3',5'-사이클릭 디구아닐산
JP2016506468A JP6392320B2 (ja) 2014-03-03 2015-02-27 結晶性３’，５’−サイクリックジグアニル酸
US15/123,328 US20170101432A1 (en) 2014-03-03 2015-02-27 Crystalline 3',5'-cyclic diguanylic acid
US16/441,484 US10787479B2 (en) 2014-03-03 2019-06-14 Crystalline 3′,5′-cyclic diguanylic acid

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014040108 2014-03-03
JP2014-040108 2014-03-03

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/123,328 A-371-Of-International US20170101432A1 (en) 2014-03-03 2015-02-27 Crystalline 3',5'-cyclic diguanylic acid
US16/441,484 Division US10787479B2 (en) 2014-03-03 2019-06-14 Crystalline 3′,5′-cyclic diguanylic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015133411A1 true WO2015133411A1 (ja) 2015-09-11

Family

ID=54055217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/055975 WO2015133411A1 (ja) 2014-03-03 2015-02-27 結晶性３'，５'－サイクリックジグアニル酸

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20170101432A1 (ja)
EP (1) EP3121188B1 (ja)
JP (1) JP6392320B2 (ja)
KR (1) KR101946808B1 (ja)
CN (1) CN106061988B (ja)
CA (1) CA2941353C (ja)
WO (1) WO2015133411A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106061988B (zh) 2014-03-03 2019-12-10 雅玛山酱油株式会社 结晶性3’,5’-环二鸟苷酸
CA2942283C (en) 2014-03-14 2020-07-28 Yamasa Corporation Inclusion compound of 3',5'-cyclic diadenylic acid and manufacturing method thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010101526A1 (en) * 2009-03-02 2010-09-10 Nanyang Technological University A diguanylate cyclase, method of producing the same and its use in the manufacture of cyclic-di-gmp and analogues thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005005450A1 (ja) 2003-07-15 2005-01-20 Mitsui Chemicals, Inc. 環状ビスジヌクレオシドの合成方法
EP1782826A1 (en) 2005-11-08 2007-05-09 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH PQS and c-diGMP and its conjugates as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
CN102199183B (zh) * 2010-03-26 2013-12-18 北京大学 环二鸟苷酸及其类似物和制备方法
US9061048B2 (en) 2010-12-15 2015-06-23 The Regents Of The University Of California Cyclic di-AMP induction of type I interferon
WO2013129427A1 (ja) 2012-02-29 2013-09-06 ヤマサ醤油株式会社 cyclic di-GMPの実践的酵素合成法
CN106061988B (zh) 2014-03-03 2019-12-10 雅玛山酱油株式会社 结晶性3’,5’-环二鸟苷酸
CA2942283C (en) 2014-03-14 2020-07-28 Yamasa Corporation Inclusion compound of 3',5'-cyclic diadenylic acid and manufacturing method thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010101526A1 (en) * 2009-03-02 2010-09-10 Nanyang Technological University A diguanylate cyclase, method of producing the same and its use in the manufacture of cyclic-di-gmp and analogues thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAZUYA ISHIGE, BIOSCIENCE & INDUSTRY, vol. 70, no. 6, 1 November 2012 (2012-11-01), pages 466 - 467, XP008174493 *
NORIAKI HIRAYAMA, YUKI KAGOBUTSU KESSHO SAKUSEI HANDBOOK, 2008, pages 17 - 23 , 37 to 40, 45 to 51, 57 to 65, XP008183763 *
See also references of EP3121188A4 *
YAN H ET AL., NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES & NUCLEIC ACIDS, vol. 26, 2007, pages 189 - 204, XP 055331730 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101946808B1 (ko) 2019-02-12
EP3121188A4 (en) 2017-02-22
EP3121188B1 (en) 2021-12-29
US20170101432A1 (en) 2017-04-13
CA2941353C (en) 2019-08-20
JP6392320B2 (ja) 2018-09-19
KR20160123379A (ko) 2016-10-25
EP3121188A1 (en) 2017-01-25
CN106061988A (zh) 2016-10-26
CA2941353A1 (en) 2015-09-11
CN106061988B (zh) 2019-12-10
US20190315795A1 (en) 2019-10-17
JPWO2015133411A1 (ja) 2017-04-06
US10787479B2 (en) 2020-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018117267A1 (ja) 置換ピペリジン化合物の塩
US10787479B2 (en) Crystalline 3′,5′-cyclic diguanylic acid
US10836783B2 (en) Inclusion compound of 3′ ,5′-cyclic diadenylic acid and manufacturing method thereof
WO2021075494A1 (ja) センタナファジンの製造方法
TWI496789B (zh) 表柔比星（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）鹽酸鹽之結晶
JP6826267B2 (ja) クエン酸誘導体のジアステレオマーの製造方法
WO2020004358A1 (ja) ３'，３'－ｃＧＡＭＰの水和物結晶
JP4892821B2 (ja) エパルレスタット製造法
JP7201263B2 (ja) Ｃｙｃｌｉｃ－ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩結晶
CN109689620B (zh) 拆分巴氯芬盐的方法
RU2538593C2 (ru) НОВЫЕ СТАБИЛЬНЫЕ КРИСТАЛЛЫ МОНОГИДРОХЛОРИДА 1-(2-β-D-АРАБИНОФУРАНОЗИЛ)ЦИТОЗИНА
JP2011144162A (ja) 光学活性４−アミノ−３−（４−クロロフェニル）ブタン酸の新規な結晶およびその製造方法
JP2011016750A (ja) ２−アセチルアミノメチル−４−（４−フルオロベンジル）モルホリンの精製方法
JPS60204741A (ja) Ｄｌ−リンゴ酸の光学分割法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15759144

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2941353

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016506468

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15123328

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20167025780

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015759144

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015759144

Country of ref document: EP