CN106061988B - 结晶性3’,5’-环二鸟苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供不含有钴或者镁等金属盐的3’,5’‑环二鸟苷酸的游离酸结晶。另外，探索可简便且大量地获取该结晶的方法。通过包括在3’,5’‑环二鸟苷酸水溶液中添加酸使pH降低至pH1～3的工序的制造方法，可以简便且大量地获取3’,5’‑环二鸟苷酸结晶。该结晶是不含有钴或镁等金属盐的游离酸结晶。
Description
【技术领域】
本发明涉及作为辅助剂有用的物质3’,5’-环二鸟苷酸的结晶以及该结晶的制造方法。
【背景技术】
3’,5’-环二鸟苷酸是参与细菌的生物膜形成的信号传达物质，近年来作为辅助剂、抗病毒剂、抗癌剂的应用被受期待(非专利文献1)。至今，作为3’,5’-环二鸟苷酸的制造方法，例如已知利用来源于Geobacillus属的二鸟甘酸环化酶的、基于酶的合成方法(专利文献1)。
另外，以往，3’,5’-环二鸟苷酸是作为冷冻干燥品或者与钴或镁的金属盐的共晶而得到的(非专利文献2、3)。
【现有技术文献】
【专利文献】
【专利文献1】WO2013－129427号
【非专利文献】
【非专利文献1】Vaccine，28，3080-3085(2010)
【非专利文献2】Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，3235-3239(1990)
【非专利文献3】FEBS Letters，264，223-227(1990)
【发明内容】
【发明要解决的问题】
现有的3’,5’-环二鸟苷酸是作为含有钴等的金属盐的共晶而提供的，在将该结晶应用到医药品原料等领域时，有可能发生安全性等的问题。但是，对于不含有这些金属盐的3’,5’-环二鸟苷酸的游离酸结晶，包括其获取方法在内至今仍为未知。另外，现有的结晶获取方法都是利用蒸汽扩散法，因此，不适合在短时间内获取大量的结晶，因此能简便且大量获取的方法的开发一直被人们所期待。
【用于解决问题的方案】
本发明人对3’,5’-环二鸟苷酸的结晶化进行了深入研究，首次得到了3’,5’-环二鸟苷酸的游离酸结晶。
另外，对于该结晶的制造方法，还发现了，能够以在3’,5’-环二鸟苷酸的水溶液中添加酸使pH降低至pH1～3这样的、与现有的金属盐共晶的制造方法相比极其简便的工序进行制造。
【发明效果】
通过本发明方法得到的3’,5’-环二鸟苷酸结晶显示出不逊色于现有结晶的稳定性，且不含多余的金属离子，因此在各种用途中容易操作，作为医药品原料等也很实用。
【附图说明】
【图1】图1为3’,5’-环二鸟苷酸结晶的结晶照片。
【图2】图2为3’,5’-环二鸟苷酸的镁共晶的结晶照片。
【图3】图3为3’,5’-环二鸟苷酸的钴共晶的结晶照片。
【图4】图4为3’,5’-环二鸟苷酸结晶的热重测定/差示热分析结果。
【图5】图5为3’,5’-环二鸟苷酸的镁共晶的热重测定/差示热分析结果。
【图6】图6为3’,5’-环二鸟苷酸的钴共晶的热重测定/差示热分析结果。
【图7】图7为3’,5’-环二鸟苷酸结晶的红外线吸收光谱。
【图8】图8为3’,5’-环二鸟苷酸的镁共晶的红外线吸收光谱。
【图9】图9为3’,5’-环二鸟苷酸的钴共晶的红外线吸收光谱。
【图10】图10为3’,5’-环二鸟苷酸结晶的X射线衍射光谱。
【图11】图11为3’,5’-环二鸟苷酸的镁共晶的X射线衍射光谱。
【图12】图12为3’,5’-环二鸟苷酸的钴共晶的X射线衍射光谱。
【具体实施方式】
本发明提供由以下结构式所示的3’,5’-环二鸟苷酸的结晶。
【化学式1】
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶是在结晶化工序中完全不利用钴或镁等金属而得到的不含金属盐的游离酸结晶。此外，在本发明中的“3’,5’-环二鸟苷酸结晶”在没有特别限定的情况下，是指该不含金属盐的游离酸结晶。
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶在通过高效液相色谱法进行纯度测试时，具有97％以上、更优选99％以上的纯度。
针对本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶利用卡尔费休法测定时的水分为9.3～13.9％。即，本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶中，相对于1分子的3’,5’-环二鸟苷酸键合或者附着有4～6分子、更详细而言3.9～6.2分子的水分子。
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶在使用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升温速度5℃/分钟)进行分析时，在213～217℃具有吸热峰。该温度比公知的与金属的共晶低。
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶作为立方体结晶而得到。相对于此，已知的与金属的共晶为六角板状或者双四角锥结晶，本发明的结晶和已知的与金属的共晶在其结构上有差异。
在对本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶测定红外线吸收光谱时，在3136、1712、1637、1601、1530、1470、1386、1339(cm-1)附近具有特征峰。
另外，在红外线吸收光谱测定中，一般包含小于2(cm-1)的误差范围，因此，除了上述数值与红外线吸收光谱的峰位置完全一致的结晶以外，峰值在小于2cm-1的误差内一致的结晶也包括在本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶中。例如，在测定红外线吸收光谱时，在3163±1.9、1712±1.9、1637±1.9、1601±1.9、1530±1.9、1470±1.9、1386±1.9、1339±1.9(cm-1)具有特征峰。
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶在粉末X射线分析中具有特征峰，例如对本发明的结晶采用使用了Cu－Kα射线的粉末X射线衍射装置进行分析时，如后述实施例所示，衍射角(2θ)在8.1、8.3、10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0、27.7(°)附近显示特征峰(参照图10)。
此外，一般粉末X射线衍射的衍射角(2θ)有时包括小于5％的误差范围，因此，除了粉末X射线衍射中的峰的衍射角完全一致的结晶以外，峰的衍射角在小于5％的误差内一致的结晶也包括在本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶中。例如在粉末X射线衍射中，衍射角(2θ)在8.1±0.4、8.3±0.4、10.8±0.5、11.8±0.5、16.9±0.8、19.1±0.9、19.5±0.9、22.4±0.1、25.0±1.2、26.7±1.3、27.0±1.3、27.7±0.3(°)具有特征峰。
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶在装有饱和食盐水的干燥器中，以50℃保存167天时的高效液相色谱测定值的纯度降低率低于1％，是稳定性极高的结晶。
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶可通过在3’,5’-环二鸟苷酸的水溶液中添加酸使pH降低至pH1～3而得到。
用于结晶化的3’,5’-环二鸟苷酸通过酶合成法或者化学合成法等公知的方法合成即可，但优选通过酶合成法合成。进行酶合成法时可以按照已知的方法进行，例如可利用专利文献1记载的方法。反应后，在反应液中生成的3’,5’-环二鸟苷酸可通过使用了活性炭或者离子交换树脂等的通常的色谱处理法进行分离纯化。
结晶化时，在3’,5’-环二鸟苷酸的水溶液中添加酸使pH降低至pH1～3，优选降低至pH1.5～2.0。作为使用的酸，可举出盐酸、硫酸、硝酸等。为了防止因急速加入酸而导致的非结晶化或者结晶急剧析出，优选缓慢添加。另外，结晶的获得产量低时，可通过从上述结晶的滤液实施上述析晶处理来回收第二晶体。
另外，结晶化可按照由以下工序构成的方法进行：(1)将分离纯化得到的3’,5’-环二鸟苷酸的水溶液加热至50～70℃的工序；(2)在该溶液中添加酸使pH降低至pH1～3，优选降低至pH1.5～2.0的工序；以及(3)将该溶液冷却至1～10℃，优选冷却至4～8℃的工序。为了更可靠地使结晶析出，优选缓慢进行(3)的冷却工序。具体地，优选以温度梯度-3～-11℃/hr进行冷却。此外，(1)和(2)工序、(2)和(3)工序可同时进行。
由上述制造方法得到的3’,5’-环二鸟苷酸结晶可通过在过滤后以30～70℃干燥1～10小时而得到产品。在干燥时，可适当地利用减压干燥等方法。
【实施例】
以下通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不限定于此。
(实施例1)3’,5’-环二鸟苷酸结晶的制造
按照公知方法(专利文献1)，利用酶合成法来合成3’,5’-环二鸟苷酸，进行纯化。
将纯化得到的59.9mM的3’,5’-环二鸟苷酸溶液(191ml)在培养器中加温至60℃，用2小时边搅拌边添加1N的盐酸溶液27.5ml，使pH达到pH1.9。
添加盐酸溶液后，利用程控培养器在温度梯度-7℃/hr下将溶度冷却至5℃使结晶析出。这样析出的结晶利用玻璃过滤器(17G3)过滤，得到湿结晶。湿结晶在30℃下干燥9小时，得到干燥结晶8.095g。
(参考例)3’,5’-环二鸟苷酸金属共晶的制造
参考非专利文献2、3的记载，按如下方式得到了3’,5’-环二鸟苷酸与镁或者钴的共晶。
(参考例1)3’,5’-环二鸟苷酸与镁的共晶
制备结晶化开始液(2mM 3’,5’-环二鸟苷酸、20mM MgCl2、20mM glycine-HCl(pH2.1)、7％(v/v)2-MPD)500mL。
将该结晶化开始液在55℃下加热，在蒸发器中浓缩，在观察到白浊的时刻再次添加溶剂至500mL，在55℃加热30分钟使之完全溶解。对其进行再浓缩，将净化产物在25℃静置一晚后，观察到六角平板状结晶的析出，利用蒸汽扩散法充分培养结晶，得到与镁的共晶。
(参考例2)3’,5’-环二鸟苷酸与钴的共晶
制备结晶化开始液(2mM 3’,5’-环二鸟苷酸、11mM CoCl2、20mM glycine-HCl(pH2.1)、7％(v/v)2-MPD)500ml。
将该结晶化开始液在55℃下加热，在蒸发器中浓缩后，在25℃静置一晚，观察到双四角锥结晶的析出，利用蒸汽扩散法进行结晶培养。蒸汽扩散法中，在密闭容器(TLC展开槽)中添加800mL的50％的2-MPD(水：MPD＝1：1)，将两个烧杯静置6个月，得到与钴的共晶。
(实施例2)3’,5’-环二鸟苷酸结晶的物理性质
针对上述实施例1中制备的3’,5’-环二鸟苷酸结晶实施的仪器分析结果如下所示。
(仪器分析)
(A)纯度检验
采用高效液相色谱法分析实施例1中得到的3’,5’-环二鸟苷酸结晶的纯度，结果为3’,5’-环二鸟苷酸的纯度为99.0％。另外，高效液相色谱法是在以下条件下进行的。
(条件)
柱：Hydrosphere C18(YMC社制)
洗脱液：0.1M TEA-P(pH6.0)
检测方法：在UV260nm下检测
(B)结晶形状
将实施例1中制备的3’,5’-环二鸟苷酸结晶，以及参考例中制备的3’,5’-环二鸟苷酸与镁的共晶和与钴的共晶的代表性照片示于图1～3。如图1所示，本发明的3’,5’-环二鸟苷酸的结晶为立方体结晶，而图2和3所示的与镁的共晶为六角平板状结晶，与钴的共晶为双四角锥结晶，本发明的结晶显示出与现有结晶完全不同的结晶形状。
(C)水分
对实施例1中制备的3’,5’-环二鸟苷酸结晶，利用卡尔费休法测定结晶的水分含量，结果为水分含量为9.3～13.9％。即，明确了本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶中，相对于1分子的3’,5’-环二鸟苷酸键合或者附着有约4～6分子、更具体而言3.9～6.2分子的水分子。
(D)差示扫描量热分析
利用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升温速度5℃/分钟)进行分析，结果为本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶在213～217℃显示特征吸热峰(图4)。相对于此，3’,5’-环二鸟苷酸与镁的共晶在221℃附近、与钴的共晶在239℃附近显示特征吸热峰(分别为图5、6)。
(E)红外线吸收光谱
对本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶，以及参考例的3’,5’-环二鸟苷酸与镁的共晶和3’,5’-环二鸟苷酸与钴的共晶，利用傅立叶变换红外分光光度计Spectrum One(PerkinElmer)，采用ATR(Attenuated Total Reflectance，衰减全反射)法测定红外线吸收光谱。
将对各结晶观察到的特征峰(cm-1)的值示于表1。另外，将本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶，以及参考例的3’,5’-环二鸟苷酸镁共晶和3’,5’-环二鸟苷酸钴共晶的红外线吸收光谱分别示于图7、图8、图9。
本发明的3’,5’-环二鸟苷酸的结晶在3163、1712、1637、1601、1530、1470、1386、1339(cm-1)附近具有特征峰。相对于此，与镁的共晶在3226、1702、1634、1597、1531、1477、1345(cm-1)附近具有特征峰，与钴的共晶在3179、1638、1576、1534、1487、1383(cm-1)附近具有特征峰。将其结果示于表1。
【表1】
(F)粉末X射线衍射
对本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶，以及参考例的3’,5’-环二鸟苷酸与钴的共晶和3’,5’-环二鸟苷酸与镁的共晶，利用X射线衍射装置X’Pert PRO MPD(Spectris Co.,Ltd.)，在以下测定条件下测定X射线衍射光谱。
(测定条件)
靶：Cu
X射线管电流：40mA
X射线管电压：45kV
扫描范围：2θ＝4.0～40.0°
预处理：利用玛瑙制研钵粉碎
如图10和表2所示，本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶在衍射角(2θ)为8.1、8.3、10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0.27.7(°)附近显示特征峰。另外，作为比较数据将3’,5’-环二鸟苷酸镁共晶的结果示于图11和表3，将3’,5’-环二鸟苷酸钴共晶的结果示于图12和表4。
【表2】
【表3】
【表4】
(G)稳定性
将本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶，以及参考例的与钴的共晶和与镁的共晶放入装有饱和食盐水的干燥器中在50℃下保存，分别在保存开始后第0、7、31、84、167天后测定HPLC纯度。将HPLC纯度(％)的测定结果示于下述表5，另外，将第0天测定的HPLC纯度视为100％时各测定日相对于开始保存时的残存率(％)示于表6。
结果为本发明的3’,5’-环二鸟苷酸在50℃下保存167天时的HPLC纯度降低率低于1％，表明稳定性极高。该值明确地说明了本发明的3’,5’-环二鸟苷酸结晶不逊色于现有的与金属的共晶，可以实际应用。
【表5】
| (天数) | 0 | 7 | 31 | 84 | 167 |
| 本发明(％) | 99.0 | 99.1 | 98.6 | 98.9 | 98.9 |
| Mg(％) | 99.8 | 99.7 | 99.6 | 99.8 | 99.3 |
| Co(％) | 99.9 | 99.9 | 99.7 | 99.7 | 99.4 |
【表6】
| (天数) | 0 | 7 | 31 | 84 | 167 |
| 本发明(％) | 100 | 100.1 | 99.6 | 99.9 | 100.0 |
| Mg(％) | 100 | 100 | 99.8 | 100.0 | 99.5 |
| Co(％) | 100 | 100 | 99.8 | 99.8 | 99.6 |
Claims (7)
1.一种3’,5’-环二鸟苷酸结晶，其特征在于，其是不含金属盐的游离酸结晶；
在粉末X 射线分析中，在衍射角2θ为8.1、8.3、10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0、27.7°附近具有特征峰。
2.如权利要求1 所述的结晶，其特征在于，利用高效液相色谱测定时具有97％以上的纯度。
3.如权利要求1 所述的结晶，其特征在于，利用高效液相色谱测定时具有99％以上的纯度。
4.如权利要求1 至3 中任一项所述的结晶，其特征在于，相对于一分子的3’,5’-环二鸟苷酸，键合或者附着有3.9～6.2 分子的水分子。
5.如权利要求1 至3 中任一项所述的结晶，其特征在于，利用热重测定/差示热分析装置，即TG/DTA 装置测定时，在213～217℃显示吸热峰。
6.如权利要求1 至3 中任一项所述的结晶，其特征在于，测定红外线吸收光谱时，在3136、1712、1637、1601、1530、1470、1386、1339cm -1 附近具有特征峰。
7.一种3’,5’-环二鸟苷酸结晶的制造方法，其特征在于，包括以下（1）～（4）的工序：
（1）将3’,5’-环二鸟苷酸水溶液加热至50～70℃的工序；
（2）在50～70°C 的3’,5’-环二鸟苷酸水溶液中添加酸使pH 降低至pH1～3 的工序；
（3）将3’,5’-环二鸟苷酸溶液冷却至1～10℃，并以温度梯度-3℃～-11℃/hr 进行冷却，进而在所述水溶液中使所述3’,5’-环二鸟苷酸结晶析出的工序；
（4）过滤所述3’,5’-环二鸟苷酸结晶的工序。
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