KR20160123379A - 결정성 3'',5''-사이클릭 디구아닐산 - Google Patents

결정성 3'',5''-사이클릭 디구아닐산 Download PDF

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Abstract

코발트나 마그네슘 등의 금속염을 함유하지 않는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 유리산 결정. 또한, 해당 결정을 간편하고 대량으로 얻을 수 있는 방법을 탐색한다.
3',5'-사이클릭 디구아닐산 수용액에 산을 첨가하고, pH 1~3까지 저하시키는 공정을 포함하는 제조법에 의해, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정을 간편하고 대량으로 얻을 수 있다. 해당 결정은 코발트나 마그네슘 등의 금속염을 포함하지 않는 유리산 결정이다.

Description

결정성 3',5'-사이클릭 디구아닐산{CRYSTALLINE 3',5'-CYCLIC DIGUANYLIC ACID}
본 발명은 아쥬반트로서 유용한 물질이라고 생각되는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 결정 및 해당 결정의 제조법에 관한 것이다.
3',5'-사이클릭 디구아닐산은 세균의 바이오필름 형성 등에 관여하는 시그널 전달 물질이며, 근년에 아쥬반트, 항바이러스제, 항암제로서의 응용이 기대되고 있다(비특허문헌 1). 지금까지 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 제조방법으로서는, 예를 들면 지오바실러스(Geobacillus)속에서 유래하는 디구아닐레이트 싸이클라아제(고리화효소)를 이용한 효소에 의한 합성법 등이 알려져 있다(특허문헌 1).
또한, 종래 3',5'-사이클릭 디구아닐산은 동결 건조품 또는 코발트나 마그네슘 금속염의 공결정으로서 얻어졌다(비특허문헌 2, 3).
특허문헌 1: 국제공개 WO2013-129427호 공보
비특허문헌 1: Vaccine, 28, 3080-3085(2010) 비특허문헌 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3235-3239(1990) 비특허문헌 3: FEBS Letters, 264, 223-227(1990)
종래 3',5'-사이클릭 디구아닐산은 코발트 등의 금속염을 함유하는 공결정으로서 제공되고 있어, 해당 결정을 의약품 원료 등으로 이용하려고 한 경우에는 안전성 등의 문제가 생길 우려가 있었다. 하지만, 이 금속염을 함유하지 않는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 유리산(遊離酸) 결정에 대해서는, 그 취득 방법도 포함하여 종래에 전혀 알려지지 않았다. 또한, 종래의 결정 취득 방법은 어느 것이나 증기확산법을 이용하고 있기 때문에, 단기간에 대량의 결정을 취득하기에는 적합하지 않고, 간편하게 대량의 결정을 취득할 수 있는 방법의 개발이 기대되고 있었다.
본 발명자들은 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 결정화에 관하여 예의 연구를 거듭한 결과, 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 유리산 결정을 처음으로 얻었다.
또한, 그 결정의 제조법에 대해서도, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 수용액에 산을 첨가하여 pH 1~3까지 저하시키는 종래의 금속염과의 공결정의 제조법과 비교하여, 아주 간단한 공정으로 제작가능한 것을 새롭게 알아냈다.
본 발명의 방법에 의해 얻어진 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 기존의 결정과 비교하여 손색이 없는 안정성을 나타내고, 여분의 금속 이온을 포함하지 않는 것 때문에 여러 가지 용도로 취급하기 쉽고, 의약품 원료 등으로서 유용하다.
도 1은 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 결정사진을 나타낸다.
도 2는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 마그네슘 공결정의 결정사진을 나타낸다.
도 3은 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 코발트 공결정의 결정사진을 나타낸다.
도 4는 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 열중량측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 5는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 마그네슘 공결정의 열중량측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 6은 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 코발트 공결정의 열중량측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 7은 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 마그네슘 공결정의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 코발트 공결정의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 마그네슘 공결정의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 코발트 공결정의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명은 하기의 구조식으로 나타내는 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 결정을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure pct00001
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은, 결정화의 공정에서 코발트나 마그네슘 등의 금속을 전혀 이용하지 않고 얻을 수 있는, 금속염을 포함하지 않는 유리산 결정이다. 한편, 본 발명에서의 「3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정」은 특히 한정하지 않을 경우, 해당 금속염을 포함하지 않는 유리산 결정을 말한다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 고속 액체 크로마토그래피법으로 순도 검정했을 때, 97% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가진다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정에 대해서, 칼 피셔법으로 측정했을 때의 수분은 9.3~13.9%이다. 다시 말해 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정에는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 1분자에 대하여 4~6분자의, 보다 상세하게는 3.9~6.2분자의 물분자가 결합 또는 부착된다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 열중량측정/시차 열분석(TG/DTA)장치(승온속도 5℃/분)로 분석했을 때, 213~217℃에 흡열피크를 가진다. 해당 온도는 공지의 금속과의 공결정인 것에 비하여 낮다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 입방체결정으로서 얻을 수 있다. 이에 비하여, 종래의 알려진 금속과의 공결정은 육각평판(六角平板) 또는 쌍 사각추 결정이며, 본 발명의 결정과 종래 알려진 금속의 공결정은 그 구조에 있어서 다른 것이다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때, 3163, 1712, 1637, 1601, 1530, 1470, 1386, 1339(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가진다.
한편, 적외선 흡수 스펙트럼 측정에서는, 일반적으로 2(cm-1) 미만의 오차범위를 포함하는 경우가 있으므로, 상기 수치와 적외선 흡수 스펙트럼에서의 피크의 위치가 완전히 일치하는 결정 외에, 피크가 2cm-1 미만의 오차로 일치하는 결정도 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 결정에 포함된다. 예를 들면, 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때, 3163±1.9, 1712±1.9, 1637±1.9, 1601±1.9, 1530±1.9, 1470±1.9, 1386±1.9, 1339±1.9(cm-1)에 특징적인 피크를 가진다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 분말 X선 분석에서 특징적인 피크를 가지고, 예를 들면 본 발명의 결정을 Cu-Kα선을 이용한 분말 X선 회절장치로 분석하면, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이 회절각(2θ)이 8.1, 8.3, 10.8, 11.8, 16.9, 19.1, 19.5, 22.4, 25.0, 26.7, 27.0, 27.7(°) 부근에 특징적인 피크를 나타낸다(도 10 참조).
한편, 일반적으로 분말 X선 회절에서의 회절각(2θ)은 5% 미만의 오차범위를 포함하는 경우가 있으므로, 분말 X선 회절에서의 피크의 회절각이 완전히 일치하는 결정 외에, 피크의 회절각이 5% 미만의 오차로 일치하는 결정도 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 결정에 포함된다. 예를 들면, 분말 X선 회절에서 회절각(2θ)은 8.1±0.4, 8.3±0.4, 10.8±0.5, 11.8±0.5, 16.9±0.8, 19.1±0.9, 19.5±0.9, 22.4±1.1, 25.0±1.2, 26.7±1.3, 27.0±1.3, 27.7±1.3(°)에 특징적인 피크를 가진다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 포화 식염수를 넣은 데시케이터 내에서, 50℃에서 167일간 보존했을 때의 고속 액체 크로마토그래피 측정치에서의 순도저하율 1% 미만이고, 극히 안정성이 아주 높은 결정이다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 3',5'-사이클릭 디구아닐산 수용액에 산을 첨가하여, pH 1~3까지 저하시키는 것에 의해 얻을 수 있다.
결정화에 이용하는 3',5'-사이클릭 디구아닐산은 효소합성법이나 화학합성법 등 공지의 방법에 의해 합성하면 좋지만, 효소합성법에 의해 합성한 것이 바람직하다. 효소합성을 실시함에 있어서는 기지(旣知)의 방법을 따르면 되고, 예를 들면 특허문헌 1에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 반응 후, 반응액 중에 생성한 3',5'-사이클릭 디구아닐산은 활성탄이나 이온교환 수지 등을 이용한 통상의 크로마토그래피 처리법에 의해 단리정제(單離精製)할 수 있다.
결정화에서는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 수용액에 산을 첨가하여, pH 1~3, 바람직하게는 pH 1.5~2.0까지 저하시킨다. 사용하는 산으로서는 염산, 황산, 질산 등을 예시할 수 있다. 산을 급격하게 첨가하는 것에 의한 아몰퍼스화나 급격한 결정 석출을 막기 위하여, 첨가는 천천히 실시하는 것이 바람직하다. 한편, 결정의 취득 수율이 낮은 경우에는, 상기 결정의 여과액으로부터 상기한 정출(晶析) 처리를 실시함으로써, 2번 결정을 회수해도 된다.
또한, 결정화에 있어서는, (1) 단리정제한 3',5'-사이클릭 디구아닐산 수용액을 50~70℃까지 가열하는 공정, (2) 해당 용액에 산을 첨가하여 pH 1~3, 바람직하게는 pH 1.5~2.0까지 저하시키는 공정, (3) 해당 용액을 1~10℃, 바람직하게는 4~8℃가 될 때까지 냉각하는 공정으로 이루어지는 방법에 의해 실시해도 된다. 보다 확실하게 결정을 석출시키기 위하여, (3)의 냉각은 천천히 실시하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 온도 구배 -3~-11℃/hr으로 냉각하는 것이 바람직하다.
또한, (1), (2)의 공정, (2), (3)의 공정은 동시에 실시할 수도 있다.
상기 제조법에 의해 얻어진 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 여취(濾取)한 후, 30~70℃에서 1~10시간 건조시킴으로써 제품으로 할 수 있다. 건조시킬 때에는 감압건조 등의 방법을 적절히 이용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이것에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1) 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 제조
공지의 방법(특허문헌 1)에 따라 효소적으로 3',5'-사이클릭 디구아닐산을 합성하고 정제를 했다.
정제하여 얻어진 59.9mM의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 용액(191ml)을 인큐베이터로 60℃로 가온하고, 교반하면서 1N의 염산용액 27.5ml를 2시간 들여 첨가하고 pH 1.9로 했다.
염산 용액을 첨가한 뒤, 프로그램 인큐베이터를 이용하여 온도 구배 -7℃/hr로, 액체 온도가 5℃로 될 때까지 냉각하여 결정이 석출되게 했다. 이렇게 하여 석출된 결정은 글라스 필터(17G3)로 여취하여 습결정(濕結晶)을 얻었다. 습결정은 9시간, 30℃에서 건조하여 건조 결정 8.095g을 얻었다.
(참고예) 3',5'-사이클릭 디구아닐산 금속 공결정의 제조
비특허문헌 2, 3의 기재를 참고로 하기와 같이 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 마그네슘 또는 코발트의 공결정을 얻었다.
(참고예 1) 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 마그네슘의 공결정
결정화 개시액(2mM 3',5'-사이클릭 디구아닐산, 20mM MgCl2, 20mM 글리신(glycine)-HCl(pH 2.1), 7%(v/v) 2-MPD) 500mL를 조제했다.
해당 결정화 개시액을 55℃의 가온하, 증발기(evaporator)로 농축하고, 백탁이 관찰된 시점에서 다시 500mL로 가득 채우고, 55℃에서 30분 가온하여 완전 용해시켰다. 이것을 다시 농축하고 청징화(澄化)시킨 것을 25℃에서 밤새 방치하면, 육각평판 결정의 석출이 관찰된 것에서부터, 증기확산법으로 결정을 충분히 육성하여 마그네슘과의 공결정을 얻었다.
(참고예 2) 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 코발트의 공결정
결정화 개시액(2mM 3',5'-사이클릭 디구아닐산, 11mM CoCl2, 20mM 글리신-HCl(pH 2.1), 7%(v/v) 2-MPD) 500ml를 조제했다.
해당 결정화 개시액을 55℃의 가온하, 증발기로 농축한 후, 25℃에서 밤새 방치하면, 쌍사각추 결정의 석출이 관찰된 것에서부터 증기확산법으로 결정 육성을 수행했다. 증기확산법에서는, 밀폐 용기(TLC 전개조(展開槽))에 800mL의 50% 2-MPD(물:MPD=1:1)을 가득 채우고, 양 비이커를 6개월 정치함으로써 코발트와의 공결정을 얻었다.
(실시예 2) 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 물성
상기 실시예 1에서 조제한 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정에 대하여 실시한 기기 분석의 결과에 대하여 이하에 나타낸다.
(기기 분석)
(A) 순도 검정
실시예 1에서 얻어진 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 순도를 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 순도는 99.0%이었다. 한편, 고속 액체 크로마토그래피법은 이하의 조건에서 실시했다.
(조건)
칼럼: 하이드로스피어(Hydrosphere) C18(YMC사제)
용출액: 0.1M TEA-P(pH 6.0)
검출법: UV 260nm에 의한 검출
(B) 결정형
실시예 1에서 조제한 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정 및 참고예에서 조제한 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 마그네슘과의 공결정 및 코발트와의 공결정의 대표적인 사진을 도 1~3에 나타낸다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 결정은 입방체 결정인 것에 대하여, 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이 마그네슘과의 공결정은 육각평판 결정, 코발트와의 공결정은 쌍사각추 결정이며, 본 발명의 결정은 종래의 결정과는 완전히 다른 결정형을 나타냈다.
(C) 수분
실시예 1에서 조제한 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정에 대하여, 칼 피셔법에 의해 결정의 수분 함량을 측정한 결과, 수분 함량은 9.3~13.9%이었다. 즉, 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정에서는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 1분자에 대하여 약 4~6분자, 보다 상세하게는 3.9~6.2분자의 물분자가 결합 또는 부착되어 있는 것이 분명하였다.
(D) 시차주사 열량분석
열중량측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치(승온속도 5℃/분)로 분석한 바, 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 213~217℃에서 특징적 흡열피크를 나타냈다(도 4). 이에 대하여, 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 마그네슘과의 공결정은 221℃ 부근, 코발트와의 공결정은 239℃ 부근에 특징적인 흡열피크를 나타냈다(각각 도 5, 6).
(E) 적외선 흡수 스펙트럼
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정 및 참고예의 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 마그네슘의 공결정 및 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 코발트의 공결정에 대하여, 푸리에 변환 적외분광 광도계 스펙트럼 원(Spectrum One)(페르킨 엘머(Perkin Elmer))을 이용하여 ATR(Attenuated Total Reflectance, 감쇠 전반사(減衰全反射))법에 의해 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했다.
각각의 결정에서 관찰된 특징적인 피크(cm-1)의 값을 표 1에 나타낸다. 또한, 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정 및 참고예의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 마그네슘 공결정 및 3',5'-사이클릭 디구아닐산 코발트 공결정의 적외 흡수 스펙트럼을 각각 도 7, 도 8, 도 9에 나타낸다.
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산의 결정은 3163, 1712, 1637, 1601, 1530, 1470, 1386, 1339(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가지고 있었다. 이것에 대하여, 마그네슘과의 공결정은 3226, 1702, 1634, 1597, 1531, 1477, 1345(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가지고 코발트와의 공결정은 3179, 1638, 1576, 1534, 1487, 1383(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가지고 있었다. 이들의 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00002
(F) 분말 X선 회절
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정 및 참고예의 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 코발트의 공결정 및 3',5'-사이클릭 디구아닐산과 마그네슘의 공결정에 대하여, X선 회절장치 엑스퍼트 프로 엠피디(X’Pert PRO MPD)(스펙트리스)를 이용하여 하기의 측정 조건에서 X선 회절 스펙트럼을 측정했다.
(측정 조건)
타겟: Cu
X선관 전류: 40mA
X선관 전압: 45kV
주사 범위: 2θ=4.0~40.0°
전처리: 마노제 유발을 이용하여 분쇄
도 10 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정은 회절각(2θ)이 8.1, 8.3, 10.8, 11.8, 16.9, 19.1, 19.5, 22.4, 25.0, 26.7, 27.0, 27.7(°) 부근에 특징적인 피크를 나타냈다. 한편, 비교 데이터로서 3',5'-사이클릭 디구아닐산 마그네슘 공결정의 결과를 도 11과 표 3에, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 코발트 공결정의 결과를 도 12와 표 4에 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
(G) 안정성
본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정 및 참고예의 코발트와의 공결정 및 마그네슘과의 공결정을, 포화 식염수를 넣은 데시케이터 내에 넣어 50℃에서 보존하고, 보존 개시부터 0, 7, 31, 84, 167일째 후에 각각 HPLC 순도를 측정했다. HPLC 순도(%)의 측정 결과를 하기의 표 5에, 또한, 측정 0일째의 HPLC 순도를 100%로 했을 때의 각 측정일의 보존 개시로부터의 잔존율(%)을 표 6에 나타낸다.
결과, 본 발명의 3',5'-사이클릭 디구아닐산은 50℃에서 167일간 했을 때의 HPLC 순도 저하율이 1% 미만이며, 안정성이 아주 높은 것이 판명됐다. 이 값은 종래의 금속과의 공결정과 비교해도 손색이 없는 것이며 실용적으로 사용 가능한 것이 밝혀졌다.
Figure pct00006
Figure pct00007

Claims (9)

  1. 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정.
  2. 제1항에 있어서,
    고속 액체 크로마토그래피로 측정했을 때 97% 이상의 순도를 가지는 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    고속 액체 크로마토그래피로 측정했을 때 99% 이상의 순도를 가지는 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서,
    3',5'-사이클릭 디구아닐산 1분자에 대하여 약 4~6분자의 물분자가 결합 또는 부착되어 있는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정.
  5. 제1항 내지 제4항의 어느 한 항에 있어서,
    열중량측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치에 의해 측정했을 때, 213~217℃에 흡열피크를 나타내는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정.
  6. 제1항 내지 제5항의 어느 한 항에 있어서,
    적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때, 3163, 1712, 1637, 1601, 1530, 1470, 1386, 1339(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 갖는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정.
  7. 제1항 내지 제6항의 어느 한 항에 있어서,
    분말 X선 분석에 있어서, 회절각(2θ)이 8.1, 8.3, 10.8, 11.8, 16.9, 19.1, 19.5, 22.4, 25.0, 26.7, 27.0.27.7(°) 부근에 특징적인 피크를 나타내는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정.
  8. 3',5'-사이클릭 디구아닐산 수용액에 산을 첨가하고, pH 1~3까지 저하시키는 공정을 포함하는, 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 제조법.
  9. 하기 (1)~ (3)의 공정을 포함하는 3',5'-사이클릭 디구아닐산 결정의 제조법.
    (1) 3',5'-사이클릭 디구아닐산 수용액을 50~70℃까지 가열하는 공정,
    (2) 3',5'-사이클릭 디구아닐산 용액에 산을 첨가하고 pH 1~3까지 저하시키는 공정,
    (3) 3',5'-사이클릭 디구아닐산 용액을 1~10℃로 될 때까지 냉각하는 공정.
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