KR102650450B1 - Cyclic-di-AMP 나트륨염 결정 - Google Patents
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Abstract
Cyclic-di-AMP의 동결 건조 제품은 제조에 특별한 설비를 필요로 하기 때문에 대량 생산에 적합하지 않다. Cyclic-di-AMP의 유리산 결정은 105℃의 가혹한 조건하에서 불안정하다. 하여, 간편하게 대량으로 취득할 수 있고, 또한 105℃의 가혹한 조건하에서의 안정성이 뛰어난 Cyclic-di-AMP 결정을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 105℃의 가혹한 조건하에서도 매우 안정적이다.
또한, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 c-di-AMP 수용액을 pH 5.2 ~ 12.0이 되도록 조정한 후, 유기 용매를 첨가하는 간편한 방법에 의해 대량으로 조제 가능하다.
본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 105℃의 가혹한 조건하에서도 매우 안정적이다.
또한, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 c-di-AMP 수용액을 pH 5.2 ~ 12.0이 되도록 조정한 후, 유기 용매를 첨가하는 간편한 방법에 의해 대량으로 조제 가능하다.
Description
본 발명은 보조제로서 유용한 물질이 될 수 있을 것으로 고려되는 Cyclic-di-AMP의 나트륨염 결정에 관한 것이다.
Cyclic-di-AMP(이하 "c-di-AMP"로 표기)는 세균의 2차 전달자로 발견된 물질이다. 최근, 이 물질은 제1형 인터페론을 유발할 수 있는 것으로 보고되는 등 의약품으로서의 이용이 기대된다(비특허문헌 1). 지금까지 c-di-AMP의 제조 방법으로는 화학 합성법(비특허문헌 2, 3) 및 Bacillus속이나 Streptococcus속 등에서 유래하는 디아데닐레이트 시클라아제를 이용한 효소 합성법이 알려져 있다(비특허문헌 4, 5).
현재 일반적으로 판매되는 c-di-AMP는 동결 건조 제품이며, 또한 결정의 취득에 대해서는 특허문헌 1에 나타내는 유리산 결정에 대해서만 보고가 이루어지고 있다(특허문헌 1). 일부에는 결정성 고체("crystalline solid")로 판매되고 있는 것도 존재하지만, 부정형이고 또한 눌러 찌부러뜨렸을 때에는 벽개(劈開)하지 않고 전연(展延)하기 때문에 시판의 결정성 고체는 결정이라고는 할 수 없었다(도 1).
Science, 328, 1703-1705(2010)
SYNTHESIS, 24, 4230-4236(2006)
Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 32, 1-16(2013)
Molecular Cell, 30, 167-178(2008)
Nagoya J. Med. Sci., 73, 49-57(2011)
c-di-AMP는 동결 건조 제품이 일반적으로 알려져 있지만, 동결 건조 제품은 그 제조 과정에서 동결 건조기가 필요하며, 대량 생산을 위해 스케일 업을 하기에도 한계가 있기 마련이다. 그래서 동결 건조기와 같은 특별한 장치를 사용하지 않고 또한 간편하게 대량으로 취득할 수 있는 결정 취득 방법의 개발이 요구되고 있었다.
또한, 본 발명자들의 검토에 있어서 기존의 c-di-AMP 유리산 결정은 가혹한 조건하에서, 예를 들어 105℃ 조건하에서 안정성이 저하된다는 결점이 발견되었다.
본 발명자들은 c-di-AMP의 결정화에 대해 예의 연구를 거듭한 결과, c-di-AMP의 나트륨염 결정을 최초로 취득하고 본 발명을 완성시켰다.
본 발명자들의 검토에서, (1) c-di-AMP 수용액에 염기 및/또는 산을 첨가하여 pH를 5.2 ~ 12.0으로 조정하는 공정, (2) c-di-AMP 수용액을 측정 파장 257nm에서의 흡광도 OD257을 500 ~ 20000으로 하는 공정, (3) c-di-AMP 수용액을 30 ~ 70℃까지 가열하는 공정, (4) c-di-AMP 수용액에 유기 용매를 첨가하는 공정, (5) c-di-AMP 수용액을 1 ~ 30℃가 될 때까지 냉각하는 공정을 거치는 것으로, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정을 취득할 수 있고, 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정은 105℃의 가혹한 조건하에서도 매우 안정적인 것이 밝혀졌다. 또한, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 기존의 c-di-AMP 유리산 결정과 비교하여 높은 용해성을 나타내었다.
특히 결정화를 위해서는 (1)공정의 pH가 중요하며, pH 5.2 미만의 산성 조건에서는 결정화 자체가 곤란하고, 설사 결정을 취득할 수 있었던 경우에도 수율이 낮아지기 때문에 바람직한 것은 아니다. 반면, pH가 5.2 이상인 조건에서는 나트륨염 결정만을 용이하게 취득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정의 제조 방법은 c-di-AMP 염 결정의 대량 제조에 호적한 방법이다.
도 1은 시판의 c-di-AMP 결정성 고체를 전연했을 때의 외관 사진을 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 결정 사진을 나타낸다.
도 3은 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 결정 사진을 나타낸다.
도 7은 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 결정 사진을 나타낸다.
도 11은 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 14은 c-di-AMP 유리산 결정의 사진을 나타낸다.
도 15은 c-di-AMP 유리산 결정의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은 c-di-AMP 유리산 결정의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 17은 c-di-AMP 유리산 결정의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 18은 참고예에서 얻어진 c-di-AMP 유리산 결정, 실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 나트륨염 결정α, 및 실시예 4에서 얻어진 나트륨염 결정β의 가혹한 조건(105℃)하에서의 안정성 시험 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 결정 사진을 나타낸다.
도 3은 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 6은 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 결정 사진을 나타낸다.
도 7은 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 10은 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 결정 사진을 나타낸다.
도 11은 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 13은 실시예 4에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 14은 c-di-AMP 유리산 결정의 사진을 나타낸다.
도 15은 c-di-AMP 유리산 결정의 X선 회절 스펙트럼을 나타낸다.
도 16은 c-di-AMP 유리산 결정의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 17은 c-di-AMP 유리산 결정의 열중량 측정/시차 열분석 결과를 나타낸다.
도 18은 참고예에서 얻어진 c-di-AMP 유리산 결정, 실시예 1 및 실시예 2에서 얻어진 나트륨염 결정α, 및 실시예 4에서 얻어진 나트륨염 결정β의 가혹한 조건(105℃)하에서의 안정성 시험 결과를 나타낸다.
본 발명은 하기 구조식으로 나타내어지는 c-di-AMP의 나트륨염 결정을 제공하는 것이다. 하기 구조식 중의 X는 수소 원자(H) 또는 나트륨 원자(Na) 중 어느 하나이며, 식 중에 있는 2개의 X 중 적어도 하나는 나트륨 원자이다.
[화학식 1]
본 발명의 c-di-AMP의 나트륨염 결정은 조제시의 c-di-AMP 수용액의 pH에 따라 2가지 형태를 취할 수 있다. 이하에서는 조제시의 pH가 6.0 ~ 12.0의 범위인 c-di-AMP 결정을 결정α, 조제시의 pH가 5.2 ~ 6.0의 범위인 것을 결정β라고 정의한다.
본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 원자 흡광 광도법으로 분석하면 나트륨 함유량이 6.2 ~ 6.8%의 범위 내가 된다. 이로부터 결정α에 있어서 c-di-AMP 1분자에 대한 나트륨 원자의 존재량 비는 2임을 알 수 있다.
본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 주상(柱狀) 결정으로 얻어진다(도 2 및 도 6 참조).
또한, 본 발명의 나트륨염 결정α를 Cu-Kα선을 이용한 분말 X선 회절 장치로 분석하면 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 회절각(2θ)이 10.9, 23.9(°) 부근에 특징적인 피크를 나타낸다(도 3 및 도 7 참조).
또한 일반적으로 분말 X선 회절에서의 회절각(2θ)은 5% 미만의 오차 범위를 포함하는 경우가 있기 때문에, 분말 X선 회절에서의 피크의 회절각이 완전히 일치하는 결정 외에도 피크의 회절각이 5% 미만의 오차로 일치하는 결정도 본 발명의 나트륨염 결정α에 포함된다. 예를 들어, 분말 X선 회절에 있어서, 회절각(2θ)은 10.9±0.5, 23.9±1.2(°)에 특징적인 피크를 가진다.
본 발명의 나트륨염 결정α는 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때 3118, 1604, 1221, 1074(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 갖는다(도 4 및 도 8 참조).
또한 적외선 흡수 스펙트럼 측정에서는 일반적으로 2(cm-1) 미만의 오차 범위를 포함하는 경우가 있기 때문에, 상기 수치와 적외선 흡수 스펙트럼에서의 피크 위치가 완전히 일치하는 결정 외에도 피크가 2cm-1 미만의 오차로 일치하는 결정도 본 발명의 나트륨염 결정α에 포함된다. 예를 들어, 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때 3118±1.9, 1604±1.9, 1221±1.9, 1074±1.9(cm-1)에 특징적인 피크를 가진다.
본 발명의 나트륨염 결정α는 열중량 측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치(승온 속도 5℃/분)로 분석했을 때, 255℃ 부근에서 흡열 피크를 갖는다(도 5 및 도 9 참조).
본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정β는 원자 흡광 광도법으로 분석하면 나트륨 함유량이 4.7 ~ 5.2%의 범위 내가 된다. 이로부터 결정β에 있어서 c-di-AMP 1분자에 대한 나트륨 원자의 존재량 비는 1.5임을 알 수 있다.
본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정β는 입방체상 결정으로 얻어진다(도 10 참조).
또한, 본 발명의 나트륨염 결정β를 Cu-Kα선을 이용한 분말 X선 회절 장치로 분석하면 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 회절각(2θ)이 9.3, 23.6, 24.3(°) 부근에 특징적인 피크를 나타낸다(도 11 참조).
또한 일반적으로 분말 X선 회절에서의 회절각(2θ)은 5% 미만의 오차 범위를 포함하는 경우가 있기 때문에, 분말 X선 회절에서의 피크의 회절각이 완전히 일치하는 결정 외에도 피크의 회절각이 5% 미만의 오차로 일치하는 결정도 본 발명의 나트륨염 결정β에 포함된다. 예를 들어, 분말 X선 회절에 있어서, 회절각(2θ)은 9.3±0.5, 23.6±1.2, 24.3±1.2(°)에 특징적인 피크를 가진다.
본 발명의 나트륨염 결정β는 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때 3119, 1606, 1222, 1074(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 갖는다(도 12 참조).
또한, 적외선 흡수 스펙트럼 측정에서는 일반적으로 2(cm-1) 미만의 오차 범위를 포함하는 경우가 있기 때문에, 상기 수치와 적외선 흡수 스펙트럼에서의 피크 위치가 완전히 일치하는 결정 외에도 피크가 2cm-1 미만의 오차로 일치하는 결정도 본 발명의 나트륨염 결정β에 포함된다. 예를 들어, 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했을 때 3119±1.9, 1606±1.9, 1222±1.9, 1074±1.9(cm-1)에 특징적인 피크를 가진다.
본 발명의 나트륨염 결정β는 열중량 측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치(승온 속도 5℃/분)로 분석했을 때, 239℃ 부근에서 흡열 피크를 갖는다(도 13 참조).
본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 고속 액체 크로마토그래피법으로 순도 검정했을 때, 97% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가진다. 또한, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 기존의 c-di-AMP 유리산 결정과 비교하여 높은 용해성을 나타낸다.
다음으로, 본 발명의 c-di-AMP의 나트륨염 결정의 제조 방법에 대해 설명하면, 결정화에 사용하는 c-di-AMP는 효소 합성법이나 화학 합성법 등 공지의 방법에 의해 합성하면 된다. 합성을 실시함에 있어서는 기존의 방법에 따르면 되고, 예를 들어 비특허문헌 2 ~ 5에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 반응 후, 반응액 중에 생성된 c-di-AMP는 활성탄이나 역상 크로마토그래피 등으로 정제할 수 있다.
본 발명의 나트륨염 결정은 c-di-AMP 수용액을 pH 5.2 ~ 12.0이 되도록 조정하고, 유기 용매를 첨가함으로써 얻을 수 있다.
c-di-AMP 수용액의 pH가 5.2 ~ 6.0인 경우에는 취득되는 나트륨염 결정은 결정β가 되고, pH가 6.0 ~ 12.0인 경우에는 취득되는 나트륨염 결정은 결정α가 된다.
pH가 5.2 미만인 경우에는 고농도의 c-di-AMP 수용액을 조제하려고 하면 수용액 중에 침전이 생겨 버리게 되어, 순수한 c-di-AMP 나트륨염 결정을 취득하는 것이 곤란해진다. 침전의 생성을 회피하기 위해 c-di-AMP 수용액의 농도를 저농도로 한 경우에는 c-di-AMP 나트륨염 결정이 전혀 취득되지 못하거나 또는 극미량밖에 얻을 수 없기 때문에 효율적인 결정의 제조가 불가능하다. 결과적으로 c-di-AMP 염 결정을 공업상 이용 가능한 수준으로 효율적인 대량 조제를 하기 위해서는, pH를 5.2 이상으로 하는 것이 필수적이다.
상기 결정화에 있어서는, 보다 높은 수율로 결정을 얻기 위해, (1) c-di-AMP 수용액에 염기 및/또는 산을 첨가하여 pH를 5.2 ~ 12.0으로 조정하는 공정, (2) c-di-AMP 수용액을 측정 파장 257nm에서의 흡광도 OD257을 500 ~ 20000으로 하는 공정, (3) c-di-AMP 수용액을 30 ~ 70℃까지 가열하는 공정, (4) c-di-AMP 수용액에 유기 용매를 첨가하는 공정, (5) c-di-AMP 수용액을 1 ~ 30℃가 될 때까지 냉각하는 공정을 실시하는 것이 바람직하다.
상기 공정(1)에서의 c-di-AMP 수용액의 pH는 5.2 ~ 12.0의 범위 내이면 c-di-AMP 나트륨염 결정을 취득할 수 있지만, 고농도의 수용액의 조제가 용이하다는 관점에서, pH는 5.4 이상인 것이 바람직하고, 5.6 이상인 것이 특히 바람직하다. 또한 결정을 용해시켰을 때 수용액의 pH가 중성 부근이 되어 편리성이 높기 때문에, c-di-AMP 수용액의 pH는, 바람직하게는 pH 7.0 ~ 11.0이며, 더욱 바람직하게는 pH 7.0 ~ 10.0이며, 더욱 바람직하게는 pH 7.0 ~ 8.5이며, 이 경우에는 유기 용매를 첨가함으로써 결정α가 취득된다.
상기 공정(1)에서 사용하는 산으로는 염산, 황산, 질산을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 사용하는 염기로는 수산화 나트륨, 아세트산 나트륨 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 산 또는 염기를 급격히 첨가하는 것에 의한 비정질화나 급격한 결정 석출을 방지하기 위해, 첨가는 천천히 하는 것이 바람직하다.
상기 공정(2)에 있어서 c-di-AMP 수용액의 측정 파장 257nm에서의 흡광도 OD257은 500 이상인 경우에는 유기 용매의 첨가에 의해 결정을 취득할 수 있지만, 결정을 석출시키는 데 필요한 유기 용매의 첨가량을 저감할 수 있는 점에서, 1000 이상인 것이 보다 바람직하고, 2000 이상인 것이 보다 바람직하고, 3000 이상인 것이 보다 바람직하다. 한편, c-di-AMP 수용액이 고농도가 되는 경우에는, 용액의 점도가 높아져 취급성이 저하되기 때문에, c-di-AMP 수용액의 측정 파장 257nm에서의 흡광도 OD257은 20000 이하인 것이 바람직하고, 15000 이하인 것이 보다 바람직하고, 10000 이하인 것이 보다 바람직하다.
상기 공정(3)에 있어서는 c-di-AMP 수용액의 온도를 30 ~ 70℃까지 가열한다. 공정(5)에서의 냉각시와 온도차가 있을수록 결정이 석출되기 쉬우므로, 공정(3)에서의 수용액의 온도는 40℃ 이상인 것이 보다 바람직하고, 50℃ 이상인 것이 보다 바람직하다.
본 결정 취득 공정에 사용되는 유기 용매 첨가 전의 c-di-AMP 수용액에는, 결정이 석출되지 않는 범위 내에서 유기 용매를 함유해도 된다. 그러나 예기치 않은 결정 석출을 방지하는 관점에서, 유기 용매의 함유량은 30%(v/v) 이하인 것이 바람직하고, 20%(v/v) 이하인 것이 보다 바람직하고, 10%(v/v) 이하인 것이 보다 바람직하고, 5%(v/v) 이하인 것이 보다 바람직하고, 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 것이 보다 바람직하다.
상기 공정(4)에서 사용하는 유기 용매로는 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 6 이하의 알코올류, 아세톤 등의 케톤류, 디옥산 등의 에테르류, 아세토니트릴 등의 니트릴류, 디메틸포름아미드 등의 아미드류 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 특히, 입수 용이성 및 안전성의 관점에서 탄소수 6 이하의 알코올류가 바람직하고, 그 중에서도 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 공정(5)에 있어서는 c-di-AMP 수용액을 1 ~ 30℃가 될 때까지 냉각한다. 공정(3)에서의 가열시와 온도차가 있을수록 결정이 석출되기 쉬우므로, 공정(5)에서의 수용액의 온도는 20℃ 이하인 것이 보다 바람직하고, 10℃ 이하인 것이 보다 바람직하다.
또한, 상기 (1) ~ (5)의 공정은 순서대로 실시하는 것이 바람직하지만, 적절히 연속된 공정을 동시에 실시해도 된다.
상기 제조 방법에 의해 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정은 여과 취출한 후 건조시킴으로써, 제품으로 할 수 있다. 건조시킬 때에는 감압 건조 등의 방법을 적절히 이용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는 것은 분명하다.
(실시예 1) pH 8.2에서의 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 제조
공지의 방법에 의해 효소적으로 c-di-AMP를 합성하고 정제를 실시하였다.
정제하여 얻어진 OD257이 4710, pH 8.2의 c-di-AMP 용액(102mL)을 40℃로 가온했다. 거기에 교반하면서 142mL의 99.5%(w/w) 에탄올을 천천히 첨가한 후, 액체 온도가 4℃가 될 때까지 냉각하여 결정을 석출시켰다. 이렇게 하여 석출된 결정은, 바스켓 분리기로 여과 취출하여 습결정을 얻었다. 습결정을 2시간, 30℃에서 건조시켜, 건조 결정 9.8g을 얻었다.
(A) 나트륨염의 형태 분석
원자 흡광 광도법으로 분석한 결과, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정에 있어서의 나트륨 함유량은 6.4%였다. 이로부터 c-di-AMP 1분자에 대한 나트륨 원자의 존재량은 2.0이 되어, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 2나트륨염의 형태를 취하고 있는 것으로 밝혀졌다.
(B) 순도 검정
상기 실시예 1에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 순도를 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, c-di-AMP 순도는 100%였다. 또한, 고속 액체 크로마토그래피법은 다음의 조건에서 실시했다.
(조건)
컬럼: Hydrosphere C18(YMC사 제조)
용출액: 0.1M TEA-P(pH 6.0) + 4.5% ACN
검출법: UV 260nm에 의한 검출
(C) 결정 형태
본 실시예에 있어서의 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 사진을 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타내는 바와 같이, c-di-AMP 나트륨염 결정α는 주상의 결정 형태를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
(D) 분말 X선 회절
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α에 대해, X선 회절 장치 X'Pert PRO MPD(Spectris)를 사용하여 아래의 측정 조건에서 X선 회절 스펙트럼을 측정했다.
(측정 조건)
대상: Cu
X선관 전류: 40mA
X선관 전압: 45kV
주사 범위: 2θ = 4.0 ~ 40.0°
전처리: 마노제 유발을 이용하여 분쇄
도 3 및 표 1에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 회절각(2θ)이 6.2, 10.9, 12.6, 23.9(°) 부근에 피크를 나타내고, 특히 10.9, 23.9(°) 부근에 특징적인 피크를 나타냈다.
(E) 적외선 흡수 스펙트럼
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α에 대해 푸리에 변환 적외선 분광 광도계 Spectrum One(Perkin Elmer)을 이용하여 ATR(Attenuated Total Reflectance, 감쇠 전반사)법에 의해 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했다.
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 3119, 1604, 1220, 1073(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가지고 있었다. 이러한 결과를 도 4에 나타낸다.
(F) 시차 주사 열량 분석
열중량 측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치(승온 속도 5℃/분)로 분석한 결과, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 255℃ 부근에서 흡열 피크를 가졌다(도 5).
(실시예 2) pH 10.0에서의 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 제조
공지의 방법에 의해 효소적으로 c-di-AMP를 합성하고 정제를 실시하였다.
정제하여 얻어진 OD257이 6600, pH 10.0의 c-di-AMP 용액(50mL)을 40℃로 가온했다. 거기에 교반하면서 45mL의 에탄올을 천천히 첨가한 후, 액체 온도가 4℃가 될 때까지 냉각하여 결정을 석출시켰다. 이렇게 하여 석출된 결정은, 멤브레인 필터(3μm)로 여과 취출하여 습결정을 얻었다. 습결정을 1시간 30분, 20℃에서 건조시켜 건조 결정 7g을 얻었다.
(A) 나트륨염의 형태 분석
원자 흡광 광도법으로 분석한 결과, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α에 있어서의 나트륨 함유량은 6.6%였다. 이로부터 c-di-AMP 1분자에 대한 나트륨 원자의 존재량은 2.0이 되어, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 2나트륨염의 형태를 취하고 있는 것으로 밝혀졌다.
(B) 순도 검정
상기 실시예 2에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 순도를 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, c-di-AMP 순도는 100%였다. 또한, 고속 액체 크로마토그래피법은 다음의 조건에서 실시했다.
(조건)
컬럼: Hydrosphere C18(YMC사 제조)
용출액: 0.1M TEA-P(pH 6.0) + 4.5% ACN
검출법: UV 260nm에 의한 검출
(C) 결정 형태
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α의 사진을 도 6에 나타낸다. 도 6에 나타내는 바와 같이, c-di-AMP 나트륨염 결정α는 주상의 결정 형태를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
(D) 분말 X선 회절
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α에 대해, X선 회절 장치 X'Pert PRO MPD(Spectris)를 이용하여 아래의 측정 조건에서 X선 회절 스펙트럼을 측정했다.
(측정 조건)
대상: Cu
X선관 전류: 40mA
X선관 전압: 45kV
주사 범위: 2θ = 4.0 ~ 40.0°
전처리: 마노제 유발을 이용하여 분쇄
도 7 및 표 2에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 회절각(2θ)이 10.9, 24.0(°) 부근에 특징적인 피크를 나타냈다.
(E) 적외선 흡수 스펙트럼
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α에 대해 푸리에 변환 적외선 분광 광도계 Spectrum One(Perkin Elmer)을 이용하여 ATR(Attenuated Total Reflectance, 감쇠 전반사)법에 의해 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했다.
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 3118, 1604, 1221, 1074(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가지고 있었다. 이러한 결과를 도 8에 나타낸다.
(F) 시차 주사 열량 분석
열중량 측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치(승온 속도 5℃/분)로 분석한 결과, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정α는 255℃ 부근에서 흡열 피크를 가졌다(도 9).
(실시예 3) 낮은 pH 영역(pH 5.0 ~ 6.5)에서의 c-di-AMP 나트륨염 결정의 취득 시험
c-di-AMP 나트륨염 결정을 취득할 수 있는 pH 범위를 결정하기 위해, 낮은 pH 영역(pH 5.0 ~ 6.5)에서의 결정의 취득 시험을 실시했다.
공지의 방법에 의해 효소적으로 c-di-AMP를 합성하고 정제를 실시하였다.
정제하여 얻어진 c-di-AMP를 이용하여, OD257이 2500, pH가 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 또는 6.5인 c-di-AMP 수용액을 조제하였다. 얻어진 OD257이 2500인 c-di-AMP 용액(0.2mL)을 30℃로 가온했다. 거기에 1mL의 99.5%(w/w) 에탄올을 천천히 첨가한 후, 밀폐하여 하룻밤 내지 며칠간 30℃하에서 정치하여 결정을 석출시켰다. 이렇게 하여 석출된 결정은, 멤브레인 필터로 여과 취출하여 습결정을 얻었다.
얻어진 결과를 이하의 표 3에 나타낸다. 하기 표 3 중에서 "결정"은 결정 취득 여부를 나타내며,
○: 문제없이 결정을 취득할 수 있었다
△: 결정을 얻을 수는 있었지만, 그 양은 다른 pH와 비교하면 소량이었다
×: 수용액을 조제할 수 없어, 결정을 취득할 수 없었다
는 것을 나타내고 있다.
상기 표 3에 나타내는 바와 같이, pH 5.0에서는 c-di-AMP의 용해도가 낮아, 애초에 OD257이 2500인 c-di-AMP 수용액을 조제할 수 없었다. 희석함으로써 저농도의 c-di-AMP 수용액은 조제할 수 있었지만, 이후 동일한 조작을 해도 결정을 취득할 수는 없었다. pH 5.2에서는 결정을 취득할 수는 있었지만, 석출된 결정의 양은 5.4 이상에 비해 소량이었다. pH 5.4 이상에서는 문제없이 결정을 취득할 수 있었다.
pH 5.4 이상 6.0 미만의 범위에서 얻어진 c-di-AMP 결정은 입방체상의 외관을 나타내는 등 모두 동일한 성상이며, 동일한 형태로 간주되었다. pH 6.0에서는 결정으로서 입방체상인 것과 주상인 것이 혼재되어 있었다. pH 6.0보다 높은 pH 영역에서 얻어진 c-di-AMP 결정은 주상의 외관을 나타내는 등, 실시예 1 및 2에서 취득된 결정과 동일한 성상을 나타냈다. 이상의 결과로부터, c-di-AMP 수용액의 pH가 5.2 ~ 6.0의 범위인 경우에는 본 실시예의 형태의 c-di-AMP 결정β가 취득되고, pH 6.0 ~ 12.0의 범위인 경우에는 c-di-AMP 나트륨염 결정α가 취득되는 것으로 밝혀졌다.
(실시예 4) pH 5.6에서의 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 제조
공지의 방법에 의해 효소적으로 c-di-AMP를 합성하고 정제를 실시하였다.
정제하여 얻어진 OD257이 3000, pH 5.6의 c-di-AMP 용액(15mL)을 30℃로 가온했다. 거기에 교반하면서 15mL의 에탄올을 천천히 첨가한 후, 액체 온도가 4℃가 될 때까지 냉각하여 결정을 석출시켰다. 이렇게 하여 석출된 결정은, 멤브레인 필터로 여과 취출하여 습결정을 얻었다. 습결정을 2시간, 25℃에서 건조시켜 건조 결정 1.0g을 얻었다.
(A) 나트륨염의 형태 분석
원자 흡광 광도법으로 분석한 결과, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정β에 있어서의 나트륨 함유량은 5.2%였다. 이로부터 c-di-AMP 1분자에 대한 나트륨 원자의 존재량은 1.5인 것을 알 수 있었다.
(B) 순도 검정
본 실시예에서 얻어진 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 순도를 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, c-di-AMP 순도는 100%였다. 또한, 고속 액체 크로마토그래피법은 다음의 조건에서 실시했다.
(조건)
칼럼: YMC-Triart C18(YMC사 제조)
용출액: 0.1M TEA-P(pH6.0) + 4.5% ACN
검출법: UV 260nm에 의한 검출
(C) 결정 형태
본 실시예에 있어서의 c-di-AMP 나트륨염 결정β의 사진을 도 10에 나타낸다. 도 10에 나타내는 바와 같이 c-di-AMP 나트륨염 결정β는 입방체상의 결정 형태를 나타내는 것으로 밝혀졌다.
(D) 분말 X선 회절
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정에 대해, X선 회절 장치 X'Pert PRO MPD(Spectris)를 이용하여 아래의 측정 조건에서 X선 회절 스펙트럼을 측정했다.
(측정 조건)
대상: Cu
X선관 전류: 40mA
X선관 전압: 45kV
주사 범위: 2θ = 4.0 ~ 40.0°
전처리: 마노제 유발을 이용하여 분쇄
도 11 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정β는 회절각(2θ)이 9.3, 23.6, 24.3(°) 부근에 피크를 나타냈다.
(E) 적외선 흡수 스펙트럼
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정β에 대해 푸리에 변환 적외선 분광 광도계 Spectrum One(Perkin Elmer)을 이용하여 ATR(Attenuated Total Reflectance, 감쇠 전반사)법에 의해 적외선 흡수 스펙트럼을 측정했다.
본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정β는 3119, 1606, 1222, 1074(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가지고 있었다. 이러한 결과를 도 12에 나타낸다.
(F) 시차 주사 열량 분석
열중량 측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치(승온 속도 5℃/분)로 분석한 결과, 본 실시예의 c-di-AMP 나트륨염 결정β는 239℃ 부근에 흡열 피크를 가졌다(도 13).
(참고예) c-di-AMP 유리산 결정의 제조
공지의 방법에 의해 효소적으로 c-di-AMP를 합성하고 정제를 실시하였다.
정제하여 얻어진 c-di-AMP 용액으로부터, 특허문헌 1에 기재된 방법에 의해 c-di-AMP 유리산 결정을 취득했다. 즉, OD257이 114인 c-di-AMP 용액(980mL)을 50℃로 가온했다. 거기에, 2N HCl을 조금씩 첨가하여 pH 1.8까지 조제하고, 액체 온도가 4℃가 될 때까지 냉각하여 결정을 석출시켰다. 이렇게 하여 석출된 결정은, 유리 필터(G3)로 여과 취출하여 습결정을 얻었다. 습결정을 1시간, 20℃에서 건조시켜 건조 결정 2.8g을 얻었다.
(A) 순도 검정
상기 참고예에서 얻어진 c-di-AMP 유리산 결정의 순도를 고속 액체 크로마토그래피법으로 분석한 결과, c-di-AMP 순도는 100%였다. 또한, 고속 액체 크로마토그래피법은 다음의 조건에서 실시했다.
(조건)
컬럼: Hydrosphere C18(YMC사 제조)
용출액: 0.1M TEA-P(pH 6.0) + 4.5% ACN
검출법: UV 260nm에 의한 검출
(B) 결정 형태
c-di-AMP 유리산 결정의 대표적인 사진을 도 14에 나타낸다. c-di-AMP 유리산 결정은 침상의 결정 형태를 나타낸다.
(C) 분말 X선 회절
c-di-AMP 유리산 결정에 대하여 X선 회절 장치 X'Pert PRO MPD(Spectris)를 이용하여 아래의 측정 조건에서 X선 회절 스펙트럼을 측정했다.
(측정 조건)
대상: Cu
X선관 전류: 40mA
X선관 전압: 45kV
주사 범위: 2θ = 4.0 ~ 40.0°
전처리: 마노제 유발을 이용하여 분쇄
도 15 및 표 5에 나타내는 바와 같이, 특허문헌 1에 기재된 c-di-AMP 유리산 결정은 회절각(2θ)이 9.2, 10.2, 10.9, 11.1, 13.7, 15.2, 19.0, 20.6, 22.4, 23.1, 24.3, 26.6, 26.8(°) 부근에 특징적인 피크를 나타냈다.
(D) 적외선 흡수 스펙트럼
c-di-AMP 유리산 결정을 푸리에 변환 적외선 분광 광도계 Spectrum One(Perkin Elmer)을 이용하여 ATR(Attenuated Total Reflectance, 감쇠 전반사)법에 의해 적외선 흡수 스펙트럼을 측정한 결과에 대하여, 특허문헌 1에 기재가 있다.
특허문헌 1에 기재된 c-di-AMP 유리산 결정은 3087, 1686, 1604, 1504, 1473, 1415, 1328, 1213(cm-1) 부근에 특징적인 피크를 가지고 있었다. 이러한 결과를 도 16에 나타낸다.
(E) 시차 주사 열량 분석
특허문헌 1에 기재된 c-di-AMP 유리산 결정은, 열중량 측정/시차 열분석(TG/DTA) 장치(승온 속도 5℃/분)로 분석하면, 193℃ 부근에 흡열 피크를 가졌다(도 17).
(실시예 5) 105℃ 조건하에서의 취득 결정의 안정성 시험
상기 실시예 1, 실시예 2, 실시예 4, 및 참고예에서 얻어진 결정을 105℃ 조건하에서 정치했다. 거기에서 시간의 경과에 따라 결정을 회수하여, 수용액을 조제하고, 고속 액체 크로마토그래피법으로 결정의 순도를 분석했다. 얻어진 결과를 도 18 및 표 6에 나타낸다.
표 6에 나타내는 바와 같이, 본 발명에 속하는 c-di-AMP 나트륨염 결정은 기존의 c-di-AMP 유리산 결정에 비해 105℃라는 가혹한 조건하에서도 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있었다. 또한, 기존의 c-di-AMP 유리산 결정을 용해시켰을 때에는 교반 조작이 필요했던 것에 비해, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 신속하게 용해되었다. 이로부터, 본 발명의 c-di-AMP 나트륨염 결정은 기존의 c-di-AMP 유리산 결정과 비교하여 높은 용해성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
Claims (5)
- 하기의 측정 조건에 따른 Cu-Kα선을 이용한 분말 X선 회절의 회절각(2θ)으로서 10.9±0.5, 23.9±1.2(°)에 특징적인 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, Cyclic-di-AMP 나트륨염 결정α.
(측정 조건)
대상: Cu
X선관 전류: 40mA
X선관 전압: 45kV
주사 범위: 2θ = 4.0 ~ 40.0°, 및
전처리: 마노제 유발을 이용하여 분쇄 - 하기의 측정 조건에 따른 Cu-Kα선을 이용한 분말 X선 회절의 회절각(2θ)으로서 9.3±0.5, 23.6±1.2, 24.3±1.2(°)에 특징적인 피크를 갖는 것을 특징으로 하는, Cyclic-di-AMP 나트륨염 결정β.
(측정 조건)
대상: Cu
X선관 전류: 40mA
X선관 전압: 45kV
주사 범위: 2θ = 4.0 ~ 40.0°, 및
전처리: 마노제 유발을 이용하여 분쇄 - Cyclic-di-AMP 수용액의 pH를 5.2 ~ 12.0으로 조정하고, 유기 용매를 첨가하고, 석출되는 결정을 취득하는 공정으로 이루어지는 제1항 또는 제2항에 기재된 Cyclic-di-AMP 나트륨염 결정의 제조 방법.
- 제3항에 있어서,
(1) Cyclic-di-AMP 수용액에 염기 및/또는 산을 첨가하여 pH를 5.2 ~ 12.0으로 조정하는 공정,
(2) Cyclic-di-AMP 수용액을 측정 파장 257nm에서의 흡광도 OD257을 500 ~ 20000으로 하는 공정,
(3) Cyclic-di-AMP 수용액을 30 ~ 70℃까지 가열하는 공정,
(4) Cyclic-di-AMP 수용액에 유기 용매를 첨가하는 공정,
(5) Cyclic-di-AMP 수용액을 1 ~ 30℃가 될 때까지 냉각하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는 Cyclic-di-AMP 나트륨염 결정의 제조 방법. - 삭제
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