WO2015111712A1 - 癌治療用医薬組成物及びその組成物を有効成分とする癌治療用医薬製剤 - Google Patents

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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for cancer treatment and a pharmaceutical preparation for cancer treatment comprising the composition as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cancer using a culture supernatant of mammalian dental pulp stem cells and a pharmaceutical preparation for treating cancer comprising the composition as an active ingredient.
  • hypoxic response in the microenvironment in the body plays a role in organogenesis and stem cell proliferation during development, and that the hypoxic response is also involved in diseases such as cancer and ischemic disease. .
  • the hypoxic environment also regulates the expression of numerous genes and controls cell responses such as cell proliferation, differentiation, and apoptosis.
  • anticancer agents have been developed for the treatment of cancer.
  • DNA synthesis inhibitors cytarabine, fluorouracil, mercaptopurine, thioguanine, vinca alkaloids vinblastine, vincristine, procarbazine, alkylating agents mustine, cyclophosphamide, cisplatin, and antibiotics.
  • examples thereof include actinomycin D, doxorubicin, mitomycin, mitramycin, bleomycin, glucocorticoids that are steroid hormones, estrogens, antiestrogens, androgens, and the like.
  • Cytarabine inhibits DNA polymerase, and fluorouracil inhibits thymidylate synthase and suppresses pyrimidine synthesis.
  • Mercaptopurine and thioguanine inhibit purine synthesis.
  • Vinblastine or vincristine acts specifically in the M phase, binds to tubulin, destroys the spindle, and stops mitosis.
  • Procarbazine causes depolymerization of double-stranded DNA, and mucin, cyclophosphamide, cisplatin, etc. cause covalent cross-linking and inhibit DNA synthesis.
  • Actinomycin D, doxorubicin, mitomycin, mitramycin, and the like are intercalators that enter between the base pairs of double-stranded DNA and block RNA production. Bleomycin also causes double-stranded DNA breaks. Glucocorticoids, estrogens, antiestrogens, androgens, etc. inhibit protein synthesis after RNA synthesis.
  • WO2011 / 118795 discloses a composition for treating a damaged part for repairing a damaged part of a target tissue, which includes a stem cell culture supernatant obtained by culturing stem cells (hereinafter referred to as “conventional”). Technology 1 ”).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ growth factor-beta
  • anticancer agents are often ineffective (made resistant).
  • a mechanism of resistance for example, it may be due to a biological reaction of a cancer patient, such as inactivation of an anticancer agent in the liver or enhancement of metabolism, or may be due to a biochemical change at a cancer cell level.
  • many anticancer drugs have strong side effects, and there are cases where patients die due to side effects.
  • Immunotherapy is attracting attention as a treatment with few side effects, but its ability to control tumors is low, making it difficult to eradicate tumors reliably. This is due to the fact that immunotherapy uses lymphocytes and NK cells, which are the main body of immunity, and because lymphocytes and NK cells are originally infection-response cells, solid cancer This is due to the fact that the inhibitory effect on water is small.
  • SHED deciduous tooth stem cells
  • an embodiment of the present invention includes a stem cell preparation step in which four types of genes are introduced into a deciduous dental pulp stem cell obtained from a dental pulp of a mammal to obtain an immortalized stem cell; and the immortalized stem cell is predetermined in a serum-free medium.
  • conditioned medium preparation step of culturing at 23-27 ° C. under low oxygen concentration conditions where the oxygen concentration is 0.5% or more and less than 20% to prepare a conditioned medium.
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • the predetermined time is preferably 40 to 56 hours, and the low oxygen concentration is preferably 5% or less.
  • the low oxygen concentration is preferably an oxygen concentration of 1% or less.
  • the four types of genes are preferably selected from the group consisting of hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc, and p16INK4a.
  • the pharmaceutical composition for cancer treatment prepared by the above method contains 5 times more transforming factor ⁇ (TGF- ⁇ 1) than when cultured under the same conditions except that the oxygen concentration is 20%. Furthermore, it is preferable to include. It is preferable that the pharmaceutical composition further contains a stromal cell-derived factor (SDF-1) three times or more.
  • TGF- ⁇ 1 transforming factor ⁇
  • SDF-1 stromal cell-derived factor
  • another embodiment of the present invention is a pharmaceutical preparation for treating cancer containing a conditioned medium obtained as described above as an active ingredient.
  • the cancer is preferably a solid tumor.
  • a pharmaceutical composition comprising significantly higher concentrations of IGF-1 and VEGF than when cultured at a low oxygen concentration under a predetermined culture condition, with an oxygen concentration of 20%. You can get things.
  • the population of macrophages gathering around the solid tumor can be controlled to suppress the growth of cancer cells or to kill the cancer cells.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between an immortalized stem cell selected from the above-described dental pulp cells and the number of individual doublings of cells that are not immortalized stem cells and the culture period.
  • SHED-T represents an immortalized stem cell
  • SHED-C represents a cell that is not an immortalized stem cell.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of STRO-1 expression in SHED-C and SHED-T (FIGS. 2 (A) to (D)).
  • FIG. 3 is a view showing tissue staining images of SHED-C (D) to (F) and SHED-T (A) to (C) at the individual doubling time shown in FIG. 4 below.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the individual doubling time (number of times) and the amount of new bone, in which ** represents p ⁇ 0.05 and *** represents p ⁇ 0.01.
  • the amount of new bone was determined by the following calculation formula.
  • New bone mass New bone area / field of view x 100
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of examining over time how tumor size after subcutaneous injection of SCCVII changes when SHED culture supernatants with different culture conditions are administered. . In the figure, * indicates the result of ANOVA test, p ⁇ 0.05, and ** indicates p ⁇ 0.001.
  • FIG. 6 is a diagram showing a case (B) in which a tumor (A) having a diameter exceeding 10 mm is completely regressed.
  • FIG. 7 is a graph showing the survival rate over time of mice in each group subcutaneously injected with SCCVII.
  • FIG. 8 is an image obtained by injecting 1 ⁇ 10 7 macrophages labeled with IVIS (registered trademark) XenoLight DiR (Sumitomo Pharma International Co., Ltd.) from the tail vein into a tumor-formed mouse and imaging it in vivo.
  • IVIS registered trademark
  • XenoLight DiR Spectrum XenoLight DiR
  • FIG. 9 shows changes in the population of intraperitoneal macrophages in mice in which solid tumors were formed by SCCVII.
  • FIG. 10 is a histological search result (hematoxylin-eosin stained image) of a solid tumor formed by subcutaneous injection of the mouse squamous cell carcinoma strain SCCVII.
  • stem cells are isolated from mammalian mesenchymal cells, early embryos and somatic cells.
  • the mammal is preferably selected from the group consisting of humans, pigs, horses and monkeys because of its high genetic similarity with human cells and low risk of infection.
  • mesenchymal cells refer to cells that have the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system, such as osteoblasts, adipocytes, muscle cells, and chondrocytes.
  • mesenchymal cells include dental pulp cells, bone marrow cells, umbilical cord cells, and adipocytes of the above animals.
  • the “early-development embryo” refers to an embryo at an early stage up to a blastocyst that has developed more than a fertilized egg, which is necessary for establishing ES cells.
  • Somatic cell refers to a general term for cells other than germ cells among the cells constituting an organism.
  • “dental pulp cell” refers to a kind of stem cell contained in a dental nerve having regenerative ability. Because it is protected by a hard material called teeth, it has the property that it does not transmit ultraviolet rays or radiation, and genes are not easily damaged.
  • “Bone marrow cell” is a general term for cells obtained in a bone marrow aspirate, and includes leukocyte cells such as myeloblasts, erythroblast cells, bone marrow megakaryocytes, and plasma cells.
  • the umbilical cord cell is a cell existing in the umbilical cord connecting the fetus and the placenta, and is also included in the umbilical cord and includes umbilical cord blood that is rich in hematopoietic stem cells.
  • examples of the gene to be introduced into the stem cells described above include hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc, and p16INK4a.
  • hTERT is a gene for telomere repair enzyme
  • bmi-1 is a gene for Bmi-1, which is one of the proteins constituting the polycomb complex.
  • Bmi-1 is necessary for maintenance of hematopoietic stem cells, and has an effect that hematopoietic stem cells can be increased by enhancing the activity.
  • E6 and E7 are the early genes of HPV-16 or HPV-18 DNA.
  • Oct3 / 4 is a gene that activates transcription of the target gene in cooperation with Sox2.
  • Klf4 Keruppel-type transcription factor 4 regulates genes involved in cell division and embryogenesis, and has been implicated as a tumor suppressor for digestive cancer.
  • Sox2 belongs to the SRY-related HMG box gene family and is known to be involved in maintaining undifferentiated (pluripotent) functions.
  • c-Myc is an oncogene and promotes both cell survival and death in tumors induced with c-Myc.
  • p16INK4a is a gene that plays an important role in controlling the cell cycle of cancer cells.
  • the collected dental pulp tissue is basal medium such as Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified) containing 5-15% bovine serum (hereinafter sometimes referred to as “CS”) and 50-150 units / mL antibiotics. Suspended in Eagle's Medium (hereinafter referred to as “DMEM”). Subsequently, the cells are treated with 1-5 mg / mL collagenase and 1-5 mg / mL dispase at 37 ° C. for 0.5-2 hours.
  • basal medium such as Dulbecco's Modified Eagle Medium (Dulbecco's Modified) containing 5-15% bovine serum (hereinafter sometimes referred to as “CS”) and 50-150 units / mL antibiotics. Suspended in Eagle's Medium (hereinafter referred to as “DMEM”). Subsequently, the cells are treated with 1-5 mg / mL collagenase and 1-5 mg / mL dispase at 37
  • IMDM Iskov modified Dulbecco medium
  • HamF12 Ham F12 medium
  • RPMI1640 medium Two or more basic media may be used in combination.
  • IMDM and HamF12 are mixed in equal amounts (for example, commercially available as trade name: IMDM / HamF12 (GIBCO)) can be mentioned.
  • FCS fetal bovine serum
  • KSR washout serum replacement
  • BSA bovine serum albumin
  • the sorted cells are resuspended in, for example, 3 to 6 mL of the above basic medium, and seeded in an adherent cell culture dish having a diameter of 4 to 8 cm.
  • the cells are cultured at 37 ° C. for about 2 weeks in a 5% CO 2 incubator. After removing the culture medium, the cells are washed 1 to several times with PBS or the like. Instead of removing the culture medium and washing the cells, the adhesive dental pulp stem cells that formed colonies can also be recovered. Adherent dental pulp stem cells are detached from the dish by treatment with, for example, 0.025-0.1% trypsin and 0.3-1 mM EDTA for several minutes at 37 ° C., and the cells are then collected.
  • a culture solution for example, DMEM containing 10% FCS
  • the adherent cells selected as described above are cultured.
  • the dental pulp stem cells obtained as described above are seeded in an adherent cell culture dish and cultured in an incubator under conditions of 5% CO 2 and 37 ° C.
  • the subculture is detached and collected from the culture vessel using trypsin and EDTA as described above. Seed in a culture vessel containing
  • the sub-conflict refers to a state in which cells adhere to about 70% of the cell attachment surface in the culture vessel.
  • the subculture is performed 1 to 8 times, and the selected cells are grown to the required number of cells, for example, about 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the cells are collected and stored in liquid nitrogen.
  • Cells collected from various donors may be stored in the form of dental pulp stem cell banks.
  • genes to be introduced are preferably four types selected from the group consisting of hTERT, bmi-1, E6, E7, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, c-Myc, and p16INK4a.
  • hTERT is a gene for human telomerase reverse transcriptase
  • bmi-1 is a polycomb group gene involved in stem cell self-renewal and differentiation control.
  • E6 and E7 are genes present in an open reading frame that encodes the early genes used by human papillomavirus for self-replication. Such gene introduction can be performed as follows.
  • a plasmid for incorporating the above gene of interest is prepared, this is incorporated into a shuttle vector, for example, pSuttle2, and the above gene is cloned.
  • E. coli is transformed with this shuttle vector, and kanamycin resistant transformants are selected.
  • the plasmid DNA of the selected kanamycin resistant transformant is purified and the restriction enzyme site is analyzed to identify the recombinant.
  • the expression cassette is excised from the above shuttle vector using restriction enzymes such as PI-SceI and I-CueI, and this is ligated to an adenovirus vector such as Adeno-X viral DNA.
  • restriction enzymes such as PI-SceI and I-CueI
  • the resulting ligation product is cleaved with SwaI and used to transform E. coli.
  • an ampicillin resistant transformant is selected.
  • the recombinant adenovirus DNA in which the above gene is incorporated is purified, and the restriction enzyme site is analyzed to identify the recombinant.
  • the recombinant adenovirus is digested with PacI, and this is transfected into HEK293 cells. Recombinant adenovirus is propagated and collected to determine virus titer. The virus is purified according to a conventional method and infected with the target cell, SHED.
  • STRO-1 is considered as one of the markers of pluripotent mesenchymal stem cells in the bone marrow and serves as an indicator of cell immortalization.
  • the immortalized stem cells obtained were cultured for 24 to 48 hours under the conditions of 5% CO 2 and 37 ° C. using the above-mentioned basic medium, for example, DMEM supplemented with 10% FBS. Get Qing.
  • DMEM fetal calf serum
  • Get Qing For the collection of the culture supernatant, for example, a comago pipette can be used.
  • the collected culture supernatant may be used as it is as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, and after the concentration, solvent replacement, dialysis, lyophilization, dilution and other treatments, the effective of the pharmaceutical composition of the present invention. It may be used as an ingredient.
  • the culture supernatant of the immortalized stem cells obtained as described above contains various growth factors and exhibits various actions without high purification. That is, since the pharmaceutical composition of the present invention that can be used for treatment of various diseases can be produced by a simple process, it is possible to avoid a decrease in physiological activity of various growth factors accompanying high-purification.
  • the “culture supernatant of immortalized stem cells” used in the present invention refers to a culture supernatant containing various biological factors obtained by culturing immortalized stem cells, and does not include immortalized stem cells or other cells. Refers to a solution.
  • serum-free media When preparing culture supernatants that do not contain serum, use serum-free media in all steps from initial culture to passage, or do not pass through several passages before harvesting the cells. Serum medium may be used.
  • the dental pulp stem cells selected and cultured by the above method are tissues and cells collected from the living body and have the same properties as the primary cultured cells seeded first.
  • primary cultured cells are important in that they have properties similar to those of the source organ and are close to normal cells.
  • the growth is slower than that of the established cell line, and de-differentiation may occur while the culture is continued, which is difficult to maintain while maintaining its properties.
  • the expression rate of STRO-1 which is a marker of the degree of cell undifferentiation, is significantly higher than that of dental pulp stem cells that are not immortalized stem cells when the number of cell doublings is 20 or 40. It is preferable that the ratio is as high as about 1.5 to 3 times. This is because the high expression rate of STRO-1 is an indicator that the same properties as the primary cultured cells are exhibited.
  • the immortalized stem cells of the present invention are derived from insulin-like growth factor (IGF-1), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), and hepatocyte growth factor HGF. At least two or more growth factors selected from the group consisting of are secreted into the culture supernatant.
  • the “growth factor” is a general term for polypeptides that promote cell division or cause morphological changes or hypertrophy. Factors vary depending on the type of cells that produce growth factors, and are roughly classified into epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor (FGF), nervous system nerve growth factor, tumor growth factor (TGF), and the like.
  • receptors on the cell membrane of each cell have tyrosine kinase activity, and when a growth factor binds, the tyrosine residue of the protein is phosphorylated, causing cell proliferation and differentiation.
  • growth factors are mesoderm inducers in ontogeny.
  • mesoderm inducers in lymphokine ontogeny that regulates the immune system.
  • Such growth factors can be quantified by an ELISA method, a microarray method, or the like.
  • IGF-1 is a polypeptide having a sequence highly similar to that of insulin, and induces a mitogenic reaction or the like in the same manner as insulin in cell culture. It is known to affect the growth of nerve cells.
  • VEGF is a group of glycoproteins involved in angiogenesis that forms new blood vessels where there are no blood vessels and angiogenesis that branches from existing blood vessels to form blood vessels during the embryogenesis stage. is there.
  • TGF- ⁇ is also a potent growth inhibitory factor for many cells and is closely involved in cell differentiation, migration, and adhesion, ontogeny and tissue remodeling, wound healing, inflammation / immunity, cancer invasion / It plays an important role in a wide range of areas such as metastasis.
  • HGF is versatile not only for hepatocytes but also for various cells that promote cell proliferation, promote cell motility, induce anti-apoptosis (cell death), induce morphogenesis, and regenerate and protect other tissues and organs. It has various physiological activities.
  • the above-mentioned proteins are obtained in the culture supernatant containing the above growth factors by culturing the above-mentioned various stem cells, for example, in DMEM supplemented with 15% FCS at 37 ° C. for a predetermined period. be able to.
  • the stem cell culture supernatant contains about 70 types of proteins in addition to IGF-1, VEGF, TGF- ⁇ , and HGF.
  • Amicon can be concentrated by ethanol precipitation. For example, 5 mL of the culture supernatant is mixed with 45 mL of 100% ethanol and left at ⁇ 20 ° C. for 60 minutes. The supernatant is then removed by centrifugation at 15,000 xg for 15 minutes at 4 ° C.
  • the culture supernatant obtained as described above may be used as it is, or may be appropriately diluted with a physiologically acceptable solvent such as phosphate buffered saline. Moreover, it can also be freeze-dried according to a conventional method to prepare a pharmaceutical composition adjusted at the time of use.
  • a physiologically acceptable solvent such as phosphate buffered saline.
  • the amount of growth factor in the culture supernatant contained in this pharmaceutical preparation is preferably about 50 to 500% by weight based on the total dry weight.
  • Examples of the dosage form of this pharmaceutical composition include powders, solutions, gels, sprays, and transdermal absorption systems.
  • additives such as fillers, excipients, and pH adjusters can be added and placed in sterilized glass ampoules, serum tubes, or other small containers to make pharmaceutical preparations. At the time of use, it may be dissolved in physiological saline or sterilized water for injection and administered nasally, or it may be infiltrated with gauze and attached to the affected area.
  • collagen, ⁇ -TCP, or the like may be used as a scaffold, and these may be immersed in the above solution and embedded.
  • Example 1 Preparation of immortalized cells (1) Preparation of vector for virus introduction (1-1) Reagent for plasmid extraction, etc. Kanamycin (Kan), ampicillin (Amp), LB liquid medium and LB agar medium, glycogen, agarose Sterile water, ammonium acetate, sodium acetate, sodium dodecyl sulfate and RNase A were used. 50 mg / mL kanamycin and ampicillin were prepared and stored at ⁇ 20 ° C. as stock solutions. Glycogen was adjusted to 20 mg / mL. 10 mg / mL RNase A was prepared and stored at -20 ° C. 10M (saturated) ammonium acetate (NH 4 OAc), 3M sodium acetate (NaOAc; pH 5.2) were prepared.
  • E. coli competent cells Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells, product code 636756), Swa I (product code 1111A, Smi I is equivalent), Xho I (product code 1094A), T4 DNA Ligase (product) Code 2011A), NucleoBond Xtra Midi (product code 740410.10 / .50 / .100), and NucleoSpin Plasmid (product code 740588 10/50/250) were all purchased from Takara Bio Inc. Pac I was purchased from New England Biolabs.
  • Buffer 1 25 mM Tris-HCl containing 10 mM EDTA and 50 mM glucose (pH 8. 0) (After autoclaving, store at 4 ° C)
  • Buffer 2 0.2M NaOH containing 1% SDS (prepared immediately before use, sealed, and stored at room temperature)
  • Buffer 3 5M KOAc (After autoclaving, store at 4 ° C)
  • Buffer 4 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) containing 1 mM EDTA, 20 ⁇ g / mL RNase (Add RNase immediately before use and store at –20 ° C)
  • HEK293 cells (ATCC # CRL1573) transformed with human type 5 adenovirus were used.
  • HEK293 cells were cultured in complete medium.
  • the composition of the complete medium was DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, basic medium) supplemented with 100 unit / mL penicillin G sodium, 100 ⁇ g / mL streptomycin, 4 mM L-glutamine and 10% FBS.
  • the penicillin G sodium solution was prepared at 10,000 units / mL
  • the streptomycin sulfate solution was prepared at 10,000 ⁇ g / mL and stored as a stock solution.
  • Trypsin-EDTA (product code CC-5012) was purchased from Takara Bio Inc. Phosphate buffered saline (containing no PBS, Ca2 + and Mg2 + ) and Dulbecco's phosphate buffered saline (containing DPBS, Ca2 + and Mg2 + ) were prepared. Further, a 0.33% neutral red staining solution and a 0.4% trypan blue staining solution were used.
  • X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside [25 mg / mL]) dimethylformamide (DMF) solution was stored in the dark at -20 ° C.
  • Luminescent ⁇ -gal Detection Kit II (product code 631712) was used.
  • trypsin reaction was stopped by adding 10 mL complete medium and gently suspended. Viable count was performed, and 10 5 cells were transferred to a 100 mm plate containing 10 mL of the culture solution and spread uniformly.
  • pShuttle2-lac Z positive control vector included in Adeno-X Expression System 1
  • Adeno-X Viral DNA PI-Sce I and I-Ceu I digested
  • a recombinant adenovirus containing lac Z was constructed according to the protocol attached to.
  • the target cell, SHED was infected and assayed for ⁇ -galactosidase expression to confirm that the vector was constructed.
  • rpShuttle2 Vector Before construction of recombinant pShuttle2 Vector (hereinafter referred to as “rpShuttle2 Vector”), DH5 ⁇ E. coli was transformed with pShuttle2 Vector and pShuttle2-lac Z Vector included in the kit. did. A transformant was selected on an LB agar plate (hereinafter referred to as “LB / Kan”) containing 50 ⁇ g / mL kanamycin, and the cells taken from a single colony were streaked to a new LB / Kan. Incubate overnight at ° C.
  • LB / Kan LB agar plate
  • hTERT, bmi-1, E6, and E7 were cloned into pShuttle2 by the following procedure.
  • PShuttle2 Vector was cleaved with restriction enzymes suitable for these genes.
  • the target DNA fragment was prepared and purified according to a conventional method.
  • the vector digested with the restriction enzyme and the gene fragment were ligated, and DH5 ⁇ cells (competent cells) were transformed with the ligation product.
  • a part of the above competent cells was taken and transformed with the control vector pShuttle2-lac Z Vector included in the kit as a positive control.
  • the mixed solution containing transformed E. coli was inoculated on an LB / Kan agar plate, and kanamycin resistant (Kanr) transformants (colony) were selected. Five to ten Kan resistant clones were selected and inoculated into a small amount of liquid medium for amplification. After confirming that these clones had rpShuttle2 Vector, they were incubated overnight. Thereafter, the constructed plasmid DNA was purified by a conventional method using a commercially available silica adsorption column.
  • This plasmid DNA was treated with a restriction enzyme and subjected to 1% agarose gel electrophoresis to identify the desired recombinant plasmid. By sequencing, the direction of the inserted fragment and the insertion site were confirmed, and a positive clone was identified.
  • rpShuttle2 plasmid DNA Recombinant pShuttle2 plasmid DNA (hereinafter referred to as “rpShuttle2 plasmid DNA”) was directly transfected into target cells, and Western blotting was performed to preliminarily check the expression of the target protein.
  • Phenol chloroform: isoamyl alcohol extraction
  • 1 ⁇ TE Buffer pH 8.0
  • PCI isoamyl alcohol extraction
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the aqueous layer was transferred to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed by aspiration to obtain a pellet.
  • 300 ⁇ L of 70% ethanol was added and centrifuged at 14,000 rpm for 2 minutes at room temperature. The supernatant was carefully aspirated off and the pellet was air dried at room temperature for approximately 15 minutes.
  • pellets were dried, they were dissolved in 10 ⁇ L of sterilized 1 ⁇ TE buffer (pH 8.0) and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed by aspiration to obtain a pellet.
  • the following ethanol precipitation operation was performed in the same manner as in the above (3-4). After the pellet dried, it was dissolved in 15 ⁇ L of sterile deionized water.
  • the transformation mixture is inoculated into an agar plate (hereinafter referred to as “LB / Amp agar plate”) containing ampicillin (final concentration 100 ⁇ g / mL) in LB medium and incubated overnight at 37 ° C. for resistance to ampicillin. (Ampr) transformants were selected. About 10 6 colonies were obtained. The obtained colonies were checked with the Adeno-X System PCR Screening Primer Set attached to the product. 5 mL of fresh LB / Amp liquid medium was inoculated with cells from a single colony and cultured overnight. On the next day, Adeno-X plasmid DNA was purified according to the mini-scale method described later.
  • 150 ⁇ L of the above buffer 1 was added, gently pipetted and resuspended.
  • 150 ⁇ L of Buffer 2 was added, gently mixed by inversion, and left on ice for 5 minutes.
  • 150 ⁇ L of buffer 3 was added, and the mixture was inverted again and left on ice for 5 minutes.
  • the cell suspension was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the clear supernatant was transferred to a clean 1.5 mL centrifuge tube.
  • 450 ⁇ L of a PCI mixed solution was added, mixed by inversion and stirred. Thereafter, the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the aqueous layer was transferred to a clean 1.5 mL microcentrifuge tube.
  • the following ethanol precipitation was performed in the same manner as in (3-4) above, and the pellet solution was stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • the target rDNA was identified by restriction enzyme analysis and PCR described below.
  • Each culture plate was transfected with 10 ⁇ L of Pac-I-digested Adeno-X plasmid DNA, and Adeno-X DNA was introduced into HEK293 cells according to the standard transfection method (CalPhos Mammalian Transfection Kit product code 631312). From the day after transfection, it was confirmed whether CPE (cytopathic effect) occurred.
  • the cells adhering to the bottom and sides of the culture plate were gently agitated to release them.
  • the resulting cell suspension was transferred to a 15 mL sterilized conical centrifuge tube and centrifuged at 1,500 ⁇ g for 5 minutes at room temperature.
  • the obtained precipitate was suspended in 500 ⁇ L of sterile PBS.
  • a freeze-thaw operation of freezing in dry ice / boiled ethanol and thawing in a 37 ° C. constant temperature bath was repeated three times to obtain a lysate in which cells were sufficiently thawed.
  • the suspension was lightly centrifuged to remove the suspended matter, and the supernatant was transferred to another sterilized tube and used immediately. The portion not used immediately was stored at -20 ° C.
  • titer of adenovirus was measured according to the instruction manual (PT3651-1) of this kit, using an anti-Hexon antibody included in Adeno-X Rapid Rapider Kit (product code: 631028).
  • CPE was confirmed by culturing at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 3 to 4 days. When 50% of the cells were detached, a free cell suspension was prepared in the same manner as above and transferred to a 15 mL sterilized conical centrifuge tube. Freezing and thawing operations similar to the above were performed to thaw the cells. A titer of 10 7 PFU / mL was obtained using the Adeno-X Rapid Titer Kit (product code 631028).
  • Adenoviral infection of target cells (7-1) Infection of target cells 6-well plates were inoculated with 1 ⁇ 10 6 SHEDs 24 hours before infection. The day after inoculation, the medium was removed and 1.0 mL of medium containing virus was added to the center of each plate. This solution was spread evenly over the monolayer formed by SHED.
  • the cells were cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 4 hours to infect the virus with SHED. Then, a fresh medium was added and further cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 .
  • Transgene expression was analyzed over time from 24 to 48 hours after infection. (7-2) Analysis of ⁇ -galactosidase expression in infected cells ⁇ -galactosidase expression in adherent cells infected with Adeno-X-lac Z was performed using Luminescent ⁇ -galDetection Kit II (product code 631712, Clontech). Assayed.
  • Example 2 Production of SHED (1) Isolation of deciduous stem cells
  • Deciduous deciduous teeth obtained from a 10-year-old healthy boy were used. After this deciduous deciduous tooth was sterilized with an isodine solution, the dental crown was cut horizontally using a dental diamond point, and the pulp tissue was collected using a dental reamer. The obtained dental pulp tissue was digested in a solution of 3 mg / mL type I collagenase and 4 mg / mL dispase at 37 ° C. for 1 hour. The solution was then filtered using a 70 mm cell strainer (Falcon).
  • the cells separated by filtration were resuspended in 4 mL of the above medium and seeded in an adherent cell culture dish having a diameter of 6 cm.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FCS 10% FCS
  • the incubator desktop personal use cell culture device 9000EX series, Wakenbee Tech Co., Ltd.
  • Adherent cells dental pulp stem cells
  • the cells detached from the dish were collected.
  • adherent cells selected as described above are seeded in an adherent cell culture dish (collagen-coated dish), and then primary cultured in an incubator adjusted to 5% CO 2 and 37 ° C. It was. When it becomes subconfluent (contains about 70% of the surface of the culture vessel) or confluent by visual observation, it is treated with 0.05% trypsin / EDTA for 5 minutes at 37 ° C to detach the cells from the culture vessel And recovered.
  • the cells thus obtained were seeded again in a dish containing the above medium and subcultured several times to grow to about 1 ⁇ 10 7 cells / mL.
  • the resulting cells were stored in liquid nitrogen.
  • SHED human fallen deciduous dental pulp stem cells
  • SHED was fixed with 3% paraformaldehyde, then rinsed twice with PBS, and treated with 100 mM glycine for 20 minutes. These cells were then permeabilized with 0.2% Triton-X (Sigma-Aldrich) for 30 minutes and then incubated in a mixture of 5% donkey serum and 0.5% bovine serum albumin for 20 minutes.
  • the cells were incubated with the primary antibody mouse anti-human STRO-1 antibody (1: 100, manufactured by R & D) for 1 hour, and the secondary antibody goat anti-mouse immunoglobulin M-FITC antibody (1: 500, Incubated for 30 minutes with Southern Biotech) and mounted using VectorShield DAPI (Vector Laboratories Inc).
  • ⁇ -MEM supplemented with 15% FBS was placed in a 6-well plate, and the sorted cells were seeded for clone preparation. Approximately 300 colonies from the expanded cells were pooled for testing.
  • infected cells were selected by culturing for 10 days in the above medium supplemented with puromycin (1 pg / mL), and 500-600 resistant clones were pooled. Every 3-4 days, about 0.5 ⁇ 10 5 SHEDs were seeded in a 100 mm ⁇ culture dish and subcultured.
  • SHED-T The SHED into which the gene was introduced
  • SHED-C the SHED into which the gene was not introduced
  • Example 3 Examination of characteristics of SHED (1) Measurement of growth rate of SHED-C and SHED-T The doubling state of the number of individuals of SHED-T (SHED into which gene was introduced) was shown in FIG. In the figure, the vertical axis represents the number of individual doublings (number of cell divisions, times), and the horizontal axis represents time (culture days). In addition, the state in which SHED in culture does not divide for one month was used as a criterion for cell aging.
  • SHED-C stopped growing after about 30 times and entered the aging or growth stop phase. In contrast, SHED-T exceeded 250 PD and proliferated after 800 days.
  • SHED-C the percentage of STRO-1 positive cells was 27% in PD20 and decreased to 15% in PD30 (FIGS. 2 (A) and (B)).
  • SHED-T the proportion of STRO-1 positive cells was 46% for PD20 and 41% for PD40, respectively (FIGS. 2 (C) and (D)).
  • transplant 8 weeks after transplantation, the transplant was collected, fixed with 4% formalin, decalcified, and buffered with a PBS solution containing 10% EDTA for embedding in paraffin. Some were stored in 70% ethanol solution for plastic embedding.
  • FIG. 4 shows changes in the amount of new bone between SHED-T and SHED-C at each individual doubling number (doubling time).
  • ** represents p ⁇ 0.05
  • *** represents p ⁇ 0.01.
  • the amount of new bone was calculated
  • SHED-C and SHED-T cells were transplanted into the subcutaneous tissue of immunocompromised mice. After the transplantation, observation was performed for 30 days or more. During this period, no tumor was formed in any mouse transplanted with the above cells. In SHED-T cells, there was no change in the morphology of all clones of 40-200 PD cultured cells. From the above, it was shown that SHED-T has no carcinogenic activity.
  • Evaluation SEHD-T was shown to have the ability to proliferate while maintaining differentiation ability even when it exceeded 260 PD, but SHED-C aged at 30 PD or less, although it had differentiation ability. .
  • SHED-T is an immortalized stem cell and is suitable for mass production of highly active SHED culture supernatant.
  • Example 4 Preparation of conditioned medium Immortalized SHED prepared in Example 1 was cultured in a serum-free medium for 48 hours under the following conditions with oxygen concentrations of 20%, 10%, 5%, and 1%. The supernatant was collected.
  • cytokines shown in Table 6 below were determined using ELISA kits (manufactured by R & D Systems, Human IGF-1 Quantikine Elisa kit (catalog number: DG100), Human TGF- ⁇ Quantikine Elisa kit (catalog number: DB100B), Human Measurement was performed using VEGF Quantikine Elisa kit (catalog number: DVE00)).
  • Example 5 Examination of therapeutic effect using cancer-bearing animal Mouse squamous cell carcinoma strain SCCVII (provided by Mr. Nishimura, Kinki University School of Medicine) in DMEM containing 10% FBS (Gibco), After culturing at 37 ° C. for 1 week, the cells were separated using a PBS buffer containing 0.5% trypsin. Viable cells were counted by staining with trypan blue, and a suspension of 1 ⁇ 10 6 cells / mL was prepared using 1 mL of PBS buffer.
  • mice Under the back of 50 mice (C3H / He, 7 weeks old, purchased from Chubu Scientific Materials Co., Ltd.), 0.5 mL of the cell suspension prepared as described above was added to the 18G injection needle (manufactured by Terumo). Were injected (5 ⁇ 10 5 mice / mouse). There were 10 animals per group. 1 mL of the culture supernatant of a control group (buffer only) and group I to group IV (hereinafter sometimes referred to as “GI to GIV”) was administered to each group of mice via the tail vein. After injecting the cancer cells, each group of mice was bred under the same conditions as above.
  • mice Each group of mice was placed in a cage and reared under light and dark conditions for 12 hours under conditions of 25 ⁇ 0.5 ° C. and 50% humidity. Water and feed were given freely. Tumor diameter was measured daily with calipers.
  • GII and GIII had a significantly slower increase in tumor diameter than GI (* is p ⁇ 0.05), exceeding 10 mm on the 7th day of administration and exceeding 20 mm on the 19th day.
  • FIG. 6 shows photographs of mice in a state (A) and a complete cure (B) when the diameter of the tumor is maximized.
  • Fig. 7 shows changes in the survival rate of each group of mice.
  • the difference in the increase in tumor diameter was reflected in the survival rate of mice, and in GI, all mice died on the 41st day. In GII and GIII, all mice died after 50 days. In contrast, with GIV, approximately 80% of mice survived beyond 60 days, and all mice died on the 78th day. Survival was about twice that of GI.
  • Example 6 Examination about change of tumor and surrounding tissue Macrophage behavior with respect to cancer tissue was measured by in vivo imaging. 5 mL of thioglycolate solution (2% Brewer's thioglycolate medium (Difco)) was injected into the abdominal cavity of the mouse, and after 4 days, the abdominal cavity was washed with PBS to obtain 10 7 macrophages. . Among the obtained macrophages, 3 ⁇ 10 6 cells were mixed with 3.5 ⁇ g / mL dye (Molecular Tracer DiR (Sumitomo Pharma International)) and 0.5% ethanol and labeled.
  • thioglycolate solution 2% Brewer's thioglycolate medium (Difco)
  • the culture supernatant prepared in Example 2 was injected at 1 mL / mouse into each group of mice from the tail vein.
  • the amount of cytokine in the culture supernatant was measured using the above-described Human IGF-1 Quantikine Elisa kit, Human TGF- ⁇ Quantikine Elisa kit, and Human VEGF Quantikine Elisa kit.
  • the behavior of labeled macrophages was observed using Xenogen IVIS 200 series system (Xenogen, Alameda, CA). Imaging was performed using a recommended IVIS filter set (excitation 710 nm / fluorescence 760 nm) at an excitation wavelength of 748 nm and a fluorescence wavelength of 780 nm.
  • Example 7 Histological examination 5 ⁇ 10 5 SCCVII were injected into CH3 / He mice, and after 1 week and 15 weeks, tumors including the surrounding tissues were excised and examined histologically. At 15 weeks, there was a case where tumor necrosis was observed in the treatment group (GIV) (FIG. 6).
  • the macrophage marker is stained with CD11b antibody (BioLegend), the M2 macrophage marker is stained with CD206 antibody (Abcam), and the M1 macrophage marker is stained with ED1 (CD68) antibody (Millipore). The ratio of M1 and M2 was examined. The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 shows stained images of mouse tumor tissues stained with eosin-hematoxylin in the control group and the treatment group.
  • the macrophages accumulated in the tumor were considered to have destroyed the tumor tissue with its original phagocytic ability and at the same time controlled the growth of the tumor via TGF- ⁇ .
  • the present invention is useful in the field of medicine.

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Abstract

　固形癌に対して効果が高く、化学療法剤のような副作用がなく、耐性化を起こしにくい新たな抗ガン治療薬を提供することを目的とする。 哺乳類の歯髄から得た乳歯歯髄幹細胞に4種類の遺伝子を導入して不死化幹細胞とする幹細胞作製工程と；前記不死化幹細胞を、無血清培地中で所定の時間、酸素濃度が0.5％以上20％未満の低酸素濃度条件下で23～27℃で培養し、コンディション培地を調製する、コンディション培地調製工程と；を備える方法によって調製され、酸素濃度を20％とした以外は同じ条件の下で培養した場合に調製されるコンディション培地に比べて、1.5倍以上のインスリン様成長因子（IGF-1）及び血管内皮細胞増殖因子（VEGF）を含む、癌治療用医薬組成物を提供する。

Description

癌治療用医薬組成物及びその組成物を有効成分とする癌治療用医薬製剤
　本発明は、癌治療用医薬組成物及びその組成物を有効成分とする癌治療用医薬製剤に関する。より詳細には、哺乳類の歯髄幹細胞の培養上清を用いた癌治療用医薬組成物及びその組成物を有効成分とする癌治療用医薬製剤に関する。
　体内の微小環境における低酸素応答は発生時の器官形成、幹細胞増殖などに働くこと、及び、低酸素応答の働きは癌や虚血性疾患などの病気にも関与していることが知られている。
　また、低酸素環境は、多数の遺伝子発現を調整し、細胞の増殖、分化、アポトーシスなどの細胞応答などを制御する。
　一方で、癌の治療のために、種々の抗癌剤が開発されてきた。こうした抗癌剤としては、例えば、DNA合成阻害剤であるシタラビン、フルオロウラシル、メルカプトプリン、チオグアニン、ビンカアルカロイドであるビンブラスチンやビンクリスチン、プロカルバジン、アルキル化剤であるムスチン、シクロホスファミド、シスプラチン、抗生物質であるアクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、マイトマイシン、ミトラマイシン、ブレオマイシン、ステロイドホルモンである糖質コルチコイド、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン等を挙げることができる。
　シタラビンはDNAポリメラーゼを阻害し、フルオロウラシルはチミジル酸合成酵素を阻害し、ピリミジン合成を抑制する。メルカプトプリンやチオグアニンはプリン合成を阻害する。ビンブラスチンやビンクリスチンはＭ期に特異的に作用し、チューブリンと結合して紡錘を破壊し、有糸分裂を停止させる。プロカルバジンは二本鎖DNAの解重合を生じさせ、ムスチン、シクロホスファミド、シスプラチン等は共有交差結合を生じさせ、DNA合成を阻害する。アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、マイトマイシン、ミトラマイシン等はインターカレーターであり、二本鎖DNAの塩基対の間に入り込んでRNAの産生を遮断する。また、ブレオマイシンは二本鎖DNAの切断を起こす。糖質コルチコイド、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン等は、RNA合成後のタンパク質合成を阻害する。
　これらの他にも、多くの抗癌剤が開発されて治療に使用され、一定の治療効果を挙げてきた。
ＷＯ２０１１／１１８７９５号公報
Yue Wang, et al., PLOS ONE, January 2013, Vol. 8, Issue 1, e54296 M. Celeste Simon and Brian Keith, Nature Reviews/ Molecular Cell Biology, April 2008, Vol. 9, pp. 285-296
　ＷＯ２０１１／１１８７９５号公報には、幹細胞を培養することによって得られた幹細胞培養上清を含む、標的組織の損傷部を修復するための損傷部治療用組成物が開示されている（以下、「従来技術１」という。）。
　従来技術１は、通常の酸素濃度条件の下で培養した、血管内皮増殖因子（VEGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、インシュリン様成長因子（IGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、形質転換成長因子－ベータ（TGF-β）からなる群より選択された少なくとも２のサイトカインを含む幹細胞の培養上清が、種々の疾病によって損傷を受けた組織、例えば、中枢神経組織、皮膚組織、歯周組織、骨組織、脳組織、網膜組織の治療に使用できることを見出し、主要な死因のひとつである、心疾患や脳血管疾患によって損傷した組織の治療剤を開発したという点では優れた技術である。しかし、主要な死因のひとつである腫瘍（癌）については検討がされていない。
　癌の治療に関しては、上記のような抗癌剤を用いて、化学療法が行われることが多いが、臨床では、抗癌剤が効かなくなる（耐性化する）ことがしばしば見られる。耐性化の機序としては、例えば、肝臓における抗癌剤の不活化や代謝の亢進等、癌患者の生体反応に起因する場合や、癌細胞レベルの生化学的変化に起因する場合がある。これらのうち、後者では、多剤耐性に関与する抗癌剤の膜輸送機構の変化、標的酵素やタンパク質の増幅、薬剤活性化機構、酵素の活性の低下、例えば、DNA修復機構の亢進、抗癌剤の不活化機構の亢進等が起こっていると考えられる。また、抗癌剤は強い副作用を有する者が多く、副作用によって患者が死亡するケースもある。
　このため、副作用の少ない癌治療法に対する要求は高い。こうした副作用の少ない治療法として免疫療法が注目を浴びているが、腫瘍制御能が低く、確実に腫瘍を撲滅することは困難である。これは、免疫療法が、免疫の主体であるリンパ球やNK細胞を利用することに起因するものであり、また、リンパ球やNK細胞が、本来は、感染症対応細胞であるため、固形癌への抑制効果が小さいことによるものである。
　したがって、固形癌に対して効果が高く、化学療法剤のような副作用がなく、耐性化を起こしにくい新たな抗ガン治療薬の開発に対する、強い社会的要請がある。
　本願発明の発明者らは、こうした状況の下で、乳歯幹細胞（SHED）の生物学的能力についての研究を進め、その過程において、SHEDの培養上清（以下、「SHED-CM」ということがある。）が、マクロファージ（以下、「Ｍ」と略すことがある。）の機能を制御することを見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本願発明の一実施態様は、哺乳類の歯髄から得た乳歯歯髄幹細胞に4種類の遺伝子を導入して不死化幹細胞とする幹細胞作製工程と；前記不死化幹細胞を、無血清培地中で所定の時間、酸素濃度が0.5％以上20％未満の低酸素濃度条件下で23～27℃で培養し、コンディション培地を調製する、コンディション培地調製工程と；を備える方法によって調製され、酸素濃度を20％とした以外は同じ条件の下で培養した場合に調製されるコンディション培地に比べて、1.5倍以上のインスリン様成長因子（IGF-1）及び1.5倍以上の血管内皮細胞増殖因子（VEGF）を含む、癌治療用医薬組成物である。
　ここで、前記所定の時間は40～56時間であることが好ましく、前記低酸素濃度は、酸素濃度5％以下であることが好ましい。また、前記低酸素濃度は、酸素濃度1％以下であることが好ましい。前記４種類の遺伝子は、hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、及びp16INK4aからなる群から選ばれるものであることが好ましい。
　上記の方法で調製された癌治療用医薬組成物は、酸素濃度を20％とした以外は同じ条件の下で培養した場合に比べて、5倍以上のトランスフォーミング因子β（TGF-β1）をさらに含むことが好ましい。前記医薬組成物は、3倍以上のストロマ細胞由来因子（SDF-1）をさらに含むことが好ましい。
　また、本願発明の別の実施態様は、上記のようにして得られたコンディション培地を有効成分として含有する、癌治療用医薬製剤である。前記癌は、固形腫瘍であることが好ましい。
　本発明によれば、所定の培養条件の下に、低酸素濃度で培養することにより、酸素濃度を20％として培養した場合よりも、有意に高い濃度のIGF-1及びVEGFを含む、医薬組成物を得ることができる。
　そして、この医薬組成物を投与することにより、固形腫瘍周囲に集まるマクロファージのポピュレーションを制御して、癌細胞の増殖を抑制するか、癌細胞を死滅させることができる。
図１は、上述した歯髄細胞から選択された不死化幹細胞と、不死化幹細胞ではない細胞の個体倍加回数と培養期間との関係を表すグラフである。図１中、SHED-Tは不死化幹細胞を表し、SHED-Cは不死化幹細胞ではない細胞を表す。 図２は、SHED-C及びSHED-TでのSTRO-1発現の結果を示すグラフである（図２（Ａ）～（Ｄ））。図中、PD20は個体数倍加回数＝20回、PD30は個体数倍加回数＝30回、及びPD40は個体数倍加回数＝40回を表す。 図３は、下記の図４に示す各個体倍加時間のときのSHED-C（D）～（F）とSHED-T（A）～（C）との組織染色像を示す図である。
図４は、個体倍加時間（回数）と新生骨量との関係を示すグラフであり、図中、**はｐ＜0.05、***はｐ＜0.01を表わす。新生骨量は、以下の算出式で求めた。　新生骨量＝新生骨面積／視野面積ｘ100 図５は、SCCVIIを皮下に注射した後の腫瘍の大きさが、培養条件の異なるSHEDの培養上清を投与したときに、どのように変化するか経時的に調べた結果を示す図である。図中、*はANOVA検定の結果、p＜0.05を、また、**はp＜0.001を示す。
図６は、直径10mmを越える大きさの腫瘍（A）が、完全に退縮した症例（B）を示す図である。 図７は、SCCVIIを皮下注射した各群のマウスの経時的な生存率を示す図である。 図８は、腫瘍が形成されたマウスに、IVIS（登録商標）XenoLight DiR（住商ファーマインターナショナル（株））で標識したマクロファージ1ｘ107個を尾静脈から注入し、in vivoイメージングした像である。
図９は、SCCVIIによって固形腫瘍が形成されたマウスの腹腔内マクロファージのポピュレーションの変化を示す図である。 図10は、マウス扁平上皮癌株SCCVIIを皮下注射して形成された固形腫瘍の組織学的検索結果（ヘマトキシリン－エオシン染色像）である。
　以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
　本願発明の不死化幹細胞を得るには、まず、哺乳類の間葉系細胞、初期発生胚及び体細胞から幹細胞を単離する。上記哺乳類としては、ヒト、ブタ、ウマ、及びサルからなる群から選ばれるものであることが、ヒト細胞との遺伝的類似性が高いこと、及び感染の危険性が低いことから好ましい。
　本明細書中、「間葉系細胞」とは、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞等、間葉系に属する細胞への分化能を持つとされる細胞をいう。具体的な間葉系細胞としては、上記の動物の歯髄細胞、骨髄細胞、臍帯細胞及び脂肪細胞等を挙げることができる。また、「初期発生胚」とは、ES細胞を樹立するために必要な、受精卵よりも発生が進んだ胚盤胞までの初期段階の胚をいう。「体細胞」とは、生物体を構成している細胞のうち、生殖細胞以外の細胞を総称したものをいう。
　さらに、「歯髄細胞」とは、再生能を有する歯の神経に含まれる幹細胞の一種をいう。歯という硬質の材料に保護されているため紫外線や放射線を通さず、遺伝子も傷つきにくいという特性を有する。「骨髄細胞」とは、骨髄の穿刺液中に得られる細胞の総称であり、骨髄芽球等の白血球系の細胞、赤芽球系の細胞、骨髄巨核球、及び形質細胞等が含まれる。
　本明細書中で臍帯細胞とは、胎児と胎盤とを結ぶ臍帯中に存在する細胞であり、臍帯中に含まれ、造血幹細胞を豊富に含有する臍帯血も含む。
　また、上述した幹細胞中に導入する遺伝子としては、hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、及びp16INK4a等を挙げることができる。hTERTはテロメア修復酵素の遺伝子であり、bmi-1はポリコーム複合体を構成するたんぱく質の１つであるBmi-1の遺伝子である。ここで、Bmi-1は造血幹細胞の維持に必要であり、活性増強により造血幹細胞を増やすことができるという作用を有する。
　E6及びE7はHPV-16又はHPV-18のDNAの初期遺伝子である。また、Oct3/4はSox2と協調して標的遺伝子の転写を活性化する遺伝子である。Klf4（Kruppel型転写因子4）は細胞分裂と胚発生にかかわる遺伝子を調節し、消化器系の癌の癌抑制因子としてかかわっている。
　Sox2はSRY-related HMG box遺伝子ファミリーに属しており、機能の未分化性（多能性）維持に関与することが知られる遺伝子である。c-Mycは発癌遺伝子であり、c-Mycで誘導された腫瘍内で細胞の生存と死の両方を促進する遺伝子である。p16INK4aはがん細胞のcell cycleをcontrolするのに重要な役割を果たす遺伝子である。
　以下に、ヒトの脱落乳歯から歯髄細胞を用いた不死化幹細胞の作製を説明する。
　まず、脱落乳歯を、例えば、クロロヘキシジン、イソジン溶液その他の消毒薬で消毒した後、歯冠部を分割し、歯科用リーマーにて歯髄組織を回収する。
　採取した歯髄組織を、基本培地、例えば、5～15％ウシ血清（以下、「CS」ということがある。）及び50～150ユニット/mLの抗生物質を含有するダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's Medium、以下、「DMEM」という。）に懸濁する。ついで、1～5mg/mLのコラゲナーゼ及び1～5mg/mLのディスパーゼを用いて、37℃で、0.5～2時間処理する。
　上記基本培地としては、DMEMの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、GIBCO社等）、RPMI1640培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、IMDMとHamF12を等量混合した培地（例えば商品名：IMDM/HamF12（GIBCO社）として市販される）を挙げることができる。
　また、基本培地に添加するものとしては、ウシ胎仔血清（以下、「FCS」という。）、ヒト血清、羊血清その他の血清、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、ウシ血清アルブミン（以下、「BSA」ということがある。）、ペニシリン、ストレプトマイシンその他の抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
　上記の基本培地は、後述する細胞選別用の培養、及び選別後の細胞の培養に使用することもできる。
　酵素処理の後、3～10分間の遠心操作（3,000～7,000回転／分）を行い、歯髄細胞を回収する。必要に応じて、セルストレーナーを用いて細胞の選別を行う。選別された細胞を、例えば、3～6mLの上記基本培地で再懸濁し、直径4～8cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種する。
　次いで、培養液、例えば、10％FCSを含有するDMEMを添加した後、5％CO2インキュベータにて、37℃で2週間程度培養する。上記培養液を除去した後、PBS等で細胞を1～数回洗浄する。培養液の除去及び細胞の洗浄に代えて、コロニーを形成した接着性の歯髄幹細胞を回収することもできる。接着性の歯髄幹細胞は、例えば、0.025～0.1％のトリプシンと0.3～1mMのEDTAにて、数分間、37℃で処理してディッシュから剥離させ、次いで細胞を回収する。
　次に、上記のように選別された接着性細胞を培養する。例えば、上記のようにして得た歯髄幹細胞を付着性細胞培養用ディッシュに播種し、5％CO2、37℃の条件でインキュベータにて培養する。
　継代培養は、例えば、肉眼で観察してサブコンフレント又はコンフレントに達したときに、上述のように、トリプシンとEDTAとを用いて細胞を培養容器から剥離させて回収し、再度、培養液を入れた培養容器に播種する。
　ここで、サブコンフレントとは、培養容器中の細胞付着面の約70％に細胞が付着した状態をいう。例えば、継代培養を1～8回行い、選別された細胞を、必要な細胞数、例えば約1ｘ107個/mLまで増殖させる。以上のように培養した後に、細胞を回収して液体窒素中にて保存する。様々なドナーから回収した細胞を歯髄幹細胞バンクの形態で保存することにしてもよい。
　次いで、前記幹細胞を初期培養して得られた初期培養細胞に、４種類の遺伝子を導入して遺伝子導入細胞を作製する。ここへ導入する遺伝子は、hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、及びp16INK4aからなる群から選ばれる4種類であることが好ましい。hTERT、bmi-1、E6、E7を導入することにより、より個体数倍加回数の多い不死化幹細胞を得ることができる。ここで、hTERTは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素の遺伝子であり、bmi-1は幹細胞の自己複製や分化制御に関わっているポリコーム群遺伝子である。E6及びE7は、ヒトパピローマウイルスが自己複製のために使用する初期遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム中に存在する遺伝子である。
　こうした遺伝子の導入は、以下のようにして行うことができる。
　目的とする上記の遺伝子を組み込むためのプラスミドを調製し、これをシャトルベクター、例えば、pSuttle2に組み込んで、上記の遺伝子をクローニングする。このシャトルベクターで大腸菌を形質転換し、カナマイシン耐性形質転換体を選択する。選択したカナマイシン耐性形質転換体のプラスミドDNAを精製し、制限酵素部位を解析して組換え体を同定する。
　次に、制限酵素、例えば、PI-Sce I及びI-Cue Iを使用して発現カセットを上記のシャトルベクターから切り出し、これをアデノウイルスベクター、例えば、Adeno-X viral DNAにライゲーションする。得られたライゲーション産物をSwa Iで切断し、これを用いて大腸菌をトランスフォーメーションする。
　得られた形質転換体の中からアンピシリン耐性形質転換体を選択する。上記の遺伝子が組み込まれた組換えアデノウイルスDNAを精製し、制限酵素部位を解析して組換え体を同定する。
　次いで、Pac Iで組換えアデノウイルスを消化し、これをHEK293細胞にトランスフェクトする。組換えアデノウイルスを増殖させ、これを集めてウイルスの力価を測定する。常法に従ってウイルスを精製し、標的細胞であるSHEDに感染させる。
　ウイルス感染後の細胞群を、常法に従ってFITCで染色し、フローサイトメーターを用いて、STRO-1陽性細胞を検出する。ここで、STRO-1は、骨髄における多分化能を有する間葉系幹細胞のマーカーの１つとして考えられており、細胞の不死化の指標となる。
　以上の手順によって、歯髄由来の不死化幹細胞を得ることができる。
　次に、得られた不死化幹細胞を、上述した基本培地、例えば、10％FBSを加えたDMEMを用いて、5％CO2、37℃の条件下に、24～48時間培養し、培養上清を得る。培養上清の回収には、例えば、コマゴメピペット等を使用することができる。回収した培養上清は、そのまま本発明の医薬組成物の有効成分として使用してもよく、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結乾燥、希釈その他の処理の後に、本発明の医薬組成物の有効成分として使用してもよい。
　また、後述するように、上記のようにして得られた不死化幹細胞の培養上清は、種々の成長因子を含み、高度な精製をしなくとも、種々の作用を示す。すなわち、各種の疾病の治療に使用できる本発明の医薬組成物を、簡易な工程で製造できるため、高度精製に伴う各種成長因子の生理活性の低下を回避することができる。
　なお、本発明で使用する「不死化幹細胞の培養上清」は、不死化幹細胞を培養して得られる、種々の生体因子を含有する培養上清をいい、不死化幹細胞その他の細胞を含まない溶液をいう。血清を含まない培養上清を調製する場合には、初期培養から継代までのすべての過程において無血清培地を使用するか、又は、細胞を回収する前の数回の継代の際に無血清培地を使用するとよい。
　上記の方法で選抜・培養した歯髄幹細胞は、生体から採取した組織や細胞であって、最初に播種された初代培養細胞と同様の性質を有する。一般に、初代培養細胞は、そのソースとなった臓器と類似した性質を有し、正常細胞に近いという点で重要である。しかし、株化細胞に比べて増殖が遅く、また、培養を継続するうちに脱分化を起こす場合もあり、その性質を保ったまま維持することが難しい。
　しかし、本発明の不死化幹細胞は、細胞倍加回数が20回又は40回の時点で、細胞の未分化度のマーカーとなるSTRO-1の発現率が、不死化幹細胞ではない歯髄幹細胞よりも有意に高く、約1.5～3倍という高い割合を示すものであることが好ましい。STRO-1の発現率の高さは、初代培養細胞と同様の性質を示すことの指標となるからである。
　また、本発明の不死化幹細胞は、インスリン様成長因子（IGF-1）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、トランスフォーミング増殖因子－β（TGF-β）、及び肝細胞増殖因子であるHGFからなる群から選ばれる、少なくとも2以上の成長因子を培養上清中に分泌する。ここで、「成長因子」とは、細胞分裂を促進させたり、形態の変化や肥大をもたらしたりするポリペプチドの総称である。成長因子を産生する細胞の種類によって因子は異なり、上皮成長因子(EGF)、繊維芽細胞成長因子(FGF)、神経系神経成長因子、腫瘍増殖因子(TGF)などに大別される。
　さらに、各細胞の細胞膜にある受容体はチロシンキナーゼ活性をもち、成長因子が結合すると、たんぱく質のチロシン残基がリン酸化され、細胞の増殖や分化を引き起こす。成長因子が個体発生において中胚葉誘導物質となっている例がいくつか知られている。また、免疫系を調節するリンホカイン個体発生において中胚葉誘導物質となっている例がいくつか知られている。こうした成長因子は、ELISA法、マイクロアレイ法等で定量することができる。
　上記IGF-1は、インスリンと配列が高度に類似したポリペプチドであり、細胞培養でインスリンと同様に有糸分裂誘発等の反応を引き起こす。神経細胞の成長にも影響することが知られている。また、上記VEGFは、胚の形成期に、血管がないところに新たな血管を形成する脈管形成及び既存の血管から分枝伸長して血管を形成する血管新生に関与する一群の糖タンパクである。上記TGF-βはまた、多くの細胞に対する強力な増殖抑制因子となり、細胞の分化・遊走・接着にも密接に関与し、個体発生や組織再構築、創傷治癒、炎症・免疫、癌の浸潤・転移などの幅広い領域に重要な役割を担っている。さらに、HGFは、肝細胞のみならず様々な細胞に対して、細胞増殖促進、細胞運動促進、抗アポトーシス（細胞死）、形態形成誘導、血管新生その他の組織・臓器の再生と保護を担う多才な生理活性を有している。
　以上のようなタンパクは、上述した各種幹細胞を、例えば、15％FCSを添加したDMEM中で、37℃にて所定の期間、培養することにより、上記の成長因子を含む培養上清中に得ることができる。なお、上記幹細胞の培養上清には、IGF-1、VEGF、TGF-β、及びHGF以外にも、約70種類のタンパクが含まれる。
　得られた培養上清のうち15ｍLを、Amicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(ミリポア社製)に入れ、4,000ｘgで約60分間遠心し、約200μLまで濃縮する。次いで、このチューブに培養上清と同量の滅菌PBSを投入し、再度、4,000ｘgで約60分間遠心し、溶媒をPBSに置換する。得られた200μLの溶液をマイクロテストチューブへ回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。
　上記のAmiconを使用する方法に代えて、エタノール沈殿法で濃縮することもできる。例えば、5mLの培養上清に対して、45mLの100％エタノールを加えて混和し、－20℃で60分間放置する。その後、15,000ｘgで15分間、4℃にて、遠心して、上澄みを除去する。
　次いで、例えば、10mLの90％エタノールを加えてよく攪拌し、再び、15,000ｘgで5分間、４℃にて遠心する。上澄みを除去し、得られたペレットを、例えば、500μLの滅菌水に溶解することができる。溶解後、全量をマイクロテストチューブに回収し、濃縮幹細胞培養上清とする。
　以上のようにして得られた培養上清はそのまま使用してもよく、リン酸緩衝生理食塩水等の生理学的に許容される溶媒を用いて適宜希釈して使用してもよい。また、常法に従って凍結乾燥し、用時調整の医薬組成物とすることもできる。
　この医薬製剤に含まれる培養上清中の成長因子の量は、その全乾燥重量に対して約50～500重量％であることが好ましい。
　この医薬組成物の剤形としては、粉末、液剤、ゲル剤、スプレー剤及び経皮吸収システム等を挙げることができる。例えば、充填剤、賦形剤、pH調整剤等の添加物を加えて、滅菌済みのガラスアンプル、セラムチューブその他の小型の容器に入れ、医薬製剤とすることができる。使用時に、生理食塩水や、滅菌済注射用蒸留水で溶解し、経鼻投与してもよく、また、ガーゼに浸潤させて患部に貼付するようにしてもよい。歯槽骨その他の骨の再形成に使用する場合には、足場材として、コラーゲンやβ-TCP等を使用し、これらを上記溶解液に浸漬させて埋め込んでもよい。
　以上のようにして得られた培養上清を静脈内投与をはじめとする種々の方法で投与することにより、体内マクロファージのサブポピュレーションを制御することができ、それによって、腫瘍を治療することができる。
　以下に実施例を用いて、本願発明をさらに詳細に説明するが、本願発明は下記の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）不死化細胞の調製
（１）ウイルス導入用ベクターの作製
（１－１）プラスミド抽出用試薬等
　カナマイシン（Kan）、アンピシリン（Amp）、LB液体培地及びLB寒天培地、グリコーゲン、アガロース、滅菌水、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム及びRNase Aを使用した。50mg/mLのカナマイシン及びアンピシリンを調製し、ストック溶液として－20℃で保存した。グリコーゲンは20mg/mLに調製した。10mg/mLのRNase Aを調製し－20℃で保存した。10M（飽和）酢酸アンモニウム（NH4OAc）、3Mの酢酸ナトリウム（NaOAc；pH5.2）を調製した。
（１－２）制限酵素等
　大腸菌コンピテントセル（Supercharge EZ10 Electrocompetent Cells、製品コード 636756）、Swa I（製品コード 1111A、Smi Iが同等品）、Xho I（製品コード 1094A）、T4 DNA Ligase（製品コード 2011A）、NucleoBond Xtra Midi（製品コード 740410.10/.50/.100）、NucleoSpin Plasmid（製品コード 740588 10/50/250）は、いずれもタカラバイオ（株）より購入した。Pac IはNew England Biolabsより購入した。
（１－３）バッファー等
　1ｘTE Buffer（1mMのEDTAを含む10mM Tris-HCl [pH8.0]）、100mM Tris-HCl（pH8.0）で飽和したフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1、以下、「PCI混液」という。）を調製した。エタノールは、100％及び70％で使用した。ミニスケールでの組換えで使用するpAdeno-X プラスミドDNAの精製用に、以下のバッファー１～４を調製した。
　バッファー１：10mM EDTA及び50mM グルコースを含む25mM Tris-HCl（pH8.
　　　　　　　　0）（オートクレーブ後、4℃で保存）
　バッファー２：1％SDSを含む0.2M NaOH（使用直前に用時調製、密封し、室
　　　　　　　　温保存）
　バッファー３：5M KOAc（オートクレーブ後、4℃で保存）
　バッファー４：１mM EDTA、20μg/mL RNaseを含む10mM Tris-HCl（pH8.0）
　　　　　　　　（使用直前にRNaseを添加し、－20℃で保存）
（２）アデノウイルス精製及びβ-galアッセイ用試薬
　ヒト5型アデノウイルスで形質転換したヒトHEK293細胞（ATCC #CRL1573）を使用した。HEK293細胞は完全培地で培養した。完全培地の組成は、100 unit/mLのペニシリンGナトリウムと100μg/mLのストレプトマイシン、4mMのL-グルタミン及び10％FBSを添加したDMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium、基本培地）とした。ペニシリンＧナトリウム溶液は10,000units/mL、硫酸ストレプトマイシン溶液は10,000μg/mLで調製し、ストック溶液として保存した。
　培養には、60mmプレート、100mmプレート、6－ウェルプレート、T75及びT175フラスコを使用した。
　トリプシン-EDTA（製品コード CC-5012）はタカラバイオ（株）より購入した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS、Ca2＋とMg2＋不含）及びDulbecco’s リン酸緩衝生理食塩水（DPBS、Ca2＋とMg2＋含有）を調製した。また、0.33％のニュートラルレッド染色液、0.4％トリパンブルー染色液を使用した。
　β-galアッセイには、X-Gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside [25mg/mL]）ジメチルホルムアミド（DMF）溶液は－20℃で遮光保存した。Luminescent β-gal Detection Kit II（製品コード 631712）を使用した。
（３）予備試験
（３－１）lac Zを含む組換えアデノウイルス（pAdeno-X-lac Z）の構築
　10mLの上述した完全培地に、解凍後、DMSOを除去したHEK293細胞を再懸濁し、全量を100mmの培養プレートに移した。HEK293細胞が付着した後に培養液を除去し、細胞を滅菌PBSで1度洗浄し1mLのトリプシン-EDTA溶液を加えて約2分間処理した。
　次に、10mLの完全培地を加えてトリプシンの反応を止め、穏やかに懸濁した。バイアブルカウントを行って、培養液10mLを入れた100mmのプレートに105個の細胞を移し、均一に拡げた。
　pShuttle2-lac Z（Adeno-X Expression System 1に含まれている陽性対照ベクター）とキットに含まれているAdeno-X Viral DNA（PI-Sce I及びI-Ceu I digested）とを使用し、キットに添付されているプロトコルに従って、lac Zを含む組換えアデノウイルスを構築した。標的細胞であるSHEDに感染させ、β-ガラクトシダーゼの発現をアッセイし、ベクターが構築されていることを確認した。
（３－２）組換えpShuttle2プラスミドの構築
　組換えpShuttle2 Vector（以下、「rpShuttle2 Vector」という。）の構築前に、キットに含まれているpShuttle2 Vector及びpShuttle2-lac Z VectorでDH5α大腸菌を形質転換した。50μg/mLのカナマイシンを含有するLB寒天プレート（以下、「LB/Kan」という。）上で形質転換体を選択し、単一コロニーからとった菌体を新しいLB/Kanに画線し、37℃で一晩インキュベートした。
　次いで、hTERT、bmi-1、E6、E7を、pShuttle2へ以下の手順でクローニングした。これらの遺伝子に適した制限酵素でpShuttle2 Vectorを切断した。
　次いで、上記のキットに添付されているpShuttle2 Vector Information Packet（PT3416-5）を参照し、挿入するDNAに合致するマルチクローニングサイトを決定した。制限酵素処理済みの上記プラスミドをアルカリホスファターゼで処理して精製した。
　常法に従って、標的DNA断片を調製し精製した。上記の制限酵素で消化したベクターと上記の遺伝子断片とをライゲーションし、DH5α細胞（コンピテント細胞）を、ライゲーション産物で形質転換した。上記コンピテント細胞の一部をとり、キットに含まれている対照ベクターpShuttle2-lac Z Vectorで形質転換して陽性対照とした。
　形質転換した大腸菌を含む混合液を、LB/Kan寒天プレートに接種し、カナマイシン耐性（Kanr）の形質転換体（コロニー）を選択した。5～10個のKan耐性クローンを選択し、少量の液体培地に接種して増幅した。これらのクローンがrpShuttle2 Vectorを有していることを確認した後に、一晩インキュベートした。その後、市販のシリカ吸着カラムを用いて、常法に従い、構築されたプラスミドDNAを精製した。
　このプラスミドDNAを制限酵素で処理して、1％アガロースゲル電気泳動を行い、目的の組換えプラスミドを同定した。シーケンシングによって、挿入した断片の方向と挿入部位を確認し、ポジティブクローンを同定した。
　組換えpShuttle2プラスミドDNA（以下、「rpShuttle2プラスミドDNA」という。）をターゲット細胞に直接にトランスフェクトし、ウエスタンブロットを行って目的タンパク質の発現を予備的にチェックした。
（３－３）rpShuttle2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化
　上記のようにして作製したrpShuttle2プラスミドDNAから、導入した遺伝子の発現カセットをPI-Sce I及びI-Ceu Iで切り出した。キットに添付されたプロトコルに記載されたin vitroライゲーション法に従って、切り出した発現カセットをAdeno-X Viral DNAに組み込んだ。rpShuttle2プラスミドDNAのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化液を30μL調製し、下記の表１に記載した試薬を1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れて混合した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次いで、十分に混和した後にマイクロ遠心チューブに入れて軽く遠心し、その後、37℃にて3時間インキュベートした。
　1kbラダー（DNA サイズマーカー）と共に上記二重消化後の反応液（5μL）を1％アガロース/EtBrゲルで泳動した。
（３－４）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール抽出
　遠心チューブに、上述した二重消化液の残り（25μL）に、70μLの1ｘTE Buffer（pH8.0）と100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。次いで、微量遠心機を用いて、4℃にて14,000rpmで５分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブ移した。ここに、400μLの95％エタノール、25μLの10M酢酸アンモニウム、及び1μLのグリコーゲン（20mg/mL）を添加し、ボルテックスで十分に撹拌した。
　次いで、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、上清を吸引して除去し、ペレットを得た。このペレットに300μLの70％エタノールを加え、室温にて14,000rpmで2分間遠心した。上清を注意深く吸引して除去し、ペレットを室温にておよそ15分間風乾した。
　ペレットが乾燥した後に、これを10μLの滅菌した1ｘTE Buffer（pH8.0）に溶解し、使用するまで－20℃にて保存した。
（４）組換えAdeno-X プラスミドDNAの構築
（４－１）Adeno-X ウイルスゲノムへの発現カセットのサブクローニング
　下記の表２に示す試薬を、順番通りに1.5mLの滅菌済マイクロ遠心チューブに入れ、穏やかに混和し、軽く遠心した後に、16℃にて一晩インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　各サンプルに、90μLの1ｘTE Buffer（pH8.0）と100μLのPCI混液とを加えて、ボルテックスで穏やかに撹拌した。4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移し、ここに400μLの95％エタノール、25μLの10M酢酸アンモニウム、及び1μLのグリコーゲン（20mg/mL）を加えてボルテックスで穏やかに撹拌した。
　4℃にて5分間、14,000rpmで遠心し、上清を吸引により除去してペレットを得た。以下のエタノール沈殿操作は、上記（３－４）と同様に行った。
　ペレットが乾燥した後に、これを15μLの滅菌脱イオン水に溶解した。
（４－２）組換えAdeno-X プラスミドDNAのSwa I消化
　下記表３に示す消化液を調製し、遠心チューブに入れた各サンプルに加えて、2時間、25℃にて、インキュベートした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　各サンプルに、80μLの1ｘTE Buffer（pH8.0）と100μLのPCI混液とを加え、ボルテックスで穏やかに撹拌した。マイクロ遠心チューブ、4℃にて5分間、14,000rpmで遠心した。以下のエタノール沈殿の操作は、上記（３－４）と同様に行い、ペレットの溶解液は使用まで－20℃にて保存した。
（４－３）組換えAdeno-X プラスミドDNAによる大腸菌の形質転換の確認
　電気的にコンピテントにした大腸菌を、Supercharge EZ10Electrocompetent Cell（製品コード 636756）を使用して、上記（４－２）で得たSwa I消化産物で形質転換した。
　形質転換混合液を、LB培地にアンピシリン（終濃度100μg/mL）を加えた寒天プレート（以下、「LB/Amp寒天プレート」という。）に接種し、37℃で一晩インキュベートして、アンピシリン耐性（Ampr）形質転換体を選択した。約106個のコロニーを得た。得られたコロニーを、製品に付属のAdeno-X System PCR Screening Primer Setでチェックした。5mLの新鮮なLB/Amp液体培地に単一のコロニーからの菌体を接種し、一晩培養した。翌日、後述するミニスケール法に従って、Adeno-X プラスミドDNAを精製した。
（４－４）組換えAdeno-X プラスミドDNAのミニスケール調製
　対数増殖にある培養液5mLを、14,000rpmで30秒間遠心し、上清を除去した。ペレットを再度10,000rpmで１分間遠心し、マイクロピペットを用いて、上清を除去した。
　ここに、150μLの上記バッファー１を加えて穏やかにピペッティングし、再懸濁した。この細胞懸濁液に、150μLのバッファー２を添加し、穏やかに転倒混和し、氷上に5分間放置した。冷却した細胞懸濁液に、150μLのバッファー３を加えて、再度転倒混和し、氷上に5分間放置した。
　この細胞懸濁液を、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、透明な上清を清浄な1.5mLの遠心チューブに移した。この上清に、450μLのPCI混液を添加し、転倒混和して撹拌した。その後、4℃にて14,000rpmで5分間遠心し、水層を清浄な1.5mLのマイクロ遠心チューブに移した。
　以下のエタノール沈殿の操作は、上記（３－４）と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで－20℃にて保存した。目的のrDNAは、後述する制限酵素による解析及びPCRにより同定した。
（５）得られたrAdeno-X プラスミドDNAの制限酵素部位解析
　PI-Sce I及びI-Ceu Iを用いて解析を行った。下記の表４に示す試薬を、1.5mLの滅菌済みマイクロ遠心チューブに入れ、30μLのPI-Sce I/I-Ceu I二重消化反応液を加えて、十分に撹拌し、軽く回転させて内容物を集めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　37℃にて３時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。この処理後の反応液を1％アガロース/EtBrゲルで泳動し、培養液を得た。
（６）組換えアデノウイルスの産生
（６－１）HEK293細胞トランスフェクト用rAdeno-X プラスミドDNAの調製
　下記表５に示す試薬等を、1.5mLの滅菌済み遠心チューブに入れて混合し、微量遠心機で軽く遠心した。その後、37℃にて2時間、インキュベートし、rAdeno-X プラスミドDNAのPac I制限酵素処理を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　60μLの1ｘTE Buffer（pH8.0）と、100μLのPCI混液とを添加し、ボルテックスで穏やかに撹拌し、微量遠心機で、4℃にて5分間、14,000rpmで遠心した。水層を、清浄な1.5mLの滅菌済み遠心チューブに注意深く移した。
　以下のエタノール沈殿の操作は、上記（３－４）と同様に操作を行い、ペレットの溶解液は、使用まで－20℃にて保存した。
（６－２）Pac I消化Adeno-X プラスミドDNAのHEK293細胞へのトランスフェクション
　上記プラスミドDNAのトランスフェクションの24時間前に、60mmの培養プレートあたりの細胞数が1～2ｘ106（およそ100 cells/mm2）になるよう、HEK293細胞を接種し、37℃、5％CO2存在下でインキュベートした。
　各培養プレートに、Pac I消化した10μLのAdeno-X プラスミドDNAをトランスフェクトし、標準的なトランスフェクション法（CalPhos Mammalian Transfection Kit 製品コード 631312）に従って、HEK293細胞にAdeno-X DNAを導入した。トランスフェクションの翌日から、CPE（細胞変性効果）が起きているかどうかを確認した。
　1週間後に、培養プレートの底面や側面に付着している細胞を穏やかに撹拌して遊離させた。得られた細胞懸濁液を15mLの滅菌済みの円錐遠心チューブに移し、室温にて5分間、1,500ｘgで遠心した。
　得られた沈殿を、500μLの滅菌PBSに懸濁した。ドライアイス/ エタノール中で凍結させ、37℃の恒温槽で融解させるという凍結融解操作を3回繰り返して、細胞を十分に融解させたライセートを得た。次いで、軽く遠心して浮遊物を除き、上清を滅菌した別のチューブに移して、直ちに使用した。直ちに使用しない分は、－20℃で保存した。
　60mmプレートの培養細胞に250μLの上記ライセートを加えて、培養を続けた。なお、Adeno-X Rapid Titer Kit（製品コード 631028）に含まれる抗Hexon 抗体を用いて、このキットの取扱説明書（PT3651-1）に従い、アデノウイルスの力価を測定した。
（６－３）高力価ウイルス調製のためのウイルスの増幅
　この力価測定を始める約24時間前に、HEK293細胞をT75フラスコに接種し、37℃、5％CO2存在下で一夜培養し、50～70％コンフルエントになっていることを確認した。翌日、ウイルスを含む新しい培地と交換し、MOI＝10で感染させた。37℃、５％CO2存在下で90分間培養した後にフラスコを取り出し、10mLの培地を加えた。
　37℃、5％CO2存在下で3～4日間培養し、CPEを確認した。50％の細胞が剥がれたところで、上記と同様にして遊離細胞懸濁液とし、15mLの滅菌済円錐遠心チューブに移した。上記と同様の凍結融解操作を行い、細胞を融解させた。Adeno-X Rapid Titer Kit（製品コード 631028）を使用し、107PFU/mLの力価を得た。
　ウェスタンブロッティングを行い、パッケージングされたアデノウイルスゲノムが、目的遺伝子に特異的な転写単位のコピーを、機能する形で持っているかを確認した。
（７）標的細胞へのアデノウイルス感染
（７－１）標的細胞への感染
　感染の24時間前に6－ウェルプレートに1x106個のSHEDを接種した。接種の翌日に培地を取り除き、ウイルスを含む1.0mLの培地を各プレートの中心に添加した。この溶液をSHEDが形成した単層全体に均一に広げた。
　37℃、5％ CO2存在下で４時間培養し、ウイルスをSHEDに感染させた。次いで、新鮮な培地を添加し、さらに、37℃、5％CO2存在下で培養した。感染24時間後～48時間後にかけて導入遺伝子の発現を経時的に解析した。
（７－２）感染細胞のβ-ガラクトシダーゼ発現の解析
　Adeno-X-lac Zを感染させた接着性細胞におけるβ-ガラクトシダーゼの発現は、Luminescent β-galDetection Kit II（製品コード 631712、クロンテック社）を使用してアッセイした。
（実施例２）SHEDの作製
（１）乳歯幹細胞の分離
　10歳の健常男児から得られた脱落乳歯を使用した。この脱落乳歯をイソジン溶液で消毒した後、歯科用ダイヤモンドポイントを用いて、歯冠を水平方向に切断し、歯科用リーマーを用いて歯髄組織を回収した。得られた歯髄組織を、3mg/mLのＩ型コラゲナーゼ及び4mg/mLのディスパーゼの溶液中で37℃にて1時間消化した。ついで、この溶液を70mmの細胞ストレーナ（Falcon社製）を用いて濾過した。
　濾別した細胞を、4mLの上記培地に再懸濁し、直径６cmの付着性細胞培養用ディッシュに播種した。10％FCSを含有するDMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）をこのディッシュに添加し、5％CO2、37℃に調整したインキュベータ（卓上型パーソナルユース細胞培養装置　9000EXシリーズ、ワケンビーテック（株））中にて、２週間程度培養した。コロニーを形成した接着性細胞（歯髄幹細胞）を、0.05％トリプシン/EDTAにて５分間、37℃で処理し、ディッシュから剥離した細胞を回収した。
　次に、上記のようにして選抜した接着性細胞を、付着性細胞培養用ディッシュ（コラーゲンコートディッシュ）に播種し、5％CO2、37℃に調整したインキュベータにて、一次培養し初代培養細胞とした。肉眼観察でサブコンフルエント（培養容器の表面の約70％を細胞が占める状態）又はコンフルエントになったときに、0.05％トリプシン/EDTAにて5分間、37℃で処理して細胞を培養容器から剥離して回収した。
　こうして得られた細胞を、再度、上記の培地を入れたディッシュに播種し、継代培養を数回行って、約1ｘ107個/mLまで増殖させた。得られた細胞を、液体窒素中で保存した。
　その後、一次培養細胞を上記の培地を用いて約1ｘ104細胞/cm2濃度で継代培養した。1～3回継代した細胞を実験に用いた。ヒトBMMSC（骨髄間葉系幹細胞、Bone Marrow Mesenchymal stem cells）はロンザ社から購入し、メーカーの取扱説明書に従って培養した。
　以上のようにして、ヒト脱落乳歯歯髄幹細胞（SHED）を得た。得られたSHEDを、FACSTARPLUS (ベクトン・ディキンソン社製)を用いて、各試料について、約1x106個のSTRO-1陽性細胞を以下のようにしてソートした。
　ブロモデオキシウリジンBrdU染色キットのメーカー（Invitrogen社製）の取扱説明書に従いBrdUを12時間取り込ませ、SHEDの増殖速度を評価した（各群についてｎ＝3）。実験は5回繰り返した。1元配置分散分析後に、Tukey-Kramer検定を行い、統計的有意差を評価した。
　STRO-1を免疫蛍光で検出するために、SHEDを3％パラホルムアルデヒドで固定し、その後PBSで2回リンスし、100mMのグリシンで20分間処理した。次いで、これらの細胞を0.2％のTriton-X（Sigma-Aldrich社）で30分間透過処理し、その後、5％のロバ血清及び0.5％のウシ血清アルブミンの混合物中で20分間インキュベートした。
　次に、細胞を一次抗体のマウス抗ヒトSTRO-1抗体（1:100、R&D社製）と一緒に1時間インキュベートし、二次抗体のヤギ抗マウス免疫グロブリンM-FITC抗体（1:500、Southern Biotech社製）と一緒に30分間インキュベートし、ベクタシールドDAPI（Vector Laboratories Inc）を用いてマウントした。
　その後、15％FBSを添加したα-MEMを6－ウェルプレートに入れ、ソートした細胞をクローン作製用に播種した。増殖した細胞の中から約300コロニーを試験用にプールした。
（２）遺伝子の導入
　上述したように、bmi-1, E6, E7及びhTERTの4つの遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込み、これらの遺伝子産物を発現するウイルスベクターを作製した。対照として、これらの遺伝子を組み込んでいない対照ベクターを作製した。
　SHEDを100mmφのコラーゲンコートディッシュに1ｘ106個を播種し、10％FBSを添加したDMEMを加えてサブコンフレントまで培養した。この培地を吸引除去して上記培地で希釈したウイルス溶液500μLを加え（MOI=10）、37℃にて、5％CO2インキュベータ中で１時間培養し、上記ウイルスベクターを感染させた。感染48時間後、感染細胞をピューロマイシン（1pg/mL）を加えた上記の培地中で10日間培養して選択し、500～600個の耐性クローンをプールした。3～4日ごとに約0.5ｘ105個のSHEDを100mmφの培養シャーレに播種し、継代した。遺伝子が導入されたSHEDをSHED-T、遺伝子が導入されないSHEDをSHED-Cとした。
（実施例３）SHEDの特性の検討
（１）SHED-C及びSHED-Tの成長速度の測定
　SHED-T（遺伝子導入をしたSHED）の個体数の倍加状態を、図１に示した。図中、縦軸は個体数倍加回数（細胞分裂回数、回）、横軸は時間（培養日数）である。また、培養中のSHEDが１ヶ月間分裂しない状態を、細胞の老化の判断基準とした。
　SHED-Cは30回程で増殖が停止し、老化又は増殖停止段階に入った。これに対し、SHED-Tは250PDを超え、800日経過後も増殖した。
（２）フローサイトメトリー分析
　単一細胞を含む懸濁液を得るため、接着性の単層細胞をトリプシン/EDTAで消化した。2ｘ105個の細胞に抗STRO-1モノクローナル抗体（1:100）を加えて放置し、FACSCaliburフローサイトメーター（Becton Dickinson社）を使用して分析した。対応するアイソタイプが同一の対照抗体と比較し、99％以上の割合で蛍光レベルが高い場合に発現が陽性とした。SHED-T及びSHED-Cともに、初期及び後期の継代細胞を固定し、FITC結合STRO-1抗体で染色した。その後、フローサイトメトリーで分析した。試験はそれぞれ２回行なった。SHED-CではSTRO-1陽性細胞の割合がPD20で27％であり、PD30では15％まで減少した（図２(A)及び(B)）。SHED-TではSTRO-1陽性細胞の割合が、それぞれPD20で46％、PD40で41％であった（図２(C)及び(D)）。
（３）分化能の検討
　PD０、PD10及びPD20におけるSHED-C及びSHED-Tの分化能を、新生骨量の形成能及び組織染色で調べた。まず、2.0ｘ106個のSHED-C又はSHED-Tを、40mgのヒドロキシアパタイト／三カルシウムリン酸（HA/TCP）セラミック粉末(オリンパス工業（株）)に混合し、10週齢の免疫無防備状態マウス(NIH-bgnu-xid, 雌、Harlan Sprague Dawley社)の背側表面の皮下に移植した。
　移植8週間後に移植物を回収し、4％ホルマリンで固定して脱灰した後、パラフィン包埋するために10％EDTAを含むPBS溶液でバッファリングした。一部は、プラスチック包埋するために70％エタノール溶液中に保存した。
　パラフィン切片を脱パラフィン化し、これを水和した後、ヘマトキシリン及びエオシン（以下、「H&E」という。）で染色した。図３(A)～(C)は、SHED-T（不死化幹細胞）のPD０～PD20を示し、同(D)～(F)はSHED-C（正常細胞）のPD０～PD20を示す。生体内での新しい骨の形成を定量するため、特定の領域を選び、SHED-T移植後に形成された移植物又はSHED-C移植後に形成された移植物それぞれについて、新生骨面積と視野面積とを算出し、これらの数値から新生骨量を求めた。
　　　新生骨量＝新生骨面積／視野面積ｘ100
　図４に各個体数倍加回数（倍加時間）における、SHED-TとSHED-Cとの新生骨量の変化を示した。図中、**はｐ＜0.05、***はｐ＜0.01を表す。なお、新生骨量は、以下の算出式で求めた。
　図４に示されるように、SHED-Cでは個体数倍加回数が増えるについて新生骨量が減少し、PD20ではPD0の約1/5まで低下した。これに対し、SHED-Tでは、PD20まで新生骨量はほとんど変動がなく、PD20では、SHED-TはSHED-Cの５倍以上の骨を形成したことが示された。
（４）癌化活性の評価
　SHED-C及びSHED-T細胞を、免疫無防備状態マウスの皮下組織に1ｘ106個移植した。移植後、30日以上観察を行ったが、この期間中、上記の細胞を移植したいずれのマウスにおいても、腫瘍は形成されなかった。また、SHED-T細胞では、40～200PDの培養細胞のすべてのクローンの形態に変化はなかった。
　以上より、SHED-Tには、癌化活性はないことが示された。
（５）評価
　SEHD-Tは、260PDを超えても分化能力を保ったまま増殖する能力を有していることが示されたが、SHED-Cは、分化能力を有するものの30PD以下で老化した。
　以上から、SHED-Tは不死化幹細胞となっており、活性の高いSHED培養上清の大量生産に適することが示された。
（実施例４）コンディション培地の調製
　実施例１で調製した不死化SHEDを、酸素濃度を20％、10％、5％、1％とした下記の条件で48時間、無血清培地で培養し、その上清を回収した。
　下記表６に示すサイトカインの産生量を、ELISAキット（R & Dシステムズ社製、Human IGF-1 Quantikine Elisa kit (カタログ番号：DG100)、Human TGF-β Quantikine Elisa kit (カタログ番号：DB100B)、Human VEGF Quantikine Elisa kit (カタログ番号：DVE00)）を用いて測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示すように、低酸素濃度で培養した方が、IGF-1, VEGF, TGF-β1, SDF-1の産生量は有意に高くなっており、低酸素濃度下での培養が、少なくとも上記4種類のサイトカインの産生量を有意に増加させることが示された。
（実施例５）担癌動物を用いた治療効果の検討
　マウス扁平上皮癌株SCCVII（近畿大学医学部、西村氏より提供を受けた）を、10％FBS（ギブコ社製）を含むDMEM中で、37℃で1週間培養し、0.5％トリプシンを含むPBSバッファーを用いて、細胞をバラバラにした。トリパンブルーで染色して生細胞数を計数し、1ｘ106個/mLの懸濁液を1mLのPBSバッファーを用いて調製した。
　50匹のマウス（C3H/He、7週齢、中部科学資材（株）より購入）の背部皮下に、上記のようにして調製した細胞懸濁液0.5mLを18Gの注射針（テルモ社製造）を用いて注入した（5x105個／マウス）。1群10匹とした。
　対照群（バッファーのみ）、グループI～グループIV（以下、「GI～GIV」ということがある。）の培養上清を、各群のマウスに1mLずつ、尾静脈から投与した。
　癌細胞を注入した後に、各群のマウスをそれぞれ上記と同じ時条件飼育した。
　各群のマウスをケージに入れ、12時間明暗条件の下、25±0.5℃、湿度50％の条件で飼育した。水と飼料は自由に摂取させた。腫瘍の直径を、毎日、ノギスで測定した。
　マウスに注入したSCCVIIが形成した腫瘍の直径が6mmを越えた時点で、酸素濃度を変えて培養したGI～GVIの培養上清を、マウスの尾静脈より1mLずつ、1回注入した。各群の腫瘍径の増加を、図５に示す。
　GIでは、投与開始３日目で腫瘍の直径が10mmを越え、14日目で20mmを越えた。投与開始21日目には、25mmを越えた。GII及びGIIIは、GIよりは腫瘍直径の増加速度が有意に遅く（*は、p＜0.05）、投与開始７日目で10mmを越え、19日目で20mmを越えた。
　これに対し、GIVでは腫瘍直径の増加が有意に遅く（**は、p＜0.01）投与開始21日目でも平均は10mmを越えなかった。ただし、14日目以降は、腫瘍が退縮するケースも見られたため、標準偏差が大きくなった。図６に、腫瘍の直径が最大になったときの状態(A)及び完治した状態(B)のマウスの写真を示す。
　図７に各群のマウスの生存率の推移を示す。腫瘍直径の増加速度の差は、マウスの生存率に反映されており、GIでは41日目で全てのマウスが死亡した。また、GII及びGIIIでは、50日で全てのマウスが死亡した。これに対し、GIVでは、60日を越えても約80％のマウスが生存しており、全てのマウスが死亡したのは78日目であった。生存期間はGIの約2倍となっていた。
（実施例６）腫瘍及びその周辺組織の変化についての検討
　癌組織に対するマクロファージの挙動を、in vivoイメージングで測定した。5mLのチオグリコレート溶液（2％のBrewer's チオグリコレート培地(Difco社)）をマウスの腹腔内に注入し、4日後に、PBSを用いて腹腔洗浄を行い、107個のマクロファージを得た。得られたマクロファージのうち、3ｘ106個を、3.5μg/mLの色素（MolecularTracer DiR（住商ファーマインターナショナル（株）））及び0.5%のエタノールと混合してラベルした。
　実施例２で調製した培養上清を、1mL/マウスで尾静脈から各群のマウスに注入した。この培養上清中のサイトカインの量を上述したHuman IGF-1 Quantikine Elisa kit、Human TGF-β Quantikine Elisa kit、Human VEGF Quantikine Elisa kitを用いて測定した。ラベルしたマクロファージの挙動は、Xenogen IVIS 200 series system (Xenogen, Alameda, CA)を用いて観察した。イメージングは、推奨されているIVISフィルターセット（励起710nm／蛍光760nm）を使用し、励起波長748nm、蛍光波長780nmで行った。
　GIVでは、ラベルしたマクロファージは１時間以内に移動を始め、24時間後には、腫瘍全体を取り囲むように集積した（図８）。図中、腫瘍下形成された右後肢の付け根部分に、マクロファージの浸潤像が見られた。これに対し、GI～GIIIではこのようなマクロファージの腫瘍周辺への集積は見られなかった。
（実施例７）組織学的検討
　CH3/Heマウスに、5ｘ105個のSCCVIIを注入し、1週間後、15週間後に周辺組織を含めて腫瘍を切除し、組織学的に検索した。15週で、治療群（GIV）において、腫瘍壊死を認めた例があった（図６）。
　また、マクロファージマーカーはCD11b抗体（BioLegend社）、また、M2マクロファージマーカーはCD206抗体（Abcam社）、M1マクロファージマーカーはED1（CD68）抗体（Millipore社）をそれぞれ用いて染色し、マクロファージのサブポピュレーションであるM1及びM2の比を検討した。結果を図９に示す。
　図９に示すように、腫瘍発生初期（細胞注入後1週目）ではM2の割合が多かった（M1優位）のに対し、後期（細胞注入15週）では、M1とM2との割合が逆転（M1優位）していた。ウェスタンブロッティング法で腫瘍組織を調べたところ、M2にはTGF-βスーパーファミリーが多く発現しているのに対し、M1にはTGF-βインヒビター(Trabedersen, LAP 12009)などが発現していることがわかった。　
　図10に、対照群と治療群とにおける、マウスの腫瘍組織のエオシン－ヘマトキシリン染色による染色像を示す。拡大率が低い対照群(A)と治療群(B)の染色像を対比すると、治療群の染色像で腫瘍組織に若干の死滅している部分があることがわかる。拡大率を上げると、その相違が明確に観察された（図10(C)及び(D)）。
　以上より、上記の歯髄幹細胞は低酸素条件に応答して、腫瘍増殖に関与する特定のサイトカインを増加、活性化させることが示された。そして、その結果、マクロファージの遊走能を高め、腫瘍組織へ高度に集積させることが示された。
　さらに、腫瘍に集積したマクロファージは、その本来の貪食能で腫瘍組織を破壊すると同時に、TGF－βを介した腫瘍の増殖制御を行ったものと考えられた。
　本発明は、医薬の分野において有用である。

Claims (9)

  1. 哺乳類の歯髄から得た乳歯歯髄幹細胞に4種類の遺伝子を導入して不死化幹細胞とする幹細胞作製工程と；
    　前記不死化幹細胞を、無血清培地中で所定の時間、酸素濃度が0.5％以上20％未満の低酸素濃度下で23～27℃で培養し、コンディション培地を調製する、コンディション培地調製工程と；を備える方法によって調製され、
    　酸素濃度を20％とした以外は同じ条件の下で培養した場合に調製されるコンディション培地に比べて、1.5倍以上のインスリン様成長因子（IGF-1）及び1.5倍以上の血管内皮細胞増殖因子（VEGF）を含む、癌治療用医薬組成物。
  2. 前記所定の時間が40～56時間である、請求項１に記載の癌治療用医薬組成物。
  3. 前記低酸素濃度は、酸素濃度5％以下である、請求項１又は２に記載の癌治療用医薬組成物。
  4. 前記低酸素濃度は、酸素濃度1％以下である、請求項３に記載の癌治療用医薬組成物。
  5. 前記4種類の遺伝子が、hTERT、bmi-1、E6、E7、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、及びp16INK4aからなる群から選ばれるものである、請求項４に記載の癌治療用医薬組成物。
  6. 請求項１に記載の癌治療用医薬組成物は、酸素濃度を20％とした以外は同じ条件の下で培養した場合に比べて、5倍以上のトランスフォーミング因子β（TGF-β1）をさらに含む、癌治療用医薬組成物。
  7. 3倍以上のストロマ細胞由来因子（SDF-1）をさらに含む、請求項５又は６に記載の癌治療用医薬組成物。
  8. 請求項１，５又は６に記載の癌治療用医薬組成物を有効成分として含有する、癌治療用医薬製剤。
  9. 前記癌は、固形腫瘍である、請求項８に記載の癌治療用医薬製剤。
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