WO2015034012A1 - 新規ドーパミン産生神経前駆細胞の誘導方法 - Google Patents

新規ドーパミン産生神経前駆細胞の誘導方法 Download PDF

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大輔 土井
文平 佐俣
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    • C12N2533/50—Proteins
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing dopaminergic neural progenitor cells.
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease caused by the loss of midbrain substantia nigra dopamine-producing neurons, and there are currently about 4 million affected individuals worldwide.
  • drug treatment with L-DOPA or a dopamine agonist, coagulation by stereotaxic surgery or deep electrical stimulation treatment, and fetal midbrain transplantation are performed.
  • Fetal mesencephalic transplantation has ethical problems with the source tissue and also has a high risk of infection. Then, the treatment method using the nerve cell which induced differentiation from pluripotent stem cells, such as an embryonic stem cell (ES cell) and an induced pluripotent stem cell (iPS cell), is proposed (nonpatent literature 1). However, the possibility of forming benign tumors when transplanted with differentiation-induced neurons and dyskinesias that are thought to be caused by cells other than the desired dopamine-producing neurons have been pointed out, and are safe to take. There is a need to select and transplant cells.
  • ES cell embryonic stem cell
  • iPS cell induced pluripotent stem cell
  • Patent Documents 1 to 4 have been proposed to select cells suitable for transplantation using genes that serve as markers for dopaminergic neurons or dopaminergic neural progenitor cells.
  • Patent Documents 1 to 4 there is room for improvement in marker selection. there were.
  • these documents do not discuss whether it is appropriate to administer cells immediately after selection, or whether to administer cells derived from this intermediate cell.
  • An object of the present invention is to produce dopaminergic neural progenitor cells suitable as a therapeutic agent for Parkinson's disease. Therefore, the subject of this invention is providing the kit required for the manufacturing process or manufacture of a dopamine production neural progenitor cell.
  • the present inventors focused on the cell surface membrane protein Corin and / or Lrtm1, which is considered to be a marker gene of dopaminergic neural progenitor cells, and extracted cells using this as an index, Furthermore, it was found that dopaminergic cells were engrafted even after transplantation by transplanting after continuing the culture, and it was confirmed that dopaminergic neural progenitor cells as a treatment for Parkinson's disease can be obtained by this production process. It came to be completed.
  • a method for producing dopaminergic neural progenitor cells from pluripotent stem cells comprising the following steps: (I) A step of adhesion-culturing pluripotent stem cells on an extracellular matrix in a culture solution containing a reagent selected from the group consisting of a BMP inhibitor, TGF ⁇ inhibitor, SHH signal stimulator, FGF8 and GSK3 ⁇ inhibitor , (Ii) collecting Corin and / or Lrtm1 positive cells from the cells obtained in the step (i), (Iii) A step of suspension culture of the cells obtained in the step (ii) in a culture solution containing a neurotrophic factor.
  • step (i) includes the following steps; (A) a step of adherent culture of pluripotent stem cells on an extracellular matrix in a culture solution containing a BMP inhibitor and a TGF ⁇ inhibitor; (B) a step of adhesion-culturing the cells obtained in the step (a) on an extracellular substrate in a culture solution containing a BMP inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, a SHH signal stimulator and FGF8; (C) Adherent culture of the cells obtained in the step (b) on an extracellular matrix in a culture solution containing a BMP inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, an SHH signal stimulator, FGF8 and a GSK3 ⁇ inhibitor; (D) A step of adherent culture of pluripotent stem cells on an extracellular matrix in a culture solution containing a BMP inhibitor and a TGF ⁇ inhibitor; (B) a step of adhesion-culturing the cells obtained in the step (a) on an extracellular substrate in a culture solution containing a BMP
  • step (i) is performed for 12 to 14 days.
  • step (iii) is performed for at least 7 days.
  • step (iii) is performed for 14 to 30 days.
  • step (iii) is performed for 14 to 16 days.
  • a kit for preparing dopaminergic neural progenitor cells from pluripotent stem cells comprising a BMP inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, an SHH signal stimulator, FGF8, a GSK3 ⁇ inhibitor, an extracellular matrix and a neurotrophic factor.
  • the kit according to [22] further comprising an anti-Corin antibody and / or an anti-Lrtm1 antibody.
  • the kit according to [22] or [23], wherein the extracellular matrix is laminin 511E8.
  • the BMP inhibitor is LDN193189.
  • the TGF ⁇ inhibitor is A83-01.
  • a dopaminergic neural progenitor cell having a high engraftment rate suitable for transplantation that is useful as a therapeutic agent for Parkinson's disease and the like can be obtained efficiently.
  • FIG. 1 shows an example of a protocol for producing dopaminergic cells.
  • “Y” represents Y-27632 and “AA” represents Ascorbic acid.
  • FIG. 2 shows the content of Tra-1-60 positive cells on the 12th day when differentiation is induced using MG (Matrigel), CS (CELLStart), LM111 (Laminin111E8) or LM511 (Laminin511E8) as a coating agent, It is a graph which shows the content rate of a PSA-NCAM positive cell, and the content rate of a Corin positive cell.
  • FIG. 3 shows phase contrast images of human iPS cells (836B3) and cells in the differentiation induction process (photographs).
  • FIG. 4 shows changes in the content of positive cells in Corin ( ⁇ ), PSA-NCAM ( ⁇ ), and Tra-1-60 ( ⁇ ) in the differentiation induction step. After day12, the results are shown under the condition where sorting is not performed.
  • FIG. 5 shows changes in the expression levels of undifferentiated markers and differentiated markers. The value is a relative value when the value of day0 is 1. The values of Sox1, hGSC, Sox17, Brachyury, Nanog and Oct4 are shown on day 12 in FIG. 5A.
  • FIG. 5B shows an immunostained image of cells on day 42 cultured on a poly-L-Ornithine® / Laminin / Fibronectin coat (photograph).
  • FIG. 7 shows the results of gene expression analysis of cells that are Corin-positive, Corin-negative, or unsorted when sorted using an anti-Corin antibody on day 12 (day 12).
  • FIG. 7A shows the expression levels of Lmx1a, En1, Foxa2, Otx2, Gbx2, and Six3 in each cell. The expression level is shown as a relative value when unsorted is 1.
  • FIG. 6 shows an immunostained image of cells on day 42 cultured on a poly-L-Ornithine® / Laminin / Fibronectin coat (photograph).
  • FIG. 7 shows the results of gene expression analysis of cells that are Corin-positive, Corin-negative, or unsorted when sorted using an anti-Corin antibody on day 12 (day 12).
  • FIG. 7A shows the expression levels of Lmx1a,
  • FIG. 7B shows an analysis result of expression comparison of unsorted cells and Corin positive cells (Corin +) on day12 using a microarray.
  • FIG. 8 shows the results of gene expression analysis of Corin positive cells (Corin +), Corin negative cells (Corin-) or cells not sorted (Unsorted) sorted using an anti-Corin antibody on day 12.
  • FIG. 8A shows triple-stained images of Foxa2 / Lmx1a (upper) and Otx2 / Lmx1a / DAPI (lower) in each cell (photograph).
  • FIG. 8B shows the content of Foxa2 positive and Lmx1a positive cells in each cell.
  • FIG. 8C shows the cell content of Otx2 positive and Lmx1a negative in each cell.
  • FIG. 8D shows the expression levels of Oct4 and Nanog in each cell and cells before differentiation induction.
  • FIG. 9 shows the results of gene expression analysis of Corin positive cells (Corin +) or Corin negative cells (Corin ⁇ ) sorted using an anti-Corin antibody on day 21 or cells not sorted (Unsorted).
  • FIG. 9A shows the expression levels of Lmx1a, En1, Foxa2, Otx2, Gbx2, and Six3 in each cell. The expression level is shown as a relative value when unsorted is 1.
  • FIG. 9B shows double-stained images of Corin / Lmx1a (upper figure) and Foxa2 / Lmx1a (lower figure) in each cell (photograph).
  • FIG. 9 shows double-stained images of Corin / Lmx1a (upper figure) and Foxa2 / Lmx1a (lower figure) in each cell (photograph).
  • FIG. 10 shows the analysis results of the size of the cell sphere on differentiation induction day 28 (day 28) and day 42 (day 42).
  • FIG. 10A shows a phase contrast image of each cell mass (photograph).
  • FIG. 10B shows a graph of the diameter value of each cell mass.
  • FIG. 11 shows the results of gene expression analysis on differentiation induction day 28 (day 28) and day 42 (day 42).
  • FIG. 11A shows immunostaining images for Foxa2 / DAPI and Nurr1 / TH (tyrosine hydroxylase) (photograph).
  • FIG. 10 shows the analysis results of the size of the cell sphere on differentiation induction day 28 (day 28) and day 42 (day 42).
  • FIG. 10A shows a phase contrast image of each cell mass (photograph).
  • FIG. 10B shows a graph of the diameter value of each cell mass.
  • FIG. 11 shows the results of gene expression analysis on differentiation induction day 28 (day 28) and day 42 (day 42).
  • FIG. 11A shows immunostain
  • FIG. 11B shows the content of Nurr1-positive cells, Foxa2-positive cells, and TH-positive cells on day 28 (left) and day 42 (right).
  • FIG. 11C shows the amount of dopamine (DA), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) and serotonin (5-HT) released from 1 ⁇ 10 6 cells on day 42 in Corin + and Unsorted.
  • FIG. 12 shows that cells obtained by culturing Corin positive cells collected by sorting (day 12) (Corin +) or cells not induced by sorting (Unsorted) were differentiated into rats (6-hydroxydopamine on the 28th day of induction of differentiation). (6-OHDA) administration) shows the state of the graft 16 weeks after transplantation in the brain.
  • FIG. 12A shows immunostained images of GFAP, Ki67 and human nuclei of the graft (photograph). An enlarged image in the frame in the figure is separately shown.
  • FIGS. 12B, C and D show graphs plotting the size of the grafts when cells of day 28, day 42 and day 19 were transplanted, respectively.
  • FIG. 12E shows the content of Ki67 positive cells in the graft when day28 cells were transplanted.
  • FIG. 13 shows cells obtained by culturing Corin-positive cells collected by sorting (day 12) (Corin +), cells that were induced without sorting (Unsorted), or negative controls (Medium) on differentiation induction day 28 ( The results of transplantation into the brain of rats (6-OHDA administration) on day 28) and day 42 (day 42) are shown.
  • FIG. 13A shows the number of turning behaviors per unit time at each time after transplantation when cells on day28 were administered.
  • FIG. 13B shows a graph plotting the number of TH positive cells per graft when day28 cells were administered.
  • FIG. 13C shows stained images of brain TH (red) and human nucleus (green) when day28 cells were administered (photograph).
  • FIG. 13D shows the number of turning actions per unit time in each period after transplantation when cells on day 42 were administered.
  • FIG. 13E shows a graph plotting the number of TH positive cells per graft when day 42 cells were administered.
  • FIG. 13F shows stained images of brain TH (red) and human nucleus (green) when day 42 cells were administered (photograph).
  • FIG. 14 shows the results of analysis of the graft when day28 cells were transplanted.
  • FIG. 14A shows a graph plotting the number of TH positive cells per neuron (NeuN +).
  • FIG. 14B shows a graph in which the number of TH positive cells per donor cell (human nuc +) is plotted.
  • FIG. 14C shows double-stained images of Foxa2 / TH, Pitx3 / TH, Nurr1 / TH and Girk2 / TH of the graft (photograph).
  • FIG. 15 shows that cells obtained by culturing Corin-positive cells collected by sorting (day 12) (Corin +) or cells that were induced without sorting (Unsorted) were differentiated on day 28 of differentiation induction (6-OHDA administration).
  • FIG. 15A shows a double-stained image of serotonin (green) / TH (red) in a 16-week graft in each cell (photograph).
  • FIG. 15B shows the content of serotonin positive cells per viable cell (NeuN positive cell) at 16 weeks in each cell. The results of gene expression analysis of day28 cells, day42 cells and fetal ventral midbrain cells are shown.
  • FIG. 16A shows the results of comparing the expression of cells sorted with Corin positive cells (d28 Corin +) and unsorted cells (d28 Unsorted) on day 12 using microarray (left figure), and induction sorted with Corin positive cells.
  • FIG. 16B shows the measurement of CORIN, LMX1A, FOXA2, NURR1, TH and TPH2 using PCR on day28 cells (d28 Corin +), day42 cells (d42 Corin +) and fetal ventral midbrain cells (VM). Results are shown. It shows by the numerical value which compared the value of the fetal ventral midbrain cell (VM) as 1. Fig.
  • FIG. 17 shows a stained image of cells obtained by culturing Lrtm1-positive cells collected by sorting (day 14).
  • FIG. 17A shows a stained image with Foxa2, Lmx1a and DAPI on the seventh day after sorting (photograph). The numbers in the figure indicate the content of each positive cell, and in the case of double staining, the content of the double positive cell.
  • FIG. 17B shows stained images of each marker (Foxa2, Nurr1 and TH) after culturing the cells sorted with Lrtm1 positive cells (Lrtm1 +) and the cells not sorted (Unsort) for 21 days (photograph).
  • the numbers in the figure indicate the content of each positive cell, and in the case of double staining, the content of the double positive cell.
  • FIG. 19 shows stained images after further culturing the cells obtained by sorting Lrtm1-positive cells (from left, Foxa2 / DAPI, Nurr1 / DAPI, TH / DAPI, Foxa2 + TH + / DAPI, Nurr1 + TH + / DAPI). And Foxa2 + Nurr1 + TH + / DAPI).
  • the numbers in the figure indicate the positive cell rate of the stained image.
  • FIG. 19A shows a stained image after 7 days of culture after sorting on day 14 of differentiation induction.
  • FIG. 19A shows a stained image after 7 days of culture after sorting on day 14 of differentiation induction.
  • FIG. 19 shows stained images after further culturing the cells obtained by sorting Lrtm1-positive cells (from left, Foxa2 / DAPI, Nurr1 / DAPI, TH / DAPI, Foxa2 + TH + / DAPI, Nurr1 + TH + / DAPI). And Foxa2 + Nurr1 + TH + / DAPI).
  • the numbers in the figure indicate the positive cell rate of the stained image.
  • FIG. 19B shows a stained image after 14 days of culture after sorting on the 14th day of differentiation induction.
  • FIG. 19 shows stained images after further culturing the cells obtained by sorting Lrtm1-positive cells (from left, Foxa2 / DAPI, Nurr1 / DAPI, TH / DAPI, Foxa2 + TH + / DAPI, Nurr1 + TH + / DAPI). And Foxa2 + Nurr1 + TH + / DAPI).
  • the numbers in the figure indicate the positive cell rate of the stained image.
  • FIG. 19C shows a stained image after sorting on day 21 of differentiation induction and culturing for 7 days.
  • the present invention provides a method for producing dopaminergic neural progenitor cells from pluripotent stem cells comprising the following steps; (I) A step of adhesion-culturing pluripotent stem cells on an extracellular matrix in a culture medium containing a reagent selected from the group consisting of a BMP inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, an SHH signal stimulator, an FGF8 and a GSK3 ⁇ inhibitor , (Ii) collecting Corin and / or Lrtm1 positive cells from the cells obtained in the step (i), (Iii) A step of suspension culture of the cells obtained in the step (ii) in a culture solution containing a neurotrophic factor.
  • the pluripotent stem cell that can be used in the present invention is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into all cells existing in a living body and also has proliferative ability, and is not particularly limited.
  • embryonic stem (ES) cells embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transfer
  • GS cells sperm stem cells
  • EG cells embryonic germ cells
  • artificial pluripotency Examples include sex stem (iPS) cells, cultured fibroblasts, and pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse cells).
  • Preferred pluripotent stem cells are ES cells, ntES cells, and iPS cells.
  • ES cells are stem cells established from the inner cell mass of early embryos (for example, blastocysts) of mammals such as humans and mice, and having pluripotency and proliferation ability by self-replication.
  • ES cells are embryonic stem cells derived from the inner cell mass of the blastocyst, the embryo after the morula, in the 8-cell stage of a fertilized egg, and have the ability to differentiate into any cell that constitutes an adult, so-called differentiation. And ability to proliferate by self-replication.
  • ES cells were discovered in mice in 1981 (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and then ES cell lines were also established in primates such as humans and monkeys (JA Thomson et al.
  • ES cells can be established by taking an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder. In addition, maintenance of cells by subculture is performed using a culture solution to which substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor (bFGF)) are added. It can be carried out.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • DMEM / F-12 culture medium supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR and 4 ng / ml bFGF is used as the culture medium for ES cell production.
  • Human ES cells can be maintained in a humid atmosphere of 37 ° C., 2% CO 2 /98% air (O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 215-224).
  • ES cells also need to be passaged every 3-4 days, where passage is eg 0.25% trypsin and 0.1 mg / ml collagenase IV in PBS containing 1 mM CaCl 2 and 20% KSR. Can be used.
  • ES cells can be selected by Real-Time PCR using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog
  • expression of gene markers such as OCT-3 / 4, NANOG, ECAD and the like can be used as an index (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443 -452).
  • Human ES cell lines are obtained from, for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2, and KhES-3 from Kyoto University Institute for Regenerative Medicine (Kyoto, Japan). Is possible.
  • sperm stem cells are testis-derived pluripotent stem cells that are the origin of spermatogenesis. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into various types of cells, and have characteristics such as the ability to create chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts (M. Kanatsu-Shinohara et al. ( 2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells, such as LIF, bFGF, stem cell factor, etc. It can be established by culturing primordial germ cells in the presence of these substances (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550 -551).
  • iPS Artificial pluripotent stem cells
  • somatic cells in the form of DNA or protein, which is almost equivalent to ES cells
  • It is an artificial stem cell derived from a somatic cell having the characteristics of, for example, differentiation pluripotency and proliferation ability by self-replication (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al (2007), Cell, 131: 861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol.
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-cording RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-cording RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the reprogramming factors include histone deacetylase (HDAC) inhibitors [for example, small molecule inhibitors such as valproate (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg Nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene) etc.], MEK inhibitors (eg PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901), Glycogen synthase-kinase 3 inhibitors (eg, Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (eg, 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (eg, small molecule inhibitors such as BIX-01294, Suv39hl, Suv39h2, SetDBl and G9a nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and
  • the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane-permeable peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine), or microinjection.
  • a cell membrane-permeable peptide for example, HIV-derived TAT and polyarginine
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054) and the like.
  • artificial chromosome vectors examples include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosomes
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosomes
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, enhancer, ribosome binding sequence, terminator, polyadenylation site, etc. so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • Selective marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • FLAG FLAG
  • the above vector has a LoxP sequence before and after the introduction of the gene into a somatic cell in order to excise the gene or promoter encoding the reprogramming factor and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it. May be.
  • RNA it may be introduced into somatic cells by techniques such as lipofection and microinjection, and in order to suppress degradation, RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudouridine® (TriLink® Biotechnologies) is used. Yes (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • Examples of the culture medium for inducing iPS cells include DMEM, DMEM / F12 or DME culture medium containing 10 to 15% FBS (these culture media include LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine). , Non-essential amino acids, 2-mercaptoethanol, etc.) or a commercially available culture medium [eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES cells Culture medium for culture (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology).
  • DMEM DMEM / F12 or DME culture medium containing 10 to 15% FBS
  • these culture media include LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine). , Non-essential amino acids, 2-mercaptoethanol, etc.
  • a commercially available culture medium eg, culture medium for mouse ES cell culture (TX-
  • a somatic cell is brought into contact with a reprogramming factor on a DMEM or DMEM / F12 medium containing 10% FBS at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for about 4 to 7 days. Then, re-spread the cells on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and use bFGF-containing primate ES cell culture medium about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor. Culturing and generating iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 10% FBS-containing DMEM medium including LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • somatic cells to be reprogrammed themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 or WO2010 / 137746), or extracellular matrix (eg, Laminin- 5 (WO2009 / 123349) and Matrigel (BD)) are exemplified.
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237 -241 or WO2010 / 013845).
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day onward.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • a drug resistance gene that is expressed in conjunction with a gene that is expressed when somatic cells are initialized for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture solution containing the corresponding drug selection The established iPS cells can be selected by culturing with the culture medium.
  • the marker gene is a fluorescent protein gene
  • iPS cells are selected by observing with a fluorescence microscope, in the case of a luminescent enzyme gene, by adding a luminescent substrate, and in the case of a chromogenic enzyme gene, by adding a chromogenic substrate can do.
  • the term “somatic cell” refers to any animal cell (preferably, a mammalian cell including a human) except a germ line cell such as an egg, oocyte, ES cell, or totipotent cell.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells. , Passage cells, and established cell lines.
  • somatic cells include, for example, (1) neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells such as dental pulp stem cells (somatic stem cells), (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, enterocytes, spleen cells, pancreatic cells (exocrine pancreas cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells Examples thereof include differentiated cells such as fat cells.
  • somatic cells having the same or substantially the same HLA genotype as the transplant destination individual from the viewpoint that rejection does not occur.
  • substantially the same means that the HLA genotype matches the transplanted cells to such an extent that an immune response can be suppressed by an immunosuppressive agent.
  • HLA-A, HLA-B And somatic cells having an HLA type in which 3 loci of HLA-DR or 4 loci plus HLA-C are matched.
  • E Cloned embryo-derived ES cells obtained by nuclear transfer nt ES cells are cloned embryo-derived ES cells produced by nuclear transfer technology and have almost the same characteristics as ES cells derived from fertilized eggs (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72: 932-936; J. Byrne et al. (2007) , Nature, 450: 497-502).
  • an ES cell established from an inner cell mass of a clonal embryo-derived blastocyst obtained by replacing the nucleus of an unfertilized egg with the nucleus of a somatic cell is an nt ES (nuclear transfer ES) cell.
  • nt ES nuclear transfer ES
  • nuclear transfer technology JB Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (above) is used (Wakayama). Seika et al. (2008), Experimental Medicine, Vol. 26, No. 5 (extra number), 47-52).
  • Nuclear transfer can be initialized by injecting a somatic cell nucleus into a mammal's enucleated unfertilized egg and culturing for several hours.
  • Muse cells are pluripotent stem cells produced by the method described in WO2011 / 007900. Specifically, fibroblasts or bone marrow stromal cells are treated with trypsin for a long time, preferably 8 or 16 hours. It is a pluripotent cell obtained by suspension culture after treatment, and is positive for SSEA-3 and CD105.
  • dopaminergic neural progenitor cells include dopaminergic neurons or dopaminergic neurons unless otherwise specified.
  • the dopaminergic neural progenitor cell may be a cell population containing other cell types, and is preferably a cell population not containing serotonin neurons.
  • the dopaminergic neural progenitor cells are preferably a cell population containing Foxa2Nurr1 and / or TH positive cells.
  • examples of human Foxa2 include a polynucleotide represented by NCBI accession number NM_021784 or NM_153675 and proteins encoded by these.
  • human Nurr1 includes a polynucleotide represented by NCBI accession number NM_006186 and a protein encoded by these.
  • human TH includes a polynucleotide represented by NCBI accession number NM_000360, NM_199292 or NM_199293 and proteins encoded by these.
  • the extracellular matrix is a supramolecular structure existing outside the cell and may be naturally derived or an artificial product (recombinant). Examples thereof include substances such as collagen, proteoglycan, fibronectin, hyaluronic acid, tenascin, entactin, elastin, fibrillin and laminin, or fragments thereof. These extracellular matrices may be used in combination, for example, preparations from cells such as BD Matrigel TM. Laminin or a fragment thereof is preferable.
  • laminin is a protein having a heterotrimeric structure having one ⁇ chain, one ⁇ chain, and one ⁇ chain, and is not particularly limited.
  • the ⁇ chain includes ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4.
  • it is ⁇ 5, the ⁇ chain is ⁇ 1, ⁇ 2, or ⁇ 3, and the ⁇ chain is exemplified by ⁇ 1, ⁇ 2, or ⁇ 3, more preferably laminin 511 consisting of ⁇ 5, ⁇ 1, and ⁇ 1.
  • laminin may be a fragment, and is not particularly limited as long as it has an integrin-binding activity.
  • it may be an E8 fragment that is a fragment obtained by digestion with elastase. Good. Therefore, in the present invention, laminin 511E8 (preferably human laminin 511E8) described in WO2011 / 043405 is exemplified.
  • the BMP inhibitor refers to proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin (ie, 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin- 4-yl-pyrazolo [1,5-a] pyrimidine) and its derivatives (PB Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; PB Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4 : 33-41; J. Hao et al.
  • proteinaceous inhibitors such as Chordin, Noggin, Follistatin, Dorsomorphin (ie, 6- [4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy) phenyl] -3-pyridin- 4-yl-pyrazolo [1,5-a] pyrimidine) and its derivatives (PB Yu et al. (2007), Circulation, 116: II_60; PB Yu
  • LDN193189 ie 4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1 , 5-a] pyrimidin-3-yl) quinoline).
  • Dorsomorphin and LDN193189 are commercially available and are available from Sigma-Aldrich and Stemgent, respectively.
  • the BMP inhibitor used in the present invention may preferably be LDN193189.
  • the concentration of LDN193189 in the culture solution is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits BMP.
  • 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 750 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M Examples include, but are not limited to, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, and 50 ⁇ M. Preferably, it is 100 nM.
  • the TGF ⁇ inhibitor is a substance that inhibits signal transduction from binding of TGF ⁇ to the receptor to SMAD, and a substance that inhibits binding to the receptor ALK family, or SMAD by the ALK family.
  • SMAD signal transduction from binding of TGF ⁇ to the receptor to SMAD
  • ALK family a substance that inhibits binding to the receptor ALK family, or SMAD by the ALK family.
  • SB431542, SB202190 above, RKLindemann et al., Mol.
  • the TGF ⁇ inhibitor used in the present invention may preferably be A83-01.
  • the concentration of A83-01 in the culture solution is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits ALK5.
  • it is 500 nM to 5 ⁇ M, more preferably 500 nM.
  • a SHH (Sonic hedgehog) signal stimulator is defined as a substance that causes the inhibition of Smoothened (Smo) caused by SHH binding to the receptor Patched (Ptch1) and the subsequent activation of Gli2.
  • SHH SHH, Hh-Ag1.5 (Li, X., et al., Nature Biotechnology, 23, 215-221 (2005)), Smoothened Agonist, SAG (N-Methyl-N ′-(3- pyridinylbenzyl) -N '-(3-chlorobenzo [b] thiophene-2-carbonyl) -1,4-diaminocyclohexane), 20a-hydroxycholesterol, Purmorphamine and derivatives thereof (Stanton BZ, Peng LF., Mol Biosyst. 6: 44-54, 2010).
  • the SHH signal stimulator used in the present invention may preferably be Purmorphamine.
  • the concentration of Purmorphamine in the culture solution is not particularly limited as long as it activates Gli2, for example, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 750 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M. , 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, and 50 ⁇ M, but are not limited thereto. Preferably, it is 2 ⁇ M.
  • a GSK3 ⁇ inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of GSK-3 ⁇ protein (for example, phosphorylation ability for ⁇ -catenin), and many of them are already known.
  • BIO also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3′-oxime
  • maleimide derivative SB216763 (3- (2,4-dichlorophenyl) -4- (1-methyl-1H-indole) -3-yl) -1H-pyrrole-2,5-dione
  • GSK-3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone), a phenyl ⁇ bromomethyl ketone compound, L803-mts, a cell membrane permeation type phosphorylated peptide (Also known as GSK-3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH 2 (SEQ ID NO: 1)) and highly selective CHIR99021 (6- [2- [4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (4-methyl-1H-imidazol-2-yl) pyrimidin-2-ylamino] ethylamino] pyridine-3-carbonitrile).
  • the concentration of CHIR99021 in the culture solution is, for example, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 500 nM, 750 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M. 40 ⁇ M and 50 ⁇ M, but are not limited thereto. Preferably, it is 1 ⁇ M.
  • FGF8 is not particularly limited, but in the case of human FGF8, four splicing forms of FGF8a, FGF8b, FGF8e or FGF8f are exemplified, and FGF8b is more preferable in the present invention.
  • FGF8 is commercially available from, for example, Wako, R & D systems, etc., and can be easily used, but may be obtained by forced expression in cells by methods known to those skilled in the art.
  • the concentration of FGF8 in the culture solution is, for example, 1 ng / mL, 5 ng / mL, 10 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL, 150 ng / mL, 200 ng / mL, 250 ng / mL, 500 ng / mL, 1000 ng / Although it is mL, 2000ng / mL, 5000ng / mL, it is not limited to these. Preferably, it is 100 ng / mL.
  • a substance that specifically binds to Corin or Lrtm1 in order to select Corin positive cells and / or Lrtm1 positive cells from the cell population, a substance that specifically binds to Corin or Lrtm1 can be used.
  • an antibody or an aptamer can be used, and preferably an antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody may be a polyclonal or monoclonal antibody.
  • These antibodies can be made using techniques well known to those skilled in the art (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.12-11.13).
  • a protein encoded by Corin or Lrtm1 expressed in E. coli or a mammalian cell line, etc. and purified according to a conventional method an oligopeptide or glycolipid having a partial amino acid sequence is purified. It is possible to immunize a non-human animal such as a rabbit and obtain it from the serum of the immunized animal according to a conventional method.
  • a monoclonal antibody in the case of a monoclonal antibody, it can be obtained from hybridoma cells prepared by cell fusion of spleen cells and myeloma cells obtained from the immunized non-human animal described above (Current protocols in Molecular Biology). edit.Ausubel et al. (1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4-11.11).
  • the antigen-binding fragment of an antibody include a part of an antibody (eg, a Fab fragment) or a synthetic antibody fragment (eg, a single chain Fv fragment “ScFv”).
  • Antibody fragments such as Fab and F (ab) 2 fragments can also be prepared by methods well known in genetic engineering.
  • antibodies against Corin can be obtained by the production methods described in WO2004 / 065599 and WO2006 / 009241, and antibodies against Lrtm1 can be obtained by the production methods described in WO2013 / 015457.
  • Human Corin can obtain its sequence by NCBI accession number NM_006587. Similarly, the sequence of human Lrtm1 can be obtained by NM_020678.
  • the substance to be bound is, for example, a detectable substance such as fluorescent label, radioactive label, chemiluminescent label, enzyme, biotin or streptavidin or protein A Alternatively, it may be bound or conjugated to a substance allowing isolation and extraction, such as protein G, beads or magnetic beads.
  • the binding substance may also be indirectly labeled.
  • Various methods known to those skilled in the art can be used, and examples include a method using a pre-labeled antibody (secondary antibody) that specifically binds to the antibody.
  • Methods for extracting dopaminergic neural progenitor cells include a method in which particles are joined to the binding substance and precipitated, a method in which cells are magnetically sorted using magnetic beads (e.g., MACS), and a cell sorter using a fluorescent label. Examples thereof include a method of using, or a method of using a carrier (for example, a cell concentration column) on which an antibody or the like is immobilized.
  • a carrier for example, a cell concentration column
  • aptamers that specifically bind to Corin or Lrtm1 can be prepared using techniques well known to those skilled in the art (SELEX (systematicsystemevolution of ligand by exponential enrichment) method: Ellington, AD & Szostak) , JW (1990) Nature, 346, 818-822., Tuerk, C. & Gold, L. (1990) Science, 249, 505-510.)
  • a neurotrophic factor is a ligand to a membrane receptor that plays an important role in survival and function maintenance of motor neurons, such as Nerve Growth Factor (NGF), Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) , Neurotrophin 3 (NT-3), Neurotrophin 4/5 (NT-4 / 5), Neurotrophin 6 (NT-6), basic FGF, acidic FGF, FGF-5, Epidermal Growth Factor (EGF), Hepatocyte Growth Factor ( HGF), Insulin, Insulin Like Growth Factor 1 (IGF 1), Insulin Like Growth Factor 2 (IGF 2), Glia cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF), TGF-b2, TGF-b3, Interleukin 6 (IL-6 ), Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) and LIF.
  • NGF Nerve Growth Factor
  • BDNF Brain-derived Neurotrophic Factor
  • NT-3 Neurotrophin 3
  • Neurotrophin 4/5 NT-4 / 5
  • Neurotrophin 6 Neurotrophin 6
  • a preferred neurotrophic factor in the present invention is a factor selected from the group consisting of GDNF and BDNF.
  • the neurotrophic factor is commercially available from, for example, Wako and R & D systems, and can be easily used. However, it may be obtained by forced expression in cells by methods known to those skilled in the art.
  • the concentration of GDNF1 in the culture solution is, for example, 0.1 ng / mL, 0.5 ng / mL, 1 ng / mL, 5 ng / mL, 10 ng / mL, 15 ng / mL, 20 ng / mL, 25 ng / mL, 30 ng / mL 40 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL, 200 ng / mL, 500 ng / mL, but not limited thereto.
  • it is 10 ng / mL.
  • the concentration of BDNF1 in the culture solution is, for example, 0.1 ng / mL, 0.5 ng / mL, 1 ng / mL, 5 ng / mL, 10 ng / mL, 15 ng / mL, 20 ng / mL, 25 ng / mL, 30 ng / mL 40 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL, 200 ng / mL, 500 ng / mL, but not limited thereto.
  • it is 20 ng / mL.
  • the step (i) is preferably performed by the following multi-step process; (A) a step of adherent culture of pluripotent stem cells on an extracellular matrix in a culture solution containing a BMP inhibitor and a TGF ⁇ inhibitor; (B) a step of adhesion-culturing the cells obtained in the step (a) on an extracellular substrate in a culture solution containing a BMP inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, a SHH signal stimulator and FGF8; (C) Adherent culture of the cells obtained in the step (b) on an extracellular matrix in a culture solution containing a BMP inhibitor, a TGF ⁇ inhibitor, an SHH signal stimulator, FGF8 and a GSK3 ⁇ inhibitor; (D) A step of adhesion-culturing the cells obtained in the step (c) on an extracellular matrix in a culture solution containing a BMP inhibitor and a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the culture solution used in step (i) can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • a basal medium for example, Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, 640 Medium, Fischer's medium, Neurobasal Medium (Life Technologies) and mixed media thereof are included.
  • GMEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • IMDM medium Medium 199 medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • 640 Medium Fischer's medium
  • Neurobasal Medium Life Technologies
  • the medium can be, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen It may contain one or more serum substitutes such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, It may also contain one or more substances such as growth factors, small molecule compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • a preferred culture medium is a GMEM medium containing KSR, 2-mercaptoethanol, non-essential amino acids and pyruvic acid.
  • a reagent selected from the group consisting of a BMP inhibitor, TGF ⁇ inhibitor, SHH signal stimulator, FGF8 and GSK3 ⁇ inhibitor can be added and cultured as appropriate.
  • adhesion culture on an extracellular matrix can be performed by culturing using a culture vessel coated with the extracellular matrix.
  • the coating treatment can be performed by placing a solution containing an extracellular matrix in a culture container and then removing the solution as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably about 2 to 5%.
  • the culture period is not particularly limited as long as it is a period in which Corin and / or Lrtm1-positive cells appear, but it is preferable that step (i) is performed for at least 10 days. More preferably, it is 12 days to 21 days, and more preferably 12 days to 14 days.
  • the number of days is 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, or more. Preferably, it is 1 day.
  • the number of days is 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, or more.
  • the number of days is 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, or more.
  • the number of days is 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, 5 days or more, 6 days or more, 7 days or more, or more.
  • it is 5 days or longer.
  • Pluripotent stem cells may be used after dissociating the cells.
  • the method for dissociating the cells include a method of dynamically dissociating, a dissociation solution having protease activity and collagenase activity (for example, Accutase (trademark) and And a dissociation method using a dissociation solution having only collagenase activity.
  • a method of dissociating human pluripotent stem cells using trypsin or an alternative thereof is used.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of Rho kinase (ROCK).
  • ROCK Rho kinase
  • Y-27632 for example, Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976- 983 (2000); see Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)
  • Fasudil / HA1077 see, eg, Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)
  • H-1152 eg, Sasaki et al., Pharmacol. Ther.
  • ROCK inhibitors may be used.
  • the ROCK inhibitor used in the present invention may preferably be Y-27632.
  • the concentration of Y-27632 is, for example, 100 nM, 500 nM, 750 nM, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 15 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M, 50 ⁇ M. It is not limited to. Preferably, it is 10 ⁇ M.
  • Step (ii)> The step (ii) of collecting Corin and / or Lrtm1-positive cells can be performed based on the above-described ⁇ Method for selecting cells>.
  • the culture solution used in step (iii) can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • a basal medium for example, Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 Medium, Fischer's medium, Neurobasal Medium (Life Technologies), and mixed media thereof are included.
  • GMEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • IMDM medium Medium 199 medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium RPMI 1640 Medium
  • Fischer's medium Neurobasal Medium (Life Technologies)
  • mixed media thereof are included.
  • Neurobasal Medium may contain serum or may be serum-free.
  • the medium can be, for example, albumin, transferrin, Knockout Serum Replacement (KSR) (serum substitute for FBS during ES cell culture), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen It may contain one or more serum substitutes such as precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax (Invitrogen), non-essential amino acids, vitamins, One or more substances such as growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, nucleic acids (eg, Dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP)) may also be included.
  • a preferred culture medium is Neurobasal Medium containing B27 supplement, ascorbic acid and dbcAMP. A neurotrophic factor can be appropriately added to this culture solution and cultured.
  • the suspension culture in the step (iii) is to culture the cells in a non-adherent state in the culture vessel, and is not particularly limited, but artificially treated for the purpose of improving the adhesion with the cells (for example, Culture containers not coated with extracellular matrix, etc., or artificially suppress adhesion (for example, polyhydroxyethyl methacrylic acid (poly-HEMA), nonionic surfactant polyol (Pluronic® F-127) Etc.) or a phospholipid-like structure (for example, a water-soluble polymer (Lipidure) containing 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine as a structural unit) can be used.
  • poly-HEMA polyhydroxyethyl methacrylic acid
  • Pluronic® F-127 nonionic surfactant polyol
  • Etc. a phospholipid-like structure
  • the culture temperature is not particularly limited, but is about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the culture is performed in an atmosphere of CO 2 -containing air, and the CO 2 concentration is preferably about 2 to 5%.
  • the culture period is not particularly limited as long as Nurr1 or Foxa2 positive cells appear, but step (iii) is preferably performed for at least 7 days. More preferably, it is 7 days to 30 days, more preferably 14 days to 21 days, or 14 days to 16 days, and most preferably 16 days.
  • a ROCK inhibitor When performing step (iii) following step (ii), it is desirable to add a ROCK inhibitor appropriately and culture.
  • a ROCK inhibitor When a ROCK inhibitor is added, it may be added and cultured for at least 1 day, more preferably 1 day.
  • the dopaminergic neural progenitor cells obtained in the present invention can be administered as a preparation to Parkinson's disease patients.
  • the obtained dopaminergic neural progenitor cells are suspended in physiological saline or the like and transplanted to the striatal region of the patient.
  • the present invention provides a therapeutic agent for Parkinson's disease comprising dopaminergic neural progenitor cells obtained from pluripotent stem cells by the above method.
  • the number of dopaminergic neural progenitor cells contained in the therapeutic agent for Parkinson's disease is not particularly limited as long as the graft can be engrafted after administration, but may be contained, for example, 15 ⁇ 10 4 or more. Further, it may be prepared by appropriately increasing or decreasing according to the size of the symptom or body.
  • Transplantation of dopaminergic neural progenitor cells into the disease site can be performed by a technique such as that described in NatureNNeuroscience, 2,1137 (1999) or N Engl J Med.; 344: 710-9 (2001). it can.
  • kits for producing dopaminergic neural progenitor cells from pluripotent stem cells includes a culture solution, an additive, a culture container, or the like used for each step of producing the above-described dopaminergic neural progenitor cells.
  • a reagent selected from the group consisting of anti-Corin antibody, anti-Lrtm1 antibody, BMP inhibitor, TGF ⁇ inhibitor, SHH signal stimulator, FGF8, GSK3 ⁇ inhibitor, extracellular matrix and neurotrophic factor can be mentioned.
  • the kit may further include a document or instructions describing the procedure of the manufacturing process.
  • Example 1 Cells and cultured human ES cells (KhES-1) were received from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University (Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345: 926-32, 2006).
  • Human iPS cells 404C2 and 836B3 are cells obtained by introducing Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-MYC, LIN28 and p53 shRNA into human fibroblasts using episomal vectors. (Okita, et al, Nat Methods. 8: 409-412, 2011).
  • ES cells and iPS cells were cultured by the method described in Miyazaki Tet et al., Nat Nat Commun. 3: 1236, 2012. Briefly, the cells were cultured in 6-well plate coated with Laminin511E8.
  • the medium contains 10 ⁇ M Y-27632 (WAKO), 0.1 ⁇ M LDN193189 (STEMGENT) and 0.5 ⁇ M A83-01 (WAKO)
  • the basic medium A was changed to GMEM (Invitrogen) containing 8% KSR (Invitrogen), 1 mM Sodium pyruvate (Invitrogen), 0.1 mM MEM non essential amino acid (Invitrogen) and 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (WAKO).
  • the medium was changed to a basic medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189, 0.5 ⁇ M A83-01, 2 ⁇ M Purmorphamine (WAKO) and 100 ng / mL FGF8 (WAKO).
  • the medium was changed to a basic medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189, 0.5 ⁇ M A83-01, 2 ⁇ M Purmorphamine, 100 ng / mL FGF8 and 3 ⁇ M CHIR99021 (WAKO).
  • the medium was changed to basal medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189 and 3 ⁇ M CHIR99021. Thereafter, the medium was changed once a day.
  • Laminin511E8 which is the above-mentioned coating agent
  • Matrigel BD
  • CELLstart Invitrogen
  • Laminin111E8 a similar experiment was carried out for 12 days. PSA-NCAM positive even if any coating agent was used. Cells and Corin positive cells were obtained, but when Laminin511E8 was used, there were few remaining undifferentiated cells (Tra-1-60 positive cells), and the content of Corin positive cells was the highest (FIG. 2). It was confirmed that by performing adhesion culture with Laminin511E8 coating, it was possible to handle a larger amount of cells at once than in suspension culture, and the content of desired cells was also increased. Thereafter, Laminin511E8 was used as a coating agent.
  • Anti-Corin antibody was prepared by the following method. First, among the cynomolgus monkey Corin gene, a gene sequence encoding a part of the extracellular region (79-453 amino acids) was introduced into 293E cells, and the extracellular region fragment of Corin protein was expressed and recovered. After immunizing mice with the recovered protein, lymphocyte cells were taken out and fused with myeloma cells. Clones reactive to Corin were selected from the fused cell population. The culture supernatant of this clone was used as an anti-Corin monoclonal antibody.
  • suspension culture was similarly performed on day 12 without sorting with Corin.
  • FIG. 3 shows the state of cells in each differentiation induction period obtained from iPS cells (836B3) by the above method.
  • the cell mass obtained on day 28 is transferred to Poly-L-ornithine, Fibronectin and Laminin-coat dish without culturing on day 12, and cultured in basal medium B for 14 days (day 42)
  • the content of each positive cell of polysialylated (PSA) -NCAM and Tra-1-60 is shown in FIG.
  • the content of PSA-NCAM positive cells which are neuronal markers
  • Corin positive cells, which are floor plate markers appeared on day 10 and peaked on day 21 to 28. This tendency was the same even when 404C2 was used. Therefore, in order to obtain Corin positive cells by sorting, it was suggested that it is preferable to carry out after day 10.
  • TH positive cells also co-expressed other dopaminergic neuron markers AADC, Pitx3 and Girk2 (FIG. 6).
  • Pax6 of the rostral marker, Foxa2 of the caudal marker, Neurog2 of the early neuronal marker, and NEFM of the neuronal marker of mitosis (see the figure) (Not shown) and non-neuronal cell markers DLK1 and CYP1B1 were confirmed to be highly expressed in cells that were not sorted (FIG. 7B). Furthermore, when immunostaining was performed, it was confirmed that the content of Lmx1a and Foxa2 co-positive cells was high in Corin positive cells (FIGS. 8A and B: 75.52 ⁇ 8.255% vs. 47.37 ⁇ 6.624%). ).
  • Nurr1-positive cells and TH-positive cells were 27.34 ⁇ 5.511% and 2.098 ⁇ 1.243%, respectively, on day 42, 19.91 ⁇ 6.966% and 42.04 ⁇ 4.481%, and the content of TH-positive cells was day 21 on day 42 It was higher than Furthermore, on day 42, dopamine (DA), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) and serotonin (5-HT) released into the medium by stimulation with high potassium chloride were quantified using HPLC, and Corin sorting was performed. It was confirmed that DA and DOPAC were significantly released in the cells subjected to Corin sorting as compared to the case where there was not (FIG. 11C).
  • DA dopamine
  • DOPAC 3,4-dihydroxyphenylacetic acid
  • 5-HT serotonin
  • day 12 sorting day 28 cells and day 28 cells without sorting were respectively compared by microarray analysis (FIG. 16A).
  • day28 cells it was confirmed that expression of PAX6, a forebrain marker, was high when sorting was not performed.
  • ALCAM expression was high when sorting.
  • comparison of day28 and day42 cells confirmed that SH28, WNT5A and CORIN expression was high in day28 cells.
  • TH was confirmed to be highly expressed in day42 cells.
  • fetal ventral midbrain cells (7 weeks old), which have been clinically used for Parkinson's disease, were compared with day 28 and day 42 cells that were sorted on day 12.
  • Dopaminergic neuron markers TH and PITX3 (not shown) were highly expressed in fetal ventral midbrain cells compared to day28 cells.
  • TPH2 a marker for serotonergic neurons, was also highly expressed in fetal ventral midbrain cells (FIG. 16B).
  • FIG. 16C Day 28 cells express genes related to axon guidance (SPON1 and SLIT2), suggesting that they are early in developmental stage than fetal ventral midbrain cells.
  • Example 2 Cell culture ES cells (Kh-ES1) were dissociated using TrypLE CTS (Life Technologies), transferred to a 6-well plate coated with Laminin511E8 separately prepared, 10 ⁇ M Y-27632, 0.1 ⁇ M LDN193189, 0.5 ⁇ M A83- The cells were cultured in a basic medium A containing 01 (GMEM containing 8% KSR, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM MEM non-essential amino acid and 0.1 mM 2-Mercaptoethanol).
  • GMEM containing 8% KSR, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM MEM non-essential amino acid and 0.1 mM 2-Mercaptoethanol.
  • the medium was changed to a basic medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189, 0.5 ⁇ M A83-01, 2 ⁇ M Purmorphamine and 100 ng / mL FGF8.
  • the medium was changed to a basic medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189, 0.5 ⁇ M A83-01, 2 ⁇ M Purmorphamine, 100 ng / mL FGF8 and 3 ⁇ M CHIR99021.
  • the medium was changed to basal medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189 and 3 ⁇ M CHIR99021.
  • Lrtm1 positive cells were collected by sorting by FACS using an anti-Lrtm1 antibody (WO2013 / 015457).
  • the collected Lrtm1-positive cells were transferred to Lipidure-coat 96 well plate (Thermo) at 20000 cells / well, 30 ⁇ M Y-27632, B27 Supplement without vitamin A, 2 mM L-Glutamine, 20 ng / mL recombinant human (rh) BDNF, Suspension culture was performed using Neurobasal medium supplemented with 10 ng / mL rhGDNF, 400 ⁇ M dbcAMP, 1% KSR, Penicillin / Streptomycin (Gibco) and 200 ⁇ M Ascorbic acid. Thereafter, the medium was changed to a medium containing no Y-27632 once every 3 days. It was used for various experiments 7 days after sorting (day 21) or 21 days
  • Example 3 Dissociate cell culture ES cells (Kh-ES1) using TrypLE CTS (Life Technologies), transfer 4 ⁇ 10 5 cells to a 6-well plate coated with Laminin511E8, and prepare StemFit medium containing 10 ⁇ M Y-27632. (Ajinomoto). Four days later, the medium was changed to the above-mentioned basic medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189 and 0.5 ⁇ M A83-01 (day 0). One day after the start of culture (day 1), the medium was changed to a basic medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189, 0.5 ⁇ M A83-01, 2 ⁇ M Purmorphamine and 100 ng / mL FGF8.
  • the medium was changed to a basic medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189, 0.5 ⁇ M A83-01, 2 ⁇ M Purmorphamine, 100 ng / mL FGF8 and 3 ⁇ M CHIR99021.
  • the medium was changed to basal medium A containing 0.1 ⁇ M LDN193189 and 3 ⁇ M CHIR99021.
  • Sorting Culture by the above method dissociating cells using TrypLE CTS on day 14 (14 days after starting culture) or day 21 (21 days after starting culture), and sorting by FACS using anti-Lrtm1 antibody (WO2013 / 015457) And Lrtm1-positive cells were collected.
  • the content of Foxa2 positive cells was confirmed to be 90% or more under all conditions, but the content of Nurr1 and TH positive cells was 14 They were 13.1%, 24.0%, and 10.2% for day-7 day, 14 day-14 day, and 21 day-7 day, respectively (FIG. 19). Therefore, the content of Foxa2, Nurr1, and TH positive cells was the highest at 14 days to 14 days.
  • the present invention is useful for regenerative medicine, particularly for the treatment of Parkinson's disease.

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Abstract

（i）多能性幹細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤から成る群より選択される試薬を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、 （ii）前記工程(i)で得られた細胞からCorinに結合する物質および/またはLrtm1に結合する物質を用いてCorinおよび／またはLrtm1陽性細胞を収集する工程、および （iii）前記工程（ii）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培養液中で浮遊培養する工程を含む、多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を製造する方法を提供する。

Description

新規ドーパミン産生神経前駆細胞の誘導方法
　本発明は、ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法に関する。
　パーキンソン病は、中脳黒質のドーパミン産生神経細胞の脱落によって起きる神経変性疾患であり、現在、世界中で約400万人の罹患者がいる。パーキンソン病の治療として、L-DOPAまたはドーパミンアゴニストによる薬物治療、定位脳手術による凝固術または深部電気刺激治療および胎児中脳移植などが行われている。
　胎児中脳移植はその供給源の組織の倫理的な問題があるとともに、感染の危険性も高い。そこで、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）などの多能性幹細胞から分化誘導した神経細胞を用いた治療法が提案されている（非特許文献１）。しかし、分化誘導した神経細胞を移植した際に、良性腫瘍を形成する可能性および目的とするドーパミン産生神経細胞以外の細胞が原因と考えられるジスキネジアが指摘されており、生着し尚且つ安全な細胞を選択して移植することが求められている。
　そこで、ドーパミン産生神経細胞またはドーパミン産生神経前駆細胞のマーカーとなる遺伝子により移植に適した細胞を選別することが提案されているが（特許文献１～４）、マーカーの選択にも改善の余地があった。また、これらの文献では選別直後の細胞を投与することが適しているのか、または、この中間体細胞から誘導した細胞を投与することが良いのかについては検討されていない。
　さらに、生物由来成分の含有によるロット差の影響や価格の高騰を抑えるためには、ドーパミン産生神経細胞の製造方法には改良の余地があると考えられる。
WO2005/052190 WO2006/009241 WO2007/119759 WO2013/015457
Wernig M, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008, 105: 5856-5861
　本発明の目的は、パーキンソン病治療剤として適したドーパミン産生神経前駆細胞を製造することである。したがって、本発明の課題は、ドーパミン産生神経前駆細胞の製造工程または製造に必要なキットを提供することである。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく、ドーパミン産生神経前駆細胞のマーカー遺伝子と考えられている細胞表面膜タンパク質のCorinおよび/またはLrtm1に着目し、これを指標として細胞を抽出し、さらに培養を継続した後に移植することで移植後もドーパミン産生細胞が生着することを見出し、本製造工程によりパーキンソン病治療剤としてのドーパミン産生神経前駆細胞を得られることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
 [１]次の工程を含む多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を製造する方法：
（i）多能性幹細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤から成る群より選択される試薬を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（ii）前記工程(i)で得られた細胞からCorinおよび/またはLrtm1陽性細胞を収集する工程、
（iii）前記工程（ii）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培養液中で浮遊培養する工程。
[２]細胞外基質が、ラミニン511またはその断片である、[１]に記載の方法。
[３]ラミニン511断片が、ラミニン511E8である、[２]に記載の方法。
[４]前記工程（i）が次の工程を含む、[１]～[３]のいずれかに記載の方法；
（a）多能性幹細胞を細胞外基質上でBMP阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程、
（b）前記工程（a）で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤およびFGF8を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（c）前記工程（b）で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（d）前記工程（c）で得られた細胞をBMP阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程。
[５]BMP阻害剤がLDN193189である、[１]から[４] のいずれかに記載の方法。
[６]TGFβ阻害剤がA83-01である、[１]から[４] のいずれかに記載の方法。
[７]SHHシグナル刺激剤がPurmorphamineである、[１]から[４] のいずれかに記載の方法。
[８]GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[１]から[４] のいずれかに記載の方法。
[９]前記神経栄養因子がBDNFおよびGDNFである、[１] から[８] のいずれかに記載の方法。
[１０]前記工程（iii）の工程で用いる培養液が、B27サプリメント、アスコルビン酸およびDibutyryl cyclic AMPをさらに含む、[１] から[９] のいずれかに記載の方法。
[１１]前記（i）および/または（iii）の工程で用いる培養液が、さらにROCK阻害剤を含む、[１] から[１０] のいずれかに記載の方法。
[１２]ROCK阻害剤がY-27632である、[１１]に記載の方法。
[１３]前記工程（i）が、少なくとも10日間行われる、[１] から[１２] のいずれかに記載の方法。
[１４]前記工程（i）が、12日間から21日間行われる、[１] から[１３]のいずれかに記載の方法。
[１５]前記工程（i）が、12日間から14日間行われる、[１] から[１３]のいずれかに記載の方法。
[１６]前記工程（iii）が、少なくとも7日間行われる、[１] から[１５] のいずれかに記載の方法。
[１７]前記工程（iii）が、14日間から30日間行われる、[１] から[１６]のいずれかに記載の方法。
[１８]前記工程（iii）が、14日間から16日間行われる、[１] から[１７]のいずれかに記載の方法。
[１９]Corinに結合する物質またはLrtm1に結合する物質が、CorinまたはLrtm1に結合する抗体またはアプタマーである、[１]から[１８]のいずれかに記載の方法。
[２０][１]から[１９] のいずれかに記載の方法で得られる、ドーパミン産生神経前駆細胞。
[２１][１]から[１９] のいずれかに記載の方法で得られるドーパミン産生神経前駆細胞を含む、パーキンソン病治療剤。
[２２]BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8、GSK3β阻害剤、細胞外基質および神経栄養因子を含む、多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を作製するためのキット。
[２３]抗Corin抗体および/または抗Lrtm1抗体をさらに含む、[２２]に記載のキット。
[２４]細胞外基質がラミニン511E8である、[２２]または[２３]に記載のキット。
[２５]BMP阻害剤が、LDN193189である、[２２] から[２４]のいずれかに記載のキット。
[２６]TGFβ阻害剤がA83-01である、[２２] から[２５]のいずれかに記載のキット。
[２７]SHHシグナル刺激剤がPurmorphamineである、[２２] から[２６]のいずれかに記載のキット。
[２８]GSK3β阻害剤がCHIR99021である、[２２] から[２７]のいずれかに記載のキット。
[２９]神経栄養因子がBDNFおよびGDNFである、[２２] または[２８]のいずれかに記載のキット。
　本発明によれば、パーキンソン病治療剤などに有用な、移植に適した生着率の高いドーパミン産生神経前駆細胞を効率よく得ることができる。
図１には、ドーパミン産生細胞の製造プロトコールの一例を示す。図中、"Y"はY-27632を示し、"AA"はAscorbic acidを示す。 図２は、コーティング剤としてMG（マトリゲル）、ＣＳ(CELLStart)、ＬＭ111（Laminin111E8）またはＬＭ511（Laminin511E8）を用いて分化誘導した場合の１２日目における、Tra-1-60陽性細胞の含有率、PSA-NCAM陽性細胞の含有率およびCorin陽性細胞の含有率を示すグラフである。 図３は、ヒトiPS細胞（836B3）および分化誘導工程の細胞の位相差像を示す（写真）。像はそれぞれ、分化誘導前（左図）、分化誘導直後（day0）（中央図）および誘導後12日目（day12）（右図）を示す。 図４は、分化誘導工程におけるCorin（○）、PSA-NCAM（□）およびTra-1-60（△）の陽性細胞数の含有率の変化を示す。day12以降は、ソーティングを行っていない条件での結果を示す。 図５は、未分化マーカーおよび分化マーカーの発現量の変化を示す。値は、day0の値を1とした場合の相対値で示す。図５A中のday12において、Sox1、hGSC、Sox17、Brachyury、NanogおよびOct4の値を示す。図５B中のday42において、Lmx1a、TH、Foxa2、Nurr1、Map2ab、En1およびOct4の値を示す。 図６は、poly-L-Ornithine /Laminin/Fibronectinコート上で培養して42日目の細胞の免疫染色像を示す（写真）。 図７は、１２日目（day12）において抗Corin抗体を用いてソーティングした場合のCorin陽性、Corin陰性またはソーティングなしの細胞の遺伝子発現解析結果を示す。図７Aは、各細胞におけるLmx1a、En1、Foxa2、Otx2、Gbx2、およびSix3の発現量を示す。発現量は、ソーティングなし(unsorted)を１とした場合の相対値にて示す。図７Bは、day12でのソーティングしなかった(unsorted)細胞とCorin陽性細胞（Corin+）をマイクロアレイにより発現比較した解析結果を示す。 図８は、day12において抗Corin抗体を用いてソーティングしたCorin陽性細胞（Corin+）またはCorin陰性細胞（Corin-）、もしくはソーティングしなかった細胞（Unsorted）の遺伝子発現解析結果を示す。図８Aは、各細胞におけるFoxa2/Lmx1a（上図）およびOtx2/Lmx1a/DAPI（下図）の三重染色像を示す（写真）。図８Bは、各細胞におけるFoxa2陽性およびLmx1a陽性の細胞含有率を示す。図８Cは各細胞におけるOtx2陽性およびLmx1a陰性の細胞含有率を示す。図８D、各細胞および分化誘導前の細胞におけるOct4およびNanogの発現量を示す。 図９は、day21において抗Corin抗体を用いてソーティングしたCorin陽性細胞（Corin+）またはCorin陰性細胞（Corin-）、もしくはソーティングしなかった細胞（Unsorted）の遺伝子発現解析結果を示す。図９Aは、各細胞におけるLmx1a、En1、Foxa2、Otx2、Gbx2、およびSix3の発現量を示す。発現量は、ソーティングなし(unsorted)を１とした場合の相対値にて示す。図９Bは、各細胞におけるCorin/Lmx1a（上図）およびFoxa2/Lmx1a（下図）の二重染色像を示す（写真）。図９Cは、各細胞におけるFoxa2陽性およびLmx1a陽性の細胞含有率を示す。 図１０は、分化誘導28日目（day28）および42日目（day42）での細胞塊（sphere）の大きさの解析結果を示す。図１０Aは、各細胞塊の位相差像を示す（写真）。図１０Bは、各細胞塊の直径の値のグラフを示す。 図１１は、分化誘導28日目（day28）および42日目（day42）での遺伝子発現解析結果を示す。図１１Aは、Foxa2/DAPIおよびNurr1/TH（チロシンヒドロキシラーゼ）に対する免疫染色像を示す（写真）。図１１Bは、day28(左図)およびday42（右図）におけるNurr1陽性細胞、Foxa2陽性細胞およびTH陽性細胞の含有率を示す。図１１Cは、Corin+およびUnsortedにおける、day42での１×106個の細胞から放出されるドーパミン（DA）、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）およびセロトニン（5－HT）の量を示す。 図１２は、ソーティング（day12）により採取されたCorin陽性細胞を培養して得られた細胞（Corin+）またはソーティングを行わず誘導した細胞（Unsorted）を分化誘導28日目にラット（６－ヒドロキシドーパミン（6-OHDA）投与）の脳内移植した後16週目での移植片の様子を示す。図１２Aは、移植片のGFAP、Ki67およびヒト核の免疫染色像を示す（写真）。図中の枠内の拡大像を別途示す。図１２B、CおよびDは、それぞれday28、day42およびday19の細胞を移植した場合の移植片の大きさをプロットしたグラフを示す。図１２Eは、day28の細胞を移植した場合の移植片におけるKi67陽性細胞含有率を示す。 図１３は、ソーティング（day12）により採取されたCorin陽性細胞を培養して得られた細胞（Corin+）、ソーティングを行わず誘導した細胞（Unsorted）または陰性対照（Medium）を分化誘導28日目（day28）および42日目（day42）にラット（6-OHDA投与）の脳内へ移植した結果を示す。図１３Aは、day28の細胞を投与した場合の移植後の各時期での単位時間あたりの旋回行動数を示す。図１３Bは、day28の細胞を投与した場合の移植片あたりのTH陽性細胞数をプロットしたグラフを示す。図１３Cは、day28の細胞を投与した場合の脳のTH（赤色）およびヒト核（緑色）の染色像を示す（写真）。図１３Dは、day42の細胞を投与した場合の移植後の各時期での単位時間あたりの旋回行動数を示す。図１３Eは、day42の細胞を投与した場合の移植片あたりのTH陽性細胞数をプロットしたグラフを示す。図１３Fは、day42の細胞を投与した場合の脳のTH（赤色）およびヒト核（緑色）の染色像を示す（写真）。 図１４は、day28の細胞を移植した場合の移植片の解析結果を示す。図１４Aは、神経細胞(NeuN +)あたりのTH陽性細胞数をプロットしたグラフを示す。図１４Bは、ドナー細胞(human nuc+)あたりのTH陽性細胞数をプロットしたグラフを示す。図１４Cは、移植片のFoxa2/TH、Pitx3/TH、Nurr1/THおよびGirk2/THに対する二重染色像を示す（写真）。 図１５は、ソーティング（day12）により採取されたCorin陽性細胞を培養して得られた細胞（Corin+）またはソーティングを行わず誘導した細胞（Unsorted）を分化誘導28日目にラット（6-OHDA投与）の脳内へ移植した結果を示す。図１５Aは、各細胞における16週目の移植片でのセロトニン（緑）/TH（赤）の二重染色像を示す（写真）。図１５Bは、各細胞における16週目での生存細胞（NeuN陽性細胞）あたりのセロトニン陽性細胞の含有率を示す。 day28の細胞、day42の細胞および胎児腹側中脳細胞の遺伝子発現解析の結果を示す。図１６Aは、マイクロアレイを用いて、day12においてCorin陽性細胞でソートした細胞（d28 Corin+）およびソートしなかった細胞（d28 Unsorted）の発現比較した結果（左図）、ならびにCorin陽性細胞でソートした誘導２８日目の細胞（d28 Corin+）および誘導４２日目の細胞の発現比較した結果（右図）を示す。図１６Bは、day28の細胞（d28 Corin+）、day42の細胞（d42 Corin+）および胎児腹側中脳細胞（VM）に対してPCRを用いてCORIN、LMX1A、FOXA2、NURR1、THおよびTPH2を測定した結果を示す。胎児腹側中脳細胞（VM）の値を１として比較した数値で示す。図１６C、Corin陽性細胞でソートしたday28の細胞（d28 Corin+）、ソートしなかったday28の細胞（d28 Unsorted）、ソートしたday42の細胞（d42 Corin+）、ソートしなかったday42の細胞（d42 Unsorted）および胎児腹側中脳細胞（VM）のマイクロアレイをクラスター解析した結果を示す。 図１７は、ソーティング（day14）により採取されたLrtm1陽性細胞を培養して得られた細胞の染色像を示す。図１７Aは、ソーティング後7日目のFoxa2、Lmx1aおよびDAPIでの染色像を示す（写真）。図中の数字は各陽性細胞の含有率を示し、二重染色の場合は、二重陽性細胞の含有率を示す。図１７Bは、Lrtm1陽性細胞をソーティングした細胞（Lrtm1+）およびソーティングしなかった細胞（Unsort）を21日間培養した後の各マーカー（Foxa2、Nurr1およびTH）の染色像を示す（写真）。図中の数字は各陽性細胞の含有率を示し、二重染色の場合は、二重陽性細胞の含有率を示す。 ソーティング（day14）により採取されたLrtm1陽性細胞を1日培養して得られた細胞を10週齢SDラットに移植した後の移植片における各マーカー（Foxa2、THおよびNurr1）の免疫染色像を示す（写真）。 図１９は、Lrtm1陽性細胞をソーティングにより採取した細胞をさらに培養した後の染色像を示す（左から、Foxa2/DAPI、Nurr1/DAPI、TH/DAPI、Foxa2+TH+/DAPI、Nurr1+TH+/DAPIおよびFoxa2+Nurr1+TH+/DAPIを示す）。図中の数字は染色像の陽性細胞率を示す。図１９Aは、分化誘導１４日目にソーティングし、7日間培養後の染色像を示す。 図１９は、Lrtm1陽性細胞をソーティングにより採取した細胞をさらに培養した後の染色像を示す（左から、Foxa2/DAPI、Nurr1/DAPI、TH/DAPI、Foxa2+TH+/DAPI、Nurr1+TH+/DAPIおよびFoxa2+Nurr1+TH+/DAPIを示す）。図中の数字は染色像の陽性細胞率を示す。図１９Bは、分化誘導１４日目にソーティングし、14日間培養後の染色像を示す。 図１９は、Lrtm1陽性細胞をソーティングにより採取した細胞をさらに培養した後の染色像を示す（左から、Foxa2/DAPI、Nurr1/DAPI、TH/DAPI、Foxa2+TH+/DAPI、Nurr1+TH+/DAPIおよびFoxa2+Nurr1+TH+/DAPIを示す）。図中の数字は染色像の陽性細胞率を示す。図１９Cは、分化誘導２１日目にソーティングし、7日間培養後の染色像を示す。
　本発明は、次の工程を含む多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を製造する方法を提供する；
（i）多能性幹細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤から成る群より選択される試薬を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（ii）前記工程(i)で得られた細胞からCorinおよび/またはLrtm1陽性細胞を収集する工程、
（iii）前記工程（ii）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培養液中で浮遊培養する工程。
＜多能性幹細胞＞
　本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、特に限定されないが、例えば胚性幹(ES)細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹(iPS)細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、ES細胞、ntES細胞、およびiPS細胞である。
 (A) 胚性幹細胞
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
　ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された (J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
　ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848； Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
　ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、2% CO2/98% 空気の湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(O. Fumitaka et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:215-224)。また、ES細胞は、3～4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
　ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
　ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
 (B) 精子幹細胞
　精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41～46頁,羊土社(東京、日本))。
 (C) 胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
 (D) 人工多能性幹細胞
　人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
　また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
　iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10～15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、2-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
　培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、2-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPS細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPS細胞を選択することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
 (E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
　nt ES細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47～52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
 (F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells（Muse細胞）
　Muse細胞は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
＜ドーパミン産生神経前駆細胞＞
　本発明において、ドーパミン産生神経前駆細胞とは、特に断りがなければ、ドーパミン産生神経細胞またはドーパミン作動性ニューロンなどを含むものとする。また、ドーパミン産生神経前駆細胞は、他の細胞種が含まれている細胞集団であってもよく、好ましくはセロトニン神経細胞を含まない細胞集団である。ドーパミン産生神経前駆細胞は、Foxa2Nurr1および/またはTH陽性細胞を含有する細胞集団であることが望ましい。本発明において、ヒトFoxa2としては、NCBIアクセッション番号NM_021784またはNM_153675で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が挙げられる。本発明において、ヒトNurr1としては、NCBIアクセッション番号NM_006186で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が挙げられる。本発明において、ヒトTHとしては、NCBIアクセッション番号NM_000360、NM_199292またはNM_199293で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が挙げられる。
＜細胞外基質＞
　本発明において、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリンおよびラミニンといった物質またはこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、BD Matrigel(商標)などの細胞からの調製物であってもよい。好ましくは、ラミニンまたはその断片である。本発明においてラミニンとは、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ1本ずつ持つヘテロ三量体構造を有するタンパク質であり、特に限定されないが、例えば、α鎖は、α１、α２、α３、α４またはα５であり、β鎖は、β１、β２またはβ３であり、ならびにγ鎖は、γ１、γ２またはγ３が例示される、より好ましくは、α５、β１およびγ１からなるラミニン511である。本発明では、ラミニンは断片であってもよく、インテグリン結合活性を有している断片であれば、特に限定されないが、例えば、エラスターゼにて消化して得られる断片であるE8フラグメントであってもよい。従って、本発明では、WO2011/043405に記載されたラミニン511E8（好ましくはヒトラミニン511E8）が例示される。
＜BMP阻害剤＞
　本発明において、BMP阻害剤とは、Chordin、Noggin、Follistatin、などのタンパク質性阻害剤、Dorsomorphin (すなわち、6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体 (P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびLDN193189（すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が例示される。DorsomorphinおよびLDN193189は市販されており、それぞれSigma-Aldrich社およびStemgent社から入手可能である。本発明で使用されるBMP阻害剤は、好ましくは、LDN193189であり得る。
　培養液中におけるLDN193189の濃度は、BMPを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、100nMである。
＜TGFβ阻害剤＞
　本発明において、TGFβ阻害剤とは、TGFβの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、またはALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質が挙げられ、例えば、Lefty-1（NCBI Accession No.として、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、 NPC30345、SD093、 SD908、SD208 (Scios)、LY2109761、LY364947、 LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A83-01(WO 2009146408) およびこれらの誘導体などが例示される。本発明で使用されるTGFβ阻害剤は、好ましくは、A83-01であり得る。
　培養液中におけるA83-01の濃度は、ALK5を阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、500nMから5μMであり、より好ましくは、500nMである。
＜SHHシグナル刺激剤＞
　本発明において、SHH（Sonic hedgehog）シグナル刺激剤とは、SHHが受容体であるPatched (Ptch1)に結合して引き起こされるSmoothened (Smo)の脱抑制およびさらに続くGli2の活性化を引き起こす物質として定義され、例えば、SHH、Hh-Ag1.5 (Li, X., e t al., Nature Biotechnology, 23, 215～ 221 (2005).)、Smoothened Agonist, SAG (N-Methyl-N’-(3-pyridinylbenzyl)-N’-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane)、20a-hydroxycholesterol、Purmorphamineおよびこれらの誘導体などが例示される（Stanton BZ, Peng LF., Mol Biosyst. 6:44-54, 2010）。本発明で使用されるSHHシグナル刺激剤は、好ましくは、Purmorphamineであり得る。
　培養液中におけるPurmorphamineの濃度は、Gli2を活性化する濃度であれば特に限定されないが、例えば、1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、2μMである。
＜GSK3β阻害剤＞
　本発明において、GSK3β阻害剤とは、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQpSP-NH2（配列番号１））および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。本発明で使用されるGSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
　培養液中におけるCHIR99021の濃度は、例えば、1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、1μMである。
＜FGF8＞
　本発明において、FGF8とは、特に限定されないが、ヒトFGF8の場合、FGF8a、FGF8b、FGF8eまたはFGF8fの4つのスプライシングフォームが例示され、本発明のより好ましくは、FGF8bである。FGF8は、例えばWako社やR&D systems社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
　培養液中におけるFGF8の濃度は、例えば、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、150 ng/mL、200ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、5000ng/mLであるがこれらに限定されない。好ましくは、100ng/mLである。
＜細胞を選択する方法＞
　本発明において、細胞集団よりCorin陽性細胞および/またはLrtm1陽性細胞を選択するために、CorinまたはLrtm1に特異的に結合する物質を用いて行うことができる。CorinまたはLrtm1に結合する物質は、抗体、アプタマーを用いることができ、好ましくは、抗体もしくはその抗原結合断片である。
　本発明において、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。これらの抗体は、当業者に周知の技術を用いて作成することが可能である（Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.12-11.13）。具体的には、抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌または哺乳類細胞株等で発現し精製したCorinまたはLrtm1がコードするタンパク質、部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドあるいは糖脂質を精製して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、上述の免疫された非ヒト動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel et al.(1987) Publish.John Wiley and Sons.Section 11.4-11.11）。抗体の抗原結合断片としては、抗体の一部(たとえばFab断片)または合成抗体断片(たとえば、一本鎖Fv断片「ScFv」)が例示される。FabおよびF(ab)2断片などの抗体の断片もまた、遺伝子工学的に周知の方法によって作製することができる。例えば、Corinに対する抗体はWO2004/065599、WO2006/009241に記載の作製法により、Lrtm1に対する抗体はWO2013/015457に記載の作製法により得ることができる。
　ヒトCorinは、NCBIのアクセッション番号NM_006587によりその配列を得ることができる。同様に、ヒトLrtm1は、NM_020678によりその配列を得ることができる。
　CorinまたはLrtm1を発現する細胞を認識または分離することを目的として、当該結合する物質は、例えば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素、ビオチンまたはストレプトアビジン等の検出可能な物質またはプロテインA、プロテインG、ビーズまたは磁気ビーズ等の単離抽出を可能とさせる物質と結合または接合されていてもよい。
　当該結合する物質はまた、間接的に標識してもよい。当業者に公知の様々な方法を使用して行い得るが、例えば、当該抗体に特異的に結合する予め標識された抗体（二次抗体）を用いる方法が挙げられる。
　ドーパミン産生神経前駆細胞を検出する方法として、フローサイトメーターまたはプロテインチップ等を用いることが含まれる。
　ドーパミン産生神経前駆細胞を抽出する方法には、当該結合する物質へ粒子を接合させ沈降させる方法、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法(例えば、MACS)、蛍光標識を用いてセルソーターを用いる方法、または抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等が例示される。
　本発明において、CorinまたはLrtm1に特異的に結合するアプタマーは、当業者に周知の技術を用いて作成することが可能である（SELEX（systematic evolution of ligand by exponential enrichment）法：Ellington, A.D. & Szostak, J.W.（1990）Nature,346,818-822., Tuerk, C. & Gold, L.（1990）Science,249,505-510.。）
＜神経栄養因子＞
　本発明において、神経栄養因子とは、運動ニューロンの生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、Nerve Growth Factor (NGF)、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)、Neurotrophin 3 (NT-3)、Neurotrophin 4/5 (NT-4/5)、Neurotrophin 6 (NT-6)、basic FGF、acidic FGF、FGF-5、Epidermal Growth Factor (EGF)、Hepatocyte Growth Factor (HGF)、Insulin、Insulin Like Growth Factor 1 (IGF 1)、Insulin Like Growth Factor 2 (IGF 2)、Glia cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF)、TGF-b2、TGF-b3、Interleukin 6 (IL-6)、Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF)およびLIFなどが挙げられる。本発明において好ましい神経栄養因子は、GDNF、およびBDNFから成るグループより選択される因子である。神経栄養因子は、例えばWako社やR&D systems社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
　培養液中におけるGDNF1の濃度は、例えば、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15 ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30 ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL、200ng/mL、500ng/mLであるがこれらに限定されない。好ましくは、10ng/mLである。
　培養液中におけるBDNF1の濃度は、例えば、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15 ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30 ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL、200ng/mL、500ng/mLであるがこれらに限定されない。好ましくは、20ng/mLである。
＜工程（i）＞
　本発明において、前記工程（i）は、次の多段階の工程によって行われることが望ましい；
（a）多能性幹細胞を細胞外基質上でBMP阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程、
（b）前記工程（a）で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤およびFGF8を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（c）前記工程（b）で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
（d）前記工程（c）で得られた細胞をBMP阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程。
　本発明において、工程（i）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、Glasgow's Minimal Essential Medium(GMEM)培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、GMEM培地である。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい培養液は、KSR、2-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸およびピルビン酸を含有するGMEM培地である。この培養液へ適宜BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤から成る群より選択される試薬を加えて培養することができる。
　工程（i）において、細胞外基質上にて接着培養するとは、細胞外基質によりコーティング処理された培養容器を用いて培養することによって行い得る。コーティング処理は、細胞外基質を含有する溶液を培養容器に入れた後、当該溶液を適宜除くことによって行い得る。
　培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　培養期間は、Corinおよび/またはLrtm1陽性細胞が出現する期間であれば、特に限定されないが、工程（i）は、少なくとも10日間行われることが望ましい。より好ましくは、12日間から21日間であり、さらに好ましくは、12日間から14日間である。
　また工程（i）内の工程（a）では、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、1日である。同様に、工程（b）では、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、2日である。同様に、工程（c）では、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、4日である。同様に、工程（d）では、1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、5日以上、6日以上、7日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、5日以上である。
　多能性幹細胞は、細胞を解離させて用いてもよく、細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase(商標)およびAccumax(商標)など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、トリプシンまたはその代替物（TrypLE CTS（Life Technologies）が例示される）を用いてヒト多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。細胞を解離させた場合、ROCK阻害剤を適宜、解離後に添加して培養することが望ましい。ROCK阻害剤を添加する場合、少なくとも1日間添加して培養すればよく、より好ましくは1日間である。
＜ROCK阻害剤＞
　本発明において、ROCK阻害剤とは、Rhoキナーゼ(ROCK)の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Y-27632（例えば、Ishizaki et al., Mol. Pharmacol. 57, 976-983 (2000)；Narumiya et al., Methods Enzymol. 325,273-284 (2000)参照）、Fasudil/HA1077（例えば、Uenata et al., Nature 389: 990-994 (1997)参照）、H-1152（例えば、Sasaki et al., Pharmacol. Ther. 93: 225-232 (2002)参照）、Wf-536（例えば、Nakajima et al., Cancer Chemother Pharmacol. 52(4): 319-324 (2003)参照）およびそれらの誘導体、ならびにROCKに対するアンチセンス核酸、RNA干渉誘導性核酸（例えば、siRNA）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ROCK阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第20050209261号、同第20050192304号、同第20040014755号、同第20040002508号、同第20040002507号、同第20030125344号、同第20030087919号、及び国際公開第2003/062227号、同第2003/059913号、同第2003/062225号、同第2002/076976号、同第2004/039796号参照）。本発明では、１種または２種以上のROCK阻害剤が使用され得る。本発明で使用されるROCK阻害剤は、好ましくは、Y-27632であり得る。
　Y-27632の濃度は、例えば、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μMであるがこれらに限定されない。好ましくは、10μMである。
＜工程（ii）＞
　(ii)のCorinおよび/またはLrtm1陽性細胞を収集する工程は、上述した＜細胞を選択する方法＞に基づいて行うことができる。
＜工程（iii）＞
　工程（iii）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、Glasgow's Minimal Essential Medium(GMEM)培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。好ましくは、Neurobasal Mediumである。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、核酸（例えば、Dibutyryl cyclic AMP（dbcAMP））などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい培養液は、B27サプリメント、アスコルビン酸およびdbcAMPを含有するNeurobasal Mediumである。この培養液へ適宜神経栄養因子を加えて培養することができる。
　工程（iii）における、浮遊培養とは、細胞を培養容器へ非接着の状態で培養することであり、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていない培養容器、若しくは、人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（poly-HEMA）、非イオン性の界面活性ポリオール（Pluronic F-127等）またはリン脂質類似構造物（例えば、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを構成単位とする水溶性ポリマー（Lipidure））によるコーティング処理した培養容器を使用して行うことができる。
　培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約30～40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2～5％である。
　培養期間は、Nurr1またはFoxa2陽性細胞が出現する期間であれば、特に限定されないが、工程（iii）は、少なくとも7日間行われることが望ましい。より好ましくは、7日間から30日間であり、さらに好ましくは、14日間から21日間、または14日間から１６日間であり、最も好ましくは、１６日間である。
　工程（ii）に続いて工程（iii）を行う場合、ROCK阻害剤を適宜添加して培養することが望ましい。ROCK阻害剤を添加する場合、少なくとも1日間添加して培養すればよく、より好ましくは1日間である。
＜パーキンソン病治療剤＞
　本発明で得られたドーパミン産生神経前駆細胞は、製剤としてパーキンソン病患者に投与することができる。得られたドーパミン産生神経前駆細胞を生理食塩水等に懸濁させ、患者の線条体領域に移植することによって行われる。従って、本発明では、上記の方法で多能性幹細胞より得られたドーパミン産生神経前駆細胞を含むパーキンソン病治療剤を提供する。
　本発明において、パーキンソン病治療剤に含まれるドーパミン産生神経前駆細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されないが、例えば、15×104個以上含まれ得る。また、症状や体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
　ドーパミン産生神経前駆細胞の疾患部位への移植は、例えば、Nature Neuroscience,2,1137(1999)もしくはN Engl J Med. ;344:710-9(2001)に記載されるような手法によって行うことができる。
＜キット＞
　本発明での他の実施態様において、多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を作製するキットが含まれる。当該キットには、上述したドーパミン産生神経前駆細胞を作製する各工程に使用する培養液、添加剤または培養容器等が含まれる。例えば、抗Corin抗体、抗Lrtm1抗体、BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8、GSK3β阻害剤、細胞外基質および神経栄養因子から成る群より選択される試薬が挙げられる。本キットには、さらに製造工程の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１
細胞および培養
　ヒトES細胞（KhES-1）は、京都大学再生医科学研究所より受領した（Suemori H, et al. Biochem Biophys Res Commun. 345:926-32, 2006）。ヒトiPS細胞である404C2および836B3は、Oct3/4、Sox2、Klf4、L-MYC、LIN28およびp53shRNAをヒト線維芽細胞にエピソーマルベクターにより導入して得られた細胞として京都大学の山中教授らより受領した (Okita ,et al, Nat Methods. 8:409-412, 2011)。
　ES細胞およびiPS細胞は、Miyazaki T et al., Nat Commun.3:1236, 2012に記載に準拠した方法で培養した。簡潔には、Laminin511E8でコーティングした6 well plateにて培養した。
　このように得られたES細胞およびiPS細胞をTrypLE CTS（Life Technologies）を用いて解離し、別途用意したLaminin511E8（iMatrix-511、Nippi）でコーティングした6 well plateに1wellあたり4×104個を移し、上記培養方法にて４日間培養後、コンフルエントになったことを確認して、培地を10μM Y-27632（WAKO）、0.1μM LDN193189（STEMGENT）および0.5μM A83-01（WAKO）を含有する基本培地A（8％KSR（Invitrogen）、1ｍM Sodium pyruvate（Invitrogen）、0.1mM MEM non essential amino acid（Invitrogen）および0.1ｍM 2-Mercaptoethanol（WAKO）を含有するGMEM（Invitrogen））に交換した。翌日(day1)、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM Purmorphamine（WAKO）および100ng/mL FGF8（WAKO）を含有する基本培地Aへ培地を交換した。2日後(day3)、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM Purmorphamine、100ng/mL FGF8および3μM CHIR99021（WAKO）を含有する基本培地Aへ培地を交換した。4日後(day7)、0.1μM LDN193189および3μM CHIR99021を含有する基本培地Aへ培地を交換した。以後、培地交換を1日に一度行った。また、上記のコーティング剤であるLaminin511E8を、マトリゲル（BD）、CELLstart（Invitrogen）、またはLaminin111E8に置き換えて同様の実験を１２日間行ったところ、いずれのコーティング剤を用いておこなってもPSA-NCAM陽性細胞、およびCorin陽性細胞が得られたが、Laminin511E8を用いた場合、未分化細胞（Tra-1-60陽性細胞）の残存が少なく、Corin陽性細胞の含有率が最も高かった（図２）。Laminin511E8コーティングによる接着培養を行うことで浮遊培養を行うよりも一度に多量の細胞を取り扱うことが可能となり、所望の細胞の含有率も高くなることが確認された。以後は、Laminin511E8をコーティング剤として用いた。
　抗Corin抗体は以下の方法で作製した。まず、カニクイザルCorin遺伝子のうち、細胞外領域の一部(79-453アミノ酸)をコードする遺伝子配列を293E細胞に導入して、Corinタンパク質の細胞外領域断片を発現させて回収した。回収したタンパク質をマウスに免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞とフュージョンさせた。フュージョンさせた細胞集団より、Corinに反応性を持つクローンを選択した。このクローンの培養上清を抗Corinモノクローナル抗体として用いた。
　0.1μM LDN193189および3μM CHIR99021を含有する基本培地Aでの培養から5日後(day12)、TrypLE CTSを用いて細胞を解離し、2％FBS、10μM Y-27632（WAKO）、20 mM D-glucoseおよび50μg/ml Penicillin/Streptomycinを含有するCa2+Mg2+-free HBSS（Invitrogen）へ懸濁させた。上記の抗Corin抗体を添加し、4℃で20分間インキュベートし、FACSAriaII (BD)をもちいてソーティングを行いCorin陽性細胞を回収した。
　回収したCorin陽性細胞をLipidure-coat 96 well plate（NOF Corporation）に20000個/wellにて移し、基本培地B（B27 Supplement without vitamin A（Invitrogen）、20ng/mL BDNF、 10ng/mL GDNF、200mM Ascorbic acidおよび0.4mM dbcAMP（Sigma）を添加したNeurobasal medium（Invitrogen））を用いて浮遊培養した。この時、最初の培地は、30μMのY-27632を添加した培地を用いたが、3日に一度、半量ずつ交換した際には、Y-27632を添加しない培地を用いた。ソーティングから16日後（day28）、または、さらに14日間浮遊培養を継続した（day42）細胞が移植に適しているか検討をおこなった。この時、培地は、3日に一度、半量ずつ交換した。以上の培養方法のスキームを図１に示した。
　一方、対照としてday12においてCorinによるソーティングを行なわずに同様に浮遊培養を行った。
ソーティングの日程の検討
　上記の方法でiPS細胞（836B3）から得られた各分化誘導時期の細胞の様子を図３に示した。また、day12にてソーティングを行わず、day28に得られた細胞塊をPoly-L-ornithine、FibronectinおよびLaminin-coatディッシュへ移し、基本培地Bにて培養を14日間継続した場合（day42）のCorin、ポリシアル化(PSA)-NCAMおよびTra-1-60の各陽性細胞の含有率を図４に示した。本分化誘導方法では、day7から神経細胞マーカーであるPSA-NCAM陽性細胞の含有率が増加し、day12あたりで大多数を占めた。フロアプレートマーカーであるCorin陽性細胞は、day10で現れ、day21から28にピークとなった。この傾向は、404C2を用いても同じであった。従って、Corin陽性細胞をソーティングして得るためには、day10以降で行うことが好ましいことが示唆された。
　続いて、day12までのOct4、Nanog、Sox1、Sox17、Brachyury、hGSCなどの発現を定量PCRにて測定し、経時変化を図５Ａに示した。SOX1は早期より発現し、以後その発現を維持することが確認された。未分化マーカーであるOct4やNanogはその発現が減少することが確認された。中胚葉マーカーであるBrachyuryは、一過的に発現が増加した後、減少した。内胚葉マーカーであるSOX17は、低発現のままであった。一方、day12にてソーティングを行わず、day28に得られた細胞塊をPoly-L-ornithine、FibronectinおよびLaminin-coatディッシュへ移し、基本培地Bにて培養を14日間継続した場合（day42）の、Oct4、Map2ab、Lmx1a、En1、Nurr1、THおよびFoxa2の発現を測定し、経時変化を図５Ｂに示した。上記のうちTH以外のマーカーは、day12にてその発現量がほぼプラトーに達していることが確認された。この傾向は、404C2を用いた場合でも同じであった。
　ソーティングしない場合のday42の細胞を、TH（ドーパミン産生神経細胞マーカー）、Foxa2およびNurr1（いずれも中脳マーカー）に対して免疫染色を行ったところ、40％がTH陽性であり、Foxa2およびNurr1と共発現していた。また、TH陽性細胞は、他のドーパミン産生神経細胞マーカーであるAADC、Pitx3およびGirk2も共発現していることが確認された（図６）。
Corinを指標としたソーティングの効果
　上述のとおりday12でのソーティング直後の細胞における、各マーカー遺伝子の発現をPCRにより測定した（図７Ａ）。その結果、day12-Corin陽性細胞では、ソーティングしなかった細胞と比較してCorinはもちろんのこと、中脳マーカーのLmx1aおよびEn1、ならびにフロアプレートマーカーのFoxa2が高いことが確認された。一方、後脳マーカーのGbx2および前脳マーカーのSix3はソーティングしなかった細胞と比較して低いことが確認された。同様の傾向が、404C2についても確認された。day12にてソートをした場合としなかった場合について、網羅的発現解析により比較したところ、吻側マーカーのPax6、尾側マーカーのFoxa2、早期神経マーカーのNeurog2、分裂終了神経細胞マーカーのNEFM（図に示さず）および非神経細胞マーカーのDLK1およびCYP1B1がソートしない細胞で発現が高いことが確認された（図７Ｂ）。さらに、免疫染色をおこなったところ、Corin陽性細胞において、Lmx1aおよびFoxa2の共陽性細胞の含有率が高くなっていることが確認された（図８ＡおよびＢ：75.52±8.255% vs. 47.37±6.624%）。一方、中脳/後脳境界の吻側で発現しているOtx2陽性およびLmx1a陰性細胞はソートした細胞で減少していることが確認された（図８C）。Oct4およびNanogの未分化マーカーについては大きな違いは見られなかった（図８D）。
　続いて、day21にてソーティング直後の細胞において同様の検討を行ったところ、day21でのソーティングの方が、Corin陽性細胞の含有率は高かったが（45.47±47.61％ (day21) vs. 18.97±15.49% (day12)）、Lmx1aおよびFoxa2の発現量は、day21のソーティングによって変化が見られなかった（図９Ａ）。同様に、免疫染色においても、day21のソーティングによるCorin陽性細胞におけるLmx1aおよびFoxa2の共陽性細胞の含有率は、ソーティングしなかった細胞群と比較して有意差は見られなかった（図９ＢおよびＣ）。
　以上より、day21と比較して、day12でのソーティングが好ましいことが確認された。
ソーティング後の培養期間について
　上述した培養方法を用いて誘導したday28およびday42における細胞について、day12でのCorin陽性細胞のソーティングの有無によるドーパミン産生神経細胞の成熟化度について検討した。Corin陽性細胞は、ソーティングをしなかった細胞と比較して、sphereの大きさがday28およびday42で小さいことが確認された（図１０ＡおよびＢ）。day28とday42において免疫染色をおこなったところ、いずれの場合でも、day12ソーティング後においてFoxa2陽性細胞が70から75％の含有率であり、ソーティングしない場合に比べて高かった（図１１ＡおよびＢ）。day28において、Nurr1陽性細胞およびTH陽性細胞はそれぞれ27.34±5.511％および2.098±1.243％であり、day42においては、19.91±6.966％および42.04±4.481％であり、TH陽性細胞の含有率はday42においてday21に比較して高くなっていた。さらに、day42において、高塩化カリウム刺激による培地に放出されるドーパミン（DA）、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸（DOPAC）およびセロトニン（5－HT）をHPLCを用いて定量したところ、Corinソーティングを行わなかった場合と比較して、Corinソーティングを行った細胞ではDAおよびDOPACの放出量が有意に多いことが確認された（図１１Ｃ）。
　続いて、day12でCorinソーティングを行った細胞または行わなかった細胞を浮遊培養しday28またはday42にて、それぞれ4×105個を2μl（生理食塩水）に懸濁させ、パーキンソン病モデルラット（6-OHDA投与ラット）の大脳の線条体に22ゲージの注射針を用いて投与し、16週後の移植片の様子を観察した（図１２Ａ）。まず、day28細胞を用いた場合の移植片の大きさを測定したところ、Corin陽性細胞のソーティングを行った細胞では移植片の大きさがほぼ一定（8.5～1.5mm3）であったが（図１２Ｂ）、Corinソーティングを行わなかった場合、88.4～0.5mm3とばらつきが大きいことが確認され、平均値では、34.96±37.52mm3 (ソーティング無)と3.45±2.932mm3 (ソーティング有)と有意差が見られた（図１２Ｂ）。さらに、day12でCorinソーティングを行った細胞または行わなかった細胞を浮遊培養し７日目（day19）に同様にパーキンソン病モデルラットへ投与したところ、ソーティング群にて有意に移植片の大きさが小さくなった（図１２Ｄ）。また、移植片におけるKi67陽性細胞の割合を定量したところ、ソーティングの有無にかかわらず、1％以下と低い値であったが、Corinソーティングを行った細胞では有意に割合が低いことが確認された（図１２Ｅ）。一方、day42では、ソーティングの有無にかかわらず、移植片の大きさは1mm3以下であり（図１２Ｃ）、Ki67陽性細胞は確認されなかった。
　続いて、左右のドーパミン濃度の不均衡によって起きるアンフェタミン誘導による旋回を検討したところ、day12においてCorin陽性細胞をソーティングした細胞(day28)およびソーティングしなかった細胞（day28）を投与した群は共に、細胞を投与しなかった群（mediumのみ）と比較して、有意に旋回数が減少した。また、細胞投与後16週目では、ソーティングの有無による行動の変化に差はなかった（図１３Ａ）。ここで、移植片におけるTH陽性細胞を観察したところ、Corinソーティングした細胞を移植した場合の方が有意にTH陽性細胞が残存していることが確認された（図１３ＢおよびＣ、6747±2341 cells/graft (ソーティング有) vs. 3436±2384 cells/graft (ソーティング無)）。このときNeuN陽性細胞数（全神経細胞）あたりのTH陽性細胞数、またはhNc陽性細胞数（全生存細胞）あたりのTH陽性細胞数も同様にソーティングした場合において有意に高かった（図１４ＡまたはＢ）。さらに、他のドーパミン産生細胞マーカー（Foxa2、Nurr1およびPitx3）も共発現していることが確認された。黒質緻密部のA9ドーパミン産生細胞のマーカーであるGirk2もまた約半数が共陽性であった（図１４Ｃ）。また、セロトニン細胞の数について観察したところ、いずれの場合においても含有率が低かった（図１５ＡおよびＢ）。
　一方、同様にday12においてCorin陽性細胞をソーティングしたおよびソーティングしなかった細胞（day42）を投与したところ、異常旋回の改善に対してソーティングの有無による有意差は見られなかった（図１３Ｄ）。さらに、移植片におけるTH陽性細胞の数と濃度においても同様に有意差が見られなかった（図１３EおよびF）。これらの結果と相関して、生存したTH陽性細胞の平均値は、day28移植で6747±2341 cells/graft（図１３Ｂ）に対して、day42移植では1431±753.7 cells/graft（図１３Ｅ）とday28において生着細胞数が多い傾向が見られた。
　続いて、マイクロアレイ解析により、day12ソーティングday28の細胞とソーティングなしday28の細胞、およびday12ソーティングday28の細胞とday12ソーティングday42の細胞をそれぞれ比較した（図１６Ａ）。day28の細胞において、ソーティングを行わない場合、前脳マーカーであるPAX6の発現が高いことが確認された。一方、ソーティングした場合においてALCAMの発現が高いことが確認された。続いて、day28とday42の細胞との比較では、day28の細胞において、SHH、WNT5AおよびCORINの発現が高いことが確認された。一方、THはday42の細胞で発現が高いことが確認された。
　さらに、これまでパーキンソン病に対して臨床使用されている胎児腹側中脳細胞（７週齢）とCorin陽性細胞をday12でソーティングしたday28およびday42の細胞を比較した。ドーパミン産生神経細胞のマーカーであるTHおよびPITX3（図に示さず）は、day28の細胞と比較して胎児腹側中脳細胞において高発現していた。セロトニン作動性神経細胞のマーカーであるTPH2もまた胎児腹側中脳細胞で高発現していた（図１６Ｂ）。階層クラスター解析をおこなったところ、胎児中脳細胞は、day42の細胞により近似していることが確認された（図１６Ｃ）。day28の細胞は、軸索誘導に関連する遺伝子（SPON1およびSLIT2）が発現していることから、胎児腹側中脳細胞より早期の発生段階の細胞であることが示唆されている。
　以上の結果より、Corin陽性細胞を選択した後、16日間浮遊培養した細胞（day28）を用いることで移植片の増殖やドーパミン産生細胞の生着を増加させることが可能であり、パーキンソン病の治療のために使用する細胞として適していることが示唆された。
実施例２
細胞培養
　ES細胞（Kh-ES1）をTrypLE CTS（Life Technologies）を用いて解離し、別途用意したLaminin511E8でコーティングした6 well plateに全量を移し、10μM Y-27632、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01を含有する基本培地A（8％KSR、1ｍM Sodium pyruvate、0.1mM MEM non-essential amino acidおよび0.1ｍM 2-Mercaptoethanolを含有するGMEM）で培養した。培養開始1日後（day1）、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM Purmorphamineおよび100ng/mL FGF8を含有する基本培地Aへ培地を交換した。培養開始3日後（day3）、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM Purmorphamine、100ng/mL FGF8および3μM CHIR99021を含有する基本培地Aへ培地を交換した。培養開始7日後（day7）、0.1μM LDN193189、および3μM CHIR99021を含有する基本培地Aへ培地を交換した。day12（培養開始12日後）、B27 Supplement without vitamin A、2mM L-Glutamine、20ng/mLリコンビナントヒト（rh）BDNF、10ng/mL rhGDNF、400μM dbcAMP(Sigma)および200μM Ascorbic acidを添加したNeurobasal medium（Invitrogen）へ培地を交換した。指定がない限り培地交換は前日の組成で毎日行った。
　day14（培養開始14日後）、TrypLE CTSを用いて細胞を解離し、抗Lrtm1抗体（WO2013/015457）を用いてFACSによりソーティングを行いLrtm1陽性細胞を回収した。
　回収したLrtm1陽性細胞をLipidure-coat 96 well plate（Thermo）に20000個/wellにて移し、30μM Y-27632、B27 Supplement without vitamin A、2mM L-Glutamine、20ng/mLリコンビナントヒト（rh）BDNF、10ng/mL rhGDNF、400μM dbcAMP、1% KSR、Penicillin/Streptomycin(Gibco)および200μM Ascorbic acidを添加したNeurobasal mediumを用いて浮遊培養した。その後、培地は、3日に一度、半量ずつY-27632を含まない培地へ交換した。ソーティングから7日後（day21）または21日後（day35）に各種実験に用いた。
Lrtm1を指標としたソーティングの効果（免疫染色）
　day21における免疫染色により細胞を調べたところ、Foxa2陽性細胞は87.4%、Lmx1a陽性細胞は87.5%、Foxa2およびLmx1a陽性細胞は82.7%であった（図１７Ａ）。一方、day35におけるソーティングの有無により比較したところ、Foxa2、Nurr1およびTH陽性細胞はLrtm1によりソーティングすることでその含有率が高くなった（図１７Ｂ）。
Lrtm1を指標としたソーティングの効果（細胞移植）
　Lrtm1によるソーティングの翌日（day15）に、10週齢SDラットの脳内へ10～15×104cells/tractを投与し、4週後において観察した。移植細胞由来（ヒト由来）のFoxa2、TH、Nurr1陽性細胞の生着が確認できた（図１８）。
実施例３
細胞培養
　ES細胞（Kh-ES1）をTrypLE CTS（Life Technologies）を用いて解離し、別途用意したLaminin511E8でコーティングした6 well plateに4×105個を移し、10μM Y-27632を含有するStemFit培地（Ajinomoto）で培養した。4日後、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01を含有する上述の基本培地Aへ培地を交換した（day0）。培養開始1日後（day1）、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM Purmorphamineおよび100ng/mL FGF8を含有する基本培地Aへ培地を交換した。培養開始3日後（day3）、0.1μM LDN193189、0.5μM A83-01、2μM Purmorphamine、100ng/mL FGF8および3μM CHIR99021を含有する基本培地Aへ培地を交換した。培養開始7日後（day7）、0.1μM LDN193189、および3μM CHIR99021を含有する基本培地Aへ培地を交換した。day14（培養開始14日後）にソーティングまたは、B27 Supplement without vitamin A、2mM L-Glutamine、20ng/mLリコンビナントヒト（rh）BDNF、 10ng/mL rhGDNF、400μM dbcAMP(Sigma)および200μM Ascorbic acidを添加したNeurobasal medium（Invitrogen）へ培地を交換した。指定がない限り培地交換は前日の組成で毎日行った。
ソーティング
　上記の方法で培養し、day14（培養開始14日後）またはday21（培養開始21日後）にて、TrypLE CTSを用いて細胞を解離し、抗Lrtm1抗体（WO2013/015457）を用いてFACSによりソーティングを行いLrtm1陽性細胞を回収した。
　回収したLrtm1陽性細胞をLipidure-coat 96 well plate（Thermo）に2×104個/wellにて移し、30μM Y-27632、B27 Supplement without vitamin A、2mM L-Glutamine、20ng/mLリコンビナントヒト（rh）BDNF、10ng/mL rhGDNF、400μM dbcAMP、1% KSR、Penicillin/Streptomycin(Gibco)および200μM Ascorbic acidを添加したNeurobasal mediumを用いて浮遊培養した。その後、培地は、3日に一度、半量ずつY-27632を含まない培地へ交換した。ソーティングから7日後または14日後に各種実験に用いた。
Lrtm1を指標としたソーティングの効果（免疫染色）
　14 day-7 day（14日目にソーティングで、7日間培養）、14 day-14 day（14日目にソーティングで、14日間培養）および21 day-7 day（21日目にソーティングで、7日間培養）において免疫染色（Foxa2、Nurr1、TH）により細胞を調べたところ、Foxa2陽性細胞の含有率はいずれの条件においても90％以上確認されたが、Nurr1およびTH陽性細胞含有率は、14 day-7 day、14 day-14 day、および21 day-7 dayでそれぞれ、13.1％、24.0％および10.2％であった（図１９）。従って、14 day-14 dayにてFoxa2、Nurr1およびTH陽性細胞の含有率が最も高かった。
　以上の結果、ソーティングの時期は、分化誘導開始21日目より14日目の方が良く、ソーティング後の培養期間は、7日間よりも14日間の方が良いことが示された。
　本発明は、再生医療、特にパーキンソン病の治療に有用である。

Claims (16)

  1. 次の工程を含む多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を製造する方法：
    （i）多能性幹細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤から成る群より選択される試薬を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
    （ii）前記工程(i)で得られた細胞からCorinに結合する物質および/またはLrtm1に結合する物質を用いてCorinおよび／またはLrtm1陽性細胞を収集する工程、および
    （iii）前記工程（ii）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培養液中で浮遊培養する工程。
  2. 前記工程（i）が次の工程を含む、請求項１に記載の方法；
    （a）多能性幹細胞を細胞外基質上でBMP阻害剤およびTGFβ阻害剤を含む培養液中で接着培養する工程、
    （b）前記工程（a）で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤およびFGF8を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、
    （c）前記工程（b）で得られた細胞をBMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8およびGSK3β阻害剤を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程、および
    （d）前記工程（c）で得られた細胞をBMP阻害剤およびGSK3β阻害剤を含む培養液中で細胞外基質上にて接着培養する工程。
  3. 前記神経栄養因子が、BDNFおよびGDNFである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記工程（iii）で用いる培養液が、B27サプリメント、アスコルビン酸およびDibutyryl cyclic AMPをさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記工程（i）が、少なくとも10日間行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記工程（i）が、12日間から21日間行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記工程（iii）が、少なくとも7日間行われる、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記工程（iii）が、14日間から30日間行われる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記細胞外基質が、ラミニンまたはその断片である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記細胞外基質が、ラミニン511E8である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. Corinに結合する物質またはLrtm1に結合する物質が、CorinまたはLrtm1に結合する抗体またはアプタマーである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法で得られる、ドーパミン産生神経前駆細胞。
  13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法で得られるドーパミン産生神経前駆細胞を含む、パーキンソン病治療剤。
  14. BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、SHHシグナル刺激剤、FGF8、GSK3β阻害剤、細胞外基質および神経栄養因子を含む、多能性幹細胞からドーパミン産生神経前駆細胞を作製するためのキット。
  15. 抗Corin抗体および/または抗Lrtm1抗体をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
  16. BMP阻害剤がLDN193189であり、TGFβ阻害剤がA83-01であり、SHHシグナル刺激剤がPurmorphamineであり、GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、細胞外基質がラミニン511E8であり、神経栄養因子がBDNFおよびGDNFである、請求項１４または１５に記載のキット。
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EP14841854.4A EP3042951B1 (en) 2013-09-05 2014-09-04 New method for inducing dopamine-producing neural precursor cells
CA2923592A CA2923592A1 (en) 2013-09-05 2014-09-04 Method for inducing dopamine-producing neural precursor cells from pluripotent stem cells
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KR1020167006591A KR102320537B1 (ko) 2013-09-05 2014-09-04 신규 도파민 생산 신경 전구 세포의 유도 방법
US14/916,696 US11473058B2 (en) 2013-09-05 2014-09-04 Method for inducing dopaminergic neuron progenitor cells
MYPI2016700764A MY184219A (en) 2013-09-05 2014-09-04 New method for inducing dopamine-producing neural precursor cells
SG11201601720RA SG11201601720RA (en) 2013-09-05 2014-09-04 New method for inducing dopamine-producing neural precursor cells
CN201480059803.2A CN105849255A (zh) 2013-09-05 2014-09-04 新的产多巴胺神经前体细胞诱导方法
ES14841854T ES2721440T3 (es) 2013-09-05 2014-09-04 Nuevo método para inducir células precursoras neurales productoras de dopamina
JP2015535520A JP6558580B2 (ja) 2013-09-05 2014-09-04 新規ドーパミン産生神経前駆細胞の誘導方法
US17/824,603 US20230114089A1 (en) 2013-09-05 2022-05-25 Method for inducing dopaminergic neuron progenitor cells

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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016196661A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
WO2016162747A3 (en) * 2015-04-09 2017-01-05 Biolamina Ab Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases
JP2017023019A (ja) * 2015-07-17 2017-02-02 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法
CN106479980A (zh) * 2016-07-04 2017-03-08 上海爱萨尔生物科技有限公司 神经干细胞培养液及培养方法
WO2017183736A1 (ja) 2016-04-22 2017-10-26 国立大学法人京都大学 ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法
WO2019160148A1 (ja) 2018-02-19 2019-08-22 大日本住友製薬株式会社 細胞凝集体、細胞凝集体の混合物及びそれらの製造方法
EP3438251A4 (en) * 2016-03-31 2020-02-26 Keio University SPECIFIC PLURIPOTENT STEM CELL STIMULATED BY DIFFERENTIATION
WO2021100829A1 (ja) 2019-11-20 2021-05-27 大日本住友製薬株式会社 神経系細胞の凍結方法
WO2021100830A1 (ja) 2019-11-20 2021-05-27 大日本住友製薬株式会社 細胞凝集体の凍結方法
WO2023153464A1 (ja) * 2022-02-09 2023-08-17 住友ファーマ株式会社 多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法
EP4241777A4 (en) * 2020-11-06 2024-08-21 Sbiomedics PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF A DEGENERATIVE BRAIN DISEASE, COMPRISING NEURAL PRECURSOR CELLS DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8642334B2 (en) 2009-02-17 2014-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
CN104379731A (zh) 2011-11-04 2015-02-25 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于植入的中脑多巴胺(da)神经元
EP3498824A1 (en) 2013-04-26 2019-06-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
US11959103B2 (en) 2016-11-11 2024-04-16 Osaka University Method for inducing pluripotent stem cells to differentiate into somatic cells
JPWO2018193949A1 (ja) * 2017-04-19 2020-02-27 国立大学法人名古屋大学 ドパミン神経細胞の調製方法
CN114606188A (zh) * 2019-03-06 2022-06-10 安徽中盛溯源生物科技有限公司 一种中脑多巴胺能神经前体细胞的制备方法及其应用
US20220135942A1 (en) * 2019-03-29 2022-05-05 Nagasaki University Cultured tissue and method for producing same
CN110872576A (zh) * 2019-06-06 2020-03-10 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种将小鼠成纤维细胞转分化为多巴胺能神经元的方法
WO2021042027A1 (en) * 2019-08-29 2021-03-04 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of generating and isolating midbrain dopamine neurons
AU2020350408A1 (en) * 2019-09-20 2022-04-07 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Production method for induced dopaminergic neuronal progenitors, using direct reprogramming
KR102392133B1 (ko) 2019-09-25 2022-04-29 (주) 에스바이오메딕스 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포 분화 유도 방법
WO2021060637A1 (ko) * 2019-09-25 2021-04-01 (주) 에스바이오메딕스 줄기세포로부터 도파민 신경전구세포 분화 유도 방법
CN112852735A (zh) * 2019-11-12 2021-05-28 光武惠文生物科技(北京)有限公司 诱导诱导性多能干细胞分化成神经前体细胞的方法
AU2021209068B2 (en) * 2020-01-13 2024-09-19 Aspen Neuroscience, Inc. Method of differentiating neural cells and related compositions and methods of use
WO2021216622A1 (en) * 2020-04-21 2021-10-28 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of gba1 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
US20230165909A1 (en) * 2020-04-21 2023-06-01 Aspen Neuroscience, Inc. Gene editing of lrrk2 in stem cells and method of use of cells differentiated therefrom
BR112022022161A2 (pt) * 2020-05-01 2022-12-13 Univ Indiana Trustees Nanotransfecção de tecido neurogênico no manejo de polineuropatia diabética cutânea
WO2022037570A1 (zh) * 2020-08-17 2022-02-24 中国科学院动物研究所 一种神经类细胞的扩增培养基及培养方法
KR20220126211A (ko) 2021-03-07 2022-09-15 석 영 정 하이브리드 전력 연계 시스템
CN113789301B (zh) * 2021-08-27 2022-05-10 广州瑞臻再生医学科技有限公司 一种制备高纯度的诱导性多能干细胞来源的人脑多巴胺能神经元的方法
WO2024113351A1 (en) * 2022-12-02 2024-06-06 Nuwacell Biotechnologies Co., Ltd. Culture medium, coating matrix and method for maturing midbrain dopaminergic progenitor cells
WO2024174996A1 (zh) * 2023-02-21 2024-08-29 士泽生物医药（苏州）有限公司 一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元的试剂盒及其应用

Citations (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
WO2002076976A2 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20030087919A1 (en) 2001-03-23 2003-05-08 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
WO2003059913A1 (en) 2002-01-10 2003-07-24 Bayer Healthcare Ag Roh-kinase inhibitors
WO2003062225A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyrimidine derivatives as rho-kinase inhibitors
WO2003062227A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Rho-kinase inhibitors
WO2004039796A1 (de) 2002-10-28 2004-05-13 Bayer Healthcare Ag Heteroaryloxy-substituierte phenylaminopyrimidine als rho-kinaseinhibitoren
WO2004065599A1 (ja) 2003-01-24 2004-08-05 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー
WO2005052190A1 (ja) 2003-11-26 2005-06-09 Eisai Co., Ltd. ドーパミン産生ニューロン特異的マーカーLmx1a
WO2006009241A1 (ja) 2004-07-22 2006-01-26 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー
JP2006521807A (ja) * 2003-03-12 2006-09-28 リライアンス ライフ サンエンシーズ ピーヴィーティー． リミテッド ヒト胚幹細胞由来の最終分化ドーパミン作動性神経細胞の誘導
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2007119759A1 (ja) 2006-04-11 2007-10-25 Eisai R & D Management Co., Ltd. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５
WO2008118820A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009032194A1 (en) 2007-08-31 2009-03-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009058413A1 (en) 2007-10-29 2009-05-07 Shi-Lung Lin Generation of human embryonic stem-like cells using intronic rna
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009075119A1 (ja) 2007-12-10 2009-06-18 Kyoto University 効率的な核初期化方法
WO2009079007A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
WO2009091659A2 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant rna agents
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
WO2009101084A1 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009123349A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 オリエンタル酵母工業株式会社 多能性幹細胞を増殖させる方法
WO2009126250A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through rna interference
WO2009146408A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Summa Health Systems Llc Methods for using tgf-b receptor inhibitors or activin-like kinase (alk) 5 inhibitors a-83-01 and sb-431542 to treat eye disease and wound healing conditions
WO2009157593A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010009015A2 (en) 2008-07-14 2010-01-21 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
WO2010008054A1 (ja) 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
WO2010013845A1 (en) 2008-07-30 2010-02-04 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010033906A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2010056831A2 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
WO2010098419A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010111422A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010137746A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells and method for culturing the same
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
WO2011007900A1 (ja) 2009-07-15 2011-01-20 Dezawa Mari 生体組織から単離できる多能性幹細胞
WO2011043405A1 (ja) 2009-10-08 2011-04-14 国立大学法人大阪大学 ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用
WO2013015457A1 (en) 2011-07-27 2013-01-31 Kyoto University Novel markers for dopaminergic neuron progenitor cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020009743A1 (en) * 2000-05-17 2002-01-24 Carpenter Melissa K. Neural progenitor cell populations
BRPI0408733A (pt) 2003-03-12 2006-03-07 Reliance Life Sciences Pvt Ltd derivação de neurÈnios dopaminérgicos terminalmente diferenciados de células tronco embriÈnicas humanas
KR101168053B1 (ko) * 2009-11-06 2012-07-24 연세대학교 산학협력단 효율적이고 보편적인 전분화능 줄기세포의 신경세포 분화 유도방법
KR20120093407A (ko) * 2009-12-02 2012-08-22 리서치 디벨럽먼트 파운데이션 제한된 분화력을 가진 줄기세포 클론의 선별
WO2012162124A1 (en) * 2011-05-20 2012-11-29 The Mclean Hospital Corporation Neuronal progenitor cells and uses
KR101331034B1 (ko) * 2011-06-09 2013-11-19 연세대학교 산학협력단 미분화 줄기세포로부터 중뇌특이적 도파민 신경세포의 제조 방법

Patent Citations (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
WO2002076976A2 (en) 2001-03-23 2002-10-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20030087919A1 (en) 2001-03-23 2003-05-08 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20030125344A1 (en) 2001-03-23 2003-07-03 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
WO2003059913A1 (en) 2002-01-10 2003-07-24 Bayer Healthcare Ag Roh-kinase inhibitors
US20040014755A1 (en) 2002-01-10 2004-01-22 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
WO2003062225A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyrimidine derivatives as rho-kinase inhibitors
WO2003062227A1 (en) 2002-01-23 2003-07-31 Bayer Pharmaceuticals Corporation Rho-kinase inhibitors
US20040002508A1 (en) 2002-01-23 2004-01-01 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20040002507A1 (en) 2002-01-23 2004-01-01 Bayer Corporation Rho-kinase inhibitors
US20050192304A1 (en) 2002-01-23 2005-09-01 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
US20050209261A1 (en) 2002-01-23 2005-09-22 Dhanapalan Nagarathnam Rho-kinase inhibitors
WO2004039796A1 (de) 2002-10-28 2004-05-13 Bayer Healthcare Ag Heteroaryloxy-substituierte phenylaminopyrimidine als rho-kinaseinhibitoren
WO2004065599A1 (ja) 2003-01-24 2004-08-05 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞マーカー
JP2006521807A (ja) * 2003-03-12 2006-09-28 リライアンス ライフ サンエンシーズ ピーヴィーティー． リミテッド ヒト胚幹細胞由来の最終分化ドーパミン作動性神経細胞の誘導
WO2005052190A1 (ja) 2003-11-26 2005-06-09 Eisai Co., Ltd. ドーパミン産生ニューロン特異的マーカーLmx1a
WO2006009241A1 (ja) 2004-07-22 2006-01-26 Eisai Co., Ltd. Lrp4/Corinドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
WO2007119759A1 (ja) 2006-04-11 2007-10-25 Eisai R & D Management Co., Ltd. ドーパミン産生ニューロン前駆細胞マーカー１８７ａ５
WO2008118820A2 (en) 2007-03-23 2008-10-02 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009032194A1 (en) 2007-08-31 2009-03-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Wnt pathway stimulation in reprogramming somatic cells
WO2009058413A1 (en) 2007-10-29 2009-05-07 Shi-Lung Lin Generation of human embryonic stem-like cells using intronic rna
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
WO2009075119A1 (ja) 2007-12-10 2009-06-18 Kyoto University 効率的な核初期化方法
WO2009079007A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
WO2009091659A2 (en) 2008-01-16 2009-07-23 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant rna agents
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
WO2009101084A1 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2009117439A2 (en) 2008-03-17 2009-09-24 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
WO2009123349A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 オリエンタル酵母工業株式会社 多能性幹細胞を増殖させる方法
WO2009126250A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through rna interference
WO2009126655A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of a small molecule modulator
WO2009126251A2 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2009146408A1 (en) 2008-05-30 2009-12-03 Summa Health Systems Llc Methods for using tgf-b receptor inhibitors or activin-like kinase (alk) 5 inhibitors a-83-01 and sb-431542 to treat eye disease and wound healing conditions
WO2009157593A1 (en) 2008-06-27 2009-12-30 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010009015A2 (en) 2008-07-14 2010-01-21 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
WO2010008054A1 (ja) 2008-07-16 2010-01-21 ディナベック株式会社 染色体非組み込み型ウイルスベクターを用いてリプログラムされた細胞を製造する方法
WO2010013845A1 (en) 2008-07-30 2010-02-04 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010033906A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
WO2010056831A2 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
WO2010098419A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Kyoto University Novel nuclear reprogramming substance
WO2010102267A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Ipierian, Inc. Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
WO2010111409A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Pluripotent stem cells
WO2010111422A2 (en) 2009-03-25 2010-09-30 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010137746A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells and method for culturing the same
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
WO2011007900A1 (ja) 2009-07-15 2011-01-20 Dezawa Mari 生体組織から単離できる多能性幹細胞
WO2011043405A1 (ja) 2009-10-08 2011-04-14 国立大学法人大阪大学 ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用
WO2013015457A1 (en) 2011-07-27 2013-01-31 Kyoto University Novel markers for dopaminergic neuron progenitor cells

Non-Patent Citations (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Current protocols in Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY AND SONS
"Molecular Biology", 1987, JOHN WILEY AND SONS
CELL, vol. 126, 2006, pages 663 - 676
CELL, vol. 131, 2007, pages 861 - 872
DOI D. ET AL.: "Isolation of human induced pluripotent stem cell -derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation", STEM CELL REPORTS, vol. 2, no. 3, 11 March 2014 (2014-03-11), pages 337 - 350, XP055155184 *
E. KROON ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 443 - 452
ELLINGTON, A.D.; SZOSTAK, J. W., NATURE, vol. 346, 1990, pages 818 - 822
EMINLI S ET AL., STEM CELLS, vol. 26, 2008, pages 2467 - 2474
FENG B ET AL., NAT CELL BIOL., vol. 11, 2009, pages 197 - 203
H. KAWASAKI ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 99, 2002, pages 1580 - 1585
H. SUEMORI ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 345, 2006, pages 926 - 932
H. SUEMORI ET AL., DEV. DYN., vol. 222, 2001, pages 273 - 279
HAN J ET AL., NATURE, vol. 463, 2010, pages 1096 - 100
HENG JC ET AL., CELL STEM CELL, vol. 6, 2010, pages 167 - 74
HUANGFU D ET AL., NAT BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 1269 - 1275
HUANGFU D ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 795 - 797
HWANG D.Y. ET AL.: "Human ES and iPS cells as cell sources for the treatment of Parkinson's disease: current state and problems", J. CELL . BIOCHEM., vol. 109, no. 2, pages 292 - 301, XP055314363 *
ICHIDA JK ET AL., CELL STEM CELL, vol. 5, 2009, pages 491 - 503
ISHIZAKI ET AL., MOL. PHARMACOL., vol. 57, 2000, pages 976 - 983
J. A. THOMSON ET AL., BIOL. REPROD., vol. 55, 1996, pages 254 - 259
J. A. THOMSON ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 92, 1995, pages 7844 - 7848
J. A. THOMSON ET AL., SCIENCE, vol. 282, 1998, pages 1145 - 1147
J. A. THOMSON; V. S. MARSHALL, CURR. TOP. DEV. BIOL., vol. 38, 1998, pages 133 - 165
J. BYRNE ET AL., NATURE, vol. 450, 2007, pages 497 - 502
J. HAO ET AL., PLOS ONE, vol. 3, no. 8, 2008, pages E2904
J. L. RESNICK ET AL., NATURE, vol. 359, 1992, pages 550 - 551
J. YU ET AL., SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1917 - 1920
J.B. CIBELLI ET AL., NATURE BIOTECHNOL., vol. 16, 1998, pages 642 - 646
JOENSSON M.E. ET AL.: "Identification of transplantable dopamine neuron precursors at different stages of midbrain neurogenesis", EXP. NEUROL., vol. 219, no. 1, September 2009 (2009-09-01), pages 341 - 354, XP026470440 *
K. SHINOHARA ET AL., CELL, vol. 119, 2004, pages 1001 - 1012
K. TAKAHASHI ET AL., CELL, vol. 131, 2007, pages 861 - 872
K. TAKAHASHI; S. YAMANAKA, CELL, vol. 126, 2006, pages 663 - 676
KIM JB ET AL., NATURE, vol. 461, 2009, pages 649 - 643
KLIMANSKAYA I ET AL., NATURE, vol. 444, 2006, pages 481 - 485
LI, X. ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 23, 2005, pages 215 - 221
LYSSIOTIS CA ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 106, 2009, pages 8912 - 8917
M. J. EVANS; M. H. KAUFMAN, NATURE, vol. 292, 1981, pages 154 - 156
M. KANATSU-SHINOHARA ET AL., BIOL. REPROD., vol. 69, 2003, pages 612 - 616
M. UENO ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 103, 2006, pages 9554 - 9559
MAEKAWA M ET AL., NATURE, vol. 474, 2011, pages 225 - 9
MALI P ET AL., STEM CELLS, vol. 28, 2010, pages 713 - 720
MARSON A, CELL STEM CELL, vol. 3, 2008, pages 132 - 135
MASANORI TAKEHASHI ET AL.: "Experimental Medicine", vol. 26, 2008, YODOSHA, pages: 41 - 46
MIYAZAKI T ET AL., NAT COMMUN., vol. 3, 2012, pages 1236
MIYAZAKI T. ET AL.: "Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells", NAT COMMUN., vol. 3, no. 1236, pages 1 - 10, XP055055638 *
N ENGL J MED., vol. 344, 2001, pages 710 - 9
NAKAGAWA, M. ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 101 - 106
NAKAJIMA ET AL., CANCER CHEMOTHER PHARMACOL., vol. 52, no. 4, 2003, pages 319 - 324
NARUMIYA ET AL., METHODS ENZYMOL., vol. 325, 2000, pages 273 - 284
NATURE NEUROSCIENCE, vol. 2, 1999, pages 1137
O. FUMITAKA ET AL., NAT. BIOTECHNOL., vol. 26, 2008, pages 215 - 224
OKITA ET AL., NAT METHODS, vol. 8, 2011, pages 409 - 412
P. B. YU ET AL., CIRCULATION, vol. 116, 2007, pages II60
P. B. YU ET AL., NAT. CHEM. BIOL., vol. 4, 2008, pages 33 - 41
R. K. LINDEMANN ET AL., MOL. CANCER, vol. 2, 2003, pages 20
R.L. JUDSON ET AL., NAT. BIOTECH., vol. 27, 2009, pages 459 - 461
S. WAKAYAMA ET AL., BIOL. REPROD., vol. 72, 2005, pages 932 - 936
SASAKI ET AL., PHARMACOL. THER., vol. 93, 2002, pages 225 - 232
SAYAKA WAKAYAMA ET AL., EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 26, no. 5, 2008, pages 47 - 52
SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1917 - 1920
SCIENCE, vol. 322, 2008, pages 945 - 949
SCIENCE, vol. 322, 2008, pages 949 - 953
See also references of EP3042951A4
SHI Y ET AL., CELL STEM CELL, vol. 2, 2008, pages 525 - 528
SHI Y ET AL., CELL STEM CELL, vol. 3, 2008, pages 568 - 574
STANTON BZ; PENG LF., MOL BIOSYST., vol. 6, 2010, pages 44 - 54
SUEMORI H ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN., vol. 345, 2006, pages 926 - 32
SUN N ET AL., PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 106, 2009, pages 15720 - 15725
T. WAKAYAMA ET AL., SCIENCE, vol. 292, 2001, pages 740 - 743
TAKAHASHI K ET AL., PLOS ONE, vol. 4, 2009, pages E8067
THOMSON JA ET AL., PROC NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 92, 1995, pages 7844 - 7848
THOMSON JA ET AL., SCIENCE, vol. 282, 1998, pages 1145 - 1147
TUERK, C.; GOLD, L., SCIENCE, vol. 249, 1990, pages 505 - 510
UENATA ET AL., NATURE, vol. 389, 1997, pages 990 - 994
WARREN L, CELL STEM CELL, vol. 7, 2010, pages 618 - 630
WEMIG M ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 105, 2008, pages 5856 - 5861
Y. MATSUI ET AL., CELL, vol. 70, 1992, pages 841 - 847
YOSHIDA Y ET AL., CELL STEM CELL, vol. 5, 2009, pages 237 - 241
ZHAO Y ET AL., CELL STEM CELL, vol. 3, 2008, pages 475 - 479

Cited By (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018518938A (ja) * 2015-04-09 2018-07-19 ビオラミナ アーベー 神経変性疾患の処置における使用のための幹細胞由来のドパミン作用性細胞を生成するための方法および組成物
WO2016162747A3 (en) * 2015-04-09 2017-01-05 Biolamina Ab Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases
US11236302B2 (en) 2015-04-09 2022-02-01 Biolamina Ab Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases
JP6998772B2 (ja) 2015-04-09 2022-02-04 ビオラミナ アーベー 神経変性疾患の処置における使用のための幹細胞由来のドパミン作用性細胞を生成するための方法および組成物
CN107438669B (zh) * 2015-04-09 2022-09-27 拜奥拉米那公司 用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物
CN107438669A (zh) * 2015-04-09 2017-12-05 拜奥拉米那公司 用于治疗神经退行性疾病的干细胞衍生多巴胺能细胞的生产方法和组合物
US10344259B2 (en) 2015-04-09 2019-07-09 Biolamina Ab Methods and compositions for producing stem cell derived dopaminergic cells for use in treatment of neurodegenerative diseases
JP2018522538A (ja) * 2015-06-01 2018-08-16 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の方法
US10858625B2 (en) 2015-06-01 2020-12-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (MPA) neurons
EP3303564A4 (en) * 2015-06-01 2018-10-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
WO2016196661A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
EP4079314A1 (en) * 2015-06-01 2022-10-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
EP4070803A1 (en) * 2015-06-01 2022-10-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
IL255992A (en) * 2015-06-01 2018-01-31 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Processes for extracorporeal differentiation of midbrain dopamine neurons
IL291532B1 (en) * 2015-06-01 2024-08-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Processes for in vitro differentiation of midbrain dopamine neurons
US12084679B2 (en) 2015-06-01 2024-09-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mDA) neurons
JP2020146060A (ja) * 2015-06-01 2020-09-17 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 中脳ドーパミン（ｍＤＡ）ニューロンのｉｎ ｖｉｔｒｏ分化の方法
JP2017023019A (ja) * 2015-07-17 2017-02-02 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から中胚葉前駆細胞および血液血管前駆細胞への分化誘導法
EP3438251A4 (en) * 2016-03-31 2020-02-26 Keio University SPECIFIC PLURIPOTENT STEM CELL STIMULATED BY DIFFERENTIATION
KR20180135918A (ko) * 2016-04-22 2018-12-21 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 도파민 생산 신경전구세포의 제조방법
CN109072198A (zh) * 2016-04-22 2018-12-21 国立大学法人京都大学 产多巴胺神经祖细胞的制备方法
WO2017183736A1 (ja) 2016-04-22 2017-10-26 国立大学法人京都大学 ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法
KR102312123B1 (ko) * 2016-04-22 2021-10-13 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 도파민 생산 신경전구세포의 제조방법
US11898163B2 (en) * 2016-04-22 2024-02-13 Kyoto University Method for producing dopaminergic neuron progenitor cell
JP7356658B2 (ja) 2016-04-22 2023-10-05 国立大学法人京都大学 ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法
JP7011260B2 (ja) 2016-04-22 2022-02-10 国立大学法人京都大学 ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法
JP2022037232A (ja) * 2016-04-22 2022-03-08 国立大学法人京都大学 ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法
AU2017254268B2 (en) * 2016-04-22 2023-03-16 Kyoto University Method for producing dopamine-producing neural precursor cells
JPWO2017183736A1 (ja) * 2016-04-22 2019-02-28 国立大学法人京都大学 ドーパミン産生神経前駆細胞の製造方法
CN106479980A (zh) * 2016-07-04 2017-03-08 上海爱萨尔生物科技有限公司 神经干细胞培养液及培养方法
CN106479980B (zh) * 2016-07-04 2019-12-31 上海爱萨尔生物科技有限公司 神经干细胞培养液及培养方法
CN111788303A (zh) * 2018-02-19 2020-10-16 大日本住友制药株式会社 细胞聚集体、细胞聚集体的混合物和它们的制造方法
WO2019160148A1 (ja) 2018-02-19 2019-08-22 大日本住友製薬株式会社 細胞凝集体、細胞凝集体の混合物及びそれらの製造方法
JPWO2019160148A1 (ja) * 2018-02-19 2021-02-04 大日本住友製薬株式会社 細胞凝集体、細胞凝集体の混合物及びそれらの製造方法
JP7414530B2 (ja) 2018-02-19 2024-01-16 住友ファーマ株式会社 細胞凝集体、細胞凝集体の混合物及びそれらの製造方法
EP3757208A4 (en) * 2018-02-19 2021-12-01 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. CELLULAR AGGREGATE, MIXTURE OF CELLULAR AGGREGATES AND ITS PREPARATION METHOD
WO2021100830A1 (ja) 2019-11-20 2021-05-27 大日本住友製薬株式会社 細胞凝集体の凍結方法
WO2021100829A1 (ja) 2019-11-20 2021-05-27 大日本住友製薬株式会社 神経系細胞の凍結方法
EP4241777A4 (en) * 2020-11-06 2024-08-21 Sbiomedics PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF A DEGENERATIVE BRAIN DISEASE, COMPRISING NEURAL PRECURSOR CELLS DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
WO2023153464A1 (ja) * 2022-02-09 2023-08-17 住友ファーマ株式会社 多能性幹細胞から中脳底板領域の神経系細胞への分化における、培養液中の細胞の分化能を判定する方法

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