KR20120093407A - 제한된 분화력을 가진 줄기세포 클론의 선별 - Google Patents

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Abstract

a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로(essentially) 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포 집단을 수득하는 단계; b) 상기 집단의 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식시키는 단계; 및 c) 신경세포, 간세포 또는 심근세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 것으로 결정된 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계를 포함하는 세포의 클론 집단 제조 방법을 개시한다. 또한, 본 발명의 방법을 이용한 세포 클론 집단의 생산과, 본 발명의 방법으로 제조된 세포 클론을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 질병의 치료 방법을 개시한다. 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 세포 클론 집단에 시험 화합물을 접촉시키는 방법을 포함하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법을 개시한다.

Description

제한된 분화력을 가진 줄기세포 클론의 선별{SELECTION OF STEM CELL CLONES WITH DEFINED DIFFERENTIATION CAPABILITIES}
본 출원은 2009년 12월 2일에 가출원된 미국특허출원 제61/266,072호의 우선권 주장의 이익을 향유하며, 여기 개시된 사항은 그 전체로서 포기(disclaimer)없이 참조로서 삽입된다.
본 발명은 일반적으로 줄기세포 선별, 줄기세포 분화, 세포 요법 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 제한된 분화력을 가진 유전적으로 조작되지 않은 만능성 줄기세포주 클론을 선별하는 방법에 관한 것과 본 발명의 방법으로 제조된 줄기세포 클론의 응용에 관한 것이다.
배아 줄기세포(ES)를 포함하는, 만능성(pluripotent) 줄기세포와 유도된 만능성 줄기세포(iPS)는 세포 요법 목적과 더불어 초기 발생 단계를 연구하거나 질병과 독성학을 모델링하는데 유망한 기술이다. 이는 성체 신경 줄기세포나 배아 신경 줄기세포의 경우도 마찬가지이다. 이러한 세포들은 배양을 통해 증식시킬 수 있고 다른 세포 유형으로의 분화할 수 있는 능력을 유지하고 있기 때문에 다양한 질병을 치료하기 위한 세포를 거의 제한 없이 제공할 수 있다.
활발한 연구가 진행중인 분야 중 하나는 세포 요법을 사용한 신경계 질환과 심혈관 질환의 치료 분야이다. 퇴행성 신경계 질환의 치료 방법은 손상을 입은 신경계로 도파민성 뉴런과 같은 중추 신경계 세포를 이식하는 것이다.
세포 요법에 가능한 세포의 소스는 배아 줄기세포나 유도 만능성 줄기세포, 다른 유형의 줄기세포들을 체외에서 분화시켜 얻어 낸다. 포유류 배아 줄기세포를 배양하는 방법은 인간과 붉은 털 원숭이, 비단 원숭이의 경우 등이 알려졌다 (미국 특허 제5,843,780호; 제6,200,806호; 제7,029,913호).
만능성 줄기세포로부터 얻어진 여러 세포 유형의 이종 혼합물을 배양을 통해 얻어내는 과정은 쉽지만 공교롭게도 그것들을 특정 유형의 세포로 분화시키는 과정은 아직 충분히 알려져 있지 않다. 일반적으로 배양중의 배아 줄기세포의 분화 유도는 세포의 이종 혼합(단지 적은 양의 세포만이 세포 요법에 사용 될 수 있는 신경세포 따위로 분화함)을 야기한다.
줄기세포로부터 신경세포와 조직을 만드는 방법의 향상에는 분화 과정을 더욱 정밀히 통제할 수 있는 능력이 많은 도움이 될 것이다. 그러므로 줄기세포로부터 세포 요법을 위한 분화된 세포로 준비하는 향상된 방법이 요구되고 있다.
본 발명은 유도 만능성 줄기세포로부터 특정한(specific) 또는 특유한(particular) 분화력을 지닌 클론 집단을 생기게 하는 방법의 동정에 일부 기반을 두고 있다. 본 발명의 방법은 배아 줄기세포를 활용해서 세포 요법이나 생명공학에 적용할 수 있는 고순도의 분화된 세포 집단을 제공하는 장점이 있다. 더불어 정제되거나 고순도로 정제된 분화 세포의 세포 치료적 목적으로써의 사용은 두뇌에 세포 이식을 할 경우 부작용으로서 나타나는 기형종(teratoma) 또는 신경 상피 종양의 위험을 줄여주는 효과도 있다. 나아가 본 발명의 방법은 유전적으로 조작되지 않은 세포의 클론 집단을 제공할 수 있다.
본 발명은 a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로(essentially) 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포 집단을 수득하는 단계; b) 상기 집단의 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식하는 단계; 및 c) 신경세포, 간세포, 근육세포 또는 심근세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 것으로 결정된 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계를 포함하는 세포 클론 집단을 생산 또는 생성하는 방법에 관한 것이다. 어떤 구체예에서는 하나 또는 몇몇 선택된 세포 집단으로부터 세포를 공급하는 방법 또는 자손이 생기게 하는 방법을 포함할 수 있다. 하기 실시예에서 보듯이, 일부 만능성 세포주 클론 집단에서 배상체(embryoid body)로 분화시키는 동안에 간세포 전형적인 표지가 100배 가량 증가되었다.
본 명세서에서 사용된 용어 "세포 클론 집단(clonal population of cells)"은 단일 조상으로부터 내려온 세포 그룹으로 정의된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "만능성 줄기세포(pluripotent stem cell)"는 세 종류의 모든 배엽(내배엽, 중배엽, 외배엽) 유래 세포로 될 수 있는 능력을 지닌 세포로 해석된다. 비록 만능성 세포는 이론상 신체의 어떤 세포로도 분화 가능하지만 실험적으로 볼 때 만능성이란 각 배엽의 몇몇 세포종류로 분화할 수 있는 능력으로 정의된다. 본 발명의 다른 구체예에서 만능성 줄기세포는 배반포 (blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)에서 유래된 배아 줄기세포(ES)를 의미한다. 또 다른 구체예에서 만능성 줄기세포는 분화된 세포를 역분화시켜 얻어진 유도 만능성 줄기세포(iPS)를 의미한다. 어떤 구체예에서 만능성 줄기세포는 체세포 핵치환을 통해 얻어진 배아 줄기세포를 의미한다. 만능성 세포란 인간 배아 줄기세포를 의미하는 것일 수 있다. 인간 배아 줄기세포는 예를 들어, H1, H9, hES2, hES3, hES4, hES5, hES6, BG01, BG02, BG03, HSF1, HSF6, H1, H7, H9, H13B 및 H14 를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 만능성 세포란 아래에 자세히 설명하겠지만 유도 만능성 세포를 의미할 수 있다. 유도 만능성 줄기세포는 예를 들어, iPS 6.1, iPS 6.6, iPS, iPS 5.6, iPS 5.12, iPS 5.2.15, iPS 5.2.24, iPS 5.2.20, iPS 6.2.1 및 iPS 5/3-4.3 를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 방법은 선택된 세포 클론 집단의 증식 방법을 포함할 수 있다. 상기 방법은 신경세포나 간세포, 근육세포, 심근세포 등으로 적어도 50% 상동성이 있는 집단으로 분화할 수 있는 능력을 지닌 세포를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 선택된 세포 클론 집단을 제공하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 방법은 선택된 세포 클론 집단을 저장 또는 운반용으로 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세포를 저장 또는 운반용으로 제조하는 단계는 세포를 냉동하는 과정을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "다능성 줄기세포(multipotent stem cell)"는 제한된 수의 조직 유형으로 분화할 수 있는 능력을 가진 줄기세포로 해석된다. 다능성 줄기세포는 예를 들어, 신경 줄기세포와 조혈 줄기세포를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. "신경 줄기세포(neural stem cell)"는 신경 조직으로부터 분리해 낸, 신경 줄기세포(즉, 자가재생을 나타내는 세포) 뿐 아닌 완전히 분화한 자손 신경세포로도 분화할 능력을 지닌 분화하지 않은 세포를 의미한다. 상기 신경 줄기세포는 성체 신경 줄기세포 또는 배아 신경 줄기세포를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "심근세포(cardiomyocyte)"는 (a) 성숙 또는 미성숙 심근세포가 지닌 알려진 특징 중 하나 또는 몇몇의 형태학적 특징을 가진 세포; 또는 (b) 성숙 또는 미성숙 심근세포에서 발현하는 것으로 알려진 단백질 중 하나 또는 몇몇의 표지 단백질이나 표지 단백질은 아니지만 이에 준하는 단백질의 발현을 하고있는 세포로 해석된다. 그러므로, 본 명세서에서 사용된 용어 "심근세포"는 성숙 심근세포와 미성숙 심근세포 모두로 해석될 수 있다. 형태학적 특징은 예를 들어, 박동하는 근육세포를 형성하는 것, 심장 특이적 근절 단백질(sarcomeric protein)을 발현하는 것, 이온 채널을 발현하는 것을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 표지 단백질은 예를 들어, cardiac troponin I (cTnI), cardiac troponin T (cTnT), sarcomeric myosin heavy chain (MHC), GATA-4, Nkx2.5, N-cadherin, 베타.1-adrenoceptor (β1-AR), ANF, MEF-2 족 전사인자, creatine kinase MB (CK-MB), 미오글로빈 및 atrial natriuretic factor (Li et al., 2006)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "신경세포(neural cell)"는 (a) 성숙 또는 미성숙 뉴런, 성숙 또는 미성숙 글리아 세포(glial cell), 신경 선조세포가 지닌 것으로 알려진 형태학적 특징을 하나 또는 몇몇개 보이는 세포; 또는 (b) 성숙 또는 미성숙 뉴런, 성숙 또는 미성숙 글리아세포, 신경 선조세포에 존재한다고 알려진 표지 단백질이나 이에 준하는 단백질, 신경 전달 물질을 하나 또는 그 이상 발현하는 세포들로 해석된다. 형태학적 특징은 예를 들어, 작은 세포체(cell body), 축색 돌기(axon)와 수상 돌기(dendrite)를 연상시키는 복수의 돌기를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 표지 단백질이나 이에 준하는 단백질, 신경 전달 물질은 예를 들어: a) 뉴런의 특징인 β III-튜불린, microtubule-associated protein 2(MAP-2), 신경 미세 섬유의 발현; b) 성상세포(astrocyte)에 존재하는 glial fibrillary acidic protein(GFAP)의 발현; c) 희소돌기 아교세포(oligodendrocyte)의 특징인 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase), galactocerebroside (GaIC), myelin basic protein (MBP)의 발현; d) 미분화 배아 줄기세포의 특징인 Oct-4의 발현; e) 신경 전구세포와 다른 세포의 특징인 Pax-6와 nestin의 발현; f) 중추 신경계의 발생과정 중의 특성인 Sox 1의 발현; g) 카테콜아민(catecholamine) 뉴런에 존재하는 tyrosine hydroxylase(TH)의 발현; h) 가바(GABA) 뉴런에 존재하는 glutamic acid decarboxylase, isoform 67(GAD67)의 발현; i) 신경 분화의 중간단계의 특징인 vimentin의 발현; j) 도파민 작용성의 뉴런으로의 분화에 특징인 도파민 분비, 방사성 도파민 수용(uptake)과 도파민 트랜스포터(transporter)의 발현을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. "글리아 세포"는 예를 들어, 성상세포(astrocyte), 희소돌기 아교세포(oligodendrocyte), 상의세포(ependymal cell), 방사 아교세포(radial glia), 슈반세포(Schwann cell), 위성세포(satellite cell)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어 "신경세포"는 "뉴런세포(neuronal cell)"를 포함한 의미로 해석된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "뉴런세포"는 성숙 또는 미성숙 뉴런으로 해석된다. 예를 들어, 성숙 또는 미성숙 뉴런은 성숙 또는 미성숙 도파민 작용성 뉴런일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "간세포(hepatocyte)"는 (a) 성숙 또는 미성숙 간세포가 지닌 알려진 특징 중 하나 또는 몇몇의 형태학적 특징을 가진 세포; 또는 (b) 성숙 또는 미성숙 간세포에서 발현하는 것으로 알려진 단백질 중 하나 또는 몇몇의 표지 단백질이나 표지 단백질은 아니지만 이에 준하는 단백질의 발현을 하고있는 세포로 해석된다. 그러므로 본 명세서에서 사용된 용어 "간세포"는 성숙 간세포와 미성숙 간세포 모두로 해석된다. 형태학적 특징은 예를 들어, 호산성의 세포질(eosinophilic cytoplasm), 다수의 미토콘드리아, 호염기성의 반점(basophilic stippling), 염색질이 사방으로 흩어지고 핵인이 두드러지게 보이는 원형의 세포핵을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 간세포는 알파-태아 단백질과 알부민을 포함하는 간 특이 단백질의 발현 확인을 통해서도 식별할 수 있다. 전자현미경법, 면역세포염색법(immunocytochemistry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 정량적 PCR, 웨스턴 블랏팅, 원위치 하이브리드화(in situ hybridization) 등과 같은 추가적인 실험방법을 통해 간세포를 구별해 내기도 한다.
선별된 세포 클론 집단이 심장성의 분화력을 보일 수도 있다. 선별된 세포 클론 집단이 간세포으로의 분화력을 보일 수도 있다. 아니면 그 대신에, 선별된 세포 클론 집단이 신경성의 분화력을 보일 수도 있다. 신경성의 분화력을 지닌 세포 클론 집단은 신경세포의 어떤 형태로든 분화할 수 있다. 신경세포는 뉴런, 희소돌기 아교세포(oligodendrocyte), 성상세포(astrocyte), 소교세포(microglial cell), 위성세포(satellite cell), 슈반세포(Schwann cell)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 일부 구체예에서 신경세포는 도파민 작용성 뉴런을 의미하기도 한다.
다른 구체예에서 선별된 세포 클론 집단은 신경세포로의 분화력을 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 그 안에서 도출될 수 있는 어떤 범위를 나타낼 수 있다. 또 다른 구체예에서 선별된 세포 클론 집단은 심근세포로의 분화력을 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 그 안에서 도출될 수 있는 어떤 범위를 나타낼 수 있다. 또 다른 구체예에서 선별된 세포 클론 집단은 간세포로의 분화력을 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 그 안에서 도출될 수 있는 어떤 범위를 나타낼 수 있다.
세포 집단 중 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식시키는 방법은 본 명세서에 명시된 방법을 사용하였다. 본 방법은 세포 집단 중 개별화된 세포를 분리하는 방법을 포함할 수 있다. 유세포분석기법(FACS), 면역자장기술(immunomagnetic techniques), 항체컬럼법, 면역침전법, 면역패닝법(immunopanning) 같은 다양한 종류의 면역선택법들이 본 발명에서 세포를 분리하는 실험에 사용되어 졌으나, 그 실험법들은 이에 한정하지는 않는다. 아래의 명세서에서 추가예들을 다룬다. 특정 구체예에서 세포의 분리는 체외에서 이루어졌다. 세포 배양 기술은 당업자에게 잘 알려진 방식을 사용하였다. 이런 기술들은 하기 명세서에 설명되어 있지만, 이에 한정하지는 않는다.
다른 구체예에서 세포 클론 집단은 신경세포나 심근세포 유형으로 분화를 유도시키기 위해 하나 또는 그 이상의 분화제를 처리하였다. 본 명세서에서 사용된 용어 "분화를 유도하는(inducing differentiation)" 또는 "분화를 유도하다(induce differentiation)"는 줄기 세포에 직접적 또는 의도적인 영향을 끼친 결과로 줄기 세포가 특정 분화된 세포 유형으로 성장되는 원인이 되는 것의 의미로 해석된다. 분화를 조절하거나 유발하도록 영향을 미치는 요인이란 성장 인자와 싸이토카인에 한정하지 않고, 이온 유입과 pH 변화 같은 세포상의 조건, 또는 분비 단백질 같은 세포 외부 요인 등을 포함할 수 있다. 이는 세포를 모이도록 배양하는 것과 세포 밀도에 의한 영향 등을 포함 할 수 있다. 다른 구체예에서 분화제는 세포들 자체에서 생겨난 것이다. 이러한 분화제는 하기 명세서에 명시되어 있으나 이에 한정하지는 않는다.
세포의 분화를 판단하는 당업자에게 알려진 어떠한 방법도 본 발명의 방법에 적용하기 위해 고려되었다. 비분화된 줄기 세포에 분화제를 처리하여 만들어 낸 분화된 세포는 형태학적으로나 면역화학적으로, 또는 신경 전구세포, 신근세포, 간세포나 다른 세포 종류로서의 상태를 확인하는 방법 등으로 그 분화된 특징을 확인하였다. 형태학적 분석에서는 세포는 다양한 표현형적 기준에 따라 구별될 수 있다. 그 기준은 현미경으로 형태학적 특징의 관찰하는 것, 발현되는 세포 표지의 검출이나 정량적 분석, 효소 활성도, 신경 전달 물질과 그 수용체, 전기생리학적 기능 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
세포는 구별되는 특정 종류 세포의 표현형적 표지의 발현 여부를 통해서도 분화 된 것으로 판단될 수 있다. 당업자에게 조직 특이적인 것으로 알려진 표지는 분화를 판단하기 위해 유면역세포화학법(flow immunocytochemistry)과 세포 표면에 있는 표지를 검출하기 위한 유세포분석기법(FACS), 세포 안이나 세포 표면에 있는 표지를 검출하기 위한 면역조직화학법(예를 들면, 고정된 세포나 조직 절편을 사용하는), 세포 추출액이나 배양액으로 분비되는 물질을 검출하기 위한 웨스턴 블랏 분석과 효소연관 면역학적 검정법(enzyme-linked immunoassay) 등과 같은 어떤 적합한 면역학적 기술을 사용하여 탐지할 수 있다. 항원-항체 결합은 세포를 고정시킨 후 표지하는 것을 증폭시키기 위해 표지된 2차 항체를 이용하거나 다른 접합기(비오틴-아비딘 접합기 등)를 사용해 표준 면역세포화학법 또는 유세포분석기법을 통해서나 당업자에게 잘 알려진 다른 면역학적 방법들로써 관찰될 수 있다. 일반적으로 면역복합체 형성의 탐지는 당업자에게 잘 알려져 있고 수 많은 방식의 적용을 통해 이뤄낼 수 있다.
다른 구체예에서 세포 클론 집단을 만드는 방법은 체외에서 증식된 세포에 시험 화합물을 처리하고 증식된 세포상의 독성을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 특정 구체예에서 상기 세포들은 체외에서 시험 화합물을 처리하였다.
세포 클론 집단은 포유류 세포일 수 있다. 세포의 출처는 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 양, 염소, 말, 소, 유인원, 또는 인간을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서 세포 클론 집단은 인간 세포이다.
어떤 구체예에서 다능성이나 만능성 세포는 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식하기 전에 적어도 한번 계대배양을 하였다.
본 발명은 향상된 신경 분화력을 나타내는 세포 클론 집단을 제조 또는 생산하는 방법으로서, 하기 단계를 포함할 수 있다: a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로(essentially) 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포 집단을 수득하는 단계; b) 다능성이나 만능성 세포 집단의 대다수를 개별화시키고 증식시키는 단계; c) 적어도 50% 상동성이 있는 신경세포 집단으로 분화할 수 있는 능력을 지닌 하나 또는 그 이상의 세포 클론 집단을 선별하는 단계; 및 d) 하나 또는 그 이상의 선별된 세포 집단으로부터 세포나 그 자손을 제공하는 단계. 증식된 세포는 적어도 55% 신경세포로, 적어도 60% 신경세포로, 적어도 65% 신경세포로, 적어도 70% 신경세포로, 적어도 75% 신경세포로, 적어도 80% 신경세포로, 적어도 85% 신경세포로, 적어도 90% 신경세포로, 적어도 95% 신경세포로, 적어도 99% 신경세포로, 또는 그 안에서 유도될 수 있는 어떤 범위만큼의 신경세포로 분화하는 능력을 보일 수 있다. 특정 구체예에서 신경세포는 도파민 작용성 세포를 의미한다. 만능성 또는 다능성 세포는 상기 논의한 어떤 세포도 될 수 있다. 나아가 다른 구체예는 신경세포에 시험 화합물을 처리하고 신경세포상의 독성을 측정하는 단계를 포함한다. 세포 또는 그 자손을 제공하는 것은 당업자에게 알려진 어떤 방법을 사용하여 세포나 그 자손을 대상으로 실험하는 과정을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서는 본 발명의 방법으로 제조된 클론에서 유래된 심근세포 또는 신경세포 집단에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 심근세포나 신경세포는 조직 내에 포함되거나, 그렇지 않을 수 있다. 상기 조직은 적절한 저장 수단 내에 존재할 수 있다. 특정 구체예에서 신경세포는 도파민 작용성 세포를 의미한다. 신경세포는 조직 내에 포함될 수 있다. 조직과(또는) 세포는 저장 수단 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 추가 구체예에서는 본 발명의 방법으로 제조된 다수의 클론-유래(clonally-derived) 신경세포, 간세포, 또는 심근세포 집단 및 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 다른 구체예에서, 상기 조성물 내 다수의 클론-유래 신경세포, 간세포, 또는 심근세포 집단은 단일의 공통 선조세포로부터 증식한 것이다. 또 다른 구체예에서, 세포들은 2, 3, 4, 5 ,6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 공통 선조세포에서 유래한다. 상기 조성물은 포유류를 대상으로 한 투여를 위해 고안된 약제학적 조성물일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 조성물 내의 다수의 클론-유래 신경세포, 간세포, 또는 심근세포 집단은 클론-유래 신경세포 또는 심근세포에서 분리된 것으로 더욱 한정하였다. 상기 조성물은 클론-유래 신경세포 또는 심근세포에서 분리된 것이 아닌 다른 세포를 포함하거나, 그렇지 않을 수 있다. 상기 조성물 내 상기 세포 개수는 적어도 104개, 적어도 105개, 적어도 106개, 적어도 107개, 적어도 108개, 적어도 109개, 적어도 1010개, 적어도 1011개, 적어도 1012개, 적어도 1013개, 적어도 1014개, 적어도 1015개, 적어도 1016개, 적어도 1017개, 적어도 1018개, 적어도 1019개, 적어도 1020개, 또는 그 이상의 개수, 또는 그 안에서 유도될 수 있는 어떤 범위 만큼의 세포의 개수일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 조성물은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상, 또는 그 안에서 유도될 수 있는 어떤 백분율 범위 만큼 신경세포, 간세포, 또는 심근세포를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 조성물은 약 90%의 신경세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 조성물은 적어도 약 90%의 심근세포로 포함한다.
상기 조성물은 당업자에게 알려진 어떤 약학적으로 가능한 담체를 포함할 수 있다. 이러한 담체의 예는 하기 명세서에 명시되어 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 다른 구체예에서 상기 조성물은 하나 또는 그 이상의 보조적인 치료제를 포함한다. 보조적인 치료제는 예를 들어 화학 요법의 약제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 화학 요법 약제의 몇 가지 예가 하기 명세서에 명시되어 있다.
나아가 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 클론-유래 세포 집단을 포함하는 적당한 저장 수단을 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 세포는 조직 내에 포함되거나, 그렇지 않을 수 있다. 상기 키트의 다른 선택적인 구성요소는 하기 명세서에 명시되어 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다: a) 다수의 심근세포, 간세포 또는 신경 세포 및 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및 b) 본 발명의 방법으로 제조된 세포에 시험 화합물을 접촉시킨 결과 나타나는 표현형 또는 활성도의 변화를 측정하는 단계. 다른 구체예에서 표현형 또는 활성도란 독성의 측정을 의미한다. 상기 세포의 표현형 또는 활성도의 변화를 측정하는 것은 당업자에게 알려진 어떠한 방법에 따라서도 수행될 수 있다. 적용할 수 있는 방법의 예는 형태학적 분석, 면역화학적 분석 및 위에 명시된 다른 방법이 포함된다. 다른 구체예에서 심근세포, 간세포, 또는 신경세포에서의 하나 또는 그 이상의 유전자 발현이 측정된다. 이러한 유전자들은 예를 들어, caspase 3, NF-kB, TNF-alpha, heat-inducible factors (HIF-1 alpha), heat shock proteins (Hsp), cellular integrity 유전자 (예를 들어, transaminase), gamma-glutamyl transferase, alkaline phosphatase, 및 산화 스트레스 유전자를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 유전자 발현의 정도는 당업자에게 잘 알려진 어떤 방법 또는 그의 조합을 사용해 측정하였다. 이러한 방법은 예를 들어, 고효율 유전자 시퀀싱 (high throughput gene sequencing), 웨스턴 블랏, 유전자 발현 어레이, 유세포분석(flow cytometry), 면역형광법, 프로모터/리포터 유전자 기반 어레이, 또는 비색분석법 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 측정될 수 있는 변수의 다른 예로는 심근세포의 수축, 세포 사멸, 활동전위의 패턴, 이온 투과성 등이 있다.
본 발명의 다른 구체예에서는 하기 단계를 포함하는 심근세포 분화능을 나타내는 세포 클론 집단을 제조 또는 생산하는 방법에 관한 것이다: a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성) 또는 다능성 세포 집단을 수득하는 단계; b) 상기 집단의 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식시키는 단계; 및 c) 심근세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 것으로 결정된 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계; 및 d) 상기 증식된 세포가 상기 c) 단계에서 관찰된 바와 같이 심근세포로 분화되는 능력에 기초하여, 상기 선택된 세포를 세포 및 조직 공학, 약물 스크리닝 또는 세포 치료에 사용하는 단계.
본 발명의 다른 구체예에서는하기 단계를 포함하는 간세포 분화능을 나타내는 세포 클론 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다: a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성) 또는 다능성 세포 집단을 수득하는 단계; b) 상기 집단의 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식시키는 단계; 및 c) 간세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 것으로 결정된 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계; 및 d) 상기 증식된 세포가 상기 c) 단계에서 관찰된 바와 같이 간세포로 분화되는 능력에 기초하여, 상기 선택된 세포를 세포 및 조직 공학, 약물 스크리닝 또는 세포 치료에 사용하는 단계.
본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 제조된 세포 클론 집단을 포함하는 개체의 질병 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법으로 제조된 세포 또는 그의 자손은 이식, 세포 요법 또는 유전자 요법에 사용되어 질 수 있다. 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 신경세포, 간세포, 또는 심근세포의 세포기반 요법으로의 사용에 관한 것이다. 예를 들어, 그 세포들은 질병 또는 부상에 의해 상당히 손상된 인간 조직을 재생시키는데에 사용될 수 있다. 재생은 생체 내에서 또는 생체 외부에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 여기에 명시된 방법에 의해 제조된 심근세포는 심장 국소 빈혈에 의해 손상된 심장 조직을 재생시키는데 이용할 수 있다. 본 발명의 방법으로 제조된 신경세포는 손상되었거나 퇴행된 신경계를 재생시키는 목적으로 투여될 수 있다. 본 발명의 방법으로 제조된 간세포는 손상되었거나 퇴행된 신경계를 재생시키는 목적으로 투여될 수 있다. 다른 구체예에서 본 발명의 방법으로 제조된 세포는 직접 그 치료의 대상에 투여될 수 있다. 그러므로 본 개시의 방법들은 많은 질병, 손상, 또는 심장이나 신경계의 다른 해로운 상태의 치료에 유용할 것이다.
다른 구체예에서 본 발명의 방법으로 제조된 심근세포, 간세포, 또는 신경세포는 3차원 복원을 통해 인체 장기를 만드는데에 이용 될 수 있다. 예를 들어, 인간 뇌 조직을 여기에 명시된 방법대로 제조된 신경세포의 3차원 배양을 통해 만들 수 있다. 심장 조직은 본 발명의 방법으로 제조된 심근세포로부터 재건 할 수 있다. 다른 구체예에서 본 개시의 신경세포와 심근세포는 다양한 치료적 활성 분자나 유전자를 인체의 다양한 장소로 운반하는 운반체 매개물로써 사용되어질 수 있다: 예를 들어, 본 발명의 방법으로 제조된 세포를 원하는대로 유전자 조작과 분화를 시킨 후 유전자 치료가 필요한 대상 장소에 세포 또는 조직을 제공할 수 있다.
다른 구체예에서는 신경세포의 실질적으로 상동성이 있는 집단을 대상에게 투여하는 방법을 포함한다; 여기서 신경세포란 본 명세서에 명시된 방법대로 생산되었거나 제조된 신경세포의 자손을 의미한다. 특정 구체예에서 신경세포는 도파민성 세포를 의미한다. 다른 구체예에서 투여된 세포는 본 발명의 방법으로 제조된 심근세포이다. 상기 대상은 신경계 또는 심혈관계 관련 질병을 가진 것으로 알려졌거나 의심되는 대상일 수 있다.
다른 구체예에서 상기 질병은 퇴행성 신경 질환일 수 있다. 치료목적으로 고려되는 퇴행성 신경 질환은 예를 들어, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 뇌졸중, 근위축성 측색 경화증 (루게릭병), 전두측두엽 치매 (피크병), 프리온 병, 헌팅턴병, 뇌 국소 빈혈, 특발성 파킨슨병, 국소-유도 파킨슨병, 약물-유도 파킨슨병, 다른 기원의 알츠하이머병과 치매, 헌팅턴 무도병, AIDS-뇌장애나 크로이츠펠트-야콥병, 홍역과 헤르페스 바이러스, 보렐리아균에 의해 발생하는 뇌장애 같은 감염-유도 퇴행성 신경 질환, 용매- 또는 약제- 뿐 아니라 간장약-, 알코올-, 저산소증-, 과산소증-, 또는 고혈당증-유도 뇌장애 같은 대사-독성 퇴행성 신경 질환, 다양한 기원의 퇴행성-망막질환, 외상에의해 유도된 뇌와 골수 손상, 척수손상, 약물, 독소, 녹새(noxae)와 약의 투여와 중지후와 같은 다양한 기원의 대뇌 과흥분성 증상, 정신적과 외상적으로 유도된 대뇌 과흥분성 상태, 대사, 약물, 독소와 감염에의해 유발된 다발 신경병증과 다발 신경염과 같은 말초 신경계의 퇴행성 신경 증후군 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서 상기 질병은 파킨슨병을 의미한다. 심혈관질환은 예를 들어 심근 국소 빈혈, 심근증, 울혈성 심부전, 및 심근 경색 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 심장 질환 또는 그 상태를 치료하거나 예방하는 방법이다. 심장질환은 일반적으로 심장 기능 저하와 연관되어 있고 심근 경색, 심장 비대, 심장 부정맥과 같은 상태를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 본 발명의 이런 측면에서는 본 발명의 방법으로 분화시켜 분리한 심근세포 또는 본 발명의 방법을 사용해 처리했을 때 심근세포로 분화할수 있는 능력이 있는 세포를 대상의 심장조직에 주입하는 방법을 포함한다. 분화시켜 분리한 심근세포란 여기에 명시된 방법으로 제조된 심근세포의 자손일 수 있다. 분리된 심근세포는 되도록이면 대상의 손상된 심장 조직으로 이식한다. 대상에서 심장 기능을 회복한 결과를 내는 방법을 더 선호한다. 다른 구체예에서 대상이란 국소 빈혈성 심장병 또는 울혈성 심부전증을 가진 대상이다. 그 세포들은 당업자에게 알려진 어떤 방법들을 사용해서 투여될 수 있다. 그 예는 정맥 투여, 동맥 투여, 심근 투여를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 그 방법은 선택적으로 심장 질환의 보조적인 치료 요법 중 하나 또는 그 이상을 수행하거나 투여하는 것을 포함 할 수 있다. 그 치료 요법의 예는 하기 기술할 것이나 이에 한정하지는 않는다.
본 발명의 또 다른 측면에서 심장 조직을 회복시키는 방법을 제공한다. 그 방법은 분리된 심근세포나 본 발명의 방법으로 제조된 심장 선조 세포, 여기에 기술된 방법으로 제조된 심근세포의 자손을 대상의 손상된 심장 조직으로 주입하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 간질환을 치료하거나 예방하는 방법이다. 치료대상의 간질환이란 간염, 비알코올성 지방간 질환, 간경변, 간암, 윌슨병, 원발성 경화성 담관염, 원발성 담즙성 간경변증, 작은 담관의 자가 면역 질환, 바드-키아리 증후군, 길버트 증후군, 및 2형 당원축적병 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.
상기 세포들은 당업자에게 알려진 어떤 방법들을 사용해서 투여될 수 있다. 그 예는 직접 주입, 피내 투여, 수막공간내 투여, 심장내 투여, 경피의 투여, 비경구적인 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 비강내 투여, 피하 투여, 뇌 또는 중추 신경계로의 주입, 기관내 투여, 복막내 투여, 관류를 통한 투여, 및 위 등의 세척을 통한 투여 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서 파킨슨병은 도파민성 뉴런 집단을 적어도 외측밀집흑질의 일부를 포함하는 지역으로 투여하여 치료될 수 있다.
상기 질병을 치료할 때 득이 될 것으로 알려졌거나 추정되는 어떤 수 만큼의 세포가 투여되었다. 다른 구체예에서는 1회 투여 당 약 100,000 에서 10,000,000개의 세포가 투여되었다. 상기 투여는 단 한번의 투여일 수도 있고 여러번의 투여일 수도 있다.
특정 구체예에서는 상기 대상은 포유류를 의미한다. 포유류는 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 염소, 양, 소, 말, 유인원, 및 인간을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 특정 구체예에서는 상기 대상은 인간을 의미한다.
특별히 본 발명의 하나의 구체예가 본 발명의 다른 어떤 구체예에 적용될 수 있을지에 대해 제한없이 논의하였다. 나아가 본 발명의 어떤 구성요소도 본 발명의 어떤 방법에도 사용될 수 있고 본 발명의 어떤 방법이라도 본 발명의 어떤 구성요소를 생산하거나 활용하는데 사용될 수 있다.
본 청구항에서 사용된 용어 "또는"은 비록 본 개시가 유일한 대안 및 "및/또는"으로 해석되는 정의를 지지하지만, 대안을 하나로 명시하였거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"으로 해석된다.
본 명세서에서, "약" 이라는 용어는 수치를 측정하기 위해 사용된 기기 및/또는 방법에서 발생하는 오차의 표준편차를 포함한 수치를 나타내기 위해 사용되어졌다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 명확하게 달리 표현하지 않는 한 하나 또는 그 이상을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 "a" 또는 "an"이 "포함하는(comprising)"이란 단어와 동시에 쓰일 경우는 하나 또는 하나 이상을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "또 다른"은 적어도 두번째 또는 그 이상일 경우를 의미한다.
본 방법, 세포, 키트 중 어떤 것의 어떤 구체예는 특징들 및/또는 단계들을 묘사하는 것으로 구성(comprise/include/contain/have가 아닌) 또는 본질적으로 구성되어 있다. 그러므로 본 명세서에서 사용된 어떤 "구성되어 있다(consisting of)" 또는 "본질적으로 구성되어 있다(consisting essentially of)"라는 용어는 위에 인용한 것 같은 열린-말딘 연결(open-ended linking) 동사들 중 무엇으로든 맥락에 맞춰 변화시켜 대체 시킬 수 있다.
본 발명의 특징과 장점은 아래의 자세한 설명에서 명백히 나타나게 될 것이다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화 및 변형은 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하기 때문에, 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내는 동안, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 그 설명에 의해 주어지는 것으로 이해될 수 있다.
본 명세서의 하기 도면은 추가로 본 발명의 특정 측면을 입증하는 것이 포함되어 있다. 본 발명은 하기 도면 중 하나 이상을 하기 제시된 특정 구체예의 자세한 설명과 함께 조합하여 참조하면 잘 이해할 수 있다.
도 1a ~ 도 1d. 배아 줄기세포의 일부 집단이 신경분화에서 벗어나다. 배아 줄기세포를 PA6 간질세포와 함께 5일간 배양해서 신경분화가 되도록하였다. 처음 5일 동안 초기분화가 일어났다. 세포를 떼어내 폴리오르니틴(polyornithine)이 코팅된 플레이트로 옮겨 다시 플레이팅한 후 후기 분화가 유도되었다(도 1a). 초기분화 동안의 네스틴(nestin)과 베타-III-튜불린 단백질 발현의 유세포분석(도 1b). 초기분화 동안의 네스틴과 Oct-4 단백질 발현의 유세포분석(도 1c). 배아 줄기세포의 초기 분화과정과 후기 분화과정에서 CFSE 염료가 희석되는 정도의 유세포분석(도 1d). 분화중인 배아 줄기세포의 표현형과 CFSE 희석 분석을 조합해서 분석. 각 일부 집단의 다른 시간 지점에서 CFSE 희석을 측정하였음: 네스틴을 발현하면서(+) 동시에 베타-III-튜불린을 발현하지 않음(-) (신경상피세포), 네스틴을 발현하지 않으면서(-) 동시에 베타-III-튜불린을 발현함(+) (신경세포), 네스틴을 발현하지 않으면서(-) 동시에 베타-III-튜불린도 발현하지 않음(-) (신경세포가 아닌 세포).
도 2a ~ 도 2e. 개별적인 부모 배아 줄기세포로부터 파생된 자손의 다양성. (도 2a) 하나의 부모 배아 줄기세포로부터 파생된 단일 콜로니만 가지고 72h의 분화가 지난 후 네스틴과 베타-III-튜불린을 형광염색한 결과. (도 2b) 배아 줄기세포에 Talpha-1-GFP를 도입한 채로 신경분화를 72시간동안 유도한 후 녹색 형광을 측정. (도 2c) 총 150개의 배아 줄기세포에서 유래된 콜로니를 분석해서 각 표지들의 발현 유무를 분석한 데이터: NeuN을 발현하고 있으면 성숙된 뉴런, TH를 발현하고 있으면 도파민성 뉴런, 및 베타-III-튜불린을 발현하고 있으면 신경세포. (도 2d), (도 2e) 배아 줄기세포에 H2B-mRFP1를 도입한 채로 신경분화를 유도한 후 처음 이틀간 살아있는 채로 형광이미지를 모니터링함.
도 3a ~ 도 3b. 배아 줄기세포 세부 동질계통에서 mRNA 발현 프로파일. 각 배아 줄기세포 세부 동질계통 클론에서 전체 mRNA 발현 프로파일을 분석. (도 3a) 만능성 또는 초기 내세포괴 (inner cell mass) 와 연관된 mRNA의 발현을 분석. (도 3b) 배아 줄기세포 클론들 간에 유의한 발현 차이를 보이는 6800개 유전자의 발현. 각 클론의 유전자 발현 프로파일에 기반해 배아 줄기세포 클론을 분류하기 위해 계층클러스터를 만들었음. 클론 4번과 6번은 매우 비슷한 반면에 클론1번과 클론2번은 가장 다름.
도 4a ~ 도 4d. 각 배아 줄기세포 클론들은 신경세포가 될 수 있는 능력과 심장세포가 될 수 있는 능력을 동시에 보유하지 못함. (도 4a, 도 4b, 도 4c) 배아 줄기세포 클론들을 PA6 간질세포와 함께 배양해서 신경분화가 되도록하였다. (도 4a) 네스틴을 발현하고 있는 신경상피세포를 포함한 콜로니의 백분율을 3일 후부터 계산함. (도 4b, 도 4c) 베타-III-튜불린을 발현하고 있는 신경세포를 포함한 콜로니의 백분율 (도 4b) 또는 TH를 발현하고 있는 도파민성 뉴런을 포함한 콜로니의 백분율 (도 4c) 을 1주일 후부터 계산함. (도 4d) 배아 줄기세포 클론 1, 2, 3, 4번은 배상체로 분화되었다. 심장분화는 다른 시간 지점에서 박동이 관찰되는 배상체의 백분율을 계산하여 측정함.
도 5a ~ 도 5h. 배아 줄기세포 클론들은 같은 분화력을 공유하지 못함. 배아 줄기세포 클론들을 시험관 안에서 배상체로 분화시키고, 정량적 PCR 기법으로 다른 조직학적 유형과 다른 배엽에 특이적인 유전자들의 발현을 측정함.
도 6a ~ 도 6b. D3 배아 줄기세포로부터 얻어진 세부 동질계통 클론은 세포의 다양성을 입증함. 각 세부 동질계통 클론들의 전체 mRNA 발현 프로파일을 분석함. (도 6a) 만능성 또는 초기 내세포괴 (inner cell mass) 와 연관된 mRNA의 발현을 분석. (도 6b) D3 세부 동질계통 클론을 PA6 간질세포와 함께 배양해서 신경분화가 되도록하였다. 베타-III-튜불린을 발현하고 있는 신경세포를 포함한 콜로니의 백분율, neuN을 발현하고 있는 성숙된 뉴런을 포함한 콜로니의 백분율, 및 TH를 발현하고 있는 도파민성 뉴런을 포함한 콜로니의 백분율을 1주일 후부터 계산함.
도 7a ~ 도 7b. 베타-III-튜불린 프로모터의 특이성. 배아 줄기세포에 H2B-mRFP1-βIIIp-GFP를 형질전환 시킨 후 PA6 간질세포와 함께 배양해서 신경분화가 되도록한지 일주일후에 신경세포내의 (도 7a) 네스틴 단백질과 (도 7b) 베타-III-튜불린 단백질을 면역형광염색해서 관찰함.
도 8. 별개의 부모 배아 줄기세포로에서 유래된 자손의 계통 발생학. Figure 2에 설명된 방식으로 찍은 이미지를 분석해 계통도를 그렸다. 다섯 가지 계통도의 예를 공개한다.
도 9. 클론 1, 2, 6, 7에서 발견되는 미확인된 파생 염색체(der). 클론 1, 2, 6, 7번을 16번 계대 배양 시킨 후 표준 핵형 분석을 실시하였다. XY염색체가 우세한 집단의 세포에서 총 41개의 염색체가 발견되며 추가된 염색체(*)가 보인다.
도 10. 배아 줄기세포 클론 1번과 2번 사이에서 다르게 발현하는 유전자의 기능적 분류. MetaCore를 이용하여 경로를 분석하였다. 클론 1번과 2번 사이에서 다르게 발현하는 311개의 mRNA를 기반으로 하여 챠트를 작성하였다. 각 경로에서 클론간에 다르게 발현하는 유전자의 개수를 GO 리포트에 포함되어 있는 유전자의 총 개수에 대비해 백분율을 계산하였다.
본 발명은 만능성 또는 다능성 줄기세포로부터 결과적으로 세포 집단의 이질성을 감소시키면서 신경세포와 심근세포가 되게 하는 통제된 분화 과정을 포함한다. 만능성 줄기세포로부터 분화 시킬 때 발생하는 세포의 이질성은 세포 요법에 응용하기 위한 세포의 준비과정의 질이나 순도를 떨어뜨리고 그 것을 받아들이는 수용자에게 위험이 될 가능성이 있다. 아래의 예제에 보이듯이 배아 줄기세포 세부 동질계통 클론은 내세포괴(ICM: inner cell mass)의 표지를 발현하고 있는 것과 만능성을 가지고 있다는 것을 밝혔고, 어떤 세부 동질계통 클론은 시간이 지나면서 안정적이되는 별개의 다른 능력을 보였다. 예를 들면, 다양한 만능성 줄기세포 클론 세포주는 분화하여 외배엽(예를 들어, 신경세포)의 세포 운명을 우선으로 따르거나, 내배엽(예를 들어, 간세포)의 세포 운명을 우선으로 따르거나, 또는 중배엽 (예를 들어, 근육세포나 심근세포)의 세포 운명을 우선으로 따른다. 지금 수준으로 가능하거나 미래에 개발될 유도 만능성 줄기세포(iPS), 또는 배아 줄기세포는 바뀐 분화력을 가진 만능성 줄기세포 클론 세포주를 생산하는데에 사용되어진다. 그러므로 부분적으로 본 발명은 감소된 이질성을 가진, 그래서 부작용의 가능성을 낮추면서 세포 요법을 할 수 있는 가능성이 큰, 세포 클론 집단을 만드는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서 여기에 설명된 방법을 통해서 만들어진 만능성 클론 세포주는 시험 화합물의 약학적 또는 독성학적 평가에 사용되어질 수 있다.
A. 만능성 및 다능성 세포
본 발명은 만능성 또는 다능성 세포로부터 세포 클론 집단을 만드는 방법을 심사숙고하고 있다. 어떤 만능성 또는 다능성 세포의 사용이라도 본 방법에 고려 될 수 있다. 만능성 줄기세포와 다능성 줄기세포는 예를 들어 아래 논의될 세포를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
1. 포유류 배아 줄기세포
포유류 배아 줄기(ES) 세포는 배반포(blastocyst)의 내세포괴(inner cell mass)에서 유래된 만능성 세포이다. 배에서 발생중 배의 외부 영양외배엽 층(outer trophoectoderm layer)을 제거하고 내세포괴(ICM)를 증식을 하지 않는 지지세포 층(feeder layer) 위에 배양해서 배아 줄기세포를 얻는다. 적당한 조건 하에서 분화되지 않은채 증식중인 배아 줄기세포 콜로니가 제조된다. 이동시킬 수 있는 콜로니를 개개의 세포로 풀어준 다음 신선한 지지세포 층 위에 다시 안착시킨다. 다시 안착시킨 세포는 분화되지 않은 새로운 배아 줄기세포 콜로니를 생성하면서 증식을 이어 갈 수 있다. 그러면 다시 새로운 이동시킬 수 있는 콜로니를 개개의 세포로 풀어준 다음 신선한 지지세포 층 위에 다시 안착시켜 증식을 이어갈 수 있다. 분화하지 않은채의 배아 줄기세포를 이 "계대배양(subculturing)" 또는 "계대배양 (passaging)" 과정을 여러 번 반복해 분화하지 않은채의 배아 줄기세포를 가진 세포주를 생산할 수 있다 (미국 특허 제5,843,780호; 제6,200,806호; 제7,029,913호). "초대배양(primary cell culture)"이란 배반포의 내세포괴 같은 조직에서 직접 얻은 세포들을 배양하는 것을 뜻한다. "계대배양(subculture)"은 초대배양에서 유래된 어떤 배양을 뜻한다.
마우스 배아 줄기세포를 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 한 방법으로는, 129 품종의 마우스로부터 얻은 착상전의 배반포를 마우스 면역혈청을 처리해 영양외배엽(trophoectoderm)을 떼어내고, 얻어진 내세포괴를, 화학적으로 불활성화 시킨 마우스 배아 섬유 아세포를 지지세포 층으로 사용해, 그 위에 우태혈청(fetal calf serum)을 함유한 배양액으로 배양한다. 제작된 분화되지 않은 배아 줄기세포의 콜로니는 배아 줄기세포 집단을 만들기 위해 마우스 태아 섬유 아세포 지지세포 층 위에 우태혈청을 함유한 배양액으로 계대배양한다. 다른 방법으로는, 마우스 배아 줄기세포는 혈청을 함유한 배양액에 싸이토카인 leukemia inhibitory factor(LIF)를 첨가함으로써 지지세포 층 없이도 배양 할 수 있다(Smith, 2000). 또 다른 방법으로는, 마우스 배아 줄기세포는 골형성 단백질(bone morphogenetic protein)과 LIF를 포함한 배양액으로 혈청없이도 배양 할 수 있다(Ying et al., 2003).
인간 배아 줄기세포를 배반포로부터 얻는 방법은 기존에 알려진 방법들을 이용해서 얻을 수 있다(Thomson et al., 1995; Thomson et al., 1998; Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al., 2000.). 한 방법으로는, 5일째의 인간 배반포를, 인간 비장세포를 인식하도록 토끼에서 제작된 면역혈청에 노출시켰다가, 1:5로 희석된 기니아피그 보체(complement)에 노출시켜 영양외배엽 세포들을 분해시킨다. 영양외배엽 세포를 분해시켜 제거해 얻어진 손상되지 않은 내세포괴를 감마선을 처리해 불활성화 시킨 마우스 태아 섬유 아세포 지지세포 층 위에 우태혈청을 함유한 배양액으로 배양한다. 9 ~ 15일이 지난 후, 내세포괴에서 유래한 세포 덩어리를 화학적 방법으로(예를 들어, 트립신에 노출) 또는 물리적인 방법으로 해리시켜 다시 마우스 태아 섬유 아세포 지지세포 층 위에 우태혈청을 함유한 신선한 배양액으로 배양한다. 증식을 이어가기 위해서는, 분화하지 않은 표현형을 보이는 콜로니들을 선별해 마이크로파이펫으로 떼어낸 후, 덩어리를 물리적으로 잘 풀어준 후, 다시 배양한다 (미국 특허 제6,833,269호 참조). 배아 줄기세포 같은 표현형이란 외관상 높은 핵/세포질 비율을 보이고 핵인이 두드러진 세포들이 빽빽한 콜로니라고 간주된다. 얻어진 배아 줄기세포 간단한 트립신 처리를 통해서나 마이크로파이펫으로 개개의 콜로니들을 선택해 언제나 계대배양 할 수 있다.
다른 방법으로는, 인간 배아 줄기세포는 마우스 태아 섬유 아세포 지지세포 층 위에 기본 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF)를 포함한 배양액으로 혈청없이도 배양할 수 있다 (Amit et al., 2000). 또 다른 방법으로는, 인간 배아 줄기세포는 매트리젤(Matrigel) 또는 라미닌(laminin) 같은 단백질 메트릭스(matrix) 위에 기본 섬유아세포 성장인자를 함유한 "조절된(conditioned)" 배양액으로 지지세포 층 없이도 배양 할 수 있다(Xu et al., 2001). 배지는 섬유 아세포와 배아 줄기세포를 함께 배양하는 조건에 맞추어 미리 조절된 것이다.
붉은털원숭이와 비단원숭이의 배아 줄기세포를 분리하는 방법 역시 알려져 있다(Thomson, and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000).
배아 줄기세포의 다른 출처는 확립 배아 줄기세포주이다. 다양한 마우스 배아 줄기세포주와 인간 배아 줄기세포주가 알려져 있고 그들의 성장조건과 증식조건이 잘 정의되어 있다. 예를 들어, 마우스 CGR8 세포주는 129 품종의 마우스 배아 내세포괴로부터 확립되었고, 마우스 CGR8 세포주는 LIF 존재하에서 지지세포 층 없이도 배양 할 수 있다. 다른 예로는, 인간 배아 줄기세포주 H1, H7, H9, H13 및 H14가 Thompson et al.에 의해 확립되었다. 더불어 H9 세포주의 H9.1과 H9.2가 제작되었다. 예를 들어, Yu and Thompson (2008)에 개시된 바와 같은, 당업자에 알려진 어떤 배아 줄기세포 또는 줄기세포주도 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있을 것으로 사실상 예측되며, 상기 문헌은 참조로서 본 명세서에 삽입된다. 추가로, 유도 만능성 줄기세포(iPS)는 치료 목적으로 다시 환자에게 주입할 수 있도록 그 대상으로부터 만들어 확립하였다. 그러므로 유도 만능성 줄기세포는 맞춤형 의료에 사용될 수 있다.
본 발명과 연관지어 사용하기 위한 배아 줄기세포의 출처는 배반포, 즉 배반포의 내세포괴를 배양해서 얻은 세포, 또는 확립 줄기세포주를 배양해서 얻은 것이 되겠다. 그러므로, 본 명세서에서 사용된 용어 "배아 줄기세포"는 배반포의 내세포괴, 즉 내세포괴의 배양으로 얻은 배아 줄기세포, 및 확립 줄기세포주를 배양해서 얻은 배아 줄기세포로 해석된다.
만능성 세포란 신체의 어떤 세포로도 분화할 능력을 지닌 세포를 말한다. 배아 줄기세포의 만능성은 다양한 방법으로 측정된다(Martin, 1982). 한 시험의 예를 들자면, 배반포의 내세포괴에서 유래한 마우스 배아 줄기세포를 또 다른 배반포의 빈 공간에 주입해 보는 것이다. 주입된 배반포가 위임신한 암컷 마우스의 자궁에 착상하면 자손이 나오는데, 수용자의 배반포 세포와 주입한 배반포 세포의 키메라가 나오는지 보는 것이다. 또 다른 시험으로는, 마우스 배아 줄기세포를 성체 마우스에게 주입해서 테라토마라곡 불리우는 종양을 형성하는지 보는 것이다. 이런 종양은 내배엽, 중배엽, 및 외배엽에서 유래된 다양한 세포 유형을 포함하고 있다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 테라토마에서 유래된 세포가 본 발명 목적에 따라 배양되거나 신경세포 또는 신경세포에 기울어진 세포로 분화될 수 있다. 인간 배아 줄기세포의 만능성 역시 면역결핍 마우스에서의 테라토마 형성을 시험해봄으로서 알아 낼 수있다. 세번째 시험으로는, 배아 줄기세포가 배양되는 조건을 더 분화한 세포로 분화시키기 위한 조건으로 옮겨보는 것이 있다. 예를 들어, 마우스 배아 줄기세포는 지지세포 층을 걷어내고 LIF를 배양액에 첨가하면 자연적으로 다양한 세포 유형으로 분화한다. 비슷하게, 인간 배아 줄기세포는 지지세포 층을 걷어내고 배아 줄기세포를 어디에도 부착되지 않은채로 부유배양을 하게 되면 자연적으로 다양한 세포 유형으로 분화한다(Itskovitz-Eldor et al., 2000; Reubinoff et al., 2000; Roach et al., 1993). 이런 조건에하에서는, 배아 줄기세포는 신경세포와 심근세포의 특징을 가진 세포를 포함하고 있는 배상체(embryoid bodies) 라고 불리우는 세포 응집체를 형성한다. 이런 모든 시험법으로, 배아 줄기세포가 내배엽, 중배엽, 및 외배엽에서 기원한 세포가 될 수 있다는 만능성을 보여준다.
배아 줄기세포는 그것들이 생산하는 단백질들을 분석해서 특징지을 수도 있다. 예를 들어, 다음의 표지 단백질들이 배아 줄기세포를 특징지을 목적으로 사용되어진다: stage-specific embryonic antigen SSEA-1, stage-specific embryonic antigen SSEA-3, stage-specific embryonic antigen SSEA-4, tumor rejection antigen-1-60 (TRA1-60), tumor rejection antigen-1-81 (TRA1-81), alkaline phosphatase (AP), 및 transcription factor Oct-4. 표 1에서 보는 바와 같이, 마우스, 인간, 및 포유류 세포들은 각각 이런 표지들을 발현하는 패턴에 차이가 있다. 예를 들어, SSEA-1은 마우스 배아 줄기세포에서는 발현되지만 인간이나 원숭이 배아 줄기세포에서는 발현되지 않는 반면, TRA1-60은 인간과 포유류 배아 줄기세포에서는 발현되지만 마우스 배아 줄기세포에서는 발현되지 않는다.
배아 줄기세포 표지의 발현
표지 마우스 인간 원숭이
SSEA-1 Yes No No
SSEA-2 No Yes Yes
SSEQ-3 No Yes Yes
TRA1-60 No Yes Yes
TRA1-81 No Yes Yes
AP Yes Yes Yes
Oct-4 Yes Yes Yes
배양 조건에 따라, 배아 줄기세포는 분화되었거나 분화되지 않은 세포들의 콜로니를 생성할 수 있다. 용어, "분화하다(differentiate)"는 세포가 아래의 발생 경로로 진행하는 것을 의미한다. "분화된(differentiated)"이란 용어는 다른 세포와 비교했을 때 상대적으로 아래의 발생 경로로 진행하는 세포의 상태를 설명할 때 사용하는 상대적 용어이다. 예를 들어, 만능성 세포는 인체의 어떤 세포로도 자랄 수 있으나, 조혈모세포와 같은 더 "분화된" 세포들은 더 적은 수의 세포 종류로 자랄 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "분화되지 않은 배아 줄기세포(undifferentiated ES cell)"는 더 분화한 세포의 특징을 나타내지 않는 배아 줄기세포로 해석된다.
2. 유도 만능성 줄기세포
유도 만능성 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPS cell)란 배아 줄기세포의 특징을 지닌 세포이지만 분화된 체세포로부터 역분화시켜 얻은 줄기세포를 뜻한다. 유도 만능성 줄기세포는 다양한 방법으로 얻을 수 있다. 한 방법으로는, 성인 상피세포에 전사인자인 Oct3/4, Sox2, c-Myc 과 Klf4 유전자를 레트로바이러스 형질도입을 이용하여 도입시켜 얻을 수 있다(Takahashi et al., 2007). 유전자가 도입된 세포를 SNL 지지세포(LIF를 생산하는 마우스 섬유 아세포주) 위에 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) \를 포함한 배양액에 깔아준다. 약 25일이 지난 후, 인간 배아 줄기세포 콜로니를 닮은 콜로니들이 배양중에 나타난다. 배아 줄기세포를 닮은 콜로니를 따서 지지세포위에 bFGF 존재하에 증식시킨다. 세포 특징에 기반하여, 배아 줄기세포를 닮은 콜로니는 유도 만능성 줄기세포이다. 유도 만능성 줄기세포는 외관상 인간 배아 줄기세포와 흡사하고, 다양한 인간 배아 줄기세포 표지들을 발현한다. 인간 배아 줄기세포의 분화를 유발하는 조건에서 이 세포들을 키워 줄 경우 역시나 유도 만능성 줄기세포는 적절하게 분화한다. 예를 들어, 유도 만능성 줄기세포는 신경세포 구조를 가지면서 신경세포 표지를 발현하는 세포로의 분화가 가능하다. 사실상 어떠한 유도 만능성 줄기세포 또는 줄기세포주도 (Yu and Thompson (2008) 에 설명된 바와 같이) 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있을 것으로 예측된다.
또 다른 방법으로는, 인간 태아의 또는 신생아의 섬유 아세포에 Oct4, Sox2, Nanog와 Lin28 네 가지 유전자를 렌티바이러스 형질도입을 이용하여 도입시켜 얻을 수 있다 (Yu et al., 2007). 감염시킨지 12 ~ 20일이 흐르면, 인간 배아 줄기세포의 외형을 지닌 콜로니들이 나타난다. 그 콜로니들을 따서 증식시킨다. 콜로니로 만들어진 유도 만능성 줄기세포는 그 표현형이 인간 배아 줄기세포와 흡사하고, 다양한 인간 배아 줄기세포 표지들을 발현하며, 신경조직이 포함된 테라토마를 형성할 수 있고, 마우스에 주사했을 경우 연골과 내장 상피세포가 될 수 있다.
마우스로부터 유도 만능성 줄기세포를 준비하는 방법 역시 알려져 있다 (Takahashi and Yamanaka, 2006). 유도 만능성 줄기세포로의 유도는 일반적으로 Sox 패밀리 유전자 중 적어도 하나와 Oct 패밀리 유전자 중 적어도 하나를 발현시키거나 노출시켜 이룬다. Sox와 Oct는 배아 줄기세포의 정체성을 특징짓는 전사 조절 계층에서 중요한 역할을 담당 할 것으로 생각된다. 예를 들어, Sox 유전자는 Sox-1, Sox-2, Sox-3, Sox-15, 또는 Sox-18일 수 있고, Oct 유전자는 Oct-4일 수 있다. Nanog, Lin28, Klf4, 또는 c-Myc같은 추가적인 인자들은 역분화 효율을 증가시킨다; 역분화 인자들의 구체적인 세트는 Sox-2, Oct-4, Nanog, 선택적으로 Lin-28을 포함하거나; Sox-2, Oct4, Klf4, 선택적으로 c-Myc을 포함한다. 다양한 구체예에서, Oct-4, Nanog, Klf-4, 및 Sox-2는 배아 줄기세포의 만능성을 유도 및/또는 유지시키기 위해 사용된다.
3. 체세포 핵치환으로 얻는 배아 줄기세포
특정 구체예에서, 만능성 줄기세포는 체세포 핵치환으로 얻은 배아 줄기세포를 의미한다. 체세포 핵치환에서는, 공여자의 핵을 방추체(spindle)를 없앤 난모세포로 치환시킨다. 핵치환으로 얻어진 줄기세포는 유전적으로 공여자의 핵의 유전형과 동일하다. 한 방법으로는, 히말라야 원숭이의 피부 섬유 아세포로부터 얻어진 공여자 섬유 아세포의 핵을 방추체를 없앤 원숙 중기 II기의 히말라야 원숭이 난모세포의 세포질로 전기융합(electrofusion)을 이용해 넣는다(Byrne et al., 2007). 융합된 난모세포는 아이오노마이신(ionomycin)에 노출시켜 활성화시킨 후, 배반포 단계가 될 때까지 배양한다. 그 뒤에, 선택된 배반포의 내세포괴를 배아 줄기세포주로 만들기 위해 배양한다. 배아 줄기세포주는 일반적인 배아 줄기세포의 표현성을 보이고, 다양한 배아 줄기세포의 표지를 발현하며, 체내와 체외에서 모두 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "배아 줄기세포"는 수정된 핵을 포함한 배아로부터 얻은 배아 줄기세포로 해석된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "체세포 핵치환으로 얻은 배아 줄기세포"는 배아 줄기세포와는 구별되게 핵치환으로 만든 배아 줄기세포로 해석된다.
4. 신경 줄기세포
신경 줄기세포는, 자가재생(self-renewal)할 수 있는 신경 줄기세포로 자랄 수 있거나 완전히 분화되었을 때 신경세포가 될 수 있는, 신경 조직으로부터 얻은 분화하지 않은 세포를 말한다. 신경 줄기세포는 성체 신경 줄기세포 또는 배아 신경 줄기세포를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "성체" 신경 줄기세포는 성인 또는 아동의 신체조직에서 유래된 줄기세포를 의미한다. 인간과 다른 동물들로부터 성체와 배아 신경 줄기세포를 얻는 방법은 잘 알려져 있다(Rietze and Reynolds, 2006; Svendsen et al., 1999).
B. 세포배양
1. 일반적인 세포배양
당업자에게 알려진 만능성 줄기세포와 다능성 줄기세포를 배양하는 어떠한 방법이라도 본 발명의 방법에 포함하기 위해 고려될 수 있다. 하기 목록을 포함하는 세포 생물학, 조직 배양, 발생학 분야의 기본 참고서와 리뷰논문들이 본 명세서에 참고문헌으로 삽입된다. 기형암 (Teratocarcinomas)과 배아 줄기세포 분야: "실용적인 접근 방식 (A practical approach) (1987)"; "마우스 발생의 기술 가이드 (Guide to Techniques in Mouse Development) (1993)"; "시험관에서 배아 줄기세포 분화(Embryonic Stem Cell Differentiation In Vitro) (1993)". 배아 줄기세포의 성질과 용도 분야: "인간 생물학과 유전자 요법의 응용 전망 (Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy) (1998)".
일반적인 조직 배양은 다음과 같은 책에 설명된 방법을 기본 방법으로써 사용하였다: "동물세포 배양 (Animal Cell Culture) (1987)"; "포유류 세포를 위한 유전자 전달 벡터들 (Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells) (1987)"; 및 "분자생물학의 최신 프로토콜과 분자생물학의 짧은 프로토콜 (Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology) (1987 & 1995)".
2. 성장 배양액
줄기세포 배양을 위한 다양한 배양조건들은 당업자에게 알려져 있다. 어떤 측면에서는, 세포들은 섬유 아세포 같은 지지세포와 함께 성장시키거나 섬유 아세포 조건의 배양액에서 키울 수 있다. 그러나 어떤 예에서는, 줄기세포를 지지세포 없이 키우는 방법을 택할 수 있다. 다른 측면에서는, 세포는 TeSR (예를 들어, BD Biosciences에서 구입할 수 있는 MTESR.TM.1) 같은 확정된 배양액에서 키울 수 있다(Ludwig et al., 2006a, 미국 특허출원 제2006/0084168호). 이런 배양액은 배아 줄기세포의 혈청이 없는 조건에서의 배양에 사용될 수 있다. 다른 구체예에서는, 배양액에 필요한 성장인자들을 공급하기 위해 소나 인간의 혈청을 첨가해준다 (Ludwig et al., 2006b).
예를 들면, 배양액은 DMEM, RPMI 1640, GMEM, 또는 뉴로베이잘 배지(neurobasal medium)가 될 수 있다. 배양액은 혈청을 포함할 수도 있고, 혈청이 없는 배양액일 수도 있다. 혈청이 없는 배양액은 외부에서의 성장인자 첨가없이 사용할 수도 있고, basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-like growth factor-2 (IGF-2), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor 8 (FGF8), Sonic hedgehog (Shh), brain derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), 또는 Vitamin C와 같은 성장인자들을 첨가시켜 사용할 수도 있다. 비부착성 표면이란 낮은 부착성 조직을 배양하는 플라스틱일 수 있다.
첫 단계에서 처럼, 두번째 단계의 배양액은 만능성 줄기세포나 신경 줄기세포의 성장을 지원하는 어떤 배양액이라도 사용될 수 있다. 배양액은 혈청을 포함 할 수도 있고, 성장인자의 첨가 유무의 혈청이 없는 배양액일 수도 있다. 비슷하게, 세포는 비부착성 조직 배양 표면에 부유배양시켜 키울 수 있다.
더 나아간 본 발명의 측면에서, 줄기세포를 분리하게 될 때(예를 들어, 세포 집단을 나눠 계대배양(splitting) 할 때) 나타나는 세포자멸사를 감소시키는 분자와 같은 부가적인 배양액 성분이 줄기세포 성장 배양액에 포함될 수 있다. 예를 들어, 배양액은 하나 또는 그 이상의 Y-27632 또는 그로부터 파생되는 Rho-associated kinase(ROCK) 억제제를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명의 배양액은 HA-100 또는 그로부터 파생되는 물질을 포함할 수 있다. H-1152((S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)술포닐]호모피페라진)를 포함하는 다른 ROCK 억제제가 줄기세포 성장 배양액에 포함 될 수 있다. H-1152 는 HA-100 보다 약 10배 더 뛰어난 효과를 보인다. 그러므로, H-1152는 예를 들어, 약 0.1-10 μM, 약 0.5-5 μM, 약 1-3 μM, 또는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 또는 5 μM 또는 그로부터 유도될 수 있는 어떠한 범위 내의 농도로 배아 줄기세포 성장 배양액에 존재할 것이다. 특정 구체예에서, HA-100은 줄기세포 배양액에 개별화된 인간 배아 줄기세포를 매우 효과적으로 96-웰 플레이트에 깔 수 있도록 약 1 μM의 농도로써 존재한다(HA-100과 비슷하지만 10배 낮은 농도). 개별화된, 그렇지 않으면 세포 덩어리가 되어 버리는, 인간 배아 줄기세포는 웰 당 더욱 고른 세포 밀도를 보이는데 이는 세포기반 작은 분자 스크리닝을 하기위해서는 필수조건이다. 그러므로 본 발명에 따라 자동화된 세포 배양이 관련된 배아 줄기세포기반 작은 분자 스크리닝을 위한 프로토콜에 H-1142가 사용될 수 있다. H-1152에 대해서는 Ikenoya et al. (2002 과 Sasaki et al. (2002)에 설명되어 있으며, 상기 참고문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.
배아 줄기세포 성장 배양액에 포함될 수 있는 다른 ROCK 억제제에는 Y-27632, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, 글리실-H1152 ((S)-(+)-2-메틸-4-글리실-1-(4-메틸이소퀴놀리닐-5-술포닐)호모피페라진) 및/또는 HA1100(히드록시파우스딜, Hydroxyfausdil)가 있다. Y-27632((R)-(+)-트란스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)시클로헥산카르복사미드)는 Sigma-Aldrich 회사로부터 상업적으로 구입 가능하고 기존에 설명되어 있다 (예를 들어, Maekawa et al., 1999; Davies et al., 2000 등을 참고).
3. 세포배양 기구, 시스템, 및 방법
다른 측면에서, 본 발명은 생물 반응 장치(bioreactor) 기술을 이용한다. 최종 용도로 더 분화할 능력이 있는 완전히 생물학적으로 활성화된 세포의 대규모 생산을 위해 생물 반응 장치에서 세포를 키운다. 생물 반응 장치는 부유와 부착의존성 동물 세포배양 모두에서 생물학적인 생산물을 얻기 위해 널리 사용된다. 교반탱크 생물 반응 장치에서의 마이크로캐리어(Microcarrier) 세포배양은 매우 큰 부피에 특화된 배양 표면적을 제공하고 이는 바이러스의 백신을 생산하는데 사용되기도 한다 (Griffiths, 1986). 나아가, 교반탱크 생물 반응 장치는 산업상으로 규모 확장이 가능한 것으로 증명되었으나, 이 기술은 부착 비의존적인 성장을 하는 세포를 배양할 경우에 한정된다. Corning-Costar에서 제조된 멀티플레이트 CELLCUBETM 세포배양 시스템 역시 매우 큰 부피에 특화된 배양 표면적을 제공한다. 세포는 작은 큐브 모양으로 서로 밀봉된 배양 플레이트의 양쪽 면에 모두 자랄 수 있다. 교반탱크 생물 반응 장치와 달리 CELLCUBETM 배양 기구는 일회용이다. 이것은 자본 지출, 품질관리와 일회용 시스템과 관련된 품질보증 비용을 줄여주므로 임상 제품의 초기생산에 매우 적합하다.
a. 비관류(non-perfused) 부착 시스템
전통적으로, 부착의존성 세포의 배양은 여기에 설명한대로 작은 유리나 플라스틱의 바닥에서 증식시킨다. 고전적이고 전통적인 기술은 제한된 표면-대비-부피 비율은 제공하고, 실험실 규모에 적합하며, 세포와 세포 생산물을 대규모로 생산함에 있어 병목현상을 야기한다. 적은 배양 부피에서도 큰 접근 표면을 제공하기위한 몇몇 기술들이 제안되었다: 롤러 병(roller bottle) 시스템, 스택 플레이트 성장 촉진기(stack plates propagator), 나선 필름 병(spiral film bottle) 시스템, 속이 빈 섬유(hollow fiber) 시스템, 꽉 찬 모판(packed bed), 플레이트 교환(plate exchanger) 시스템, 및 박막 배관 얼래(membrane tubing reel). 이러한 시스템들은 본성상 이질적이므로, 또한 가끔씩은 다중 프로세스에 기반하고 있기 때문에, 다음과 같은 단점이 존재한다 - 제한된 규모 확장, 세포 샘플을 취하기 어려움, 중요한 변수의 측정과 조절의 제한, 및 배양하는 내내 균질 환경조건을 유지하기 어려움.
이러한 결점들에도 불구하고 큰 규모의 부착의존성 세포를 생산하기 위해 일반적으로 사용되는 과정은 롤러 병 시스템이다. 단지 대형의 T-플라스크와 차이가 나는 모양의 것으로, 시스템의 간단함은 롤러 병 시스템을 매우 믿음직하고 매력적이게 만든다. 완전 자동화된 로봇은 하루에 수천개의 롤러 병을 처리하는게 가능하므로 그렇지 않았다면 고강도의 인간 노동력이 필요했을 오염의 위험과 불일치성을 없앨 수 있다.
b. 마이크로캐리어 배양
전통적인 부착의존성 세포배양 과정의 단점을 극복하기 위한 노력으로, van Wezel(1967)은 마이크로캐리어 배양 시스템 컨셉을 개발하였다. 이 시스템에서, 세포는 느린 교반을 통해 성장 배양액에 떠 다니는 소형 고체 입자 표면에서 증식된다. 세포는 마이크로캐리어에 부착되어 마이크로캐리어 표면을 가득 채울때까지 점차 성장한다. 사실상 이 대규모 세포배양 시스템은 단일 디스크 프로세스에서 단일 층(monolayer) 배양과 부유배양을 함께 할 수 있는 유닛 프로세스로 업그레이드하였다. 그러므로 세포가 성장할 때 필요한 표면과 균질 부유배양의 장점을 결합해 생산성을 증대시켰다.
대부분의 다른 부착의존성 세포 대량 배양법에 비해 마이크로캐리어 배양의 장점은 몇 가지가 있다. 첫번째로, 마이크로캐리어 배양은 높은 표면-대비-부피 비율(캐리어의 농도에 따라 변함)을 제공해서 높은 세포 밀도의 수확을 할 수 있고 잠재적 고농도 세포 생산 능력을 갖는다. 세포 수확률은 관류 장치를 부착하면 1~2*107 cells/ml 까지 증가한다. 두번째로, 많은 소형 저생산성 용기(예를 들어, 플라스크 또는 접시)를 사용해 세포를 배양하는 다른 방식 대신 이 방식은 세포를 하나의 유닛 프로세스 용기에서 증식시킨다. 이 결과, 더 나은 영양물 이용률과 주목할만한 배양액 소비의 절감을 가져왔다. 게다가, 단일 반응장치에서의 증식은 설비공간의 감소를 이끌어내고 세포 당 필요한 처리과정의 감소를 이끌어내서, 인건비와 오염의 위험을 줄인다. 세번째로, 잘 섞이고 균질한 마이크로캐리어 부유배양은 환경조건 (예를 들어, pH, pO2, 및 배양액 성분의 농도)의 감시와 제어를 가능하게 하여 더욱 더 재현 가능하게 세포를 증식 및 생산물 회수를 가능하게 한다. 네번째로, 현미경 관찰, 약물 시험, 또는 계수를 위한 대표 샘플을 취하는 게 가능하다. 다섯번째로, 마이크로캐리어는 부유 상태를 벗어나 빠르게 가라앉기 때문에, 일괄적으로 영양분을 공급하는 과정과 세포의 수확이 상대적으로 쉽게 수행될 수 있다. 여섯번째로, 마이크로캐리어에 부착의존성 증식 배양의 형태는 다른 세포적 취급을 위한 용도(예를 들어, 단백질 분해 효소의 사용 없이 하는 세포 옮기기, 세포들의 공동 배양, 동물로의 이식, 및 마이크로캐리어 유지를 위한 디캔터, 컬럼, 유동상층, 또는 속이 빈 섬유를 사용한 세포배양의 관류)로 이 시스템을 사용 가능하게 한다. 일곱번째로, 마이크로캐리어 배양은 미생물과 동물세포 부유배양에 사용하는 평범한 기구를 이용하여 상대적으로 쉽게 규모를 키울 수 있다.
c. 포유류 세포를 마이크로캡슐에 넣기(microencapsulation)
포유류 세포를 배양하는데 특히 유용해 보이는 하나의 방법으로는 마이크로캡슐에 넣기가 있다. 포유류 세포를 반투과 히드로젤 막 안에 집어 넣는다. 다공성 막은 세포들의 주변을 싸고 있고 캡슐을 둘러싼 대량의 배양액과 영양성분, 가스, 및 대사물의 교환을 가능하게 한다. 순하고, 빠르고, 독성이 없고, 배양 기간 동안 세포덩어리의 성장을 유지시킬 만큼 충분히 다공성이고 강하게 막을 만들 수 있는 다양한 방법들이 개발되었다. 이 방법들은 모두 칼슘을 포함한 용액에 작은방울 접촉으로 만들어진 수용성 알긴산염 젤을 기반으로 한다. Lim(1982, 미국 특허 제4,352,883호, 여기에 참고문헌으로 삽입)은 세포를 약 1% 알긴산염나트륨 용액에 작은 구멍을 통해 집어넣으면, 작은 방을을 형성하게 되고, 약 1% 염화칼슘 용액에 넣어서 이 방울을 터뜨릴 수 있다고 설명한다. 그러면 작은 방울은 알긴산염 표면에 이온결합한 폴리아미노산 층에 들어간다. 마지막으로 작은 방울을 칼슘이온을 제거하기 위한 킬레이팅 시약을 처리함으로 다시 알긴산염은 액화된다. 다른 방법으로는, 칼슘 용액에 있는 세포들을 알긴산염 용액에 방울로 떨어뜨려 속이 빈 알긴산염 구체를 만든다. 비슷한 시도로는, 키도산 용액에 있는 세포들을 알긴산염 용액에 방울로 떨어뜨려 역시 속이 빈 알긴산염 구체를 만든다.
마이크로캡슐에 넣어진 세포는 교반 탱크 반응 장치에서 쉽게 증식되고, 방울 크기가 직경 150~1500 ㎛의 범위를 지니기 때문에 촘촘한 망을 이용해 쉽게 관류 반응 장치안에 남아있게 할 수 있다. 캡슐 부피 대비 전체 배양액 부비 비율은 1:2에서부터 1:10까지의 밀도로 유지될 수 있다. 캡슐안에 있는 세포의 밀도는 108까지 가능하나 효과적으로 배양하기 위한 세포의 밀도는 1~5*107이다.
다른 프로세스보다 뛰어난 마이크로캡슐에 넣기 방법의 장점은 공기주입과 교반으로부터 발생하는 해로운 비틀림 스트레스 효과로부터 보호될 수 있다는 점과, 관류 시스템을 사용할 목적으로 방울을 쉽게 잡아둘 수 있다는 점, 및 대량화가 상대적으로 수월하고 방울을 직접 이식에 사용할 수 있다는 점이 되겠다.
d. 관류 결합 시스템
관류 결합 시스템 역시 본 발명의 방법에 사용을 위해 고려되었다. 관류란 세포의 집단을 통과하거나 넘는(생리학적 영양분 용액의) 정속이고 연속적인 흐름을 의미한다. 관류란 회수된 배양액과 함께 세포가 씻겨 나오는 연속적인-흐름 배양법(예를 들어, 항성분 배양조)과는 반대로 세포가 배양 유닛 안에 보존되어있다는 뜻을 함축한다. 관류의 개념은 이번 세기의 시작때부터 알려졌고, 확장된 현미경 관찰을 위한 살아있는 조직의 작은 조각을 보존하는데 실제 적용되기 시작하였다. 이 기술은 세포가 피, 림프, 또는 다른 체액을 지속적으로 공급받을 수 있는 생체내 환경을 흉내내기위해 시작되었다. 관류없이는, 배양중의 세포는 영양분 공급 국면과 굶주린 국면이 교대로 지나게 되어 성장과 대사능의 최대치에 제한이 걸린다.
관류배양의 최근 사용법은 고밀도 (0.1~5*108 cells/ml)로 세포를 키우기 위한 도전에 대응하고 있다. 밀도를 2~4*106 cells/ml 이상으로 증가시키기 위해서는, 영양결핍을 만회하고 독성 생성물을 제거하기 위하여 배양액이 신선하게 공급되어 일정하게 교체되어야 한다. 관류는 배양 환경(pH, pO2, 영양분 수준, 기타 등등)의 더 나은 제어를 허용하고 세포 부착을 위한 배양에서 표면적의 활용도를 현저하게 증가시키는 수단이다.
엮이지 않은 직물의 바닥 메트릭스(bed matrix)를 이용한 관류되는 꽉찬 바닥(packed-bed) 반응 장치의 개발은 바닥 부피의 108 cells/ml 가 넘는 밀도로 관류배양을 유지하는 수단을 제공하였다(CELLIGENTM, New Brunswick Scientific, Edison, N.J.). 간략히 기술하자면, 이 반응 장치는 부착의존성과 부착비의존성 세포를 모두 배양하기 위한 향상된 반응 장치로 이루어진다. 이 반응 장치는 내부 순환 수단이 달린 꽉찬 바닥(packed-bed)으로써 설계되었다. 되도록이면, 섬유 매트릭스 운반체(fiber matrix carrier)는 반응 장치 용기가 든 바구니 안에 위치한다. 바구니의 윗면과 바닥면 부분은 구멍이 있고, 배양액이 바구니를 통해 흐르도록 해준다. 특별히 설계된 임펠러는 영양소의 균질한 공급과 배설물의 제거를 확보하기 위해 섬유 매트릭스가 차지한 공간을 통한 배양액의 순환을 제공한다. 이것은 동시에 전체 세포 덩어리의 무시해도 좋을 만큼의 양만이 배양액 안에 부유해 있다는 것을 보장한다. 바구니와 순환의 조합은 공기방울이 없는 산소가 녹아있는 배양액의 섬유 매트릭스를 통한 흐름 역시 제공한다. 섬유 매트릭스는 10 ㎛에서 100 ㎛까지의 직경을 가진 작은 구멍을 가진 엮이지 않은 직물이고, 개개 세포 부피의 1에서 20배에 해당하는 구멍의 부피를 가지는 높은 내부 부피를 제공한다.
다른 세포배양 시스템과는 다르게, 이 접근법은 몇가지 중요한 장점을 제공한다. 파이버 매트릭스 운반체(fiber matrix carrier)가 있으면 세포들은 교반과 거품이 일게되어 발생하는 물리적 스트레스로부터 보호될 수 있다. 바구니를 통한 자유로운 배양액의 흐름은 세포에게 최적 조건으로 조절된 산소, pH, 영양소의 정도를 제공한다. 이 방법은 세포배양으로부터 세포가 포함되지 않은 생산물을 연속적으로 얻을 수 있고, 뒤이은 정제 단계를 수월하게할 수 있는 저단백 배양액에서도 생산될 수 있다. 또한, 이 반응 장치 시스템의 독자적인 설계 덕분에 반응 장치를 대량화하기가 수월하다. 최근에는 30리터까지의 대량화가 가능해졌다. 100리터와 300리터 버젼은 개발중에 있고, 이론상 계산해 봤을 때 1000리터 반응 장치까지의 지원이 가능하다. 상기 기술은 WO 94/17178 (Aug. 4, 1994, Freedman et al.) 에 자세히 설명되어 있으며, 상기 문헌은 그 전체로 참조로써 본 명세서에 삽입된다.
CELLCUBETM 모듈은 기질 부착세포를 고정시켜 배양하기 위한 스티렌으로 된(styrenic) 넓은 표면적을 제공한다. 그것은, 얇은 일련의 유사한 배양 플레이트를 이어붙여 인접 플레이트 사이에 얇고 밀봉된 층류(laminar flow: 층이 되어 흐르는 흐트러짐이 없는 흐름) 공간을 만든, 완전히 캡슐에 넣어진 살균된 일회용 기기이다.
CELLCUBETM 모듈은 서로 맞은편 대각선에 위치하여 배양액의 흐름 조절을 돕는 유입구와 배출구 포트를 가진다. 성장의 처음 며칠 동안, 배양은 일반적으로 초기 시딩(seeding) 후 시스템에 포함된 배양액에 의해 충족된다. 초기 시딩을 마친 후에서부터 배양액 관류를 시작할 때 까지의 시간은 접종(seeding inoculum)한 세포의 밀도와 세포의 성장률에 의해 정해진다. 순환 배양액에 포함된 영양분 농도의 측정은 배양의 상태를 표시하는 좋은 지표가 된다. 절차를 수립해야하는 경우, 가장 경제적이고 생산적인 작동 조건를 찾기 위해 다양한 관류속도에서 영양분의 성분을 모니터하는 작업이 필요할 것이다.
시스템안의 세포는 전통적인 배양 시스템에 비해 더 높은 용액의 밀도 (cells/ml) 에 도달한다. 대부분 일반적으로 사용되는 기저 배양액은 1~2*106 cells/ml/day 정도까지를 지원한다. 일반적인 85,000 cm2의 표면적을 가지는 CELLCUBETM는 약 6리터의 배양액을 모듈안에 함유한다. 배양 용기 안에서 세포 밀도는 종종 107 cells/mL 을 넘곤 한다. 세포가 꽉 찼을 때는, 매일 반응 장치 부피의 2~4배 만큼의 배양액이 필요하다.
e. 자동화된, 배아 줄기세포의 증식을 위한 장치/시스템
본 발명의 어떤 측면은 자동화된, 배아 줄기세포 같은 만능성 또는 다능성 세포들의 증식을 위한 장치나 시스템을 포함한다. 전형적인 장치는 생육할 수 있는 배아 줄기세포 집단, 배양기로 유체 소통이 가능하게 연결된 유체 조절 장치, 및 세포 구별을 위한 운영 프로그램을 포함하는 제어장치로 구성될 수 있다.
본 발명의 장치에서 사용하기 위한 배아 줄기세포 집단에는 당업자에게 알려진 어떤 출처로부터의 배아 줄기세포 집단도 포함될 수 있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기세포와 같은 배아 줄기세포를 얻기 위한 방법은 미국 특허 제5,843,780호, 제6,200,806호 및 제7,029,913호에서 설명되었다. 본 명세서에서 사용된 용어 장치는 단일 하우징 장치를 포함하나 이에 한정하지는 않고, 예를 들어, 전기적으로, 장치적으로, 또는 다른 결합 메커니즘으로 서로 연결된 복합 장치도 포함될 수 있다.
다양한 종류의 유체 조절 장치가 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들면, 어떤 측면에서는, 유체 조절 장치는 Hamilton MICROLAB® STAR work station 또는 Beckman Coulter BIOMEK® 2000 liquid handler (B2K) 같은 로봇 조정기 일 수 있다. 로봇 유체 조정기에 관하여 미국 특허 제6,325,114호를 참조한다. 또 다른 측면에서는, 유체 조정기란 로봇팔을 포함하는 것이 아니라 오히려, 예를 들어, 유체 조정 장치 또는 마이크로 유체 조정 장치 같이, 유체를 밸브 작동과 압력 구배의 응용으로 이동시키는 장치수 있다.
다양한 종류의 배양기들이 당업자에게 알려져 있으며, 본 발명의 구체예에 따라서 사용될 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서 상기 배양기는 Kendro CYTOMATTM 배양기일 수 있다.
또한, 본 발명의 어떤 구체예에서는, 세포 증식 장치와 시스템은 줄기세포 증식의 제어를 위한 제어장치를 포함할 수 있다. 상기 제어장치는, 유체 조절 장치와 전기적으로 소통할 수 있는 프로그램, 유체 소통 장치, 및/또는 배양기를 의미한다. 일 측면에서, 당업자라면 운영 장치 또는 시스템이 컴퓨터 또는 컴퓨터 판독 가능 매체를 포함한다는 사실을 알 수 있다.
운용 장치는 컴퓨터 자동 제어 수단에 의해 달성될 수 있고, 그것으로 인하여 운용 장치는 본 발명의 어떤 구체예를 구성하는 다양한 하드웨어 기기들을 명령하고 제어한다는 것을 확인할 수 있다. 하드웨어 요소들의 통합을 달성하기 위해 사용되어지는 전형적인 운용 프로그램이 OVERLORDTM Integration software program (Biosero, Inc.)인데, 이는 장치들 사이를 단순한 드래그-앤드-드랍 방식으로 서로 소통할 수 있도록 해준다. 또한, 상기 소프트웨어는 숫자 변수와 문자열 변수, 조건문, 및 제어루프 같은 다양한 요소들을 프로그래밍하는 것이 가능하다.
선택적으로, 본 발명에 따른 장치는 배양기와 유체 조절 장치 간의 유체 소통을 수월도록 하는 유체 소통 장치를 포함할 수 있다.
예를 들어, 유체 조정기가 로봇 조정기일 경우에는, 유체 소통 장치란, 세포 플레이트를 유체 조절 장치 와 배양기 간에 이동시키는 기기와 같은, 로봇 기기일 것이다. 예를 들면, 로봇 기기는 Hudson Platecrane XL 일 수 있다.
게다가, 만능성세포 또는 배아 줄기세포 증식 시스템은 하나 또는 그 이상의 유체 조절 장치를 위한 시약 등을 보관하는 저장소를 포함할 수 있다. 예를 들어 저장소는 단백질 분해 효소 억제제를 함유하거나 하지 않은 세포 증식 배양액; 세포 배양 플레이트; 단백질 분해 효소 용액; PBS; 및/또는 파이펫 팁을 포함한다. 어떤 측면에서는, 부가적인 로봇 기기들은 유체 조절 장치와 저장소 간의 전달을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서 저장소는 TeSR 배지(선택적으로, ROCK 억제제 및/또는 콩 트립신 억제제와 같은 단백질 분해 효소 억제제와 함께) 를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서 저장소는 단백질 분해 효소(예를 들면, 트립신, EDTA 등)를 포함하는 용액을 포함할 수 있다.
어떤 측면에서 Beckman Coulter Stacker Carousel는 저장소(예를 들면, 플레이트 또는 피펫 리저버)와 유체 조절 기기 간의 전달을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 저장소는 냉장고 같은 온도 조절 장치 안에 들어 있을 수 있다. 온도 조절 장치는 선택적으로, 용액을 원하는 온도 (예를 들면, 37℃) 로 미리 데워놓기 위한 가열 장치를 포함할 수 있으나, 본 발명자들은 어떤 구체예에서 단순 냉장고처럼 가열 장치가 필요하지 않음을 밝혔다.
4. 집단으로부터 개개의 세포들의 분리
본 발명의 방법에서 어떤 구체예들은 세포들 집단으로부터 한 세포를 선택하는 방법을 포함한다. 당업자에게 알려진 어떠한 방법이라도 세포들 집단으로부터 개개의 세포를 분리하기 위한 방법으로서 고려될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 집단으로부터 개개의 세포를 분리하기 위해(96웰 플레이트에서) 유세포분석기를 이용한 고전적인 한계 희석 분석법이 활용되었다.
심근세포 운명이 아닌 세포들로부터 심근세포 운명의 세포들을 분류하는 가용한 기술들은 다양하다. 그러한 세포 분류 기술들은 예를 들어, 음성 면역선택법과 양성 면역선택법을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
면역선택법이란 선별 시스템의 특이성이 항체, 또는 렉틴(lectin)이나 헵텐(hapten) 같은 유사항체 분자에 의해 주어지는 다양한 기술들을 포함하는 포괄적인 용어이다. 이러한 특이성의 한 예는, 특정 세포 표면 항원에 대한 항체의 친화력이다. 면역선택법의 일반적이 두 유형이 실행되었다. 음성 면역선택법은, 이 문서의 방법에 따라 포유류 만능성 줄기세포를 분화시켜 얻어진 결과인 세포집단으로부터 심근세포 운명이 아닌 세포들을 제거하는 것 같은, 이질적 집단으로부터의 특정 부분 구성 집단의 제거를 수반한다. 반면 양성 면역선택법은, 이 문서의 방법에 따라 포유류 만능성 줄기세포를 분화시켜 얻어진 세포집단으로부터 심근세포 운명의 세포를 선택해서 회수하는 것 같은, 특정 구성성분의 직접적 선택과 회수를 의미한다. 다양한 종류의 면역선택법이 본 발명의 실시에 사용될 수 있으며, 예를 들어, 유세포분석법(FACS), 면역자장기술, 항체컬럼법, 면역침전법, 및 면역패닝법(immunopanning)을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.
5. 비분화된 상태의 유지
만능성 세포와 다능잠재성 세포들은 당업자에게 알려진 어떤 방법을 사용해서 비분화된 상태로 유지될 수 있다. 예를 들어, 비분화된 상태는 세포들을 혈청과 지지세포 층이 존재하는 상태로 배양함으로써 유지되는게 가능할 수 있다.예를 들어, 지지세포 층은 마우스 배아 섬유아세포일 수 있다. 줄기세포를 비분화된 상태로 유지시키는 다른 방법들 또한 알려졌다. 예를 들어, 마우스 배아 줄기세포는 지지세포 층 없이 LIF의 존재하에 배양함으로써 비분화된 상태로 유지될 수 있다. 그러나, 마우스 배아 줄기세포와는 달리, 인간의 배아 줄기세포는 LIF에 반응하지 않는다. 인간 배아 줄기세포는 배아 줄기세포를 섬유아세포 지지세포 층 위에 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)의 존재하에 배양하거나 (Amit et al., 2000), 지지세포 층 없이 매트리겔(Matrigel)이나 라미닌(laminin) 같은 단백질 매트릭스 위에 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 포함한 섬유아세포-조건 배지의 존재하에 배양함으로써 (Xu et al., 2001; 미국 특허 제 6,833,269호) 비분화된 상태로 유지될 수 있다.
만능성 세포 또는 다능성 세포들의 배양은 집단중에서 줄기세포들과 그의 파생물들의 상당한 비율이 분화된 배아유래세포나 성체유래세포로부터 확실히 구별되는 비분화된 세포의 표현형적 특징을 보일 때 "비분화된" 배양으로 표현된다. 당업자에게 받아들여진 비분화된 배아 줄기세포는 일반적으로 현미경상에서 2차원의 높은 핵/세포질 비율을 보이고 핵인이 두드러진 세포들의 콜로니들로 나타난다. 비분화된 세포들의 콜로니들이 이웃한 세포들로 분화된 세포를 가질수 있다고 이해된다.
C. 줄기세포의 분화
인간 배아 줄기세포(hES)와 같은 줄기세포, 및 적절한 분화 인자를 제공하는 어떤 세포가 체외에서 함께 배양되었다. 이것은 인간 배아 줄기세포가 배양중인 배아세포의 증식에 의해 제조된 배아세포 단일층 위에 도입되는 것을 수반한다. 배아세포 단일층은 상당한 밀도까지 자라게되어, 줄기세포는 특정 세포 유형으로 분화하는 것을 유도할 충분한 시간동안 배아세포외액의 존재하에서 자라게 된다. 그 대신에, 줄기세포는 배아세포 없이 배아세포외액의 존재하에서 자라게 될 수도 있다. 배아세포와 줄기세포는 필터나 한천 같은 무세포 매트릭스에 의해 서로 떼어놓을 수 있다.
줄기세포의 분화를 위해서, 줄기세포를 배아세포 단일층 위에 깔아줘서 배양중에 줄기세포의 분화를 유도시키면서 자라게 할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적에 따라, 줄기세포는 당업자에게 알려진 어떤 방법을 사용해 심근세포와 심장 선조세포로 분화시킬 수 있다. 예를 들어, 아스코브 산(ascorbic acid)를 첨가해주어 그 분화를 유도시킬 수 있다.
최상의 줄기세포 증식 조건으로부터의 점진적인 철회(withdrawl)는 줄기세포의 특정 세포유형으로의 분화를 촉진시킨다. 공동 배양(co-culture)의 적합한 배양 조건은 분화율 및/또는 분화효율을 증가시킬 수 있는 DMSO, 레티노산(retinoic acid), FSFs, 또는 BMPs의 첨가를 포함할 수 있다.
일반적으로 배아세포층의 세포밀도는 그의 안정성과 성능에 영향을 미친다. 인간 배아 줄기세포의 심근세포로의 분화를 증가시키기 위한 세포 배양액은 아스코브산, 또는 기능적으로 그와 동등한 유도체를 함유한 배양액을 말한다. 배양액의 농도는 아스코브산, 또는 기능적으로 그와 동등한 유도체를 인간 배아 줄기세포로 전달하기에 적합한 농도이다. 그 농도는 10-3 M 에서 10-5 M범위일 수 있다. 더욱 적절한 농도는 10-4 M 이다. 만약 인간 배아 줄기세포를 배양하기에 적합하다면, 어떤 종류의 배양액도 적합하다.
세포 배양액은 혈청이 없는 상태일 수 있다. 그러나 다양한 농도의 혈청이 허용될 수 있으며, 그 범위는 20% 로부터 0% 까지이다. 혈청농도는 20%, 10%, 5%, 2.5%, 및 0%로 제공될 수 있다.
본 발명에 따라, 비분화된 포유류 줄기세포를 분화제에 노출시키는 것이 수행되었다. 비분화된 줄기세포는 일시적으로 분화제의 존재하에서 배양될 수 있고, 그 뒤에 분화제 없이 증식이 허락될 수 있다. 분화제 노출의 결과로 줄기세포가 신경세포, 간세포, 또는 심근세포로 분화하기만 한다면, 이 기초 절차의 변형이 고려되었다. 예를 들어, 첫번째 단계에서, 비분화된 줄기세포는 분화제의 존재하에서 비부착성 표면에서 부유상태로 배양될 수 있다. 두번째 단계에서, 줄기세포를 분화제에 적당한 시간동안 노출시킨 후, 그 세포는 분화제의 존재하에서 비부착성 표면에서 신선한 배양액과 함께 부유상태로 배양될 수 있다. 세번째 단계에서, 노출된 세포를 분화제 없이 깔아서 자라게 할 수 있다. 증식하고 있는 세포는 80~90%에 도달하면 계대배양할 수 있다.
첫번째 단계에서, 배양액은 줄기세포의 생존과 성장을 지원하는 어떠한 배양액도 될 수 있다. 예를 들어, 배양액은 DMEM, RPMI 1640, GMEM, 또는 뉴로베이잘 배지(neurobasal medium)가 될 수 있다. 배양액은 혈청을 포함할 수도 있고, 혈청이 없는 배양액일 수도 있다. 혈청이 없는 배양액은 외부에서의 성장인자 첨가없이 사용할 수도 있고, basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-like growth factor-2 (IGF-2), epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth factor 8 (FGF8), Sonic hedgehog (Shh), brain derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), 또는 Vitamin C와 같은 성장인자들을 첨가시켜 사용할 수 있다. 비부착성 표면이란 낮은 부착성 조직을 배양하는 플라스틱일 수 있다.
첫 단계에서 처럼, 두번째 단계의 배양액은 줄기세포의 성장을 지원하는 어떤 배양액이라도 사용될 수 있다. 배양액은 혈청을 포함 할 수도 있고, 성장인자의 첨가 유무의 혈청이 없는 배양액일 수도 있다. 비슷하게, 세포는 비부착성 조직 배양 표면에 부유배양시켜 키울 수 있다.
세번째 단계에서, 노출된 세포를 부착성 표면에 혈청이 포함된 배양액에서, 성장인자와 혈청이 없는 배양액에서, 또는 혈청은 없이 bFGF, IGF-2, EGF, FGF8, Shh, BDNF, GDNF, 또는 Vitamin C 등과 같은 성장인자가 포함된 배양액에서 배양시킬 수 있다. 부착성 표면이란 조직을 배양하는 플라스틱일 수 있고, 또는 폴리오르니틴/라미닌(polyornithine/laminin), bovine collagen I, human extracellular extract, porcine skin gelatin, 또는 Matrigel 등과 같은 것들이 코팅된 조직 배양 플레이트의 표면일 수도 있다. 세포들은 80~90%에 도달하게되면, 또는 어떤 수준으로 도달하게되면 계대배양할 수 있다. 세포 응집체, 단일 세포 현탁액, 또는 둘 다일 때 모두 배양될 수 있다. 계대배양을 위한 세포를 준비하기 위해서, 세포들은 부착성 표면으로부터 물리적으로, 또는 트립신-EDTA, 콜라게나제(collagenase), 또는 디스파아제(dispase)와 같은 단백질 분해 효소를 처리하여 화학적으로 해리시킬 수 있다.
첫번째, 두번째 및 세번째 단계의 모든 가능한 조합이 고려되었다. 예를 들어, 어떤 방법에서는, 두번째와 세번째 단계는 성장인자가 포함되었으나 혈청이 없는 배양액의 사용을 필요로하는 반면, 첫번째 단계는 성장인자와 혈청이 없는 배양액의 사용을 필요로 한다. 다른 방법에서는, 세 단계 모두 성장인자가 포함되었으나 혈청이 없는 배양액의 사용을 필요로 한다. 또 다른 방법에서는, 세포들이 세번째 단계에서 세포를 다시 깔기 전에, 배양액의 변화 없이 분화제(differentiation agent)에 노출되기 위해 첫번째와 두번째 단계가 결합되었다.
분화제의 효과적인 농도는 양-반응 분석법으로 측정될 수 있다. 분화제는 DMSO와 같은 용매에 용해될 수 있고, 그 후 다양한 농도로 배아 줄기세포 배양에 첨가될 수 있다.
당업자에게 알려진 어떠한 분화제도 본 발명의 분화제로서 고려되었다. 예를 들어, 도파민성 세포와 같은 신경성의 세포 유형으로 분화시키기 위해서는 적절한 배양액으로 PA6 지지세포 위에 같이 배양하는 것과 함께 stromal derived induced activity (SDIA)가 사용될 수 있다. 후기 분화 실험을 위해서는, 공동 배양물을 효소학적으로 해리시켜 폴리오르니틴이 코팅된 유리 커버슬립 위에 다시 깔아주었다.
심근세포는 부유상태로 생성시켰다. 배아 줄기세포를 단일 세포 수준으로 해리시켰으며, 각 세포는 제한된 배양액에서 배상체라 불리우는 부유 구조를 형성한다. 일주일 후, 박동하는 세포를 포함한 배상체의 백분율이(육안으로 평가) 정량화되었다. 어떤 구체예에서, 엑티빈(Activin)은 배양액에 포함되어 있다. 어떤 구체예에서, 분화에 사용된 Activin은 Activin A, Activin B, Activin AB, 또는 Activin C이다. 어떤 구체예에서, 한 종류 이상의 Activin이 사용될 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명 방법의 Activin을 대신하여, 또는 Activin에 추가하여, TGF-β, 노달(nodal), 또는 레프티(lefty)와 같은 TGFβ 슈퍼패밀리 멤버가 사용되었다. 어떤 구체예에서, 분화에 사용된 BMP는 BMP-2, BMP-4, 또는 BMP-7이다. 어떤 구체예에서, BMP는 BMP-2, BMP-4, 또는 BMP-7 이외의 BMP이다 (BMP-1을 제외하고). 어떤 구체예에서, 한 종류 이상의 BMP가 사용될 수 있다.
분화중인 세포는 BMP 단계 후에 Activin과 BMP 없이 배양될 수 있다. 그 배양 단계에서 IGF(insulin-like growth factor)가 포함될 수 있다. 어떤 구체예에서, IGF의 농도는 10 ng/ml ~ 500 ng/ml; 또는 25 ng/ml ~ 100 ng/ml; 또는 50 ng/ml ~ 100 ng/ml을 포함한다. 어떤 구체예에서, IGFP의 농도는 10 ng/ml 보다 낮거나 500 ng/ml 보다 높다. IGF는 IGF-1 또는 IGF-2 일 수 있다. 어떤 구체예에서, 인슐린이 본 발명의 방법에서 IGF를 대신해서 치환될 수 있다.
D. 세포 선택
1. 신경 전구세포, 신경세포 와 글리아세포의 특징짓기
다른 양의 분화제에 노출된 후 배아 줄기세포 배양의 분화 정도는 신경 전구세포 및/또는 신경세포에서 활발하게 발현되는 프로모터, 유전자, 및 단백질의 발현을 재어 측정될 수 있다. 예를 들어, Tα-1 프로모터, β3-튜불린 유전자와 단백질, 네스틴 유전자와 단백질, 더블-코르틴(double-cortin) 유전자와 단백질, 비멘틴(vimentin) 유전자와 단백질, NeuN 유전자와 단백질, 또는 MAP2 유전자와 단백질의 발현이 분석될 수 있다. 양-반응 분석법을 위한 분화제의 일반적인 농도 범위는 100 nM에서 100 nM이다.
비분화된 줄기세포에 분화제를 처리해서 얻은 분화된 세포는 형태학적으로, 면역화학적으로, 및 신경 전구세포로서 그들의 상태를 확인할 수 있는 다른 어떤 방법으로 특징지어질 수 있다.
다양한 표현형적 기준에 따라 세포들이 특징지어질 수 있다. 그 기준은 형태학적 특징의 현미경상 관찰, 발현되는 세포 표지들의, 효소 활성의, 신경전달물질과 그들의 수용체의, 및 전기생리학적 기능의 검출 또는 정량 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에서 구체화된 어떤 세포들은 신경세포 또는 글리아세포의 형태학적 특징을 가진다. 이들 특징들은 당업자에게 받아들여진다. 예를 들어, 뉴런은 작은 세포체(cell body), 및 축색(axon) 과 수상돌기(dendrite)를 연상시키는 다수의 돌기들을 포함한다.
신경세포는 그들이 특정 종류 신경세포에 특징적인 표현형적 표지들을 발현하는지의 여부에 따라서도 특징지어질 수 있다. 관심표지들은 예를 들어 다음을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다: a) 뉴런의 특징인 β3-튜불린, microtubule-associated protein 2 (MAP-2), 신경 미세 섬유; b) 성상세포(astrocyte) 에 존재하는 glial fibrillary acidic protein(GFAP); c) 희소돌기 아교세포 (oligodendrocyte)의 특징인 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase), galactocerebroside (GaIC), myelin basic protein (MBP)의 발현; d) 미분화 배아 줄기세포의 특징인 Oct-4; e) 신경 전구세포와 다른 세포의 특징인 Pax-6와 네스틴; f) 중추 신경계의 발생과정 중의 특성인 Sox 1; g) 카테콜아민(catecholamine) 뉴런에 존재하는 티로신 히드록실라제(tyrosine hydroxylase, TH); h) 가바(GABA) 뉴런에 존재하는 글루탐산 디카르복실라제, 이소폼 67(glutamic acid decarboxylase, isoform 67, GAD67); i) 신경 분화의 중간단계의 특징인 비멘틴(vimentin).
당업자에게 조직 특이적인 것으로 알려진 표지들은 유면역세포화학법(flow immunocytochemistry)과 세포 표면에 있는 표지를 검출해 내기 위한 유세포분석기법(FACS), 세포 안이나 세포 표면에 있는 표지를 검출해 내기 위한 면역조직화학법(예를 들면, 고정된 세포나 조직 절편을 사용하는), 세포 추출액이나 배양액으로 분비되는 물질을 검출하기 위한 웨스턴 블랏 분석과 효소연관 면역학적 검정(enzyme-linked immunoassay) 등과 같은 어떤 적합한 면역학적 기술을 사용하여 탐지 할 수 있다. 항원-항체 결합은 세포를 고정시킨 후 표지하는 것을 증폭시키기 위해 표지된 2차 항체를 이용하거나 다른 접합기(비오틴-아비딘 접합기 등)를 사용해 표준 면역세포화학법 또는 유세포분석기법을 통해서나 당업자에게 잘 알려진 다른 면역학적 방법들로써 관찰 될 수 있다. 일반적으로 면역복합체 형성의 탐지는 당업자에게 잘 알려져 있고 수 많은 방식의 적용을 통해 이뤄낼 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 방사능을 가진, 형광성의, 생물학적, 및 효소의 꼬리표를 붙인 그런 것들 등과 같은 표지 또는 유전자표지의 검출에 기반하고 있다. 이들 표지법들의 사용을 다루는 미국 특허는 각각 여기에 참고문헌으로 첨부된 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호을 포함한다.
조직 특이적인 유전자 생산물들의 발현은, 노던블랏 분석법 또는 닷블랏 접합 분석법(dot-blot hybridization analysis)을 이용하여, 또는, 그 전체로서 본 명세서에 참조로서 삽입된, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 및 Innis et al., 1988 에 자세히 기술된 표준 증폭법 중에서 시퀀스-특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR법을 이용하여 mRNA 수준으로도 검출할 수 있다. 본 개시의 표에 기재된 특정 표지들의 시퀀스 데이터는 GenBANK 같은 공공 데이터베이스로부터 얻어질 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준으로 검출된 것 같은 조직 특이적 표지들의 발현은 만약 비분화된 배아 줄기세포 같은 대조군 세포의 경우보다 적어도 두배 이상일 때라면, 및 바람직하게는 10배 또는 50배 이상일 때라면 양성으로 간주된다.
더욱이 신경세포의, 특히 말기적으로 분화된 세포의, 특성은 신경전달물질의 생합성, 분비, 및 재흡수에 연관된 수용체와 효소, 및 시냅스 전달에 관련된 탈분극과 재분극에 연관된 이온채널이다. 시냅스 형성의 증거는 시냅토피신(synaptophysin)을 염색함으로써 얻어질 수 있다. 어떤 신경전달물질 수용성에 관한 증거는 GABA, 글루타메이트, 도파민, 3,4-디히드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine, DOPA), 노르아드레날린, 아세틸콜린, 및 세로토닌 수용체를 검출함으로써 얻어질 수 있다.
신경세포는 다양한 표현형적 기준에 따라 특징지어질 수 있다. 그 기준은 형태학적 특징의 현미경상 관찰, 발현되는 세포 표지들의, 효소 활성의, 신경전달물질과 그들의 수용체의, 및 전기생리학적 기능의 검출 또는 정량 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
본 발명에서 구체화된 어떤 세포들은 신경세포 또는 글리아세포의 형태학적 특징을 가진다. 이들 특징들은 당업자에게 받아들여진다. 예를 들어, 뉴런은 작은 세포체, 및 축색과 수상돌기를 연상시키는 다수의 돌기들을 포함한다.
신경세포는 그들이 특정 종류 신경세포에 특징적인 표현형적 표지들을 발현하는지의 여부에 따라서도 특징지어질 수 있다. 관심표지들은 예를 들어 다음을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다: a) 뉴런의 특징인 β3-튜불린, microtubule-associated protein 2 (MAP-2), 신경 미세 섬유; b) 성상세포(astrocyte)에 존재하는 glial fibrillary acidic protein(GFAP); c) 희소돌기 아교세포 (oligodendrocyte)의 특징인 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase), galactocerebroside (GaIC), myelin basic protein (MBP)의 발현; d) 미분화 배아 줄기세포의 특징인 Oct-4; e) 신경 전구세포와 다른 세포의 특징인 Pax-6와 네스틴; f) 중추 신경계의 발생과정 중의 특성인 Sox 1; g) 카테콜아민(catecholamine) 뉴런에 존재하는 티로신 히드록실라제(tyrosine hydroxylase, TH); h) 가바(GABA) 뉴런에 존재하는 글루탐산 디카르복실라제, 이소폼 67(glutamic acid decarboxylase, isoform 67, GAD67); i) 신경 분화의 중간단계의 특징인 비멘틴(vimentin).
본 명세서에 기재되고 당업자에게 조직 특이적인 것으로 알려진 표지들은 유면역세포화학법(flow immunocytochemistry)과 세포 표면에 있는 표지를 검출해 내기 위한 유세포분석기법(FACS), 세포 안이나 세포 표면에 있는 표지를 검출해 내기 위한 면역조직화학법(예를 들면, 고정된 세포나 조직 절편을 사용하는), 세포 추출액이나 배양액으로 분비되는 물질을 검출하기 위한 웨스턴 블랏 분석과 효소연관 면역학적 검정법(enzyme-linked immunoassay) 등과 같은 어떤 적합한 면역학적 기술을 사용하여 탐지 할 수 있다. 항원-항체 결합은 세포를 고정시킨 후 표지하는 것을 증폭시키기 위해 표지된 2차 항체를 이용하거나 다른 접합기(비오틴-아비딘 접합기 등)를 사용해 표준 면역세포화학법 또는 유세포분석기법을 통해서나 당업자에게 잘 알려진 다른 면역학적 방법들로써 관찰 될 수 있다. 일반적으로 면역복합체 형성의 탐지는 당업자에게 잘 알려져 있고 수 많은 방식의 적용을 통해 이뤄낼 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 방사능을 가진, 형광성의, 생물학적, 및 효소의 꼬리표를 붙인 그런 것들 등과 같은 표지 또는 유전자표지의 검출에 기반하고 있다. 이들 표지법들의 사용을 다루는 미국 특허는 각각 여기에 참고문헌으로 첨부된 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호를 포함한다.
조직 특이적인 유전자 생산물들의 발현은, 노던블랏 분석법 또는 닷블랏 접합 분석법(dot-blot hybridization analysis)을 이용하여, 또는, 그 전체로서 본 명세서에 참조로서 삽입된, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 및 Innis et al., 1988 에 자세히 기술된 표준 증폭법 중에서 시퀀스-특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR법을 이용하여 mRNA 수준으로도 검출할 수 있다. 본 개시의 표에 기재된 특정 표지들의 시퀀스 데이터는 GenBANK 같은 공공 데이터베이스로부터 얻어질 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준으로 검출된 것 같은 조직 특이적 표지들의 발현은 만약 비분화된 배아 줄기세포 같은 대조군 세포의 경우보다 적어도 두배 이상일 때라면, 및 바람직하게는 10배 또는 50배 이상일 때라면 양성으로 간주된다.
더욱이 신경세포의, 특히 말기적으로 분화된 세포의, 특성은 신경전달물질의 생합성, 분비, 및 재흡수에 연관된 수용체와 효소, 및 시냅스 전달에 관련된 탈분극과 재분극에 연관된 이온채널이다. 시냅스 형성의 증거는 시냅토피신(synaptophysin)을 염색함으로써 얻어질 수 있다. 어떤 신경전달물질 수용성에 관한 증거는 GABA, 글루타메이트, 도파민, 3,4-디히드록시페닐알라닌(dihydroxyphenylalanine, DOPA), 노르아드레날린, 아세틸콜린, 및 세로토닌 수용체를 검출함으로써 얻어질 수 있다.
배아 줄기세포를 사용하는 신경 분화를 평가할 때는 일반적으로 신경 발생에 연관된 생리학적 세포 상호 작용을 가능한 한 비슷하게 따르는 것이 바람직하다. 인간 배아 줄기세포의 공기/유체 접면-기반 배양(air/liquid interface-based cultures)에 관련된 방법들이 본 방법에서 고려되었다. 이 배양 시스템은 3차원적인 세포의 증식을 가능하게하고 성장인자의 첨가 없이도 신경 분화를 가능하게 한다. 어떤 구체예에서, Eiraku et al. (2008)에서 설명된 바와 같은 배양법은 본 발명과 함께 사용될 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체로 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
2. 심근세포의 특징짓기
상기 분화에 대한 세포들의 특징짓기 방법 중 어느것이라도 심근세포로 분화하는 세포에 대한 판단으로 적용될 수 있다. 인간 배아 줄기세포는 마우스 내장 내배엽(VE: visceral endoderm)-유사 세포와 함께 배양되어 박동하는 근육세포를 형성하여, 심장 특이적 근절의 단백질과 이온채널을 발현할 수 있다. 이 공동 배양법은 심근세포 분화를 개시하도록 한다. 만능성 배아 줄기세포(예를 들어, 인간 배아 줄기세포)의 END-2 세포와의 공동배양은 다른 운명으로부터 두가지의 뚜렷한 구별이 되는 세포 유형으로의 대단한 분화를 유발한다. 하나는 상피세포 유형이고, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein)에 양성으로 염색되는 큰 포낭구조를 형성하고, 아마도 배 외부의 내장 내배엽일 것이다; 다른 하나는 높은 국소 밀도의 지역에 무리를 짓고 자발적으로 박동한다. 이들 박동하는 세포가 심근세포이다. 심근세포 분화에 관한 추가정보는 여기에 참고문헌으로 구체적으로 포함된 미국 특허공개 제20080031857호, 제20080187494호, 및 제20070010012호에서 확인할 수 있다.
3. 간세포의 특징짓기
앞서 말한 분화에 대한 세포들의 특징짓기 방법 중 어느것이라도 간세포로 분화하는 세포에 대한 판단으로 적용될 수 있다. 만능성 줄기세포의 간세포로의 분화를 체외에서 촉진시키는 방법은, 예를 들어 Sancho-Bru et al. (2009) 또는 Zaret et al. (2008) 에서 설명되었듯이, 그들의 분화를 방해하는 요인들의 제거, 및/또는 적절한 성장인자에 노출을 통한 것들을 필요로 할 수 있다. 유도 만능성 줄기세포는 간세포로 분화될 수 있고 조직 교체 또는 유전자 요법에 사용되어질 수 있다. iPSs로부터의 간 발생은 activin-A에 노출 시켜 시작 시킬 수 있다. BMP-4와 bFGF를 추가 처리해서 간 운명을 지닌 세포로 분화시킬 수 있다(예를 들면, Zaret et al. (2008) 참조). 이전의 연구들은 인간 유도 만능성 줄기세포는 배아 줄기세포에 필적하는 간세포-운명 분화력을 가졌다는 사실을 알려주었다(Si-Tayeb et al. (2010)). 간세포 분화에 관한 추가정보는 여기에 참고문헌으로 구체적으로 포함된 미국 특허공개 제2010/0086525호, 제2010/0129351호, 제2005/0042750호, 제2010/0143313호, 제2010/0086999호, WO 2010/049752A1, 및 미국 특허 제7,473,555호에서 확인할 수 있다.
E. 스크리닝에 적용
여기에 명시된 방법으로 제조된 세포는 치료적 이식 또는 예방적 이식, 치료, 약물 스크리닝, 또는 시험관내 약물 발견에 사용하기 위한 분화된 세포의 생산을 연구하는 것 뿐만 아니라, 발생세포생물학과 발생분자생물학, 기능유전체학을 연구하는데에도 사용될 수 있다.
예를 들면, 그 세포들은 유전체학 분석을 위해, mRNA, cDNA, 또는 유전체 라이브러리을 생산하기 위해, 특정 폴리클론 또는 모노클론 항체, 인간화 모노클론 항체 (WO 01/51616, 여기에 참고문헌으로 구체적으로 포함됨)를 포함하나 이에 한정하지는 않으며, 이들을 생산하기 위해, 또는 약물조사에 약학 화합물 같은 여러 가지의 시험 약물 또는 생물학적 활성분자의 세포 또는 거기서 나온 조직에 대한 효과를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 게다가 그 세포들은, 배양중의 신경세포 또는 심근세포의 특성과 그들 세포들의 분화에 영향을 미치는, 인자들(예를 들어, 소형 분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등 또는 조건들(예를 들어, 세포 배양조건 또는 촉진) 을 스크리닝하기 위해 사용될 수도 있다.
본 발명은 시험 약물을, 본 발명의 방법으로 제조된 신경세포나 심근세포에서 평가하는 방법을 포함한다. 그 시험 약물은, 시험 약물과 접촉된 결과로 그 세포의 표현형 또는 활성에 변화를 유도하는지의 여부로 평가될 수 있다. 이들 분석은 단일 시험 약물 또는 많은 후보 물질들 라이브러리의 무작위적 스크리닝을 포함할 수 있다; 그 대신에 그 분석은 구조적 속성에 대한 고려와 함께 선택된 화합물의, 그들이 신경세포 또는 신경으로 운명이 맡겨진 세포의 기능을 더 쉽게 조절하도록 만들 것이라고 믿겨지는 특수한 클래스에 초점을 맞춰 사용될 수도 있다. 어떤 구체예에서, 시험 화합물의 독성은 그 화합물을 다수의 신경세포 또는 공작된 신경 조직을 만들어 낸 세포들 (Schmandt et al., 2005) (예를 들면, 인간 배아 줄기세포로부터 유래된) 같은 신경으로 운명이 맡겨진 세포와 접촉시켜서 평가된다. 공작된 신경 조직(engineered neural tissue: ENT)이란 배아 줄기세포로부터 유래된 본 발명에 따른 세포의 분화를 통해 생산되었을 수 있는, 인간 태아 뇌의 어떤 층과 비슷한, 조직의 3차원적 조각이다. 독성을 시험하는 것은, 예를 들어, 시험 화합물의 인간 환자와 같은 대상에 대한 임상 적용을 하기에 앞서서, 체외 약물-스크리닝 과정의 한 부분으로 이용될 수 있다.
다양한 속성들이, 시험 화합물이 세포에 유독한지를 명확히 하기 위해 평가되었다. 예를 들어, 다음을 포함하는 규정 요인들을 시험 화합물이 가지는지를 세포에서 평가할 수 있다: 세포 사멸(괴사, 세포자멸사), 흥분독성, 세포독성, 신경 기능 악화(예를 들면, 활동 전위의 발생 악화 또는 장기 강화 악화, 기타 등등), 뇌 수용체 기능 악화, 알려진 독성 화합물에 대한 저항성 감소, 시냅스 독성, 발생상의 신경독성 또는 신경 운명-특이 독성(예를 들면, 희소돌기 아교세포, 성상세포, 또는 도파민성 뉴런에서 발생). 세포는 제한된 운명(예를 들면, 희소돌기 아교세포, 도파민성 뉴런, 등등)으로의 발광단백질 또는 형광단백질 같은 리포터 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 특이성을 가지도록 공작될 수 있다. 이런 방식으로, 신경 운명-특이 독성은 체외에서 리포터 유전자의 발현 변화를 통해 더욱 쉽게 관찰될 수 있다. 어떤 구체예에서 활성산소종은, 시험 화합물이 세포내 산화 스트레스를 증가시키는지를 명확히 하기 위해 측정될 수 있다. 어떤 구체예에서, 양-반응 연관성은 시험 화합물의 독성을 평가함으로써 생성될 수 있다. 어떤 구체예에서, 발생중의 신경독성은 신경분화 동안에 시험 화합물을 배양함으로써 측정될 수 있다.
소형 분자 라이브러리의 다양한 화합물 또는 부분 또는 모두는, 독성에 대해서 또는 본 발명에 따라 배양된 세포의 신경 활성에 대해서 스크리닝될 수 있다. 더구나 신경세포 또는 신경으로 운명이 맡겨진 세포의 일부 또는 본질적으로 모든 세포는 시험 화합물의 독성 평가 이전에 도파민성 세포로 분화될 수 있다; 이것은 화합물의 도파민성 독성에 대한 이해가 요구될 경우에 특히 유용하다.
본 발명의 배양 방법 및/또는 독성 시험법은 자동화 될 수 있다. 어떤 구체예에서, 세포를 배양하는 것, 세포를 분화시키는 것, 및/또는 시험 화합물의 특성을 측정하는 것(예를 들어, 독성) 등이 연관된 하나 또는 그 이상의 단계가 자동화 될 수 있다; 예를 들어, 로봇공학의 사용을 통해, 고효율(high-throughput) 세포내 독성 평가를 수월하게 하기 위해. 예를 들어, 다음과 같은 다양한 로봇공학이 본 발명에 따라 분화된 신경세포 또는 신경으로 운명이 맡겨진 세포를 포함하는 세포들을 배양하기위해 사용될 수 있다; 세포에 배양액을 추가하거나 제거하기, 시험 화합물을 배양액에 추가하기. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 구체적인 로봇공학은, 자동화된 세포의 분배와 표준화된 세포의 분배를, 비록 더 많거나 적은 개수의 웰이 요구에 따라 사용될 수 있을지라도, 일반적으로 12개~384개 웰 개수 범위의 많은 웰을 가진 플레이트에 가능하게 하는 세포 분배자(예를 들면, Thermo Fisher Scientific, Inc.의 Matrix WellMateTM), 및 예를 들어 IC50 산출을 위해, 라이브러리 화합물의 자동화된 배급을 많은 웰을 가진 플레이트에 할 수 있게 하고 화합물의 자동화된 희석을 가능하게 하는 다중채널 유체 조정기(예를 들면, Caliper Life Sciences의 Zephyr)를 포함한다.
화합물의 독성을 평가하기 위해, 일반적으로 세포의 기능을 및/또는 시험 화합물이 있을 때와 없을 때의 세포의 생존력을 측정한다. 예를 들어, 방법은 일반적으로 하기 단계를 포함한다:
시험 화합물을 준비하는 단계;
시험 화합물을 분리된 세포 또는 본 발명에 따라 제조된 다수의 세포들과 혼합하는 단계;
후보 조절자가 세포 내에서 또는 (c) 단계의 세포들 내에서 세포 생존력이나 기능을 바꾸거나 방해할 수 있는지를 측정하는 단계; 및
(c) 단계에서 측정된 특징을, 세포 또는 후보 조절자 부재하의 세포들 특징과 비교하는 단계,
거기서 서로 측정된 특징의 차이는 후보 조절자가 세포/세포들에 대한 독성에 영향을 미쳤거나 독성을 나타낸다는 것을 알려준다.
스크리닝은 하나 또는 그 이상의, 96웰 플레이트 같은, 많은 웰을 가진 플레이트를 이용하여 고 처리량 분석법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 공작된 신경 조직(engineered neural tissue: ENT) 은 시험 화합물의 (예를 들면, 소형 분자, 단백질, 펩티드, 항체, 추정의 치료의(putative therapeutic)) 또는 다양한 화합물의(예를 들면, 화합물 은행으로부터, 소형 분자 라이브러리, 펩티드 라이브러리, 항체 라이브러리 등) 신경독성 잠재력을 연구하기 위한 스크리닝 플랫폼을 확립하기 위해 많은 웰을 가진 플레이트에서 생산될 수 있다. 시험 화합물은 합성하여 생산되거나 천연의 재료로부터 정제될 수 있다. ENTs를 생산하기 위한 및/또는 시험 화합물의 특성을 평가하기 위한 방법은 자동화 될 수 있다; 예를 들면, 화합물 또는 용액을 많은 웰을 가진 플레이트에 첨가하거나 또는 제거하는 단계, 많은 웰을 가진 플레이트에서 발광 또는 형광을 검출하는 단계, 및/또는 많은 웰을 가진 플레이트에서 ENTs를 생산하는 단계 등은, 예를 들어 로봇공학을 통해, 자동화 될 수 있다.
다양한 구체예에서 시험 화합물의 조합들은, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 시험 화합물을 동시 또는 순차적으로 신경세포, 간세포, 또는 심근세포에 적용 한 결과 특정 효과나 독성이 나타나는지를 측정하는 것으로 평가될 수 있다. 다양한 화합물을 조직에 순차적으로 투여하는 것은 수초로부터 수시간, 수주, 또는 더 길게, 요구되는대로 다양하게 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 경우에, 어떤 것은 세포와 모든 양식들(투여 간격이 서로 약 12~24시간 안쪽에, 더욱 바람직하게는, 서로 약 6~12시간 안쪽에)로 접촉될 수 있다는 점이 고려되었다. 그러나 어떤 상황에서는, 각각의 투여 사이 경과를 수 일(2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일) 에서 수 주(1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주)의 간격으로 현저하게 기간을 연장하는게 바람직할 수 있다. 시험 화합물 "A" 와 시험 화합물 "B" 사이에 다양한 조합들이 사용될 수 있다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
다른 구체예에서, 시험 화합물들은 별개로 다른 신경조직 또는 신경으로 운명이 맡겨진 조직(neural or neurally-commited tissue)과 접촉될 수 있다.
신경 특이적 프로모터로 사용될 수 있는 프로모터는 예를 들어, Tα1 프로모터와 βIII-튜불린 프로모터를 포함한다. 특정 신경 운명에 대한 다양한 프로모터들이 특정 세포 유형에서의 감응을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 그 프로모터들은 예를 들어 다음과 같은 것들을 포함한다: 도파민성 뉴런-특이적 프로모터들 (예를 들어, 티로신 히드록실라제 프로모터), 시냅스-특이적 프로모터들 (예를 들어, synapsin I 프로모터), 축색-특이적 프로모터들 (예를 들어, MAP2 프로모터), 및 뉴런이 아닌 세포-특이적 프로모터들 (예를 들어, CNPase II 프로모터에 의해 판단되는 희소돌기 아교세포). 본 명세서에서 사용된 용어 "프로모터"는 그의 일반적인 의미에서 DNA 조정력을 가진 시퀀스를 포함하는 핵산 영역, RNA 중합효소와 결합할 수 있고 다운스트림 (3' 방향으로) 코딩 시퀀스의 전사를 개시할 수 있는 조절 능력을 가진 유전자로부터 유래된 시퀀스로 해석된다.
어떤 구체예에서 만능성 줄기세포에는, 줄기세포의 신경 또는 신경으로 운명이 맡겨진 세포로의 분화를 검출할 수 있는 이원적인 리포터 시스템이 트랜스펙션되었다. 이원적인 리포터 시스템은 첫번째 발광 또는 형광 단백질을 발현할 수 있는 신경-특이적 프로모터를 사용하고, 두번째 발광 또는 형광 단백질을 발현할 수 있는 두번째 프로모터(예를 들어, 모든세포에서 발현되는 프로모터나 두번째 세포 유형에서 발현되는 프로모터)를 사용한다. 이 방법에서는, 신경 표지의 상대적인 발현이 측정된다. 리포터 시스템은 예를 들어 리포솜 트랜스펙션, 극미립자 포격, 또는 렌티바이러스 트랜스펙션 같은 바이러스 트랜스펙션을 포함하는, 여러 기법들에 의해 만능성 세포로 트랜스펙션 될 수 있다. 아래의 예제에서는, Tα1 프로모터에 의한 초파리 루시퍼레이즈의 발현과 EF1-α short 프로모터 (EF1-αS)에 의한 레닐라 루시퍼라제(Renilla luciferase)의 발현을 관찰하기 위해, 이원적인 리포터 시스템이 사용된다.
일반적으로 형광 단백질은 형광 발색단(chromophore)을 포함하고, 그 발색단은 적어도 3 아미노산으로 형성되고, 대체적으로 p-히드록시벤질이덴-이미다졸이디논(p-hydroxybenzylidene-imidazolidinone) 발색단을 만드는 고리화 반응으로 특징지어진다. 발색단은 보결분자단(prosthetic group)을 포함하지 않을 수 있고, 알맞은 파장을 포함하는 외부 빛 소스로부터의 직전 조명으로 발색단에 보관되었던 선택적 에너지의 빛을 방출할 수 있다. 자발적으로 형광을 내는 단백질들은, 발색단이 p-히드록시벤질이덴-이미다졸이디논의 링 구조를 포함한다면, 구조와 발색단에 존재하는 아미노산의 수에서 매우 다양할 수 있다. 어떤 경우에 형광 단백질은, GFP에서 발견되고 Chalfie et al. (1994) 에서 설명된, β-배럴(barrel) 구조를 포함할 수 있다. 형광 단백질은 일반적으로 단백질에 의해 흡수되는 특정 파장의 입사광에 반응하여 더 긴 파장대의 빛을 방출할 수 있는 능력을 가진다. 유세포분석기(FACS)는 어떤 구체예에서 하나 또는 그 이상의 신경-특이 표지들의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. FACS 제품들이 가용하다, 예를 들어, 본 발명에서 사용될 수 있는 FACS는 FACSCaliburTM (Becton Dickson)이다.
시험 화합물은 천연에서 얻어지는 화합물의 파편 또는 부분을 포함할 수 있고, 또는, 조합하지 않으면 불활성화 되는, 알려진 화합물들의 활성이 있는 조합으로 발견될 수 있다. 동물, 박테리아, 곰팡이, 나뭇잎과 나무 껍질을 포함하는 식물재료, 및 해양 샘플과 같은 천연재료로부터 분리된 화합물이 잠재적으로 유용한 약제의 후보물질로서 분석되는 것이 제안된다. 또한, 스크리닝되는 약학적 제제는 화학적 화합물 또는 인공 화합물로부터 유래하거나 합성될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 동정된 후보 물질은 펩티드, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소형 분자 억제제 또는 알려진 억제제 또는 자극제로부터 출발해 논리적인 약물 설계를 통해 설계된 다른 어떤 화합물이라고 이해될 수 있다.
다른 시험 화합물은 대상 분자에 특이성을 가지는 각각의 안티센스 분자, 라이보자임, 및 항체(단일 체인 항체를 포함)를 포함한다. 상기 화합물들은 본 명세서에 더욱 자세히 설명되어있다. 예를 들면, 번역 또는 전사 시작 부위 또는 스플라이스 정션(splice junction)에 결합할 수 있는 안티센스 분자는 이상적인 억제제 후보가 된다. 펩티드 조절자 또는 다른 화합물의, 3차원 구조적으로 약학적으로 활성이 있는 화합물과 유사한, 펩티도미메틱(peptidomimetics) 또한 시험 화합물로 사용될 수 있다.
본 발명의 모든 스크리닝법은, 물론, 독성 또는 기타 특성이 시험 화합물에서 관찰되거나 관찰되지 않을 수도 있다는 사실에도 불구하고, 그 자체가 유용하다고 이해된다.
F. 조직 공학과 세포 요법
본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 신경세포, 간세포, 또는 심근세포의 세포-기반 요법으로의 효용 역시 고려한다. 질병이나 상해 때문에 상당히 손상된 인간 조직을 재생시킬 수 있는 능력은 성인인 경우 현저하게 줄어든다. 여기에 개시된 세포들은 세포 교체 요법 또는 조직 재생을 위해 포유류 대상으로 투여되거나 이식될 수 있다. 그 대신에, 본 발명의 세포들은 대상에게 직접 투여될 수 있다. 그러므로, 본 개시의 방법은 많은 질병, 상해, 또는 다른 해로운 조건의 치료에 유용할 것이다.
본 발명의 심근세포, 간세포, 또는 신경세포는 인체 장기를 3차원 조직 공학으로 모형을 만드는데에 이용될 수 있다. 예를 들어 인간 뇌조직은 여기에 기술된 방법으로 제조된 신경세포의 3차원 배양으로 모형이 만들어질 수 있다. 유사하게, 심장조직은 본 발명의 방법으로 제조된 심근세포로부터 유래되고 재생될 수 있다. 간조직은 본 발명의 방법으로 제조된 간세포로부터 유래되고 재생될 수 있다. 본 개시의 신경세포, 간세포, 및 심근세포는 예를 들어 세포를 원하는대로 유전자 조작과 분화를 시킨 후 유전자 치료가 필요한 대상 장소에 세포 또는 조직을 제공하는 것과 같이 다양한 치료상의 활성 분자나 유전자들을 인체의 다양한 장소로 운반하는 매개물로써 이용되어질 수도 있다.
G. 질병의 치료
본 발명의 또 다른 측면은 질병대상에게 본 발명의 방법으로 제조된 신경세포 또는 심근세포의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하는 치료법을 제공하는 것이다. 다른 구체예에서, 신경계 질환이나 신경계 손상을 치료하기 위해 도파민성 뉴런이 투여된다.
본 발명이 유효한 퇴행성 신경질환과 장애에는 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 근위축성 측색 경화증(루게릭병), 전두측두엽 치매(피크병), 프리온 병, 헌팅턴병, 뇌 국소 빈혈, 특발성 파킨슨병, 국소-유도 파킨슨병, 약물-유도 파킨슨병, 다른 기원의 알츠하이머병과 치매, 헌팅턴 무도병, AIDS-뇌장애나 크로이츠펠트-야콥병, 홍역과 헤르페스 바이러스, 보렐리아균에 의해 발생하는 뇌장애 같은 감염-유도 퇴행성 신경질환, 용매- 또는 약제- 뿐 아니라 간장약-, 알코올-, 저산소증-, 과산소증-, 또는 고혈당증-유도 뇌장애 같은 대사-독성 퇴행성 신경 질환, 다양한 기원의 퇴행성-망막질환, 외상에의해 유도된 뇌와 골수 손상, 척수손상, 약물, 독소, 녹새(noxae)와 약의 투여와 중지 후와 같은 다양한 기원의 대뇌 과흥분성 증상, 정신적과 외상적으로 유도된 대뇌 과흥분성 상태, 대사, 약물, 독소와 감염에의해 유발된 다발 신경병증과 다발 신경염과 같은 말초 신경계의 퇴행성 신경 증후군을 포함하지만 이에 한정하지는 않는다.
본 발명이 유효한 간질환과 장애에는 예를 들어, 간염, 비알코올성 지방간 질환, 간경변, 간암(cancer of the liver), 윌슨병, 원발성 경화성 담관염, 원발성 담즙성 간경변증, 작은 담관의 자가 면역 질환, 바드-키아리 증후군, 길버트 증후군, 및 2형 당원축적병, 급성 간부전, 알라질 증후군, 알파-1 항트립신 결핍, 자가면역성 간염, 담도 폐쇄증, 당원축적병, 간 모세포종, 간세포 암(hepatoma), 진행성 가족성 간내 담즙정체증 (PFIC), 요소 회로 장애를 포함히나, 이에 한정하지는 않는다.
1. 약학적 제형(Pharmaceutical Formulations)
약학적 제형은 본 발명의 방법으로 생산한 신경세포, 간세포, 또는 심근세포가 포함될 수 있다. 세포 약제의 성분은 당업자에게 알려진 어떤 방법들을 사용해서 투여될 수 있다. 예를 들어, 그 투여란 손상된 신경계 지역으로의 직접 주입, 또는 비경구적인 투여, 정맥내 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 피부를 통한 투여, 복막내 투여, 또는 수막강내 투여가 될 수 있다.
주사로 투여하기 위해서 세포들을 수용성 배지에 혼합하였다. 주사 목적으로 쓰기에 적합한 약제의 형식은 멸균수를 함유한다. 담체(carrier)는 다음과 같은 예들을 포함하는 용매, 또는 분산매질(dispersion medium)이 될 수 있다: 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 그들의 적당한 혼합물, 및/또는 식물성 기름. 병원성 미생물의 활성을 방지하기 위해서 다음과 같은 예들을 포함하는 다양한 종류의 항박테리아 약제와 항진균성 약제를 사용할 수 있다: 파라벤(parabens), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀, 솔빅산(sorbic acid), 티메로살(thimerosal), 및 그와 유사한 약제. 많은 경우에서는 당류 또는 염화 나트륨 같은 등장성 작용물들이 포함되는 것이 바람직하다.
수용액상의 비경구적인 투여를 위해서는, 예를 들어, 그 용액은 필요한 경우 적절한 완충작용을 해야하며, 희석용 액체는 우선 충분한 식염수 또는 포도당으로 등장성을 만들어야 한다. 이들 특수한 수용액은 특히 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하와 복막내 투여에 적합하다. 이런 맥락에서 쓰일 수 있는 멸균된 수용성 배지는 본 개시에 비추어 당업자에게 알려질 수 있을 것이다. 개개인에게 적절한 투여량은 투여 대상인 사람에 따라 결정되어야 할 것이다.
본 명세서에서 사용된 "담체(carrier)"는 온갖 용매들, 분산매질, 매개물, 코팅, 희석제, 항박테리아 약제와 항진균성 약제, 등장성 작용물과 흡수를 지체시키는 작용물, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드, 및 이와 같은 것들을 포함한다. 약제로써 활성을 갖는 물질을 만들기 위한 이러한 배지와 작용물들의 용법은 당업자에게 잘 알려져있다. 활성원료와 함께 조화되지 않는 어떤 양식화된 배지나 작용물을 제외한 범위에서는, 약제의 혼합물로써의 사용이 고려되었다. 보충 활성원료 역시 혼합물의 일부분이 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 구 "약제학적으로-허용가능한" 또는 "약리학적으로-허용가능한"은 인간에게 투여했을 때 알러지 반응이나 알러지와 비슷한 적당치 못한 반응을 일으키지 않는 분자체와 분자혼합물로 해석된다. 활성성분으로써의 단백질을 함유하는 수용성 혼합물의 조제법은 당업자에게 잘 알려져있다. 일반적으로, 이러한 혼합물들은 수용액이나 현탁액으로써 주사 가능하도록 제조될 수 있다; 또한, 주사하기에 앞서 녹이기에 적합한 고체형태, 또는 현탁액으로 만들기에 적합한 고체형태로써 액상으로 제조될 수 있다.
2. 투여
신경계 손상의 치료를 위해서 약제로써 효과적인 양만큼의 본 발명의 세포들을 환자에게 투여한다. 물론, 예를 들어, 피내, 수막강내, 중추신경계로의 주사, 심장내, 피부를 통한, 비경구적인, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하의, 기관내, 복막내, 관류를 통한, 세척을 통한, 및 직접 주사와 같이 손상의 위치와 성질에따라 투여 경로는 다양할 것이다.
세포들은 단일 투여량 또는 복식 투여량으로 제공 될 수 있다. 지속적인 투여 역시 적합한 곳에 적용될 수 있다. 일반적으로, 지속적 관류를 통한 약제 혼합물의 투여량은 관류를 행하는 동안의 기간에 보정하면 단일 또는 복식 주사에 의한 투여량에 상당할 것이다. 투여된 세포의 투여량은 치료대상, 대상의 몸무게, 투여의 방식, 및 의사의 판단에 의존할 것이다. 마찬가지로 섭생 치료법은 다양할 것이고, 신경계 손상의 유형, 손상의 위치, 질병의 진행, 및 환자의 건강과 나이들에 의존할 것이다.
3. 복합 치료
특정 구체예에서 본 발명의 혼합물과 방법은, 본 발명의 방법으로 제조된 클론 세포들의 투여와 하나 또는 그 이상의 부가적인 요법들을 포함한다. 이런 요법은 어떤 질병의 치료(본 발명의 클론 세포들을 사용한 치료)에 적용될 수 있다. 예를 들어, 그 질병은 퇴행성 신경 질환, 심혈관 질환, 간 질환, 또는 암과 같은 다 세포분열 질환일 수 있다.
복합 요법을 포함하는 그 방법과 혼합물은 치료효과나 예방효과를 증진시키고, 또는 또 다른 요법의 치료효과를 크게한다. 치료와 예방 방법과 혼합법은 결합시킨 결과가 원하는 효능을 얻기에 효과적이도록 퇴행성 신경 질환 또는 심혈관 질환의 치료와 같은 것에 제공될 수 있다.
본 발명의 클론 세포들은 보조적인 형식의 요법전에, 중에, 후에, 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 그 투여는 동시에서부터 분단위, 일단위, 주단위까지의 간격으로 수행될 수 있다. 첫 투여의 효과는 일반적으로 두 혼합물이 여전히 환자에게 유리하게 결합된 효능을 미칠 수 있을 만큼 시간의 중요한 기간이 각 투여의 시간 사이에 만료되지 않는다는 것을 보증한다. 그 세포들과 보조적인 요법은 서로 약 12 ~ 24 또는 72시간 이내에, 및 이왕이면 서로 약 6 ~ 12시간 이내에, 투여될 수 있다. 어떤 상황에서는 치료를 위한 시간 기간을 각각의 투여 사이에 수일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7) 부터 수주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 경과로 현저하게 연장하는 것이 바람직할 것이다.
어떤 구체예에서, 치료의 진행은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일, 41일, 42일, 43일, 44일, 45일, 46일, 47일, 48일, 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 68일, 69일, 70일, 71일, 72일, 73일, 74일, 75일, 76일, 77일, 78일, 79일, 80일, 81일, 82일, 83일, 84일, 85일, 86일, 87일, 88일, 89일, 90 일, 또는 그 이상 동안 계속 될 것이다. 하나의 약제가 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일, 41일, 42일, 43일, 44일, 45일, 46일, 47일, 48일, 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 68일, 69일, 70일, 71일, 72일, 73일, 74일, 75일, 76일, 77일, 78일, 79일, 80일, 81일, 82일, 83일, 84일, 85일, 86일, 87일, 88일, 89일, 및/또는 90일, 그로 인해 발생한 모든 조합 일째에 주어지는 것과, 또 다른 약제가 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일, 31일, 32일, 33일, 34일, 35일, 36일, 37일, 38일, 39일, 40일, 41일, 42일, 43일, 44일, 45일, 46일, 47일, 48일, 49일, 50일, 51일, 52일, 53일, 54일, 55일, 56일, 57일, 58일, 59일, 60일, 61일, 62일, 63일, 64일, 65일, 66일, 67일, 68일, 69일, 70일, 71일, 72일, 73일, 74일, 75일, 76일, 77일, 78일, 79일, 80일, 81일, 82일, 83일, 84일, 85일, 86일, 87일, 88일, 89일, 및/또는 90일, 그로 인해 발생한 모든 조합 일 째에 주어지는 것이 고려되었다. 하루 (24시간 기간) 이내에 환자는 세포의 단일 또는 복식의 투여가 주어질 수 있으며, 또한, 치료의 진행후에, 투여해서 치료하지 않는 시간의 기간의 필요에 대해 고려하였다. 이 시간의 기간은 그들의 예후, 체력, 건강, 기타등등 같은 환자의 상태에 따라 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 및/또는 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 및/또는 1달, 2달, 3달, 4달, 5달, 6달, 7달, 8달, 9달, 10달, 11달, 12달동안 계속될 수 있으며, 더 길게 지속될 수 있다.
다양한 조합이 사용될 것이다. 아래의 예를 들면, 본 발명의 클론 세포들은 "A"로 표기하였고 보조적인 형식의 요법은 "B"로 표기하였다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에게 하는 어떤 혼합물의 투여 또는 본 발명의 요법은, 만약에 있다면 그 약제의 독성을 참작하면서 이러한 혼합물들의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 그러므로 다른 구체예에서 독성을 측정하는 단계는 복합요법에 기인한다. 치료 주기가 필요에 따라 반복될 것이 예상된다. 수술적 개입뿐만 아니라 다양한 표준 요법들 역시 기술된 요법과 함께 조합하여 적용될 수 있을지가 고려된다.
다양한 구체예에서, 본 발명의 방법으로 얻은 세포들(예를 들어 심근세포, 간세포, 신경세포, 도파민성 뉴런 등)은 환자에게 면역억제제와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 다른 구체예에서는, 면역억제제와 본 발명의 세포들을 함께 조합하여 투여하는 것이 불필요할 수 있다. 예를 들면, 유도 만능성 줄기세포는 대상으로부터 세포를 얻은 다음에 원하는 세포유형으로 역분화시켜 생산될 수 있다; 그 다음에 다시 이러한 세포들은 대상에 치료적으로 투여될 수 있다. 역분화된 세포는 대상의 세포로부터 유래된 세포이므로 부작용으로 나타나는 면역반응이 거의 없거나 없을 수 있다. 그럼에도 불구하고 다양한 구체예에서는, 면역억제제나 항염증제를 환자에게 투여하는 것이 유리할 수 있다 (예를 들어, 환자가 염증성 질환이나 자가면역 질환일 경우).
특정 측면에서는, 약물요법, 화학요법, 면역요법, 수술요법, 방사선 요법, 또는 유전자 요법을 포함하는 표준 보조 요법이 여기에 기술된 클론 세포들과 함께 조합하여 사용될 수 있을지에 대해 고려하였다. 아래는 보조 형식 약물요법의 예들이나, 이에 한정하지는 않는다.
a. 심혈관계통 약물
본 발명에 사용된 약물적 치료제는 예를 들어, 항고지질단백혈증제, 항동맥경화증제, 항혈전제/혈전용해제, 지혈제, 항부정맥제, 항고혈압제, 혈관수축제, 심부전증 치료제, 협심증제, 항균제, 또는 이들의 조합 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
더불어, 다음 중 어떤것은 본 실시예에서 사용된 베타-차단제(β-blockers) 처럼(하기 참조) 새로운 심장병 치료 표적 유전자의 세트를 개발하는 데 사용될 수 있다. 이러한 유전자들 중 다수는 겹칠 것으로 예상되고 있지만 새로운 유전자 표적이 개발될 가능성이 높다.
어떤 구체예에서, 높은 혈중 지질 및/또는 지질단백질의 농도를 낮춰주는(본 명세서에서는 항고지질단백혈증으로 알려짐) 약제의 투여는, 특히 아테로마성 동맥 경화증과 혈관조직의 비후 또는 폐색의 치료에서, 본 발명에 따른 심혈관 요법과 함께 결합될 수 있다. 어떤 측면에서, 항고지질단백혈증제는 아릴옥시알카노익/피브릭산(aryloxyalkanoic/fibric acid) 유도체, 레진/담즙산(resin/bile acid) 금속 이온 봉쇄제, HMG CoA 리덕타아제(reductase) 억제제, 니코틴산(nicotinic acid) 유도체, 갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 유사체, 여러 종류의 약제 또는 그들의 조합 등을 포함할 것이다.
아릴옥시알카노익/피브릭산 유도체는 예를 들어, 베클로브레이트(beclobrate), 엔자피브레이트(enzafibrate), 비니피브레이트(binifibrate), 시프로피브레이트(ciprofibrate), 클리노피브레이트(clinofibrate), 클로피브레이트(clofibrate)(아트로미드-S(atromide-S)), 클로피브릭산(clofibric acid), 에토피브레이트(etofibrate), 페노피브레이트(fenofibrate), 젬피브로질(gemfibrozil)(로비드(lobid)), 니코피브레이트(nicofibrate), 피리피브레이트(pirifibrate), 로니피브레이트(ronifibrate), 심피브레이트(simfibrate), 및 테오피브레이트(theofibrate)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
레진/담즙산 금속 이온 봉쇄제는 예를 들어, 콜레스티라민(cholestyramine)(콜리바르(cholybar), 퀘스트란(questran)), 콜레스티폴(colestipol)(콜레스티드(colestid)), 및 콜리덱시드(polidexide)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
HMG CoA 리덕타아제 억제제는 예를 들어, 로바스타틴(lovastatin)(메바코르(mevacor)), 프라바스타틴(pravastatin)(프라보콜(pravochol)) 또는 심바스타틴(simvastatin)(조코르(zocor))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
니코틴산 유도체는 예를 들어, 니코티네이트(nicotinate), 아세피목스(acepimox), 니세리트롤(niceritrol), 니코클로네이트(nicoclonate), 니코몰(nicomol), 및 옥시니아식산(oxiniacic acid)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
갑상선 호르몬 또는 갑상선 호르몬 유사체는 예를 들어, 에토록세이트(etoroxate), 티로프로픽산(thyropropic acid), 및 티록신(thyroxine)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
기타 항고지질단백혈증제은 예를 들어, 아시프란(acifran), 아자코스테롤(azacosterol), 벤플루오렉스(benfluorex), 베타-벤잘부티라미드(β-benzalbutyramide), 카르니틴(carnitine), 콘드로이틴 술페이트(chondroitin sulfate), 클로메스트론(clomestrone), 데탁스트란(detaxtran), 덱스트란 술페이트 소듐(dextran sulfate sodium), 5, 8, 11, 14, 17-에이코사펜타에노익산(5, 8, 11, 14, 17-eicosapentaenoic acid), 에리타데닌(eritadenine), 푸라자볼(furazabol), 메글루톨(meglutol), 멜린아미드(melinamide), 미타트리엔디올(mytatrienediol), 오르니틴(ornithine), 감마-오리자놀(γ-oryzanol), 펜테틴(pantethine), 펜타에리스티롤 테트라아세테이트(pentaerythritol tetraacetate), 알파-페닐부티라미드(α-phenylbutyramide), 피로자딜(pirozadil), 프로부콜(probucol)(lorelco), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 술토실릭산-피페라진염(sultosilic acid-piperazine salt), 티아데놀(tiadenol), 트리파라놀(triparanol), 및 젠부신(xenbucin)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
항동맥경화증제는 예를 들어, 피리디놀 카바메이트(pyridinol carbamate)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
어떤 구체예에서, 혈전의 제거나 방지를 돕는 약제의 투여는, 특히 아테로마성 동맥 경화증과 맥관 구조(예를 들어, 동맥) 폐색의 치료에서는, 조절기 (modulator) 의 투여와 결합될 수 있다. 항혈전제/혈전용해제는 예를 들어, 항응고제, 항응고 길항제, 항혈소판제, 혈전제, 혈전 길항제 또는 그들의 조합 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
어떤 측면에서, 예를 들어 아스피린과 와파린(wafarin)(카우마딘(coumadin)) 같은 항혈전제는 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.
항응고제는 예를 들어, 아세노카우마롤(acenocoumarol), 안크로드(ancrod), 아니신디온(anisindione), 브로민디온(bromindione), 클로린디온(clorindione), 카우메타롤(coumetarol), 시클로쿠마롤(cyclocumarol), 덱스트란 술페이트 소듐(dextran sulfate sodium), 디쿠마롤(dicumarol), 디페나디온(diphenadione), 에틸 비스카우마아세테이트(ethyl biscoumacetate), 에킬이덴 디카우마롤(ethylidene dicoumarol), 플루인디온(fluindione), 헤파린, 히루딘, 리아폴레이트 소듐(lyapolate sodium), 옥사지디온(oxazidione), 펜토산 폴리술페이트(pentosan polysulfate), 페닌디온(phenindione), 펜프로카우몬(phenprocoumon), 포스비틴(phosvitin), 피코타미드(picotamide), 티오클로마롤(tioclomarol), 및 와파린을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
항혈소판제는 예를 들어, 아스피린, 덱스트란, 디피리다몰(dipyridamole)(페르산틴(persantin)), 헤파린, 술핀피라논(sulfinpyranone)(안투란(anturane)), 및 티클로피딘(ticlopidine)(티클리드(ticlid))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
혈전제는 예를 들어, 조직 프라스미노겐 활성제(tissue plaminogen activase), 플라스민(plasmin), 프로-우로키나아제(pro-urokinase), 우로키나아제(urokinase)(아보키나아제(abbokinase)), 스트랩토키나아제(streptokinase)(스트랩타아제(streptase)), 안트스트렙플라제/APSAC(anistreplase/APSAC)(에미나아제(eminase))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
출혈이나 출혈의 가능성이 증가되어 고통받는 환자에서의 어떤 구체예에서는, 혈액의 응고를 증가시키는 지혈제가 사용될 수 있다. 혈액응고 촉진제는 예를 들어, 혈전 길항제와 항응고 길항제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
항응고 길항제는 예를 들어, 프로타민(protamine)과 비타민 K1를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
혈전 길항제는 예를 들어, 아미오카플로익산(amiocaproic acid)(아미카르(amicar))와 트란엑사믹산(tranexamic acid)(암스태트(amstat))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 항혈전제는 예를 들어, 아나그레리드(anagrelide), 아르가트로반(argatroban), 실스타졸(cilstazol), 달트로반(daltroban), 데피브로티드(defibrotide), 에녹사파린(enoxaparin), 프락시파린(fraxiparine), 인도부펜(indobufen), 라모파란(lamoparan), 오자그렐(ozagrel), 피코타미드(picotamide), 플라피브리드(plafibride), 테델파린(tedelparin), 티클로피딘(ticlopidine), 및 트리플루살(triflusal)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
항부정맥제는 예를 들어, 클래스1 항부정맥제(나트륨 채널 차단제), 클래스2 항부정맥제(베타-아드레날린성(adrenergic) 차단제), 클래스3 항부정맥제(재분극 연장제), 클래스4 항부정맥제(칼슘 채널 차단제), 및 각 종류의 항부정맥제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
나트륨 채널 차단제는 예를 들어, 클래스1A 항부정맥제, 클래스1B 항부정맥제와 클래스1C 항부정맥제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 클래스1A 항부정맥제는 예를 들어, 디스피라미드(disppyramide)(노르페이스(norpace)), 프로카인아미드(procainamide)(프로네스틸(pronestyl)) 및 퀴니딘(quinidine)(퀴니덱스(quinidex))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 클래스1B 항부정맥제는 예를 들어, 리도카인(lidocaine)(자일로카인(xylocaine)), 토카이니드(tocainide)(토노카드(tonocard)) 및 멕실레틴(mexiletine)(멕시틸(mexitil))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 클래스1C 항부정맥제는 예를 들어, 엔카이니드(encainide)(엔카이드(enkaid)) 및 플레카이니드(flecainide)(탐보코르(tambocor))를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
β-아드레날린성 차단제, β-아드레날린성 길항제, 또는 클래스2 항부정맥제로 알려진 베타-차단제는 예를 들어, 아세부톨올(acebutolol)(섹트랄(sectral)), 알프레놀올(alprenolol), 아모술날올(amosulalol), 아로티놀올(arotinolol), 아테놀올(atenolol), 베푸놀올(befunolol), 베탁솔올(betaxolol), 베반톨올(bevantolol), 비소프롤올(bisoprolol), 보핀돌올(bopindolol), 부쿠몰올(bucumolol), 부페톨올(bufetolol), 부푸랄올(bufuralol), 부니트롤올(bunitrolol), 부프라놀올(bupranolol), 부티드린 히드로클로라이드(butidrine hydrochloride), 부토피롤올(butofilolol), 카라졸올(carazolol), 카르테올올(carteolol), 카르베딜올(carvedilol), 세리프롤올(celiprolol), 세타몰올(cetamolol), 클로란올올(cloranolol), 디레발올(dilevalol), 에판올올(epanolol), 에스몰올(esmolol)(brevibloc), 인덴올올(indenolol), 라베탈올(labetalol), 레보부놀올(levobunolol), 메핀돌올(mepindolol), 메티프라놀올(metipranolol), 메토프롤올(metoprolol), 모프롤올(moprolol), 나돌올(nadolol), 나독솔올(nadoxolol), 니페날올(nifenalol), 니프라딜올(nipradilol), 옥스프레놀올(oxprenolol), 펜부톨올(penbutolol), 핀돌올(pindolol), 프락톨올(practolol), 프로네탈올(pronethalol), 프로판올올(propanolol)(인데랄(inderal)), 소탈올(sotalol)(베타페이스(betapace)), 술피날올(sulfinalol), 탈리놀올(talinolol), 테르타톨올(tertatolol), 티몰올(timolol), 토리프롤올(toliprolol), 및 지비놀올(xibinolol)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 어떤 측면에서, 베타-차단제는 아릴옥시프로판올아민(aryloxypropanolamine) 유도체를 포함한다. 아릴옥시프로판올아민 유도체는 예를 들어, 아세부톨올(acebutolol), 알프레놀올(alprenolol), 아로티놀올(arotinolol), 아테놀올(atenolol), 베탁솔올(betaxolol), 베반톨올(bevantolol), 비소프롤올(bisoprolol), 보핀돌올(bopindolol), 부니트롤올(bunitrolol), 부토피롤올(butofilolol), 카라졸올(carazolol), 카르테올올(carteolol), 카르베딜올(carvedilol), 세리프롤올(celiprolol), 세타몰올(cetamolol), 에판올올(epanolol), 인데놀올(indenolol), 메핀돌올(mepindolol), 메티프라놀올(metipranolol), 메토프롤올(metoprolol), 모프롤올(moprolol), 나돌올(nadolol), 니프라딜올(nipradilol), 옥스프레놀올(oxprenolol), 펜부톨올(penbutolol), 핀돌올(pindolol), 프로판올올(propanolol), 탈리놀올(talinolol), 테르타톨올(tertatolol), 티몰올(timolol), 및 톨리프롤올(toliprolol)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
클래스3 항부정맥제로도 알려진 재분극 연장제는 예를 들어, 아미오다론(amiodarone)(코르다론(cordarone)) 및 소탈올(sotalol)(베타페이스(betapace))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
클래스4 항부정맥제로 알려진 칼슘 채널 차단제는 예를 들어, 아릴알킬아민(예를 들어, 베프리딜(bepridile), 딜티아젬(diltiazem), 펜딜린(fendiline), 갈로파밀(gallopamil), 프레닐아민(prenylamine), 테로딜린(terodiline), 베라파밀(verapamil), 디히드로피리딘 유도체(펠로디핀(felodipine), 이스라디핀(isradipine), 니카르디핀(nicardipine), 니페디핀(nifedipine), 니모디핀(nimodipine), 니솔디핀(nisoldipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 피페라진 유도체 (예를 들어, 시나리진(cinnarizine), 플루나리진(flunarizine), 리도플라진(lidoflazine), 또는 벤시클란(bencyclane), 에타페논(etafenone), 마그네슘, 미베프라딜(mibefradil) 또는 퍼헥실린(perhexiline)과 같은 여러 종류의 칼슘 채널 차단제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 어떤 구체에에서, 칼슘 채널 차단제는 지속성이 있는 디히드로피리딘(니페디핀-타입) 칼슘 길항제를 포함한다.
여러 종류의 항부정맥제는 예를 들어, 아데노신(adenosine)(아데노카드(adenocard)), 디그옥신(digoxin)(라녹신(lanoxin)), 아세카이니드(acecainide), 아즈말린(ajmaline), 아모프록산(amoproxan), 아프린딘(aprindine), 브레틸륨 토실레이트(bretylium tosylate), 부나프틴(bunaftine), 부토벤딘(butobendine), 카포베닉산(capobenic acid), 시펜린(cifenline), 디소피라니드(disopyranide), 히드로퀴니딘(hydroquinidine), 인데카이니드(indecainide), 이파트로피움 브로마이드(ipatropium bromide), 리도카인(lidocaine), 로라즈민(lorajmine), 로카이니드(lorcainide), 메오벤틴(meobentine), 모리시진(moricizine), 피르메놀(pirmenol), 프라즈말린(prajmaline), 프로파페논(propafenone), 피리놀린(pyrinoline), 퀴니딘 폴리갈락투로네이트(quinidine polygalacturonate), 퀴니딘 술페이트(quinidine sulfate), 및 비퀴딜(viquidil)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
항고혈압제는 예를 들어, 교감 신경 차단제, 알파/베타-차단제, 알파-차단제, 항-안지오텐신 II 약제, 베타-차단제, 칼슘 채널 차단제, 혈관 확장 신경제, 및 여러 종류의 항고혈압제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
α-아드레날린성 차단제 또는 α-아드레날린성 길항제로 알려진 알파-차단제는 예를 들어, 아모술랄올(amosulalol), 아로티놀올(arotinolol), 다피프라졸(dapiprazole), 독사조신(doxazosin), 에르고로이드 메실레이트(ergoloid mesylates), 펜스피리드(fenspiride), 인도라민(indoramin), 라베탈올(labetalol), 니세르골린(nicergoline), 프라조신(prazosin), 테라조신(terazosin), 토라졸린(tolazoline), 트리마조신(trimazosin) 및 요힘빈(yohimbine)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 어떤 구체예에서, 알파-차단제는 퀴나졸린(quinazoline) 유도체를 포함한다. 퀴나졸린 유도체는 예를 들어, 알푸조신(alfuzosin), 부나조신(bunazosin), 독사조신(doxazosin), 프라조신(prazosin), 테라조신(terazosin), 및 트리마조신(trimazosin)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
어떤 구체예에서, 항고혈압제는 알파-아드레날린성 길항제와 베타-아드레날린성 길항제 모두이다. 알파/베타-차단제는 예를 들어 라베탈올(labetalol)(노르모딘(normodyne), 트란데이트(trandate))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
항-안지오텐신 II 약제는 예를 들어, 안지오텐신 전환 효소 억제제와 안지오텐신 II 수용체 길항제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 안지오텐신 전환 효소 억제제 (ACE 억제제)는 예를 들어, 아라세프릴(alacepril), 에나라프릴(enalapril) (바소텍(vasotec)), 캡토프릴(captopril), 실라자프릴(cilazapril), 델라프릴(delapril), 에날라프릴라트(enalaprilat), 포신프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 모벨로프릴(moveltopril), 페린도프릴(perindopril), 퀴나프릴(quinapril), 및 라미프릴(ramipril)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 안지오텐신 II 수용체 길항제, ANG 수용체 차단제, 또는 ANG-II 1형 수용체 차단제(ARBS)로 알려진 안지오텐신 II 수용체 차단제는 예를 들어, 안지오칸데사르탄(angiocandesartan), 에프로사르탄(eprosartan), 이르베사르탄(irbesartan), 로사르탄(losartan) 및 발사르탄(valsartan)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
교감 신경 차단제는 예를 들어, 중추적으로 작용하는 교감 신경 차단제 또는 말초적으로 작용하는 교감 신경 차단제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 중추신경계 (CNS) 교감 신경 차단제로도 알려진 중추적으로 작용하는 교감 신경 차단제는 예를 들어, 클로니딘(clonidine) (카타프레스(catapres)), 구아나벤즈(guanabenz) (위텐신(wytensin)),구안파신(guanfacine) (테넥스(tenex)), 및 메틸도파(methyldopa) (알도메트(aldomet))를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 말초적으로 작용하는 교감 신경 차단제는 예를 들어, 신경절 차단제, 아드레날린성 뉴런 차단제, β-아드레날린성 차단제, 또는 α1-아드레날린성 차단제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 신경절 차단제는 예를 들어, 메카밀아민(mecamylamine)(인베르신(inversine))과 트리메타판(trimethaphan)(아르포나드(arfonad))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 아드레날린성 뉴런 차단제는 예를 들어, 구아네티딘(guanethidine)(이스멜린(ismelin)) 및 레세르핀(reserpine)(세르파실(serpasil))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. β-아드레날린성 차단제는 예를 들어, 아세니톨올(acenitolol)(섹트랄(sectral)), 아테놀올(atenolol)(테노르민(tenormin)), 베탁솔올(betaxolol)(케르론(kerlone)), 카테올올(carteolol)(카트롤(cartrol)), 라베탈올(labetalol)(노르모딘(normodyne), 트란데이트(trandate)), 메토프롤올(metoprolol)(로프레서(lopressor)), 나다놀(nadanol)(코르가드(corgard)), 펜부톨올(penbutolol)(레바톨(levatol)), 핀돌올(pindolol)(비스켄(visken)), 프로프라놀올(propranolol)(인데랄(inderal)), 및 티몰올(timolol)(블로카드렌(blocadren))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. α1-아드레날린성 차단제는 예를 들어, 프라조신(prazosin)(미니프레스(minipress)), 독사조신(doxazocin)(카르두라(cardura)), 및 테라조신(terazosin)(히트린(hytrin))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
어떤 구체예에서 심혈관 치료 약제는 혈관 확장 신경제(예를 들면, 뇌혈관 확장제, 관상동맥 확장제, 또는 말초혈관 확장제)를 포함할 수 있다. 본 발명에서 제시한 어떤 구체예에서, 혈관 확장 신경제는 관상동맥 확장제를 포함한다. 관상동맥 확장제는 예를 들어, 아모트리펜(amotriphene), 벤다졸(bendazol), 벤푸로딜헤미숙시네이트(benfurodil hemisuccinate), 벤지오다론(benziodarone), 클로라시진(chloracizine), 크로모나르(chromonar), 클로벤푸롤(clobenfurol), 클로니트레이트(clonitrate), 딜라젭(dilazep), 디피리다몰(dipyridamole), 드로프레닐아민(droprenilamine), 에플록세이트(efloxate), 에리스리틸 테트라니트란(erythrityl tetranitrane), 에타페논(etafenone), 펜딜린(fendiline), 플로레딜(floredil), 간글레펜(ganglefene), 헤레스트롤 비스(β-디에틸아미노에틸 에테르)(herestrol bis(β-diethylaminoethyl ether)), 헥소벤딘(hexobendine), 이트라민 토실레이트(itramin tosylate),켈린(khellin), 리도플라닌(lidoflanine), 만니톨 헥사니트란(mannitol hexanitrane), 메디바진(medibazine), 니코르글리세린(nicorglycerin), 펜타에리스리톨 테트라니트레이트(pentaerythritol tetranitrate), 펜트리니트롤(pentrinitrol), 페르헥실린(perhexiline), 피메필린(pimefylline), 트라피딜(trapidil), 트리크로밀(tricromyl), 트리메타지딘(trimetazidine), 트롤니트레이트 포스페이트(trolnitrate phosphate), 및 비스나딘(visnadine)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
어떤 측면에서, 혈관 확장 신경제는 만성 요법 혈관 확장 신경제 또는 고혈압 응급 혈관 확장 신경제를 포함 할 수 있다. 만성 요법 혈관 확장 신경제는 예를 들어, 히드랄라진(hydralazine)(아프레솔린(apresoline))과 미녹시딜(minoxidil)(로니텐(loniten))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 고혈압 응급 혈관 확장 신경제는 예를 들어, 니트로프루시드(nitroprusside)(니프라이드(nipride)), 디아족시드(diazoxide)(하이퍼스태트 IV(hyperstat IV)), 히드랄라진(hydralazine)(아프레솔린(apresoline)), 미녹시딜(minoxidil)(로니텐(loniten)), 및 베라파밀(verapamil)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
여러 종류의 항고혈압제는 예를 들어, 아즈말린(ajmaline), 감마-아미노부틸산(γ-aminobutyric acid), 부테니오드(bufeniode), 시클레타이닌(cicletainine), 시클로시도민(ciclosidomine), 크립텐아민 탄네이트(cryptenamine tannate), 페놀도팜(fenoldopam), 플로세퀴난(flosequinan), 케탄세린(ketanserin), 메부타메이트(mebutamate), 메카밀아민(mecamylamine), 메틸도파(methyldopa), 메틸 4-피리딜 케톤 티오세미카르바존(methyl 4-pyridyl ketone thiosemicarbazone), 무졸이민(muzolimine), 파르질린(pargyline), 펨피딘(pempidine), 피나시딜(pinacidil), 피페록산(piperoxan), 프라마페론(primaperone), 프로토베라트린(protoveratrine), 라우바신(raubasine), 레시메톨(rescimetol), 릴멘이덴(rilmenidene), 사라라신(saralasin), 소듐 니트로프루시드(sodium nitroprusside), 티크리나펜(ticrynafen), 트리메타판 캄실레이트(trimethaphan camsylate), 티로시나아제(tyrosinase), 및 우라피딜(urapidil)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
어떤 측면에서, 항고혈압제는 아릴에타놀아민(arylethanolamine) 유도체, 벤조티아디아진(benzothiadiazine) 유도체, N-카르복시알킬(펩티드/락탐)(N-carboxyalkyl(peptide/lactam)) 유도체, 디히드로피리딘(dihydropyridine) 유도체, 구아니딘(guanidine) 유도체, 히드라진/프탈라진(hydrazines/phthalazine), 이미다졸(imidazole) 유도체, 4차 암모늄 화합물, 레세르핀(reserpine) 유도체, 또는 술포아미드(sulfonamide) 유도체를 포함할 수 있다.
아릴에타놀아민(arylethanolamine) 유도체는 예를 들어, 아모술랄올(amosulalol), 부푸랄올(bufuralol), 딜레발올(dilevalol), 라베탈올(labetalol), 프로네탈올(pronethalol), 소탈올(sotalol), 및 술피날올(sulfinalol)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
벤조티아디아진(benzothiadiazine) 유도체는 예를 들어, 알티지드(althizide), 벤드로플루메티아지드(bendroflumethiazide), 벤즈티아지드(benzthiazide), 벤질히드로클로로티아지드(benzylhydrochlorothiazide), 부티아지드(buthiazide), 클로로티아지드(chlorothiazide), 클로르탈리돈(chlorthalidone), 시클로펜티아지드(cyclopenthiazide), 시클로티아지드(cyclothiazide), 디아족시드(diazoxide), 에피티아지드(epithiazide), 에티아지드(ethiazide), 펜퀴존(fenquizone), 히드로클로로티지드(hydrochlorothizide), 히드로플루메티지드(hydroflumethizide), 메티클로티아지드(methyclothiazide), 메티크란(meticrane), 메톨아존(metolazone), 파라플루티지드(paraflutizide), 폴리티아지드(polythizide), 테트라클로르메티아지드(tetrachlormethiazide), 및 트리클로르메티아지드(trichlormethiazide)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
N-카르복시알킬(펩티드/락탐)(N-carboxyalkyl(peptide/lactam)) 유도체는 예를 들어, 아라세프릴(alacepril), 캅토프릴(captopril), 실라자프릴(cilazapril), 델라프릴(delapril), 에날라프릴(enalapril), 에날라프릴라트(enalaprilat), 포신프릴(fosinopril), 리시노프릴(lisinopril), 모벨티프릴(moveltipril), 페린도프릴(perindopril), 퀴나프릴(quinapril), 및 라미프릴(ramipril)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
디히드로피리딘(dihydropyridine) 유도체는 예를 들어, 암로디핀(amlodipine), 펠로디핀(felodipine), 이스라디핀(isradipine), 니카르디핀(nicardipine), 니페디핀(nifedipine), 닐바디핀(nilvadipine), 니솔디핀(nisoldipine), 및 니트렌디핀(nitrendipine)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
구아니딘(guanidine) 유도체는 예를 들어, 베타니딘(bethanidine), 데브리소퀸(debrisoquin), 구아나벤즈(guanabenz), 구아나클린(guanacline), 구아나드렐(guanadrel), 구아나조딘(guanazodine), 구아네티딘(guanethidine), 구안파신(guanfacine), 구아노클로르(guanochlor), 구아녹사벤즈(guanoxabenz), 및 구아녹산(guanoxan)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
히드라진/프탈라진(hydrazines/phthalazine)은 예를 들어, 부드랄아진(budralazine), 카드랄아진(cadralazine), 디히드랄아진(dihydralazine), 엔드랄아진(endralazine), 히드라카르바진(hydracarbazine), 히드랄아진(hydralazine), 페니프라진(pheniprazine), 필드랄아진(pildralazine), 및 토드랄아진(todralazine)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
이미다졸(imidazole) 유도체는 예를 들어, 클로니딘(clonidine), 로펙시딘(lofexidine), 펜톨아민(phentolamine), 티아메니딘(tiamenidine), 및 톨로니딘(tolonidine)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
4차 암모늄 화합물은 예를 들어, 아자메토늄 브로마이드(azamethonium bromide), 클로리손다민 클로라이드(chlorisondamine chloride), 헥사메토늄(hexamethonium), 펜타시늄 비스(메틸술페이트)(pentacynium bis(methylsulfate)), 멘타메토늄 브로마이드(pentamethonium bromide), 펜톨리늄 타르트레이트(pentolinium tartrate), 페낙트로피늄 클로라이드(phenactropinium chloride), 및 트리메틴디늄 메토술페이트(trimethidinium methosulfate)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
레세르핀(reserpine) 유도체는 예를 들어, 비에타세르핀(bietaserpine), 데세르핀(deserpidine), 레시나민(rescinnamine), 레세르핀(reserpine), 및 시로싱고핀(syrosingopine)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
술포아미드(sulfonamide) 유도체는 예를 들어, 암부시드(ambuside), 클로파미드(clopamide), 푸로세미드(furosemide), 인다파미드(indapamide), 퀴네타존(quinethazone), 트리파미드(tripamide), 및 지파미드(xipamide)를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
승압제는 일반적으로 수술 과정에서 발생할 수 있는 쇼크 중에 혈압을 올리기 위해 사용된다. 항저혈압제로도 알려진 승압제는 예를 들어, 아메지늄 메틸 술페이트(amezinium methyl sulfate), 안지오텐신 아미드(angiotensin amide), 디메토프린(dimetofrine), 도파민, 에티펠민(etifelmin), 에틸레프린(etilefrin), 게페프린(gepefrine), 메타라미놀(metaraminol), 미도드린(midodrine), 노르에피네프린(norepinephrine), 포레드린(pholedrine), 및 시네프린(synephrine)을 포함하나 이에 한정하지는 않는다.
울혈성 심부전증 치료제는 예를 들어, 항-안지오텐신 II 약제, 전부하-후부하 감소 치료제, 이뇨제, 및 근육 수축성의 약제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
어떤 구체예에서, 안지오텐신 길항제를 받아들이지 못하는 동물 개체의 경우 복합 요법이 처리된다. 이러한 요법은 히드랄아진(hydralazine)(아프레솔린(apresoline))과 이소소르비드 디니트레이트(isosorbide dinitrate)(이소르딜(isordil), 솔비트레이트(sorbitrate))의 투여를 포함할 수 있다.
이뇨제는 예를 들어, 티아지드(thiazide) 또는 벤조티아디아진(benzothiadiazine) 유도체(예를 들면, 알티아지드(althiazide), 벤드로플루메타지드(bendroflumethazide), 벤즈티아지드(benzthiazide), 벤질히드로클로로티아지드(benzylhydrochlorothiazide), 부티아지드(buthiazide), 클로로티아지드(chlorothiazide), 클로로티아지드(chlorothiazide), 클로르탈리돈(chlorthalidone), 시클로펜티아지드(cyclopenthiazide), 에피티아지드(epithiazide), 에티아지드(ethiazide), 에티아지드(ethiazide), 펜퀴존(fenquizone), 히드로클로로티아지드(hydrochlorothiazide), 히드로플루메티아지드(hydroflumethiazide), 메티클로티아지드(methyclothiazide), 메티크란(meticrane), 메톨아존(metolazone), 파라플루티지드(paraflutizide), 폴리티아지드(polythizide), 테트라클로로메티아지드(tetrachloromethiazide), 트리클로르메티아지드(trichlormethiazide)), 오가노머큐리얼(organomercurial)(예를 들면, 클로르메로드린(chlormerodrin), 메랄루리드(meralluride), 메르캄파미드(mercamphamide), 메르캅토메린 소듐(mercaptomerin sodium), 메르쿠마릴릭산(mercumallylic acid), 메르쿠마틸린 도듐(mercumatilin dodium), 메르큐로스 클로라이드(mercurous chloride), 메르살릴(mersalyl)), 프테리딘(pteridine)(예를 들면, 푸르테렌(furterene), 트리암테렌(triamterene)), 퓨린(purines)(예를 들면, 아세필린(acefylline), 7-모르포리노메틸테오필린(7-morpholinomethyltheophylline), 파모브롬(pamobrom), 프로테오브로민(protheobromine), 테오브로민(theobromine)), 알도스테론(aldosterone) 길항제를 포함하는 스테로이드(예를 들면, 칸레논(canrenone), 올레안드린(oleandrin), 스피로놀락톤(spironolactone)), 술포아미드(sulfonamide) 유도체 (예를 들면, 아세트아졸아미드(acetazolamide), 암부시드(ambuside), 아조세미드(azosemide), 부메타니드(bumetanide), 부타졸아미드(butazolamide), 클로라미노페나미드(chloraminophenamide), 클로펜아미드(clofenamide), 클로파미드(clopamide), 클로렉솔론(clorexolone), 디페닐메탄-4,4'-디술포아미드(diphenylmethane-4,4'-disulfonamide), 디술파미드(disulfamide), 에트옥스졸아미드(ethoxzolamide), 푸로세미드(furosemide), 인다파미드(indapamide), 메프루시드(mefruside), 메타졸아미드(methazolamide), 피레타니드(piretanide), 퀴네타존(quinethazone), 토라세미드(torasemide), 트리파미드(tripamide), 지파미드(xipamide)), 우라실(예를 들면, 아미노메트아딘(aminometradine), 아미소메트라딘(amisometradine)), 포타슘 보존성 길항제(예를 들면, 아밀로라이드(amiloride), 트리암테렌(triamterene)), 또는아미노진(aminozine), 아르부틴(arbutin), 클로라자닐(chlorazanil), 에타크리닉산(ethacrynic acid), 에토졸린(etozolin), 히드라카르바진(hydracarbazine), 이소솔비드(isosorbide), 만니톨(mannitol), 메토칼콘(metochalcone), 무졸리민(muzolimine), 페르헥실린(perhexiline), 티크르나펜(ticrnafen), 및 우레아(urea)와 같은 여러 종류의 이뇨제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
강심제로도 알려진 수축촉진제는 예를 들어, 아세필린(acefylline), 아세틸디지톡신(acetyldigitoxin), 2-아미노-4-피콜린(2-amino-4-picoline), 암리논(amrinone), 벤푸로딜 헤미숙시네이트(benfurodil hemisuccinate), 부클라데신(bucladesine), 세르베로신(cerberosine), 캄포타미드(camphotamide), 콘발라톡신(convallatoxin), 시마린(cymarin), 데노파민(denopamine), 데슬라노시드(deslanoside), 디지탈린(digitalin), 디지탈리스(digitalis), 디지톡신(digitoxin), 디그옥신(digoxin), 도부타민(dobutamine), 도파민, 도펙사민(dopexamine), 에녹시몬(enoximone), 에리스로프레인(erythrophleine), 페날코민(fenalcomine), 지탈린(gitalin), 지톡신(gitoxin), 글리코시아민(glycocyamine), 헵타미놀(heptaminol), 히드라스티닌(hydrastinine), 이보파민(ibopamine), 라나토시드(lanatoside), 메타미밤(metamivam), 밀리논(milrinone), 네리폴린(nerifolin), 올레안드린(oleandrin), 오우아바인(ouabain), 옥시페드린(oxyfedrine), 프레날테론(prenalterol), 프로실라리딘(proscillaridine), 레시부포제닌(resibufogenin), 실라렌(scillaren), 실라레닌(scillarenin), 스트르판틴(strphanthin), 술마졸(sulmazole), 테오브로민(theobromine), 및 자모테롤(xamoterol)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
특정 측면에서 수축촉진제는 강심 배당체(cardiac glycoside), 베타-아드레날린 작동약(베타-아드레날린성 작용제), 또는 포스포디에스터라아제(phosphodiesterase) 억제제를 의미한다. 강심 배당체는 예를 들어, 디그옥신(digoxin)(라녹신(lanoxin))과 디지톡신(digitoxin)(크리스토디진(crystodigin))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 베타-아드레날린성 작용제는 예를 들어, 알부테롤(albuterol), 밤부테롤(bambuterol), 비톨테롤(bitolterol), 카르부테롤(carbuterol), 클렌부테롤(clenbuterol), 클로프레날린(clorprenaline), 데노파민(denopamine), 디옥세테드린(dioxethedrine), 도부타민(dobutamine)(도부트렉스(dobutrex)), 도파민(인트로핀(intropin)), 도펙사민(dopexamine), 에페드린(ephedrine), 에타페드린(etafedrine), 에틸노르에피네프린(ethylnorepinephrine), 페노테롤(fenoterol), 포르모페롤(formoterol), 헥소프레날린(hexoprenaline), 이보파민(ibopamine), 이소에탈린(isoetharine), 이소프로테레놀(isoproterenol), 마부테롤(mabuterol), 메타프로테레롤(metaproterenol), 메톡시펜아민(methoxyphenamine), 옥시페드린(oxyfedrine), 피르부테롤(pirbuterol), 프로카테롤(procaterol), 프로토킬올(protokylol), 레프로테롤(reproterol), 리미테롤(rimiterol), 이토드린(ritodrine), 소테레롤(soterenol), 테르부탈린(terbutaline), 트레토퀴놀(tretoquinol), 툴로부테롤(tulobuterol), 및 자모테롤(xamoterol)을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase) 억제제는 예를 들어, 암리논(amrinone)(이노코르(inocor))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
항협심증제는 오가노니트레이트(organonitrates), 칼슘 채널 차단제, 베타-차단제, 및 그것들의 조합 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
니트로바소딜레이터(nitrovasodilators)로도 알려진 오가노니트레이트(organonitrates)는 예를 들어, 니트로글리세린(nitroglycerin)(니트로-비드(nitro-bid), 니트로스태트(nitrostat)), 이소솔비드 디니트레이트(isosorbide dinitrate)(이소르딜(isordil), 솔비트레이트(sorbitrate)), 및 아밀 니트레이트(amyl nitrate)(아스피롤(aspirol), 바포롤(vaporole))을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
수술요법은 부가적인 요법들 중 하나로 고려되었다. 혈관질환/장애와 심혈관질환/장애를 위한 이러한 수술적 치료법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 그들은 예를 들어, 생물에게 수술을 행하는 것, 심혈관에 장치적인 인공 삽입물을 집어 넣는 것, 혈관형성술, 관상동맥 재관류(coronary artery reperfusion), 전극도자 절제술(catheter ablation), 삽입형제세동기(implantable cardioverter defibrillator) 공급, 장치적인 순환 보조 장치, 심장이식, 심장판막수술, 관상동맥우회술(coronary artery bypass grafting), 또는 그들의 조합 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 장치적인 순환 보조 장치에는 예를 들어, 대동맥내 풍선대위박동(intra-aortic balloon counterpulsation), 좌심실 보조장치(left ventricular assist device), 또는 그것들의 조합 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
b. 퇴행성 신경 질환의 부가적인 요법
퇴행성 신경 질환의 부가적인 요법의 예들은 약물요법 또는 수술요법을 포함한다. 약물요법은 예를 들어, 콜린에스터라아제(cholinesterase) 억제제 (예를 들면, 도네제필(donezepil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine))을를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 부가적인 요법의 다른 예들은 뇌에서 글루타메이트를 조절하는 Memantine 같은 약제를 포함한다. 추가 예로는 비타민 E와 같은 항산화제가 포함된다. 항정신병약, 신경 이완제, 항우울제, 불안 완화제, 및 수면제 등이 부가적인 요법으로써 고려되었다. 다른 부가적인 약제들은, 셀레질린(selegiline), 모노아민 옥시다아제(monoamine oxidase) 선택성 억제제, 에스트로겐, 항염증제, 및 은행나무 잎(ginkgo biloba) 등을 포함한다.
부가적인 요법들은 레보도파(levodopa), 도파민 작동약, 및 COMT 억제제 역시 포함한다.
부가적인 수술요법들은 절제, 뇌 심부 자극술(deep brain stimulation), 창백핵 절단술(pallidotomy), 및 본 발명의 세포와 다른 도파민을 생성하는 세포의 대뇌 이식 등을 포함한다.
c. 간 질환의 부가적인 요법
간 질환의 부가적인 요법의 예들은 약물요법 또는 수술요법을 포함한다. 약물요법은 예를 들어, 술파살라진(sulfasalazine), 코르티코스테로이드(corticosteroid), 항염증 화합물, 지침화된 싸이토카인 요법 (예를 들면, 펜톡시필린(pentoxifylline) 또는 TNF-항체), 항산화제, 및 항바이러스 요법 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
d. 화학요법의 약제
다양한 화학요법의 약제들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "화학요법(chemotherapy)"은 암을 치료하기 위한 약의 사용으로 해석된다. "화학요법의 약제(chemotherapeutic agent)"란 암의 치료를 위해 투여되는 화합물 또는 혼합물의 뜻을 내포한다. 이들 약제나 약물은 그들의 세포안에서의 작용방식(예를 들면, 그들이 세포주기에 영향을 미치는지 아닌지와 정확히 어떤 단계에 영향을 미치는지 등)에 따라 분류된다. 다른 방법으로는, 약제를 그것이 DNA와 교차결합(cross-link) 할 수 있는 능력, DNA로 삽입될 수 있는 능력, 또는 핵산합성에 영향을 끼쳐 염색체 이상과 유사분열의 이상을 유도 할 수 있는 능력 등에 기반하여 구분할 수 있다. 대부분의 화학요법 약제들은 다음의 분류에 속한다: 알킬레이션을 시키는 약제, 대사 길항 물질, 항종양성의 항생제, 유사분열 억제제, 및 니트로소우레아(nitrosourea). 이들 약제의 예는 상기 명시되었다.
H. 키트
본 발명의 다양한 측면에서 키트는, 본 발명의 세포 클론 집단을 포함하는 하나 또는 그 이상의 밀봉된 저장소(container)를 포함하도록 계획되었다. 다른 구체예에서, 키트는 적당한 용기 역시 포함하는데, 여기서 용기란 에펜도르프 튜브, 분석 플레이트, 주사기, 병, 또는 튜브 등과 같은 키트의 성분과 반응하지 아니하는 용기를 말한다. 상기 저장소는 플라스틱이나 유리 같은 살균가능한 재료로 만들 수 있다.
본 키트는, 본 발명의 방법에 관한 절차적 단계의 개요, 또는 세포 클론 집단의 출처, 보관법, 관리법, 기타등등에관한 정보를 설명하는 사용 설명서를 추가로 포함한다. 본 사용 설명서 정보는 치료약제의 약학적으로 효과적인 양을 전달하는 현실적 절차의 디스플레이 또는 가상 절차의 디스플레이 때문에 컴퓨터를 실행했을 때 읽을 수 있는 설명서가 포함된 매체일 것이다. 본 키트는 하나 또는 그 이상의 질병의 치료나 예방에 적용할 수 있는 부가적 치료약제를 선택적으로 포함할 것이다. 예를 들어, 부가적 치료약제란 퇴행성 신경질환이나 심혈관질환의 치료나 예방에 적용가능한 약제일 수 있다. 이러한 약제들은 본 명세서에서 논의된 것 일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
I. 실시예
아래 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 증명하기 위한 것이다. 당업자는 하기 실시예들에 의해 개시될 기술들이 본 발명자에 의해 개발된, 본 발명의 실행에서 잘 기능하는, 기술들을 나타냄을, 고로 선호되는 방법들을 기술의 실행을 위해 적당히 선택한다고 여길 수 있다는 점을 잘 인식하여야 한다. 그러나, 당업자라면 본 개시의 관점에서, 개시된 특정 구체예에서 변형들이 생길 수 있으며, 본 발명의 의도와 범위 내에서 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식할 수 있을 것이다.
실시예 1
재료와 방법
세포배양: 마우스 CGR8-배아 줄기세포주(CGR8-ESC line)는 European Collection of Cell Culture (ATCC)로부터 구하였다; PA6 간질세포는 일본의 Riken BRC cell bank에서 제공 받았다. CGR8 배아 줄기세포주는 10% 우태혈청(fetal calf serum), 2 mM L-글루타민, 1% 비필수 아미노산, 1mM 소듐 피루베이트, 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, Invitrogen, Grand Island, NY, USA; www.invitrogen.com), 및 leukemia inhibitory factor(LIF)를 추가한 BHK 21 배지로 유지 배양하였다. CGR8는 젤라틴이 코팅된 배양접시에서 배양하였다. PA6 간질세포는 10% FBS(Gibco, Invitrogen)를 추가한 MEM-alpha 배지로 유지배양하였다.
항체: 다음의 일차항체들이 사용되었다: 마우스 항-네스틴, 마우스-항-신경핵(neuronal nuclei)-특이 단백질(NeuN), 토끼 항-티로신 히드록실라아제, 래트 항-d도파민 트란스포터(DAT) (Chemicon, Temecula, CA, USA; www.chemicon.com), 마우스 항-티로신 히드록실라아제(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA; www.scbt.com), 마우스 항-베타-III-튜불린 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; www.sigmaaldrich.com), 및 토끼 항-베타-III-튜불린 (Covance, Princeton, NJ, USA; www.covance.com). 다음의 형광물질이 표지된 이차항체들이 사용되었다: 고트(goat) 또는 동키(donkey)로부터 얻어진 마우스, 고트 또는 토끼에 대한 Alexa Fluor(555 또는 488)-표지된 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, USA; probes.invitrogen.com); 마우스 IgG에 대한 Cy5-컨쥬게이트된 동키, 토끼 IgG에 대한 PE-Cy5.5 고트(Jackson Immunoresearch Laboratories, USA; www.jacksonimmuno.com).
유세포분석: 세포들을 1.25 μmol/L 5,6-카르복시-플루오르세인-숙시니미딜-에스테르(CFSE, Sigma) 를 이용해서 제조사의 권고방법에 따라 표지하였다. 그 후 네스틴과 베타-III-튜불린을 인식하는 항체를 붙였다. 그들의 세포내 검출을 위해서는, 세포를 0.5% 파라포름알데히드에 10분 동안 상온에서 일정하게 흔들면서 고정시킨 후, 항체를 0.2% Triton X-100과 FBS가 함유된 PBS로 적당하게 희석해서45분간 붙였다. 세포를 PBS로 두번 씻어준 후, 적당한 이차항체를 45분 동안 붙였고, FACS분석을 하기 전에 다시 씻겨주었다. 형광은 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA; http:www.bd.com)과 CellQuest 소프트웨어를 이용해 분석하였다.
면역형광염색과 현미경관찰: 세포가 붙어있는 유리 커버슬립을 2% 파라포름알데히드가 함유된 PBS에 15분동안 상온에서 고정시킨 후, 0.2% Triton X-100이 함유된 PBS로 30분동안 세포막에 구멍들을 뚫어 주었다(permeabilization). PBS로 씻겨준 후, 커버슬립에 일차항체를 1% FBS가 함유된 PBS로 적당하게 희석해서 4 ℃에서 밤새도록 붙였다. PBS로 씻겨준 후, 커버슬립에 적당히 희석된 이차항체를 상온에서 1시간 붙여준 후, 다시 씻겨주고, 300 nM 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)와 15분간 인큐베이션 시켰다. 세포를 다시 PBS로 씻겨주고, 물로 씻겨준후, FluorSave mounting medium (Calbiochem, San Diego, CA; USA; www.emdbiosciences.com)을 이용해 마운팅시켰다. imageXpress 자동화된 형광현미경과 MetaXpress 소프트웨어 (Molecular Devices, city, country)를 이용해 이미지를 얻었다.
배아 줄기세포의 신경분화: 배아 줄기세포를 PBS로 씻겨준 후, 5000 rad 의 방사선이 조사된 꽉찬 PA6 세포층 위에 낮은 밀도로 깔아주었다. 분화를 위한 배양액은 다음을 포함한다: GMEM, 15% 녹아웃 혈청 교체(knockout serum replacement), 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 1 mM 비필수 아미노산, 0.1 mM 베타-머캅토에탄올, 1% 페니실린/스트랩토마이신(Gibco, Invitrogen). 어떤 실험에서, 신경으로 분열되는 세포들은 0.5% 트립신/EDTA를 이용해 떼어내서 0.001% 폴리오르니틴이 코팅된 세포배양용 페트리접시에 5000 cells/cm2 밀도로 다시 깔았다.
배상체의 생성: CGR8 세포를 PBS로 한 번 씻겨준 후 5% 트립신/EDTA를 이용해 떼어냈다. 세포들을 LIF (leukemia inhibitory factor) 없는 배양액에 희석해서 세포배양용 플레이트의 뚜껑위에 500개의 세포를 함유한 20 ㎕의 방울을 만들어 올려놓았다. 이틀이 지난 후, 배상체를 형성한 세포들은 10 ml 극저부착성 플레이트에 모아놓고 다시 인큐베이터 안에서 3일간 두었다. 5일째 날에 배상체를 젤라틴이 코팅된 접시에 도말하였다. 7일째가 되면 첫번째 배상체가 박동하기 시작하였다. 이틀마다 배양액을 교환해 주었다.
렌티바이러스용 벡터와 배아 줄기세포 형질도입: 엔트리벡터(entry vector) 를 만들기 위해서 프로모터(eta-IIIp 및 Talpha-1)와 원하는 유전자(GFP 및 H2B-mRFP1)를 Gateway® BP clonase enzyme mix(Invitrogen)를 사용해 pDONRP4 P1R와 pDONR221벡터에 각각 클로닝하였다. 얻어진 엔트리벡터는 2K7bsd 또는 2K7neo 렌티벡터에 Gateway® LR plus clonase enzyme mix (Invitrogen)를 이용해 클로닝하였다. 렌티벡터를 293T세포에 칼슘 포스페이트를 이용해 한시적인 트랜스펙션을 시켜 렌티바이러스 파티클을 만들었다. 72시간 후 렌티바이러스가 포함된 상청액을 모아서 0.45-μm 구멍 크기 폴리에테르술폰 맴브레인(polyethersulfone membran)으로 필터를 하고 초원심분리(50,000 x g, for 90분, 4℃)를 시켜 120배로 농축시켰다. 펠렛을 다시 배아 줄기세포 배양액에 풀어준 후 타겟 세포에 첨가해 주었다. 형질도입한 지 3일이 지난 후, 블라스티시딘(blasticidin)(7.5 ㎍/ml) 또는 네오마이신(400 ㎍/ml)을 배양액에 첨가해주고, 6일(blasticidin) 또는 10일(neomycin) 동안 진행해서 죽지 않는 세포들을 선발하였다.
마이크로어레이: 전체 RNA를 RNA mini Kit (Quiagen, city, country)를 이용해서 추출한 후, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)로 모세관 전기영동을 해서 RNA가 잘 추출되었는지 품질 테스트를 하였다. Illumina TotalPrep RNA Amplification kit (Ambion, city, country)를 이용해 500 ng의 RNA를 증폭시키고 표지시켰다. Agilent 2100로 모세관 전기영동을 해서 cRNA가 잘 생성되었는지 품질 테스트를 하였다. Human expression arrays (인간 유전자 발현 어레이) (Illumina, city, country)에다 만들어진 cRNA를 제조사의 권고 방법에 따라 혼성화시켰다(hybridization).
Illumina Beadstudio 3.1.3를 이용해 데이터를 표준화시키고 분석하였다. 각 샘플의 발현 프로파일은 GeneSpringGX 7.3.1 (Agilent Technologies)로 불러왔다. 발현값 외에도 Illumina BeadStudio 소프트웨어 프로그램으로 p-값을 계산하였다. 이를 기초로 해서 각 탐침을 다음의 탐지 플래그로 대입하였다 (P (존재: present): p < 0.045; M (근소: marginal): p값이 0.045와 0.050사이; 0.045, A (부재: absent): p>0.05). 다르게 발현되는 전사체를 동정하기 위해 t-검정 (Student’s t-test)과 아노바테스트(ANOVA), 및 추가 필터링 단계가 수행되었다. 기능적 온톨로지를 위한 강화 분석이 MetaCore 소프트웨어(www.genego.com)를 이용해 이루어졌다.
세포유전학과 분자생물학적 분석: 배아 줄기세포에 콜세미드(colcemid)(Invitrogen)를 50 ng/ml 농도로 4시간 처리하였다. 유사분열 단계에 멈춘 세포들은 0.075 M 의 KCl을 5분 동안 처리해 저삼투압을 받도록 하였고, Carnoy's fixative (methanol:acetic acid = 3: 1, v/v)를 3번 처리해서 고정시켰고, 세포를 포함하는 용액을 유리 슬라이드 위에 골고루 도말하였다. 이어서 염색체는 표준 실험 방법에 따라 G-밴드를 만들었다. 올리고뉴클레오티드 어레이-비교 유전체 접합(oligonucleotide array-comparative genomic hybridization : Array-CGH) 분석은 유전체 전체를 ~20kb 까지의 해상력으로 커버하는 Mouse Genome CGH Microarray Kit 244B (Agilent Technologies)을 이용하여 제조사의 권고방법에 따라 수행하였다. 데이터는 Agilent CGH analytics 3.4 소프트웨어로 통계학적 알고리듬, z값 (z-score) 과 ADAM-2, 을 사용하여 민감도역치를 각각 2.5 와 6.0으로 정해주고, 이동평균 창크기를 0.2 Mb로 해서 분석되었다. 매핑 데이터는 NCBI database Build 37 (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 이용해서 마우스 유전체 시퀀스에서 분석하였다.
실시예 2
배아 줄기세포 내 세포상의 다양성: 만능성 클론 계통들은 각기 다른 분화력을 보인다
초기 내세포괴(ICM)에서 유래한 배아 줄기세포(ESCs)는 이론적으로 균질한 만능성 세포이다. 이 연구는 이런 개념을, 하나의 부모 배아 줄기세포로부터 얻은 자손의 특성 구분을 가능하게 하는 실험 조건을 이용하여 테스트하도록 설계되었다. 유세포분석과 살아있는 세포 영상분석은, 신경분화가 유도된 어떤 개개의 배아 줄기세포는 우리가 원하는 표현형에서 빨리 벗어나는 자손을 발생시킨다는 것을 증명하였다. 그것은 지체된 분화 프로그램때문이 아니라 개개의 부모 배아 줄기세포의 뉴런을 생성시킬 수 있는 능력의 현저한 편차에 의한 것이므로, 배아 줄기세포간 클론의 다양성이 생길 것이라는 가설이 맞을 확률을 높인다. 이 가설을 더 입증하기 위해, 마우스 배아 줄기세포에 한계희석법(limit dilution method)을 적용해 클론 계통들을 만들었다. 이들 클론주 (clonal lines)의 전사체 분석 결과, 모든 클론이 만능성 표지 유전자들(Oct4, Nanog, Sox2, Klf4 등)을 유사한 수준으로 발현한다는 사실에도 불구하고, 유전자 발현 프로파일에 현저한 차이를 보였다. 다른 클론은 표현형적 분화 분석과 배상체에서 유전자 발현에 관하여서 조사했을 때 다른 분화력을 보였다. 이러한 결과의 광범위한 적용성을 증명하기 위해, 또 다른 배아 줄기세포주로부터 클론을 만들어 보았다. 이들 클론 계통들도 그들의 분화력에 현저한 개별성을 보였다. 종합해 볼 때 이러한 관찰들은, 만능성 배아 줄기세포가 다른 분화력을 가지는 개개의 세포 유형들로 구성된다는 것을 증명한다. 이러한 결과는 배아 줄기세포에 대한 생물학적 이해에 새로운 정보를 제공할 뿐 아니라, 미래에 생체내와 생체외부에서 쓰일 수 있는 도구로써 그들의 새로운 용도에 대한 가능성을 제시한다.
배아 줄기세포의 분화과정에서 신경세포로의 운명을 조기에 빠져나와 증식하는 세포들이 생겨난다.
배아 줄기세포의 분화과정에서, 대체적으로 세포들 중 일부는 분화에 의한 세포적 표현형을 획득하지 못한다. 이것은 비동시성(anisochronicity), 즉, 어떤 부분 집단은 성숙과정으로의 진행이 지체되는 것에 의한 것일 수 있음에도 불구하고, 분화 프로토콜에 고유한 저항성이 보이므로, 세포의 부분 집단은 우리가 원하는 분화에서 벗어났다고 생각될 수 있다. 이 질문을 해결하기 위해, 본 발명자들은 분화 표지들의 면역검출법과 세포분열 분석을 접목시킨 유세포분석법을 개발하였다.
마우스 CGR8 배아 줄기세포주를 방사선 조사를 받은 꽉찬 PA6 간질세포 층 위에(Shintani et al., 2008) 낮은 밀도로 깔아 5일간 배양해서 초기 분화를 유도했고, 필요할 때에 분리해서 폴리오르니틴이 코팅된 곳에 깔아서 더 나아간 신경분화를 진행시켰다. 비분화된 배아 줄기세포는 네스틴과 베타-III-튜불린을 발현하지 않고 있다(도 1a, 좌측패널). 분화유도 5일째에, 이들 두가지 표지유전자의 세포내 발현의 복합 패턴이 (네스틴을 발현하지 않으면서(-) 동시에 베타-III-튜불린을 발현하는(+) 신경세포, 네스틴을 발현하면서(+) 동시에 베타-III-튜불린을 발현하지 않는(-) 전구세포, 및 적은 수의 집단이지만 네스틴과 베타-III-튜불린을 둘 다 발현하는 과도기세포) 관찰된다. 참고로, 네스틴과 베타-III-튜불린을 둘 다 발현하지 않는 상당한 크기의 세포 집단이 관찰되었는데, 분화유도 5일째에 네스틴을 발현하거나 발현하지 않는 세포 모두에서 SSEA-1의 발현이 사라지기 때문에(도 1b) 만능성 상태로부터 벗어나는 시기가 지연된 세포집단은 아니다.
카르복시-플루오르세인-숙시니미딜-에스테르(CFSE) (Lyons, 2000) 형광 탐침을 이용해 세포분열의 동시성 역시 관찰하였다. CFSE는 세포 분열이 한 번 일어날 때 마다 딸세포에 50%로 희석되는 안정하고 독성이 없는 형광 염료이므로 유세포분석를 통해 세포분열이 몇 번 일어났는지 측정할 수 있다. 분열하지 않는 세포는 처음 수준의 CFSE 형광을 가지고 있으나, 분열하는 세포는 분열 횟수에 따라 형광을 잃게된다. 단상의(monophasic) CFSE 히스토그램에서 보이는 바와 같이, 대부분의 세포는 초기 신경분화 동안에 세포분열을 한다(도 1c, 좌측패널). 반대로, 다상의(multiphasic) CFSE 히스토그램은 후기 신경분화 동안에 세포의 부분 집단은 세포분열이 늦춰지거나 멈춘다는 것을 보인다(도 1c, 우측패널).
그런 다음에, 후기 신경분화 동안(폴리오르니틴 코팅된 곳에 도말한지 24시간, 48시간, 72시간이 지난 다음)의 세포 증식을 세포 분화의 표지와 함께 사용해서 분석하였다 (도 1d). 세포를 도말한 후 이틀이 지나서, 신경 부분 집단(네스틴-발현하지않고, 베타-III-튜불린-발현하는)의 증식속도는, 신경상피세포 네스틴-발현하고, 베타-III-튜불린-발현하지않는)와 신경이 아닌 세포(네스틴-발현하지않고, 베타-III-튜불린-발현하지않는)에 비교했을 때(상대적으로 CFSE 농도가 더 낮음), 느려졌다(상대적으로 CFSE 농도가 더 높음). 세포를 다시 깐 후 사흘이 지나서, 신경 집단은 확실하게 분열을 중단하였으나, 신경이 아닌 세포와 신경상피세포는 분열은 계속하였다. 참고로, 세 종류의 부분 집단내에서 다른 CFSE 농도에 대응하는 다양한 피크가 관찰되었는데, 이는 그들간에도 역시 이질성이 존재함을 나타낸다.
종합해 볼 때 이러한 관찰들은, 모든 배아 줄기세포가 분화 프로그램을 시작했으나 어떤 세포들은 매우 초기단계에서 신경 운명으로부터 빠져나왔고, 분열이 끝난 뉴런이 증식중인 신경 선조세포와 신경이 아닌 세포와 같이 존재하는 혼합된 배양을 초래하였다는 것을 보여준다. 이러한 탈출 반응은 신경 분화가 유도된 배아 줄기세포간에 이질성이 존재하는 이유를 설명할 수 있다.
신경 분화가 유도된 개개의 배아 줄기세포는 제한된 자손을 생성한다.
그런 다음, 배아 줄기세포간의 이질성에 대한 가설을 조사하였다. 실험 조건은, 전적으로 하나의 배아 줄기세포로부터 유래한 자손의 특성 구분을 가능하도록, 설계되었다. 배아 줄기세포를 매우 낮은 밀도로 PA6 간질세포 위에 까는 것으로 신경분화를 유도하였다. 이런 조건하에서는, 단일 배아 줄기세포가 분화를 진행하는 가운데 콜로니를 형성하므로 각 자손의 특질을 추적할 수 있다. 3일 후, 배아 줄기세포 유래 콜로니들은 콜로니들 간에 이질성을 가졌다. 어떤 콜로니들은 신경 표현형을 가졌으나(네스틴을 발현하고 βIII-튜불린도 발현하는) 다른 콜로니들은 신경이 아닌 세포의 표현형을 가졌다(네스틴과 βIII-튜불린 모두 발현하지않는)(도 2a). 이런 결과들은 하나의 단일 배아 줄기세포로부터 유래된 자손일지라도 특질에 상당한 편차가 있음을 알려준다. 정량화한 결과는 콜로니의 절반이 3일 후에 βIII-튜불린을 발현하고 있는 신경세포가 된 것을 보여준다(도 2b). 더 후반의 분화단계에서, 콜로니의 25%가 도파민성 뉴런의 표현형을 가지고(티로신 히드록실라아제를 발현하는 TH+), 10%는 성숙단계의 뉴런의 표현형을 가진다(NeuN을 발현하는 NeuN+)(도 2b). 콜로니간의 이질성은 두가지 다른 신경 전구세포 표지인 Pax-6와 Sox-1을 이용하여 확인되었다. 신경의 운명을 가지는 것의 콜로니간의 이질성은 초기 신경의 특이적인 Tα1(Suter et al., 2009) 프로모터의 조절을 받는 GFP를 발현하도록 유전자 조작된 배아 줄기세포주를 사용하여 확인되었다. 이전 관찰에 따라, ESC-Tα1-GFP(배아 줄기세포주에 Tα1프로모터의 조절을 받는 GFP 유전자 카세트를 넣어 만든 세포주)를 신경분화시켰을 경우 GFP를 발현하는 콜로니와 GFP를 발현하지 않는 콜로니들이 발생하였고(도 2c), 이는 신경세포와 신경세포가 아닌 자손이 같이 존재한다는 것을 확인시켜준다. 그러므로, 어떤 세포가 신경 운명을 빠져나올 능력은 그들 부모 세포의 특질에 연관되어있다.
다른 자손들간에 관찰된 다양성은 프로모터-리포터유전자-기반 방법을 사용해 더욱 자세하게 분석되었다. βIII-튜불린 프로모터(βIIIp)의 조절을 받는 GFP를 발현하도록 유전자 조작된 CGR8 배아 줄기세포주가 제작되었다. 이런 ESC-βIIIp-GFP 세포는 monomeric red fluoresecent protein(mRFP1)가 세포핵에 위치하도록 H2B 히스톤 단백질과 퓨전시킨 H2B-mRFP1 단백질을 발현하는 렌티바이러스와 함께 감염시켰다. 이를통해 ESC-βIIIp-GFP-H2B-mRFP1 세포는 핵이 빨간색 형광을 띄기 때문에 형광현미경상에 보이게 된다. βIII-튜불린 프로모터는 분화가 되지 않은 배아 줄기세포에서 항상 활발하게 낮은 수준으로 작동한다. 대조적으로, GFP의 발현은 nesin을 발현하지 않는 신경세포가 아닌 집단에서 감소하는데 반해(도 7a), βIII-튜불린을 발현하는 신경세포에서는 더 많이 발현한다(도 7b). ESC-βIIIp-GFP-H2B-mRFP1 세포는 신경분화를 유도하기 위해 PA6 간질세포 위에 깔았고, 다양한 개개의 배아 줄기세포는 automated high throughput imaging system (ImageXpress, Molecular Devices)을 사용하여 이틀동안 관찰되었다. 분화되지 않은 ESC-βIIIp-GFP-H2B-mRFP1 세포는 잡음 수준의 GFP만을 발현하고 있고 깔아 준 후 빠르게 분열함을 이미지화를 통해 확인하였다. 어떤 콜로니에서는, 배아 줄기세포 유래 자손에서 GFP를 발현하는 것이 유지되거나 증가되었다(도 2d, colony 1). 또 다른 콜로니에서는, GFP의 발현이 모든세포에서 빠르게 사라졌고 (도 2d, colony 2), 이를통해 어떤 개개의 배아 줄기세포는 신경세포가 아닌 자손을 생성함을 확인할 수 있다. 마지막으로, 단지 세포들의 일부분만이 GFP 발현이 꺼지는 콜로니들도 발견되었고(도 2e), 이를통해 하나의 배아 줄기세포로부터 유래된 자손이라 할지라도 신경세포와 신경이 아닌 세포의 혼합이 형성될 수 있음을 알 수 있다.
살아있는 세포 영상을 찍어 GFP를 발현하는 세포를 포함하는 계통도를 만들었다. 그 어떤 분석된 계통도도 동일하지 않았는데 이는 개개의 배아 줄기세포로부터 유래된 자손들이 각자 유일함을 확인시켜준다. 예를 들어, 부분적으로(도 8A, B, D) 또는 완전히 (도 8C) GFP 발현이 없어지는 자손이 관찰되었다. 다른 콜로니에서는, 이틀 후 대부분의 세포들에서 프로모터가 활발히 작동하는채 남아있다(도 8D). 흥미롭게도 GFP 발현이 사라지는 세포들은, 첫번째 분열시 생성되는 두개의 딸세포 중 하나에서만 빈번하게 유래된다. 반면에 계속 GFP발현을 유지하는 세포들은 위와 다른 딸세포로부터 유래되는데, 이는 첫번째 분열이 각기 다른 자손을 생성하는 두개의 다른 딸세포를 생산함을 말해준다.
종합해볼 때 이러한 관찰들은, 개개의 배아 줄기세포는 제한된 자손을 생성하고, 이들 자손들은 신경세포 자손이 될 수 있는 잠재력을 동일하게 공유하지 않는다는 점을 확인해준다.
초기 만능성 내세포괴에 해당하는 배아 줄기세포들 간 클론의 다양성.
동시에 배양한 개개의 배아 줄기세포들이 신경세포가 될 수 있는 잠재력을 동일하게 공유하지 않는다는 결과는, 개개의 세포들 간의 이질성 또는 배아 줄기세포 신경분화를 유발하는 결정의 확률로 설명될 수 있다. 단일 세포 수준에서 배아 줄기세포들간의 개별성 가정을 연구하였다. 배아 줄기세포로부터 한계희석법으로 7개 클론 계통을 얻었다. 각 클론 계통의 만능성 표현형이 먼저 조사되었다. 시험된 계통의 대부분이 rex-1, 알칼라인 포스파타아제, Oct-4, Nanog, Klf-4, Sox-2, Klf-2, Pecam-1 및 Pramel-4을 포함하는 초기(early) ICM의 만능성 세포의 표지를 발현하고 있었다(도 3a). Stella의 발현이 대부분의 클론에서 발견되었으나 다양한 발현 수준을 보이고 있다는 점은 주목할 만하다. 하나의 클론 계통(clone 5)은 초기의 내배엽 표지를 발현하고 있어서 이 연구에서 제외되었다.
그 다음, 배아 줄기세포 클론 계통들의 염색체 구조 분석을 하였다. 다른 클론들의(clones 1 부터 7) 표준 핵형 분석(G-banding) 이 수행되었다. 두가지 배양시간 간격을두고(10번과 16번 계대배양 시킨 후) 염색체 수와 염색체 이상의 존재를 계산 및 판별하였다(표 2). 클론 7의 16번 계대배양 후의 경우를 제외하고, 대부분의 클론들이 세포 모자이키즘 (정상 염색체 개수보다 많은 수를 가짐) 을 보인다. 정상 염색체 개수인 2n=40이 되는 빈도값이 클론 3의 경우 10번 계대배양 후에는 36%였다가 16번 계대배양 후에는 60%에 달하였다(표 2). 이 분석은 염색체 이상의 존재 역시 밝혀주었다. 클론 1, 2, 6, 7은 모든 계대배양 상태에서 미확인된 파생 염색체(der)의 존재에 의한 동일한 구조의 재배열을 보였다. 이런 재배열된 염색체는 고배수성의 41,XY 이 우세한 집단 세포에 존재한다(도 9). 분자 핵형분석 (array-CGH)을 이용한 클론의 고분해능 염색체 분석 역시 수행되었다. 이 분석은 분석된 모든 클론에서 공통 조각 결실과 1 Mb보다 짧은 중복이 존재함을 밝혀주었다(표 3). 1번, 2번 클론에서 X 염색체의 중복이 존재하고 다른 클론에서는 존재하지 않는다는 것이 주목할 만하다. 유기된 클론 5는 5qE1 지역의 결손으로 대표되는 다른 염색체 프로파일을 보였다. 종합해볼 때 이러한 관찰들은, 클론 5를 제외한 클론들의 염색체 구조는 비슷하고 특별한 비정상점이 보이지 않는다는 것을 암시한다.
G-banding을 이용한 배아 줄기세포의 표준 핵형분석
클론_계대배양 분석된 중기(metaphase)의 수 핵형(karyotpe) 결과 *
클론 1_10 15 2 41,XY,+der(?)[2]/40,XY,der(?)[13]
클론 1_16 15 3 41,XY,+der(?)[8]/40,XY,der(?)[7]
클론 2_10 14 2 41,XY,+der(?)[10]/40,XY,der(?)[4]
클론 2_16 16 2 41,XY,+der(?)[3]/40,XY,der(?)[13]
클론 3_10 11 2 42,XY[7]/40,XY[4]
클론 3_16 15 1 42,XY[2]/41,XY[3]/40,XY[9]
클론 4_10 10 2 42,XY[4]/41,XY[1]/40,XY[2]
클론 4_16 12 4 42,XY[5]/41,XY[4]/40,XY[2]
클론 6_10 10 1 42,XY,+der(?)[6]/41,XY,+der(?)[4]
클론 6_16 10 2 41,XY,+der(?)[[5]/40,XY,der(?)[[4]
클론 7_10 12 2 41,XY,+der(?)[2]/40,XY,der(?)[13]
클론 7_16 12 2 40,XY,der(?)[9]
클론들의 염색체 불균형. 염색체 복제수 변이(copy number variations: CNV)의 흥미를 끄는 지역을 그들의 매핑 위치와 함께 보고함(핵형분석에서 밝힌 세포유전학적 밴드와 올리고뉴클레오티드 시작-종료 위치 (genome.ucsc.edu, Genome Assembly March 2006)).
염색체 CNV 클론 1 클론 2 클론 3 클론 4 클론 6 클론 7
1 del1qD
(90,044,442-90,133,091)		 + + + + + +
1 dup1qF
(141,423,792-141,591,642)		 + + + + + +
2 del2qC3
(77,680,396-77,822,003)		 + + + + + +
4 del4qB3
(61,983,292-62,007,821)		 + + + + + +
4 dup4qD22
(121,473,470-121,858,924)		 + + + + + +
7 del7qA3(homozygote)
(25,713,227-25,896,924)		 + + + + + +
7 del7qB3
(37,887,916-37,909,541)		 + + + + + +
7 del7qC
(67,514,394-68,264,472)		 + + + + + +
8 trisomy(mosaicism) + + + + + +
9 dup9qA53
(46,630,511-46,901,471)		 + + + + + +
11 trisomy(mosiacism) + + + + + +
11 del11qB4(heterozygote)
70,987,724-71,109,737		 + + + + + +
14 dup14qA1
(3,892,581-3,983,962)		 + + + + + +
17 dup17qA1
(6,180,566-6,408,926)		 + + + + + +
18 dup18qA1
(9,813,671-10,016,566)		 + + + + + +
X dupXqF4-qF5
(152,230,281-158,698,463)		 + + - - - -
분명한 유전체학적 비정상점 없는 클론 계통 (예를 들어, 클론 1, 2, 3, 4, 6, 7)을 마이크로어레이로 전체 mRNA 발현을 분석하였다. 클론 계통들 간에 6800개의 유전자 발현이 현저하게 달랐다(ANOVA 통계 테스트를 이용해 분산 분석). 각 배아 줄기세포 클론들에 따른 이들 6800개 유전자들의 발현 프로파일을 수학적으로 분석해 계층 클러스터를 만들었다(도 3b). 가장 다른 배아 줄기세포 클론은 클론 1번과 2번이다. 반면, 클론 4번과 6번처럼 클론 2번과 3번이 가장 유사하였다. 도 10은 클론 1번과 2번 사이에 다르게 발현하는 유전자군을 요약한다(공용 데이터베이스 GO 프로세스로부터(Metacore software); www.genego.com). 두 클론들 간에 다르게 발현하는 유전자 중 대략 절반이 신경 생성을 포함하는 발생 프로세스로 분류된다. 모든 클론 계통들간의 가장 중요한 변화의 특질 역시 분석되었다. 표 4에서는, 다른 클론들간 정량적으로 가장 중요한 차이를 보이는 30개의 유전자의 일람표를 만들었다. 일람표는 다양한 유전자 그룹을 포함한다: i) 세가지 guanylate binding proteins (Gbp 1,2,3); ii) 세가지 케라틴 (Krt 8. 18, 19); iii) 두가지 carbonic anhydrases (Car2, 4). 다양한 전사인자들과 마찬가지로 insulin-like growth factor 2(Igf2)와 insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3) 유전자 역시 주목된다.
클론 1, 2, 3, 4, 6, 7의 mRNA 발현간에 가장 중요한 변화를 보이는 유전자들.
Gbp1 guanylate binding protein 1 (Gbp1), mRNA.
Acta1 actin, alpha 1, skeletal muscle (Acta1), mRNA.
Gbp2 guanylate binding protein 2 (Gbp2), mRNA.
Tacstd2 tumor-associated calcium signal transducer 2 (Tacstd2), mRNA.
Krt8 keratin 8 (Krt8), mRNA.
Igfbp3 insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3), mRNA.
Krt19 keratin 19 (Krt19), mRNA.
Oasl2 2'-5' oligoadenylate synthetase-like 2 (Oasl2), mRNA.
Krt18 keratin 18 (Krt18), mRNA.
Sfn stratifin (Sfn), mRNA.
Gbp3 guanylate binding protein 3 (Gbp3), mRNA.
Car2 carbonic anhydrase 2 (Car2), mRNA.
Anxa3 annexin A3 (Anxa3), mRNA.
Arl4c ADP-ribosylation factor-like 4C (Arl4c), mRNA.
Nnat neuronatin (Nnat), transcript variant 1, mRNA.
Gbp3 guanylate nucleotide binding protein 3 (Gbp3), mRNA.
Slc40a1 solute carrier family 40 (iron-regulated transporter), member 1 (Slc40a1), mRNA.
Klk1 kallikrein 1 (Klk1), mRNA.
Pitx2 paired-like homeodomain transcription factor 2 (Pitx2), transcript variant 2, mRNA.
Flnc filamin C, gamma (Flnc), mRNA.
Bhlhb2 basic helix-loop-helix domain containing, class B2 (Bhlhb2), mRNA.
Ampd3 adenosine monophosphate deaminase 3 (Ampd3), mRNA.
Dok2 docking protein 2 (Dok2), mRNA.
Bmp1 bone morphogenetic protein 1 (Bmp1), mRNA.
Ddit3 DNA-damage inducible transcript 3 (Ddit3), mRNA.
Efna5 ephrin A5 (Efna5), transcript variant 2, mRNA.
Ddit3 DNA-damage inducible transcript 3 (Ddit3), mRNA.
Car4 carbonic anhydrase 4 (Car4), mRNA.
Igf2 insulin-like growth factor 2 (Igf2), mRNA.
Sp5 trans-acting transcription factor 5 (Sp5), mRNA.
표 4에서, 클론들간의 모든 전사체의 발현 수준을 비교하였다. 표준편차에 해당하는 값은 클론들간 전사체 발현 평균으로 표준화되었다. 모든 전사체들은 표준편차와 발현수준의 비율에 따라 분류되었다. 가장 높은 비율을 보이는 30개 유전자의 리스트를 표로 제공한다.
본 발명자들은 이들 mRNA 발현수준의 차이점이 다른 클론들에게 특정 분화경로로 가는 경향을 주지 않을까 하는 가설을 세웠다. 다양성을 기능적 수준으로 조사하기위해, 배아 줄기세포 클론을 PA6 간질세포와 같이 배양해 신경분화를 유도하였다. 모든 클론 계통이 신경세포와 신경세포가 아닌 콜로니를 유도하였다. 그러나, 신경세포와 신경세포가 아닌 콜로니의 비율은 클론들간에 서로 달랐다. 클론 2와 6은 클론 7에 비해 현저하게 높은 신경상피세포(네스틴을 발현하고 있는)를 포함하는 콜로니의 백분율을 보였다(도 4a). 클론 2와 6의 증가된 능력을 신경의 βIII-튜불린 염색으로 확인하였다(도 4b).
일주일의 분화가 지나고 이들 결과에 따라, 클론 7은 TH 도파민성 뉴런을 포함하는 콜로니를 만드는 능력을 낮게 보였다(도 4c). 클론 1이 다른 클론에 비해 TH를 발현하고 있는 콜로니를 더 많은 수로 유도한다는 점은 주목할 만 하다. 클론들은 심근형성 잠재력 역시 달랐다. 클론 2와 3은 클론 4와 비교할 때 현저하게 높은 효율로 박동하는 심근세포를 생산하였다. 반면, 클론 1은 효율적으로 심근세포를 만들어내지 못하였다(도 4d).
적당한 조건 하에서 모든 클론 계통들은 부유성의 배상체를 만드는 능력을 가졌다. 그 다음, 2주가 흐른 후 배상체에서 세포 유형 별 다른 배엽과 연관된 유전자 발현량을 정량하였다. 분석된 유전자들 모두 발현량이 클론들간에 서로 달랐다(도 5a ~ 도 5h). 외배엽의 Zic1(도 5a)과 신경외배엽의 nkx2.2(도 5b) 유전자의 이질적 발현이 관찰되었고, 이는 배아 줄기세포 클론들이 신경이 될 수 있는 능력의 다양성을 가진다는 것을 암시한다. 이질성은 내배엽의 Foxa2(도 5c) 유전자에서 역시 관찰되었다. 클론 2와 3은 높은 수준의 심장 표지 Myh7(도 5d) 유전자 발현을 유도했음에 비하여, 클론 7은 간세포의 α-foeto 단백질을 더 생성하였다(도 5e). 중배엽의 Tal1(도 5G) 유전자 발현, 근육세포의 actinin1(도 5h) 유전자 발현과 마찬가지로, 클론들의 췌장 인슐린을 만드는 능력에서도 역시 다양성이 관찰되었다(도 5f).
종합해볼 때 이러한 데이터는 클론 계통들이 같은 분화력을 공유하지 않는다는 것을 보여주고, 같이 배양한 개개의 만능성 배아 줄기세포가 기능적으로 이질적임을 입증한다.
클론 이질성의 개념은 또 다른 배아 줄기세포주(D3)에서도 테스트하였다. D3로부터 한계희석법으로 클론 계통들을 생성하였고, 각 클론의 유전체와 전체 유전자 발현 프로파일을 분석하였다. CGR8 세포주에서 관찰된 것 처럼, 클론 계통들 간에 중대한 염색체 이상은 발견되지 않았다. 유전자 발현 어레이 수행 결과, 초기 내세포괴에 해당하는 모든 만능성 표지들이 클론들에서 관찰되었다(도 6a).
D3 클론 계통들은 βIII-튜불린을 발현하는 뉴런(도 6b), NeuN을 발현하는 성숙단계의 뉴런 (도 6C), 그리고TH를 발현하는 도파민성 뉴런(도 6D)들을 포함하는 콜로니를 생성하는 능력에서 현저하게 차이가 났는데, 이는 배아 줄기세포의 세포적인 개별성을 입증한다.
참고문헌
하기 참고문헌은, 예시적인 과정 또는 기타 상세한 보충자료를 제공하는 범위 내에서 본 명세서를 설명할 수 있으며, 특별히 참조로써 본 명세서에 삽입된다.
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미국 특허 제4,275,149호
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Claims (60)

  1. a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로(essentially) 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포 집단을 수득하는 단계;
    b) 상기 집단의 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식시키는 단계; 및
    c) 신경세포, 간세포 또는 심근세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 것으로 결정된 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계를 포함하는 세포의 클론 집단 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 선택된 세포 클론 집단은 심장으로 분화할 수 있는 능력을 나타내는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포 클론 집단은 적어도 약 65%의 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 나타내는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포 클론 집단은 적어도 약 75%의 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 나타내는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포 클론 집단은 적어도 약 90%의 심근세포로 분화할 수 있는 능력을 나타내는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 만능성 세포는 인간 배아줄기 세포인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 선택된 세포 클론 집단은 신경성 분화(neurogenic differentiation)를 나타내는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포 클론 집단은 적어도 약 65%의 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 나타내는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 세포 클론 집단은 적어도 약 75%의 신경세포로 분화할 수 있는 능력을 나타내는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 신경세포는 도파민성 뉴런인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 만능성 세포는 인간 배아줄기 세포인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 인간 배아줄기 세포는 H1, H9, hES2, hES3, hES4, hES5, hES6, BG01, BG02, BG03, HSF1, HSF6, H1, H7, H9, H13B, 및 H14로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 만능성 세포는 유도된 만능성세포(iPSC)인 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유도된 만능성세포는 iPS 6.1, iPS 6.6, iPS, iPS 5.6, iPS 5.12, iPS 5.2.15, iPS 5.2.24, iPS 5.2.20, iPS 6.2.1, 및 iPS 5/3-4.3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 선택된 세포 클론 집단을 증식시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 신경세포, 간세포 또는 심근세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 가진 세포인지 여부를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 선택된 클론 세포 집단을 제공하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 세포 클론 집단을 저장 또는 운반용으로 제조하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 세포 클론 집단을 저장 또는 운반용으로 제조하는 것은 상기 세포를 동결시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 증식된 세포를 시험 화합물에 노출시키는 단계 및 상기 증식된 세포 내에서 독성과 관련된 세포 파라미터(parameter)를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 클론 집단은 분화제(differentiation agent)에 노출시킴으로서 적어도 약 50%의 심근세포를 포함하는 세포 집단으로 분화될 수 있는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 세포 클론 집단은 인간 세포인 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 만능성 또는 다능성 세포는 상기 개별화 과정 이전에 적어도 1회 계대배양(passage)된 것인 방법.
  24. 제1항의 방법에 의해 제조된 클론-유래(clonally-derived) 다수의 심근세포.
  25. 제24항에 있어서, 상기 심근세포는 조직 내에 포함된 것인 심근세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조직은 적절한 저장 수단 내에 포함된 것인 심근세포.
  27. 제26항에 있어서, 상기 클론-유래 심근세포 조직은 저장 수단 내에 포함된 것인 심근세포.
  28. 제1항의 방법에 의해 제조된 클론-유래(clonally-derived) 다수의 심근세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  29. a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로(essentially) 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포 집단을 수득하는 단계;
    b) 상기 만능성 또는 다능성 세포 집단으로부터 다수의 세포를 증식시키고 개별화하는 단계;
    c) 상기 개별화된 세포로부터 증식된 세포가 신경 세포 타입으로의 분화될 수 있는지 여부를 시험하는 단계; 및
    d) 상기 세포를 분화제에 노출시킴으로써 적어도 약 50% 신경 세포로 분화될 수 있는 증식된 세포를 선택하는 단계를 포함하는 향상된 신경 세포 분화능을 나타내는 세포 클론 집단을 제조하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 증식된 세포는 75%의 도파민성 뉴런으로 분화될 수 있는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 만능성 또는 다능성 세포는 만능성 세포인 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 만능성 세포는 인간 배아줄기세포인 것인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포는 H1, H9, hES2, hES3, hES4, hES5, hES6, BG01, BG02, BG03, HSF1, HSF6, H1, H7, H9, H13B, 및 H14로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 만능성 세포는 유도된 만능성 세포(iPSC)인 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 유도된 만능성 세포는 iPS 6.1, iPS 6.6, iPS, iPS 5.6, iPS 5.12, iPS 5.2.15, iPS 5.2.24, iPS 5.2.20, iPS 6.2.1, 및 iPS 5/3-4.3로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 방법은 상기 신경 세포를 시험 화합물에 노출시키는 단계 및 상기 신경 세포 내에서 독성과 관련된 세포 파라미터(parameter)를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  37. 제1항의 방법에 의해 제조된 클론-유래(clonally-derived) 다수의 신경 세포.
  38. 제37항에 있어서, 상기 신경 세포는 조직 내에 포함된 것인 신경 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조직은 적절한 저장 수단에 포함된 것인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 다수의 클론-유래 신경 조직은 저장 수단에 포함된 것인 방법.
  41. 제1항의 방법에 의해 제조된 클론-유래(clonally-derived) 다수의 신경 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  42. a) 다수의 심근세포, 간세포 또는 신경 세포 및 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및,
    b) 상기 시험 화합물과 접촉 결과 상기 세포의 표현형 또는 활성의 변화를 결정하는 단계로서, 상기 세포는 제1항의 방법에 의해 제조된 세포인 것인 단계를 포함하는 시험 화합물을 스크리닝하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 표현형 또는 활성은 독성의 측정인 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 다수의 심근세포 또는 신경 세포 내에서 하나 이상의 유전자의 발현을 측정하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 유전자는 activated caspase 3, NF-kB, TNF-alpha, heat-inducible factors (HIF-1 alpha), heat shock proteins (Hsp), transaminase, gamma-glutamyl transferase, 및 alkaline phosphatase로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 유전자 발현은 고효율 유전자 시퀀싱(high throughput gene sequencing), 웨스턴 블롯(Western blot), 유전자 발현 어레이(Gene expression arrays), 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광법(immunofluorescence), 프로모터/리포터 유전자 기반 어세이(promoter/reporter gene based assays), 또는 비색분석법(colorimetric assays)을 사용하여 측정하는 것인 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 표현형 또는 활성의 변화를 결정하는 단계는 심근세포의 수축, 세포 사멸, 활동 전위 및 이온 투과성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 파라미터를 측정하는 것인 방법.
  48. 제42항에 있어서, 상기 만능성 또는 다능성 세포는 인간 세포인 것인 방법.
  49. a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로(essentially) 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포 집단을 수득하는 단계;
    b) 상기 집단의 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식시키는 단계; 및
    c) 심근세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 것으로 결정된 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계; 및
    d) 상기 증식된 세포가 상기 c) 단계에서 관찰된 바와 같이 심근세포로 분화되는 능력에 기초하여, 상기 선택된 세포를 세포 및 조직 공학, 약물 스크리닝 또는 세포 치료에 사용하는 단계를 포함하는 심근세포 분화능을 나타내는 세포 클론 집단을 제조하는 방법.
  50. 실질적으로 상동성이 있는 신경 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 치료 방법으로서, 상기 신경 세포는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 방법:
    a) 체외(in vitro)에서 증식되며, 분화되지 않거나 본질적으로(essentially) 분화되지 않은 상태로 유지된 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent) 세포 집단을 수득하는 단계;
    b) 상기 집단의 개별화된 세포를 세포 클론 집단으로 증식시키는 단계; 및
    c) 신경 세포에 대해 적어도 약 50% 상동성이 있는 집단으로 분화될 수 있는 능력을 갖는 것으로 결정된 하나 이상의 클론 집단을 선택하는 단계; 및
    d) 상기 하나 이상의 선택된 세포 집단의 세포, 또는 그의 자손을 제공하는 단계.
  51. 제50항에 있어서, 상기 신경 세포는 도파민성 뉴런인 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 상기 질병은 파킨슨병인 것인 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 도파민성 뉴런 집단은 적어도 외측밀집흑질(substantia nigra pars compacta)의 일부를 포함하는 지역에 투여하는 것인 방법.
  54. 제50항에 있어서, 상기 약 100,000 내지 약 10,000,000개의 세포를 투여하는 것인 방법.
  55. 제50항에 있어서, 상기 개체는 인간인 것인 방법.
  56. 제1항의 방법에 의해 제조된 다수의 클론-유래 심근세포를 심장 질환이 치료되어야 할 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심장 질환을 치료하는 방법
  57. 제56항에 있어서, 상기 개체는 허혈성 심질환을 갖는 개체로 확인된 것인 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 심근세포를 정맥투여, 동맥투여, 심근투여에 의해 투여하는 것인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 심장 질환의 치료를 위하여 하나 이상의 보조적인 치료 방법를 수행하는 것을 더 포함하는 것인 방법
  60. 제56항에 있어서, 상기 개체의 심장의 심장 기능이 향상되는 것인 방법.
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