CN102741397A - 选择具有确定分化能力的干细胞克隆 - Google Patents

Abstract

公开了生成细胞克隆群的方法，所述方法包括a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态；b)将所述克隆群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和c)选择一个或多个细胞克隆群，所选细胞克隆群确定能分化成对任一神经细胞类型、肝细胞、或心肌细胞至少约50%同质的群体。还公开了由本发明方法生成的细胞克隆群，和治疗对象中疾病的方法，所述方法包括将本发明的克隆细胞给予对象。还列出筛选测试化合物的方法，所述方法包括将测试化合物接触本发明方法生成的细胞克隆群。

Description

选择具有确定分化能力的干细胞克隆

发明背景

本申请要求2009年12月2日提交的美国专利申请第61/266,072号的优先权，其全文通过引用具体纳入本文而无放弃声明。

1.技术领域

本发明一般涉及干细胞选择、干细胞分化和细胞治疗的领域。更具体地，本发明涉及选择具有确定分化能力的非遗传修饰克隆多能干细胞系的方法，和由本发明方法所生成干细胞克隆的应用。

2.相关领域描述

包括胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞在内的多能干细胞为研究早期发育、疾病建模和毒理学以及细胞治疗应用带来极大希望。成体和胚胎神经干细胞也如此。由于这种细胞可在培养中增殖并维持其分化成不同细胞类型的潜能，它们可提供几乎不受限制的细胞供给用于治疗各种疾病。

一个活跃的研究领域是用细胞疗法治疗神经系统疾病和心血管病。治疗神经系统退行性疾病的一种方法是将中枢神经系统的细胞如多巴胺能神经元移植到神经系统的受影响区域。

用于细胞治疗的潜在细胞源通过体外分化ES细胞、诱导多能干(iPS)细胞和其它类型干细胞来制备。就人、恒河猴和狨猴ES细胞描述了制备灵长类ES细胞培养物的方法(美国专利号5,843,780;6,200,806;7,029,913)。

不幸的是，尽管易通过培养获得衍生自多能干细胞的不同细胞类型异质混合物，但其靶向分化成特定谱系仍是难题。一般，培养中的ES细胞分化产生细胞的异质混合物，其中仅一些可能是适于细胞治疗的分化细胞，如神经细胞。

更受控的分化过程会有力地帮助改善来自干细胞的神经细胞和组织工程改造。因此，需要从干细胞制备分化细胞用于细胞治疗的改良方法。

发明内容

本发明部分基于对提供具有特定或具体分化潜能的多能干细胞克隆群的方法的鉴定。本发明的方法具有提供分化细胞的富集群体的益处，所述细胞能应用于采用ESC的细胞治疗或生物技术。另外，在治疗性应用中采用纯化或高度纯化的分化细胞可减少对象中不良作用的风险，如将细胞移植入脑后畸胎瘤或神经上皮瘤的风险。此外，本发明的方法可提供未遗传修饰的细胞克隆群。

本发明包括生成或产生细胞克隆群的方法，所述方法包括a)获得多能(pluripotent)或多潜能(multipotent)细胞群，所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态；b)将所述群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞克隆群经确定能分化成对至少约50%均一的任一神经细胞类型、肝细胞、肌肉细胞或心肌细胞群体。在某些实施方式中，所述方法还可包括提供一个或多个选定细胞群的细胞或其后代。如以下实施例所示，某些克隆多能干细胞系中的肝细胞典型标记物在向拟胚体分化期间增加约100倍。

“细胞克隆群”在本文中定义为指源自单个共同祖先细胞的细胞组。

术语“多能干细胞”指能使细胞产生所有3个胚层即内胚层、中胚层和外胚层的细胞。尽管在理论上多能细胞可分化成任何机体细胞，实验测定多能性通常是基于多能细胞分化成各胚层中的数种细胞类型。在本发明的一些实施方式中，多能干细胞是从囊胚的内细胞团衍生的胚胎干(ES)细胞。在其它实施方式中，所述多能干细胞是通过分化细胞重编程衍生的诱导多能干细胞。在某些实施方式中，所述多能干细胞是通过体细胞核移植衍生的胚胎干细胞。所述多能干细胞可以是人胚胎干细胞。人胚胎干细胞的非限制性示例包括H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BG01、BG02、BG03、HSF1、HSF6、H1、H7、H9、H13B和H14。多能细胞可以是如下更详细讨论的诱导多能细胞(iPSC)。iPSC的非限制性示例包括iPS6.1、iPS 6.6、iPS、iPS 5.6、iPS 5.12、iPS 5.2.15、iPS 5.2.24、iPS 5.2.20、iPS 6.2.1和iPS 5/3-4.3。所述方法还包括扩增所选细胞克隆群。所述方法还包括确定细胞是否能分化成对任一神经细胞、肝细胞或心肌细胞至少约50%同质的群体。所述方法还包括提供所选细胞克隆群。所述方法还包括制备用于储存或运输的选定细胞克隆群。所述制备用于储存或运输的细胞可包括冷冻细胞。

术语“多潜能干细胞”指能分化成有限数量组织类型的干细胞。多潜能干细胞的非限制性示例包括神经干细胞和造血干细胞。“神经干细胞”是来自神经组织的未分化细胞，能产生更多的神经干细胞(即显示自我更新)和最终将分化成神经细胞的后代细胞。神经干细胞可以是成体或胚胎神经干细胞。

本文所用的术语“心肌细胞”指(a)显示已知存在于成熟或未成熟心肌细胞中的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟或未成熟心肌细胞中的一种或多种标记物或其它蛋白的细胞。因此，本文所用的术语“心肌细胞”指成熟或未成熟心肌细胞。形态特征的非限制性示例包括形成跳动肌肉细胞，表达心特异性肌节蛋白，表达离子通道。标记物的非限制性示例包括心肌肌钙蛋白I(cTnI)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌节肌球蛋白重链(MHC)、GATA-4、Nkx2.5、N-钙粘蛋白、β1-肾上腺受体(β1-AR)、ANF、MEF-2转录因子家族、肌酸激酶MB(CK-MB)、肌红蛋白和心钠素(Li等,2006)。

本文所用的“神经细胞”指显示(a)显示已知存在于成熟神经元、未成熟神经元、成熟胶质细胞、未成熟胶质细胞或神经祖细胞的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟神经元、未成熟神经元、成熟胶质细胞、未成熟胶质细胞或神经祖细胞的一种或多种标记物、神经递质或其它蛋白的细胞。形态特征的非限制性示例包括小细胞体、树突和轴突样多重突起。标记物、神经递质或其它蛋白的非限制性示例包括：a)神经元特征性的β3-微管蛋白、微管相关蛋白2(MAP-2)或神经丝；b)星状细胞中存在的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)；c)少突细胞特征性的2’,3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)、半乳糖脑苷脂(GaIC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)；d)未分化ES细胞特征性的Oct-4；e)神经前体和其它细胞特征性的Pax-6和巢蛋白；f)发育中的中枢神经系统特征性的Sox 1；g)存在于儿茶酚胺神经元中的酪氨酸羟化酶(TH)；h)存在于含γ-氨基丁酸的神经元中的谷氨酸脱羧酶同种型67(GAD67)；i)中间神经分化特征性的波形蛋白；和j)多巴胺分泌、放射性多巴胺摄取和多巴胺转运体表达，其是多巴胺能分化的特征。“胶质细胞”的非限制性示例包括星状细胞、少突细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞、施万(Schwann)细胞和卫星细胞。本文所用的“神经细胞”包括“神经元细胞”。本文所用的“神经元细胞”指成熟或未成熟神经元。例如，成熟或未成熟神经元可以是成熟或未成熟多巴胺能神经元。

本文所用的术语“肝细胞”指(a)显示已知存在于成熟或未成熟肝细胞中的一种或多种形态特征的细胞；或(b)表达已知存在于成熟或未成熟肝细胞中的一种或多种标记物或其它蛋白的细胞。因此，本文所用的术语“肝细胞”指成熟或未成熟肝细胞。形态特征的非限制性示例包括嗜酸性胞质，大量线粒体和嗜碱性点彩，具有分散染色质和显著核仁的圆核。还可通过鉴定包括甲胎蛋白、白蛋白在内的肝特异性蛋白表达来识别肝细胞。可用于区分肝细胞的其他方法包括电子显微镜、免疫细胞化学、免疫荧光、定量PCR、蛋白质印迹和原位杂交。

所选细胞克隆群可显示心原性分化潜能。所选细胞克隆群可显示肝细胞分化潜能。或者，所述细胞克隆群可显示神经原性分化潜能。表现出神经原性分化潜能的细胞克隆群可显示分化成任何特定神经细胞类型。非限制性示例包括神经元、少突细胞、星状细胞、小胶质细胞、卫星细胞和施万细胞。在具体实施方式中，所述神经细胞是多巴胺能神经元。

在一些实施方式中，所选细胞克隆群可显示能分化成至少55%神经细胞、至少60%神经细胞、至少65%神经细胞、至少70%神经细胞、至少75%神经细胞、至少80%神经细胞、至少85%神经细胞、至少90%神经细胞、至少95%神经细胞、或至少99%神经细胞，或其中任何可派生范围。在其它实施方式中，所选细胞克隆群可显示能分化成至少55%心肌细胞，至少60%心肌细胞、至少65%心肌细胞、至少70%心肌细胞、至少75%心肌细胞、至少80%心肌细胞、至少85%心肌细胞、至少90%心肌细胞、至少95%心肌细胞、或至少99%心肌细胞，或其中任何可派生范围。在其它实施方式中，所选细胞克隆群可显示能分化成至少55%肝细胞，至少60%肝细胞、至少65%肝细胞、至少70%肝细胞、至少75%肝细胞、至少80%肝细胞、至少85%肝细胞、至少90%肝细胞、至少95%肝细胞、或至少99%肝细胞，或其中任何可派生范围。

本文所示方法中考虑使用将群体的个体细胞扩增成细胞克隆群的任何方法。所述方法可包括分离群体的个体细胞。本发明的实施中可用各种免疫选择来分离细胞，包括但不限于流式细胞术(FACS)、免疫磁性技术、抗体柱、免疫沉淀和免疫抗体包被筛选(immunopanning)。下面说明书中讨论了其它示例。在特定实施方式中，分离在体外进行。细胞培养技术为本领域普通技术人员所熟知。这类技术的非限制性示例列于下面说明书。

在一些实施方式中，细胞克隆群接触一种或多种分化剂以诱导分化成神经细胞类型或心肌细胞。本文所用的术语“分化诱导”或“诱导分化”指由于对干细胞直接或有意的影响而引起干细胞发育成特定分化细胞类型。影响因素可包括细胞参数如离子流入、pH改变和/或胞外因子如分泌蛋白，例如但不限于调节和引发分化的生长因子和细胞因子。这可包括将细胞培养至汇合且可受细胞密度影响。在一些实施方式中，分化剂由细胞提供。这种试剂的非限制性示例列于下面说明书。

本领域普通技术人员已知的任何评价细胞分化方法可考虑应用于本发明方法。通过将未分化干细胞接触分化剂制备的分化细胞可以形态学、免疫化学和其他方式鉴定从而确认其状态为神经前体细胞、心肌细胞、肝细胞或其它细胞类型。关于形态分析，可根据一些表型标准鉴定细胞。所述标准包括但不限于显微镜观察形态特征、检测或定量表达的细胞标记物、酶活性、神经递质及其受体、和电生理功能。

还可根据细胞是否表达特定种类细胞的特征性表型标记物来评价细胞的分化。可用任何合适免疫学技术检测本领域已知的组织特异性标记物以评价分化，所述技术如用于细胞表面标记的流式免疫细胞化学和荧光激活细胞分选，用于胞内或细胞表面标记物的免疫组化(例如，固定细胞或组织切片)，用于细胞提取物或分泌到培养基中产物的细胞提取物蛋白质印迹分析和酶联免疫测定。可在固定细胞后通过标准免疫细胞化学或流式细胞测定观察抗体与抗原的结合，用经标记二抗或其它偶联物(如生物素-亲和素偶联物)来放大标记，或者用本领域熟知的其它免疫学方法。一般，检测免疫复合物形成为本领域熟知且可通过应用多种方法来完成。

在一些实施方式中，提供细胞克隆群的方法还包括将体外扩增的细胞接触测试化合物并测量所述扩增细胞内与毒性相关的细胞参数。在特定实施方式中，细胞体外接触测试化合物。

所述细胞克隆群可以是哺乳动物细胞。所述细胞来源的非限制性示例包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、绵羊、山羊、马、牛、灵长类动物或人。在特定实施方式中，所述细胞克隆群是人细胞。

在某些实施方式中，在个体细胞扩增成细胞克隆群之前，所述多潜能或多能细胞传代至少一次。

本发明还涉及制备或生成显示神经分化潜能提高的细胞克隆群的方法，包括步骤：a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；b)从多潜能或多能细胞群个体化并扩增多个细胞；c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞群确定为能分化成就神经细胞类型而言至少约50%同质的群体；和d)提供一种或多种选定细胞群的细胞或其后代。所述扩增细胞显示能分化成至少55%神经细胞、至少60%神经细胞、至少65%神经细胞、至少70%神经细胞、至少75%神经细胞、至少80%神经细胞、至少85%神经细胞、至少90%神经细胞、至少95%神经细胞、或至少99%神经细胞，或其中任何可派生范围。在特定实施方式中，所述神经细胞是多巴胺能细胞。所述多能或多潜能细胞可以是上述任何细胞。在一些实施方式中，所述方法还包括将神经细胞接触测试化合物并测量所述神经细胞内与毒性相关的细胞参数。提供细胞或其后代可包括用本领域普通技术人员已知的任何方法将细胞或其后代给予对象。

本发明的一些实施方式涉及由本发明方法生成的多种克隆衍生心肌细胞，或多种克隆衍生神经细胞。本发明方法生成的心肌细胞或神经细胞可包含在组织中或可不包含于其中。所述组织可在合适容器用具中。在特定实施方式中，所述神经细胞是多巴胺能细胞。所述神经细胞可包含在组织中。所述组织和/或细胞可包括在容器用具中。

本发明的其它实施方式涉及组合物和载体，所述组合物包括由本发明方法生成的多种克隆衍生神经细胞、肝细胞或心肌细胞。在一些实施方式中，所述组合物中的多种克隆衍生神经细胞、肝细胞或心肌细胞扩增自单一共同祖细胞。在其它实施方式中，所述细胞衍生自2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多共同祖细胞。所述组合物可以是配制用于给予哺乳动物对象的药物组合物。

在一些实施方式中，所述组合物中的多种克隆衍生神经细胞、肝细胞或心肌细胞还定义为分离的克隆衍生神经细胞或分离心肌细胞。所述组合物可包括或不包括其它非分离的克隆衍生神经细胞或分离的克隆衍生心肌细胞。所述组合物中的细胞数量可以是至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷、至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰、至少10¹¹、至少10¹²、至少10¹³、至少10¹⁴、至少10¹⁵、至少10¹⁶、至少10¹⁷、至少10¹⁸、至少10¹⁹、至少²⁰或更多细胞，或本文可得细胞数量的任何范围。

在一些实施方式中，所述组合物包括至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约98%、至少约99%或更多或本文可得百分数的任何范围的神经细胞、肝细胞或心肌细胞。在一些实施方式中，所述组合物包括约90%神经细胞。在其它实施方式中，所述组合物包括约90%心肌细胞。

所述组合物可包括本领域普通技术人员已知的任何药学上可接受载体。这类载体的非限制性示例在以下说明书中列出。在一些实施方式中，所述组合物包括一种或多种辅助治疗剂。辅助治疗剂的非限制性示例包括化疗剂。一些化疗剂示例在以下说明书中列出。

本发明还包括含合适容器用具的药盒，所述容器用具包含由本发明方法生成的多种克隆衍生细胞。所述细胞可以包括在组织中或可不包括于其中。其它可选药盒组成在以下说明书中列出。

本发明还涉及筛选测试化合物的方法，包括：a)将多种心肌细胞、肝细胞或神经细胞接触测试化合物；和b)测定由接触测试化合物引起的任何细胞表型或活性变化，其中所述细胞通过本文所示方法生成。在一些实施方式中，表型或活性是毒性的量度。可根据本领域普通技术人员已知的任何方法测定细胞表型或活性的任何变化。可应用的方法示例包括形态学分析、免疫化学分析和上述其它方法。在一些实施方式中，检测多种心肌细胞、肝细胞或神经细胞中的一种或多种基因表达。这类基因的非限制性示例包括胱天蛋白酶3、NF-kB、TNF-α、热诱导因子(HIF-1α)、热激蛋白(Hsp)、细胞完整性基因(例如转氨酶)、γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶和氧化应激基因。可用本领域普通技术人员熟知的任何方法或方法组合检测基因表达。这类方法的非限制性示例包括高通量基因测序、蛋白质印迹、基因表达阵列、流式细胞术、免疫荧光、基于启动子/报道基因的试验、或比色分析。可检测的其它参数示例包括心肌细胞收缩、细胞死亡、动作电位模式和离子渗透性。

本发明的其它实施方式涉及制备和生成显示心原性分化潜能的细胞克隆群的方法，包括步骤：a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；b)从多潜能或多能细胞群个体化多个细胞并扩增细胞克隆群；c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞群确定为能分化成就心肌细胞而言至少约50%同质的群体；和d)根据步骤(c)中观察到的扩增细胞分化成心肌细胞的能力，使用扩增细胞用于细胞和组织工程改造、药物筛选或细胞治疗。

发明的其它实施方式涉及提供显示肝细胞分化潜能的细胞克隆群的方法，包括步骤：a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；b)从多潜能或多能细胞群个体化多个细胞并扩增细胞克隆群；c)选择一个或多个细胞克隆群，所述细胞群确定为能分化成就肝细胞而言至少约50%同质的群体；和d)根据步骤(c)中观察到的扩增细胞分化成肝细胞的能力，使用扩增细胞用于细胞和组织工程改造、药物筛选或细胞治疗。

还考虑涉及通过本发明方法所生成细胞克隆群的治疗对象中疾病的方法。由本发明方法生成的细胞或其后代可用于移植、细胞治疗或基因治疗。本发明考虑使用由本发明方法生成的神经细胞、肝细胞或心肌细胞用于基于细胞的治疗。例如，所述细胞可用于再生因疾病或损伤而明显受损的成人中显著减弱的人组织。所述再生可体内或离体进行。例如，由本文所示方法生成的心肌细胞可用于再生对象中的心脏组织，其中所述对象的心脏组织由于心脏缺血而受损。可给予本发明的神经细胞以用于再生已受损或经历退化的神经系统细胞的目的。可给予本发明的肝细胞以用于再生受损或经历变性的神经系统细胞的目的。在一些实施方式中，本发明的细胞可直接给予对象。因此，本公开的方法可用于治疗多种疾病、损伤或者心脏或神经系统的其它有害病症。

在一些实施方式中，本发明的心肌细胞、肝细胞或神经细胞可用于通过三维重建来建模人体器官。例如，人脑中的组织可通过本文所述方法所生成神经细胞的三维培养来建模。心脏组织可由本发明方法生成的心肌细胞衍生和重建。在一些实施方式中，本公开的神经细胞和心肌细胞还可用作要在人体各个位点递送的多种治疗活性分子或基因的载体载剂，例如通过所需基因操作细胞和使其分化，将细胞或组织递送到供体的靶位置用于基因治疗。

在一些实施方式中，所述方法包括将基本同质的神经细胞群给予对象；其中神经细胞通过本文所述方法生成或是通过本文所述方法所生成神经细胞的后代。在特定实施方式中，所述神经细胞是多巴胺能细胞。在其它实施方式中，给予的细胞是由本发明方法生成的心肌细胞。所述对象可以是已知或怀疑患有涉及神经系统的疾病或涉及心血管系统的疾病的对象。

在一些实施方式中，所述疾病是神经退行性疾病。考虑治疗的神经退行性疾病的非限制性示例包括帕金森病，阿尔茨海默病，多发性硬化，中风，肌萎缩侧索硬化症(路格里克氏病)，额颞痴呆(皮克病)，朊病毒病，亨廷顿氏症，脑缺血，特发性帕金森病，局部或药物引起的帕金森综合征，不同起源的阿尔茨海默病和脑痴呆，亨廷顿氏舞蹈病，感染引起的神经退行性疾病如AIDS-脑病，克雅氏病，麻疹(rubiola)和疱疹病毒和螺旋体引起的脑病，代谢毒性神经退行性疾病如肝、酒精、缺氧、低血糖或高血糖所引起的脑病以及溶剂或药物引起的脑病，各种起源的视网膜退行性疾病，创伤引起的脑和骨髓损伤，脊髓损伤，不同起源如加入和/或停止药剂、毒素、病原和药物后的脑过度兴奋症状，精神和创伤引起的脑过度兴奋状态，周围神经系统的神经退行性综合征如代谢、药物、毒素和感染引起的多发性神经病变和多神经炎。在特定实施方式中，所述疾病是帕金森病。心血管病的非限制性示例包括心肌缺血、心肌症、充血性心力衰竭和心肌梗塞。

发明的另一方面是治疗或预防心脏疾病或病症的方法。心脏病通常与心脏功能下降相关且包括病症例如但不限于心肌梗塞、心脏肥大和心律失常。在发明的此方面，所述方法包括将本发明所述分离的分化心肌细胞和/或能在用本发明方法处理时分化成心肌细胞的细胞引入对象的心脏组织。分离的分化心肌细胞可以是本文所述方法生成的心肌细胞的后代。分离的心肌细胞优选移植到对象的受损心脏组织内。更优选地，所述方法使得对象的心脏功能恢复。在一些实施方式中，所述对象是患缺血性心脏病或充血性心力衰竭的对象。所述细胞可用本领域普通技术人员已知的任何方法给予。非限制性示例包括静脉内给药、动脉内给药和心肌内给药。所述方法可选包括进行或给予一种或多种二级治疗形式用于治疗心脏病。这种治疗的非限制性示例讨论于下。

本发明的另一方面提供修复心脏组织的方法，所述方法包括将本发明的分离心肌细胞或心脏祖细胞或由本文所述方法所生成心肌细胞的后代引入对象的受损心脏组织。

本发明的另一方面是治疗或预防肝脏疾病或病症的方法。考虑治疗的肝病的非限制性示例包括肝炎、非酒精性脂肪肝病、硬化、肝癌、威尔逊氏病、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、小胆管自身免疫疾病、布-加综合征、吉尔伯氏综合征和II型糖原贮积症。

所述细胞可用本领域普通技术人员已知的任何方法给予。非限制性示例包括直接注射，皮内、鞘内、心脏内、透皮、胃肠外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下注入脑或中枢神经系统、经皮、气管内、腹膜内、灌注或灌洗。在特定实施方式中，通过将多巴胺能神经元注射入包括至少部分黑质致密部的区域来治疗帕金森病。

给予已知或认为有益于治疗疾病的任何细胞数量。在一些实施方式中，每剂量给予约100,000-约10,000,000个细胞。可给予单剂量，或可给予多剂量。

特定实施方式中的对象是哺乳动物对象。哺乳动物对象的非限制性示例包括小鼠、大鼠、兔、狗、猫、山羊、绵羊、牛、马、灵长类动物和人。在一个特定实施方式中，所述对象是人。

特别考虑到，关于发明的一个实施方式讨论的任何限制可应用于发明的任何其它实施方式。此外，本发明的任何组合物可用于发明的任何方法，本发明的任何方法可用于生成或利用本发明的任何组合物。

尽管本公开支持的定义指仅择一以及“和/或”，但除非明确表明仅指择一或选项是互斥的，在权利要求中使用术语“或”用于指“和/或”。

本申请中，采用术语“约”表明值包括用于测定该值的装置和/或方法的标准偏差。

除非另有明确说明，本说明书所用的“一”或“一种”可指一个或多个。与单词“包括”联用时，本文权利要求书所用的单词“一”或“一种”可指一个或超过一个。本文所用的“另一(种)”可指至少第二(种)或更多。

任何本方法、细胞和药盒的任何实施方式可由所述特征和/或步骤组成或基本由其组成-而不是包含/包括/含有/具有。因此，在任何权利要求中，术语“由…组成”或“基本由…组成”可替代上面引用的任何开放式系动词，用于改变原本使用开放式系动词的给定权利要求的范围。

通过下列详细描述可以明了本发明的其它目标、特征和优点。然而应理解，尽管表明本发明的优选实施方式，详细描述和特定实施例仅以说明的方式给出，因为本领域技术人员通过此详细描述可清楚了解在本发明精神和范围内的各种变化和修改。

附图说明

下列图形成本说明书的部分且被纳入以进一步证明本发明的某些方面。通过参考一张或多张这些图结合本文所示特定实施方式的详细描述可更好理解本发明。

图1A-D。ESC亚群逃逸神经分化。ESC通过与PA6基质细胞共培养5天来经受神经分化。在头5天中进行早期分化。在细胞解离和再接种于多鸟氨酸后诱导晚期分化。(图1A)流式细胞仪分析早期分化中的巢蛋白和β-III-微管蛋白表达。(图1B)流式细胞仪分析早期分化中的巢蛋白和Oct-4表达。(图1C)通过流式细胞仪分析早期和晚期ESC分化中的CFSE稀释。(图1D)分化ESC中的表型和CFSE稀释分析组合。在不同时间点对以下不同亚群评价CFSE稀释：巢蛋白-阳性/β-III-微管蛋白-阴性(神经上皮细胞)，巢蛋白-阴性/β-III-微管蛋白-阳性(神经元细胞)，巢蛋白-阴性/β-III-微管蛋白-阴性(非神经细胞)。

图2A-E。单个母本ESC所衍生后代的差异。(图2A)-在一个集落衍生自一个母本ESC的实验设置中，细胞在72小时分化后就巢蛋白和β-III-微管蛋白染色。(图2B)ESC-Tα-1-GFP进行神经分化72小时并分析绿色荧光。(图2C)分析150个ESC衍生集落是否存在NeuN-阳性(成熟阶段神经元)、TH-阳性(多巴胺能神经元)和β-III-微管蛋白-阳性(神经元细胞)。(图2D)、(图2E)ESC-H2B-mRFP1进行神经分化并在头两天由实时成像监控。

图3A-B。ESC亚细胞系的mRNA表达概况。对各克隆ESC亚细胞系进行总mRNA表达概况分析(图3A)-建立与多能和/或早期内细胞团相关的mRNA表达。(图3B)-有6800个基因的表达在ESC克隆间显著不同。根据各克隆的基因表达概况，建立分层聚类分析以分类ESC克隆。最不同的2个克隆是克隆1和2，而克隆4和6高度相似。

图4A-D。克隆ESC不共有神经原性和心原性潜能。(图4A，图4B，图4C)-克隆ESC通过在PA6基质细胞上共培养来进行神经分化。(图4A)3天后评估包括巢蛋白-阳性神经上皮细胞的集落百分数。(图4B，图4C)1周后评估包括β-III-微管蛋白-阳性神经元细胞(图4B)或(C)TH-阳性多巴胺能神经元的集落百分数。(图4D)ESC克隆1、2、3和4向拟胚体分化。通过不同时间点的跳动拟胚体百分数来评估心脏分化。

图5A-H。克隆ESC不共有同一分化潜能。ESC克隆体外向拟胚体分化并通过对不同组织学类型和胚层特异性的基因表达的定量PCR来评价。

图6A-B。来自D3ESC的克隆亚细胞系证实细胞多样性。对各克隆D3亚细胞系进行总mRNA表达概况分析(图6A)-建立与多能和/或早期内细胞团相关的mRNA表达。(图6B)-D3亚细胞系通过在PA6基质细胞上共培养来进行神经分化。1周后评估包括βIII-微管蛋白+(神经元细胞)、neuN+成熟神经元和TH+多巴胺能神经元的集落百分数。

图7A-B。β-III-微管蛋白启动子的特异性。ESC-H2B-mRFP 1-βIIIp-GFP在PA6基质细胞上神经分化1周后，针对神经细胞中巢蛋白(图7A)和β-III-微管蛋白(图7B)的免疫荧光。

图8。单个母本ESC所衍生后代的系统发生。根据图2所述成像建立了系统发生树。显示系统发生树的5个示例。

图9。克隆1、2、6和7中未鉴定衍生染色体(der)的呈现。对第16次传代的克隆1、2、6和7进行标准核型分析。染色体是G显带并计数，显示超倍体41,XY优势群细胞(^*)中存在额外染色体。

图10。在ESC克隆1和2间差异性表达的基因的功能分类。用MetaCore鉴定路径。图表是基于在克隆1和2间的311个差异性表达mRNA。百分数指各路经中差异性表达的基因数相对具有GO设定的总基因数的百分数。

具体实施方式

本发明包括来自多能和多潜能干细胞的神经细胞和心肌细胞的受控分化方法，产生所得细胞群的异质性降低。多能干细胞所分化细胞的异质性损害用于治疗性应用的细胞制品的质量和纯度，且可能危及受体对象。如以下实施例所示，建立表达内细胞团(ICM)和多能性的克隆ESC亚细胞系，观察到某些克隆亚细胞系显示随着时间稳定的不同分化潜能。例如，建立各种克隆多能干细胞系，其显示优选分化成外胚层(例如神经元)、内胚层(例如肝细胞)、或中胚层(例如肌肉细胞或心肌细胞)细胞谱系。诱导多能干细胞(iPS)或ESC可用于生成显示分化潜能改变的克隆多能干细胞系，iPS包括目前可用的iPS细胞和/或将来可发育的iPS。因此，本发明部分提供产生异质性降低并因而治疗潜能更大且副作用可能降低的细胞克隆群的方法。在各种实施方式中，通过本文所述方法生成的衍生自克隆多能细胞系的细胞可用于测试化合物的药理学或毒理学评价。

A．多能和多潜能细胞

本发明考虑了提供来自多能或多潜能细胞的细胞克隆群的方法。本方法考虑使用任何多能或多潜能细胞。下文讨论多能干细胞和多潜能干细胞的非限制性示例。

I．哺乳动物胚胎干细胞

哺乳动物胚胎干(ES)细胞是衍生自囊胚内部细胞团的多能细胞。通过移除发育中胚胎的滋养外胚层，然后将内部细胞团在非生长细胞的饲养层上培养，可分离ES细胞。合适条件下，产生增殖、未分化ES细胞的集落。所述集落可移出、解离成单独细胞，然后再接种于新鲜饲养层上。再接种细胞可继续增殖，生成新的未分化ES细胞集落。然后，所述新集落可移出、解离、再次重接种并允许生长。未分化ES细胞的这种“继代培养”或“传代”过程可重复数次以生成含未分化ES细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。“原代细胞培养物”是直接获自组织如囊胚内部细胞团的细胞培养物。“继代培养物”是衍生自原代细胞培养物的任何培养物。

熟知获得小鼠ES细胞的方法。一种方法中，来自129系小鼠的植入前囊胚用小鼠抗血清处理以去除滋养外胚层，内部细胞团在培养基内化学灭活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养，所述培养基含有胎牛血清。产生的未分化ES细胞集落在胎牛血清存在下于小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上继代培养生成ES细胞群。在一些方法中，通过在含血清培养基中添加细胞因子白血病抑制因子(LIF)(Smith,2000)，小鼠ES细胞可在没有饲养层的情况下生长。在其他方法中，小鼠ES细胞可在骨形态发生蛋白和LIF存在下于无血清培养基中生长(Ying等,2003)。

人ES细胞可用前述方法获自囊胚(Thomson等，1995；Thomson等，1998；Thomson和Marshall，1998；Reubinoff等，2000)。一种方法中，将第5天的人囊胚接触兔抗人脾细胞抗血清，然后接触1:5稀释的豚鼠补体以裂解滋养外胚层细胞。从完整内部细胞团中移出经裂解滋养外胚层细胞后，所述内部细胞团在胎牛血清存在下于γ灭活小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上培养。9-15天后，获自内部细胞团的细胞团块可化学(即接触胰蛋白酶)或机械解离并再接种于含胎牛血清和小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的新鲜培养基中。进一步增殖后，通过微量移液选择具有未分化形态的集落，机械分离成团块并再接种(参见美国专利号6,833,269)。ES样形态的表征为有明显高的核质比与显著核仁的密集集落。所得ES细胞可通过短暂胰蛋白酶消化或通过微量移液选择个体集落来常规传代。一些方法中，通过在碱性成纤维生长因子存在下于成纤维细胞饲养层上培养ES细胞，人ES细胞可无血清生长(Amit等,2000)。其他方法中，通过在含碱性成纤维生长因子的“条件”培养基存在下于蛋白基质如基质胶(Matrigel)或层连蛋白上培养细胞，人ES细胞可以无饲养细胞层生长(Xu等,2001)。先前通过与成纤维细胞共培养形成条件培养基。

分离恒河猴和普通狨猴ES细胞的方法也已知(Thomson和Marshall,1998;Thomson等,1995;Thomson和Odorico,2000)。

另一ES细胞来源是建立的ES细胞系。已知各种小鼠细胞系和人ES细胞并明确其生长和增殖条件。例如，小鼠CGR8细胞系从小鼠129系胚胎的内部细胞团建立，CGR8细胞培养物可在LIF存在下不需饲养层而生长。作为另一示例，人ES细胞系H1、H7、H9、H13和H14由Thompson等建立。另外，开发了H9细胞系的亚克隆H9.1和H9.2。预期几乎所有本领域已知的ES或干细胞系都可用于本发明，如Yu和Thompson所述(2008)，其通过引用纳入本文。可从对象建立其它iPS细胞以产生可治疗性给回病人的细胞。因此，iPS细胞可用于个体化医疗。

与本发明联用的ES细胞源可以是囊胚，培养囊胚内部细胞团所得细胞，或已建立细胞系培养物所得细胞。因此，本文所用的术语“ES细胞”可指囊胚内部细胞团细胞，内部细胞团培养物所得ES细胞，ES细胞系培养物所得ES细胞。

多能细胞能分化成任何机体细胞。以各种方式测定了ES细胞的多能性(Martin,1982)。一个试验中，将囊胚内部细胞团衍生的小鼠ES细胞注入另一囊胚腔。所注入囊胚沉积于假孕雌性小鼠子宫中，产生的后代是注入和受体囊胚细胞的嵌合体。另一试验中，将小鼠ES细胞注入成年小鼠产生称为畸胎瘤的肿瘤。这种肿瘤可包含衍生自内胚层、中胚层和外胚层的多种细胞类型。在某些实施方式中，可根据本发明将一种或多种畸胎瘤衍生细胞培养或分化成神经或神经定向细胞。还可通过形成免疫缺陷小鼠中的畸胎瘤来测试人ES细胞的多能性。第三种试验是改变培养条件以允许ES细胞分化成更专门的细胞。例如，通过移出饲养层和添加LIF到培养基，小鼠ES细胞可自发分化成各种细胞类型。类似地，通过移出饲养层和在非粘附表面上悬浮培养ES细胞，人ES细胞可自发分化(Itskovitz-Eldor等,2000;Reubinoff等,2000;Roach等,1993)。这些条件下，ES细胞形成称为拟胚体的细胞聚集物，其包含具有神经元和心肌细胞特征的细胞。所有这些试验中，ES细胞的多能性通过其产生内胚层、中胚层和外胚层起源细胞的能力来显示。

ES细胞可通过其产生的蛋白来鉴定。例如，下列标记蛋白已用于鉴定ES细胞：阶段特异性胚胎抗原SSEA-1，阶段特异性胚胎抗原SSEA-3，阶段特异性胚胎抗原SSEA-4，肿瘤排斥抗原1-60(TRA1-60)，肿瘤排斥抗原1-81(TRA1-81)，碱性磷酸酶(AP)和转录因子Oct-4。如表1所示，小鼠、人和灵长类动物细胞的差异在于这些标记物表达模式。例如，SSEA-1在小鼠ES细胞中表达，但在人或猴ES细胞中不表达，而TRA1-60在人和猴ES细胞中表达，但在小鼠ES细胞中不表达。

表1.ES细胞标记物表达

标记物	小鼠	人	猴
				SSEA-1	是	否	否
SSEA-2	否	是	是
				SSEQ-3	否	是	是
TRA1-60	否	是	是
				TRA1-81	否	是	是
AP	是	是	是
				Oct-4	是	是	是

根据培养条件，ES细胞可产生分化细胞或未分化细胞的集落。术语“分化”指细胞向发育途径进展。术语“已分化”是描述细胞相较另一细胞胞向发育途径进展的相对术语。例如，多能细胞可产生任何机体细胞，而更加分化的细胞如造血细胞会产生较少的细胞类型。如本文所用，“未分化ES细胞”指不显示更加专门细胞特征的ES细胞。

2.诱导多能干细胞

诱导多能干(iPS)细胞是具有ES细胞特征但通过已分化体细胞重编程获得的细胞。诱导多能干细胞已通过多种方法获得。一种方法中，成人真皮成纤维细胞用逆转录病毒转导来转染有转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4(Takahashi等,2007)。在补充有碱性成纤维生长因子(bFGF)的培养基中，将经转染细胞接种于SNL饲养细胞(产LIF的小鼠细胞成纤维细胞系)。约25天后，培养物中出现与人ES细胞集落类似的集落。挑出ES细胞样集落并在bFGF存在下于饲养细胞上扩增。根据细胞特征，ES细胞样集落的细胞是诱导多能干细胞。诱导多能干细胞形态类似人ES细胞，表达各种人ES细胞标记物。同样，在已知引起人ES细胞分化的条件下生长时，诱导多能干细胞相应分化。例如，诱导多能干细胞可分化成具有神经元结构和神经元标记物的细胞。预期几乎所有iPS细胞或细胞系可用于本发明，包括例如Yu和Thompson所述的那些(2008)。

另一方法中，人的胚成纤维细胞或新生成纤维细胞用慢病毒转导转染有4个基因-Oct4、Sox2、Nanog和Lin28(Yu等,2007)。感染后12-20天，显现具有人ES细胞形态的集落。挑出所述集落并扩增。构成集落的诱导多能干细胞形态上类似人ES细胞，表达各种人ES细胞标记物，在注入小鼠后形成具有神经组织、软骨、肠道上皮的畸胎瘤。

从小鼠制备诱导多能干细胞的方法也已知(Takahashi和Yamanaka,2006)。诱导iPS细胞通常需要表达或接触至少一个Sox家族成员和至少一个Oct家族成员。认为Sox和Oct对确定ES细胞特性的转录调节层次至关重要。例如，Sox可以是Sox-1、Sox-2、Sox-3、Sox-15或Sox-18；Oct可以是Oct-4。其它因子如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc可提高细胞重编程效率；特定重编程因子组可以是含Sox-2、Oct-4、Nanog和可选Lin-28的组；含Sox-2、Oct4、Klf4和可选c-Myc的组。在各种实施方式中，Oct-4、Nanog、Klf-4和Sox-2可用于诱导和/或维持ESC的多能性。

3.通过体细胞核移植获得的胚胎干细胞

在某些实施方式中，多能干细胞是通过体细胞核移植获得的胚胎干细胞。在体细胞核移植中，供体核转入无纺锤体的卵母细胞中。由核移植生成的干细胞与供体核遗传一致。一种方法中，将来自恒河猴皮肤成纤维细胞的供体成纤维细胞核通过电融合引入无纺锤体、成熟中期II的恒河猴卵母细胞的胞质(Byrne等,2007)。融合的卵母细胞通过接触离子霉素来激活，然后孵育直到囊胚期。然后，培养所选囊胚的内部细胞团以生成胚胎干细胞系。胚胎干细胞系在体外和体内显示正常ES细胞形态，表达各种ES细胞标记物，并分化成多种细胞类型。本文所用的术语“ES细胞”指从含受精核的胚胎获得的胚胎干细胞。ES细胞不同于由核移植生成的胚胎干细胞，后者称为“通过体细胞核移植获得的胚胎干细胞”。

4.神经干细胞

神经干细胞是来自神经组织的未分化细胞，能产生神经干细胞(能自我更新)或最终分化成神经细胞的细胞。神经干细胞可以是成体神经干细胞或胚胎神经干细胞。本文所用的术语“成体”神经干细胞指获得自成人或儿童体组织的干细胞。熟知从人或其它动物分离成体和胚胎神经干细胞的方法(Rietze和Reynolds,2006;Svendsen等,1999)。

B．细胞培养

1.细胞培养概述

本领域普通技术人员已知的任何培养多能干细胞和多潜能干细胞的方法均考虑包括在本发明方法内。细胞生物学、组织培养和胚胎学的标准教材和综述都通过引用纳入本文，包括Teratocarcinomas and embryonic stemcells:A practical approach(《畸胎瘤和胚胎干细胞：实用方法》)(1987)；Guideto Techniques in Mouse Development(《小鼠发育技术指南》)(1993);Embryonic Stem Cell Differentiation In Vitro(《胚胎干细胞体外分化》)(1993);Properties and uses of Embryonic Stem Cells:Prospects for Application toHuman Biology and Gene Therapy(《胚胎干细胞的特性和用途：应用于人体生物学和基因治疗的前景》)(1998)。

用于组织培养的标准方法一般描述于Animal Cell Culture (《动物细胞培养》)(1987)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(《哺乳动物细胞的基因转移载体》)(1987)；和Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)及Short Protocols in Molecular Biology(《精编分子生物学实验指南》)(1987&1995)。

2.生长培养基

本领域已知各种用于干细胞培养的培养基和培养条件。在某些方面，细胞可与饲养细胞如成纤维细胞一起或在成纤维细胞条件培养基中生长。然而，在一些情况中，可能优选干细胞在没有饲养细胞的情况下生长。在一些方面，细胞可在确定的培养基如TeSR(例如，来自BD生物科学公司(BDBiosciences)的MTESR.TM.1)中生长(Ludwig等,2006a,美国申请2006/0084168)。这种培养基可用于ES细胞的无血清培养。在一些实施方式中，培养基补充有牛或人血清以提供必需生长因子(Ludwig等,2006b)。

例如，培养基可以是DMEM、RPMI 1640、GMEM或神经基础(Neuralbasal)培养基。培养基可包含血清，或可以是无血清培养基。可使用所述无血清培养基而不需添加外源生长因子，或可补充有生长因子如碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子8(FGF8))、Sonic Hedgehog(Shh)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)或维生素C。非粘附表面可以是低附着组织培养塑料。

如同第一步骤，第二步骤的培养基可以是支持多能干细胞或神经干细胞生长的任何培养基。所述培养基可包含血清，或可以是添加或不添加生长因子的无血清培养基。类似地，所述细胞可悬浮生长于非粘附组织培养表面。

在本发明的另一方面，在干细胞生长培养基中可包括其他培养基组分，如降低细胞分离时干细胞凋亡的分子(例如，在细胞群分传期间)。例如，培养基可包括一种或多种Rho相关激酶(ROCK)抑制剂如Y-27632或其衍生物。在一些方面，本发明的培养基可包括HA-100:或其衍生物。干细胞生长培养基中可包括的其它ROCK抑制剂包括H-1152((S)-(+)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉)磺酰基]高哌嗪)。H-1152显示的功效约比HA-100高10倍。因此，H-1152可以例如约0.1-10μM，约0.5-5μM，约1-3μM，或约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4或5μM的浓度，或其中任何可派生范围存在于ES细胞生长培养基中。在某些实施方式中，HA-100可以约1μM存在于ES细胞生长培养基，H-1152允许在96孔板中非常有效地接种个体人ES细胞(类似HA-100，但浓度低10倍)。原本在细胞团块中传代的个体HES细胞可产生每孔更均匀细胞密度，这是基于细胞的小分子筛选的严格先决前提。因此，H-1152可用于基于ES细胞的小分子筛选实验方案，所述方案包括本发明所述的自动细胞培养。H-1152已描述于例如Ikenoya等(2002)和Sasaki等(2002)，其通过引用纳入本文。

可包括在ES细胞生长培养基中的其它ROCK抑制剂包括Y-27632、N-(4-吡啶)-N'-(2,4,6-三氯苯)尿素、3-(4-吡啶)-1H-吲哚、甘氨酰-H1152((S)-(+)-2-甲基-4-甘氨酰-1-(4-甲基异喹啉-5-磺酰基)高哌嗪-基)和/或HA1100(羟基法舒地尔，Hydroxyfausdil)。Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨甲基)-N-(4-吡啶)环己甲酰胺)可市售获自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)且已有描述(参见例如Maekawa等，1999；Davies等，2000)。

3.细胞培养设备、系统和方法

在一些方面，本发明利用生物反应器技术。在生物反应器中培养细胞可大规模生产能进一步分化用于最终用途的完全生物活性细胞。生物反应器广泛用于从悬液和贴壁依赖性动物细胞培养物中生产生物制品。搅拌釜式生物反应器中的微载体细胞培养提供很高的体积-比培养表面积并用于生产病毒疫苗(Griffiths,1986)。此外，搅拌釜式生物反应器从工业上证明可规模化，然而这类技术仅当细胞可在贴壁非依赖性培养中生长时可采用。康宁公司(Corning-Costar)生产的多板CELLCUBE^TM细胞培养系统还提供很高的体积-比培养表面积。生长于培养板2面的细胞以紧凑正方形形状密封在一起。不同于搅拌釜式生物反应器，CELLCUBE^TM培养单元是一次性的。这在早期生产临床制品中很需要，因为一次性系统相关的资本支出、质量控制和质量保证成本减少。

a.非灌注附着系统

通常，贴壁依赖性细胞培养物如本文所述在玻璃或塑料的小容器底部增殖。通过经典和传统技术提供的受限表面-体积比适用于实验室规模，造成大规模细胞和细胞产物生成的瓶颈。在提供系统用于在小培养体积中给出较大可及表面供细胞生长的尝试中，提出了许多技术：滚瓶系统、叠板增殖器、螺旋膜瓶系统、中空纤维系统、填充床、板式交换器系统和膜管滚筒。由于这些系统的非均一性质且有时基于多个过程，它们有以下缺点-放大潜力有限、细胞取样困难、测量和控制关键过程参数的可能性有限以及难以在培养过程中维持均匀环境条件。

尽管有这些缺点，但大规模贴壁依赖性细胞生成的常用方法是滚瓶。滚瓶其实就是大的、不同形状的T型瓶，系统的简单性使得其很可靠，并因而具有吸引力。可用能每天能处理数以千计滚瓶的全自动机器人，因而消除与原本所需密集人工处理相关的污染和不恒定风险。

b.微载体上的培养

在尝试克服传统贴壁依赖性培养方法缺点的努力中，van Wezel(1967)发展了微载体培养系统的概念。此系统中，细胞通过缓慢搅拌在悬于生长培养基的小固体颗粒表面上增殖。细胞附着微载体并在微载体表面逐步生长到汇合。事实上，此大规模培养系统使附着依赖性培养从单盘过程升级到集合单层和悬浮培养的单元过程。因此，细胞生长必需表面和均匀悬浮培养优点的联合使得生产增加。

微载体培养对于大部分其它贴壁依赖性、大规模培养方法的优点是多方面的。首先，微载体培养提供高表面-体积比(通过改变载体浓度而可变)，这产生高细胞密度得率和获得高浓缩细胞产物的潜能。培养物在灌注反应器模式中增殖时，细胞得率多至1-2*10⁷个细胞/毫升。第二，细胞可在一个单元过程容器中增殖，而不是使用许多小的低产率容器(即培养瓶或培养皿)。这使得营养物利用好很多且显著节约培养基。此外，单反应器中的增殖使得每细胞所需处理步骤数量对设施空间的需求下降，因此减少劳动力成本和污染风险。第三，混合良好且均匀的微载体悬浮培养使得能监控和控制环境条件(例如，pH、pO₂和培养基组分浓度)，因而产生更具重复性的细胞增殖和产物回收。第四，能获得代表性样品用于显微镜观察、化学测试或计数。第五，由于微载体快速从悬液沉降，使用分批补料过程或收获细胞可相对容易地完成。第六，微载体上的贴壁依赖性培养增殖模式使得能采用此系统用于其它细胞操作，如不用蛋白裂解酶的细胞转移、共培养细胞、植入动物、和灌注培养物，使用倾析器、柱、流化床或中空纤维以保留微载体。第七，微载体培养相对易于用悬浮培养微生物和动物细胞的常规设备来放大。

c.哺乳动物的微囊化

一种对于培养哺乳动物细胞特别有用的方法是微囊化。所述哺乳动物细胞保留在半渗透水凝胶膜内。多孔膜形成于细胞外周允许与囊周围的主体培养基交换营养物、气体和代谢产物。开发了一些温和、迅速且无毒的方法，其中所得膜的多孔性和强度足以在整个培养过程中支持生长的细胞团。这些方法都基于通过液滴接触含钙溶液胶化的可溶性藻酸盐。Lim(1982,美国专利号4,352,883，通过引用纳入本文)描述了使浓缩于约1%藻酸钠溶液中的细胞受迫通过小孔，形成液滴，散入约1%氯化钙溶液。然后，所述液滴投入聚氨基酸层，聚氨基酸与表面藻酸盐离子键合。最后，通过在鳌合剂中处理液滴去除钙离子来再液化藻酸盐。其它方法使用钙溶液中的细胞来滴入藻酸盐溶液，因而产生中空藻酸盐球。类似方法包括壳聚糖溶液中的细胞滴入藻酸盐，也产生中空球。

微囊化细胞易在搅拌釜式反应器中增殖，珠尺寸的直径范围为150-1500μm，易用细孔网维持在灌注反应器中。囊体积与总培养基体积之比可保持1:2-1:10的密度。囊内细胞密度多至10⁸，培养物中的有效细胞密度是1-5*10⁷。

微囊化相较其它方法的优点包括提供保护免受鼓泡和搅拌中所产生剪应力的有害影响，能够容易保留珠以使用灌注系统，放大相对直接以及能使用珠以用于移植。

d.灌注附着系统

还考虑了灌注附着系统在本发明方法中的应用。灌注指以稳定速率连续流过或拂过细胞群(生理营养物溶液中)。这意味着细胞保留在培养单元内而非连续流动培养中细胞随排出培养基而洗出(例如恒化器)。灌注的概念自本世纪初以来就已知且应用于保持小片活组织以供延时的显微镜观察。所述技术开始于模拟体内细胞环境，细胞在体内连续供应有血液、淋巴或其它体液。没有灌注情况下，培养细胞经历加料和饥饿的交替阶段，因此限制其生长和代谢潜能的充分表达。

目前使用灌注培养应对细胞以高密度(即0.1-5*10⁸个细胞/毫升)生长的挑战。为使密度超过2-4*10⁶个细胞/毫升，用新鲜供给持续取代培养基以弥补营养欠缺并移除有毒产物。灌注可更好控制培养环境(pH、pO₂、营养物水平等)且就细胞粘附而言是显著增加培养物内表面积利用的手段。

使用无纺织物床基质的灌注填充床反应器的开发提供了维持灌注培养物密度超过10⁸个细胞/毫升床体积的手段(CELLIGEN^TM,新泽西州爱迪生的NBS公司(New Brunswick Scientific))。简要来说，此反应器包括用于培养贴壁和非贴壁依赖性细胞的改良反应器。所述反应器设计成具有提供内部再循环手段的填充床。优选将纤维基质载体置于反应容器中的篮内。所述篮的顶部和底部有孔，可使培养基流过该篮。专门设计的叶轮提供经过纤维基质所占空间的培养基再循环，以确保均匀供应营养物和去除废物。这同时确保可忽略量的总细胞团悬于培养基中。篮和再循环的组合还提供含氧培养基经过纤维基质的无泡流动。纤维基质是“孔”直径为10μm-100μm的无纺织物，提供高内部体积，孔体积对应于个体细胞体积的1-20倍。

相较其它培养系统，此方法提供数个显著优点。纤维基质载体保护细胞免受来自搅拌和发泡的机械应力。游离培养基流经篮，提供细胞最佳调节水平的氧、pH和营养物。产物可从培养物中连续移出且所收获产物没有细胞并能在有利后续纯化步骤的低蛋白培养基中生成。同样，此反应器系统的独特设计提供放大反应器的更简单方法。目前，可获得多至30升的尺寸。100升和300升形式在开发中且理论计算支持多至1000升的反应器。此技术详细解释于WO 94/17178(1994年8月4日，Freedman等)，其通过引用全文纳入本文。

CELLCUBE^TM(康宁公司)模块提供大的苯乙烯表面积用于基底附着细胞的固定和生长。这是完整包封的无菌单次使用装置，具有一系列平行培养板，连接产生相邻板之间的薄且密封的层流空间。

CELLCUBE^TM模块具有入口和出口，彼此处于对角相对且帮助调节培养基流动。最初几天生长中，初始接种后系统内所含培养基大致满足培养物所需。初始接种和培养基灌注开始之间的时间量取决于接种物的细胞密度和细胞生长率。循环培养基中营养物浓度的测量是培养物状态的良好指示。建立过程时，可能需要监控各种不同灌注速率下的营养物组成以测定最经济和最多产的操作参数。

所述系统内细胞达到的溶液密度(细胞/毫升)高于传统培养系统。许多常用的基础培养基设计成支持每天1-2*10⁶个细胞/毫升。用85,000cm²表面运行的典型CELLCUBE^TM在模块内包含约6L培养基。培养容器中的细胞密度通常超过10⁷个细胞/毫升。汇合时，每天需要2-4个反应器体积的培养基。

e.自动扩增ES细胞的设备/系统

本发明的某些方面包括自动扩增多能或多潜能细胞如ES细胞的设备或系统。示例性装置可含有活ES细胞群，与培养箱流体连通的液体处理单元以及含细胞分离操作程序的控制器。

用于本发明设备的ES细胞群可包括来自本领域技术人员已知的任何来源的ES细胞群。例如，获得胚胎干细胞如人ESC的方法先前已描述于美国专利号5,843,780、6,200,806和7,029,913。应理解本文所用的术语设备不限于单外壳中的装置，并可包括例如通过电、机械或其它联接机制连接在一起的多个装置。

各种液体处理单元市售可得，例如在某些方面，液体处理器可以是机器人处理器如汉密尔顿(Hamilton)

STAR工作站或贝克曼库尔特(Beckman Coulter)2000液体处理器(B2K)。还参见涉及机器人液体处理器的美国专利号6,325,114。其它方面中，液体处理器可以是不包括机器人臂但通过阀的致动和压力梯度的应用来移动液体的装置，如流体或微流体液体处理器。

本领域已知大量培养箱并可根据本发明实施方式使用。例如，在某些实施方式中，培养箱可以是科峻(Kendro)CYTOMAT^TM培养箱。

此外，在本发明的某些实施方式中，细胞扩增设备和系统可包括控制干细胞扩增的控制器。这种程序可与液体处理单元、流体连通装置和/或培养箱电子连通。技术人员应认识到在某些方面，操作设备或系统可包括在计算机或计算机可读介质中。

应理解，可通过计算机自动化方法实现操作设备，其中操作设备指导和控制构成本发明某些实施方式的各种硬件设施。可用于实现硬件元件整合的示例性操作程序是OVERLORD^TM整合软件程序(Biosero公司(Biosero,Inc.))，所述程序采用简单拖放系统设置仪器间的连通。所述软件还允许一系列编程元件如数值和串变量、条件语句和控制环。

可选地，本发明所述的设备可包括促进培养箱和液体处理单元间流体连通的流体连通装置。例如，在液体处理器是机器人处理器的情况中，流体连通装置可以是机器人装置，如在液体处理单元和培养箱间移动细胞板的装置。例如，机器人装置可以是哈德森(Hudson)Platecrane XL。

此外，多能或ES细胞扩增系统可包括一种或多种含液体处理单元所用试剂的储器。例如，储器可包含：有或没有蛋白酶抑制剂的细胞生长培养基；细胞培养板；蛋白裂解酶溶液；磷酸缓冲盐水(PBS)；和/或移液器头。在某些方面，可用其它机器人装置促进液体处理装置和储器之间的流通。在某些实施方式中，储器可包含TeSR培养基，可选有ROCK抑制剂和/或蛋白酶抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂。在其它实施方式中，所述储器可含有含蛋白裂解酶(例如，胰蛋白酶、EDTA等)的溶液。

在一些方面，可用贝克曼库尔特Stacker Carousel促进储器(例如，板或移液管储器)和液体处理装置间的连通。所述储器可位于温控单元如冰箱内。所述温控单元可任选包括加热单元以预加热溶液到所需温度(例如约37°C)；然而，发明人发现加热单元在某些实施方式中不必需，如简单冰箱。

4.从群中分离个体细胞

本发明方法的某些实施方式包括从细胞群中选择细胞。将本领域普通技术人员已知的任何方法考虑为从细胞群中选择个体细胞的方法。在一些实施方式中，将用流式细胞分选仪(96孔板中)的经典有限稀释试验用于从群中分离个体细胞。

有许多细胞分选技术可用于从非心肌细胞谱系细胞中分选心肌细胞谱系细胞。这些细胞分选技术包括但不限于阴性免疫选择和阳性免疫选择。

免疫选择是涵盖多种技术的通用术语，其中选择系统的特异性由抗体或抗体样分子如凝集素或半抗原产生。这种特异性的一个示例是抗体对特定细胞表面抗原的亲和性。实施2种常规类型的免疫选择技术。阴性免疫选择包括从异质群体中消除特定组分亚群，如根据本文所述方法从灵长类多能干细胞分化产生的细胞群中消除非心肌细胞谱系细胞。相反，阳性免疫选择指直接选择和回收特定组分，如直接选择和回收根据本文所述方法由灵长类多能干细胞分化的心肌细胞谱系细胞。本发明的实施可用各种免疫选择，包括但不限于流式细胞术(FACS)、免疫磁性技术、抗体柱、免疫沉淀和免疫抗体包被筛选。

5.维持未分化状态

多能和多潜能细胞可通过本领域普通技术人员已知的任何方法维持于未分化状态。例如，可通过在血清和饲养层存在下培养细胞来维持未分化状态。例如，所述饲养层可以是小鼠胚胎成纤维细胞。也已知其它使干细胞维持未分化状态的方法。例如，可通过存在LIF但没有饲养层的情况下培养将小鼠ES细胞维持在未分化状态。然而，不同于小鼠ES细胞，人ES细胞不响应LIF。通过在碱性成纤维生长因子存在下于成纤维细胞饲养层上培养ES细胞(Amit等,2000)，或通过在没有饲养层和存在成纤维细胞条件培养基与碱性成纤维生长因子情况下于蛋白基质如基质胶或层连蛋白上培养(Xu等,2001；美国专利号6,833,269)，可维持人ES细胞的未分化状态。

群体中显著部分的干细胞及其衍生物显示未分化细胞的形态特征，将其与胚胎或成体来源的分化细胞明显区分时，将多能或多潜能细胞的培养物描述为“未分化”。未分化ES细胞为本领域技术人员所了解，通常在细胞集落的2维显微镜视图中显现高核质比和显著核仁。应理解未分化细胞的集落可具有分化的相邻细胞。

C.干细胞分化

干细胞如人胚胎干细胞(hES)和任何优选提供一种或多种分化因子的细胞在体外共培养。这包括优选将hES细胞引入由培养中胚胎细胞增殖生成的胚胎细胞单层。胚胎细胞单层可生长至基本汇合，干细胞可在胚胎细胞胞外培养基存在下生长一段足够的时间以诱导干细胞分化成特定细胞类型。或者，干细胞可在含胚胎细胞胞外培养基而无胚胎细胞的培养物中生长。胚胎细胞和干细胞可通过滤器或无细胞基质如琼脂来彼此分离。

对于干细胞分化，所述干细胞可接种于胚胎细胞单层并使其在培养物中生长以诱导干细胞分化。然而，为了本发明目的，干细胞可通过本领域普通技术人员已知的任何方法分化成心肌细胞和心脏祖细胞。例如，可添加抗坏血酸以提高分化。

逐步撤出干细胞生长最优条件可促进干细胞分化成特定细胞类型。合适培养条件可包括在共培养物中添加DMSO、视黄酸、FGF或BMP，这可增加分化速率和/或效率。

胚胎细胞层的细胞密度通常影响其稳定性和性能。提高hES细胞向心肌细胞分化的细胞培养基可包括抗坏血酸、或其衍生物或功能等价物。所述培养基的浓度优选为给hES细胞递送合适浓度的抗坏血酸、其衍生物或功能等价物。所述浓度范围为10^-3M-10^-5M。所述浓度更优选为10^-4M。适于培养hES细胞的任何类型培养基均适合。

所述细胞培养基可以无血清。然而，可耐受各种血清浓度且浓度范围可为20%-0%。也可提供浓度选自20%、10%、5%、2.5%和0%的血清浓度。

根据本发明，将未分化哺乳动物干细胞接触分化剂。未分化干细胞可在分化剂存在下培养一段时间，然后使其在没有分化剂情况下增殖。考虑此基本过程的变化，只要接触分化剂的结果是干细胞分化成神经细胞、肝细胞或心肌细胞。例如，第一步中，未分化干细胞可在分化剂存在下于非粘附表面上悬浮培养。第二步中，干细胞接触分化剂一段合适时间后，所述细胞可在分化剂存在下于非粘附表面上用新鲜培养基悬浮培养。第三步中，所述已接触细胞可接种并在没有分化剂情况下生长。增殖细胞可在细胞达到约80-90%汇合度时分离并传代。

第一步中，所述培养基可以是支持干细胞存活和生长的任何培养基。例如，所述培养基可以是DMEM、RPMI 1640、GMEM或神经基础培养基。所述培养基可包含血清，或可以是无血清培养基。可使用所述无血清培养基而不添加外源生长因子，或可补充有生长因子如碱性成纤维生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子8(FGF8))、Sonic Hedghog(Shh)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)或维生素C。非粘附表面可以是低附着组织培养塑料。

如同第一步，第二步的培养基可以是支持干细胞生长的任何培养基。所述培养基可包含血清，或可以是添加或不添加生长因子的无血清培养基。类似地，所述细胞可悬浮生长于非粘附组织培养表面。

第三步中，可在含血清的培养基，或无生长因子的无血清培养基，或含生长因子如bFGF、IGF-2、EGF、FGF8、Shh、BDNF、GDNF或维生素C的无血清培养基中，将已接触细胞接种于粘附表面。所述粘附表面可以是组织培养塑料，或可以是包被组织培养表面如包被有多鸟氨酸/层连蛋白、牛胶原I、人胞外提取物、猪皮明胶或基质胶的组织培养板。细胞可在达到汇合、80-90%汇合度或任何其它水平汇合度时传代。细胞聚集物、单细胞悬液中任一种或两者都可接种。为制备传代细胞，细胞可从粘附表面机械移出例如通过抽吸移出，或通过蛋白酶如胰蛋白酶-EDTA、胶原酶或分散酶处理来化学移出。

考虑第一、第二和第三步的所有可能组合。例如，在一个过程中，第一步涉及使用没有生长因子的无血清培养基，而第二和第三步涉及使用有生长因子的无血清培养基。另一过程中，所有三步涉及使用有生长因子的无血清培养基。其它过程中，组合第一和第二步，从而细胞在第三步接种前接触分化剂而培养基无变化。

有效分化剂浓度可通过剂量响应分析来测定。分化剂可溶于溶剂如二甲基亚砜(DMSO)，然后以不同浓度加入ES细胞培养物。

将本领域普通技术人员已知的任何分化剂考虑作为本发明的分化剂。例如，为分化成神经原性细胞类型如多巴胺能细胞，可采用基质衍生诱导活性(SDIA)，在合适培养基中与PA6饲养细胞共培养。对于晚期分化实验，共培养物通过酶分离并再接种于多鸟氨酸包被的盖玻片。

心肌细胞悬浮生成。ESC以单细胞水平分离，各细胞在确定培养基中产生称为拟胚体的漂浮结构。一周后，定量含跳动细胞的拟胚体百分数(肉眼评价)。在某些实施方式中，培养基中包括激活素。在某些实施方式中，用于分化的激活素是激活素A、激活素B、激活素AB或激活素C。在某些实施方式中，可使用超过1种激活素。在某些实施方式中，其它TGFβ超家族成员如TGF-β、nodal或lefty可取代或补充本发明方法中的激活素。在某些实施方式中，分化中使用的BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7。在某些实施方式中，所述BMP是BMP-2、BMP-4或BMP-7以外的BMP(排除BMP-1)。在某些实施方式中，可使用超过1种BMP。

BMP步骤后，正在分化的细胞可在没有激活素和BMP情况下培养。该培养步骤可包括IGF。在某些这类实施方式中，所包括的IGF浓度为10ng/ml-500ng/ml；或25ng/ml-100ng/ml；或50ng/ml-100ng/ml。在某些实施方式中，所包括的IGF浓度小于10ng/ml或大于500ng/ml。所述IGF可以是IGF-1或IGF-2。某些实施方式中，胰岛素可取代本发明方法中的IGF。

D.选择细胞

1.鉴定神经前体细胞、神经细胞和胶质细胞

通过检测神经前体细胞和/或神经细胞中有活性的启动子、基因和蛋白表达，可测定ES细胞培养物接触不同量分化剂后的分化程度。例如，可分析Tα-1启动子、β3-微管蛋白基因和蛋白、巢蛋白基因和蛋白、双皮质素基因和蛋白、波形蛋白基因和蛋白、NeuN基因和蛋白、或MAP2基因和蛋白的表达。剂量响应分析的典型浓度范围为100nM-100nM的分化剂。

未分化干细胞接触分化剂所制备的已分化细胞可以形态学、免疫化学和其他方式鉴定，确认其状态为神经前体细胞。

可根据多种表型标准鉴定细胞。所述标准包括但不限于显微镜观察形态特征，检测或定量所表达细胞标记物、酶活性、神经递质及其受体、以及电生理功能。

本发明包含的某些细胞具有神经细胞或胶质细胞的形态特征。本领域技术人员了解这些特征。例如，神经元包括小细胞体，树突和轴突样多重突起。

神经细胞还可根据其是否表达特定种类神经细胞的特征性表型标记物来鉴定。感兴趣的标记物包括但不限于：a)神经元特征性的β3-微管蛋白，微管相关蛋白2(MAP-2)，或神经丝；b)星状细胞中存在的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)；c)少突细胞特征性的2’,3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)半乳糖脑苷脂(GaIC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)；d)未分化ES细胞特征性的Oct-4；e)神经前体和其它细胞特征性的Pax-6和巢蛋白；f)发育中的中枢神经系统特征性的Sox 1；g)儿茶酚胺神经元中存在的酪氨酸羟化酶(TH)；h)含γ氨基丁酸的神经元中存在的谷氨酸脱羧酶同种型67(GAD67)；i)中间神经分化特征性的波形蛋白。

本领域已知的组织特异性标记物可用任何合适免疫学技术检测，所述技术如用于细胞表面标记物的流式免疫细胞化学和荧光激活细胞分选，用于胞内或细胞表面标记物的免疫组化(例如，固定的细胞或组织切片)，用于细胞提取物或分泌到培养基中产物的酶联免疫测定和细胞提取物的蛋白质印迹分析。可在固定细胞后通过标准免疫细胞化学或流式细胞测定或者用本领域熟知的其它免疫学方法观察抗体与抗原的结合，采用经标记二抗或其它偶联物(如生物素-亲和素偶联物)来放大标记。一般，本领域熟知免疫复合物形成的检测且可通过应用多种方法来完成。这些方法一般基于检测标记或标记物，如放射性、荧光、生物和酶标签的标记或标记物。涉及使用这类标记的美国专利包括3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，各通过引用纳入本文。

通过Northern印迹分析或斑点杂交分析，或在标准扩增法中使用序列特异性引物通过逆转录聚合酶起始的聚合酶链反应(RT-PCR)，还可在mRNA水平检测组织特异性基因产物的表达，详述见美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159以及Innis等，1988，各通过引用全文纳入本文。本公开所列特定标记物的序列数据可获自公共数据库，如GenBANK。在蛋白质或mRNA水平检测的组织特异性标记物表达如果至少为对照细胞如未分化ES细胞的2倍，优选大于10或15倍，则认为其为阳性。

神经细胞，特别是终末分化细胞的特征还有参与神经递质的生物合成、释放和再摄入的受体和酶，参与突触传递相关的去极化和再极化的离子通道。突触形成证据可通过对突触泡蛋白染色获得。对某些神经递质的感受性的证据可通过检测γ氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、多巴胺、3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和血清素的受体获得。

可根据多种表型标准鉴定神经细胞。所述标准包括但不限于显微观察形态特征，检测或定量所表达的细胞标记物、酶活性、神经递质及其受体、以及电生理功能。

本发明包含的某些细胞具有神经细胞或胶质细胞的形态特征。本领域技术人员了解这些特征。例如，神经元包括小细胞体，树突和轴突样多重突起。

神经细胞还可根据其是否表达特定种类神经细胞的特征性表型标记物来鉴定。感兴趣的标记物包括但不限于：a)神经元特征性的β3-微管蛋白，微管相关蛋白2(MAP-2)，或神经丝；b)星状细胞中存在的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)；c)少突细胞特征性的2’,3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶(CNPase)半乳糖脑苷脂(GaIC)或髓磷脂碱性蛋白(MBP)；d)未分化ES细胞特征性的Oct-4；e)神经前体和其它细胞特征性的Pax-6和巢蛋白；f)发育中的中枢神经系统特征性的Sox 1；g)儿茶酚胺神经元中存在的酪氨酸羟化酶(TH)；h)含γ氨基丁酸的神经元中存在的谷氨酸脱羧酶同种型67(GAD67)；i)中间神经分化特征性的波形蛋白。

本公开所列和本领域已知的组织特异性标记物可用任何合适免疫学技术检测，所述技术如用于细胞表面标记物的流式免疫细胞化学和荧光激活细胞分选，用于胞内或细胞表面标记物的免疫组化(例如，固定的细胞或组织切片)，用于细胞提取物或分泌到培养基中产物的酶联免疫测定和细胞提取物的蛋白质印迹分析。可在固定细胞后通过标准免疫细胞化学或流式细胞测定或者用本领域熟知的其它免疫学方法观察抗体与抗原的结合，采用经标记二抗或其它偶联物(如生物素-亲和素偶联物)来放大标记。一般，本领域熟知免疫复合物形成的检测且可通过应用多种方法来完成。这些方法一般基于检测标记或标记物，如放射性、荧光、生物和酶标签的标记或标记物。涉及使用这类标记的美国专利包括3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241，各通过引用纳入本文。

通过Northern印迹分析或斑点杂交分析，或在标准扩增法中使用序列特异性引物通过逆转录聚合酶起始的聚合酶链反应(RT-PCR)，还可在mRNA水平检测组织特异性基因产物的表达，详述见美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159以及Innis等，1988，各通过引用全文纳入本文。本公开所列特定标记物的序列数据可获自公共数据库，如GenBANK。在蛋白质或mRNA水平检测的组织特异性标记物表达如果至少为对照细胞如未分化ES细胞的2倍，优选大于10或15倍，则认为其为阳性。

神经细胞，特别是终末分化细胞的特征还有参与神经递质的生物合成、释放和再摄入的受体和酶，参与突触传递相关的去极化和再极化的离子通道。突触形成证据可通过对突触泡蛋白染色获得。对某些神经递质的感受性的证据可通过检测γ氨基丁酸(GABA)、谷氨酸、多巴胺、3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)、去甲肾上腺素、乙酰胆碱和血清素的受体获得。

用胚胎干细胞(ES)评价神经分化时，一般需要尽可能模拟参与神经发生的生理细胞相互作用。本方法考虑涉及基于空气/液体界面培养人ES细胞的方法。此培养系统可在没有添加生长因子情况下允许三维细胞扩增和神经分化。在某些实施方式中，培养方法如通过引用全文纳入本文的Eiraku等(2008)所述方法可用于本发明。

2.鉴定心肌细胞

上述任何鉴定细胞分化的方法可用于评价细胞向心肌细胞的分化。人胚胎干细胞可与小鼠内脏内胚层(VE)样细胞共培养以形成跳动肌肉细胞，表达心脏特异性肌节蛋白和离子通道。此共培养方法可诱导心肌细胞分化。多能ES细胞(包括例如人ES细胞)与END-2细胞的共培养引起广泛分化成不同谱系的2种独特细胞类型。一种是上皮细胞且形成对甲胎蛋白染色阳性的大囊性结构并可能是胚外内脏内胚层；其他聚集在局部密度高的区域且自发跳动。这些跳动细胞是心肌细胞。涉及心肌细胞分化的其它信息可参见美国专利申请公开号20080031857、20080187494和20070010012，其通过引用具体纳入本文。

3.鉴定肝细胞

上述任何鉴定细胞分化的方法可用于评价细胞向肝细胞的分化。促进多能干细胞体外分化成肝细胞的方法可包括移除阻止其分化的因子和/或通过接触合适生长因子，例如Sancho-Bru等(2009)或Zaret等(2008)所述。iPS细胞可分化成肝细胞并用于组织替代或基因治疗。可通过接触激活素A从iPS起始肝发育。用BMP-4和bFGF进一步处理可随后使细胞向肝谱系分化(参见例如Zaret等(2008))。先前的研究表明人iPS细胞具有与ESC相当的肝谱系分化潜能(Si-Tayeb等(2010))。涉及肝分化的其它信息可参见美国专利申请公开号2010/0086525、2010/0129351、2005/0042750、2010/0143313、2010/0086999，WO 2010/049752A1和US7473555，其通过引用具体纳入本文。

E.筛选应用

由本文所示方法生成的细胞还可用于研究发育的细胞和分子生物学，功能基因组学，以及产生分化细胞用于治疗性或预防性移植、治疗、药物筛选或体外药物开发。例如，所述细胞可用于基因组分析，生成mRNA、cDNA或基因组文库，产生特异性多克隆或单克隆抗体，包括但不限于人源化单克隆抗体(WO 01/51616，通过引用具体纳入本文)，或者筛选不同测试化合物或生物活性分子如药物研究中的药物化合物对由此衍生的细胞或组织的影响。所述细胞还可用于筛选影响培养中神经细胞或心肌细胞特征以及这些细胞分化的因子(如小分子药物、肽、多核苷酸等)或条件(如细胞培养条件或操作)。

本发明包括在由本发明方法生成的神经细胞或心肌细胞中评价测试化合物的方法。可评价所述测试化合物是否引起由接触该测试化合物导致的细胞表型或活性变化。这些试验可包括测试单一测试化合物或随机筛选候选物质的大文库；或者，所述试验可用来聚焦用着眼于据信使它们更可能调节神经元或神经定向细胞功能的结构属性所选择的特定类型化合物。在某些实施方式中，可通过使测试化合物接触多种神经或神经定向细胞如已形成经改造神经组织的细胞(Schmandt等，2005)(例如，衍生自人胚胎干细胞)来评价测试化合物的毒性。ENT是衍生自胚胎干细胞(ES)的三维组织片，类似于可通过本发明所述细胞分化生成的人胎脑的某些层。可采用毒性测试作为体外药物筛选方法的一部分，例如在将测试化合物临床给予对象如人患者之前。

可评价各种属性以确定测试化合物是否导致细胞中的毒性。参数包括例如细胞死亡(坏死、凋亡)兴奋性中毒、细胞毒性、神经功能改变(例如改变动作电位产生或长时程增强等)、脑受体功能改变、对已知有毒化合物攻击的耐受性降低、突触毒性、发育神经毒性或神经谱系特定毒性(例如在少突细胞、星状细胞或多巴胺能神经元中)，可在细胞中评价所述参数以确定测试化合物是否导致毒性或神经毒性。可采用电生理技术检测神经活性或功能。可采用突触标记物测量来检测具有突触毒性的化合物。细胞可改造成包含限定谱系(例如少突细胞、多巴胺能神经元等)特异性启动子，所述启动子控制报道基因如发光或荧光蛋白表达；如此，通过体外报道基因表达变化可更容易观察到神经谱系特异性毒性。在某些实施方式中，可测量活性氧种类以确定测试化合物是否导致细胞氧化应激增加。在某些实施方式中，可生成剂量响应关系以评价测试化合物的毒性。在某些实施方式中，可通过在神经分化期间孵育测试化合物细胞来评价发育神经毒性。

可在根据本发明培养的细胞中筛选小分子文库的部分或全部或者多种化合物的毒性或神经活性。一些或基本所有神经或神经定向细胞可进一步分化成多巴胺能细胞，然后评价测试化合物的毒性；这可能在需要理解化合物多巴胺能毒性的情况中特别有用。

本发明的培养和/或毒性测试方法可以自动化。在某些实施方式中，涉及培养细胞、分化细胞和/或评估测试化合物性质(例如毒性)的一个或多个步骤可以自动化，例如通过使用自动装置，从而促进细胞中高通量毒性评价。例如，可采用多种自动装置培养细胞，添加培养基或从细胞中移出培养基，向含根据本发明分化的神经或神经定向细胞的培养基添加测试化合物。可用于本发明方法的特定自动装置包括允许自动化和标准化分配细胞到多孔的细胞分散器，所述多孔通常范围为12-384个孔，尽管如需要可使用更高或更低数量的孔(例如，来自赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific,Inc.)的Matrix WellMate^TM)，以及包括允许自动化分配文库化合物到多孔板和自动化稀释化合物的多通道液体处理器，例如用于IC₅₀计算(如来自卡尺生命科学公司(Caliper Life Sciences)的Zephyr)。

为评价化合物毒性，一般要确定有和没有测试化合物时细胞的功能和/或存活性。例如，方法通常包括：

提供测试化合物；

将测试化合物与根据本发明生成的多种细胞或分离细胞相混合；

测定候选调节物是否能改变或破坏步骤(c)中所述细胞的细胞存活性或功能；和

将步骤(c)所测特征与没有所述候选调节物时所述细胞的特征作比较，

其中所测特征间的差异表明所述候选调节物影响或显示对所述细胞的毒性。

可使用一个或多个多孔板如96孔板在高通量试验中进行筛选。例如，ENT可在多孔板中生成以建立筛选平台来研究测试化合物(例如，小分子、蛋白、肽、抗体、假定治疗剂)或多种化合物(例如，来自化合物库、小分子文库、肽文库、抗体文库等)的神经毒性潜能。测试化合物可合成产生或从天然来源纯化。生成ENT和/或评价测试化合物性质的方法可以自动化；例如，添加化合物或溶液到多孔板或从中移出的步骤，检测多孔板中发光或荧光的步骤，和/或在多孔板中生成ENT的步骤可以自动化，例如通过自动装置。

在各种实施方式中，可评价测试化合物的组合以确定同时或依序将2、3、4、5、6种或更多测试化合物应用于神经细胞、肝细胞或心肌细胞是否引起特定效果或毒性。将多种化合物依序给予组织可按需要从数秒变化至数小时、数周或更长。例如，在这些情况中，考虑可在相互约12-24小时内，更优选相互约6-12小时内，将细胞接触2种药征。但在一些情况中，可能需要延长时间段以显著治疗，各给药间间隔数天(2、3、4、5、6或7)到数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。可采用测试化合物“A”和测试化合物“B”间的不同组合。

A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B

B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A

B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A

在其他实施方式中，测试化合物可单独接触不同神经或神经定向组织。

可用于此目的的特定神经启动子包括例如Tα1α-微管蛋白启动子(Tα1)和βIII-微管蛋白启动子。特定神经谱系的各种启动子可用于评估特定细胞类型中的响应，包括例如多巴胺能神经元特异启动子(例如酪氨酸羟化酶启动子)、突触特异启动子(例如突触素I启动子)、轴突特异启动子(例如MAP2启动子)和非神经特异启动子(例如通过CNPase II启动子评价的少突细胞)。术语“启动子”在本文中以其通常意义使用，指含DNA调节序列的核苷酸区域，其中该调节序列来自能结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的基因。

在某些实施方式中，多能干细胞可转染有双重报道子系统以检测干细胞向神经或神经定向细胞的转化。所述双重报道子系统可利用神经元特异启动子表达第一发光或荧光蛋白且第二启动子(例如，由任何细胞或第二细胞类型表达的启动子)可驱动第二发光或荧光蛋白的表达。如此，可观察到神经标记物的相对表达。报道子系统可通过多种技术转染到多能细胞内，所述技术包括例如脂质体转染、微粒轰击或病毒转染如慢病毒转染。在以下实施例中，双重报道子系统用于观察经T α1启动子的萤火虫荧光素酶表达和经EF1-α短启动子(EF1-αS)的海肾荧光素酶表达。

荧光蛋白一般包括荧光发色团，所述发色团由至少3个氨基酸形成且通常特征为产生对羟基苯亚甲基-咪唑烷酮发色团的环化反应。所述发色团可不含辅基且能发射具有选择性能量的光，所述能量先前通过含正确波长的外界光源照射储存于发色团中。自发荧光蛋白的结构和发色团中存在的氨基酸数量可广泛变化，条件是所述发色团包括对羟基苯亚甲基-咪唑烷酮环结构。在一些情况中，荧光蛋白可包括β-桶状结构，如绿色荧光蛋白中所见和Chalfie等(1994)所述。荧光蛋白通常显示能响应由所述蛋白吸收的特定波长入射光而发射更长波长的光。荧光激活细胞分选或(FACS)可用于检测某些实施方式中一种或多种神经元特定标记物的表达。可获得FACS产品，例如FACSCalibur^TM(BD公司(Becton Dickson))可用于本发明。

测试化合物可包括天然产生化合物的片段或部分，或可作为原本无活性已知化合物的活性组合。建议对分离自天然来源如动物、细菌、真菌、包括叶和树皮在内的植物来源、和海生样品的化合物可作为候选物就潜在有用药物剂的存在加以测试。应理解待筛选的药物剂还可获自或合成自化学组合物或人工化合物。因此，应理解本发明鉴定的候选物质可以是肽、多肽、多核苷酸、小分子抑制剂或可通过合理药物设计从已知抑制剂或刺激剂开始设计的任何其它化合物。

其它测试化合物包括反义分子、核酶和抗体(包括单链抗体)，各个对靶分子特异。此类化合物本文另有详述。例如，结合翻译或转录起始位点或剪接点的反义分子是理想的候选抑制剂。肽调节剂的模拟肽或与药学活性化合物立体空间类似的其它化合物也可用作测试化合物。

当然，应理解本发明的所有筛选方法本身就有用，尽管可在测试化合物中或就测试化合物观察到或未观察到毒性或一些其它性质。

F.组织工程改造和细胞治疗

本发明还考虑由本发明的方法所生成的神经细胞、肝细胞或心肌细胞在基于细胞的治疗中的应用。疾病或损伤引起的显著受损人组织的再生能力在成人中明显降低。本文所述细胞可给予或植入哺乳动物对象用于细胞替换治疗或组织再生。或者，本发明的细胞可直接给予对象。因此，本公开的方法可用于治疗许多疾病、损伤或其它有害情况。

本发明的心肌细胞、肝细胞或神经细胞可用于通过三维组织工程改造对人体器官建模。例如，可通过三维培养本文所示方式生成的神经细胞来建模人脑中的组织。类似地，可从本发明方法生成的心肌细胞衍生或重建心脏组织。可从本发明方法生成的肝细胞衍生或重建肝组织。本发明的神经细胞、肝细胞和心肌细胞还可用作待递送至人体不同位点的各种治疗活性分子或基因的载体载剂，例如按需要通过基因操作和分化所述细胞，以及递送所述细胞或组织到供体靶位点用于基因治疗。

G.疾病治疗

另一方面，本发明提供治疗对象中疾病的方法，所述方法包括将有效量的本发明方法所生成神经细胞或心肌细胞给予患病对象。在一些实施方式中，给予多巴胺能神经元以治疗神经系统疾病或损伤。

本发明可有效治疗的神经退行性疾病和紊乱包括但不限于：阿尔茨海默病，帕金森病，多发性硬化，中风，肌萎缩侧索硬化症(路格里克氏病)，额颞痴呆(皮克病)，朊病毒病，亨廷顿氏症，脑缺血，特发性帕金森病，局部或药物引起的帕金森综合征，不同起源的阿尔茨海默病和脑痴呆，亨廷顿氏舞蹈病，感染引起的神经退行性疾病如AIDS-脑病，克雅氏病，麻疹和疱疹病毒及螺旋体引起的脑病，代谢毒性神经退行性疾病如肝、酒精、缺氧、低血糖或高血糖引起的脑病以及溶剂或药物引起的脑病，各种起源的视网膜退行性疾病，创伤引起的脑和骨髓损伤，脊髓损伤，不同起源如加入和/或停止药剂、毒素、病原和药物后的的脑过度兴奋症状，精神和创伤引起的脑过度兴奋状态，周围神经系统的神经退行性综合征如代谢、药物、毒素和感染引起的多发性神经病和多神经炎，以及支气管解痉效果。

本发明可有效治疗的肝病和紊乱包括但不限于：肝炎、非酒精性脂肪肝病、硬化、肝癌、威尔逊氏病、原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、小胆管自身免疫疾病、布-加综合征、吉尔伯氏综合征和II型糖原贮积症、急性肝衰竭、艾欧吉勒(Alagille)综合征、α-1抗胰蛋白酶缺陷、自身免疫性肝炎、胆道闭锁、糖原贮积症、肝母细胞癌、肝细胞癌(肝细胞瘤)、进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)和尿素循环障碍。

1.药物制剂

本发明方法生成的神经细胞、肝细胞或心肌细胞可包括在药物组合物内。细胞的药物组合物可通过本领域普通技术人员已知的任何方法给予。例如，可以通过直接注入神经系统受损区域来给予，或胃肠外、静脉内、皮内、肌肉内、透皮、腹膜内或鞘内给予。

对于注射，细胞的溶液在水性介质内。适于可注射用途的药物形式包括无菌水溶液。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适混合物、和/或植物油。微生物作用的预防可通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

对于水溶液的胃肠外给药，例如若需要所述溶液应适当缓冲且液体稀释剂首先用充分盐水或葡萄糖呈现等渗。这些特定水溶液特别适于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内给予。在此方面，本领域技术人员根据本公开会了解可采用的无菌水性介质。无论如何，负责给予的人会确定个体对象的合适剂量。

如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载剂、包被剂、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。使用这类介质用于药物活性物质为本领域熟知。除非常规介质或试剂与所述活性组分不相容，否则考虑其在治疗性组合物中的应用。补充性活性组分也可纳入所述组合物。

短语“药学上可接受”或“药理学上可接受”指给予人时不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。包含蛋白作为活性组分的水性组合物的制备为本领域熟知。通常，这种组合物制备成可注射的液体溶液或悬液；还可制备适于在注射前用液体配成溶液或悬液的固体形式。

2.给予

对于神经系统损伤的治疗，给予对象药学有效量的本发明细胞。给予途径当然随损伤位置和性质而变化，且包括例如皮内、鞘内、注入中枢神经系统、心内、透皮、胃肠外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹膜内、灌注、灌洗和直接注射。

细胞可以单剂量或多剂量给予。适当时还可连续给予。一般，通过连续灌注的治疗性组合物剂量等同于单或多次注射所给剂量，调整至进行灌注的某持续时间段。给予的细胞剂量取决于治疗对象、对象体重、给予方式和医师的判断。治疗方案也可变化且通常取决于神经系统损伤类型、损伤位置、疾病进展、患者的健康和年龄。

3.组合治疗

在某些实施方式中，本发明的组合物和方法包括给予本发明方法生成的克隆细胞和一种或多种其它治疗。这种疗法可应用于治疗考虑用本发明克隆细胞处理的任何疾病。例如，所述疾病可以是神经退行性疾病、心血管病、肝病、或过度增殖性疾病如癌症。

包括组合治疗的所述方法和组合物提高治疗性或保护效果，和/或增加另一疗法的治疗性效果。治疗性和预防性方法和组合物可以有效获得所需效果的组合量提供，所需效果如治疗神经变性或治疗心血管病。

本发明的克隆细胞可在第二治疗形式之前、期间、之后给予，或以相对第二治疗形式的各种组合给予。所述给的间隔可以从同时到数分钟到数天到数周。一般应确保在各递送时间之间不超出显著时间段，从而2种化合物仍能对患者施加有利的组合效应。所述细胞和第二治疗可在相互约12-24或72小时内给予，更优选相互约6-12小时。在一些情况中，可能需要延长时间段以显著治疗，其中各给药间有数天(2、3、4、5、6或7天)到数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)间隔。

在某些实施方式中，治疗进程持续1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90天或更久。可考虑将一种试剂在第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,和/或90天，或其任何组合时给予，而另一试剂在第1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,和/或90天，或其任何组合时给予。单日(24小时阶段)内，患者可接受一次或多次细胞给予。此外，治疗过程后，考虑有一个不给予治疗的时间段。此时间段可持续1、2、3、4、5、6、7天，和/或1、2、3、4、5周，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更久，这取决于患者状况，如其预后、强度、健康等。

可采用各种组合。例如，下例中本发明克隆细胞表示为“A”且第二治疗形式为“B”：

A/B/A  B/A/B  B/B/A  A/A/B  A/B/B  B/A/A  A/B/B/B  B/A/B/B

B/B/B/A  B/B/A/B  A/A/B/B  A/B/A/B  A/B/B/A  B/B/A/A

B/A/B/A  B/A/A/B  A/A/A/B  B/A/A/A  A/B/A/A  A/A/B/A

将本发明任何化合物或疗法给予患者应遵照给予这类化合物的通用方案，考虑试剂的毒性(如果有)。因此，在一些实施方式中，有监控归因于组合治疗的毒性的步骤。预期治疗周期可按需要重复。还考虑各种标准治疗以及手术干预可与所需治疗联用。

在多种实施方式中，由本发明方法获得的细胞(例如心肌细胞、肝细胞、神经细胞、多巴胺能神经元等)可与免疫抑制剂联合给予患者。在其它实施方式中，可能不必将免疫抑制剂与本发明的细胞联合给予。例如，iPS细胞可由对象细胞生成，随后再分化成所需细胞类型；然后，这些细胞可治疗性给回该对象。再分化细胞可产生很少或没有不良免疫学反应，因为所述细胞衍生自该对象的细胞。然而，在多种实施方式中，免疫抑制剂或抗炎化合物可有利地给予患者，例如若患者有炎性或自身免疫疾病。

在特定方面，考虑第二标准治疗可包括药物疗法、化疗、免疫治疗、手术治疗、放疗或基因治疗，并能与本文所述克隆细胞联用。以下是第二药物治疗形式的非限制性示例：

a.心血管药物

可用于本发明的药物治疗剂的非限制性示例包括抗高脂蛋白血症剂、抗动脉硬化剂、抗血栓/纤维蛋白溶解剂、血凝剂、抗心律失常剂、抗高血压剂、血管加压剂、充血性心力衰竭治疗剂、抗心绞痛剂、抗细菌剂或其组合。

另外，应注意下列任意一种可用于开发新心脏治疗靶基因组，如将β-阻断剂用于本实施例(见下)。尽管预期许多这些基因可能重叠，仍可开发新基因靶。

在某些实施方式中，给予降低一种或多种血脂和/或脂蛋白浓度的本文称为“抗高脂蛋白血症”试剂，可联合根据本发明的心血管疗法，特别是治疗动脉粥样硬化和血管组织的增厚或阻断。在某些方面，抗高脂蛋白血症剂可包括芳氧基烷酸/纤维酸衍生物、树脂/胆酸螯合剂、HMG CoA还原酶抑制剂、烟酸衍生物、甲状腺激素或甲状腺激素类似物、杂剂或其组合。

芳氧基烷酸/纤维酸衍生物的非限制性示例包括苄氯贝特、苯扎贝特(enzafibrate)、比尼贝特、环丙贝特、克利贝特、氯贝特(安妥明-S)、氯贝酸、依托贝特、非诺贝特、吉非贝齐(lobid)、尼可贝特、吡贝特、罗尼贝特、双贝特和益多脂(theofibrate)。

树脂/胆酸螯合剂的非限制性示例包括消胆胺(考来烯胺、贵舒醇)、降胆宁(考来替泊)和降胆葡胺。

HMG CoA还原酶抑制剂的非限制性示例包括洛伐他汀(美降脂)、普伐他汀(普拉固)或辛伐他汀(舒降之)。

烟酸衍生物的非限制性示例包括烟酸盐、阿西莫司、戊四烟酯、尼可氯酯、尼可莫尔和氧烟酸。

甲状腺激素及其类似物的非限制性示例包括依托洛赛(etoroxate)、甲状丙酸和甲状腺素。

杂项抗高脂蛋白血症剂的非限制性示例包括阿昔呋喃、阿扎胆醇、苯氟雷司、β-苯亚甲基丁酰胺、肉毒碱、硫酸软骨素、氯雌酮甲醚、考来糖酐(detaxtran)、葡聚糖硫酸钠、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、香菇嘌呤、十八碳二烯酸、羟甲戊二酸、甲亚油酰胺、双甲雌三醇、鸟氨酸、γ-谷维素、泛硫乙胺、季戊四醇四乙酸酯、α-苯基丁酰胺、吡扎地尔、普罗布考(丙丁酚)、β-谷甾醇、磺托酸-哌嗪盐、硫地醇、三苯乙醇和联苯丁酸。

抗动脉硬化剂的非限制性示例包括吡醇氨酯。

在某些实施方式中，给予辅助移除或防止血凝块的试剂可联合给予调节剂，特别是治疗动脉粥样硬化和血管系统(例如动脉)阻断。抗血栓和/或纤维蛋白溶解剂的非限制性示例包括抗凝剂、抗凝剂拮抗剂、抗血小板剂、血栓溶解剂、血栓溶解剂拮抗剂或其组合。

在某些方面，优选可口服给予的抗血栓剂，例如阿司匹林和华法林(香豆素)。

抗凝剂的非限制性示例包括苊香豆醇、安克洛酶、茴茚二酮、溴茚二酮、氯茚二酮、库美香豆素、环香豆素、葡聚糖硫酸钠、双香豆素、二苯茚酮、双香豆乙酯、乙叉双香豆素、氟茚二酮、肝素、水蛭素、阿朴酸钠、奥沙二酮、戊糖多硫酸盐、苯茚二酮、苯丙香豆素、高磷蛋白、吡考他胺、噻氯香豆素和华法林。

抗血小板剂的非限制性示例包括阿司匹林、葡聚糖、双嘧达莫(潘生丁)、肝素、磺吡酮(苯磺唑酮)和噻氯匹定(抵克立得)。

血栓溶解剂的非限制性示例包括组织纤维溶酶原激活剂(阿替普酶)、纤溶酶、尿激酶原、尿激酶(雅激酶)链球菌激酶(链激酶)、阿尼普酶/APSAC(依米那酶)。

在病人有出血或出血可能性增加的某些实施方式中，可使用增强凝血的试剂。凝血促进剂的非限制性示例包括血栓溶解剂拮抗剂和抗凝剂拮抗剂。

抗凝剂拮抗剂的非限制性示例包括鱼精蛋白和维生素K1。

血栓溶解剂拮抗剂的非限制性示例包括氨基己酸(amicar)和传明酸(氨甲环酸)。抗血栓剂的非限制性示例包括阿那格雷、阿加曲班、西洛他唑、达尔卓潘、去纤苷、依诺肝素、速避凝、吲哚布芬、拉莫帕朗(lamoparan)、奥扎格雷、吡考他胺、普拉贝脲、替地肝素、噻氯匹定和三氟柳。

抗心律失常剂的非限制性示例包括I型抗心律失常剂(钠通道阻断剂)、II型抗心律失常剂(β-肾上腺素阻断剂)、II型抗心律失常剂(复极化延长药物)、IV型抗心律失常剂(钙通道阻断剂)和杂项抗心律失常剂。

钠通道阻断剂的非限制性示例包括IA、IB和IC型抗心律失常剂。IA型抗心律失常剂的非限制性示例包括达舒平(丙吡胺)、普鲁卡因胺(百浪斯迪)和奎尼丁(硫酸奎尼丁)。IB型抗心律失常剂的非限制性示例包括利多卡因(赛罗卡因)、妥卡尼(妥卡胺)和美西律(脉舒律)。IC型抗心律失常剂的非限制性示例包括恩卡胺(恩卡尼)和氟卡尼(氟卡胺)。

β阻断剂另外称为β-肾上腺素阻断剂、β-肾上腺素拮抗剂或II型抗心律失常剂，非限制性示例包括醋丁洛尔(醋丁心安)、阿普洛尔、氨磺洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、苯呋洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、布库洛尔、布非洛尔、丁呋洛尔、布尼洛尔、布拉洛尔、布替君盐酸盐、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、塞他洛尔、氯拉洛尔、地来洛尔、依泮洛尔、艾司洛尔(艾斯洛尔)、茚心安、拉贝洛尔、左布诺洛尔、甲吲洛尔、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、纳多洛尔、萘肟洛尔、硝苯洛尔、尼普地洛、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、普拉洛尔、丙萘洛尔、普萘洛尔(心得安)、心得怡(索他洛尔)、硫氧洛尔、他林洛尔、特他洛尔、噻吗洛尔、托利洛尔和西宾洛尔(xibinolol)。在某些方面，β阻断剂包括芳基丙醇胺衍生物。芳基丙醇胺衍生物的非限制性示例包括醋丁洛尔、阿普洛尔、阿罗洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、贝凡洛尔、比索洛尔、波吲洛尔、布尼洛尔、丁非洛尔、卡拉洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、塞利洛尔、塞他洛尔、依泮洛尔、茚心安、甲吲洛尔、美替洛尔、美托洛尔、莫普洛尔、纳多洛尔、尼普地洛、氧烯洛尔、喷布洛尔、吲哚洛尔、心得安、他林洛尔、特他洛尔、噻吗洛尔和托利洛尔。

延长复极化的试剂(也称为III型抗心律失常剂)的非限制性示例包括胺碘酮(可达龙)和索他洛尔(心得怡)。

钙通道阻断剂(另称为IV型抗心律失常剂)的非限制性示例包括芳烷基胺(例如，苄普地尔(bepridile)、地尔硫卓、芬地林、加洛帕米、普尼拉明、特罗地林、维拉帕米)、二氢吡啶衍生物(非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼莫地平、尼索地平、尼群地平)、哌嗪衍生物(例如，桂利嗪、氟桂利嗪、利多氟嗪)或杂项钙通道阻断剂如苄环烷、依他苯酮、镁、米贝拉地尔或哌克昔林。在某些实施方式中，钙通道阻断剂包括长效二氢吡啶(硝苯地平类)钙拮抗剂。

杂项抗心律失常剂的非限制性示例包括腺苷(艾吉伴，adenocard)、地高辛(狄戈辛)、乙酰卡尼、阿吗灵、克冠吗啉、安搏律定、溴苄乙胺、丁萘夫汀、克冠异丁胺、卡泊酸、西苯唑啉、丙吡胺(disopyranide)、氢化奎宁定、英地卡尼、异丙托溴铵、利多卡因、劳拉义明、劳卡尼、甲氧苯汀、莫雷西嗪、吡美诺、普拉马林、普罗帕酮、吡诺林、聚半乳糖醛酸奎尼丁、硫酸奎尼丁和维喹地尔。

抗高血压剂的非限制性示例包括交感神经阻滞剂、α/β阻断剂、α阻断剂、抗血管紧张素Ⅱ剂、β阻断剂、钙通道阻断剂、血管扩张剂和杂项抗高血压剂。

α阻断剂(也称为α-肾上腺素阻断剂或α-肾上腺素拮抗剂)的非限制性示例包括氨磺洛尔、阿罗洛尔、达哌唑、多沙唑嗪、甲磺酸双氢麦角碱、芬司匹利、吲哚拉明、拉贝洛尔、尼麦角林、哌唑嗪、特拉唑嗪、苄唑啉、三甲氧唑啉和育亨宾。在某些实施方式中，α阻断剂可包括喹唑啉衍生物。喹唑啉衍生物的非限制性示例包括阿夫唑嗪、布那唑嗪、多沙唑嗪、哌唑嗪、特拉唑嗪和三甲氧唑啉。

在某些实施方式中，抗高血压剂是α和β肾上腺素拮抗剂。α/β阻断剂的非限制性示例包括拉贝洛尔(柳胺苄心定、湍泰低)。

抗血管紧张素Ⅱ剂的非限制性示例包括血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。血管紧张素转换酶抑制剂(ACE抑制剂)的非限制性示例包括阿拉普利、依那普利(沃热泰克)、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫维托普利(moveltopril)、培哚普利、喹那普利和雷米普利。血管紧张素II受体阻断剂(也称为血管紧张素II受体拮抗剂、ANG受体阻断剂或ANG-II 1型受体阻断剂(ARBS))的非限制性示例包括血管坎地沙坦(angiocandesartan)、依普罗沙坦、厄贝沙坦、氯沙坦和缬沙坦。

交感神经阻滞剂的非限制性示例包括中枢作用性交感神经阻滞剂或外周作用性交感神经阻滞剂。中枢作用性交感神经阻滞剂(也称为中枢神经系统(CNS)交感神经阻滞剂)的非限制性示例包括氯压定(可乐定)、胍那苄(氯压胍)胍法辛(泰尼克斯)和甲基多巴(爱道美)。外周作用性交感神经阻滞剂的非限制性示例包括神经节阻断剂、肾上腺素能神经元阻断剂、β-肾上腺素能阻断剂或α1-肾上腺素能阻断剂。神经节阻断剂的非限制性示例包括梅坎米胺(美加明)和三甲噻方(咪噻吩)。肾上腺素能神经元阻断剂的非限制性示例包括胍乙啶(依斯迈林)和利血平(蛇根碱)。β-肾上腺素能阻断剂的非限制性示例包括醋丁洛尔(塞克塔尔)、阿替洛尔(天诺敏)、倍他洛尔(卡尔仑)、卡替洛尔(cartrol)、拉贝洛尔(柳胺苄心定、湍泰低)、美托洛尔(甲氧乙心安)、纳多洛尔(康加尔多)、喷布洛尔(硫酸戊丁心安)、吲哚洛尔(卫心根)、普萘洛尔(心得安)和噻吗洛尔(噻吗心安)。α-肾上腺素能阻断剂的非限制性示例包括哌唑嗪(脉宁平)、多沙唑嗪(卡度雷)和特拉唑嗪(高特灵)。

在某些实施方式中，心血管治疗剂可包括血管扩张剂(例如，脑血管扩张剂、冠血管扩张剂或外周血管扩张剂)。在某些优选的实施方式中，血管扩张剂包括冠血管扩张剂。冠血管扩张剂的非限制性示例包括胺氧三苯、地巴唑、琥珀苯呋地尔、苯碘达隆、氯酚嗪、卡波罗孟、氯苄呋醇、氯硝甘油、地拉卓、双嘧达莫、氢普拉明、乙酯黄酮、丁四硝酯、依他苯酮、芬地林、夫洛地尔、更利芬、乙烷雌酚双(β-二乙氨基乙醚)、海索苯定、甲苯磺酸硝乙胺酯、凯林、利多夫宁(lidoflanine)、甘露醇六硝酯(mannitolhexanitrane)、美地巴嗪、尼可甘油(nicorglycerin)、戊四硝酯、戊硝醇、哌克昔林、匹美茶碱、曲匹地尔、甲色酮、曲美他嗪、磷酸三硝乙醇胺和维司那定。

在某些方面，血管扩张剂可包括慢性治疗血管扩张剂或高血压急症血管扩张剂。慢性治疗血管扩张剂的非限制性示例包括肼苯哒嗪(阿普利素灵)和米诺地尔(敏乐啶)。高血压急症血管扩张剂的非限制性示例包括硝普盐(硝普钠)、二氮嗪(氯苯甲噻二嗪IV)、肼苯哒嗪(阿普利素灵)、米诺地尔(敏乐啶)和戊脉安。

杂项抗高血压剂的非限制性示例包括阿吗灵、γ-氨基丁酸、丁苯碘胺、西氯他宁、环西多明、绿藜安丹宁酸盐、非诺多泮、氟司喹南、酮色林、美布氨酯、美加明、甲基多巴、甲基4-吡啶基酮缩氨基硫脲、莫唑胺、优降宁、潘必啶、吡那地尔、哌罗克生、普立哌隆、原藜芦碱、萝巴新、瑞西美托、利美尼啶、沙拉新、硝普钠、替尼酸、樟磺咪芬、酪氨酸酶和乌拉地尔。

在某些方面，抗高血压剂可包括芳基乙醇胺衍生物、苯并噻二嗪衍生物、N-羧烷基(肽/内酰胺)衍生物、二氢吡啶衍生物、胍衍生物、肼/酞嗪、咪唑衍生物、季铵化合物、利血平衍生物或氨苯磺胺类衍生物。

芳基乙醇胺衍生物的非限制性示例包括氨磺洛尔、丁呋洛尔、地来洛尔、拉贝洛尔、普罗纳赛洛、索他洛尔和硫氧洛尔。

苯并噻二嗪衍生物的非限制性示例包括阿尔噻嗪、苄氟噻嗪、苄噻嗪、苄氢氯噻嗪、布噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、环戊噻嗪、环噻嗪、二氮嗪、依匹噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、氢氯噻嗪、氢氟甲噻、甲氯噻嗪、美替克仑、美托拉宗、对氟噻嗪、多噻嗪、四氯甲噻嗪和三氯甲噻嗪。

N-羧烷基(肽/内酰胺)衍生物的非限制性示例包括阿拉普利、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫维普利、培哚普利、喹那普利和雷米普利。

二氢吡啶衍生物的非限制性示例包括氨氯地平、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平、尼索地平和尼群地平。

胍衍生物的非限制性示例包括二甲苄胍、异喹胍、胍那苄、胍那克林、胍那决尔、胍甲啶、胍乙啶、胍法辛、胍氯酚、胍诺沙苄和胍生。

肼/酞嗪的非限制性示例包括布屈嗪、卡屈嗪、双肼屈嗪、恩屈嗪、肼卡巴嗪、肼屈嗪、苯异丙肼、匹尔屈嗪和托屈嗪。

咪唑衍生物的非限制性示例包括氯压定、洛非西定、酚妥拉明、噻美尼定和托洛尼定。

季铵化合物的非限制性示例包括阿扎溴铵、松达氯铵、六甲铵、甲硫酸氰戊吗啉、五甲溴铵、酒石酸戊双吡铵、芬托氯铵和甲硫曲美替定。

利血平衍生物的非限制性示例包括比他舍平、地舍平、瑞西那明、利血平和昔洛舍平。

磺胺类衍生物的非限制性示例包括安布赛特、氯帕胺、呋塞米、吲达帕胺、喹乙宗、曲帕胺和利多速尿。

血管加压剂一般用于在休克期间提升血压，手术过程中可能发生休克。血管加压剂(也称为抗低血压药)的非限制性示例包括阿美铵甲硫酸盐、血管紧张素胺、二甲福林、多巴胺、依替非明、依替福林、吉培福林、间羟胺、米多君、去甲肾上腺素、福来君和辛弗林。

充血性心力衰竭治疗剂的非限制性示例包括抗血管紧张素II剂、后负荷-前负荷降低治疗、利尿剂和心肌收缩剂。

在某些实施方式中，不能耐受血管紧张素拮抗剂的动物患者可用组合疗法治疗。这种治疗可联合给予肼苯哒嗪(阿普利素)和硝酸异山梨酯(速必瑞锭、硝异梨醇)。

利尿剂的非限制性示例包括噻嗪或苯并噻二嗪衍生物(例如，阿尔噻嗪、苄氟噻嗪、苄噻嗪、苄氢氯噻嗪、布噻嗪、氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、环戊噻嗪、依匹噻嗪、乙噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、氢氯噻嗪、氢氟甲噻嗪、甲氯噻嗪、美替克仑、美托拉宗、对氟噻嗪、多噻嗪、四氯甲噻嗪、三氯甲噻嗪)，有机汞制剂(例如，氯汞君、莫鲁来、汞罗茶碱、汞迈灵钠、汞香豆酸、汞香豆林钠、氯化亚汞、汞撒利)，蝶啶(例如，呋氨蝶啶、氨苯蝶啶)，嘌呤(例如，醋茶碱、7-吗啉甲茶碱、柏马溴、丙可可碱、可可碱)，类固醇，包括醛固酮拮抗剂(例如，坎利酮、欧夹竹桃甙、螺内酯)，磺胺类衍生物(例如，乙酰唑胺、安布赛特、阿佐塞米、布美他尼、布他唑胺、氯米非那胺、氯非那胺、氯帕胺、氯索隆、二苯基甲烷-4,4’-二磺胺、二磺法胺、依索唑胺、呋塞米、吲达帕胺、美夫西特、醋甲唑胺、吡咯他尼、喹乙宗、托拉塞米、曲帕胺、利多速尿)，尿嘧啶(例如，氨美啶、阿米美啶)，保钾拮抗剂(例如，阿米洛利、氨苯蝶啶)或杂项利尿剂如氨嗪(aminozine)、熊果苷、氯拉扎尼、依他尼酸、依托唑啉、肼卡巴嗪、异山梨醇酯、甘露醇、美托查酮、莫唑胺、哌克昔林、替宁酸(ticrnafen)和尿素。

心肌收缩剂(也称为强心剂)的非限制性示例包括醋茶碱、醋洋地黄毒甙、2-氨基-4-甲基吡啶、氨力农、琥珀苯呋地尔、布拉地新、黄夹次苷(cerberosine)、樟吡他胺、铃兰毒甙、加拿大麻甙、地诺帕明、去乙酰毛花苷、毛地黄苷、洋地黄、洋地黄毒苷、地高辛、多巴酚丁胺、多巴胺、多培沙明、依诺昔酮、格木碱、非那可明、吉他林、吉妥辛、胍基乙酸、辛胺醇、白毛莨分碱、异波帕胺、毛花洋地黄甙、甲氧酚胺(metamivam)、米力农、黄花夹竹桃次苷B、欧夹竹桃甙、毒毛花苷G、奥昔非君、普瑞特罗、海葱次苷甲、酯蟾毒配基、海葱苷、海葱苷元、毒毛旋花甙、硫马唑、可可碱和扎莫特罗。

在特定方面，肌力剂是强心苷、β-肾上腺素能激动剂或磷酸二酯酶抑制剂。强心苷的非限制性示例包括地高辛(狄高辛)和洋地黄毒苷(狄吉妥辛)。β-肾上腺素能激动剂的非限制性示例包括沙丁胺醇、布特罗、比托特罗、卡布特罗、克仑特罗、氯丙那林、地诺帕明、二羟西君、多巴酚丁胺(独步催)、多巴胺(盐酸多巴胺)、多培沙明、麻黄素、乙基麻黄碱、乙基去甲肾上腺素、非诺特罗、福莫特罗、海索那林、异波帕胺、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、马布特罗、奥西那林、甲氧那明、奥昔非君、吡布特罗、丙卡特罗、普罗托醇、茶丙特罗、利米特罗、利托君、索特瑞醇、特布他林、曲托喹酚、妥洛特罗和扎莫特罗。磷酸二酯酶抑制剂的非限制性示例包括氨力农(氨吡酮)。

抗心绞痛药可包括有机硝酸酯类(organonitrate)、钙通道阻断剂、β阻断剂，及其组合。

有机硝酸酯类(也称为硝基血管扩张剂)的非限制性示例包括硝酸甘油(nitro-bid，耐绞宁),硝酸异山梨酯(速必瑞锭、硝异梨醇)和硝酸戊酯(aspirol、vaporole)。

考虑手术治疗作为辅助治疗。本领域技术人员熟知这类针对血管和心血管疾病及紊乱的手术治疗剂，可包括但不限于对生物体进行手术、提供心血管机械置换、血管成形术、冠状动脉再灌注、导管消融，给对象提供植入型心律转复除颤器、机械辅助循环、心脏移植、血管成形术、瓣膜置换术、冠状动脉旁路移植术或其组合。可用于本发明的机械辅助循环的非限制性示例包括主动脉内球囊反搏装置、左心室辅助装置或其组合。

b.神经退行性疾病的辅助治疗

神经退行性疾病的辅助治疗示例包括医药治疗或手术治疗。医药治疗的非限制性示例包括胆碱酯酶抑制剂。示例包括多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏。其它辅助治疗的示例包括调节脑内谷氨酸盐的试剂，如美金刚。其它示例包括抗氧化剂如维生素E。还考虑抗精神病药、神经安定剂、抗抑郁剂、抗焦虑药和安眠药作为治疗的辅助形式。其它辅助试剂包括司来吉兰、选择性单胺氧化酶抑制剂、雌激素、消炎药和银杏。

辅助治疗还包括左旋多巴、多巴胺激动剂和COMT抑制剂。

辅助手术治疗包括消融，深度脑刺激，苍白球毁损术，本发明细胞以外产巴胺细胞的脑移植。

c.肝病的辅助治疗

肝病辅助治疗的示例包括医药治疗或手术治疗。医药治疗的非限制性示例包括柳氮磺胺吡啶、皮质类固醇、抗炎症化合物,细胞因子导向治疗(例如，己酮可可碱或抗TNF、抗氧化剂和抗病毒治疗。

d.化疗剂

可根据本发明使用广泛种类的化疗剂。术语“化疗”指使用药物治疗癌症。“化疗剂”用于指癌症治疗中给予的化合物或组合物。这些试剂或药物通过其在细胞内的活性模式来分类，例如它们是否影响细胞周期以及在何阶段影响。或者，可根据试剂直接交联DNA、插入DNA内、或通过影响核酸合成引起染色体和有丝分裂畸变的能力，来鉴定试剂。大部分化疗剂落入下列类别内：烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂和亚硝基脲。先前已列出这些试剂的示例。

H.药盒

在发明的不同方面，设想含一种或多种密封容器的药盒，所述容器内包括本发明的细胞克隆群。在一些实施方式中，所述药盒还可包括合适容器用具，所述用具是不与药盒组分反应的容器，如EP (Eppendorf)管、试验板、注射器、凭或试管。所述容器可由无菌材料如塑料或玻璃制成。

所述药盒还可包括概括过程步骤的说明书，涉及本发明方法或涉及细胞克隆群的信息如来源、存储说明、给予说明等。所述说明信息可在含机器可读指令的计算机可读介质内，在用计算机执行所含机器可读指令时可展示递送药学有效量治疗剂的实际或虚拟过程。所述药盒可任选包括一种或多种能用于治疗或预防疾病的额外治疗剂。例如，额外治疗剂可以是能用于治疗或预防神经退行性疾病或心血管病的试剂。这种试剂的非限制性示例在本说明书另有讨论。

I.实施例

包括下列实施例以展示本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解下列实施例所示技术代表发明人所发现在本发明实施中作用良好的技术，因而可视作构成实施的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开应理解，可对所公开的具体实施方式进行许多改变，且仍获得类同或相似结果而不偏离本发明的精神和范围。

实施例1

材料和方法

细胞培养：小鼠CGR8ESC系获自欧洲细胞培养物保藏所(ATCC)；基质PA6细胞系由日本的理化研究所(Riken)BRC细胞库提供。CGR8胚胎干细胞系维持于BHK-21培养基，所述培养基补充有10%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、1%青霉素/链霉素(Gibco,英杰公司(Invitrogen),美国纽约州格兰德岛;www.invitrogen.com)和白血病抑制因子。CGR8在包被明胶的培养皿上培养。PA6基质细胞系维持于补充有10%胎牛血清的MEM–α培养基(Gibco,英杰公司)。

抗体：使用下列一抗：小鼠抗巢蛋白，小鼠抗神经元核特异蛋白(NeuN)，兔抗酪氨酸羟化酶，大鼠抗多巴胺转运体(DAT)(美国加利福尼亚州蒂梅丘拉的开米康公司(Chemicon)；www.chemicon.com)，小鼠抗酪氨酸羟化酶(美国加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology Inc.)；www.scbt.com)，小鼠抗β-III微管蛋白(美国密苏里州圣路易斯的西格玛—奥德里奇公司；www.sigmaaldrich.com)，和兔抗β-III微管蛋白(美国新泽西州普林斯顿的科文斯公司(Covance)；www.covance.com)。使用下列荧光团标记的二抗：Alexa Fluor(555或488)标记的来自山羊或者驴抗小鼠、山羊或兔(美国俄勒冈州尤金的分子探针公司(Molecular Probes)；probes.invitrogen.com)的抗体；Cy5偶联的驴抗小鼠IgG，PE-Cy5.5山羊抗兔IgG(美国杰克逊免疫研究实验室(Jackson Immunoresearch Laboratories)；www.jacksonimmuno.com)。

流式细胞术：根据生产商推荐用1.25μmol/L 5,6-羧基-荧光素-琥珀酰亚胺-酯(CFSE,西格玛(Sigma),城市?)标记细胞。使用下列抗体针对巢蛋白和β-III微管蛋白。对于胞内检测，细胞用0.5%多聚甲醛在恒定搅拌下室温固定10分钟，然后用适当稀释于PBS中的抗体孵育(45分钟)，PBS含有0.2%曲通X-100和10%胎牛血清。细胞用PBS淋洗2次，用合适二抗孵育45分钟，清洗，然后进行荧光活性细胞分选(FACS)分析。用FACSCalibur流式细胞仪(美国新泽西州富兰克林湖的BD公司(Becton Dickinson)；http:www.bd.com)和CellQuest软件分析荧光。

免疫荧光和显微术：含细胞的盖玻片用含2%多聚甲醛的PBS室温固定15分钟，然后再用含0.2%曲通X-100的PBS透化30分钟。PBS清洗后，盖玻片用适当稀释于PBS中的一抗于+4°C孵育过夜，PBS含有1%胎牛血清。PBS清洗后，盖玻片用合适稀释的二抗室温孵育1小时，再次清洗，用300nM 4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)孵育15分钟。细胞在PBS中清洗并用水淋洗，然后纳入FluorSave封固介质(美国加利福尼亚州圣地亚哥的卡巴开公司(Calbiochem)；www.emdbiosciences.com)。通过imageXpress自动荧光显微镜用MetaXpress软件进行自动成像(分子探针公司，城市，国家)。

ESC的神经分化：ESC用PBS清洗，然后以低密度(100个细胞/平方米)接种在经辐射(5000rad)PA6的汇合层上。分化培养基包含：GMEM，15%敲除血清替换，2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1mM非必需氨基酸，0.1mMβ-巯基乙醇，1%青霉素/链霉素(Gibco,英杰公司)。在一些实验中，经历神经分离的细胞用0.5%胰蛋白酶/EDTA分开并以5000个细胞/平方米的密度再接种于多鸟氨酸包被的细胞培养皿(0.001%)上。

拟胚体生成：CGR8用PBS清洗一次，用0.5%胰蛋白酶/EDTA分离。细胞在无白血病抑制因子的培养基中稀释，将含500个细胞的20μl液滴置于细胞板覆盖面。2天后，将形成拟胚体的细胞收集于10ml超低粘附板，再放在培养箱中3天。在第5天，拟胚体接种于明胶包被的培养皿。首个拟胚体在第7天开始跳动。每2天更换培养基。

慢病毒载体和ESC转导：为产生进入载体，用

BP clonase酶混合物(英杰公司)将启动子(eta-IIIp和Tα-1)和感兴趣的基因(GFP和H2B-mRFP1)分别克隆到pDONRP4-P1R和pDONR221内。然后，用

LR与clonase酶混合物(英杰公司)将所得进入载体重组入2K7_bsd或2K7_neo慢病毒载体。通过用磷酸钙在293T细胞中瞬时转染来生成慢病毒载体粒子。72小时后收集含慢病毒载体的上清，经0.45-μm孔径聚醚砜膜过滤并通过超滤(50,000x g，90分钟，4°C)浓缩120倍。团块重悬于ESC培养基并随后加至靶细胞。转导后3天，添加杀稻瘟菌素(7.5μg/ml)或新霉素(400μg/ml)到培养基且所述选择维持6天(杀稻瘟菌素)或10天(新霉素)。

微阵列：用RNA迷你试剂盒(凯杰公司(Quiagen)，城市，国家)分离总RNA并在安捷伦(Agilent)2100生物分析仪(美国加利福尼亚州帕洛阿尔托的安捷伦科技公司(Agilent Technologies))上通过毛细管电泳对RNA完整性进行质量控制。用Illumina TotalPrep RNA扩增试剂盒(安碧公司(Ambion)，城市，国家)扩增500ng并标记。在安捷伦2100生物分析仪上通过毛细管电泳评价cRNA质量。根据生产商说明在人表达阵列(亿明达公司(Illumina)，城市，国家)进行杂交。

用Illumina Beadstudio 3.1.3标准化和分析数据(背景修正和分位数标准化)。各样品的表达概况输入GeneSpringGX 7.3.1(安捷伦科技公司)。除了表达值，Illumina BeadStudio软件计算检测p值。基于此，各探针赋予检测标志(P(存在):p<0.045;M(边际):p为0.050-0.045,A(缺失):p>0.05)。为鉴定差异性表达的转录本，进行斯氏t检验和/或ANOVA及其它过滤步骤。用MetaCore软件(www.genego.com)进行功能性实体的富集分析。

细胞发生和分子分析：ESC用50ng/ml秋水仙胺(英杰公司)处理4小时。有丝分裂停滞细胞用0.075M KCl低渗处理5分钟，通过用卡诺固定液(甲醇:乙酸=3:1,v/v)更换溶液3次来固定，之后含细胞的溶液在载玻片上铺开。染色体随后根据标准过程进行G显带。根据生产商方案用以～20kb分辨率涵盖全基因组的小鼠基因组CGH微阵列试剂盒244B(安捷伦科技公司)进行寡核苷酸阵列-比较基因组杂交(阵列-CGH)分析。用安捷伦CGH analytics 3.4软件，采用统计算法z计分和ADAM-2，根据各为2.5和6.0的敏感性阈值且移动平均窗口为0.2Mb来分析数据。用NCBI数据库Build 37(www.ncbi.nlm.nih.gov)在小鼠基因组序列上分析图谱数据。

实施例2

胚胎干细胞内的细胞多样性：多能克隆亚系显示独特的分化潜能

衍生自早期内部细胞团(ICM)的胚胎干细胞(ESC)由理论上同质的多能细胞构成。此研究设计成测试此构想，使用的实验条件能鉴定衍生自一个母本ESC的后代。流式细胞术和实时成像分析证明一些定向神经分化的个体ESC产生早期逃脱所需表型的后代。这不是由于延迟分化程序而是由于个体母本ESC产生神经元能力的显著变化，因此提高ESC中克隆多样性的可能性。为进一步证实此假设，通过有限稀释法从小鼠ESC产生克隆亚系。这些克隆系的转录组分析显示基因表达概况的显著差异，尽管所有克隆的多能标记物(包括Oct4、Nanog、Sox2、Klf4)表达水平相当。不同克隆在表型分化试验以及拟胚体内基因表达中都显示不同的分化潜能。为证明这些发现的更广应用性，从另一ESC系产生克隆。这些克隆亚系还显示其分化潜能有显著个体性。综合这些观察，证明多能ESC由分化潜能不同的单独细胞类型组成。这些发现不仅鉴定用于生物学理解ESC的新元素，还提供未来在体外和体内应用中有重要潜能的新工具。

ESC分化产生早期逃脱神经命运的增殖细胞

ESC分化期间，通常一部分细胞未获得所需细胞表型。尽管这可能是由于非同步性，即某亚群延迟向成熟过程进化，某细胞亚群可能由于对分化方案的固有抗性而逃脱所需分化。为解决此问题，发明人开发了将免疫检测分化标记物与分析细胞分裂联合的流式细胞测定。

小鼠CGR8ESC以低密度在经辐射基质细胞(PA6)汇合层上培养5天(Shintani等,2008)从而诱导早期分化，且当需要时分离并接种于多鸟氨酸以向更高级神经分化进展。未分化ESC对巢蛋白和β-III微管蛋白为阴性(图1A，左图)。在分化第5天，观察到2种标记物的细胞表达的复合模式(图1A，右图)，有β-III微管蛋白阳性、巢蛋白阴性神经元细胞，巢蛋白阳性β-III微管蛋白阴性前体细胞，和小群双阳性过渡细胞。应注意，观察到相当大群体的双阴性细胞，但这些不是由于亚群延迟离开多能状态，因为巢蛋白阳性和阴性群体中分化5天后的SSEA-1表达都消失(图1B)。

还用荧光探针羧基-荧光素-琥珀酰亚胺-酯(CFSE)监控细胞分裂的同步性(Lyons,2000)。CFSE是稳定且无毒的荧光染料，每次细胞分裂后在子细胞中稀释50%，从而允许流式细胞术定量有丝分裂事件数量。非分裂细胞维持CFSE荧光的起始水平，分裂的细胞随着分裂数量而损失荧光。如单相CFSE柱状图所示，大部分细胞在早期神经分化中分裂(图1C，左图)。相反，多相CFSE柱状图显示细胞亚群在后期神经分化中减缓或停止分裂(图1C，右图)。

然后，在接种于多鸟氨酸后24、48和72小时，分析晚期神经分化中细胞增殖与细胞分化标记物的关系(图1D)。接种后2天，神经元亚群(巢蛋白阴性/β-III微管蛋白阳性)减缓其增殖(较高CFSE强度)，相比之下神经上皮细胞(巢蛋白阳性/β-III微管蛋白阴性)和非神经细胞(巢蛋白阴性/β-III微管蛋白阴性)积极增殖(较低CFSE强度)。再接种后3天，神经元群体包括明确停止分裂的细胞，而非神经细胞和神经上皮细胞继续分裂。应注意，在3种亚群内观察到对应不同CFSE强度的数个峰，证明它们之间还有异质性。

总之，这些观察显示所有ESC起始分化程序，但一些细胞在极早期逃脱神经命运并产生混合培养物，其中有丝分裂后神经元与增殖神经祖细胞和非神经细胞共存。此逃脱响应可通过定向神经分化的ESC中的异质性得到解释。

定向神经分化的个体ESC产生确定的后代

然后研究ESC中异质性的假设。设计实验条件，从而允许鉴定完全衍生自一个个体ESC的后代。通过将ESC以极低密度接种于PA6基质细胞上来诱导神经分化。这些条件下，单一ESC产生经历分化的集落，可监控各后代性质。3天后，ESC衍生集落为异质性。一些集落包括具有神经表型(巢蛋白+和β-III微管蛋白+)的细胞，而其它集落是非神经(双阴性)(图2A)。此观察表明衍生自单一ESC的后代性质有强烈变化。定量显示3天后一半集落包括β-III微管蛋白+的神经元细胞(图2B)。在分化的较晚期，25%集落包括有多巴胺能表型的神经元(酪氨酸羟化酶阳性(TH)+)，10%集落包括成熟阶段神经元(NeuN+)(图2B)。用2种其它神经前体细胞标记物Pax-6和Sox-1确认集落间的异质性。用遗传修饰的ESC细胞系确认神经定向集落间的异质性，所述细胞系在早期神经特异启动子Tα1控制下表达绿色荧光蛋白(GFP)(Suter等,2009)。根据前面的观察，定向神经分化的ESC-Tα1-GFP诱导GFP+和GFP-集落(图2C)，确认神经与非神经后代共存。因此，一些细胞逃脱神经命运的能力与其衍生来源亲代细胞的性质相关。

用基于启动子/报道基因的方法更详细分析在不同后代间观察到的变化。开发了遗传修饰的CGR8ESC系以在β-III微管蛋白启动子(βIIIp)控制下表达GFP。这些ESC-βIIIp-GFP细胞共转导有表达单体红色荧光蛋白(mRFP1)的慢病毒载体，所述mRFP1融合了H2B组蛋白以靶向细胞核。这使得ESC-βIIIp-GFP-H2B-mRFP1能通过荧光显微镜呈现，因为其核为红色荧光。β-III微管蛋白启动子在未分化ESC中有低水平组成型活性。相反，GFP表达在非巢蛋白的神经群体中降低(图7A)，而β-III微管蛋白+的神经元细胞中诱导更高的GFP表达(图7B)。ESC-βIIIp-GFP-H2B-mRFP1接种于PA6上以用于神经分化，用自动高通量成像系统(ImageXpress，分子仪器公司(MolecularDevices))在2天中跟踪数个单独ESC。成像证实未分化ESC-βIIIp-GFP-H2B-mRFP 1表达背景水平的GFP并在接种后迅速分裂。在一些集落中，在ESC衍生后代中维持或增加GFP表达(图2D，集落1)。在其它集落中，所有细胞内的GFP表达迅速消除(图2D，集落2)，证实一些个体ESC产生非神经后代。最后，还观察到其中仅部分细胞关闭GFP表达的集落(图2E)，表明衍生自一个单独ESC的后代还可以是神经和非神经细胞的混合物。

从实时成像影片中建立包括GFP表达的发生树。所有分析的发生树无一相同，因此确认后代的独特性衍生自个体ESC。例如，可观察到部分(图A、B、D)或全部(图8C)后代关闭GFP表达。在其它集落中，2天后启动子在大部分细胞中保持活性(图8D)。有趣的是，关闭GFP表达的细胞经常完全衍生自通过第一次分裂产生的2个子细胞中的一个。相反，保持GFP表达的细胞衍生自另一子细胞，表明第一次分裂生成会分别产生各不相同后代的不同子细胞。

总之，这些观察证实个体ESC产生确定的后代且不共有产生神经后代的相同潜能。

对应早期多能ICM的ESC中的克隆多样性

观察到同一培养中的个体ESC不共有相同神经原性潜能，这可通过个体间的异质性或引发ESC神经分化决定的随机性来解释。研究单细胞水平上ESC间个体性的假设。通过有线稀释法由ESC衍生7个克隆亚系。首先研究各克隆亚系的多能表型。大部分所测试亚系表达早期ICM的多能细胞标记物，包括rex-1、碱性磷酸酶、Oct-4、Nanog、Klf-4、Sox-2、Klf-2、Pecam-1和Pramel-4(图3A)。值得注意的是，大部分克隆中发现Stella表达，但表达水平不同。将一个克隆系(克隆5)从研究中排除，因为它表达原始内胚层标记物。

然后，分析克隆ESC亚系的基因组结构。对不同克隆(克隆1-7)进行标准染色体核型分析(G显带)。在2个培养时间间隔(传代10和16)评估染色体数量和染色体异常的存在(表2)。除克隆7的传代16外，大部分克隆显示细胞镶嵌现象。克隆3在传代20时的正常2n=40频率值为36%，且在传代16时多至60%(表2)。分析还显示存在染色体异常。克隆1、2、6和7显示相同结构重排，在2种传代都存在不明衍生染色体(der)。此重排染色体存在于超倍体41,XY优势细胞群中(图9)。还通过分子核型分析(阵列-CGH)对克隆进行高分辨基因组分析。此分析显示在所有分析克隆中存在共同的小于1Mb的复制和部分缺失(表3)。值得注意的是，染色体X上的复制存在于克隆1和2中，但其它克隆中没有。弃去的克隆5显示以缺乏5qE1区域为特征的不同基因组概况。总之，这些结果表明除克隆5之外的克隆的基因组结构类似且未显示主要异常。

表2.通过G显带对ESC克隆进行标准核型分析

表3.克隆中的基因组不平衡。报道感兴趣区域的拷贝数变化以及其图谱位置(细胞遗 传学带和起始-结束寡核苷酸位置(genome.ucsc.edu,基因组装配2006年3月)。

通过微阵列对无明显基因组异常的克隆亚系(即克隆1、2、3、4、6、7)进行总mRNA表达分析。6800个基因的表达在克隆系之间显著变化(用ANOVA统计检验的方差分析)。对各克隆ESC进行这6800个基因表达概况的数学分析可允许分级群聚(图3B)。最不同的克隆ESC是克隆1和2。相反，克隆2更类似克隆3，以及克隆4/克隆6对。图10小结了克隆1和2间差异性表达的基因家族(来自公共数据库GO方法(Metacore软件)；www.genego.com)。2个克隆间差异性表达的约一半基因分类在发育过程中，包括神经元生成。还分析所有克隆系间最重要变化的性质。表4中，列出了显示不同克隆间定量上最重要的表达水平差异的30个基因。所述列表包含数组基因：i)3种鸟苷酸结合蛋白(Gbp1,2,3)；ii)3种角蛋白(Krt 8.18,19)；iii)2种碳酸酐酶(Car2,4)。还要注意胰岛素样生长因子(Igf2)与胰岛素样生长因子结合蛋白3(Igfbp3)这一对，以及数个转录因子。

表4克隆1、2、3、4、6和7间mRNA表达的30种最重要变化的分类。

表4中，比较克隆间所有转录物的表达水平。对应于标准偏差的值用克隆间平均转录物表达来标准化。将所有转录物根据标准偏差与表达水平之比来分类。表格提供与更高比例相关的头30个基因的列表。

发明人假设这些mRNA表达水平差异可产生不同克隆的特定分化途径倾向。为研究功能水平的变化，克隆ESC通过与PA6基质细胞共培养来定向神经分化。所有系诱导神经和非神经集落。然而，克隆间的神经和非神经集落之比不同。克隆2和6产生的含神经上皮细胞(巢蛋白+)的集落百分数显著高于克隆7(图4A)。通过神经元βIII-微管蛋白染色确认克隆2和6的能力增加(图4B)。分化1周后并与这些观察一致，克隆7产生具有TH多巴胺能神经元的集落的能力较低(图4C)。值得注意的是，克隆1诱导的TH阳性集落数量高于其它克隆。克隆的心原性潜能也不同。克隆2和3产生跳动心肌细胞的效率显著高于克隆4。相反，克隆1不能有效产生心脏细胞(图4D)。

合适条件下，所有亚系能产生漂浮拟胚体。然后，2周后在拟胚体中定量与不同胚层/细胞类型相关的基因表达。所有所分析基因的表达在克隆间都有不同(图5A-H)。观察到外胚层Zic1(图5A)和神经外胚层nkx2.2(图5B)的异质表达，表明ESC克隆神经原性潜能的变化。还用内胚层基因Foxa2观察到异质性(图5C)。克隆2和3诱导较高水平的心脏标记物Myh7(图5D)，而在克隆7中生成更多肝甲胎蛋白(图5E)。还观察到克隆产生胰岛素(图5F)，以及产生中胚层Tal1(图5G)和肌肉细胞辅肌动蛋白1(图5H)的能力不同。

总之，这些数据显示克隆系不共有相同的分化潜能且确认同一培养中的个体多能ESC在功能上异质。

还在另一ESC系(D3)中测试克隆异质性的构想。通过有限稀释法从D3产生亚系，各克隆进行基因组分析和总基因表达分布概况分析。如CGR8系所观察到的，亚系中没有主要的基因组异常。完成基因表达阵列且在克隆中检测所有对应早期ICM的多能标记物(图6A)。D3亚系产生集落的能力显著不同，所述集落包括βIII-微管蛋白+的神经元(图6B)、NeuN+的成熟阶段神经元(图6C)和TH+的多巴胺能神经元(图6D)，证实了ESC中的细胞个体性。

参考文献

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Claims (60)

1.一种生成细胞克隆群的方法，所述方法包括：

a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞在体外扩增并维持于未分化或基本未分化状态；

b)将所述群中的个体细胞扩增成细胞克隆群；和

c)选择一个或多个细胞克隆群，所选细胞克隆群确定能分化成对任一神经细胞、肝细胞、或心肌细胞至少约50%同质的群体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选定的细胞克隆群显示心原性分化潜能。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约65%心肌细胞。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约75%心肌细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约90%心肌细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是人胚胎干细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选定的细胞克隆群显示神经原性分化。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约65%神经细胞。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆群显示能分化成至少约75%神经细胞。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是多巴胺能神经元。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是人胚胎干细胞。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞选自下列细胞：H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BG01、BG02、BG03、HSF1、HSF6、H1、H7、H9、H13B和H14。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是诱导多能细胞(iPSC)。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述iPSC选自下列细胞：iPS 6.1、iPS 6.6、iPS、iPS 5.6、iPS 5.12、iPS 5.2.15、iPS 5.2.24、iPS 5.2.20、iPS 6.2.1,和iPS 5/3-4.3。

15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括扩增所选细胞克隆群。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括群确定细胞是否能分化成对任一神经细胞、肝细胞或心肌细胞至少约50%同质的群体。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供所选细胞克隆群。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制备用于储存或运输的选定细胞克隆群。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述制备用于储存或运输的细胞包括冷冻所述细胞。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将扩增的细胞接触测试化合物并测量与所述扩增细胞内毒性相关的细胞参数。

21.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆群可通过接触分化剂而分化成含有至少约50%心肌细胞的细胞群。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞克隆群是人细胞。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多潜能或多能细胞在所述个体化前传代至少1次。

24.如权利要求1所述方法生成的多种克隆衍生心肌细胞。

25.如权利要求24所述的心肌细胞，其特征在于，所述心肌细胞包括在组织中。

26.如权利要求25所述的心肌细胞，其特征在于，所述组织包括在合适容器用具中。

27.如权利要求26所述的心肌细胞，其特征在于，所述多种克隆衍生心肌细胞组织包括在容器用具中。

28.一种组合物，所述组合物包括如权利要求1所述方法生成的多种克隆衍生心肌细胞和药学上可接受载体。

29.一种制备显示神经分化潜能提高的细胞克隆群的方法，所述方法包括步骤：

a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；

b)从所述多潜能或多能细胞群个体化并扩增多个细胞；

c)测试扩增自所述个体化细胞的细胞分化成神经细胞类型的能力；和

d)选择扩增细胞，所述细胞可通过接触分化剂而分化成至少约50%神经细胞。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述扩增细胞可分化成75%多巴胺能神经元。

31.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述多能或多潜能细胞是多能细胞。

32.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是人胚胎干细胞。

33.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述人胚胎干细胞选自下列细胞：H1、H9、hES2、hES3、hES4、hES5、hES6、BG01、BG02、BG03、HSF1、HSF6、H1、H7、H9、H13B和H14。

34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述多能细胞是诱导多能细胞(iPSC)。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述iPSC选自下列细胞：iPS 6.1、iPS 6.6、iPS、iPS 5.6、iPS 5.12、iPS 5.2.15、iPS 5.2.24、iPS 5.2.20、iPS 6.2.1和iPS 5/3-4.3。

36.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将神经细胞接触测试化合物并测量与所述神经细胞内毒性相关的细胞参数。

37.如权利要求1所述方法生成的多种克隆衍生神经细胞。

38.如权利要求37所述的神经细胞，其特征在于，所述神经细胞包括在组织中。

39.如权利要求38所述的神经细胞，其特征在于，所述组织包括在合适容器用具中。

40.如权利要求37所述的神经细胞，其特征在于，所述多种克隆衍生神经细胞组织包括在容器用具中。

41.一种组合物，所述组合物包括如权利要求1所述方法生成的多种克隆衍生神经细胞和药学上可接受载体。

42.一种筛选测试化合物的方法，所述方法包括：

a)将多种心肌细胞、肝细胞或神经细胞接触测试化合物；和

b)测定由接触测试化合物引起的任何细胞表型或活性变化，

其中所述细胞通过权利要求1所述方法生成。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述表型或活性是毒性的量度。

44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，在多种心肌细胞或神经细胞中测量一种或多种基因的表达。

45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述一种或多种基因包括至少一种选自下组的基因：半胱天冬酶3、NF-kB,TNF-α、热诱导因子(HIF-1α)、热激蛋白(Hsp)、转氨酶、γ-谷氨酰转移酶和碱性磷酸酶。

46.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述基因表达用高通量基因测序、蛋白质印迹、基因表达阵列、流式细胞术、免疫荧光、基于启动子/报道基因的试验或比色分析来测量。

47.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述测定任何表型或活性变化包括评价选自下组的参数：心肌细胞收缩、细胞死亡、动作电位模式和离子渗透性。

48.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述多能或多潜能细胞是人细胞。

49.一种生成显示心原性分化潜能的细胞克隆群的方法，所述方法包括步骤：

a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；

b)将所述群体的个体化细胞扩增成细胞克隆群；

c)选择一种或多种细胞克隆群，所选细胞群确定为能分化成对心肌细胞至少约50%同质的群体；和

d)根据步骤(c)中观察到的扩增细胞分化成心肌细胞的能力，将所选细胞用于细胞和组织改造、药物筛选或细胞治疗。

50.一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予对象基本同质的神经细胞群，其中生成所述神经细胞的方法包括：

a)获得多能或多潜能细胞群，所述细胞体外扩增并维持未分化或基本未分化状态；

b)将所述群体的个体化细胞扩增成细胞克隆群；

c)选择一种或多种细胞克隆群，所选细胞群确定为能分化成对神经细胞至少约50%同质的群体；和

d)提供一种或多种选定细胞群的细胞或其后代。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述神经细胞是多巴胺能神经元。

52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述疾病是帕金森病。

53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述多巴胺能神经元注射入包括至少一部分黑质致密部的区域。

54.如权利要求50所述的方法，其特征在于，注射约100,000-约10,000,000个细胞。

55.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述对象是人。

56.一种治疗对象中心脏病的方法，所述方法包括给予对象由步骤1所述方法生成的多种克隆衍生心肌细胞，其中心脏病得以治疗。

57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述对象鉴定为患缺血性心脏病的对象。

58.如权利要求56所述的方法，其特征在于，包括静脉内、动脉内或心肌内给予所述心肌细胞。

59.如权利要求56所述的方法，其特征在于，还包括进行用于治疗心脏病的一种或多种辅助治疗形式。

60.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述对象的心脏功能得以改善。

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