WO2015012438A1 - 파골 세포 분화 억제용 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

파골 세포 분화 억제용 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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김은미
이응지
이태훈
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide for inhibiting osteoclast differentiation and its use.
  • Bone homeostasis and the structural shape of the skeleton are maintained by organized activity between osteoclasts that absorb bone and osteoblasts that form bone.
  • Osteoclasts which are multinuclear cells, are differentiated from hematopoietic stem cells [T. Miyamoto, 0. Ohneda, F. Arai, et al. , Blood 98 (2001) 2544-2554.] Differentiation into osteoclasts is regulated by RANK ligands secreted from osteoblasts and activated T lymphocytes [Y.Y. Kong, U. Feige, I. Sarosi, et al. , Nature 402 (1999) 304-309.
  • RANKL receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand binds to RANK, a receptor present in osteoclast precursors, and induces osteoclast differentiation when macrophage- colony stimulating factor (M-CSF) is present.
  • M-CSF macrophage- colony stimulating factor
  • RANKL activates signaling pathways that regulate osteoclast formation and bone resorption [J. Li, I. Sarosi, XQ Yan, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 1566-1571.].
  • RANK does not have tyrosine kinase activity and induces signaling through an adapter protein known as TRAFsCTNF receptor-associated factors [L. Galibert, ME Tometsko, DM Anderson, et al.
  • TRAF6 part of the molecule in the cell, plays an important role in osteoclast production and activates various subsignals [M. A. Lomaga, WC Yeh, I. Sarosi, et al. , Genes Dev. 13 (1999) 1015-1024 ⁇ . TRAF6 binds to the cytoplasmic domain of RANK, and then NF- ⁇ and AP-1 (activator protein- 1) [SL Teitelbaum, J. Clin. Invest. 114 (2004) 463-465.
  • Tumor necrosis factor (TNF)- ⁇ is a TNF ligand family protein that is secreted by a variety of cells, including monocytes / macrophages or osteoclasts, and has two cell membrane receptors known as TNFR1, TNFR2CTNFR p55 and TNFR p75).
  • TNFR1 and TNFR2 induce intracellular signals that can promote the proteolysis of ⁇ , a cytoplasmic inhibitor of NF- ⁇ [Verma, IM, Stevenson, JK, Schwarz, EM, Van Antwerp, D., and Miyamoto, S. (1995) Genes Dev. 9, 2723-2735].
  • TNF- ⁇ promotes bone absorption in / bit and phosphorus w / ⁇ Bertolini, DR, Nedwin, GE, Bringman, TS, Smith, DD, and Mundy, GR (1986) Nature 319, 516-518], Induced secretion of RANKL in osteoblasts [Hofbauer, LC, Lacey, DL, Duns tan, CR, Spelsberg, TC, Riggs, BL, and hosla, S. (1999) Bone 25, 255-259].
  • TNF- ⁇ has also been shown to play an important role in the causes of bone and joint destruction in rheumatoid arthritis, as well as in various forms of periodontitis, dissociation after orthopedic transplantation, and chronic inflammatory bone resorption. .
  • TNF-a is mediated by osteoclasts stimulated by Lipopolysaccharide (Abu-Amer, Y., Ross, FP, Edwards, J., and Teitelbaum, SL (1997) J. Clin. Invest. 100, 1557-1565.
  • TNF- ⁇ plays an important role in bone loss caused by estrogen deficiency in postmenopausal osteoporosis [Cenci, S., Weitzmann, MN, Roggia, C., Namba, N., Novack, D., Woodring, J. , and Pacifici, R. (2000) J. Clin. Invest. 106, 1229-1237.
  • IL (interleukin) -3 a cytokine secreted primarily by activated T lymphocytes, can serve as a link between immune and hematopoietic stem system [JW Schrader, Inter leukin-3, in: AW Thomson, MT Lotze (Eds) .), Academic Press, London, UK, 2003, pp. 201-225].
  • IL-3 not only acts directly on mouse osteoclast precursors, but also causes cell differentiation towards macrophages. Inhibits osteoclast differentiation induced by RANKL [SM Khapl i, LS. Mangashett i, SD Yogesha, MR Wani, J. Immunol. 171 (2003) 142-151.
  • IL-3 inhibits the phosphorylation and degradation of ⁇ , thereby impeding the migration of RANKL-induced NF- ⁇ to the nucleus.
  • it inhibits the activity of RANKL-induced JNK (c-Jun N-terminal kinase) and down-regulates the expression of C- F 0S and NFATcl transcription factors.
  • the present inventors have tried to develop a substance having the same or similar function as IL-3 (Inter leukin 3), but having better activity and stability than a natural IL-3 protein. As a result, the present inventors have completed the present invention by selecting IL-3-derived peptides having excellent physiological activity (eg, osteoclast differentiation inhibitory ability, bone differentiation promoting ability, etc.) among many peptide candidates.
  • IL-3 Inter leukin 3
  • physiological activity eg, osteoclast differentiation inhibitory ability, bone differentiation promoting ability, etc.
  • an object of the present invention is to provide a peptide consisting of the amino acid sequence of the first sequence or the second sequence of the sequence listing.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for improving or treating bone disease.
  • Another object of the present invention to provide a composition for promoting bone differentiation.
  • Another object of the present invention is to provide a method for promoting bone differentiation.
  • the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 sequence.
  • the present inventors have tried to develop a substance having better activity and stability than natural IL-3 protein while maintaining the same or similar function as IL-3 (Inter leukin 3).
  • the present inventors selected IL-3-derived peptides having excellent physiological activity (for example, osteoclast differentiation inhibitory ability, bone differentiation promoting activity, etc.) among many peptide candidates.
  • IL-3-derived peptides exhibiting the above-described properties based on sites relevant to the function of human IL-3. More specifically, by selectively partially synthesizing the various sites of the IL-3 protein to search for a binding site for the receptor protein, the amino acid sequence of the predicted site is optimized to selectively select the peptide of the present invention. By screening the peptides having the highest activity among these candidate ptides, peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of the present invention were prepared.
  • the peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of the present invention are derived from human IL-3 (GenBank Accession Number, AAH66275.1; SEQ ID NO: 3). It is illustrated in Table 1.
  • Peptides of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of the present invention is a peptide having an activity similar to that of growth factor by binding to its receptor by performing a similar action as natural IL-3.
  • the peptides of the present invention not only had a potent inhibition of osteoclast differentiation at treatment concentration-dependently, but also significantly promoted osteoblast differentiation (see FIGS. 3 to 8).
  • the peptides of the invention inhibit RANKL (receptor act ivator of nuclear factor kappa-B 1 igand) -RANK signaling pathway.
  • the peptides of the present invention significantly inhibited the activation and nuclear metastasis of RAN L-mediated NF- ⁇ (see FIGS. 7A and 7B).
  • the peptides of the present invention inhibits the expression of K or type 1 or type 2 TNF receptors.
  • the above-described inflammatory cytokines may be tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ , macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), inter leukin (IL) -IL3, IL-6, and IL-7. More specifically TNF-a, IL- ⁇ and IL-6, and more specifically TNF-a and IL- ⁇ , most specifically TNF-a.
  • TNF tumor necrosis factor
  • M-CSF macrophage colony-stimulating factor
  • IL inter leukin
  • IL-7 inter leukin
  • the peptide of the present invention can promote the differentiation of osteoblasts.
  • the tide of the present invention promotes the expression of osteoblast differentiation markers such as osteocalcin (OCN), osteoprotegerin (OPN), BSPCbone sialoprotein (OPN) and osteopontin (OPN).
  • OCN osteocalcin
  • OPN osteoprotegerin
  • OPN BSPCbone sialoprotein
  • OPN osteopontin
  • peptide refers to a linear molecule formed by binding amino acid residues to each other by peptide bonds.
  • Peptides of the invention are known in the art for chemical synthesis methods, for example solid phase synthesis 7] ⁇ (sol id-phase synthesis techniques; Merrif ield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. Ed., Pierce Chem. Co .: Rockford, 111 (1984)) or liquid phase synthesis techniques (US Pat. No. 5,516,891).
  • the peptide of the present invention has better stability than native IL-3 protein by itself, but may be further improved by modification of amino acids (see FIGS. 2A and 2B).
  • the peptide of the present invention has a very excellent thermal stability compared to the natural IL-3 protein.
  • Natural IL-3 proteins have low stability in temperature and long term storage, as well as manufacturing difficulties and high production costs.
  • the peptide of the present invention can be synthesized at a very low cost and is physicochemically stable at high temperatures, it is possible to reduce the physiological activity. It can be prevented to the maximum and has a more improved therapeutic effect by increasing the remaining period in the body. Therefore, the peptide of the present invention can be advantageously applied to products requiring long-term storage, such as pharmaceuticals, quasi-drugs and cosmetics.
  • the N- or C-terminus of the peptide is an acetyl group, fluorenyl methoxy carbonyl group, formyl group, palmitoyl group, myristyl group, stearyl group and polyethylene glycol (PEG) Protecting groups selected from the group consisting of may be combined.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for improving or treating bone disease, comprising the above-mentioned peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for promoting bone differentiation comprising the above-mentioned peptide as an active ingredient.
  • composition of the present invention includes the above-described IL-3-related peptide of the present invention as an active ingredient, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • bone disease refers to a disease, condition or condition associated with RANKL-mediated signaling, including a disease, condition or condition associated with the regulation of bone formation and resorption, as well as bone loss, osteoporosis and bone And bone loss reduction disorders, including dissolution.
  • the bone disease that can be improved or treated by the pharmaceutical composition of the present invention is osteoporosis, boyhood osteoporosis, osteoplasia, osteomalacia, osteonecrosis, rickets, osteomyelitis, alveolar bone loss, bone wave Paget's di sease, hypercalcemia, primary hyperparathyroidism, metastatic bone disease, myeloma, bone loss in rheumatoid arthritis, Metastatic bone disease, bone loss caused by cancer, fibrotic dysplasia, aplastic bone disease, metabolic bone disease, and loss of bone mass with age.
  • compositions of the present invention comprise (a) a pharmaceutically effective amount of a peptide exhibiting the activity of the IL-3 protein of the invention described above; And (b) it can be used as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity of the IL-3 related 3 ⁇ 4 tide described above.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propylhydroxy banzoate, talc, stearic acid magnesium and mineral oil It includes, but is not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a sulfate, a glycerol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannito
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection intramuscular injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, or the like.
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction response. Usually, a skilled practitioner can easily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment or prophylaxis. According to a preferred embodiment of the present invention, the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.0005-1, 000 rag / kg.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by one of ordinary skill in the art.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of axes, powders, granules, tablets, accelerators or gels (eg hydrogels), and may further include dispersants or stabilizers.
  • composition of the present invention comprises: (a) a cosmetically effective amount of the above-described IL-3-derived peptide of the present invention (cosmetically ef fect ive amount); and (b) a cosmetic comprising a cosmetically acceptable carrier.
  • a cosmetically effective amount means an amount sufficient to achieve the efficacy of the composition of the invention described above.
  • Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps, surfactants-containing It may be formulated as cleansing, oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation, spray, and the like, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder.
  • the carrier components include animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide. Can be used.
  • lactose When the formulation of the present invention is a powder or a spray, lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, and especially in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, a solubilizer or an emulsifier is used as a carrier component, for example, water, ethane, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, Fatty acid esters of 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycols or sorbitan.
  • suspensions such as water, ethane or liquid diluent such as propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbide esters and polyoxyethylene sorbitan esters are used as carrier components.
  • ethane or liquid diluent such as propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbide esters and polyoxyethylene sorbitan esters
  • carrier components Firstly, microcrystalline salose, aluminum metahydroxy : bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention include components commonly used in cosmetic compositions, in addition to peptides and carrier components as active ingredients, and include, for example, antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. Phosphorus adjuvant.
  • the present invention provides a method for improving or treating bone disease, comprising administering to a subject a composition comprising the above-mentioned peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for promoting bone differentiation, comprising contacting a cell with a composition comprising the above-mentioned peptide as an active ingredient.
  • the peptide of the present invention may not only have the same or similar function as that of natural IL (inter leukin) -3, but also have a small size. Very good skin permeability.
  • the peptide of the present invention inhibits the activation and nuclear transfer of NF- ⁇ ⁇ through RAN L (receptor act ivator of nuclear factor kappa-B igand) -RANK signaling pathway as well as RANKL or inflammatory cytokine- Osteoclast differentiation is inhibited treatment-dependently by inhibiting the expression of induced tart rate-resistant acid phosphatase (TRAP), cathepsin K or type 1 or type 2 TNF receptors.
  • RAN L receptor act ivator of nuclear factor kappa-B igand
  • the peptide of the present invention may contribute to osteoblast differentiation by promoting the expression of osteoblast differentiation markers such as osteocal cin (OCN), osteoprotegerin (OPN), bone sialoprotein (BSP) or osteopont in (OPN).
  • osteoblast differentiation markers such as osteocal cin (OCN), osteoprotegerin (OPN), bone sialoprotein (BSP) or osteopont in (OPN).
  • FIG. 1 is a graph showing the results of high performance liquid chromatography analysis of the peptides of SEQ ID NO: 1 (Fig. La) and SEQ ID NO: 2 (Fig. Lb) prepared by Synthesis Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the peptide stability test results of the sequence tree specific first sequence (FIG. 2A) and the sequence listing system 2 sequence (FIG. 2B) prepared according to Synthesis Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a result showing the differentiation inhibitory effect of osteoclasts treated with the peptide of the first sequence (Fig. 3a) and the peptide of the second sequence (Fig. 3b) prepared by the synthesis example of the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the inhibitory effect of osteoclast differentiation promoting enzymes when the peptide (4a) of the sequence listing prepared by the synthesis example of the present invention and the peptide of the second sequence of the sequence (Fig. 4b) .
  • FIG. 5 shows osteoclast differentiation markers TRAP and kadepsin (Cathepsin) when the peptide of SEQ ID NO: 1 (FIG. 5A) and the peptide of SEQ ID NO: 2 (FIG. 5B) prepared according to the synthesis example of the present invention.
  • FIG. 6 shows mRNA inhibitory effects of type 1 and type 2 TNF receptors when the peptides of SEQ ID NO: 1 (FIG. 6A) and the peptides of SEQ ID NO: 2 (FIG. 6B) prepared by the synthesis examples of the present invention are treated.
  • Figure 7 is a result showing the RANKL signal inhibition effect when the peptide of the sequence list system 1 sequence prepared by the synthesis example of the present invention (Fig. 7a) and the peptide of the sequence system 2 series (Fig. 7b).
  • FIG. 8 shows the results of promoting osteoblast differentiation when the peptides of SEQ ID NO: 1 (8a) and SEQ ID NO: 2 (8b) prepared by the synthesis example of the present invention were treated.
  • Figure 9 shows the expression of p-Smadl / 5/8, a BMP2 signal in osteoblasts, when the sequence listing system (SEQ ID NO: 1a) prepared by the synthesis example of the present invention and the peptide (9b) of the SEQ ID NO: 2 sequence It is a result showing that increases.
  • CTL resin chloro trityl chloride resin
  • MC methylene chloride
  • DMF dimethylformamide
  • Trt Fmoc-L-Hi s
  • DIEA diisopropyl ethylamine
  • the dissolved amino acid mixture solution was placed in a semi-aerated container with deprotected resin and reacted with stirring at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was removed and stirred three times with DMF solution for 5 minutes and then removed.
  • a small amount of reaction resin was taken to check the degree of reaction using a Nihydrin test.
  • Thr (tBu) -His (Trt) -CTL resin was prepared by deprotection reaction twice as above with deprotection solution. After washing thoroughly with DMF and MC and performing a Kaiser test once again, the following amino acid attachment experiments were performed.
  • Peptides of the standard sequence synthesized in Synthesis Example 1 or SEQ ID No. 2 sequence and standard growth factor (IL-3) purchased from NIBSC (UK) were prepared in a phosphate buffer solution at a concentration of 0.1 mg / ml. The prepared solution was placed in a glass vial of 1 ml each and left at 37 ° C. The solution which was left at 37 ° C was sampled at 0, 1, 3, 5, 10, 20, and 40 days and centrifuged by date to remove denatured peptide or protein, and the supernatant was taken and quantified using HPLC ( 2a and 2b, respectively.
  • the synthesized peptide was sterilized in 10% distilled water and treated together at a concentration of 1 pg / ml or 10 ug / ml for 37 hours. Incubated under ° C, 5% C0 2 conditions. After 72 hours, the medium was exchanged with the same culture medium, and the blank sample and RANKL were 10 ng / ml, TNF- ⁇ 50 ng / ml, and the synthetic peptide was again 1 yg ml and 10 ug / ml for 48 hours. The culture was carried out under the same conditions.
  • Fixation buffer containing 25 ml of citric acid solution, 65 ml of acetone and 8 ml of 37% formaldehyde to remove the culture supernatant and fix the cells after completion of the incubation for a total of 5 days ) was immobilized for 30 seconds using the same, and then washed three times with PBS (phosphate buffer saline). After removal of the wash solution, the cells were stained using a leukocyte alkaline phosphatase kit (Sigma, USA).
  • Figure 3 is a result of the inhibition of differentiation of Raw264.7 cells that can be induced differentiation by RANKL and TNF- ⁇ by IL-3-K Figure 3a) and IL-3-2C Figure 3b).
  • the peptide of the present invention is a result that Raw264.7 cells can inhibit differentiation into osteoclasts by RANKL and TNF- ⁇ .
  • Test Example 3 Confirmation of Inhibitory Effect of Synthetic Peptides on Osteoclast Differentiation
  • RANKL 10 ng / ml or TNF— ⁇ 50 ng / ml and 1 or 10 yg / ml of the peptide synthesized in Synthesis Example 1 were treated with Raw264.7 cells and TRAP activity, an osteoclast differentiation marker after induction of differentiation for 5 days Experiments to determine the degree of inhibition was carried out. After incubation, the culture medium was removed, and then 100 ⁇ l of lysed complete layer solution (20 mM tris buffer, 3% triton X-100) was added to break the cell wall.
  • the peptide synthesized in 1 was treated with 1 or 10 yg / ml and experiments were conducted to confirm the degree of inhibition of mRNA expression of cathepsin K after 3 ⁇ 4 when inducing differentiation for 5 days.
  • Figures 5a and 5b show that the mRNA level of kadipsin K decreases when treated with the peptides of the present invention, respectively.
  • Figures 6a and 6b confirmed that the type 1 or type 2 TF receptor increased when treated with RA L or TNF- ⁇ all reduced their mRNA expression when treated with the peptide of the present invention.
  • the target-toxic primer sequences used for PCR were as follows: TRAP forward primer sequence, 5 ′ ⁇ AAATCACTCrrTAAGAACAG-3 ′ and TRAP reverse primer, 5′-TTATTGAATAGCAGTGACAG-3 ′ (annealing degree, 45 ° C.); Kadipsin K forward primer sequence, 5′-CCTCTCTTGGTGTCCATACA-3 ′ and kadepsin K reverse primer, 5 ′ ′ ATCTCTCTGTACCCTCTCTGCA-3 ′ (annealing temperature, 53 ° C.); GAPDH forward primer sequence, 5′-GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG-3 ′ and GAPDH reverse primer, 5′-CCGTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGT-3 ′ (annealing temperature, 55 ° C.); Type 1 TNF receptor forward primer sequence, 5′-acct 11 acggct t cccagaa-3 ′ and type 1 TNF receptor reverse primer, 5′-tcctt
  • the peptides of the present invention are able to inhibit both TRAP capidine K, which is increased by RANKL and TNF- ⁇ , and both type 1 and type 2 TNF receptors (FIGS. 5A-5B and 6A-6B).
  • Experimental Example 5 Confirmation of signal inhibition of RANKL by synthetic peptide
  • NF- ⁇ a representative signal of RANKL protein
  • the effect of each peptide was confirmed by Western blotting using NF- ⁇ polyclonal antibody (Cat. No sc-372, Santa Cruz, USA).
  • NF-icB activation and nuclear transfer were confirmed (FIGS. 7A and 7B).
  • the phosphorylation of c-Jun and the phosphorylation of phosphorylated c-Jun were identified in the signal signaling of RANKL protein.
  • the peptide synthesized in Synthesis Example 1 was treated with MC3T3-E1 cells at 10: or 50 tig / ml and induced differentiation for 2 days, followed by OCN (osteocalcin), OPN (osteoprotegerin), BSP (bone sialoprotein) and OPN (osteopontin). ) MRNA experiments of osteoblast differentiation markers were performed. 8 is used for PCR which is a differentiation marker of osteoblasts when the peptide of the present invention is treated.
  • the target-specific primer sequences are as follows: 0CN forward primer sequence, 5′-gcgctctgtctctgacct-3 ′ and 0CN reverse primer, 5′-tttgtaggcggtct tcaagc-3 ′ (annealing temperature, 60 ° C.); OPG forward primer sequence, 5′-ctgcctgggaagaagatcag-3 ′ and 0PG reverse primer, 5′-t tgtgaagctgtgcaggaac-3 ′ (annealing degree, 60 ° C.); BSP forward primer sequence, 5′-aaagt gaaggaaagcgacga-3 ′ and BSP reverse primer, 5′-gttcct tctgcacctgct tc-3 ′ (annealing temperature, 60 ° C.); OPN forward primer sequence, 5′-GATGAATCTGACGAATCTCAC-3 ′ and 0PN
  • the peptide of the present invention can promote osteoblast differentiation by increasing gene expression of osteoblast differentiation markers OCN, OPN, BSP and 0PN.
  • Test Example 7 Confirmation of Signal Promoting Effect of Bone Differentiation by Synthetic Peptides
  • MC3T3-E1 cells were dispensed into 2 x 10 5 cells in 6-well plates at 37 ° C for 24 hours. Incubated under 5% CO 2 conditions. After 24 hours, serum-free medium was exchanged for 24 hours to undergo starvat ion, and then the peptide was treated at 10 pg / ml or BMP2 was used as a positive control at 50 ng / ml. After treatment for minutes, the cells were washed with PBS and lysed in lysis buffer to obtain protein, followed by Western blotting.

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Abstract

본 발명의 펩타이드는 천연의 IL(interleukin)-3의 기능과 동일하거나 또는 유사한 기능을 할 수 있을 뿐 아니라 작은 크기에 따라 피부 투과도가 매우 우수하다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)-RANK 시그널링 경로 억제를 통해 NF-κB의 활성화 및 핵 전이를 억제시킬 뿐 아니라 RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), 카뎁신(cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시킴으로써 파골세포 분화를 처리 농도-의존적으로 억제시킨다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 OCN(osteocalcin), OPN(osteoprotegerin), BSP(bone sialoprotein) 또는 OPN(osteopontin) 같은 조골세포 분화 마커들의 발현을 촉진시킴으로써 조골세포 분화에 기여할 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 또는 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
파골 세포 분화 억제용 펩타이드 및 이의 용도
【기술분야】
본 특허출원은 2013년 07월 23일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0086939 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원와 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 파골 세포 분화 억제용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
뼈 항상성과 골격의 구조적 모양은 뼈흩 흡수하는 파골세포와 뼈를 형성하는 조골세포 사이의 조직화된 활성에 의해 유지된다. 다핵세포인 파골세포는 조혈모세포로부터 분화되고 [T. Miyamoto, 0. Ohneda, F. Arai , et al. , Blood 98 (2001) 2544-2554.] 파골세포로의 분화는 조골세포와 활성화된 T 림포구에서 분비되는 RANK 리간드에 의해 조절된다 [Y.Y. Kong, U. Feige, I. Sarosi, et al. , Nature 402 (1999) 304-309] .
RANKL( receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)은 파골세포 전구체에 존재하는 수용체인 RANK와 결합하고 M-CSF(macrophage- colony stimulating factor)가 존재할 때 파골세포 분화가 유도된다. RANKL은 파골세포 형성과 뼈 흡수를 조절하는 신호전달 경로를 활성화시킨다 [J. Li, I. Sarosi, X.Q. Yan, et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 1566-1571.]. RANK는 타이로신 키나제 활성 (tyrosine kinase activity)을 가지지 않고 TRAFsCTNF receptor-associated factors)라고 알려진 어댑터 단백질 (adaptor protein)을 통해 신호전달을 유도한다 [L. Galibert, M.E. Tometsko, D.M. Anderson, et al . , J. Biol . Chem. 273 (1998) 34120-34127] . 세포 내의 분자 일부인 TRAF6는 파골세포 생성의 중요한 역할을 하고 다양한 하위 신호를 활성화시킨다 [M. A . Lomaga, W.C. Yeh, I. Sarosi, et al. , Genes Dev. 13 (1999) 1015-1024}. TRAF6는 RANK의 세포질의 도메인과 결합한 후， NF-κΒ와 AP-l(activator protein- 1)을 활성화시킨다 [S.L. Teitelbaum, J. Clin. Invest . 114 (2004) 463- 465] .
TNF( tumor necrosis factor)- α는 TNF 리간드 계열 단백질로 이는 단핵세포 /대식세포 또는 파골세포를 포함한 여러 종류의 세포에서 분비되고， TNFR1, TNFR2CTNFR p55와 TNFR p75라고 알려진)라는 두 개의 세포 막 수용체를 통해 여러 가지 생물학적 반웅을 유도하며， TNFR1과 TNFR2 모두 NF-κΒ의 세포질 내 억제제인 ΙκΒ의 단백질 가수분해를 촉진시킬 수 있는 세포내 시그널을 유도한다 [Verma, I. M.， Stevenson, J. K., Schwarz, E. M., Van Antwerp, D.， and Miyamoto, S. (1995) Genes Dev. 9, 2723-2735].
TNF-α는 염증반웅， 면역 조절, 세포증식 및 분화， 세포자살과 같은 다양한 범위의 반웅을 조절한다 [Ledger wood, E. C.， Pober , J. S. , and Bradley, J. R. (1999) Lab. Invest . 79， 1041-1050]. 또한， TNF-α는 / 비트로 및 인 w/ ^에서 뼈 흡수를 촉진하몌 Bertolini, D. R. , Nedwin, G. E., Bringman, T. S. , Smith, D. D. , and Mundy, G. R. (1986) Nature 319, 516-518], 조골세포에서 RANKL의 분비를 유도할 수 있다 [Hofbauer, L. C. , Lacey, D. L. , Duns tan, C. R. , Spelsberg, T. C. , Riggs , B. L. , and hosla, S. (1999) Bone 25, 255-259] . 또한, TNF- α는 류마티스 관절염에서 발생되는 뼈와 관절 파괴의 원인에 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 치주염， 정형외과의 이식 후 해리， 만성 염증성 골흡수의 다양한 형태에서 그 원인으로 기능하는 것으로 밝혀졌다. TNF-a는 리포폴리사카라이드 (Hpopolysaccharide)에 의해 자극된 파골세포에 의해 매개된다 [Abu-Amer, Y. , Ross, F. P., Edwards, J. , and Teitelbaum, S. L. (1997) J. Clin. Invest . 100, 1557-1565]. TNF- α는 폐경 후에 나타나는 골다공증에서 에스트로겐 결핍에 의해 나타나는 골 소실에 중요한 역할을 한다 [Cenci, S., Weitzmann, M. N. , Roggia, C. , Namba , N. , Novack, D. , Woodring, J., and Pacifici, R. (2000) J. Clin. Invest . 106, 1229-1237] . 활성화된 T 림프구에 의해 주로 분비되는 사이토카인인 IL(interleukin)-3는 면역과 조혈모세포 시스템 사이의 연결고리로 쓰일 수 있다 [J.W. Schrader , Inter leukin-3, in: A.W. Thomson, M.T. Lotze (Eds.), Academic Press, London, UK, 2003， pp. 201-225] . IL-3는 마우스 파골세포 전구체에 직접적으로 작용할 뿐 아니라 대식세포 쪽으로 세포 분화를 촉진시킴으로써 RANKL에 의해 유도된 파골세포 분화를 억제한다 [S.M. Khapl i , L.S . Mangashett i , S.D. Yogesha, M.R. Wani , J . Immunol . 171 (2003) 142- 151] . 파골세포 전구체에서 IL-3는 Ι κ Β의 인산화와 분해를 억제함으로써 RANKL에 의해 유도된 NF- κ Β의 핵으로 이동을 방해한다. 또한 RANKL에 유도된 JNK(c-Jun N-terminal kinase)의 활성을 억제시키며， C-F0S , NFATcl 전사인자의 발현을 하향 조절한다. IL-3는 전사 후 단계에서 RANK의 발현을 억제시키며, 상기 과정은 마우스를 이용한 인 비보 실험을 통해 다시 되돌릴 수 없다는 것이 확인되었다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. 【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 IL-3( Inter leukin 3)와 동일한 기능 또는 유사한 기능 유지하면서도 천연의 IL-3 단백질보다 활성 및 안정성이 우수한 물질을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 많은 펩타이드 후보물질 중에서 우수한 생리 활성 (예컨대 , 파골세포 분화 억제능 , 골분화 촉진능, 등)을 가지는 IL-3-유래된 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 서열목록 제 1서열 또는 서열목톡 제 2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 골 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 골 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 골 질환 개선 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 골 분화 촉진 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제 1서열 또는 서열목록 제 2서열의 아미노산서열로 이루어진 펩타이드를 제공한다. 본 발명자들은 IL-3( Inter leukin 3)와 동일한 기능 또는 유사한 기능 유지하면서도 천연의 IL-3 단백질보다 활성 및 안정성이 우수한 물질올 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 많은 펩타이드 후보물질 중에서 우수한 생리 활성 (예컨대, 파골세포 분화 억제능， 골분화 촉진능， 등)을 가지는 IL-3-유래된 펩타이드를 선별하였다.
본 발명자들은 인간 IL-3의 기능과 관련 있는 부위를 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 IL-3-유래된 펩타이드를 합성하였다. 보다 상세하게는, IL-3 단백질의 여러 부위를 임의적으로 부분 합성하여 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 1차 탐색한 뒤, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화하여 본 발명의 펩타이드를 선별적으로 제조하였으며 이들 후보 핍타이드들 중에서 가장 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써， 본 발명의 서열목록 제 1서열 및 서열목톡 제 2서열의 펩타이드를 제조하였다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면， 본 발명의 서열목록 제 1서열 및 서열목록 제 2서열의 펩타이드는 인간 IL-3(GenBank Accession Number , AAH66275.1 ; 서열목록 게 3서열)에서 유래하였으며, 이는 표 1에 예시되어 있다. 본 발명의 서열목록 게 1서열 및 서열목록 제 2서열의 펩타이드는 천연 IL-3과 유사한 작용을 수행하여 이의 수용기와 결합하여 성장인자와 같은 활성을 가지는 펩타이드이다.
본 발명의 펩타이드는 처리 농도 -의존적으로 강력한 파골세포 분화 억제능을 가질 뿐 아니라 조골세포 분화를 현저하게 촉진시켰다 (참고: 도 3 내지 도 8) .
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 RANKL( receptor act ivator of nuclear factor kappa-B 1 igand)-RANK 시그널링 경로를 억제시킨다. 본 발명의 펩타이드는 RAN L-매개된 NF-κΒ의 활성화 및 핵 전이를 뚜렷하게 억제시켰다 (참고： 도 7a 및 도 7b).
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 RANKL 또는 염증성 사아토카인-유도된 파골세포 분화능을 억제시키고, RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), 카뎁신 (cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시킨다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면， 상술한 염증성 사이토카인은 TNF( tumor necrosis factor)- α , M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), IL( inter leukin)-li3 , IL-6 및 IL-7을 포함하고， 보다 구체적으로는 TNF-a , IL-Ιβ 및 IL— 6을 포함하몌 보다 더 구체적으로는 TNF-a 및 IL-Ιβ을 포함하고, 가장 구체적으로는 TNF-a이다.
본 발명의 펩타이드는 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 타이드는 OCN(osteocalcin) , OPN(osteoprotegerin) , BSPCbone sialoprotein) 및 OPN(osteopontin) 같은 조골세포 분화 마커들의 발현을 촉진시킨다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드" 는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법， 예를 들어 고상 합성 7]^ (sol id-phase synthesis techniques; Merrif ield, J . Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963)； Stewart, et al. , Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제 5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그 자체로서 천연의 IL-3 단백질보다 안정성이 우수하지만 아미노산의 변형에 의해 안정성이 더욱 향상될 수 있다 (참고: 도 2a 및 도 2b).
본 발명에 따르면， 본 발명의 펩타이드는 천연의 IL-3 단백질에 비해 매우 뛰어난 열안정성을 가진다. 천연 IL-3 단백질은 제조의 어려움 및 높은 생산 비용 뿐만 아니라, 온도 및 장기 보관 시에 낮은 안정성을 가진다. 하지만， 본 발명의 펩타이드는 매우 저렴하게 대량 합성이 가능하고 고온 등에서 물리화학적인 안정하기 때문에， 생리활성의 저하를 최대한으로 방지할 수 있으며 체내 외에서의 잔존 기간을 증가시킴으로 좀 더 향상된 치료 효과를 갖는다. 따라서， 본 발명의 펩타이드는 의약품， 의약외품 및 화장품과 같은 장기간 저장이 요구되는 제품에 유리하게 적용될 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기， 포르밀기, 팔미토일기， 미리스틸기， 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.
상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "안정성" 은 "인 /^" 안정성 뿐만 아니라， 저장 안정성 (예컨대， 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 템타이드를 보호하는 작용을 한다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 ^ 유효성분으로 포함하는 골 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 분화 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 IL-3-관련 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "골 질환" 은 RANKL-매개된 시그널링과 관련된 질환， 질병 또는 상태로， 골 형성 및 재흡수의 조절과 연관된 질환, 질병 또는 상태를 포함할 뿐 아니라 골량 감소， 골다공증 및 골 용해를 비롯한 골량 감소성 장애도 포함한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 개선 또는 치료될 수 있는 골 질환은 골다공증， 소년기 골다공증, 골형성 부전증， 골연화증， 골 괴사증， 구루병， 골수염, 치조골 소실， 뼈의 파젯병 (Paget ' s di sease) , 고칼슘혈증， 원발성 부갑상선기능항진증， 전이성 (metastat ic) 골 질환， 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환， 암에 의한 골 소실， 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환, 대사성 골 질환 및 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물들은 (a) 상술한 본 발명의 IL-3 단백질의 활성을 나타내는 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를포함하는 약제학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량" 은 상술한 IL-3 관련 ¾타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 층분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스， 수크로스， 솔비를, 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘, 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스, 폴리비닐피를리돈, 셀를로스, 물， 시럽， 메틸 셀를로스, 메틸히드톡시벤조에이트， 프로필히드록시밴조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슴 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제， 감미제, 향미제， 유화제 , 현탁제 , 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington 's
Pharmaceutical Sciences ( 19th ed . 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며， 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입 , 피하 주입 근육 주입， 복강 주입， 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태, 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며， 보통으로 숙련된 의사가 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0005-1 , 000 rag/kg이다.
또한， 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라， 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때， 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액 또는 유화액 형태이거나 액스제, 분말제, 과립제, 정제， 갑셀제 또는 젤 (예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한， 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 IL-3-유래된 펩타이드의 화장품학적 유효량 (cosmet ical ly ef fect ive amount )； 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물로 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "화장품학적 유효량 " 은 상술한 본 발명의 조성물의 효능을 달성하는 데 층분한 양을 의미한다.
본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며， 예를 들어， 용액， 현탁액， 유탁액， 페이스트, 겔， 크림， 로션， 파우더， 비누， 계면활성계 -함유 클린싱， 오일， 분말 파운데이션， 유탁액 파운데이션， 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는， 유연 화장수 , 영양 화장수， 영양 크림， 마사지 크림， 에센스， 아이 크림， 클렌징 크림， 클렌징 포음, 클렌징 워터, 팩， 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트， 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유， 식물성유， 왁스， 파라핀, 전분, 트라칸트， 셀를로오스 유도체， 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트, 실리카， 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크， 실리카， 알루미늄 히드록시드， 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매， 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고， 예컨대 물, 에탄을， 이소프로판올， 에틸 카보네이트， 에틸 아세테이트， 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트， 프로필렌 글리콜， 1 ,3-부틸글리콜 오일， 글리세를 지방족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄을 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 회석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코을， 폴리옥시에틸렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미소결정성 샐를로오스, 알루미늄 메타히드록시드: 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코을 설페이트， 지방족 알코올 에테르 설페이트 , 설포숙신산 모노에스테르， 이세티오네이트， 이미다졸리늄 유도체， 메틸타우레이트， 사르코시네이트， 지방산 아미드 에테르 설페이트， 알킬아미도베타인， 지방족 알코을， 지방산 글리세리드， 지방산 디에탄을아미드， 식물성 유， 라놀린 유도체 또는 에록실화 글리세를 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에， 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며， 예컨대 항산화제, 안정화제， 용해화제， 비타민， 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상 (subject )에게 투여하는 단계를 포함하는 골 질환 개선 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 골 분화 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상술한 조성물을 이용하기 때문에， 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명의 펩타이드는 천연의 IL( inter leukin)-3의 기능과 동일하거나 또는 유사한 기능을 할 수 있을 뿐 아니라 작은 크기에 따라 피부 투과도가 매우 우수하다.
( i i ) 본 발명의 펩타이드는 RAN L( receptor act ivator of nuclear factor kappa-B l igand)-RANK 시그널링 경로 덕제를 통해 NF- κ Β의 활성화 및 핵 전이를 억제시킬 뿐 아니라 RANKL 또는 염증성 사이토카인-유도된 TRAP( tart rate-resist ant acid phosphatase) , 카뎁신 (cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시킴으로써 파골세포 분화를 처리 농도—의존적으로 억제시킨다.
( i i i ) 또한， 본 발명의 펩타이드는 OCN(osteocal cin) , OPN(osteoprotegerin) , BSP(bone sialoprotein) 또는 OPN(osteopont in) 같은 조골세포 분화 마커들의 발현을 촉진시킴으로써 조골세포 분화에 기여할 수 있다.
( iv) 따라서， 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 또는 화장품에 매우 유용하게 적용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 합성예 1에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열 (도 la)과 서열목록 제 2서열 (도 lb)의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 합성예 1에 의하여 제조된 서열목특 제 1서열 (도 2a)과 서열목록 계 2서열 (도 2b)의 펩타이드 안정성 테스트 결과를 순도로 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열의 펩타이드 (도 3a) 및 서열목록 제 2서열의 펩타이드 (도 3b)를 처리한 파골세포의 분화 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 4는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열의 펩타이드 (4a) 및서열목특 제 2서열의 펩타이드 (도 4b)를 처리하였을 때 파골세포 분화 촉진 효소의 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열의 펩타이드 (도 5a) 및 서열목록 제 2서열의 펩타이드 (도 5b)를 처리하였을 때 파골세포 분화 마커인 TRAP 및 카뎁신 (Cathepsin) K의 mRNA 억제 효과를 나타낸 결과이다. 도 6은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열의 펩타이드 (도 6a) 및 서열목록 제 2서열의 펩타이드 (도 6b)를 처리하였을 때 타입 1 및 타입 2 TNF 수용체의 mRNA 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 7은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 계 1서열의 펩타이드 (도 7a) 및 서열목록 계 2서열의 펩타이드 (도 7b)를 처리하였을 때 RANKL 시그널 억제 효과를 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제 1서열 (8a) 및 서열목톡 게 2서열 (8b)의 펩타이드를 처리하였을 때 조골세포 분화 촉진을 나타낸 결과이다.
도 9는 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 계 1서열 (9a) 및 서열목록 제 2서열의 펩타이드 (9b)를 처리하였을 때 조골세포에서 BMP2 시그널인 p-Smadl/5/8의 발현을 증가시킨다는 것을 나타낸 결과이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
합성예 1： Asn-Cys-Ser-Asn-Met-I le— Cys-Glu-I le-I le-Thr-His (서열목록 제 1서열)의 합성
클로로 트리틸 클로라이드 레진 (Chloro tri tyl chlor ide resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반웅용기에 넣고 메틸렌 클로라이드 (MC) 10 ml를 가하여 3분 동안 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드 (DMF) 10 ml를 넣어 3분 동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄 (DCM) 용:액을 넣고 Fmoc-L-Hi s(Trt )-0H (Bachem, Swi ss) 200 匪 ole 및 디이소프로필 에틸아민 (DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반웅시켰다. 반웅 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2 : 1)를 DCM에 녹여 10분 동안 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1 : 1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 DMF를 10 ml 넣어 3분 동안 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액 (20%의 피페리딘 (Piper idine)/DMF) 10 ml를 반웅용기에 넣고 10분 동안 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분 동안 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회， MC로 1회， DMF로 1회 세척하여 His(Trt )-CTL 레진을 제조하였다. 새로운 반웅기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Thr(tBu)-0H (Bachem , Swi ss) 200 mmole , HoBt 200 醒 ole 및 Bop 200 麵 ole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA(N,N-Di isopropyIethylamine)를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분 동안 교반하였다. 녹인 아미노산 흔합용액을 탈보호된 레진이 있는 반웅용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반웅시켰다. 반웅액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진올 소량 취하여 카이저 테스트 (Nihydrin test )를 이용하여 반웅 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반웅시켜 Thr(tBu)-His(Trt )- CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 층분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-I le , Fmoc-I le , Fmoc- Glu(OtBu) , Fmoc-Cys(Trt ) , Fmoc-I le , Fmocᅳ Met , Fmoc-Asn(Trt ) , Fmoc- Ser(tBu) , Fmoc-Cys(Trt ) 및 Fmoc— Asn(Trt ) 순으로 연쇄반웅을 시켰다. Fmoc—보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반웅시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt (Hydroxybenzotriazole)를 넣어 1시간 동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF , MC 및 메탄을로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후， 오산화인 (Phosphorus pent o ide , P205) 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액 [TFA(Tri f luroacet ic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸 (Thioamsole) 2.5%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2시간 반웅을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도톡 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후， 원심분리하여 침전을 모으고， 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 층분히 건조하여 정제 전 NH2-Asn-Cys-Ser-Asn-Met- 11 e-Cys-G 1 u- 11 e- 11 e-Thr-H i s-OH 펩타이드 1을 0.5 g 합성하였다 (수율: 89.9%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1375.4 Da (이론값: 1377.6 Da)를 얻을 수 있었다 (도 la). 위와 같은 방법으로: 서열목록 제 2서열의 펩타이드 (N¾-Arg-Arg-Lys-Leu-Thr-Phe-Tyr-Leu-Lys-Thr-Leu- Glu-OH)도 합성하였다 (수율: 92.1%). 분자량 측정기를 이용하껴 측정시 분자량 1568.5 Da (이론값 :1567.9 Da)의 값을 얻을 수 있었다 (도 lb).
【표 1】
합성된 펩타이드 서열 및 분자량.
Figure imgf000015_0001
시험예 1 ： 제조된 펩타이드의 열 안정성
합성예 1에서 합성된 서열목록 제 1서열 또는 서열목톡 제 2서열의 펩타이드와 NIBSC(UK)에서 구입한 표준품 성장인자 (IL-3)를 0.1 mg/ml의 농도의 인산완층용액으로 제조하였다. 준비된 용액을 1 ml씩 유리 바이알에 넣은 후 37°C에서 정치하였다. 37°C에 정치된 용액을 0， 1, 3， 5， 10， 20， 그리고 40일째에 샘플링하여 날자별로 원심 분리하여 변성된 펩타이드나 단백질을 제거하고 상층액을 취해 HPLC를 이용해 정량을 하였다 (각각, 도 2a 및 도 2b). 시험예 2: 합성 펩타이드를 활용한 파골세포 분화 억제효과의 확인
합성예 1에서 합성된 서열목록 제 1서열 및 서열목록 제 2서열의 펩타이드에 대한 인터류킨 (Interleukin, IL)-3의 유사 효능 및 억제 효능을 분석하기 위해 주석산염 -저항 산성인산분해효소 (tartrate-resistant acid phosphatase) ¾ ^ 훠 ¾"¾ (Rizzino, et al . Cancer Res. 48:4266(1988))을 참조하여 파골세포로 분화가 가능한 Raw264.7 세포주를 이용한 TRAP(Tartrate-res) 비색법을 이용하여 측정하였다.
Raw264.7 세포주 (ATCC)를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10¾> 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 DMEMOXilbecco' s modified Eagle's medium, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 파이펫팅 (pipetting)으로 조심스럽게 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 상기 세포 침전물을 10% FBS가 함유된 DMEM 배양액에 재-현탁시킨 후， 46-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 1 X 104 세포가 되도록 넣고 공 시료와 RAW264.7 세포의 분화를 유도하기 위해 RANKL을 10 ng/ml , TNF- α 50 ng/ml의 농도와 합성된 펩타이드를 10% 증류수에 멸균상태로 녹인 뒤 1 pg/ml 또는 10 ug/ml의 농도로 함께 처리하여 72시간 동안 37°C , 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 72시간 뒤 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 공 시료와 RANKL을 10 ng/ml , TNF- α 50 ng/ml의 농도와 합성 펩타이드를 다시 1 y g ml , 10 ug/ml의 농도로 48시간 동안 상기한 조건과 동일하게 배양하였다. 총 5일 동안 배양을 진행이 완료된 후 배양 상층액올 제거하고 세포를 고정하기 위해 시트른산 용액 (citration solution) 25 ml, 아세톤 65 ml 및 37% 포름알하이드 8 ml을 포함하는 고정 완층액 (fixation buffer)을 제조하여 이를 이용해 30초 동안 고정화시킨 다음， PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 백혈구 알카라인 포스파타제 키트 (leukocyte alkaline phosphatase kit; Sigma, 미국)를 이용하여 염색하였다.
도 3은 RANKL와 TNF-α에 의해 분화 유도가 될 수 있는 Raw264.7 세포가 IL-3-K도 3a) 및 IL-3-2C도 3b)에 의해 분화억제에 대한 결과이다. 도 3a 및 3b에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 펩타이드는 Raw264.7 세포가 RANKL와 TNF-α에 의한 파골세포로의 분화를 억제할 수 있다는 결과이다. 시험예 3: 합성 펩타이드의 활용한 파골세포 분화 억제효과의 확인
Raw264.7 세포에 RANKL 10 ng/ml 또는 TNF— α 50 ng/ml과 합성예 1에서 합성한 펩타이드를 1 또는 10 yg/ml로 함께 처리하고 5일 동안 분화 유도 후 파골세포 분화 마커인 TRAP 활성의 억제 정도를 확인하는 실험을 실시하였다. 배양 후 배양액을 제거한 후 용해 완층액 (20 mM tris buffer, 3% triton X-100) 100 μ 1를 첨가하여 세포벽을 파괴하였다. 시트르산 용액 (18 mM citric acid, 9 mM sodium chloride, 12 mM surfactant； pH3.5) 500 u 1 , 타르타르산 용액 (tartrate solution) 50 μ 1, 20 mM 포스페이트 기질 500 μΐ를 넣어 반응 용액을 만든 후, 상기 용해물 (lysate) 100 μΐ와 반웅 용액 100 μΐ를 동량으로 넣은 후 37°C에서 30분 동안 반웅시켰다. 분광광도계 (spectrophometer)를 이용하여 흡광도 405 nm에서 발색올 측정하였다. 본 발명의 서열목록 제 1서열 또는 서열목록 제 2서열의 펩타이드를 RANKL 및 TNF-α와 함께 처리하였을 경우 파골세포의 분화마커인 TRAP 활성은 펩타이드 처리에 따라 농도 -의존적으로 분화 억제 효과를 확인하였다 (도 4a 및 도 4b). 시험예 4: 합성 펩타이드의 활용한 파골세포 분화 마커의 mRNA 의제효과의 확인
Raw264.7 세포에 RANKL 10 ng/ml 또는 TNF- α 50 ng/ml과 합성예
1에서 합성한 펩타이드를 1 또는 10 yg/ml로 함께 처리하고 5일 동안 분화를 유도시 ¾ 후 카뎁신 (cathepsin) K의 mRNA 발현에 대한 억제 정도를 확인하는 실험을 실시하였다. 도 5a 및 도 5b는 각각 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 카뎁신 K의 mRNA 레벨이 감소되는 것을 보여준다. 또한， 도 6a 및 6b는 RA L 또는 TNF-α을 처리하였을 때 증가되는 타입 1 또는 타입 2의 T F 수용체가 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 이들의 mRNA 발현이 모두 감소되는 것을 확인시켜 주었다. PCR에 이용된 타겟-톡이적 프라이머 서열은 다음과 같다: TRAP 정방향 프라이머 서열， 5' ᅳ AAATCACTCrrTAAGAACAG-3 ' 및 TRAP 역방향 프라이머, 5' - TTATTGAATAGCAGTGACAG-3' (어닐링 은도， 45 °C); 카뎁신 K 정방향 프라이머 서열, 5' -CCTCTCTTGGTGTCCATACA-3 ' 및 카뎁신 K 역방향 프라이머， 5' ᅳ ATCTCTCTGTACCCTCTGCA-3 ' (어닐링 온도， 53 °C); GAPDH 정방향 프라이머 서열, 5' -GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG-3' 및 GAPDH 역방향 프라이머， 5' -CCGTTGAATTTGCCGTGAGTGGAGT-3 ' (어닐링 온도， 55°C); 타입 1 TNF 수용체 정방향 프라이머 서열, 5' -acct 11 acggct t cccagaa-3' 및 타입 1 TNF 수용체 역방향 프라이머, 5' -tccttacagccacacaccgt-3' (어닐링 온도ᅳ 55°C); 타입 2 TNF 수용체 정방향 프라이머 서열, 5' - aggctggaaagcccctaact-3' 및 타입 2 TNF 수용체 역방향 프라이머， 5' - atgggggtactggagacagg-3' (어닐링 온도, 55°C); 및 액틴 정방향 프라이머 서열, 5' -CGTGGGCCGCCCTAGGCA-3 ' 및 액틴 역방향 프라이머, 5' - TTGGCTTAGGGTTCAGGGGG-3' (어닐링 온도， 55°C).
따라서 , 본 발명의 펩타이드는 RANKL과 TNF-α에 의해 증가되는 TRAP 카뎁신 K, 그리고 타입 1 및 타입 2 TNF 수용체를 모두 억제시킬 수 있다 (도 5a-5b 및 도 6a-6b). 시험예 5: 합성 펩타이드에 의한 RANKL의 시그날 억제 확인 실험
Raw264.7 세포에 합성예 1에서 합성한 펩타이드들을 처리하고 30분 경과 후， RANKL 단백질의 대표적인 시그널인 NF-κΒ의 핵 내 이동을 확인하였다. 각 펩타이드의 효과는 NF-κΒ의 다중클론 항체 (Cat .No sc-372, 산타크루즈, 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다. 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 경우 NF-icB 활성화 및 핵 내 이동이 확인되었다 (도 7a 및 도 7b). 그 외 RANKL 단백질의 대표적인 시그널 증에 c-Jun의 인산화와 인산화된 c-Jun의 핵 내 이동을 확인하였다. 각 펩타이드의 효과는 포스포 -c-Jun의 다중클론 항체 (Cat .No sc-1694, 산타크루즈， 미국)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 통해 확인하였다 (도 7a 및 도 7b). 시험예 1 내지 시험예 5의 실험 결과를 종합하면， 본 발명의 펩타이드는 RANKL-RANK 시그널링의 활성화 억제를 통해 파골세포 분화를 매우 효과적으로 억제시킨다. 시험예 6: 합성 펩타이드에 의한 골분화 마커 유전자 촉진 효과 확인
MC3T3-E1 세포에 합성예 1에서 합성한 펩타이드를 10: 또는 50 tig/ml로 처리하고 2일 동안 분화를 유도시킨 후 OCN(osteocalcin), OPN(osteoprotegerin) , BSP(bone sialoprotein) 및 OPN(osteopontin) 같은 조골세포 분화 마커들의 mRNA 발현 확인 실험을 진행하였다. 도 8은 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 조골세포의 분화마커인 PCR에 이용된 타겟-특이적 프라이머 서열은 다음과 같다: 0CN 정방향 프라이머 서열, 5' -gcgctctgtctctctgacct-3' 및 0CN 역방향 프라이머, 5' - tttgtaggcggtct tcaagc-3' (어닐링 온도, 60 °C ) ; OPG 정방향 프라이머 서열， 5' -ctgcctgggaagaagatcag-3' 및 0PG 역방향 프라이머, 5' - t tgtgaagctgtgcaggaac-3' (어닐링 은도, 60°C ) ; BSP 정방향 프라이머 서열, 5' -aaagt gaaggaaagcgacga-3 ' 및 BSP 역방향 프라이머， 5' - gttcct tctgcacctgct tc-3' (어닐링 온도, 60 °C ) ; OPN 정방향 프라이머 서열， 5' -GATGAATCTGACGAATCTCAC-3' 및 0PN 역방향 프라이머， 5' - CTGCTTAATCCTCACTAACAC-3 ' (어닐링 온도， 50°C ) . 상기 유전자들의 mRNA 레벨이 서열목록 제 1서열 또는 서열목록 제 2서열의 펩타이드에 의해 증가되는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 조골세포 분화 마커인 OCN, OPN, BSP 및 0PN의 유전자 발현을 증가시킴으로써 조골세포의 분화를 촉진시킬 수 있다. 시험예 7 : 합성 펩타이드에 의한 골분화의 시그널 촉진 효과 확인
골 분화 촉진에 관련된 시그널인 pSmadl/5/8을 본 펩타이드가 활성화 시키는 지 여부를 확인하가위해， MC3T3-E1 세포를 6-웰 플레이트에 2 X 105 세포로 분주하여 24시간 동안 37°C , 5% C02 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청이 포함되지 않는 배지로 교환하여 24시간 동안 스타베이션 (starvat ion)을 진행시킨 후， 펩타이드를 10 p g/ml 농도로 처리하거나 또는 양성 대조군으로 사용된 BMP2는 50 ng/ml로 30분 동안 처리하고， 상기 세포들을 PBS로 세척하고 용해 완충액을 넣어 용해시켜 단백질을 수득하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다.
상술한 결과들과 일치하게도, 본 발명의 서열목록 제 1서열 또는 서열목록 제 2서열의 펩타이드를 처리하였을 때 Smadl/5/8의 인산화가 일어난다는 것을 확인할 수 있었으며， 이는 본 발명의 펩타이드 처리에 의해 골 형성 촉진 시그널이 전달되어 조골세포 분화 (osteoblast di f ferent i at ion)가 유지된다는 것을 의미한다 (각각 도 9a 및 도 9b) . 제형예 1: 유연화장수
상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며， 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.
【표 2】
유연화장수 조성 .
Figure imgf000020_0001
제형예 2 : 보습크림
상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며 , 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 보습크림 제조방법에 따라 제조하였다.
【표 3】
보습크림 조성 .
Figure imgf000020_0002
스테아린산 1.5
글리세릴스테아레이트 1.5
유동 파라핀 10.0
밀납 2.0
폴리솔베이트 60 0.6
솔비탄 세스퀴올레이트 2.5
스쿠알란 3.0
1 , 3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
트리에탄을아민 0.5
토코페릴아세테이트 0.5
방부제, 색소 적량
향 적량
정제수 잔량
합계 100 제형예 3: 보습화장수
상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며 , 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조방법에 따라 제조하였다.
【표 4】
보습화장수 조성 .
Figure imgf000021_0001
토코페릴아세테이트 0.3
유동파라핀 5.0
스쿠알란 3.0
마카다미아너트오일 2.0
폴리솔베이트 60 1.5
솔비탄세스퀴올레이트 0.5
카르복시비닐폴리머 1.0
방부제，색소 ¾ ¾ᄋ：
향 적량
정제수 잔량
합계 100 제형예 4 : 에센스
상기 합성예 1에서 제조된 펩타이드 1 또는 펩타이드 2를 포함하는 나노좀을 포함하며， 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조방법에 따라 제조하였다.
【표 5】
에센스 조성 .
Figure imgf000022_0001
트리에탄올아민 Λ . 0.18
옥틸도데세스 -16 0.4
에탄을 6.0
향， 방부제, 색소 적량
정제수 잔량
합계 100 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 둥가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
서열목록 제 1서열 또는 서열목록 제 2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간 IL-3 C Inter leukin 3) 단백질에서 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 RANKUreceptor act ivator of nuclear factor kappa-B l igand)-RANK 시그널링 경로를 억제시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
[청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 RANKL 또는 염증성 사이토카인- 유도된 파골세포 분화능을 억제시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 RANKL 또는 염증성 사이토카인- 유도된 TRAP( tart rate-resist ant acid phosphatase) , 카뎁신 (cathepsin) K 또는 타입 1 또는 타입 2 TNF 수용체의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 6】
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서， 상기 염증성 사이토카인은 TNF( tumor necrosis factor)- α , M_CSF (macrophage colony-st imulat ing factor) , IL( interleukin)-lp , IL-6 또는 IL-7을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 조콜세포의 분화를 촉진시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서， 상기 펩타이드의 N- 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메특시 카르보닐기， 포르밀기， 팔미토일기， 미리스틸기， 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
【청구항 9】
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 질환 개선 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 10】
제 9 항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증， 소년기 골다공증， 골형성 부전증， 골연화증, 골 괴사증， 구투병, 골수염， 치조골 소실， 뼈의 파젯병 (Paget ' s disease) , 고칼슘혈증， 원발성 부갑상선기능항진증, 전이성 (metastat ic) 골 질환， 골수종, 류마티스 관절염에서의 골 소실， 전이성 골 질환， 암에 의한 골 소실， 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환， 대사성 골 질환 또는 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
【청구항 11】
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 골 분화 촉진용 조성물.
【청구항 12】
제 11 항에 있어서， 상기 조성물은 OCN(osteocalcin) , OPN(osteoproteger in) , BSP(bone sialoprotein) 또는 OPN(osteopont in)의 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13】
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 대상 (subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 골 질환 개선 또는 치료 방법.
【청구항 14]
제 13 항에 있어서， 상기 골 질환은 골다공증， 소년기 골다공증, 골형성 부전증, 골연화증, 골 괴사증， 구루병， 골수염， 치조골 소실， 뼈의 파젯병 (Paget' s disease), 고칼슘혈증, 원발성 부갑상선기능항진증， 전이성 (metastatic) 골 질환， 골수종， 류마티스 관절염에서의 골 소실, 전이성 골 질환， 암에 의한 골 소실， 섬유성 골이형성증, 무형성 골 질환， 대사성 골 질환 또는 나이에 따른 골 질량의 소실을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15】
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물을 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 골 분화 촉진 방법.
【청구항 16]
제 15 항에 있어서， 상기 조성물은 OCN(osteocalcin),
OPN(osteoprotegerin) , BSP(bone sialoprotein) ■또는 OPN(osteOpontin)의 발현을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 방법.
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