KR20080093334A - Ｒａｎｋ 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포 - Google Patents
Ｒａｎｋ 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는 약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포를 제공한다.
RANK, 파골세포
Description
도 1은 인간과 생쥐의 RANK 세포질 내 꼬리 부위의 RANK 저해 활성을 나타내는 영역 (A) 및 세포 투과성 서열과 연결된 융합 펩티드 (B)를 나타내는 도면이다.
도 2는 생쥐 골수에서 분리한 파골 전구세포가 RANKL 처리에 의한 파골세포로 분화되는 과정에서 RANK 저해 펩티드의 효과를 농도 별도 처리하여 TRAP 염색한 사진 (B) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)이다. 분화 정도는 액틴 고리가 완전히 형성된 파골세포를 세 번의 독립된 실험결과에서 평균 (mean) 값을 얻었고, 이에 대한 표준편차를 도표로 나타내었다. 도 2B에서, No of TRAP+ OCL는 TRAP 양성 파골세포의 수를 나타낸다.
도 3은 실험군 융합 펩티드 1-6 (A)과 대조군 융합 펩티드 1-6 (B)의 구성을 나타내는 도면이다.
도 4는 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6이 파골세포 분화에 미치는 영향을 TRAP 염색한 사진 (A) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)를 나타낸다. 분화정도는 융합 펩티드 1-6을 처리한 시료를 각각 독립된 3회의 실험에서 액틴 고리를 완전한 형태로 가지고 있는 파골세포 수를 얻어 평균값을 구하고 이에 대한 표준편차를 도표로 나타내었다. 도 4에서, TRAP+ OCL #는 TRAP 양성 파골세포의 수를 나타낸다.
도 5는 서열번호 8의 세포 투과성 RANK 저해 펩티드가 활성화된 파골세포의 뼈 흡수 활성을 억제하는 것을 나타내는 사진 (A) 및 그 정도를 정량화한 그래프 (B)이다. 뼈 흡수 정도는 뼈 흡수 측정 배양 용기인 OAASTM((주)오스코텍: 한국)의 전체 면적에서 흡수된 면적의 비를 서로 다른 3회의 실험으로 평균 (mean) 값을 구하고 이에 대한 표준편차를 구해서 나타내었다. 도 5에서 Control은 대조군을 나타내고, Mt-1 및 WT-1은 각각 서열번호 14와 8의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다.
도 6은 세포투과성 RANK 저해 펩티드가 파골세포에서 액틴 고리 형성을 억제하는 것을 나타내는 사진이다. 도 6에서 Mt-1 및 WT-1은 각각 서열번호 14와 8의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다.
도 7은 RANKL 또는 LPS (리포폴리사카리드) 주입에 의해 생쥐에서 발생되는 뼈의 파괴를 세포 투과성 RANK 저해 펩티드가 억제함을 보여주는 사진 (A) 및 그 정도를 정량한 그래프 (B)이다. 상기 그래프의 정량화는 두개관의 종단면의 전체 면적에서 흡수한 면적의 비율로 하였다. 흡수 면적이란 뼈 구조 내 골수강 (marrow cavity)의 면적을 의미하며 이 면적의 증가 또는 억제 정도를 대조군과 비교하여 정량화하였다. 서로 다른 6개 시료를 통해서 평균 (mean) 값을 얻고 이에 대한 표준 편차를 구하였다. 대조군을 1로 하였을 때, RANKL 또는 LPS 주입에 의해서는 골구강의 파괴가 증가하여 대조군 1 보다 큰 값을 나타내며, RANKL 저해 펩티드 처리에 의해서도 대조군 수준으로 감소됨을 확인하였다.
본 발명은 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는 약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포에 관한 것이다.
뼈는 우리 몸을 지탱하고 신체 장기를 보호하는 중추기관이다. 아울러 신체 기능에 필수적인 무기질의 저장소 역할을 한다. 뼈 세포는 콜라겐 단백질과 무기질로 이루어진 뼈 성분을 만들어내는 조골세포 (osteoblast)와 그 성분을 녹이는 파골세포 (osteoclast)로 이루어져 있다. 이들 두 세포는 뼈의 파괴와 형성의 재형성 (bone remodeling) 과정을 담당하며 두 세포 간의 상호 평형은 건강한 뼈 형성에 필수적이다.
Imunex 사 연구자들은 수지상 세포 (dendritic cell)의 새로운 유전자를 탐색하는 과정에 RANK (receptor activator of NF-kB)로 명명된 새로운 TNF (tumor necrosis factor) 계열의 수용체를 클로닝하였다. 동시에 RANK에 대한 리간드로서 RANKL (RANK ligand)을 클로닝하였다.
뼈 생물학을 연구하는 생명과학자들의 오랜 난제 중의 하나는 파골세포의 분화인자를 찾는 일이었다. 1990년대 초에 일본 Suda 그룹에 의해 두개관 (calvaria)에서 분리한 조골세포와 파골 전구세포 (osteoclast precursor)의 공동배양 (co-culture) 시, 비타민 D3와 프로스타글랜딘 E2의 자극에 의해 파골세포가 분화된다는 사실로부터 분화인자는 조골세포에서 유래될 가능성이 처음으로 제시되었다. 1997년 미국의 Amgen 사 연구자들은 새로운 TNF 계열의 수용체를 탐색하는 과정에 OPG (osteoprotegerin) 라는 세포 밖으로 분비되는 수용체를 발견하고 형질전환 생쥐를 이용 OPG의 과발현 시, 뼈의 밀도가 증가함을 알게 되었다. 이들은 OPG에 결합하는 리간드로서 OPGL (OPG ligand)을 클로닝하였다. OPGL은 Immunex 사 연구자들이 클로닝한 RANKL과 일치하는 사이토카인이었으며, 조골세포와의 공동배양법이 아닌 파골 전구세포 단독으로 존재할 경우라도 OPGL 처리에 의해 파골세포의 분화가 가능하게 되었다.
파골세포 분화 인자로서 판명된 RANKL의 기능은 유전자 결손 (knock-out) 생쥐를 이용한 실험 결과, 심각한 골석회증 (osteopetrosis)을 나타내었고 치아 돌출 (tooth eruption)이 일어나지 않았으며 생쥐의 발육이 저해되었다. 이와 같은 표현 형은 RANKL 수용체 (RANK)의 유전자 결손 생쥐에서 그대로 재현됨으로써 조골세포/기질세포에서 만들어진 RANKL과 파골 전구세포에 존재하는 수용체 (RANK) 간의 상호작용이 파골세포 분화에 절대적임이 입증되었다.
RANKL 수용체 RANK는 CD40와 가장 유사한 TNF 수용체 패밀리에 속한다. RANK는 비장, 림프절, 골수에서 유래된 수지상 세포, 활성화된 T 임파구, 파골 전구세포, 성숙된 파골세포, 콘드로사이트 (chondrocyte) 등에서 발현된다. RANK의 세포질내 꼬리 (cytoplasmic tail)에는 잘 알려진 신호 모티프 (signaling motif)가 없는 점으로 미루어 어떤 연결 (adaptor) 단백질이 신호전달에 관여할 것으로 추정되고 실제로 TRAF (TNF receptor-associated factor) 계열의 단백질이 결합하며 그들 가운데 TRAF6가 수용체 하류의 파골세포 분화 신호 전달에 가장 중요함이 알려져 있다.
파골세포와 조골세포의 상호작용에 의한 뼈의 재형성 과정은 노화, 호르몬 이상, 염증 등의 작용에 의해 그 항상성을 잃게 된다. 그 결과 성인의 경우 40세 이후에 뼈의 형성보다 파괴가 우세하게 되며 여성의 경우에는 폐경기 이후, 에스트로젠 호르몬이 분비되지 않음에 따라 전체 여성의 3 분의 1 이상에서 골밀도 손실이 심각한 골다공증이 빈발하게 된다. 또한 면역계의 이상으로 발생하는 만성염증은 연골과 뼈의 파괴를 유발하는 류마티스 관절염의 주요 원인으로 인식되고 있다. 이러한 과정 중에 공통적으로 발생하는 뼈의 손실 (파괴)에는 파골세포가 주 원인세포이며 파골세포의 분화에는 RANKL과 그 수용체인 RANK의 작용이 필수적이다. 따라서 파골세포 분화 제어는 골다공증을 비롯한 관절염 치료제 개발의 핵심 전략이 다.
미국 Amgen 사는 RANKL에 대한 인간화 단일클론항체 (humanized monoclonal antibody)인 Denosumab을 개발하여 골다공증, 관절염, 호르몬 이상에 의한 뼈 손실, 유방암의 뼈 전이에 의한 파괴 등에 대한 질환에 임상시험을 진행 중에 있다. 또한, 미국특허 제6,998,383호에는 TRAF6 결합 도메인을 포함하는 TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6)에 의하여 매개되는 신호절단을 억제하는 폴리펩티드가 개시되어 있다.
본 발명자들은 파골세포 분화를 제어하는 새로운 방법을 개발하여 뼈의 파괴에 작용하는 기능을 규명하고자 예의 연구 노력한 결과, RANK의 작용을 억제하는 펩티드들을 개발하게 되었다. 이들 펩티드는 RANKL에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 형성의 억제 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의해 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 리포폴리사카리드 (LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 RANK를 표적으로 하는 신규 RANK 저해 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드를 포함하는, 뼈 파괴를 유발하는 질병의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 약제학적 조성물을 이용한 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 펩티드를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하는, RANK (receptor activator of NF-kB) 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 4로 구성되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 4의 폴리펩티드는 각각 12, 10, 8 및 6개의 아미노산으로 구성되며, 각각 서열번호 1의 4번 내지 9번 아미노산 서열 (IIVVYV : 서열번호 4)을 포함한다. 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, RANK 유도된 활성을 저해하는 활성을 가진 폴리펩티드는 모두 IIVVYV (서열번호 4) 도메인을 포함하고 있었으며 (예를 들면, 서열번호 1 내지 4, 및 서열번호 8 내지 11), IIVVYV (서열번호 4) 도메인으로부터 각각 하나의 아미노산이 제거되어 5개 아미노산으로 구성된 IVVYV (서열번호 5) 및 IIVVY (서열번호 6) 서열 및 이들이 세포투과성 서열에 연결된 폴리펩티드 (서열번호 12 및 13)는 RANK 유도된 활성을 저해하는 활성을 가지고 있지 않았다. 또한, IIVVYV (서열번호 4) 도메인 및 이를 포함하는 서열 중에서 IIVVYV (서열번호 4) 도메인의 2번 및 3번 아미노산 서열 IV를 LA로 치환하여 얻어지는 폴리펩티드 (서열번호 14 내지 19)도 RANK 유도된 활성을 저해하는 활성을 가지고 있지 않았다. 따라서, 본원 발명의 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드는 어느 것이든지 포함된다. 비록 본원의 실시예에는 아미노산의 수가 6,8,10 및 12개로 이루어진 폴리펩티드만이 예시적으로 기재되어 있으나, 당업자라면 이들 내용으로부터 실시예에 기재되어 있지 않은 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드도 동일한 활성을 가지고 있는 것으로 당연히 이해할 수 있는 것이다
본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는, 세포 투과성 폴리펩티드가 연결된 것일 수 있다. 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 것일 수 있다. 바람직하게는, N 말단에 연결된 것이다.
본 발명에 있어서, "세포 투과성 폴리펩티드"란 세포막 투과성을 가지고 있어 그와 융합된 융합 파트너를 세포 내로 전달하는 기능을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 세포 투과성 폴리펩티드는 당업계에 널리 알려져 있으며, 본 발명에는 당업계에 알려진 임의의 세포 투과성 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 리더 신호 서열인 것일 수 있다. 상기 리더 신 호 서열은 예를 들면, 카포시 섬유아세포 성장인자 신호서열, HIV-1 tat (48-60), D-아미노산 치환된 HIV-1 tat (48-60), 아르기닌 치환된 HIV-1 tat (48-60), 드로소필라 안테나피디아 (Drosophila Antennapaedia)(43-58), 7 개 이상의 아미노산을 포함하는 바이러스 RNA 결합 펩티드, 7개 이상의 아르기닌을 포함하는 DNA 결합 펩티드 및 6 내지 8개 아르기닌을 갖는 폴리아르기닌 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 바이러스 RNA 결합 펩티드는 HIV-1 rev (34-50), HTLV-II rev (4-16), 브롬 모자이크 바이러스 Gag (7-25) 및 플록 하우스 바이러스 코트 단백질 (35-49)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 상기 DNA 결합 펩티드는 인간 c-Fos (139-164), 인간 c-Jun (252-279), 및 효모 전사 인자 GCN4 (231-252)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 또한, 서열번호 7의 인간 전사 인자 Hph-1의 세포 투과성 폴리펩티드인 것일 수 있다.
본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는, 서열번호 7의 인간 전사 인자 Hph-1의 세포 투과성 폴리펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드의 N 말단에 연결되어 있는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 서열번호 8 내지 11의 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드에 대하여는 전술한 바와 같다. 상기 폴리펩티드는 인간 또는 생쥐의 RANK의 세포질 내 꼬리 영역에서 유래한 것이다. 상기 폴리펩티드는 인간 RNAK 아미노산 서열의 546-551의 IIVVYV (서열번호 4) 서열을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 RANKL (RANK-ligand)에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 (ring) 형성의 억제, 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의하여 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 생쥐에 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정의 억제 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 용도로서 사용될 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체에는, 희석제, 부형제, 붕해제, 결합제, 및 활택제 등이 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 주사제인 경우, 멸균 수나 생리적 조건에 적합한 버퍼 (예, PBS)가 담체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 및 비경구형 제형으로 제조될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용가능한"이란 개체에 투여되는 경우 알러지 또는 원하지 않은 반응을 유발하지 않는 것을 의미한다. 활성 성분으로서 단백질을 포 함하는 수성 조성물을 제조하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다.
당업자라면 과도한 실험 없이, 본 발명의 조성물의 적절한 투여량 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 치료를 위하여 인 비보에서 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 치료학적으로 효과적인 양, 즉 RANKL 매개된 파골세포 분화 또는 기능을 억제하는 양으로 동물 또는 인간에게 투여된다. Remingto's Pharmaceutical Science, 17th Ed. (1990) Mark, Publishing Co., Easton, Penn. 참조.
본 발명의 조성물은 예를 들면, 활성 성분인 상기 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드의 양을 기준으로, 개체 당 1nM 내지 1M, 바람직하게는 1μM 내지 1mM, 더욱 바람직하게는 0.1mM 내지 0.2mM 의 양으로 투여될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구를 통하여 개체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 주사제의 형태로 개체에 주사를 통하여 투여될 수 있다.
파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병에는 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 폴리펩티드는 리포좀에 포집되어 있거나, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함된 바이러스 및 벡터의 형태로 존재하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하여, RANK를 매개로 한 신호 전달을 저해하는 단계를 포함하는, 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 약학적 조성물, 그의 약리학적 효과, 투여량 및 투여방법에 대하여는 상기 본 발명의 약학적 조성물에 대하여 설명한 바와 동일하다.
RANK를 매개로 한 신호 전달의 저해에 의하여, RANKL (RANK-ligand)에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 (ring) 형성의 억제, 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의하여 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 생쥐에 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정의 억제와 같은 효과가 발생한다. 그 결과, RANK를 매개로 한 신호 전달의 저해에 의하여 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방할 수 있는 효과가 발생한다.
따라서, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여, RANK를 매개로 한 신호 전달을 저해하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
상기 질병은 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 원핵 세포 및 진핵 세포일 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예
1: 세포 투과성 서열과
RANK
세포질 내 꼬리 영역 서열의 융합 폴리펩티드의 제조
본 실시예에서는 11개 아미노산으로 구성되는 인간전사 인자 Hph-1의 세포 투과성 서열 YARVRRRGPRR (서열번호 7)이 인간 RANK 세포질 내 꼬리 영역 유래의 폴리펩티드의 N 말단에 연결된 융합 폴리펩티드를 제조하였다. 상기 RANK 유래의 폴리펩티드는 인간 RANK의 아미노산 서열 543-554 (생쥐 RANK의 아미노산 서열 531-542에 해당)에 해당하는 서열 KGDIIVVYVSQT (서열번호 1)의 4-9번 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 1의 5-12개 연속 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드단편이다. 본 실시예에서 사용된 상기 단편은 각각 서열번호 1-6의 아미노산 서열을 가지며, 이들의 N 말단에 서열번호 7의 세포 투과성 서열이 융합된 폴리펩티드(이하 "실험군 융합 펩티드 1-6"라 한다)는 서열번호 8-13의 아미노산 서열을 갖는 다. 대조군으로써, 서열번호 8-13의 아미노산 서열에서 IV 서열이 LA로 치환된 서열번호 14-19의 폴리펩티드 (이하 "대조군 융합 펩티드 1-6"라 한다)를 사용하였다. 실험군과 대조군 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
표 1.
| 실험군 | 대조군 |
| YARVRRRGPRRKGDIIVVYVSQT (서열번호 8) | YARVRRRGPRRKGDILAVYVSQT (서열번호 14) |
| YARVRRRGPRRGDIIVVYVSQ (서열번호 9) | YARVRRRGPRRGDILAVYVSQ (서열번호 15) |
| YARVRRRGPRRDIIVVYVS (서열번호 10) | YARVRRRGPRRDILAVYVS (서열번호 16) |
| YARVRRRGPRRIIVVYV (서열번호 11) | YARVRRRGPRRILAVYV (서열번호 17) |
| YARVRRRGPRRIVVYV (서열번호 12) | YARVRRRGPRRLAVYV (서열번호 18) |
| YARVRRRGPRRIIVVY (서열번호 13) | YARVRRRGPRRILAVY (서열번호 19) |
상기 표 1의 폴리펩티드는 펩트론 (주) (한국)에 의뢰하여 합성하였다.
도 1은 인간과 생쥐의 RANK 세포질 내 꼬리 부위의 RANK 저해 활성을 나타내는 영역 (A) 및 세포 투과성 서열과 연결된 융합 펩티드 (B)를 나타내는 도면이다.
실시예
2: 세포 투과성
RANK
저해 펩티드에 의한 파골세포 분화 억제 효과
태어난 지 5주 되는 생쥐 (C57BL/6J)로부터 채취한 골수세포를 48-웰 플레이트에 넣고, 대식세포 (macrophage) 분화 인자인 hM-CSF (R&D system Inc.)를 30ng/ml의 농도로 포함하는 분화배지 (α-MEM (Invitrogen. co.,), 10%(v/v) 우태아혈청 (FBS), 100units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)에서 3일 동안 4x104 세포/웰로 37℃, 95%(v/v) 공기, 5% (v/v) CO2에서 배양하여 골수세포로부터 파생된 대식세포를 얻었다. 여기에 상기 30ng/ml의 농도의 hM-CSF에 더하여, 파골세포분화 인자인 생쥐 RANKL을 대장균에서 발현시켜 순수 분리 정제하여 100ng/ml의 농도로 첨가한 후 동일한 조건에서 배양을 계속하여 파골세포로의 세포분화를 유도하였다.
이때 본 발명에서 개발한 실험군 융합 펩티드 1과 대조군 융합 펩티드 1을 각각 1μM, 2.5μM, 5μM의 농도로 첨가하여 세포 배양하였다. 실험시 분화배지의 교환은 2일 간격으로 해 주었다. 그 결과 파골세포로의 정상적인 분화가 이루어지는 대조군과는 달리 실험군에서는 세포분화가 이루어지지 않음을 알 수 있었다.
도 2는 생쥐 골수에서 분리한 파골 전구세포가 RANKL 처리에 의한 파골세포로 분화되는 과정에서 RANK 저해 펩티드의 효과를 농도 별도 처리하여 TRAP 염색한 사진 (B) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)이다. 도 1은 융합 펩티드 1과 대조군 융합 펩티드 1을 첨가하여 배양하기 시작한 날로부터 4일째에 TRAP (tartrate resistant acid phosphatase) 염색하고 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 구체적으로, 상기 TRAP 염색은 세포를 3.7% 포름알데히드로 15분 동안 실온에서 고정시키고 증류수로 2회 세척한 후 Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) kitTM (Sigma Co.)의 사용설명서에 기재된 비율로 아세테이트, 패스트 가르넷 GBC 염기 (Fast Gargnet GBC base), 나프톨 AS-BI 인산, 소듐 니트라이트, 타르트레이트를 섞어 만든 염색액을 200㎕/웰을 넣고 37℃에서 20분 동안 반응시켜 이루어졌 다.
실시예
3: 길이가 축소된 세포 투과성
RANK
저해 펩티드에 의한 파골세포 분화 억제 효과
본 실시예에서는 RANK 저해 펩티드의 최소 활성 부위를 확인하기 위하여, 서열번호 8 내지 13의 실험군 융합 펩티드 1-6과 같이 일부 서열이 결실된 폴리펩티드를 사용하여 파골세포 분화 억제 효과가 있는지 확인하였다. 대조군으로는, 서열번호 14-19의 대조군 융합 펩티드 1-6을 사용하였다.
파골세포 분화 억제 실험은 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6을 각각 5μM의 농도로 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 하였다.
도 3은 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6의 구성을 나타내는 도면이다.
도 4는 실험군 융합 펩티드 1-6과 대조군 융합 펩티드 1-6이 파골세포 분화에 미치는 영향을 TRAP 염색한 사진 (A) 및 분화정도를 측정한 그래프 (B)를 나타낸다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 RANK 저해 모티프의 최소 활성 단편은 IIVVYV (서열번호 4)를 포함하는 6 내지 12개의 연속 아미노산 단편이 파골세포 분화 저해 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한, IIVVYV (서열번호 4) 서열로부터 N 말단의 I 및 C 말단의 V가 제거된 서열번호 5 및 6의 폴리펩티드는 파골세포 분화 저해 활성이 없었다.
실시예
4: 세포투과성
RANK
저해 펩티드
의
파골세포 뼈 흡수작용 억제 효능
파골세포 뻐 흡수작용 억제능을 살펴보기 위하여 칼슘포스페이트 나노크리스탈로 코팅한 연구용 뼈 흡수 측정용 세포 배양 용기인 OAASTM ((주)오스코텍: 한국)을 사용하였다.
태어난 지 5주 되는 생쥐 (C57BL/6J)로부터 채취한 골수세포를 OAASTM 48-웰 플레이트에 넣고, 대식세포 (macrophage) 분화 인자인 hM-CSF (R&D system Inc.)를 30ng/ml의 농도로 포함하는 분화배지 (α-MEM (invitrogen. co.,), 10%(v/v) 우태아혈청 (FBS), 100units/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신)에서 3일 동안 4x104 세포/웰로 37℃, 95%(v/v) 공기, 5%(v/v) CO2에서 배양하여 골수세포로부터 파생된 대식세포를 얻었다. 여기에 상기 30ng/ml의 농도의 hM-CSF에 더하여, 파골세포분화 인자인 생쥐 RANKL을 대장균에서 순수 분리정제하여 100ng/ml의 농도로 첨가한 후 동일한 조건에서 배양을 계속하여 파골세포로의 세포분화를 유도하였다.
48-웰 플페이트에서 파골세포로 분화를 시킨 후 새로운 분화 배지로 교환시에 서열번호 8과 14의 합성 펩티드를 각각 5μM 농도로 처리하고 48시간 동안 뼈 흡수작용을 살펴 보았다. 48 시간 후에 OAASTM 플레이트에서 세포배양 후 붙어 있는 세포들을 제거하기 위하여 OAASTM 플레이트를 증류수로 세척한 후 4-5% 소듐 히포클로라이트 (sodium hypochlorite) 용액을 넣어 5분간 방치하였다. 다시 증류수로 깨끗이 세척한 후 말린 다음 흡수된 부위를 관찰하였다. 파골세포에 의한 흡수와의 조직 계측을 위하여 광학현미경에 CCD 카메라가 내장된 Axiovert 200 (Carl Zeiss, Gottingen, Germany)로 화상을 얻었다. 얻은 화상을 면적계측 프로그램인 Image-pro Plus4.5 (Media Cybernetics, Inc.)를 사용하여 분석하였다.
도 5는 서열번호 8의 세포 투과성 RANK 저해 펩티드가 활성화된 파골세포의 뼈 흡수 활성을 억제하는 것을 나타내는 사진 (A) 및 그 정도를 정량화한 그래프 (B)이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 RANK 저해 펩티드를 처리한 실험군에서는 파골세포의 뼈 흡수 활성이 88% 감소됨을 알 수 있었다. 이는 파골세포로의 분화뿐만 아니라 이미 완전한 형태의 파골세포의 유지 및 기능을 억제하여 뼈 흡수작용을 못 하게 함을 나타내고 있다.
실시예
5: 세포 투과성
RANK
저해 펩티드
의
액틴
고리 형성 (
actin
ring
formation) 억제 효능
완전한 형태의 파골세포의 액틴 고리 형성을 억제하는 활성을 살펴보기 위하여, 실시예 2에 나타낸 바와 같이 48-웰 플레이트에서 파골세포로 분화를 시킨 후 6시간 동안 RANKL를 공급하지 않고 RANKL에 의한 세포신호전달을 중지시켰다.
다음으로, RANKL과 RNAK 저해 펩티드(서열번호 8) 및 대조군 펩티드 (서열번호 14)를 처리한 후 36시간 동안 배양하였다. 배양 후, 3.7%(v/v) 포름알데히드 (formaldehyde)로 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 0.1%(v/v) TritonX-100으로 세포에 구멍을 내고 Phalloidin-FITC (Sigma Chem. co., U.S.A)를 2μg/ml로 실온 에서 1시간 30분 동안 처리한 후 형광현미경을 통하여 액틴 고리형성을 관찰하였다.
도 6은 세포투과성 RANK 저해 펩티드가 파골세포에서 액틴 고리 형성을 억제하는 것을 나타내는 사진이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 액틴 고리가 정상적으로 만들어지고 유지되었지만, RANK 저해 펩티드 (서열번호 8)를 처리한 실험군에서는 무작위적이며 비정상적인 형태로 액틴 고리가 형성됨을 알 수 있었다.
실시예
6:
RANKL
또는
LPS
에 의해 유도되는 뼈 파괴작용에
RANK
저해 펩티드의 억제 효능
실제 생쥐에서 RANKL 혹은 LPS에 의해 유도되는 뼈 파괴작용의 억제 효능을 살펴보기 위하여 생후 7주 되는 생쥐의 머리뼈 두개관 (頭蓋冠; calvaria)에 대조군 펩티드를 10mg/kg으로 처리한 대조군 3그룹 (아무것도 처리하지 않은 무처리군, LPS (12.5mg/kg) 및 RANKL (2mg/kg) 처리 그룹으로 구성)과 서열번호 8의 RNAK 저해 펩티드를 10mg/kg으로 처리한 실험군 3그룹 (아무것도 처리하지 않은 무처리군, LPS(12.5mg/kg) 및 RANKL (2mg/kg) 처리 그룹으로 구성)의 총 6그룹을 4일간 매일 주입하였다. 5일째 생쥐 두개관을 채취해 그 단면을 H&E 염색하여 살펴 보았고, Image-pro Plus4.5 (Media Cybernetics, Inc.)를 이용하여 뼈 파괴작용 억제 정도를 분석하였다.
도 7은 RANKL 또는 LPS 주입에 의해 생쥐에서 발생되는 뼈의 파괴를 세포 투 과성 RANK 저해 펩티드가 억제함을 보여주는 사진 (A) 및 그 정도를 정량한 그래프 (B)이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 서열번호 8의 세포투과성 RANK 저해 펩티드를 함께 투여함으로써, LPS 주입에 의해 발생하는 뼈의 파괴가 평균 52% 저해됨을 알 수 있었고, RANKL 주입에 의한 뼈의 파괴가 평균 60% 저해되는 효과를 얻었다.
본 발명의 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드는, RANK 저해 활성을 가지고 있어, RANKL (RANK-ligand)에 의한 파골세포 분화의 억제, RANKL에 의한 활성화된 파골세포의 뼈 파괴 작용의 억제, RANKL에 의한 파골 전구세포의 세포융합의 억제, RANKL에 의한 파골세포 내 액틴 (actin) 단백질의 고리 (ring) 형성의 억제, 및 생쥐에 RANKL의 주입에 의하여 발생하는 뼈 파괴 과정의 억제 및 생쥐에 리포폴리사카리드 (lipopolysaccharide: LPS)의 주입에 의해 유발되는 뼈 파괴 과정의 억제 활성을 갖는다.
본 발명의 약학적 조성물에 의하면, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법에 의하면, 개체의 파골세포 분화를 억제할 수 있다.
본 발명의 치료 또는 예방하는 방법에 의하면, 개체의 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방할 수 있다.
<110> SungkyunKwan University Foundation for Corporation Collaboration
<120> A polypeptide inhibiting RANK, pharmaceutical composition
comprising the same, method of inhibiting osteoclast
differentiation, a method of treating or preventing a disease
caused by differentiation or activation of osteoclast, nucleic
acid encoding the polypeptide, vector comprising the nucleic acid
and a host cell transformed with the vector
<130> PN072903
<160> 21
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo
sapiens RANK cytomplasmic tail domain.
<400> 1
Lys Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo
sapiens RANK cytomplasmic tail domain.
<400> 2
Gly Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo
sapiens RANK cytomplasmic tail domain.
<400> 3
Asp Ile Ile Val Val Tyr Val Ser
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide inhibiting RANK induced activity derived from homo
sapiens RANK cytomplasmic tail domain.
<400> 4
Ile Ile Val Val Tyr Val
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail
domain.
<400> 5
Ile Val Val Tyr Val
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polypeptide derived from homo sapiens RANK cytomplasmic tail
domain.
<400> 6
Ile Ile Val Val Tyr
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cell permeability domain of human transcription factor Hph-1.
<400> 7
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 1
<400> 8
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Lys Gly Asp Ile Ile
1 5 10 15
Val Val Tyr Val Ser Gln Thr
20
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 2
<400> 9
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Asp Ile Ile Val
1 5 10 15
Val Tyr Val Ser Gln
20
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion proetin 3
<400> 10
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Asp Ile Ile Val Val
1 5 10 15
Tyr Val Ser
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 4
<400> 11
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Ile Val Val Tyr
1 5 10 15
Val
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 5
<400> 12
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Val Val Tyr Val
1 5 10 15
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cell permeability domain-RANK inhibitor fusion protein 6
<400> 13
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Ile Val Val Tyr
1 5 10 15
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control fusion protein 1
<400> 14
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Lys Gly Asp Ile Leu
1 5 10 15
Ala Val Tyr Val Ser Gln Thr
20
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control fusion protein 2
<400> 15
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Asp Ile Leu Ala
1 5 10 15
Val Tyr Val Ser Gln
20
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control fusion protein 3
<400> 16
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Asp Ile Leu Ala Val
1 5 10 15
Tyr Val Ser
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control fusion protein 4
<400> 17
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Leu Ala Val Tyr
1 5 10 15
Val
<210> 18
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control fusion protein 5
<400> 18
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Leu Ala Val Tyr Val
1 5 10 15
<210> 19
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Control fusion protein 6
<400> 19
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Ile Leu Ala Val Tyr
1 5 10 15
<210> 20
<211> 31
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile
1 5 10 15
Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Pro Gly Ser Ala
20 25 30
<210> 21
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Thr Phe Ile Ser Ser Gly Gln Val Met Asn Phe Lys Gly Asp Ile Ile
1 5 10 15
Val Val Tyr Val Ser Gln Thr Ser Gln Glu Gly Ala Ala Ala Ala
20 25 30
Claims (19)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로부터 선택되는 6 내지 12개의 연속 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 4번 내지 9번 아미노산 서열을 포함하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 서열번호 1 내지 4로 구성되는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 세포 투과성 폴리펩티드가 연결된 것을 특징으로 하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 제1항에 따른 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 것인, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 리더 신호 서열인 것을 특징으로 하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제5항에 있어서, 상기 리더 신호 서열은 카포시 섬유아세포 성장인자 신호서 열, HIV-1 tat (48-60), D-아미노산 치환된 HIV-1 tat (48-60), 아르기닌 치환된 HIV-1 tat (48-60), 드로소필라 안테나피디아 (Drosophila Antennapaedia)(43-58), 7 개 이상의 아미노산을 포함하는 바이러스 RNA 결합 펩티드, 7개 이상의 아르기닌을 포함하는 DNA 결합 펩티드 및 6 내지 8개 아르기닌을 갖는 폴리아르기닌 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제6항에 있어서, 상기 바이러스 RNA 결합 펩티드는 HIV-1 rev (34-50), HTLV-II rev (4-16), 브롬 모자이크 바이러스 Gag (7-25) 및 플록 하우스 바이러스 코트 단백질 (35-49)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제6항에 있어서, 상기 DNA 결합 펩티드는 인간 c-Fos (139-164), 인간 c-Jun (252-279), 및 효모 전사 인자 GCN4 (231-252)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 상기 세포 투과성 폴리펩티드는 서열번호 7의 인간 전사 인자 Hph-1의 세포 투과성 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제3항에 있어서, 서열번호 8 내지 11의 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 질병은 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 리포좀에 포집되어 있거나, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함된 바이러스 및 벡터의 형태로 존재하는 약학적 조성물.
- 제11항에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여, RANK를 매개로 한 신호 전달을 저해하는 단계를 포함하는, 개체의 파골세포 분화를 억제하는 방법.
- 제11항에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여, RANK를 매개로 한 신호 전달을 저해하는 단계를 포함하는, 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여 야기되는 질 병을 치료 또는 예방하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 질병은 골다공증, 관절염, 암에 의한 뼈 파괴, 대사성 뼈 질환, 백혈병 (leukemia) 및 다발성 마이엘로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 RANK 저해 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
- 제17항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
- 제18항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주세포.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070037155A KR100885545B1 (ko) | 2007-04-16 | 2007-04-16 | Ｒａｎｋ 저해 활성을 갖는 폴리펩티드, 그를 포함하는약학적 조성물, 그를 이용한 개체의 파골세포 분화를억제하는 방법 및 파골세포의 분화 및 활성화로 인하여야기되는 질병을 치료 또는 예방하는 방법, 그를 코딩하는핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포 |
| PCT/KR2008/002133 WO2008127066A1 (en) | 2007-04-16 | 2008-04-16 | Peptide inhibitors of receptor activator of nf-kb, and pharmaceutical composition including the same |
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