WO2015002378A1 - 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 골조직 생성 촉진용 약학 조성물 - Google Patents

멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 골조직 생성 촉진용 약학 조성물 Download PDF

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honey
bone
honey leaf
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최철웅
반상오
설희진
이규옥
장욱진
김희숙
김재용
강후원
이동욱
김선오
김재갑
박준영
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재단법인 전라남도생물산업진흥재단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for promoting bone tissue production, and more specifically, to use for the purpose of inhibiting and treating bone and cartilage tissue damage that can be safely used without toxicity and side effects using natural ingredients containing honey leaf extract. It relates to a pharmaceutical composition for promoting bone tissue production.
  • Bone tissue is generally made of dense bone with a strong surface of the bone, the center or both ends of the long bone ( ⁇ ⁇ ) is a bone of the corpus spongy bone ( ⁇ ⁇ ) associated with the bone. Most bones initially develop as cartilage in connective tissue, which later turns into bone tissue, some of which are made directly from connective tissue.
  • the joint surface is in contact with the neighboring bone, and the surface is covered with the articular cartilage, which is a natural bone.
  • Sea sponge shochu in the sponge is characterized by a certain arrangement. The wide course of the bony stem is continuous with the small lumen of sponge shochu and all are filled with bone marrow.
  • Hematopoietic bone marrow has a lot of blood vessels distributed in red color, called red bone marrow.
  • red bone marrow In the structure of bone, dense and spongy bones are overlapped with corrugated plates with a thickness of 5 to 12 ⁇ m. In dense material, several layers of concentric layers (harbor layer) are arranged in various directions. There is a harbor tube and blood vessels go through.
  • Bone cells are arranged between the bone lamina plates and are connected to other bone cells adjacent to each other by a protoplasma that leads to an irregular star shape.
  • a protoplasma On the surface of the bone is a tough connective tissue periosteum, and nerves and blood vessels are distributed to protect and nourish bone. Defects of the periosteum make it difficult to survive, develop, and regenerate bones.
  • the bone components are 20% moisture, 35% organic matter including cells, 45% minerals, because the constant elasticity of bone is organic. As age increases, minerals (mainly calcium phosphate) increase and bone hardness also increases.
  • the honey is Stauntonia hexaphylla , which belongs to the plant family, genus plant door, dicotyledonous plant, and buttercup. It is mainly distributed in Korea, Japan, Taiwan, China, etc., its main stem extends about 5m, leaves are alternate, and it is a palm-shaped double leaf with 5-7 small leaves. Small leaves are thick, egg-shaped or oval with flat edges. Petioles are 6-8cm long, petioles 3cm long. Flowers blossom in May, monogamous ( ⁇ ⁇ ), yellow-white, and hang on inflorescences.
  • the small flower branch of the female flower is reddish brown in autumn, and there are many trees.
  • Fruits are berry, egg-shaped or oval, 5 ⁇ 10cm long, ripened in reddish brown in October, and fruit flesh tastes better than um. Seeds are oval-shaped oval black.
  • the present invention is a natural material commonly available in our country by using honey leaf extract to extract the ethyl acetate fraction of the honey leaf hydrothermal extract, honey leaf hydrothermal extract for the purpose of providing a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of periodontitis or osteoporosis.
  • Cell ALP activity and osteoblast differentiation promoting experiment and bone or cartilage tissue promoting experiment were conducted.
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 10-2013-0020095 relates to a liver protective composition comprising a honey extract, and plant-derived honey extract for food has no side effects or safety problems, and carbon tetrachloride or acetanimophen (APAP), a liver toxic substance.
  • APAP carbon tetrachloride or acetanimophen
  • the composition discloses a pharmaceutical composition for treating or preventing liver disease or a food composition for improving liver function or protecting liver, as well as a composition that can be applied to various uses related to fatigue or hangover relief.
  • Korean Patent Publication No. 10-11675890 relates to an anti-inflammatory composition
  • an anti-inflammatory composition comprising honey fruit extract as an active ingredient.
  • the honey fruit extract is not only cytotoxic, but also confirmed the level of transcription and NO secretion of various cytokines (cytokine) mRNA associated with inflammation, the honey fruit of the various parts of the honey to inhibit inflammation most effectively
  • the anti-inflammatory composition comprising the same as an active ingredient has been disclosed with respect to an anti-inflammatory agent comprising a honey fruit extract, which can be applied as an anti-inflammatory and anti-inflammatory cosmetic composition having an anti-inflammatory effect in inflammation-related diseases.
  • Korean Patent Publication No. 10-1243115 discloses an antipyretic agent comprising a honey leaf extract as an active ingredient, which is not only cytotoxic but also has an excellent antipyretic effect compared to existing antipyretic agents. have.
  • Korean Patent Publication No. 10-1221617 relates to an anti-inflammatory composition
  • honey leaf extract as an active ingredient.
  • the honey leaf extract has not only cytotoxicity but also transcription level of cytokine (cytokine) mRNA related to inflammation.
  • an anti-inflammatory agent comprising a honey leaf extract that can effectively inhibit inflammation by confirming the inhibitory activity of the secretion amount and COX-2 enzyme that causes inflammation.
  • the honey extract is honey leaf hydrothermal extract, ethyl acetate fraction of the honey leaf hydrothermal extract for the purpose of utilizing the honey leaf extract as a natural material as in the present invention as a pharmaceutical composition for treating or preventing periodontitis or osteoporosis.
  • the composition used as a composition for promoting osteoblast production by extracting osteoblast ALP activity and osteoblast differentiation promoting experiment and promoting the production of bone or cartilage tissue is different from the present invention in that it is not disclosed.
  • the present invention by using a natural honey extract derived from the honey leaf as an active ingredient, a honeycomb extract containing a pharmaceutical composition for promoting bone tissue production that can be used for the inhibition and treatment of bone and cartilage tissue damage that is safe even without prolonged side effects.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting bone tissue production for the inhibition and treatment of bone and cartilage tissue damage, including a honey leaf crude extract or a non-polar soluble extract as an active ingredient.
  • the honey leaf crude extract is an extract available in any one of water, methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, or a mixed solvent thereof.
  • the nonpolar solvent may be any one selected from hexane, chloroform, dichloromethane and ethyl acetate. have.
  • the honey leaf hot water extract has the function of increasing ALP activity and osteoblast differentiation produced in osteoblasts, and the ethyl acetate fraction of the honey leaf hot water extract has the function of increasing ALP activity and osteoblast differentiation produced in osteoblasts.
  • the honey leaf extract is included as 0.01 to 99.9% by weight of the total pharmaceutical composition
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition is characterized in that the extract is provided in 10 to 1000mg / kg body weight.
  • the ethyl acetate fraction of the honey leaf hydrothermal extract, the honey leaf extract as an active ingredient may be used as a treatment for periodontitis or osteoporosis for treating or preventing periodontitis or osteoporosis.
  • 1 is a schematic diagram of the production of honey leaf hydrothermal extract and fractions
  • Figure 2 is a graph showing the effect on the ALP activity of the honey leaf hydrothermal extract (osteoblast-promoting activity through osteoblast differentiation).
  • Figure 3 is a graph showing the effect of honey leaf hydrothermal extract ethyl acetate fraction on the ALP activity.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of ALP activity staining of ethyl acetate fraction of honey leaf hydrothermal extract, honey leaf hydrothermal extract.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for promoting bone tissue production for inhibiting and treating bone and cartilage tissue damage, including crude honey leaf extract or non-polar soluble extract as an active ingredient, and treatment for periodontitis or osteoporosis using the same.
  • Figure 1 shows a schematic diagram for the production of honey leaf hydrothermal extract and fractions.
  • 10 kg of leaves of Stauntonia hexaphylla were washed with distilled water, 200 L of distilled water was added thereto, and extracted by heating at 110 ° C. for 4 hours with an electric bath.
  • the filtrate was filtered through a 400 mesh filter cloth and concentrated under reduced pressure. After filtration, the residue was extracted, filtered and concentrated under reduced pressure two more times using the same amount of distilled water.
  • the concentrated hot water extract was freeze-dried in a freeze dryer. Through this process, 1 kg (10%) of honey leaf hydrothermal extract was obtained.
  • honey leaf hot water extract prepared as shown in FIG. 1 was fractionated as follows using an organic solvent.
  • Figure 2 is a graph showing the effect on the ALP activity of honey leaf hydrothermal extract (osteoblastic activity through osteoblast differentiation).
  • osteoblasts exhibit ALP activity
  • the effect of the honey leaf hydrothermal extract obtained on the ALP activity in osteoblasts was measured.
  • C2C12 cells, osteoblasts were dispensed to 48 x 5 wells at 5 x 10 ⁇ 4 cells / well and cells were cultured for 3 days in ⁇ -MEM essential medium containing 10% FBS and 0.1% p / s of cell growth medium. Incubated. After 3 days, the cells were exchanged with ⁇ -MEM essential medium containing 1% horse serum and 0.1% p / s to induce osteoblast differentiation.
  • BMP-2 bone morphogenic protein-2
  • ALP activity was measured using a change in absorbance at 405 nm using ALP to decompose p-nitrophenylphosphate into p-nitrophenol and phosphate. Protein concentration was determined using the BioRad protein assay kit. ALP activity was expressed as PNP uM / min / mg protein.
  • honey leaf hydrothermal extracts obtained through the process of extracting the honey leaf hydrothermal and obtaining the fractions were treated to the osteoblasts (C2C12 cel) l by concentration, that is, the hydrothermal extract (10, 50ug / ml), and then cultured for 4 days.
  • the effect on ALP activity was measured and the results are shown graphically in FIG. 2.
  • FIG. 2 As shown in Figure 2, in the experimental group treated with BMP-2 and honey leaf hot water extract (10, 50ug / ml) at the same time, it was observed that the ALP activity increased in a concentration-dependent manner compared to the control group treated with BMP-2 .
  • Figure 3 is a graph showing the effect of honey leaf hydrothermal extract ethyl acetate fraction on the ALP activity.
  • osteoblasts exhibited ALP activity
  • the effect of the ethyl acetate fraction of the honey leaf hydrothermal extract obtained on osteoblasts in the osteoblasts was measured. Specifically, C2C12 cells, osteoblasts, were divided into 48 wells at 5 x 10 ⁇ 4 cells / well and cells were cultured for 3 days in ⁇ -MEM essential medium containing 10% FBS and 0.1% p / s of cell growth medium. Incubated.
  • the cells were exchanged with ⁇ -MEM essential medium containing 1% horse serum and 0.1% p / s to induce osteoblast differentiation. Thereafter, 10ng / ml of BMP-2 (bone morphogenic protein-2) was treated, and HP-20 column eluate HP20-2 of butanol fraction of honey leaf hydrothermal extract was treated simultaneously by concentration (5, 10ug / ml). After 4 days incubation. Subsequently, the cells were treated with AP assay buffer (kit) containing 0.01% Triton X, followed by centrifugation at 1000 x g for 5 minutes to obtain a sample for ALP activity detection.
  • kit AP assay buffer
  • ALP activity was measured using a change in absorbance at 405 nm using ALP to decompose p-nitrophenylphosphate into p-nitrophenol and phosphate. Protein concentration was determined using the BioRad protein assay kit. ALP activity was expressed as PNP uM / min / mg protein.
  • Ethyl acetate fractions of the honey leaf hydrothermal extracts were treated with different concentrations, that is, ethyl acetate fractions (5, 10 ug / ml) of the honey leaf hydrothermal extracts were treated with osteoblasts (C2C12 cells), and cultured for 4 days, followed by ALP activity of osteoblasts. The effect on the measurement was measured and the results are shown graphically in FIG.
  • ALP is an enzyme released by differentiation and activity of osteoblasts. Since the increase of ALP activity is directly related to osteoblast activity and increase, the increase of ALP activity by ethyl acetate of the honey leaf hydrothermal extract of the present invention It is to demonstrate the effect of promoting osteoblast formation by direct osteoblast differentiation and increased activity.
  • C2C12 cells, osteoblasts were dispensed into 48 wells at 5 x 104 cells / well and cultured for 3 days in ⁇ -MEM essential medium containing 10% FBS and 0.1% p / s of cell growth medium. After 3 days, the cells were exchanged with ⁇ -MEM essential medium containing 1% horse serum and 0.1% p / s to induce osteoblast differentiation. Thereafter, 10ng / ml of BMP-2 (bone morphogenic protein-2) was treated, and the samples were simultaneously treated for each concentration, followed by incubation for 4 days.
  • BMP-2 bone morphogenic protein-2
  • the culture solution of the cells after 4 days of incubation is removed and the cells are washed 3 times with 1xPBS. Fix the cells for 15 minutes at room temperature with 10% formalin solution and wash the cells 3 times with 1xPBS to remove residual formalin. The cells were washed again with 1 ⁇ alkaline phosphaste solution and then stained with AP active sites with NBT / BCIP substrate solution.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of ALP activity staining of ethyl acetate fraction of honey leaf hydrothermal extract, honey leaf hydrothermal extract. As shown in Figure 4, the experimental results of the positive control group treated only with BMP-2, it was confirmed that the cell staining by NBT / BCIP more than the normal group not treated with BMP-2 and the sample.
  • ALP is an enzyme released by osteoblast differentiation and increased activity. Since the increase of ALP activity is directly related to osteoblast activity and increase, the ALP activity by ethyl acetate fraction of the honey leaf hydrothermal extract of the present invention is increased. It can be said that the direct osteoblast differentiation and activation by the bone formation promoting effect.
  • a pharmaceutical composition for promoting the production of bone and cartilage tissue comprising crude honey leaf extract as an active ingredient and a treatment for preventing periodontitis or osteoporosis
  • Periodontitis, osteoporosis prevention or treatment using the pharmaceutical composition for promoting bone or cartilage tissue production powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, transdermals, suppositories so that the composition is contained in 0.01 to 99.9% by weight Or in the form of sterile injectable solutions.
  • the pharmaceutical composition may be contained in an amount of 0.01 to 99.9% by weight, and 99.9 to 0.01% by weight of purified water or glucose may be mixed.
  • the pharmaceutical composition may be freeze-dried to include 0.01 to 99.9% by weight, and vitamins and calcium may be prepared by mixing 99.9 to 0.01% by weight.
  • Daily dosage of the prepared pharmaceutical composition is provided in an amount of 10 to 1000mg / kg body weight of the extract.
  • the pharmaceutical composition may be prepared as a functional health food for periodontitis or osteoporosis improvement, prevention comprising 0.01 to 99.9% by weight.
  • the ethyl acetate fraction of the honey leaf hydrothermal extract, the honey leaf extract as an active ingredient may be used as a treatment for periodontitis or osteoporosis for treating or preventing periodontitis or osteoporosis, and by replacing the raw material with plants inhabiting nature, it may be expected to reduce the production cost and import substitution and export effect through industrialization.

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Abstract

본 발명은 조골세포분화 또는 연골세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 천연원료를 이용하여 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있는 멀꿀 잎 추출물을 함유하는 골 및 연골 조직 손상의 억제 및 치료를 위한 용도로 사용될 수 있는 골(조직) 생성 촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서의 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 치주염 또는 골다공증을 치료 또는 예방하기 위한 치주염 또는 골다공증 치료제로 사용될 수 있다.

Description

멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 골조직 생성 촉진용 약학 조성물
본 발명은 골조직 생성 촉진용 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 멀꿀 잎 추출물을 함유하는 천연원료를 이용하여 독성과 부작용이 없이 안전하게 사용될 수 있는 골 및 연골 조직 손상 억제와 치료를 위한 용도로 사용될 수 있는 골조직 생성 촉진용 약학 조성물에 관한 것이다.
골 조직은 대체로 뼈의 표면이 튼튼한 치밀골질로 이루어지고, 중심부 또는 장골(長骨)의 양 끝은 골질이 그물눈같이 연합된 해면골질(海綿骨質)로 되어 있다. 대부분의 뼈는 처음에 결합조직 중의 연골로서 발생하여 이것이 나중에 골조직으로 바뀌는데, 일부 뼈는 결합조직 중에서 직접 만들어진다.
골단(骨端)에서는 이웃뼈와 접하는 부분에 관절면이 있고, 그 표면은 초자연골(硝子軟骨)인 관절연골로 덮여 있다. 해면질 가운데의 해면소주(海綿小柱)는 일정한 배열로 되어 있는 것이 특징이다. 골 간부(骨幹部)의 넓은 수강(髓腔)은 해면소주로 된 소강(小腔)과 연속되어 있고 모두 골수로 채워져 있다.
조혈작용을 하는 골수는 혈관이 많이 분포되어 붉은색을 띠며, 적색골수라고 한다. 골질의 구조는 치밀질이나 해면질 모두 두께 5∼12㎛의 골판이 겹쳐 있는데, 치밀질에서는 동심원상으로 몇 층이 겹친 골층판(하버스 층판)이 여러 방향으로 배열되어 있고, 각 층판의 중심에는 하버스관이 있어 혈관이 통한다.
골 세포는 골층판 사이에 배열되어 있으며, 불규칙한 별 모양으로 가는 원형질 돌기로 인접한 다른 골세포와 연결되어 있다. 뼈의 표면에는 질긴 결합조직성 골막이 있으며, 신경과 혈관이 분포되어 뼈의 보호와 영양을 맡고 있다. 골막이 결손되면 뼈의 생존, 신생 및 재생 등이 곤란하게 된다. 골질의 성분은 수분 20%, 세포를 포함한 유기질 35%, 무기질 45%인데, 뼈의 일정한 탄력성은 유기질이 있기 때문이다. 연령이 증가함에 따라 무기질(주로 인산칼슘)이 증가하여 뼈의 경도도 증가한다.
한편 멀꿀은 학명 Stauntonia hexaphylla로서 식물계, 속씨식물문, 쌍떡잎식물강, 미나리아재비목에 속하는 식물이다. 주로 한국, 일본, 타이완, 중국 등지에 분포하고, 원줄기는 5m 정도 뻗어가고 잎은 어긋나며 5∼7개의 작은 잎으로 된 손바닥모양 겹잎이다. 작은 잎은 두껍고 달걀모양 또는 타원형이며 가장자리가 밋밋하다. 잎자루는 길이 6∼8cm, 작은 잎자루는 3cm이다. 꽃은 5월에 피고 1가화(一家花)이며 황백색이고 총상꽃차례에 달린다.
암꽃의 작은 꽃가지는 가을에 적갈색으로 되고 많은 피목(皮目)이 있어 거칠다. 열매는 장과(漿果)로 달걀모양 또는 타원형이고 길이 5~10cm이며 10월에 적갈색으로 익고 과육(果肉)은 으름보다 맛이 좋다. 종자는 달걀모양의 타원형으로 흑색이다.
본 발명은 우리나라에서 흔히 구할 수 있는 천연재료로서 멀꿀 잎 추출물을 이용하여 치주염 또는 골다공증 치료, 예방을 위한 약학 조성물을 제공할 목적으로 멀꿀 잎 열수추출물, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물을 추출하여 조골세포 ALP 활성 및 조골세포 분화 촉진실험 및 골 또는 연골조직의 생성 촉진 실험을 실시하였다.
실험 결과 멀꿀 추출물이 골조직 생성 촉진 및 예방과 관련한 효과가 있다는 것을 실험적으로 확인함으로서 멀꿀 추출물을 이용한 골생성 촉진용 약학 조성물 및 치료제를 제공하고자 한다.
국내 공개특허공보 제10-2013-0020095호에는 멀꿀 추출물을 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것으로 식용으로 식물 유래 멀꿀 추출물은 부작용이나 안전성에 대한 문제가 없고, 간 독성 물질인 사염화탄소 또는 아세트아니모펜(APAP)을 처리한 간독성 유도 실험동물 모델에서 유의적으로 지질과산화를 억제하고, 혈청 중 GOT 및 GPT 수치 증가를 억제하며, 간 보호, 간 손상 예방 및 간 기능 개선 효과가 있는 것으로 확인됨에 따라 본 발명의 조성물은 간 질환 치료 또는 예방용 의약 조성물 또는 간 기능 개선 또는 간 보호용 식품 조성물뿐만 아니라, 피로회복 또는 숙취해소와 관련된 다양한 용도로 응용될 수 있는 구성이 개시되어 있다.
국내 등록특허공보 제10-11675890호는 멀꿀 열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물에 관한 것이다. 상기 멀꿀 열매 추출물은 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 염증과 관련된 여러 사이토카인(cytokine)의 mRNA의 전사 수준 및 NO 분비량을 확인한 결과, 멀꿀의 여러 부위 중 멀꿀 열매가 가장 효과적으로 염증을 저해할 수 있는 것으로, 이를 유효성분으로 포함하는 항염 조성물은 염증과 관련된 질병에서 염증을 억제하는 항염증제 및 항염효과가 있는 화장료 조성물 등으로 응용될 수 있는 멀꿀 열매 추출물을 포함하는 항염증제에 관하여 개시되어 있다.
국내등록특허공보 제10-1243115호에는 멀꿀 잎 추출물이 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 기존 해열효과를 갖는 해열제와 비교하여서도 우수한 해열 효과를 갖는 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 해열제에 관하여 개시되어 있다.
국내 등록특허공보 제10-1221617호는 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염조성물에 관한 것으로 멀꿀 잎 추출물은 세포독성이 없을 뿐만 아니라, 염증과 관련된 사이토카인(cytokine)의 mRNA의 전사수준, NO 분비량 및 염증의 원인이 되는 COX-2 효소의 저해활성을 확인함으로서 효과적으로 염증을 저해할 수 있는 멀꿀 잎 추출물을 포함하는 항염증제에 관하여 개시되어 있다.
그러나 상기 선행 기술에는 멀꿀 추출물이 본 발명에서와 같이 천연재료로서 멀꿀 잎 추출물을 치주염 또는 골다공증 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물로 활용하기 위한 목적으로 멀꿀 잎 열수추출물, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물을 추출하여 조골세포 ALP 활성 및 조골세포 분화 촉진실험 및 골 또는 연골조직의 생성을 촉진실험을 통한 골생성 촉진용 조성물로서 이용되는 구성은 개시되지 않은 점에서 본 발명과는 차이를 보인다.
본 발명은 천연물인 멀꿀 잎 유래 추출물을 유효성분으로 사용함으로써 장기간 복용하여도 부작용 없이 안전한 골 및 연골 조직 손상의 억제 및 치료를 위한 용도로 사용될 수 있는 골 조직 생성 촉진용 멀꿀 잎 추출물 함유 약학조성물을 제공하고자 한다
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 멀꿀 잎 조추출물 또는 비극성가용 추출물을 유효성분으로 포함하는 골 및 연골 조직 손상의 억제, 치료를 위한 골조직 생성 촉진용 약학조성물을 제공한다.
멀꿀 잎 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매 중 어느 하나에서 가용한 추출물로서 상기 비극성 용매는 헥산, 클로로포름, 디클로메탄 및 에틸아세테이트 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
멀꿀 잎 열수추출물은 조골세포에서 생성되는 ALP 활성 및 조골세포 분화를 증가시키는 기능이 있고, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물은 조골세포에서 생성되는 ALP 활성 및 조골세포 분화를 증가시키는 기능을 갖는다.
또한, 멀꿀 잎 추출물은 전체 약학조성물의 0.01 내지 99.9중량%로 포함되며, 약학조성물의 1일당 투여량은 상기 추출물이 10 내지 1000mg/kg 체중으로 제공되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 멀꿀 잎 열수추출물, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물의 조골세포 ALP 활성 및 조골세포 분화를 촉진시킴으로써 골 또는 연골조직의 생성을 촉진하는 효과가 확인됨으로써 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 치주염 또는 골다공증을 치료 또는 예방하기 위한 치주염 또는 골다공증 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 멀꿀 잎 열수 추출물과 분획물의 제조 모식도이다
도 2는 멀꿀 잎 열수 추출물의 ALP활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(골아세포 분화를 통한 골형성 촉진 활성)이다.
도 3은 멀꿀 잎 열수 추출물 에틸아세테이트 분획물의 ALP활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 멀꿀 잎 열수추출물, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물의 ALP 활성 염색 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 멀꿀 잎 조추출물 또는 비극성가용추출물을 유효성분으로 포함하는 골 및 연골 조직 손상의 억제 및 치료를 위한 골조직 생성 촉진용 약학조성물 및 이를 이용한 치주염 또는 골다공증 치료제를 제공한다.
1. 멀꿀 잎 열수추출물 제조
도 1은 멀꿀 잎 열수 추출물과 분획물의 제조를 위한 모식도를 나타낸다. 멀꿀 (Stauntonia hexaphylla) 잎 10kg을 증류수로 수세한 다음, 증류수 200L를 가하고, 전기약탕기로 110℃에서 4시간 동안 가열하여 추출하였다. 400 메쉬 여과포로 여과한 다음 감압회전농축기로 농축하였다. 여과 후 남은 잔사에 다시 동량의 증류수를 사용하여 동일 과정으로 2번 더 추출, 여과 및 감압 농축한다. 농축된 열수추출물을 동결건조기(Freeze dryer)에서 동결건조 하였다. 이 과정을 통해 멀꿀 잎 열수추출물 1kg (10%)을 얻었다.
2. 멀꿀 잎의 극성용매, 비극성용매 가용 분획물의 제조
도 1에서 도시된 바와 같이 제조된 멀꿀 잎 열수추출물을 유기 용매를 이용하여 다음과 같이 분획하였다.
2.1. 헥산 가용성 분획 분리
멀꿀 잎 열수추출물로서 얻어진 멀꿀잎 추출물 250g을 5L의 증류수에 완전히 용해시킨 후에 분획여두에 넣고 헥산 5L를 첨가하여 헥산 불용성층(수층)과 헥산가용성층을 분리하였다. 다시 헥산 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 헥산 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
2.2. 클로로포름 가용성 분획분리
헥산불용성 분획(수층)에 클로로포름 5L를 가하여 섞은 후에 클로로포름가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 클로로포름 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 클로로포름 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
2.3. 에틸아세테이트 가용성 분획분리
클로로포름 불용성 분획(수층)에 에틸아세테이트 5L를 가하여 섞은 후에 에틸아세테이트 가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 에틸아세테이트 불용성층(수층)을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 에틸아세테이트 불용성 분획 및 가용성 분획를 수집하였다.
2.4. 부탄올 가용성 분획분리
에틸아세테이트 불용성 분획(수층)에 부탄올 5L를 가하여 섞은 후에 부탄올 가용성 분획 및 불용성 분획을 분리하였고, 부탄올 불용성층을 대상으로 동일한 공정을 3번 반복하여 부탄올 불용성 분획 및 가용성 분획을 수집하였다.
2.5. 물층 분획분리
멀꿀 잎 열수추출물 250g을 5L의 증류수에 완전히 용해시킨 후에 분획여두에 넣고 상기 헥산 가용성층, 클로로포름 가용성층, 에틸아세테이트 가용성층 그리고 부탄올 가용성층을 분획 분리 후 농축하여 남아있는 유기용매를 제거하고 물 분획을 수집하였다.
이와 같은 멀꿀 잎 열수 추출 및 분획물 수득과정을 통해 제조된 멀꿀 잎 열수추출물 250g에서 헥산 가용성 분획, 클로로포름 가용성 분획, 에틸아세테이트 가용성 분획 및 부탄올 가용성 분획을 감압 농축한 후에 동결 건조함으로서 헥산분획 0.02g(0.015), 클로로포름 분획 0.67g(0.27%), 에틸아세테이트 분획 2.62g(1.05%), 부탄올 분획 68.75g(27.5%), 물 분획 150.14g(60.06%) 을 얻어 시료로 사용하였다.
3. 멀꿀 잎 열수 추출물에 의한 조골세포의 AP 및 ALP의 활성측정
도 2는 멀꿀 잎 열수 추출물의 ALP활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프(골아세포 분화를 통한 골형성 촉진 활성)이다.
3.1 멀꿀 잎 열수 추출물에 의한 조골세포의 AP 활성측정
조골세포는 ALP 활성을 나타내므로, 상기에서 수득된 멀꿀 잎 열수 추출물이 조골세포에서 ALP 활성에 미치는 영향을 측정하였다. 구체적으로, 조골모세포인 C2C12 cells을 48well에 5 x 10^4 cell/well이 되도록 분주하고 세포성장 배지인 10% FBS, 0.1% p/s을 함유한α-MEM essential medium에서 3일 동안 세포를 배양하였다. 3일 뒤에 조골세포 분화를 유도하기 위하여 1% horse serum, 0.1% p/s을 함유한 α-MEM essential medium으로 교환해 주었다. 그 후 10ng/ml의 BMP-2(bone morphogenic protein-2)를 처리하고, 시료를 농도(10, 50ug/ml)별로 동시에 처리한 후 4일간 배양하였다. 이어 세포를 0.01% Triton X를 포함한 AP assay buffer (kit)로 처리한 후, 1000x g에서 5분간 원심분리하여 ALP 활성검색에 필요한 시료를 수득 하였다.
ALP가 p-니트로페닐포스페이트 (p-nitrophenylphosphate)를 p-니트로페놀 (p-nitrophenol)과 포스페이트(phosphate)로 분해시키는 것을 이용하여 405 nm에서의 흡광도의 변화를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다. 단백질의 농도는 BioRad 단백질 분석키트를 사용하였다. ALP 활성은 PNP uM/min/mg protein으로 나타냈다.
3.2. 멀꿀 잎 열수 추출물에 의한 조골세포의 ALP 활성측정
멀꿀 잎 열수 추출 및 분획물 수득과정을 통해 얻어진 멀꿀 잎 열수 추출물들을 각각 농도별로 즉, 열수추출물(10, 50ug/ml)을 조골모세포(C2C12 cel)l에 처리하고, 4일간 배양한 다음 조골세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 측정하고 그 결과를 도 2에 그래프로 나타내었다. 도 2에서 보는 바와 같이, BMP-2와 멀꿀 잎 열수추출물(10, 50ug/ml)을 동시에 처리한 실험군의 경우, BMP-2를 처리한 대조군에 비해 농도 의존적으로 ALP 활성이 증가하는 것으로 관찰되었다.
또한 멀꿀 잎 열수추출물(10, 50ug/ml)을 단독으로 처리한 경우, BMP-2를 처리하지 않은 정상군에 비해 농도 의존적으로 ALP 활성이 증가하는 것으로 관찰되었다. 이와 같은 결과는 ALP가 조골세포의 분화 및 활성 증가에 의해 방출되는 효소로서 이러한 ALP의 활성증가는 조골세포 활성 및 증가와 직접적으로 연관되어 있으므로, 멀꿀 잎 열수 추출물에 의한 ALP 활성의 증가는 직접적인 조골세포의 분화 및 활성증가에 의한 골형성 촉진효과를 증명하는 것이다.
4. 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 의한 조골세포의 AP 및 ALP의 활성측정
도 3은 멀꿀 잎 열수 추출물 에틸아세테이트 분획물의 ALP활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
4.1 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 의한 조골세포의 AP 활성측정
조골세포는 ALP 활성을 나타내므로, 앞서 수득된 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 조골세포에서 ALP 활성에 미치는 영향을 측정하였다. 구체적으로, 조골모세포인 C2C12 cells을 48well에 5 x 10^4 cell/well이 되도록 분주하고 세포성장배지인 10% FBS, 0.1% p/s을 함유한α-MEM essential medium에서 3일 동안 세포를 배양하였다.
3일 뒤에 조골세포 분화를 유도하기위하여 1% horse serum, 0.1% p/s을 함유한 α-MEM essential medium으로 교환해 주었다. 그 후 10ng/ml의 BMP-2(bone morphogenic protein-2)를 처리하고, 멀꿀 잎 열수 추출물의 부탄올 분획물의 HP-20 column 용출물 HP20-2를 농도(5, 10ug/ml)별로 동시에 처리한 후 4일간 배양하였다. 이어 세포를 0.01% Triton X를 포함한 AP assay buffer (kit)로 처리한 후, 1000 x g에서 5분간 원심분리하여 ALP 활성검색에 필요한 시료를 수득하였다.
ALP가 p-니트로페닐포스페이트 (p-nitrophenylphosphate)를 p-니트로페놀 (p-nitrophenol)과 포스페이트(phosphate)로 분해시키는 것을 이용하여 405 nm에서의 흡광도의 변화를 이용하여 ALP 활성을 측정하였다. 단백질의 농도는 BioRad 단백질 분석키트를 사용하였다. ALP 활성은 PNP uM/min/mg protein으로 나타냈다.
4.2 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 의한 조골세포의 AP 활성측정
멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 각각 농도별로 즉, 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물 (5, 10ug/ml)을 조골모세포(C2C12 cell)에 처리하고, 4일간 배양한 다음 조골세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 측정하고 그 결과를 도 3에 그래프로 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, BMP-2와 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물(5, 10ug/ml)을 동시에 처리한 실험군의 경우, BMP-2를 처리한 대조군에 비해 농도 의존적으로 ALP 활성이 증가하는 것으로 관찰되었다. 또한 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물 (5, 10ug/ml)을 단독으로 처리한 경우, BMP-2를 처리하지 않은 정상군에 비해 농도 의존적으로 ALP 활성이 증가하는 것으로 관찰되었다.
ALP는 조골세포의 분화 및 활성 증가에 의해 방출되는 효소로 이러한 ALP의 활성증가는 조골세포 활성 및 증가와 직접적으로 연관되어 있으므로, 본 발명의 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트에 의한 ALP 활성의 증가는 직접적인 조골세포의 분화 및 활성증가에 의한 골형성 촉진효과를 증명하는 것이다.
4.3. 멀꿀 잎 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 의한 조골세포의 AP activity 염색
조골모세포인 C2C12 cells을 48well에 5 x 104 cell/well이 되도록 분주하고 세포성장배지인 10% FBS, 0.1% p/s을 함유한α-MEM essential medium에서 3일 동안 세포를 배양하였다. 3일 뒤에 조골세포 분화를 유도하기 위하여 1% horse serum, 0.1% p/s을 함유한 α-MEM essential medium으로 교환해 주었다. 그 후 10ng/ml의 BMP-2(bone morphogenic protein-2)를 처리하고, 시료를 농도별로 동시에 처리한 후 4일간 배양하였다.
본 발명에서는 조골세포의 분화 유도인자인 BMP-2 (10ng/ml)를 처리한 양성대조군, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(5, 10ug/ml)을 단독 처리한 실험군, 아무것도 처리하지 않은 정상군으로 분류하여 각각 조골세포 분화(osteoblast differentiation) 정도를 NBT/BCIP 기질을 이용한 AP 활성자리 염색을 통해 측정하였다.
구체적으로 4일간 배양이 끝난 세포의 배양액을 제거하고 1xPBS로 3번 cell을 씻는다. 10% 포르말린 용액으로 실온에서 15분동안 cell을 고정시키고 1xPBS로 3번 cell을 씻어 잔여 포르말린을 제거한다. 1x alkaline phosphaste 용액으로 cell을 다시 씻어낸 다음 NBT/BCIP 기질용액으로 AP 활성자리를 염색하였다.
도 4는 멀꿀 잎 열수추출물, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물의 ALP 활성 염색 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4에서 나타낸 바와 같이, 실험결과 BMP-2만을 처리한 양성대조군의 경우, BMP-2와 시료를 처리하지 않은 정상군에 비해 NBT/BCIP에 의한 세포 염색이 더 많이 되었음을 확인하였다.
멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(5, 10ug/ml)을 단독 처리한 실험군의 경우, BMP-2와 시료를 처리하지 않은 정상군에 비해 NBT/BCIP에 의한 세포 염색이 더 많이 되었음을 확인하였다.
ALP는 조골세포의 분화 및 활성 증가에 의해 방출되는 효소로 이러한 ALP의 활성증가는 조골세포 활성 및 증가와 직접적으로 연관되어 있으므로, 본 발명의 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물에 의한 ALP 활성의 증가는 직접적인 조골세포의 분화 및 활성증가에 의한 골형성 촉진효과를 나타낸다고 할 수 있다.
5. 멀꿀 잎 조추출물을 유효성분으로 포함하는 골 및 연골 조직 생성 촉진용 약학조성물 및 치주염 또는 골다공증 예방 치료제
골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물을 이용한 치주염, 골다공증 예방 또는 치료제는 상기 조성물이 0.01 내지 99.9중량%로 포함되도록 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경피제, 좌제 또는 멸균 주사용 액으로 제형화하여 제조할 수 있다.
멸균주사액의 경우, 상기 약학조성물이 0.01 내지 99.9중량%로 포함하도록 하고 정제수 또는 포도당을 99.9 내지 0.01 중량%를 혼합하여 제조 가능하다. 캡슐제의 경우, 상기 약학조성물을 동결건조하여 0.01 내지 99.9중량%로 포함하도록 하고, 비타민제, 칼슘제을 99.9 내지 0.01 중량%를 혼합하여 제조 가능하다.
상기 제조된 약학조성물의 1일당 투여량은 상기 추출물이 10 내지 1000mg/kg 체중 포함되는 함량으로 제공한다.
또한 상기 약학 조성물을 0.01 내지 99.9중량%로 포함하는 치주염 또는 골다공증 개선, 예방용 기능성 건강식품으로도 제조 가능하다.
본 발명의 멀꿀 잎 열수추출물, 멀꿀 잎 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물의 조골세포 ALP 활성 및 조골세포 분화를 촉진시킴으로써 골 또는 연골조직의 생성을 촉진하는 효과가 확인됨으로서 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 치주염 또는 골다공증을 치료 또는 예방하기 위한 치주염 또는 골다공증 치료제로 사용될 수 있고 제조 원료를 자연에 서식하는 식물로 대체함으로 제조생산단가 절감과 산업화를 통한 수입대체 및 수출효과를 기대할 수 있을 것이다.

Claims (8)

  1. 멀꿀 잎 조추출물을 유효성분으로 포함하는 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물
  2. 제1항에 있어서, 상기 멀꿀 잎 조추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매 중에서 선택되는 어느 하나로부터 가용한 추출물인 것을 특징으로 하는 멀꿀 잎 조추출물을 함유하는 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물
  3. 제2항에 있어서, 상기 용매를 사용하여 추출한 황칠 잎 조추출물에 비극성용매로서 헥산, 클로로포름, 디클로메탄 및 에틸아세테이트 중에서 선택되는 어느 하나를 분획용매로 사용하여 분획한 것을 특징으로 하는 멀꿀 잎 조추출물을 함유하는 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물은 0.01 내지 99.9중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 멀꿀 잎 조추출물을 함유하는 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물
  5. 제4항에 있어서, 상기 추출물의 1일당 투여량은 체중 kg당 10 내지 1000mg/kg의 양으로 공급되는 것을 특징으로 하는 멀꿀 잎 조추출물을 포함하는 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 경피제, 좌제 또는 멸균 주사용 액으로 제형화된 것을 특징으로 하는 멀꿀 잎 조추출물을 포함하는 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서 상기 추출물은 치주염, 골다공증 예방 또는 치료용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 멀꿀 잎 조추출물을 포함하는 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 골 또는 연골조직 생성 촉진용 약학 조성물을 0.01 내지 99.9중량%로 포함하는 치주염 또는 골다공증 개선, 예방용 기능성 건강식품
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