KR102625435B1 - 천연발효효소복합액을 이용한 멀꿀 발효물과 이를 이용한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절건강증진용 조성물 - Google Patents

천연발효효소복합액을 이용한 멀꿀 발효물과 이를 이용한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절건강증진용 조성물 Download PDF

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홍기민
이달석
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Abstract

본 발명은 천연발효효소복합액을 이용한 멀꿀 발효물과 이를 이용한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 매실발효액과 식물혼합추출액을 혼합한 천연혼합발효액에, 유산균, 막걸리효모액과 버섯균사체, 그리고 효소 등을 첨가하여 배양한 천연발효효소복합액으로 멀꿀 추출액을 액상발효함으로써, 활성성분을 증대시키고 체내 흡수율을 향상시켜서 현저하게 우수한 기능성을 가지도록 제조된 멀꿀 발효물과 이를 이용한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용으로 사용하는 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

천연발효효소복합액을 이용한 멀꿀 발효물과 이를 이용한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절건강증진용 조성물{Fermented Stauntonia hexaphylla using a natural fermented enzyme complex and a composition for bone density improvement, bone growth promotion, height growth promotion or joint health promotion using the same}
본 발명은 천연발효효소복합액을 이용한 멀꿀 발효물과 이를 이용한 키 성장촉진 또는 관절건강증진용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 매실천연효소액과 식물혼합추출액을 혼합한 천연혼합발효액에, 유산균, 막걸리효모액과 버섯균사체, 그리고 효소 등을 첨가하여 배양한 천연발효효소복합액으로 멀꿀추출액을 액상발효함으로써, 활성성분을 증대시키고 체내 흡수율을 향상시켜서 현저하게 우수한 기능성을 가지도록 제조된 멀꿀 발효물과 이를 이용한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용으로 사용하는 조성물의 용도에 관한 것이다.
발효란 유기물이 미생물이나 효소에 의해 분해 및 변화되는 과정을 말한다. 부패 역시 본질적으로는 발효와 같은 과정을 거친다. 따라서 발효와 부패의 경계는 모호하다. 단지 미생물의 분해결과가 사람에게 이로운가 해로운가에 따라 부패와 발효를 구별하는 것뿐이다. 사람에게 유익하면 발효라고 하지만 유익한 것이 꼭 건강에 좋다는 것은 아니다.
이러한 발효과정은 일반적인 식품 등에서 다양하게 이루어지는데, 많은 경우 발효는 탄수화물이 분해될 때 일어나고 부패는 단백질이 분해될 때에 일어난다. 단백질은 분해될 때 그에 포함된 질소나 황에 의해 생기는 암모니아 등 질소화합물이나 황화수소 등 황 화합물이 유독하고 악취가 나기 때문이다. 이를 역이용하는 식품도 있는데, 그 대표적인 사례는 우리나라에서 전통식품으로 이용되고 있는 홍어를 예로 들 수 있다.
농산물을 주식으로 해온 우리나라는 발효를 이용한 전통식품이 특히 많고 다양한 방법으로 응용, 발전되어 왔다. 예를 들어 우리나라 전통식품으로 세계적인 관심을 받기 시작한 김치를 비롯하여, 된장, 고추장, 술, 빵 등 우리의 주된 먹거리는 상당수가 발효식품이라고 할 수 있다. 실제로, 발효식품은 면역력 증강, 항암, 항산화, 중성지방 감소, 항바이러스 작용 등 다양한 생리활성물질이 강화되는 것이 알려져 있다.
반면에, 이러한 식품들은 발효라는 특성 때문에 아플라톡신, 에틸카바메이트 등 인체에 해로운 물질들도 생성되는 것으로 알려져 있어서 세심한 주위와 발효조건의 정교한 제어가 필요하다.
그럼에도 불구하고, 최근 웰빙 등 소비 트랜드의 급격한 변화로 건강에 대한 관심이 높아지면서, 자연에서 구한 건강한 재료로 만든 친환경 소재에 대한 소비자의 요구가 증가되고 있으며, 발효공법 또한 식품의 거의 모든 분야에서 적용되고 있다.
이러한 발효공정이 적용된 식품, 건강식품, 첨가제, 의약품 원료 등이 가히 폭발적으로 다양하게 개발되고 있지만, 대체로 유산균이나 널리 알려진 발효균에 의존하여 발효 처리하여 식품이나 의약품 원료를 개발하거나 자연발효공법으로 발효식품을 제조하는 것이 대부분이고, 발효를 효과적이고 고부가가치화하기 위한 바이오 소재는 별로 제안된 바가 없다.
한편, 멀꿀(Stauntonia hexaphylla)은 으름덩굴과에 속하는 상록 덩굴식물로 한국, 일본, 타이완 등의 지역에 분포하며, 추위에 약해서 한반도의 남쪽 해안 지방과 섬 지역에 자생한다. 줄기는 녹색 또는 갈색으로 왼쪽으로 감아 오르며, 잎은 손 모양의 겹잎으로 두꺼우며 난형이고 표면에 광택이 있다. 꽃은 암수한몸 단성화이며 황백색의 꽃이 2~4개가 총상화서로 핀다.
멀꿀 열매는 10월 하순에서 12월 중순에 적자색으로 익는데 으름덩굴과 달리 익어도 벌어지지 않으며 장과로 달걀모양 또는 타원형이고 과육은 으름보다 맛이 달다. 종자는 흑색이며 보통 열매 하나에 100여개가 들어 있다. 완전히 익은 열매는 ‘꿀 같이 달다’고하여 ‘멀꿀’이라고 한다.
한방에서는 멀꿀의 줄기와 뿌리를 야모과(野木瓜)라고 하며, 심장이 약하거나 불완전할 때 기능을 정상으로 돌이키는 데 사용하는 강심제나, 체내의 불필요한 수분의 배출을 촉진하는 이뇨제로도 사용된다. 또한, 외상동통, 내장동통, 수술 후 동통, 신경통, 두통 등 각종 통증에 대한 진정 및 진통제로 쓰이고 있다. 이외에도 피하지방 축적의 억제, 관절질환, 자궁근종이나 안면신경통 등에도 효과 가 있다고 알려져 있다.
멀꿀은 매우 다양한 생리활성물질을 함유하고 있다. 열매에는 탄수화물, 아미노산, 무기질, 비타민 C 등의 다양한 영양성분들이 있으며, 열매와 잎, 줄기에는 크게 3그룹의 파이토케미컬이 존재한다.
멀꿀의 알려진 효능을 종합해 보면 멀꿀 열매 및 멀꿀 잎 추출물은 항산화, 항염증, 간 보호, 알콜성 간손상 보호, 해열, 진통, 소염, 관절염 예방 및 치료, 연골재생, 골밀도, 전립선 예방 및 치료, 항 당뇨, 눈 건강 특히 결막염, 이뇨작용, 우울증, 피로회복 등 매우 다양한 효능이 밝혀졌다. 멀꿀의 이와 같은 효능에 근거하여 건강식품, 의약품 및 화장품 등의 원료로 활용되고 있다.
이러한 멀꿀 추출물을 이용하는 기술로서, 종래에 한국공개특허 제10-2020-0022422호에는 멀꿀 잎 유래 추출물 또는 분획 정제물 또는 이로부터 분리된 신규 플라보노이드 화합물 및 카페인산 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염, 또는 골조직 생성 또는 연골조직 생성 촉진용 약학적 조성물이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2016-0008131호에는 멀꿀 잎 조추출물을 유효성분으로 포함하는 조골 또는 연골조직 생성 촉진용 기능성 식품조성물이 개시되어 있는 등 멀꿀추출물이 다양한 의약용도와 건강기능식품으로서 활용되고 있다. 이와 유사하게, 한국공개특허 제10-2018-0077998호에서 멀꿀 잎 조추출물을 유효성분으로 포함하는 조골 또는 연골조직 생성 촉진용 기능성 식품조성물, 한국공개특허 제10-2018-0077997호에서 멀꿀 잎 추출물로부터 분리된 신규한 플라보노이드 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 항염, 골조직 생성 또는 연골조직 생성 촉진용 조성물 등이 제안되어 있다.
그러나 이러한 멀꿀 추출물은 그 효과가 부족하여 상품화가 어려운 문제가 있고, 가공방법은 기존의 한약재를 추출 농축하는 수준에서 크게 벗어나지 않아서 아직도 그 가공방법이 전문적으로 연구되어 있지 않으며, 활용도가 부족한 실정이다.
따라서 멀꿀에 대한 가공기술을 개발하여 귀한 한약재의 기능성을 향상시키고 효율적인 활용이 가능하게 하는 기술 개발이 절실하다.
한국공개특허 제10-2020-0022422호 한국공개특허 제10-2016-0008131호 한국공개특허 제10-2018-0077998호 한국공개특허 제10-2018-0077997호
상기와 같은 종래기술의 문제들을 해결하기 위하여, 본 발명은 기존에 건강기능식품 등으로 사용되고 있는 멀꿀의 기능성을 향상시키고 활용성을 높일 수 있는 새로운 가공기술의 제공을 해결과제로 한다.
따라서 본 발명의 목적은 멀꿀을 특정 조건의 발효액으로 발효처리한 고기능성 발효물로 얻어진 멀꿀 발효물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 특정 발효액을 이용한 멀꿀 발효물을 유효성분으로 하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 멀꿀 발효물을 유효성분으로 하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용 건강식품 조성물, 약학조성물 또는 동물용 사료첨가제를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 발효된 멀꿀 발효물의 제조방법을 제공하는데 있다.
위와 같은 본 발명의 과제해결을 위하여, 본 발명은 매실천연효소액 30~70중량부와 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각, 황금 및 용안육을 함유하는 식물혼합추출액 30~70중량부가 혼합된 천연혼합발효액; 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)와 바실러스 아밀로리퀴피엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 포함하는 유산균; 막걸리효모액; 버섯균사체; 그리고 수미자임(Sumizyme), 얼티메이즈(Ultimase MFC), 파이르플로(Pyr-flo), 탄네이즈(Tannase) 중에서 선택된 하나이상을 포함하는 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소를 혼합하여 배양한 천연발효효소복합액으로, 멀꿀추출액을 액상발효한 것을 특징으로 하는 멀꿀발효물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 막걸리 효모액은 생막걸리를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 배양한 것이 바람직하게 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 버섯균사체는 동충하초, 차가버섯, 영지버섯, 능이버섯, 상황버섯, 운지버섯, 노루궁뎅이버섯 중에서 하나이상의 버섯 균사체를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액의 최종 발효 전 혼합물에 비타민 에이(vitamin A), 비타민 비 복합체(vitamin B complex) 및 비타민 씨(vitamin C) 중에서 2 이상의 복합비타민을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액의 최종 발효 전 혼합물에 아미노산, 식이유황(MSM) 중 하나 이상을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액은 매실천연효소액 30~70중량부와 상기 식물혼합추출액 30~70중량부가 혼합된 천연혼합발효액 85~95중량%에, 유산균 0.1~5중량%와 막걸리효모액 0.5~5중량%, 버섯균사체 1~10중량%, 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소 0.01~3중량%, 복합비타민 0.01~3 중량%, 아미노산 0.01~3 중량%, 식이유황 0.01~3중량%를 첨가하여 발효한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 멀꿀 발효물을 유효성분으로 함유하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 멀꿀 발효물을 유효성분으로 함유하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용 조성물은 건강식품조성물 또는 약학조성물로 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 멀꿀 발효물을 유효성분으로 함유하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용 조성물은 동물사료 첨가제로 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 매실천연효소액 30~70중량부와 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각, 황금 및 용안육을 함유하는 식물혼합추출액 30~70중량부를 혼합한 천연혼합발효액을 제조하는 단계;
상기 천연혼합발효액에 유산균과 막걸리효모액 및 버섯균사체를 접종하고 30~45℃에서 12~72시간 발효하는 단계;
상기 발효물에 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소와 복합비타민, 아미노산 및 식이유황을 첨가하여 30~45℃에서 1~6시간 발효하는 단계를 포함하는 천연발효효소복합액을 제조하는 단계;
멀꿀 추출액을 제조하는 단계;
상기 천연발효효소복합액을 이용하여 상기 제조된 멀꿀 추출액을 액상발효하는 단계;
상기 액상발효물을 농축하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 천연발효효소복합액을 이용한 멀꿀 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액은 상기 멀꿀추출액에 0.1~50부피%로 첨가하여 발효된 것일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 멀꿀 발효물은 기존에 알려지지 않은 새로운 구성의 천연발효효소복합액으로 멀꿀 추출액을 액상 발효하여 얻음으로써, 종래의 일반적인 멀꿀 추출물에 비해 맛과 풍미가 현저하게 증가할 뿐만 아니라, 우수한 영양성분을 크게 증대시켜서 우수한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진 등에 현저한 효과를 발휘할 수 있는 것이다.
또한, 본 발명에 의한 발효물은 특정 조성의 식물 성분이 혼합된 성분으로 발효함으로써 발효 효율을 크게 개선시키고, 특히 멀꿀의 유효성분 이외에 버섯균사체, 효소 등의 상호작용으로 인하여 세포벽을 분해하고 영양성분과 유효성분의 추출율을 높여서 기능성 성분의 체내 흡수율을 현저하게 향상시킬 수 있는효과를 발휘할 수 있다.
따라서 본 발명에 의해 제조된 멀꿀 발효물은 음용시에 거부감 없이 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진을 위한 제제로 효율적으로 제제화할 수 있어서 건강식품, 의약품, 사료첨가제 등으로 널리 활용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 천연발효효소복합액의 제조공정에 대한 예시도이다.
이하, 본 발명을 하나의 실시예에 의거 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 최근 한약재로 각광을 받고있는 멀꿀을 가공함에 있어서, 이를 보다 효율적으로 개선하고 기능성 성분의 증대와 체내 흡수율 개선 등을 위하여 새로운 원료를 이용하여 개발한 천연발효효소복합액을 이용한 멀꿀 발효물과 그 용도에 관한 것이다.
또한, 이러한 본 발명에 따른 천연발효효소복합액을 발효용 바이오 소재로 활용하여, 멀꿀 추출액을 액상 발효함으로써 세포벽의 분해를 통한 활성성분의 현저한 향상과 인체 흡수율이 개선되게 한 새로운 형태의 발효물을 제공하기 위한 기술에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 멀꿀은 멀꿀의 열매, 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 등 어느 부위든지 사용 가능하고 각 부위를 혼합하여 사용할 수 있다. 더 바람직하게는 멀꿀 열매와 잎 중 하나 이상을 사용할 수 있으며, 가장 좋기로는 멀꿀열매를 사용할 수 있다. 그러므로 본 발명에서 멀꿀은 이러한 모든 부위에 해당하는 부분들을 통칭하는 것으로 정의될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 멀꿀의 발효에 사용된 여러 효소, 효모, 균주 등을 매우 유익한 조건과 선택적 조합으로 구성함으로써, 본 발명의 특별한 효과와 기능 향상을 가능하게 한다는 점에서 멀꿀 발효물에 대한 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진에 대한 더욱 우수하고 현저한 개선 효과를 얻을 수 있다.
일반적으로 천연물의 발효는 발효대상이 되는 멀꿀의 원물이 함유하고 있는 기능성 유효성분과 이에 합당한 미생물의 선택에 의해서 그 유용성이 결정된다. 그러나 미생물이라고 하지만 결국은 미생물 내에 존재하는 특정 효소의 존재와 활성도가 더욱 중요하다. 모든 효소는 고유의 기질특이성을 가지고 있기 때문에 한 효소는 한 반응만 촉매하고 온도, pH, 염의 농도 등 특이한 조건을 요구한다.
본 발명의 바람직한 구성은 이러한 개념에 기초로 하고, 멀꿀이 함유하고 있는 유효성분들과 특정 미생물에 존재하는 효소들과의 상관관계가 발효물의 효율과 특성을 부여하는 점을 고려하여, 특정 성분의 조성과 발효조건으로 특정 조성의 천연발효효소복합액을 제조하고, 이를 이용하여 멀꿀 추출액을 액상발효시켜서 우수한 물성의 멀꿀 발효물을 얻을 수 있게 되는 것이다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 발효하기 전에 식물세포가 함유한 다양한 성분들을 손실함이 없이 최대한 노출될 수 있도록 효모 및 세포막 분해효소를 처리하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 다양한 성분들은 발효 미생물 고유의 효소 외에 탄네이즈 등 발효대상물에 존재하는 성분들을 변환시킬 수 있는 효소들을 첨가하여 어떤 천연물에서도 다양하고 많은 생리활성물질이 생성될 수 있는 다기능(multi-functional) 효소 복합물로 제조하고, 이를 이용하여 멀꿀을 발효함으로써 생체이용율도 현저하게 개선시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 멀꿀 추출액의 액상발효에 사용되는 상기 천연발효효소복합액은 매실천연효소액에 식물혼합추출액을 혼합 사용할 수 있는데, 여기서는 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각, 황금 및 용안육을 함유하는 식물혼합추출액을 구성하여 사용하는 것이 특징이다. 이러한 식물혼합추출액은 멀꿀 발효시 여러 유효성분의 균형을 유지하여 본 발명에 따른 용도인 골밀도 개선, 키성장, 뼈성장, 관절건강의 증진에 대한 개선 효과를 현저하게 증대시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 상기 식물혼합추출액에 사용되는 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각, 황금 및 용안육 등은 그 함량을 각각 1~2의 중량비율, 더 좋기로는 비슷하거나 동일함량의 비율로 사용할 수 있다. 이러한 식물혼합추출액은 한약재 처방의 효과가 있는 것이므로 이러한 식물혼합추출액의 구성에서 일부가 제외되면 키성장이나 뼈와 관절 건강 등의 효과가 저하될 수 있다.
한편, 본 발명에 따르면 상기 천연발효효소복합액에서 사용되는 막걸리 효모액과 매실천연효소액은 30~70 : 70~30의 중량비율, 더 좋기로는 2~3:3~2의 중량비율, 통상적으로는 서로 동일함량이나 비슷한 중량으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 매실천연효소액은 바람직하게는 5~30brix, 더 좋기로는 약 10brix인 것이 사용될 수 있고, 상기 식물혼합추출액도 바람직하게는 5~30brix, 더 좋기로는 약 10brix인 것이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 매실천연효소액과 식물혼합추출액은 30~70 : 70~30 중량부의 비율로 사용하는 것이 바람직한데, 만일 이 범위를 벗어나면 다양한 식물에 대한 발효과정에서 발효의 균형을 이루지 못하고 특히 효과적인 발효를 기대하기 어렵다,
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 사용되는 유산균은 효율적인 발효를 위해 사용되는데, 복합균인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)와 바실러스 아밀로리퀴피엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 혼합하여 사용할 수 있다. 또한, 예컨대 여기에 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus fermentum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Streptococcus thermophilus 중에 하나 이상을 추가로 사용할 수 있다. 여기서 유산균에 바실러스 아밀로리퀴피엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 혼합하는 것은 된장, 고추장 등 우리나라의 대표적인 발효식품에 존재하는 발효균으로서 질소대사를 촉진하기 위함이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이러한 유산균은 0.1~5중량%, 더 바람직하게는 0.5~3 중량%로 사용하는 것이 바람직하다. 만일 그 사용량이 너무 적으면 발효 효과가 저하되고, 너무 과다하면 과발효로 인하여 원하지 않는 물질 발생 등의 염려가 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액에서 상기 유산균과 더불어서 막걸리 효모액을 사용하는 바, 이러한 막걸리 효모액은 바람직하게는 생막걸리를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 배양한 것이 바람직하게 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이러한 막걸리 효모액은 0.5~5중량%로 사용하는 것이 좋은데, 더 바람직하게는 0.5~3중량%로 사용할 수 있다. 만일, 그 사용량이 너무 적으면, 발효 성능이 저하되고, 그 사용량이 너무 과다하면 과발효 문제가 발생하여 좋지 않고 유효성분의 향상 효과가 낮아질 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이러한 버섯균사체는 1~10중량%로 사용하는 것이 좋은데, 더 바람직하게는 1~5중량%로 사용할 수 있다. 만일, 그 사용량이 너무 적으면, 발효 성능이 저하되고, 그 사용량이 너무 과다하면 역시 과발효 문제가 발생하여 좋지 않고 경제적으로 불리하다. 이러한 버섯균사체로는 동충하초, 차가버섯, 영지버섯, 능이버섯, 상황버섯, 운지버섯, 노루궁뎅이버섯 중에서 하나이상의 버섯 균사체를 사용할 수 있다. 더 바람직하게는 동충하초 균사체가 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소는 식물 세포막을 분해하여 세포내 성분을 유출하고 고분자 물질을 저분자 물질로 또는 생리활성이 우수한 물질로 변환시켜서 흡수율을 향상시키는데 기여하는 바, 예컨대 수미자임(Sumizyme), 얼티메이즈(Ultimase MFC), 파이르플로(Pyr-flo), 탄네이즈(Tannase) 중에서 하나 이상을 바람직하게 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소는 0.01~3 중량%. 더 바람직하게는 0.05~1중량%로 사용하는 것이 바람직한데, 만일 그 사용량이 너무 적으면 흡수율 등이 저하되며, 과다하면 원하는 유효성분의 효능이 저하될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액의 최종 발효 전에 추가로 복합비타민을 0.01~1중량%로 첨가할 수 있다. 이러한 복합비타민으로서는 예컨대, 비타민 에이(vitamin A), 비타민 비 복합체(vitamin B complex) 및 비타민 씨(vitamin C) 중에서 2 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액의 최종 발효 전 혼합물에 아미노산, 식이유황 중 하나 이상을 추가로 함유할 수 있다. 특히, 이러한 천연발효효소복합액의 구성에서 복합비타민과 아미노산 및 식이유황을 추가로 함유하면 더욱 바람직하다.
본 발명에 의하면, 이러한 본 발명의 천연발효효소복합액은 기존에 알려지지 않은 새로운 조성의 식물혼합추출액 등의 구성 등 일련의 성분 구성을 새롭게 함으로써, 특히 멀꿀 추출액 발효시 서로 우수한 상승효과를 발휘할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기한 천연발효소복합액으로 멀꿀 추출액을 발효한 멀꿀 발효물을 새로운 구성으로 제안하는 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액은 매실천연효소액 30~70중량부와 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각, 황금 및 용안육을 함유하는 식물혼합추출액 30~70중량부를 혼합한 천연혼합발효액 85~95중량%에, 유산균 0.1~5중량%와 막걸리효모액 0.5~5중량%, 버섯균사체 1~10중량%, 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소 0.01~3중량%, 아미노산 0.01~3 중량%, 식이유황 0.01~3중량%를 첨가하여 발효한 것으로 바람직하게 제조될 수 있다.
본 발명은 이러한 천연발효효소복합액에 멀꿀 추출액을 액상 발효하는데, 그 액상발효 조건은 통상의 방법으로 액상발효할 수 있다.
본 발명에 의하면, 이러한 본 발명의 멀꿀 발효물은 일반적인 발효와는 달리 특정 식물 성분들이 발효 과정에 관여하여 그 발효 후의 기능성이 현저하게 개선되는 효과를 기대할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에서는 일반 발효가 아닌 본 발명에서 특별히 제조된 특정 조건의 성분으로 구성된 천연발효효소복합액으로 액상발효한 결과물로서, 발효 전의 멀꿀추출액과는 그 효과가 현저한 차이를 보이며, 기존의 일반적인 유산균 등을 이용하여 발효한 발효물에 비해서도 월등하게 우수한 효과를 얻을 수 있으며, 또 기호성과 활용성 측면에서도 우수한 효과를 나타낼 수 있는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 천연발효효소복합액을 제조하기 위한 방법과 이를 이용하여 멀꿀 발효물의 제조공정을 각 단계별로 하나의 실시예로 설명하면 다음과 같다.
(1) 사용원료의 제조
<매실천연효소액의 제조>
본 발명은 매실천연효소액 30~70중량부와 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각, 황금 및 용안육를 함유하는 식물혼합추출액 30~70중량부를 혼합한 천연혼합발효액을 제조하는 단계를 거친다.
여기서 사용되는 매실천연효소액은 매실에 설탕 또는 흑설탕을 1:0.8∼1.5의 중량비로 혼합하여 상온에서 3∼6개월 동안 발효시킨 것이 바람직하게 사용될 수 있다. 이러한 매실천연효소액은 상기 농도로 농축하여 사용하면 좋다.
이러한 매실천연효소액은 구체적으로는 예컨대, 청매실을 중량비율로 동량의 설탕으로 침지하여 음지 상온에서 3개월 이상 자연발효한 것으로 최종 농도가 5~30brix인 것을 바람직하게 사용할 수 있다. 여기서 사용된 청매실 대신 홍매실을 사용할 수 있고, 설탕은 흑설탕을 바람직하게 사용할 수 있다. 매실천연효소액의 당도는 상기 범위가 바람직한데, 그 이유는 첨가한 매실청이 이후 첨가할 유산균의 성장을 위한 탄소원을 제공할 수 있기 때문에 바람직한 환경으로 조성하는 것이다. 만일, 매실천연효소액의 당도가 너무 높으면 미생물의 성장과 효소의 활성도를 저해할 수 있다.
<식물혼합추출액의 제조>
본 발명에서 사용된 상기 식물혼합추출액은 상기 열거된 종류의 천연물을 이용하여 예컨대, 10배 내지 20배 용량의 정제수를 가하고 80∼98℃에서 5~15시간. 좋기로는 8시간 침지한 후 여과하여 5~30brix로 만들어 사용할 수 있다. 추출은 천연물의 종류에 따라서 1, 2회 더 수행할 수 있고 이들을 합하여 제조할 수 있다. 추출 용매는 극성용매, 바람직하게는 30∼90% 주정을 사용할 수 있다.
<막걸리효모액의 제조>
본 발명에서 사용되는 막걸리효모액은 예컨대, 생막걸리에 막걸리 대비 설탕 2~10%(w/v)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 3~7%를 첨가한 후 25~40℃, 더 좋기로는 28~32℃에서 2~10일, 더 좋기로는 3~5일 동안 배양하여 제조할 수 있다. 더욱 바람직하게는 생막걸리에 설탕 3~4%(w/v)와 사카로마이세스 세레비지애를 첨가한 후 30℃에서 4일 동안 배양하여, 이후 단계인 발효과정에서 효모의 활성이 최적화된 막걸리효모액으로 제조할 수 있다.
(2) 천연발효효소복합액의 제조
상기 방법으로 제조되는 매실천연효소액 30~70중량부와 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각, 황금 및 용안육을 함유하는 식물혼합추출액 30~70중량부를 발효하여 천연혼합발효액을 제조할 수 있다.
이러한 천연혼합발효액에, 유산균과 막걸리효모액 및 버섯균사체를 접종하고 30~45℃에서 12~72시간 발효한다. 여기서 사용되는 매실천연효소액, 식물혼합추출액과 및 막걸리효모액은 상기와 같은 방법으로 제조될 수 있다.
그 다음으로는, 상기 발효물에 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소와 실리카를 첨가하여 30~45℃에서 1~6시간 발효하는 단계 거쳐서 천연발효효소복합액을 제조할 수 있다. 여기서 더 바람직하게는 복합비타민을 추가로 사용할 수 있으며, 아미노산, 식이유황 중 하나 이상을 추가로 혼합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 이러한 복합비타민과 아미노산, 식이유황 등을 추가로 사용하는 경우 이를 사용하지 않는 경우에 비하여 추후 이를 이용하여 멀꿀 추출액을 액상발효하였을 때, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진 효과가 현저하게 더 우수한 효과를 보일 수 있다.
(3) 멀꿀 추출액의 제조
멀꿀 열매를 준비하여 통상의 방법으로 압착하여 멀꿀 추출액을 제조하거나, 예컨대 멀꿀 열매 또는 멀꿀 열매와 잎의 혼합물에 대하여 건조중량의 10~50배 용량의 정제수를 가하고 80~100℃에서 1~24시간 추출하여 멀꿀 추출액을 제조할 수 있다. 여기서, 열매와 잎의 혼합시에는 멀꿀의 전체 조성물 대비 열매 20~80중량%, 잎 20~80중량% 비율로 혼합하여 사용할 수 있다.
(4) 액상발효
본 발명의 바람직한 실시에에 의하면, 상기 제조된 멀꿀 추출액을 상기 제조된 천연발효효소복합액을 이용하여 액상발효시킨다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 천연발효효소복합액은 상기 발효원료인 멀꿀 추출액에 0.1~50부피%로 첨가하여 액상발효시킬 수 있다. 만일, 그 사용량이 적으면 발효가 제대로 일어나지 않게 되고, 그 사용량이 과다하면 과발효로 인해 부작용이나 부생성물이 나타날 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 액상발효에서는 상기 발효원료에 상기 천연발효효소복합액을 0.5∼50부피%, 더 좋기로는 1~10부피%로 첨가 또는 분사하고 15℃∼45℃, 더 바람직하게는 17~37℃에서 1시간 내지 30일 동안 발효하는 단계를 거쳐서 액상발효로 얻어지는 멀꿀 발효물을 얻을 수 있다. 이러한 멀꿀 발효물은 멀꿀발효 농축액으로 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 액상발효 과정에서 활성화된 유산균과 막걸리, 효모, 아미노산 및 추가로 첨가되는 물질 등을 포함한 최종농도가 약 0.01∼1.0% 수준으로 유지되는 것이 바람직하다.
상기와 같이 멀꿀 추출액을 상기 천연발효효소복합액으로 액상발효한 멀꿀 발효물은 기존의 멀꿀 추출물이나 멀꿀의 일반적인 발효물에 비해 그 기능성분의 구성과 골밀도 개선이나 키성장, 뼈건강, 관절건강 등에 대한 개선 효과가 매우 우수한 결과로 나타난다. 이것은 멀꿀을 단순하게 유산균이나 효소 등으로 발효하는 것과는 달리 본 발명에 따른 특정 식물혼합추출액을 이용하는 일련의 조성을 가지는 천연발효효소복합액을 이용하여 액상발효를 수행함으로써 발현되는 것으로서, 각 사용성분들의 상승효과와 유효성분의 상호작용으로 인한 우수한 효과의 결과로 보인다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기와 같이 제조한 천연발효효소복합액은 Lactobacillus와 대표적인 토종 발효균인 Bacillus amyloliquefaciens 및 효모를 포함하여 제조할 수 있으며, 이를 사용하는 경우 이 균들은 자체가 가지고 있는 고유의 효소반응 외에 산화질소 대사를 촉매하는 nitrate reductase 효소도 함유되어 있다. 또한, 천연발효효소의 주요 성분인 매실천연효소액은 다량의 설탕을 함유하고 있어 본 발명에 따른 특정 구성의 식물혼합추출액 성분들과 함께 본 발효시 미생물 성장에 필요한 탄소원 등 영양분을 제공할 수 있다. 그러므로 발효 효과가 현저하게 개선될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소인 Sumizyme, Pyr-flo, Ultimase 등은 cellulase, Hemi-cellulase, β-glucosidase, arabinosidase, 및 pectinase 등을 함유할 수 있어서 세포막, 세포벽을 분해하고 유출된 활성성분을 가수분해하여 다양한 성분으로 변환할 수 있다. 그리고 추가로 첨가하는 복합비타민 등은 유산균의 성장이나 효소의 촉매반응을 활성화할 수 있다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 멀꿀 발효물은 천연물의 영양성분 추출율을 높여 체내 흡수율을 상승시키며, 인체에 유익한 항산화 물질, 산화질소 전구체 등 다양한 생리활성 성분이 크게 증가된 발효물로 얻을 수 있어서, 종래의 멀꿀 가공품과는 현저하게 차별화되어 경쟁력이 높은 제품의 생산 가능하다.
본 발명에 따르면 이렇게 제조된 멀꿀 발효물은 골밀도 개선 등의 효과와 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진 등에 현저하게 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 효과는 기존과 다른 사용 성분의 구성에 의한 발효의 결과로 인해 더욱 우수한 효과를 보이는 것으로 판단된다.
더욱이, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 멀꿀 추출액의 액상발효에 이용되는 천연발효효소복합액 제조과정에서 사용되는 아미노산 등은 멀꿀추출액의 발효과정에 첨가되어 다른 성분들과의 상승 작용으로 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진 효과를 향상시키는데 기여한다.
본 발명에 의하면, 이러한 아미노산, 식이유황 등은 키 성장이나 관절 개선에도 기여하는 성분이다. 그러므로 이러한 멀꿀 발효물에 아미노산 등을 추가 사용하면 효과가 더욱 개선될 수 있다.
그러나 본 발명에서는 이러한 아미노산 등을 단순 혼합하여 사용하지 아니하고 천연발효효소복합액의 제조과정에 사용하고, 이를 이용하여 멀꿀 추출액을 액상발효하는데 사용하기 때문에 그 자체로서 더욱 바람직한 효과를 발휘하고, 발효과정에서 다른 천연성분들과의 상승효과 및 멀꿀 추출액 성분과의 상승효과가 더욱 향상됨으로 인하여 매우 우수하고 예측할 수 없는 우수한 골밀도 개선이나 뼈 성장촉진 또는 키 성장촉진 또는 효과를 발휘할 수 있으며, 조골이나 연골조직 생성 촉진, 성장판 증식 등 관절 건강증진 효과를 발휘하는 것이다.
따라서 본 발명의 멀꿀 발효물은 여러 기능 성분이 매우 복합적이고 바람직한 형태로 존재하여 골밀도 개선, 뼈 성장촉진, 키 성장촉진 또는 관절 건강증진용의 건강식품 또는 의약품이나 동물용 사료첨가제 등에 매우 유용한 원료로 널리 활용될 수 있을 것이다. 이 경우 다양한 통상의 첨가제가 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의거 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 멀꿀 발효물의 제조
(1) 생막걸리에 생막걸리 대비 흑설탕 3.5%(w/v)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 5%(w/v)를 접종한 후 30℃에서 4일 동안 배양하여 막걸리 효모액을 제조하였다.
(2) 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각 및 용안육을 각 10중량%씩 혼합한 식물혼합물에 그 식물혼합물 대비 정제수 8배(v/w)를 첨가한 후 90℃에서 8시간 동안 추출하여 식물혼합추출액을 제조하였다.
(3) 매실과 설탕을 1:1 중량비율로 혼합한 후 25~30℃에서 동안 숙성시킨 후 여과하여 매실천연효소액을 제조하였다.
(4) 상기 (2)단계에서 제조한 식물혼합추출액과 상기 (3)단계에서 제조한 매천연효소액을 7:3의 중량비율로 혼합하여 식물혼합효소액을 제조하였다.
(5) 10브릭스의 상기 식물혼합추출액을 얻고, 여기에 10브릭스의 상기 매실천연효소액을 동량 혼합하고, 여기에 이들 혼합액 대비 lactobacillus brevis (1x108cfu/ml)와 Bacillus amyloliquefaciens(1x108cfu/ml)를 각각 0.5중량%, 그리고 막걸리효모액 1중량%와 동충하초 균사제를 3중량% 첨가하고 37℃에서 24시간 회전 보온기에서 배양하여 천연혼합발효액을 제조하였다.
(6) 상기 천연혼합발효액에 수미자임(Sumizyme), 얼티메이즈(Ultimase MFC), 파이르플로(Pyr-flo), 탄네이즈(Tannase) 각각 0.5 중량%와, 아미노산 1중량%, 식이유황 0.5중량% 및 복합비타민(비타민A, 비타민B 복합체 및 비타민C)을 첨가하고 37℃에서 2시간 더 배양하여 천연발효효소복합액을 제조하였다.
(7) 멀꿀 추출액의 제조
멀꿀 원료 준비를 위하여, 멀꿀 열매는 2021년 10월에서 12월 사이에 전남 장흥지역에서 수확한 완숙과를 사용하였다. 멀꿀 줄기와 멀꿀 잎은 5년생 이상된 멀꿀 나무에서 12월에 채취하였다. 줄기와 잎의 채취는 늦은 가을에서 겨울에 수확한 것을 사용하였다. 수확한 멀꿀 열매는 정제수로 잘 세척한 후 약 0.7~1.cm 두께로 절단하여 건조하였다. 줄기는 5~10 cm 길이로 절단하고, 잎은 그대로 세척하고 건조하였다. 모든 멀꿀 원료는 50℃ 이하에서 열풍 건조하였고, 수분이 14~15% 수준으로 될 때까지 건조하였다.
본 시료 제조를 위해 상기 채취하여 준비된 멀꿀 열매와 잎을 사용하였다. 멀꿀 열매와 잎의 추출액 제조는 열매와 잎을 각각 추출하거나 혼합하여 동시에 추출할 수 있다. 본 실험에서는 멀꿀 열매와 잎에 대하여 각 건조중량의 20배 용량의 정제수를 가하고 90±2℃에서 6시간 2회 추출하였다. 그리고 열매와 잎 혼합 추출액으로 제조된 각각의 추출물을 동일한 량으로 혼합하여 멀꿀 추출액을 제조하였다.
(8) 상기 (7)단계에서 제조된 멀꿀 추출액에 상기 제조된 천연발효효소복합액을 10부피% 되게 첨가하였다. 이를 37℃에서 24시간 동안 발효시켜서 액상발효된 멀꿀 발효물을 얻었다.
(9) 상기 제조된 멀꿀 발효물은 농축하여 농축액으로 제조하였다.
실시예 2
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 멀꿀 발효물을 제조하되, 상기 천연발효효소복합액 제조시에 복합비타민, 아미노산, 식이유황을 사용하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 멀꿀 발효물을 제조하였다.
실시예 3
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 멀꿀 발효물을 제조하되, 천연발효효소복합액 제조시에 얼티메이즈(Ultimase MFC), 파이르플로(Pyr-flo), 탄네이즈(Tannase)를 사용하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 멀꿀 발효물을 제조하였다.
비교예 1
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 멀꿀 발효물을 제조하되, 천연발효효소복합액을 이용하지 아니하고 수미자임과 상기 사용한 유산균만 사용하여 액상발효를 진행하여 멀꿀 발효물을 제조하였다.
비교예 2
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 멀꿀 발효물을 제조하되, 상기 천연발효효소복합액 제조시에 상기 조성의 식물혼합추출액을 사용하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 멀꿀 발효물을 제조하였다.
비교예 3
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 멀꿀 발효물을 제조하되, 천연발효효소복합액 제조시에 막걸리효모액과 버섯균사체를 사용하지 않은 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 멀꿀 발효물을 제조하였다.
비교예 4
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 멀꿀 발효물을 제조하되, 상기 천연발효효소복합액 제조시에 상기 조성의 식물혼합추출액 대신 다른 조성(황기, 마늘, 오가피, 연자육, 인삼 및 감태)을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 멀꿀 발효물을 제조하였다.
비교예 5
상기 실시예 1과 동일한 방법으로 멀꿀 발효물을 제조하되, 상기 천연발효효소복합액 제조시에 상기 조성의 식물혼합추출액 대신 다른 조성(숙지황, 산약, 목단피, 산수유)을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 실시하여 멀꿀 발효물을 제조하였다.
실험예 1 : 자유라디칼 소거능(DPPH)
상기 실시예와 비교예의 시료에 대한 자유라디칼 소거능 측정은 DPPH법을 사용하였다. 즉, DPPH를 0.2 mM농도로 에탄올에 용해한 후, 20 ㎕의 시료와 180 ㎕의 DPPH 용액을 96 웰플레이트에 첨가하고 암소에서 강하게 진탕하면서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 측정 결과는 하기 표와 같다.
시료 저해율 (%)
5㎍/ml 10㎍/ml 50㎍/ml 100㎍/ml
실시예 1 24 45 67 79
비교예 1 12 19 22 28
비교예 5 18 27 36 54
대조약물(카제인산) 42 51 80 -
실험예 2 : NK세포 활성측정
20g 내외의 4주령 수컷C57BL/6M 마우스를 명암은 12시간(light/dark cycle), 온도는 23±2℃, 상대습도는 50±5%인 조건에서 1주 동안 적응기를 거쳐 실험에 이용하였다. 적응기간 동안 AIN-93G 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 체중을 측정하여 평균 체중에 가까운 개체를 무작위 법으로 8마리씩 7군으로 분리하였다.
적응기간이 끝나고 시료의 섭취는 2주간 경구투여로 진행하였으며, 희생 4일전 첫 강제수영운동을 실시하였고, 3일간의 휴식기를 거쳐 희생 하루전 2차 강제수영운동을 실시하였으며, 희생당일 3차 강제 수영운동을 실시하였다. 강제수영운동은 한계수영을 기준으로 진행되었다.
실험동물은 12시간 절식시킨 후 마취시켜 개복하여 복대동맥을 통해 채혈하였다. 전혈을 sample로 사용해야 하는 경우, 채혈 전 주사기와 tube에 10% EDTA solution을 충분히 적셔 혈액응고를 방지하였고, 장기 무게를 측정한 후 실험에 필요한 spleen은 splenocytes로 분리하였다.
분리한 splenocyte를 96well plate에 각 well당 5X105cells/well씩 분주한다. 표적세포는 Yac-1 cell로 1X104cells/well씩 분주한다. Sample을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액 50ul을 새로운 plate에 분주하고 Cytotox 96 Non-radioactive Cytotoxicity assay kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 이용하여 ELISA reader (Bio-Rad)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 NK cell의 활성도를 측정하였다.
자연살해세포는 과거에 항원을 인식한 적이 없는 상태에서도 활성화되어 반응하기 때문에 선천면역에서 virus에 감염된 세포, 종양세포, 또는 비정상적인 세포를 인지하여 사멸시키는 역할을 하며 IL-2, IL-12, IL-15 등의 대식세포에서 분비되는 cytokines에 의해 자극되어 활성화되며 IFN-γ등의 분비를 증가시킨다.
또한, 자연살해세포는 MHC class I 발현의 변화를 인식하여 감염되지 않는 정상 세포에 공격을 막음으로 감염된 세포와 결합하여 선택적으로 세포사멸을 유도시킨다. 자연살해세포가 제거할 수 있는 대상은 다양하게 알려져 있지만 자연살해세포의 활성능에 이용되고 있는 세포는 mouse의 경우 Moloney virus-induced lymphoma 세포주인 YAC-1 세포가 가장 널리 알려져 있다. 따라서 여기서는 YAC-1 세포를 target cell로 설정하고 자연살해세포를 effector cell로 설정하여 co-culture하여 천연소재들의 처리가 자연살해세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
그 결과, 정상대조군(NC) 대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 실시예 시료에서 유의적으로 증가하였다. 특히, 실시예 1의 멀꿀 발효물 (200 μg/mL)에서 가장 많은 활성이 나타났다.
NK activity (% of normal control)
실시예 1 90
실시예 2 87
실시예 3 88
비교예 1 45
비교예 2 49
비교예 3 54
비교예 5 61
NC 100
C 41
PC 112
실험예 3 : 혈중 NO 생성능 측정 실험
Nitric oxide 생성능을 측정하기 위하여 Ll venes 등의 방법을 참고하였고, Nitric Oxide Assay Kit (abcam, cambridge, MA, USA)를 사용하였다. Assay 용 96well plate에 standard와 분리한 혈액 serum을 sample로 사용하여 85 μL 씩 분주하였고, Nitrate reductase와 Enzyme cofactor을 5 μL씩 분주하였으며, plate sealer를 씌워 실온에서 1시간 방치하였다. 각 well에 Enhancer 5 μL씩 분주하여 실온에 10분 더 반응시킨 후, Griess Reagent R1과 R2를 각각 50 μL 씩 분주하여 반응시키며 ELISA reader (Bio-Rad) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
탐식작용을 하는 동안 대식세포에서는 탐식된 병원균을 죽이기 위하여 다양한 독성 물질들을 생산, 중요한 독성물질 젓 하나가 NO이며, 선천 면역과 적응 면역 간 경계에서 중요한 역할을 하여 세균, 바이러스, 미생물 등의 병원균을 사멸시키는 매개체로 작용한다. 본 실험에서의 결과는 다음 표에 나타내었다.
시료 총 NO 량(μmol/ml)
실시예 1 122
실시예 2 125
실시예 3 124
비교예 1 181
비교예 2 153
비교예 3 161
비교예 4 146
비교예 5 141
NC 100
C 195
PC 121
혈중 NO의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 현저하게 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 실시예의 시료에서는 양성대조군(PC)에 수준으로 현저하게 감소하였다.
실험예 4 : 경골 길이 및 성장판 증식 확인 실험
실험 동물은 3주령의 웅성 Sprague-Dawley(SD) 계열 흰쥐(60± 10 g)를 이용하였다. 실험 동물은 사육케이지(42 × 28 cm)을 이용해 실험실 온도 22-24℃, 습도 60±5%가 유지되며 밤낮 주기(12시간 light/ 12시간 dark)가 자동 조절 장치에 의해 조절되는 경희대학교 동물실에서 1주간 예비 사육 후 2주 동안 사육되었다.
실험동물에 대하여 무작위 추출법에 의해 군당 6마리씩 5개군으로 분류하였다. 시료 처치군은 실시예 1 시료 투여군(A)과 비교예 1 시료투여군(B), 비교예 5 시료투여군(C)으로 분류하였다. A, B, C 투여군 모두 100mg/kg으로 투여하였으며 전 실험기간 동안 물과 AIN-93 기본식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
양성대조군은 멀꿀추출액 300mg/kg BW (M-300)을 사용하였다.
식이 섭취량은 주 2회, 체중은 주 1회 측정하였으며 식이효율(feed efficiency ratio, FER)은 측정된 식이 섭취량에 대한 체중 증가량으로 계산하였다.
상기 실험군인 A, B, C 투여군과 양성대조군인 M-300 실험군들에 대하여 각 시료를 경구투여한 후 경골 성장판의 길이와 경골의 길이를 측정하였다.
실험 전과 실험 종료 직후의 경골 및 경골 성장판의 길이는 ethyl ether로 마취시켜 X-ray mammography system(GE Senographe 500t, GE Medical Systems, France)로 증감지(minR-2, Kodak, USA)와 필름(CM-H for mammography, Konica, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 촬영시 관전압은 32 kVp, 관전류는 32 mAs으로 하였으며, plateform과의 거리는 25cm였고 15초간 노출하여 촬영하였다. 촬영된 필름은 현상기(QX-130Ⅱ, Konica)로 현상액 31°C, 정착액 29°C에서 현상하고 필름을 Vidar VXR-12 film digitizer(Vidar Systems Co., USA; Resolution 570 dpi, Depth 12)로 스캔하였다. 스캔된 영상은 Image J 프로그램(National Institute of Health, MD, USA)을 이용하여 경골과 경골 성장판의 중앙, 좌, 우 등 세 부위의 profile curve를 구하고 반치폭의 픽셀수로부터 길이를 계산하였다.
그 결과는 다음 표와 같다.
시험군 경골 증가 길이(mm) 성장판 증가 길이(mm)
대조군 6.81±0.19 0.50±0.16
A(실시예1)군 8.99±0.14 0.82±0.17
B(비교예1)군 6.92±0.21 0.58±0.12
C(비교예5)군 7.21±0.15 0.64±0.13
M-300 6.86±0.44 0.54±0.09
실험예 5 : 골밀도 영향 실험
6주령 SD rat 암컷을 이용하여 난소를 적출하였으며 1주일간 안정기를 보낸 후 16주간 실시예 1, 비교예 1, 비교예 5의 시료를 투여하였다. 사용한 SD rat은 총 50마리였으며 각 그룹당 5마리씩 총 10개의 그룹으로 분류하였다. 온도는 25±1℃, 습도는 50±5%에서 사육하였다. 난소적출을 하지 않은 normal 그룹, 난소적출은 하지 않았으나 복부를 개복하였다가 닫은 sham 그룹, 난소 적출 후 단백질원으로 카세인을 경구 투여한 control 그룹, 동물의 중량(kg) 당 150mg의 각 시료를 투여한 그룹 등을 positive 및 negative control로 분류하고, 동물의 중량(kg) 당 50, 100, 150, 200, 300mg의 시료를 농도별로 투여한 5개의 그룹으로 분류하여 총 10개의 그룹으로 분류하여 실험을 진행하였다.
각 그룹의 동물은 기본적으로 자유식이를 하였으며 각각의 시료에 대하여 경구 투여하였다. 골밀도 측정은 micro CT(Inveon™, Siemens Preclinical Solution, USA) 기기를 이용하여 측정하였으며, 측정조건은 엑스레이 전압 80kV, 전류 500uA, 노출시간 250ms 및 filed of view(FOV) 56.97 × 71.21의 조건으로 촬영하였다.
얻어진 이미지는 Shepp-Logan 필터 방식으로 영상을 재구성하였다. 영상 분석은 Inveon Research Workplace(Siemens Preclinical Solution, USA) 프로그램을 이용하였으며, 대퇴골체 부분에 관심영역을 지정하여 평균값을 구하여 BMD를 산출하였다. 측정 부위는 대퇴부 경부 부분에서 대퇴골 슬개면까지 측정하여 평균값을 구하였다.
실험결과를 보면, 하기 표와 같이 일반 SD rat과 개복 후 닫은 sham 그룹은 사육 8주까지 골밀도가 증가하다가 16주까지 더 이상 증가하지 않고 유지되는 것을 관찰하였다. 난소적출 후 카세인을 투여한 동물의 그룹에서는 8주 이후 골밀도가 저하되는 것을 관찰할 수 있었으며, 동물의 중량(kg) 당 150mg의 실시예 1의 시료는 8주 이후로도 골밀도가 유의적으로 상승되는 것을 관찰할 수 있었다. 이 실험에서 CA는 카세인 150mg/kg 투여군이다.
실험기간 BMD 증가율(%)
4주 8주 12주 16주
정상군 116 128 131 133
Sharm 117 130 132 133
CA 111 119 120 118
실시예 1 126 132 135 137
비교예 1 119 123 125 124
비교예 5 121 126 129 128
실험예 6 : 키 성장 촉진 효능 평가 실험
만 10세 이상의 소아청소년을 대상으로 상기 실시예 1의 조성물이 포함된 제품의 사용 전후에 있어서의 키 성장 상태를 평가하였다. 구체적으로, 실시예 1의 조성물 10mL을 500mL의 생수에 혼합하여 아침 식전 100mL, 아침식사 후에서 저녁 식사 전 300mL, 저녁 취침 직전 100mL 로 나누어 하루에 500mL를 모두 소비하는 방식으로 기간은 자유롭게 하여 평가하였다.
그 결과를 하기 표에 나타내었다.
성별 나이 복용기간(일) 복용전(cm) 복용후(cm) 복용전후 차이(cm)
남 11 60 135 139 4
남 15 60 138 144 6
여 16 60 131 136 5
여 11 60 130 134 4
여 14 60 132 133 2
남 15 60 139 143 4
여 14 50 135 140 5
남 15 50 144 147 3
여 14 50 131 135 4
남 14 50 141 145 4
남 12 50 146 149 3
여 14 40 140 144 4
남 14 40 132 137 5
여 13 40 141 144 3
여 12 40 130 134 4
대조군(남) 14 60(복용없음) 135 136 1
대조군(여) 13 60(복용없음) 137 139 2
상기 실험결과, 60일 복용 후 평균 4~5cm의 성장을 보였으며, 이는 대조군의 평균 성장 예측치인 1.5cm의 2~4배의 현저한 키성장 효과를 보이는 것으로 확인되었다.

Claims (10)

  1. 매실천연발효액 30~70중량부와 가시오가피, 한속단, 황기, 우슬, 숙지황, 황금, 참당귀, 녹각 및 용안육을 함유하는 식물혼합추출액 30~70중량부가 혼합된 천연혼합발효액; 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)와 바실러스 아밀로리퀴피엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 포함하는 유산균; 막걸리효모액; 버섯균사체; 그리고 수미자임(Sumizyme), 얼티메이즈(Ultimase MFC), 파이르플로(Pyr-flo), 탄네이즈(Tannase) 중에서 선택된 하나이상을 포함하는 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소; 그리고 아미노산과 식이유황(MSM)을 혼합하여 배양한 천연발효효소복합액으로, 멀꿀추출액을 액상발효한 멀꿀발효물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진 또는 키 성장촉진용 건강식품 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 막걸리 효모액은 생막걸리를 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 배양한 것을 특징으로 하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진 또는 키 성장촉진용 건강식품 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 버섯균사체는 동충하초, 차가버섯, 영지버섯, 능이버섯, 상황버섯, 운지버섯, 노루궁뎅이버섯 중에서 하나이상의 버섯 균사체를 사용하는 것을 특징으로 하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진 또는 키 성장촉진용 건강식품 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 천연발효효소복합액의 최종 발효 전 혼합물에 비타민 에이(vitamin A), 비타민 비 복합체(vitamin B complex) 및 비타민 씨(vitamin C) 중에서 2 이상의 복합비타민을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진 또는 키 성장촉진용 건강식품 조성물.
  5. 삭제
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 천연발효효소복합액은 상기 매실천연효소액 30~70중량부와 상기 식물혼합추출액 30~70중량부가 혼합된 천연혼합발효액 85~95중량%에, 유산균 0.1~5중량%와 막걸리효모액 0.5~5중량%, 버섯균사체 1~10중량%, 세포막 분해 및 생체성분 변환 효소 0.01~3중량%, 복합비타민 0.01~3 중량%, 아미노산 0.01~3 중량%, 식이유황 0.01~3중량%를 첨가하여 발효한 것을 특징으로 하는 골밀도 개선, 뼈 성장촉진 또는 키 성장촉진용 건강식품 조성물.
  7. 삭제
  8. 청구항 1 내지 청구항 4 및 청구항 6 중 어느 하나의 항에 따른 골밀도 개선, 뼈 성장촉진 또는 키 성장촉진용 건강식품 조성물을 포함하는 동물사료 첨가제.
  9. 삭제
  10. 삭제
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