WO2015002302A1 - 酸素添加酵素含有組成物の活性化方法並びにこれに基づく汚染物質の無害化方法及び装置 - Google Patents

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Abstract

酸素添加酵素を含有する組成物を、常温、常圧の大気環境下での飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を含有した水性媒体中に溶解又は分散させることを特徴とする、酸素添加酵素含有組成物の活性化方法を提供する。

Description

酸素添加酵素含有組成物の活性化方法並びにこれに基づく汚染物質の無害化方法及び装置
　本発明は、トルエンやベンゼン等の単環芳香族化合物、及びダイオキシン類やポリ塩化ビフェニル類等の多環芳香族炭化水素を含む汚染物質の分解又は無害化方法並びにそのための装置に関する。さらに詳細には、マイクロバブルを分散させることにより溶存酸素濃度を高めた水性媒体中で、酸素添加酵素含有組成物と汚染物質を含む油性成分との混合物を、通気及び／又は撹拌することにより前記汚染物質を酸化還元反応により分解する方法並びにそのための装置に関する。
　汚染物質の例で挙げれば、ポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢｓ）は難分解性有機塩素化合物の一種で、化学的に安定な性質から幅広い産業分野で用いられたが、生体への蓄積性や内分泌系に対する撹乱作用を示すことが明らかとなって以来、国際的にその製造や使用が禁じられている。ＰＣＢｓは化学的にも安定で、長期間にわたって自然分解することなく残留するため、人体への影響のみならず地球上に存在する様々な生命体にも深刻な影響をもたらすことが大きな問題となっている。
　国内でこれまでに輸入・製造販売されたＰＣＢｓは、およそ５５,０００トンと推定される。その使用が禁止された上、使用者に対する保管が義務付けられた後、ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法等により、所定の期限までに無害化する計画が立てられている。近年、電気機器中の絶縁油に、１ｋｇ当たり数十ｍｇ程度という微量のＰＣＢｓが検出されるものが大量に存在することが明らかとなったが、この微量ＰＣＢｓ汚染油については、使用あるいは保管に関する正確な数量は把握できていない。ＰＣＢｓの分解方法としては、従来からの焼却法に加えて、脱塩素化分解法、水熱酸化分解法、水素供与物質による還元熱化学分解法、紫外線照射法等による光分解法等が知られている。これらのうち、紫外線分解法は、ＰＣＢｓを極性有機溶媒中に溶かして紫外線を照射することにより脱塩素化し、残留するＰＣＢｓを生物処理又は触媒処理等によって無害化するものであり、常温、常圧処理できるため安全性が高く、毒性を有するＰＣＢｓを、生命体である微生物が異化することでその分解物の安全性が高いと想定され、化学処理等に較べて利点があると考えられる。
　例えば、特許文献１に記載された方法は、最初にＰＣＢｓを紫外線に曝して脱塩素処理を行い、次に大型発酵プラントの微生物で分解に至るものである。しかしながら、この処理法は６０から８０％（ｗ／ｖ）にもなる高濃度なＰＣＢｓで汚染した油を一度に大量処理する点に問題があり、紫外線照射工程に続く微生物処理工程で大量の培地を加えてＰＣＢｓ濃度を調整しなければならず、微生物の培養や増殖とＰＣＢｓ分解とを同時に行わなければならないという困難性があった。
　一方、近年では直径１００μｍ以下の気泡であるマイクロバブルを、工業のみならず農業や水産業、医療へ利用する動きが広がっている。マイクロバブルは体積当たりの表面積が広く浮上速度も極めて遅いため、効果的に酸素等の気体を液体に溶解させることができる。また、電荷を帯びることで液中に均一に分散する。例えば、浄化水槽でのばっ気プロセスに酸素のマイクロバブルを充填することは、活性汚泥中の好気性微生物の活性化・高効率化に有効とされている（非特許文献１参照）。また、特許文献２には、揮発性有機化合物で汚染された汚染土壌または地下水を、微細気泡と、前記汚染土壌中に生息している微生物によって浄化する方法も報告されているが、汚染物質を分解する酵素反応自体を、マイクロバブルによって促進するプロセスは知られていない。
特開２００１－４６５４７号公報 特開２０１２－４０４７６号公報
Terasaka K et al., Chem Eng Sci, 2011, Vol.66, pp.3172-3179
　本発明は、トルエンやベンゼン等の単環芳香族化合物、及びダイオキシン類やポリ塩化ビフェニル類等の多環芳香族炭化水素に由来する汚染物質を、酵素を用いた酸化還元反応により分解するプロセスの効率化を図ることを目的とする。特に、初発酸化反応として一連の分解反応の進行に重要な役割を果たす酸素添加酵素による反応を促進することにより、これらの汚染物質を効率的に分解し、無害化する方法及びそのための装置を提供することを課題とする。
　本発明者らの分析によれば、従来からの好気性微生物による分解酵素の生産と、汚染物質の分解とを同時に行う発酵方法において、通常の大気下の酸素分圧環境中での培養液では、この発酵反応に必要な十分な量の酸素を供給することが難しい。これに対し、あらかじめ微生物等により生産した酸素添加酵素組成物、例えば、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを含む多成分酵素を大量に菌体内に発現させた微生物製剤を用いるとともに、当該酵素反応が進行する水性媒体中にマイクロバブルを分散させて水性媒体中の溶存酸素濃度を高めることにより、基質の分解に用いられる分子状酸素の供給が増強され、さらに分解反応に関与する各成分が十分に分散されてそれらが効率的に接触し、その結果、汚染物質の分解率が顕著に向上することを見いだした。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明の１つの視点において、酸素添加酵素を含有する組成物を、常温、常圧の大気環境下での飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を含有した水性媒体中に溶解又は分散させることを特徴とする、酸素添加酵素含有組成物の活性化方法を提供する。また別の視点において、本発明は、汚染物質の分解又は無害化方法を提供するものであって、当該方法は、飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を含有した水性媒体中で、酸素添加酵素含有組成物と汚染物質を含む油性成分との混合物を攪拌することを特徴とする。前記水性媒体中の酸素の少なくとも一部は、マイクロバブルとして存在することが好ましく、したがって、１つの実施形態における本発明の方法は、前記水性媒体中へマイクロバブルを供給することを含む。
　本発明の他の視点では、上記汚染物質の分解又は無害化方法に使用しうる装置を提供するものであって、当該装置は、通気手段、攪拌手段及び／又は温度制御手段を備えた攪拌槽と、前記攪拌槽と連通し水性媒体及び／又は汚染物質を含む油性成分を導入する試料導入部と、前記攪拌槽内の試料にマイクロバブルを供給するマイクロバブル発生部と、を備えることを特徴とする。前記マイクロバブル発生部が、前記攪拌槽に備えられた超音波型マイクロバブル発生装置であるか、又は前記試料導入部に備えられた加圧型マイクロバブル発生装置であることが好ましい。
　本発明の方法によれば、汚染物質の分解に用いられる分子状酸素の供給が増強されて酸素添加酵素による反応速度が向上する。さらに、分解効率も向上することで比較的低濃度の汚染物質でも効率的に無害化することができる。加えて、マイクロバブルを含有する水性媒体は、微生物製剤のような酵素組成物の分散性が向上し、汚染物質を含む油性成分と容易にエマルジョンを形成して、汚染物質の分解に適した環境を整えることができると考えられる。
　また、本発明の汚染物質の無害化装置は、水性媒体中にマイクロバブルを効率的に供することができるとともに、分解反応の進行とともに減少へと転ずる溶存酸素濃度を補う目的で適切な時期にマイクロバブルで酸素を供給することができるため、より効率的に汚染物質を無害化することができると考えられる。
参考例２で行った酸素添加酵素遺伝子を発現する組成物であることを示す電気泳動の結果である。 実施例１で行った酸素添加酵素遺伝子を発現する組成物がＰＣＢｓを分解することを示すガスクロマト質量分析計が出力したトータルイオン・クロマトグラフの結果である。 本発明の１つの実施形態に係る汚染物質の無害化装置の概略断面図である。 本発明の方法又は無害化装置に用いられる好適なマイクロバブル発生装置の概略を示す斜視図である。 実施例２で行ったＰＣＢｓ分解試験の結果である。 実施例３で行った経時的ＰＣＢｓ分解試験の結果である。 バークホルデリア・ゼノボランスＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ複合体発現プラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）の構造を示す。 実施例４における、ＰＣＢｓ分解装置を用いてＰＣＢｓ汚染絶縁油を分解したときの残存ＰＣＢｓ量の経時変化を示すグラフである。
　以下に、本発明に係る酸素添加酵素含有組成物の活性化方法、及びこれに基づく汚染物質の無害化方法と、これに使用しうる無害化装置についてそれぞれ詳細に説明する。本明細書において、用語「無害化」とは、生体に対する毒性を低下させることを意味し、必ずしも汚染物質を完全に分解する必要はないが、環境中に放出された場合でも生物への悪影響を軽減できるように、好ましくはそれぞれの物質について一般的に安全であると認められるか、あるいは法律等で定められた基準値を下回るような濃度まで低下させることをいう。本発明の汚染物質の無害化方法は、酸素添加酵素含有組成物を、高濃度酸素及びマイクロバブルを分散した水性媒体中で、汚染物質を含む油性成分と混合し、これらの混合物を通気及び／又は撹拌して分解することを特徴とするものであり、以下に、その構成要素ごとに順を追って説明する。
［酸素添加酵素含有組成物］
　本発明の方法に使用しうる酸素添加酵素は、汚染物質を酸化的に分解しうる酵素であれば特に限定されるものではなく、多種多様な汚染物質を分解するものとして多くの動物又は微生物由来の酸素添加酵素を用いることができる。これらの中でも、特に、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ、又はRieske non-heme iron oxygenaseと称される一群の酵素が好ましく、これらは多くの芳香族化合物分解経路での最初の反応であるｃｉｓ型二水酸化反応を触媒する。トルエンやナフタレンに加えてベンゼン、クメン、フェナントレン、ピレン等の単環・多環の芳香族炭化水素に限らず、ダイオキシン類、ジベンゾチオフェン、カルバゾール等のヘテロ環式芳香族化合物、ＰＣＢｓ等のビフェニル環化合物等の種々の芳香族化合物の好気的代謝経路において、これらの酵素は初発酸化酵素として一連の分解反応の進行の有無を左右する重要な役割を果たしている。芳香環水酸化ジオキシゲナーゼは、基質を認識し酸化反応を行う酸化酵素（ＴＯ：terminal oxygenase）と、電子をＮＡＤ（Ｐ）ＨからＴＯに伝える電子伝達系から構成される多成分酵素である。電子伝達系は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受け取るレダクターゼ（Ｒｅｄ）単独で構成される場合と、Ｒｅｄとフェレドキシン（Ｆｄｘ）の二つで構成される場合がある。
　微生物は、芳香族化合物への暴露とそれへの適応、進化を通じて多種多様の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを生み出してきたと考えられ、現在では、数十種以上の化合物の分解酵素として２００以上の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが単離されている。電子伝達鎖の特徴による芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの分類、及び酸化酵素触媒サブユニットのアミノ酸配列アライメントに基づく各酵素の分子系統樹による分類等は、「野尻秀昭他３名、蛋白質核酸酵素Vol.50, No.12, (2005) pp.1519-1526」に記載されており、その全内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
　好ましい実施形態において、本発明の方法に使用する酸素添加酵素含有組成物は、上記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを微生物細胞内に発現させた微生物製剤であり、二水酸化反応によって生じた中間体生成物をさらに分解して最終的にはアセチルＣｏＡやピルビン酸等のエネルギー物質にまで変換しうるその他の代謝酵素を含む。例えば、ビフェニル分解に関与する一連の酵素群を挙げれば、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼとしてのビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）の他に、ＢｐｈＡの反応産物から２つの水素を除くジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ酵素）、ＢｐｈＢ反応産物に酸素１分子を付加して２－ヒドロキシ－６－オキソ－６－フェニルヘキサ－２，４－ジエン酸（ＨＯＰＤＡ）を生成する２，３－ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ酵素）、ついで、ＨＯＰＤＡを安息香酸と２－ヒドロキシペンタ－２，４－ジエン酸とに分解する２－ヒドロキシ－６－オキソ－６－フェニルヘキサ－２，４－ジエン酸ヒドロラーゼ（ＢｐｈＤ酵素）、そして、アセチルＣｏＡとピルビン酸に転換する２－ヒドロキシペンタ－２，４－ジエン酸ヒドラターゼ（ＢｐｈＥ酵素）、４－ヒドロキシ－２－オキソ吉草酸アルドラーゼ（ＢｐｈＦ酵素）及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＧ酵素）等を含む。ビフェニル分解に関与する一連の酵素群による物質変換経路等に関しては、「原富次郎、高塚由美子、産業と環境 2012年10月号 pp.65-69」に記載されており、その全内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
　このような芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを有する微生物は、自然環境中から対象とする汚染物質又はそれと構造の類似する化合物を培地に添加して、当業者に既知の方法によりスクリーニングすることができる。例えば、ＰＣＢｓ分解菌は、ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物からのスクリーニングを繰り返し行うことにより見出される。天然にビフェニル分解酵素を産生する微生物としては、シュードモナス属、コマモナス属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ロドコッカス属、ラルストニア属等に属する多くの細菌があるが、ビフェニル資化性菌のスクリーニング段階でビフェニル分解活性の一つの指標となる黄橙色を示すメタ開裂物質（例えば、２-ｈｙｄｒｏｘｙ-６-ｏｘｏ-６-ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａ-２，４-ｄｉｅｎｏａｔｅ）を速やかに生産し、且つ生育速度が速い微生物を選択することで、ＰＣＢｓ分解活性に優れる微生物の取得が期待できる。
　さらに、スクリーニングにより得られた微生物から当該物質の分解に関与する酵素遺伝子、例えば、ビフェニル分解酵素遺伝子をクローン化し、これらに部位特異的突然変異誘発法等によって変異を導入することで、さらにＰＣＢ分解活性の向上した遺伝子群を作製することができる。なお遺伝子に変異を導入する方法には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えば、エラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A. L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001等に記載されている。これらの手法によって作製された突然変異遺伝子を、もとの微生物のゲノムＤＮＡと置換するか、プラスミドＤＮＡやコスミドＤＮＡにクローン化して宿主微生物に導入し、新規な微生物を作製することも可能である。本発明の方法に使用しうる酸素添加酵素、好ましくは芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを産生する微生物は、このような方法により、当業者であれば容易に入手しうると考えられる。
　酸素添加酵素を産生する微生物の培養方法も、特に限定されるものではなく、当業者に公知の培養方法及び培養装置を用いて培養し、培養して得られた微生物菌体から通常の方法により酸素添加酵素を抽出、精製することができる。
　あるいは、酸素添加酵素を産生する微生物を含む培養物は、そのまま粉体にするか、水や界面活性剤等を含む分散媒で洗浄して、菌体内酵素のままで使用することもできる。培養後の培養液をそのまま利用することもできるし、減圧濃縮することもできる。また、遠心分離による集菌や密度勾配遠心法、二相分離法等を行い、高濃度に酸素添加酵素を産生する微生物を分離回収することができる。各種分散媒で酸素添加酵素を産生する微生物を分散した懸濁液を用いてもよい。
　液剤組成物を製造する際に、上記培養物に、必要に応じて、保存性や安定性の向上を目的とした物質を追加することもできる。例えば、ｐＨ調整剤、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、緩衝剤等を添加することができる。
　粉体組成物であれば、上記培養物から得られる微生物菌体を乾燥させる必要がある。菌体の乾燥方法としては、自然乾燥や凍結乾燥、スプレードライ等で生菌のまま粉末化することができる。この際、スキムミルク等の保護剤を用いることが望ましい。また、製剤化のために増量剤等の任意の物質を添加することができる。賦形剤としては、例えば、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、白糖等の糖類、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン等のデンプン類、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、沈降炭酸カルシウム等の無機塩類の他、脱脂米糠、大豆粉、おから、ピーナッツの皮、フスマ、もみがら粉、炭酸カルシウム、糖、澱粉、ビール酵母、小麦粉等、飼料安全法で認可されている任意の賦形剤があげられる。これらの賦形剤は１種のみならず２種以上併用してもよい。
　本発明の好ましい実施形態において、微生物菌体は、生理食塩水あるいは２０ｍＭのリン酸緩衝液で少なくとも２回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム塩を用いるのが良い。また、菌体に対し糖アルコール等の賦形剤を加えて、糖アルコールはアルファ、ベータあるいはデルタ型のマンニトールでも良く、最終的に－２０～－８０℃までに調温された冷凍庫等で保存でき、乾燥粉体化させた場合は、１５～２５℃の常温で保存できる酸素添加酵素含有組成物が得られる。
　また、酸素添加酵素組成物は、汚染物質を効率よく分解するよう適切な配合率で複合化させた組成物であることが望ましく、例えば、微生物菌体を乾燥させる前の湿菌体の状態で汚染物質を効率よく分解するよう適切な配合率で複合化させ、この複合体に対し糖アルコール等の賦形剤を加えた微生物製剤からなる酸素添加酵素組成物としてもよい。
　例えば、汚染物質としてのＰＣＢｓを分解するためには、コマモナス属、シュードモナス属、アクロモバクター属、ロドコッカス属、及びステノトロフォモナス属からなる群より選択される少なくとも１種、あるいはそれ以上のＰＣＢｓ分解菌を用いることができる。これらの菌株は、２，３-ビフェニルジオキシゲナーゼ(2,3-biphenyl dioxygenase)が共通に選択する基質特異性を示し、ＰＣＢｓ異性体に対しては更に狭い範囲の基質特異性を示す。具体的には、２，２’，３，４－テトラクロロビフェニルや、３，３’，４，４’－テトラクロロビフェニル、２，３，３’，６－テトラクロロビフェニル，３，４，４’－トリクロロビフェニル、２，２’，３，４’－テトラクロロビフェニル、２，３，３’，４’，テトラクロロビフェニル、２，３，４，４’，テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５，５’－ペンタクロロビフェニル、２，２’，４，４’－テトラクロロビフェニル、２，２’，４，５－テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’－テトラクロロビフェニルを選択的に分解する複数の細菌を混合して複合化させることが好ましい。
［酸素添加酵素含有組成物の活性化方法］
　このような酸素添加酵素含有組成物を、常温、常圧の大気環境下での飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を含有した水性媒体中に溶解又は分散させることにより、酸素添加酵素含有組成物を活性化することができる。特に、酸素添加酵素含有組成物として上述した微生物製剤を用いた場合に、顕著な活性化効果を得ることができる。水性媒体中の溶存酸素濃度の上昇によって、酸素添加酵素含有組成物が活性化されること、例えば、あらかじめ芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを高発現させた微生物製剤による基質の分解反応が向上するメカニズムについては現在のところ明らかではないが、考えられる要因は、まず、水性媒体中の微生物細胞外の酸素濃度が高まることで、受動輸送により、極めて短時間に、微生物細胞内の酸素濃度が水性媒体中の酸素濃度近くまで上昇する。次に、微生物細胞内と細胞外の酸素濃度の平衡化現象は、微生物細胞内で行われる芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの基質に対する酸素添加反応の速度向上へ寄与していることである。さらに、この酸素添加反応の生成物は、高酸素下で誘導された酸化ストレスによって活性化した酵素組成物中に含まれるその他の代謝系酵素類や補酵素類が、より低分子にまで物質変換を進めるため、基質を完全に分解することができると考えられる。
［マイクロバブル含有水性媒体］
　本明細書において、用語「マイクロバブル」とは、概ね直径１ｍｍ以下、好ましくは直径１００μｍ以下の気泡をいう。外部から酸素や空気等の気体を供給して気泡を形成してもよいし、水性媒体中に溶存している酸素や空気等を用いてもよいが、水性媒体の溶存酸素濃度を高めるためには、酸素ガスを外部から供給しつつマイクロバブルを発生させることが好ましい。マイクロバブルは体積当たりの表面積が広く浮上速度も極めて遅いため、効果的に酸素等の気体を液体に溶解させることができる。また、電荷を帯びることで液中に均一に分散し、水性媒体中で油性成分のエマルジョン化を促進する。マイクロバブルは負の表面電荷を有するため、一般に正の表面電荷を持つ微生物菌体等との相互作用を介して、これらを水性媒体中で均一に分散させることが可能になる。
　水性媒体にマイクロバブルを分散させる工程は、汚染物質を含む油性成分との混合前であってもよいし、あるいは、水性媒体と汚染物質を含む油性成分とを混合した後に、これらの混合液中へマイクロバブルを発生させてもよい。マイクロバブルを発生させる方法は、微小孔を有する管又は多孔質体を通じて気体を液体中に噴出させる方法、噴流や旋回流中で生じるせん断力を利用して気相を液相に巻き込む方法、超音波を利用して気液界面振動させて微細な気泡を生成させる方法等いずれの方法を用いてもよい。
　本発明の方法では、少なくとも水性媒体中における飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を当該水性媒体に含有させることが好ましく、そのため酸素ガスを流しながら超音波処理を行うことによりマイクロバブルを発生させることが好ましい。以下、これを酸素マイクロバブルと呼ぶ。水溶液中の飽和溶存酸素濃度は、気圧、水温、溶存塩濃度等によって変化するが、大気圧下、３０℃における蒸留水中の溶存酸素濃度は約７．５ｍｇ／Ｌである。本発明の方法において、水性媒体中の溶存酸素濃度は、３０℃において、少なくとも初期濃度で約８ｍｇ／Ｌであり、１５ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、２５ｍｇ／Ｌ（ｐｐｍ）以上がさらに好ましい。１つの実施形態において、上記超音波発生法により酸素マイクロバブルを水性媒体中へ充填した場合、その溶存酸素濃度は実測値で２８ｍｇ／Ｌ程度である。一般に水性媒体中に溶解した高濃度状態の酸素は、周辺環境中の酸素濃度と均衡を保とうとする性質から減少に転じると考えられる。したがって、酸素添加酵素組成物による汚染物質の分解反応を最適化するためには、２８ｍｇ／Ｌ程度まで上昇した溶存酸素濃度を維持することが望ましく、適宜マイクロバブル発生器により連続、あるいは断続的に酸素マイクロバブルを供給し続けることが望ましい。
［汚染物質の分解反応］
　本発明の分解又は無害化方法の対象となる汚染物質は、酸素添加酵素によって酸化的に分解されるものであれば特に限定されるものではないが、単環若しくは多環芳香族化合物であることが好ましく、これらの中にはトルエン及び／又はベンゼン若しくはダイオキシン類及び／又はポリ塩化ビフェニル類を含む。本明細書において、ダイオキシン類とは、ポリ塩素化ジベンゾ－ｐ－ダイオキシン、ポリ塩素化ジベンゾフラン、及びコプラナーＰＣＢ（特に、オルト位以外に塩素原子が置換したポリ塩化ビフェニル）の全ての総称である。本発明では、「ダイオキシン類」は、特に断らない限りこれらの化合物の一部又は全部を表す。
　本発明で対象となるＰＣＢｓとしては、ビフェニル化合物に塩素原子が置換した化合物が含まれ、その置換塩素原子の数は１～１０個である。平均置換塩素原子数は、一般に２～６個である。本発明では、これらのＰＣＢｓから選択された少なくとも一種を用いることができ、それぞれ単独で又は二種以上を任意に組み合わされたものへも用いることができる。一般に、ＰＣＢｓは単一化合物として存在せずに、塩素原子の数や置換位置が異なる配合物として存在する。従って、塩素原子の数及び置換位置の組み合せからして、理論上２０９種類の異性体が存在し、市販品には、およそ７０から１００、あるいはこれらを越える数の異性体が配合存在している。
　本発明の分解あるいは無害化の方法で処理できるＰＣＢｓとしては、特徴的には、３，４，４’，５－テトラクロロビフェニルや３，３’，４，４’－テトラクロロビフェニル、３，３’，４，４’，５－ペンタクロロビフェニル、２，３，３’，４，４’－ペンタクロロビフェニル、２，３，４，４’，５－ペンタクロロビフェニル、２，３’，４，４’，５－ペンタクロロビフェニル、２’，３，４，４’，５－ペンタクロロビフェニルに加えて、２，２’，４，４’－テトラクロロビフェニルや２，２’，４，５－テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’－テトラクロロビフェニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
　ＰＣＢｓは、過去にＰＣＢ単体からなる配合物として市販されたものであり、これがコンデンサーやトランスの絶縁油として用いられた。また現在でも、その一部が絶縁油で希釈された比較的低濃度のＰＣＢｓとして、一部のコンデンサーやトランスに包含されている。その具体例としては、鐘淵化学（株）が製造販売したカネクロールＫＣ－２００（含有異性体が２塩化ビフェニルを中心としたもの）やＫＣ－３００（含有異性体が３塩化ビフェニルを中心としたもの）、ＫＣ－４００（含有異性体が４塩化ビフェニルを中心としたもの）、ＫＣ－５００（含有異性体が５塩化ビフェニルを中心としたもの）、ＫＣ－６００（含有異性体が６塩化ビフェニルを中心としたもの）、ＫＣ－１０００（ＫＣ５００／トリクロルべンゼン＝６０／４０（質量比）の配合物）や、三菱モンサント（株）が製造販売したアロクロール１２５４（５４％Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等も挙げられる。
　本発明の一つの実施形態における汚染物質の分解又は無害化の方法は、上記の酸素添加酵素含有組成物と汚染物質を含む油性成分とを、高濃度の酸素マイクロバブル含有水性媒体中で混合する工程と、当該混合物を通気及び攪拌する工程とを含む。本発明の好ましい実施形態では、汚染物質として、比較的低濃度のＰＣＢｓ汚染油を用いたときに、高いＰＣＢｓ分解活性を発揮し、効果的に無害化することができる。
　他の実施形態では、上記の酸素添加酵素含有組成物と汚染物質を含む油性成分とを、水性媒体中で撹拌会合させつつ、これらの混合物へさらに酸素マイクロバブルを通気供給しながら分散させることで汚染物質を分解してよい。さらに、これらの実施形態を組み合わせて、あらかじめ酸素マイクロバブルを分散させた水性媒体中で上記酸素添加酵素含有組成物と汚染物質を含む油性成分とを分散会合させるとともに、撹拌しながら混合液中の溶存酸素濃度の低下を補うようにマイクロバブルを追加的に供給することも可能である。
　さらに別の１つの実施形態によれば、酸素添加酵素組成物として微生物製剤を用いた場合は、分解工程の所定の時期に混合物を超音波処理することにより微生物製剤を破砕し、菌体内酵素を混合物中に遊離分散させることもできる。一般的に、ダイオキシンやＰＣＢｓを含む芳香族化合物は疎水性であるため油性成分中に飽和溶解又は分散しているが、微生物菌体と接触するとその細胞膜を透過して菌体内で一連の酸素添加酵素による分解反応を受けると考えられる。しかしながら、分解反応が進行して汚染物質の濃度が低下することにより混合物中での物質移動が分解反応の律速段階となった場合は、超音波処理により菌体内から酵素を混合液中に放出させて残存する汚染物質と反応させることが好ましい。
　１つの実施形態として、前記の混合物は水性媒体と油性成分とのエマルジョンを形成し、これは水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョン又は油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンのいずれであってもよい。前記水性媒体と油性成分との混合比率は、３：７～１００：１までの任意の比率でよいが、エマルジョンを形成するためには、３：７～７：３の比率であることが好ましく、より好ましくは、１：２～２：１の比率であり、最も好ましくは約１：１の比率である。分解すべき汚染物質は、エマルジョン全量に対し０．０５～１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１～１００ｍｇ／Ｌ程度含むことができ、当該エマルジョン中に、酸素添加酵素含有組成物を０．２～２０重量％、好ましくは２～１２重量％程度添加することにより行うことができる。エマルジョン化しない場合は、トリトンＸ－１００等の界面活性剤０．００５％を加え、さらに必要な場合は超音波を加えて均質化させる。さらにエマルジョン化を促進するために、油性成分の粘性を下げる処理、例えば、アルコール等を添加してもよい。
　本発明の好ましい実施形態において使用しうる界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性イオン性等に分類される。非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（具体的にはポリソルベート８０等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（具体的にはプルロニックＦ６８等）、ソルビタン脂肪酸（具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等）、グリセリン脂肪酸エステル、ツイン－２０(Tween 20)、ツイン－８０(Tween 80)、トリトンＸ－１００(Triton-X-100)、ポリエチレングリコールモノオレイルエーテル、トリエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクチルグルコシド、またはノナノイルメチルグルカミン等が挙げられる。
　アニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数７～２２の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。
　カチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、Ｎ－アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、Ｎ－アルキルアミノプロピルアミン、脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。
　両性界面活性剤としては、例えば、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミン酸化物、ジメチルパルミチルアンモニオプロパンスルホネート、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸、Ｎ－テトラデシル－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホン酸等があげられる。
　油性成分の粘度を低下させるために添加するアルコールとしては、２～５質量％のアルコールからなる。アルコールは、Ｃ１～Ｃ５アルコール及びこれらの混合物から選択されてもよい。好適なアルコールの例は、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｔ－ブタノール、イソブタノール及びこれらの混合物を含む。好ましくは、アルコールはエタノールである。
　分解反応条件は、約２０～４０℃、好ましくは２５～３５℃、さらに好ましくは約３０℃に調温し、ｐＨは６～９、好ましくは６．５～８とし、攪拌した状態で約１２～７２時間処理することが好ましい。このような処理は、密閉式で攪拌できる反応装置を用いて行うことができ、すなわち小型の専用装置を用いて行うことが好ましい。ポリ塩化ビフェニル類分解反応装置が小型化できることにより、微量ＰＣＢｓを保管するような貯蔵所でも直接処理作業を行うことができる。
［汚染物質の無害化装置］
　次に本発明の１つの実施形態に係る汚染物質の無害化装置を、図面を参照しながら説明する。図３において、本実施形態に係る汚染物質の無害化装置１は、通気手段を兼ねた攪拌翼１８を供えた攪拌槽１０と、当該攪拌槽と連通し水性媒体を供給するためのバッファータンク２０と、汚染物質を供給するタンク３０と、酵素製剤投入口４０と、これらに酸素ガスを供給又は排出するための通気管１９及び排気管２３とを備えている。この実施形態においてＰＣＢｓ等の汚染物質は専用のタンクから攪拌槽に供給されるが、特にこれに限定されるものではなく、バッファータンクと兼用しても良い。攪拌槽には、さらに超音波の振動伝達体５０超音波振動子５１とからなるマイクロバブル発生部が備えられている。
　上記の攪拌槽１０に導入された水性媒体と汚染物質を含む油性成分との混合液に上記マイクロバブル発生部から酸素を流しながら超音波処理を行って、水性媒体中にマイクロバブルを含有させることができる。あるいは、バッファータンク２０中にてあらかじめ水性媒体にマイクロバブルを含有させてからマイクロバブル含有水性媒体と汚染物質を含む油性成分とを混合してもよい。このためのマイクロバブル発生装置としては、超音波型のマイクロバブル発生装置や加圧型マイクロバブル発生装置のいずれも使用することができる。
　前記マイクロバブル発生部は、前記攪拌槽内で水性媒体と油性成分との混合液と接触する位置に配置することが出来れば良く、特に形状は限定されないが、好ましい実施形態として図４に示す超音波型のマイクロバブル発生装置２を使用することができる。また、振動体周囲の液体への気体供給は、前記振動体５０からの振動が有効に伝わる範囲の液体に気体の供給が行えるようにすればよく、供給した気体のなるべく多くの大きな割合が振動体に接触できるようにすることがマイクロバブルを形成する効率の点で好ましい。前記気体供給の形態としては、前記振動体５０に気体供給口５２と気体放出口５４を接続する気体流路５３を設け、コンプレッサーから気体供給口５２に気体を供給し、前記攪拌槽中の液体の中に位置した気体放出口５４から放出することが望ましい。前記振動体は、超音波放射面５５が攪拌槽中の液体の中に配置され、当該振動体に電気信号を供給することによって所定の周波数及び振幅の振動が付与される。前記振動伝達体５０の形状は、特に限定されるものではないが、超音波振幅の増幅に一般的に用いられる振幅拡大ホーンとして公知の形状が望ましい。前記振動伝達体５０の一つの好ましい形態としては図４に示す段付き円筒形状が例示される。図４において、大面積の端部には超音波振動子５１が接続され、小面積の端部が前記超音波振動子５１で発生した振動が増幅された前記超音波放射面５５となる。また、前記気体放出口５４は振動が増幅された前記超音波放射面５５に設けられることが望ましい。前記振動伝達体５０は、超音波の圧力振動を伝えることができれば、１つの部品からなる構造体でも、複数の部品をネジ止め、接着、溶接等により接続した構造体でも良い。
　前記振動伝達体５０として用いる材料は限定されないが、超音波ホーン材料として用いられている公知の材料が望ましく、チタン合金、純チタン、Ｎｉ－Ｃｒ鋼、ステンレス鋼、黄銅、モネルメタル、工具鋼が例示される。
　前記超音波型のマイクロバブル発生部を構成する超音波振動子５１は特に限定されず、公知の超音波振動子から適宜選択される。前記超音波振動子で発生する超音波の周波数と振幅は、振動制御器５７で発生させた任意の周波数と波形の信号を、ケーブル５６を介した電気信号によって制御される。本発明によるマイクロバブルの発生は、液体中に存在する気泡を超音波で振動させる際、一定以上の速度および一定以上の振幅を与えることにより、気泡あるいは振動体上の気液界面の一部が分裂することによってマイクロバブルが生成する。このため、用いる超音波の周波数が高く、振幅が大きい程マイクロバブルの発生効率が高く、発生する気泡を微小にすることができる。用いる超音波の周波数、振幅はマイクロバブル発生の目的に応じて、１０μｍ以上、１０ｋＨｚ以上の範囲で適宜選択される。周波数については、公知の超音波振動子が多数存在する１５ｋＨｚ～１００ｋＨｚが望ましく、より好ましくは振幅を大きくとることが可能な２０ｋＨｚ～４０ｋＨｚの範囲が望ましい。また、超音波の印加は連続的な印加でも、印加する超音波周波数以下の周波数で発生と停止を繰り返すバーストモードの印加でも良い。
　加圧型マイクロバブル発生装置
　さらに、マイクロバブル発生装置としては、基質を含む気体を加圧溶解した水を減圧して、マイクロバブルを発生させてバッファータンク２０内の水性媒体に供給する装置も用いることができる。あるいは、気液二相流を突起物や衝突体に衝突させて、気泡を剪断してマイクロバブルとして攪拌槽１０内の混合液中に供給する装置等、いずれの装置も用いることができる。
　以下に本発明の汚染物質の無害化方法の詳細について、酸素添加酵素含有組成物の調製と分解反応に関する実験方法及びその結果に係る参考例及び実施例を挙げて説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［参考例１］ＰＣＢｓ分解細菌の培養と製剤調製
　コマモナス・テストステロニ(C. testosteroni) YAZ2株及びYU14-111株の培養には、以下の表１に示した組成のミネラル塩合成培地（Ｗ培地）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　最初に試験管及びフラスコを用いた前培養を行った。YAZ2株及びYU14-111株の種菌（アプリザイム社製、ＹＡＺライブラリー）を、ビフェニルを最終濃度０．１％となるように加えた１０倍容量Ｗ培地へ播種し、振とう速度１２０ｒｐｍ、温度３０℃で培養した。細菌が十分に増殖したことを確認後、０．１％ビフェニルを含む１０倍容量Ｗ培地へ全量を播種し再度培養した。さらに同様の操作をもう一度繰り返すことで、本培養に十分な菌量を含む前培養液を得た。本培養には５Ｌ容量のジャーファーメンター（エイブル社製、ＢＭＳ－Ｃ型）を用いた。前培養液をジャーファーメンターへ全量投入し、３Ｌの培養液に対して、空気通気量４Ｌ／分、攪拌回転数６００ｒｐｍ、温度３０℃で培養を行った。炭素源としたビフェニルは、培養菌体の酸素消費量（培養液中の溶存酸素濃度）を目安に適宜追加投入した。遠心操作により培養液から菌体を回収し、発現したビフェニルジオキシゲナーゼの失活を防ぐために液体窒素で速やかに凍結し、直ちに－８０℃の冷凍庫に保存した。
［参考例２］細菌が保有するビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子の確認
　既知のＰＣＢｓ分解細菌のＢｐｈＡ１（ビフェニル－２，３－ジオキシゲナーゼ　αサブユニット）のアミノ酸配列の比較から、保存性の高い領域を数カ所選び（Asn-Gln/Ser-Cys-Arg/Ser-His-Arg-Gly-Met（配列番号１）並びにGlu-Gln-Asp-Asp-Gly/Thr-Glu-Asn（配列番号２）など）、縮重プライマーを作製した。
　次に、コマモナス・テストステロニ(C. testosteroni) YAZ2株及びYU14-111株の細菌を適当量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に懸濁し、加熱処理して得たゲノムＤＮＡを含む抽出物を鋳型として使用した。作製した縮重プライマーを用いて、９４℃、３分→［９４℃、３０秒→５８～６０℃、３０秒→７２℃、１分（３０サイクル）］→７２℃、２分、の反応条件でＰＣＲを行った。また、ＢｐｈＡ１遺伝子を持たないネガティブコントロールとして、大腸菌Ｋ－１２株のゲノムを含む熱抽出物を用いて同様の反応を行った。
　その結果、図１に示したように、予測される約９００ｂｐのＢｐｈＡ１断片増幅産物がYAZ2株及びYU14-111株において検出され、これらの菌株がＢｐｈＡ１遺伝子を保有することを確認した。試験は３回繰り返して行った。
［実施例１］ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子発現細菌によるＰＣＢｓ分解試験
　上記の参考例１に倣い、ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子を発現するコマモナス・テストステロニ(C. testosteroni)YAZ2株の細菌製剤を作製し、この細菌製剤を波長６６０ｎｍの濁度で１０又は６０（湿菌重量で約１５ｍｇ又は９０ｍｇ）に調整して、ビフェニル及びＰＣＢｓ異性体である２，２’－ジクロロビフェニル、４，４’－ジクロロビフェニル、および３，３’，４，４’－テトラクロロビフェニルの標準品を、それぞれ０．５ｐｐｍの濃度で混合したＰＣＢｓ混合溶液と、３０℃で加温しながら２４時間にわたり接触反応させた。試験は２回繰り返して行った。
　細菌製剤と接触反応させた後の残存ＰＣＢｓの回収は、酢酸エチルを用いた液－液抽出法で行った。具体的には、内部標準物質としてアントラセンを添加した試料溶液に対し、２倍容量の酢酸エチルを加えてよく撹拌した後、遠心操作により上層の有機溶媒層を回収する操作を２回繰り返し行った。無水硫酸ナトリウムで脱水した有機溶媒層を適宜希釈し、ガスクロマトグラフィー質量分析計（アジレント社製、５９７５ＧＣ／ＭＳＤ）に供した。
　ガスクロマトグラフィーの温度プログラムは、初期温度８０℃から２０℃／分の昇温速度で１３０℃まで昇温し、引き続き８℃／分で３００℃まで昇温した。分析カラムは非極性のキャピラリーカラム（アジレント社製、ＨＰ-５ｍｓ、０．２５ｍｍ×１５ｍ、０．２５μｍ）を使用した。
　細菌製剤とＰＣＢｓとを接触反応させた試験サンプルと、ＰＣＢｓ異性体標準品を混合したガスクロマトグラフィー質量分析計のトータルイオンクロマト分析チャート（以下、ＴＩＣチャート）を図２に示した。
　両者のＴＩＣチャートを比較すると、試験サンプルではビフェニルをはじめ、ＰＣＢｓ異性体である２，２’－ジクロロビフェニルや４，４’－ジクロロビフェニル、３，３’，４，４’－テトラクロロビフェニルのピークは消失した。
　すなわち、ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子を発現する細菌は、ビフェニル及びＰＣＢｓ異性体を分解することを示した。この結果は、細菌製剤がＰＣＢｓ分解酵素であるビフェニルジオキシゲナーゼを含有していることを示唆した。
［実施例２］酸素マイクロバブル存在下での細菌によるＰＣＢｓ分解試験
　氷冷した２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に図４に示すような超音波ホモジナイザー（ＳＭＴ社製、ＵＨ-５０）に内部がガス通過可能な中空ホーン（出口内径－外径：φ２．６-φ６．０）を取り付けた装置を用いて酸素マイクロバブルを１０分間連続充填した。この装置からは、直径２０μｍ以下のマイクロバブルが発生し、１０分間のバブリングにより、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の溶存酸素濃度は約２８ｐｐｍまで上昇した。
　このマイクロバブル充填溶液０．５ｍＬあたりに、界面活性剤トリトンＸ－１００を最終濃度０．０１％又は０．００５％、ビフェニルジオキシゲナーゼを発現する細菌製剤を波長６６０ｎｍの濁度で１０又は６０（湿菌重量で約１５ｍｇ又は９０ｍｇ）、ＰＣＢｓ汚染廃油又は商用ＰＣＢｓであるカネクロールＫＣ－３００（GLサイエンス社製）を１０ｐｐｍ又は１００ｐｐｍとなるように加えてＰＣＢｓ分解反応溶液とし、３０℃で加温しながら転倒撹拌した。このとき、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に対するＰＣＢｓ含有油の混合比率は、容量比で約９９：１である。試験は３回繰り返して行った。
　分解反応溶液中の残存ＰＣＢｓの回収は、実施例１と同様に酢酸エチルを用いた液－液抽出法で行った。ガスクロマトグラフィー質量分析計による分析やガスクロマトグラフィーの温度プログラムも実施例１と同様にアジレント社製、５９７５ＧＣ／ＭＳＤで行い、初期温度８０℃から２０℃／分の昇温速度で１３０℃まで昇温し、引き続き８℃／分で３００℃まで昇温した。分析カラムは非極性のキャピラリーカラム（アジレント社製、ＨＰ－５ｍｓ、０．２５ｍｍ×１５ｍ、０．２５μｍ）を使用した。
　定量解析は内部標準法で行い、また各定点での分析はすべて３回繰り返し行って、定量値の平均と標準偏差を求めた。
　酸素マイクロバブル充填による高酸素溶存下（初期濃度約２８ｐｐｍ）の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で、ビフェニルジオキシゲナーゼ発現細菌製剤であるコマモナス・テストステロニ(C. testosteroni)YU14-111株と、ＰＣＢｓ汚染廃油（ＰＣＢｓ初期濃度；１０ｐｐｍ及び１００ｐｐｍ）との接触反応を行い、２４時間経過後のＰＣＢｓ分解率の結果を図５に示した。
　ＰＣＢｓ初期濃度を１０ｐｐｍとした分解反応では、マイクロバブルを添加しないコントロールにおける分解率６５．８±４．７％に対して、酸素マイクロバブル添加では７１．６±３．７％へ分解率が上昇した。一方、ＰＣＢｓ初期濃度を１００ｐｐｍとした場合においても、コントロール分解率６２．６±９．９％に対して、酸素マイクロバブル存在下では７０．７±１０．１％と、分解率の上昇を確認した。
　以上の結果から、通常の酸素分圧下での反応と比較して、酸素マイクロバブルを充填するとコマモナス・テストステロニ(C. testosteroni)YU14-111製剤によるＰＣＢｓの分解効率が約５～８％向上することが分かった。
［実施例３］酸素マイクロバブル存在下における経時的ＰＣＢｓ分解率の変化
　実施例１と同様の方法にて、酸素マイクロバブル充填による高酸素溶存下（初期濃度約２８ｐｐｍ）の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で、ビフェニルジオキシゲナーゼを高発現させたコマモナス・テストステロニ(C. testosteroni)YAZ2細菌製剤と、商用ＰＣＢｓのカネクロールＫＣ－３００（初期濃度１００ｐｐｍ）とを反応させ、４８時間後までの残存ＰＣＢｓ濃度の経時的変化を追い、その結果を図６に示した。
　酸素マイクロバブルを充填した場合は充填しない場合と比べて反応開始直後から高い分解活性を示し、両者の分解率には１６．１％の差があった（残存ＰＣＢｓ濃度；マイクロバブル充填あり７５．６±５．９ｐｐｍに対し、充填なし９１．７±５．０ｐｐｍ）。その後の全測定時間においても、酸素マイクロバブルを充填した場合の方が、一様にＰＣＢｓ分解率が高く、特に４８時間反応後においては、酸素マイクロバブルを充填した場合の残存ＰＣＢｓ濃度は、２５．９±１．２ｐｐｍ；充填しない場合は４１．０±７．１ｐｐｍと、１５．１ｐｐｍの差があった。残存ＰＣＢｓ濃度の全測定時間を通じた両者の平均差は１１．６ｐｐｍあり、酸素マイクロバブル充填により平均約１２％の分解効率の向上を確認した。
［参考例３］バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株のビフェニルジオキシゲナーゼ発現用プラスミドの構築
　ビフェニルジオキシゲナーゼの中には、ビフェニル-２，３-ジオキシゲナーゼ（以下、２，３-ジオキシゲナーゼ）活性ならびにビフェニル-３，４-ジオキシゲナーゼ（以下、３，４-ジオキシゲナーゼ）活性がある。本出願人が、これまでに国内で取得した２００株以上の環境微生物のビフェニルジオキシゲナーゼを調べたところ、全てが２，３-ジオキシゲナーゼ活性であった。よって本発明者らは、３，４-ジオキシゲナーゼ活性をもつ酵素を取得することが、ＰＣＢｓの分解効率をさらに向上させるために重要であると考えた。
　上記理由から、３，４-ジオキシゲナーゼ活性をもつ酵素の取得を目的に、遺伝子組換えに用いるプラスミドを作製するに及んだ。モチーフとなった遺伝子は、バークホルデリア・ゼノボランス（Burkholderia xenovorans）ＬＢ４００株（以下、ＬＢ４００株）のＢｐｈＡ１Ａ２あるいはＢｐｈＡ３Ａ４の遺伝子を含む、２１２０ｂｐ（配列番号３）あるいは１，６００ｂｐ（配列番号６）のＤＮＡ配列を使用した。これらのＤＮＡ配列は有機化学合成法で作製した人工遺伝子を用い、それぞれをクローニングベクターｐＵＣ５７（Thermo Fisher Scientific）へ挿入したプラスミド、ｐＵＣ５７－ｂｐｈＡ１Ａ２（ＬＢ４００）あるいはｐＵＣ５７－ｂｐｈＡ３Ａ４（ＬＢ４００）を鋳型として、以下に記載したプライマー１と２、あるいはプライマー３と４の組合せにより、９４℃、３分→［９４℃、３０秒→６０℃、３０秒→６８℃、２分（２８サイクル）］→６８℃、３分の反応条件でＰＣＲを行った。
　ＰＣＲに必須なＤＮＡポリメラーゼは、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ）を使用することが望ましい。その理由は、ＰＣＲ反応で起き得る誤った遺伝子置換の発生を抑えることで、高品質なプラスミドを構築できるからである。
　上記に記載したプライマー１から４までの各配列は、以下のとおりである。
Primer 1: 5’-ATGCATTCTAGATATTTTTTCCGCCCTGCCAAG-3’（下線：制限酵素ＸｂａＩ認識配列、配列番号９）
Primer 2: 5’-ATGCATCCATGGCGTGCTGGGCTAGAAGAACAT-3’（下線：制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、配列番号１０）
Primer 3: 5’-ATGCATCCATGGCCCAGGCGATTTAACCCTTTTA-3’（下線：制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、配列番号１１）
Primer 4: 5’-ATGCATCATATGCGCATCAATTCGGTTTGGC-3’（下線：制限酵素ＮｄｅＩ認識配列、配列番号１２）
　上記のＰＣＲで得られたＬＢ４００株のＢｐｈＡ１Ａ２あるいはＢｐｈＡ３Ａ４の遺伝子を含むＤＮＡ断片をそれぞれ、ＸｂａＩとＮｃｏＩあるいはＮｃｏＩとＮｄｅＩで切断した後、ゲル抽出法により精製し、プラスミドベクターｐＥＴ－１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＸｂａＩ－ＮｃｏＩまたはＮｃｏＩ－ＮｄｅＩ切断部位へ、それぞれ挿入した。
　上記のように、あらかじめｐＥＴ－１５ｂ－ｂｐｈＡ１Ａ２（ＬＢ４００）およびｐＥＴ－１５ｂ－ｂｐｈＡ３Ａ４（ＬＢ４００）をそれぞれ作製し、挿入した各ＤＮＡ配列にＰＣＲ反応で起き得る誤った遺伝子置換が無いことを確認した後、ｂｐｈＡ３Ａ４（ＬＢ４００）を含むＮｃｏＩ－ＮｄｅＩ断片を切り出してｐＥＴ－１５ｂ－ｂｐｈＡ１Ａ２下流のＮｃｏＩ－ＮｄｅＩ部位に挿入し、最終的なＬＢ４００株のＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４発現用プラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）（図７）を得た。
［実施例４］酸素マイクロバブル発生機構搭載型の小型ＰＣＢｓ分解装置を用いた試験
　ＰＣＢ異性体の分解特性が異なる２種類のジオキシゲナーゼを発現する、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現大腸菌株と野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４－１１１株を複合化した微生物触媒を使用し、多様なＰＣＢ異性体類の分解効率について、小型分解装置（図３）を用いて検証した。
　参考例３で作製したプラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地を用いて、温度３０℃、ＯＤ６６０＝４．０～５．０、望ましくは５．０まで培養し、ＩＰＴＧを終濃度０．２ｍＭとなるように添加してから９０分後に集菌した。集菌した菌体は緩衝液で洗浄後、洗浄と同様の緩衝液に再懸濁したものを使用した。一方、野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４－１１１株の調製は、特開２０１３－１７９８９０号公報に記載の方法と同様に作製した製剤を必要量はかりとり、上記と同様の緩衝液で洗浄後、同緩衝液に再懸濁したものを使用した。
　本検討において、酸素マイクロバブルを発生させることができる小型分解装置は、加圧法でマイクロバブルを発生することができる機構を搭載するものを用いた。以下に、反応操作の手順を説明する。
　最初に、上記の小型分解装置に搭載しているＰＣＢｓ分解反応槽内へ、あらかじめ加圧法で酸素マイクロバブルを充填させた、溶存酸素濃度が２０ｐｐｍ以上、望ましくは２８ｐｐｍ以上のリン酸ナトリウム緩衝液を導入した。その次に、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現大腸菌体と野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４－１１１株菌体を、ＯＤ６６０の濁度比で１６対４となるよう複合した製剤を投入した。続けて、ＰＣＢｓ汚染絶縁油（ＰＣＢｓ最終濃度４０ｐｐｍ）および、最終濃度０．００１から０．０１％、望ましくは０．００５％の界面活性剤トリトンＸ－１００を投入し、反応液の最終容量を１Ｌとして分解反応させた。反応中の反応槽温度は３０±２℃を維持した。反応中の溶存酸素の濃度は、あらかじめ分圧を高めてある反応槽へ追加するように、酸素ガスを連続的あるいは断続的に供給することで、その濃度を２０～４０ｐｐｍ、望ましくは２８ｐｐｍ以上に保つよう調整した。酸素の追加法は、反応槽下方からの酸素ガスの曝気、あるいは反応槽の側面下部に設けた酸素マイクロバブル充填口を改良した径１マイクロメーター以下の細孔をできるだけ複数貫通させたＰＴＦＥ製のスパージャを用いた。最適な反応、すなわち反応液中のＰＣＢｓと複合微生物触媒の分散および接触反応を最適に行うため撹拌した。撹拌力は、撹拌翼による物理的撹拌力、あるいは酸素曝気や酸素マイクロバブルの浮上力も用いつつ、４０ｒｐｍ相当の撹拌力を与えた。
　ＰＣＢｓと複合微生物触媒を接触開始してから５分、１時間、３時間、６時間、および２４時間後のそれぞれの時点で反応溶液の一部を採取し、残存ＰＣＢｓ量の経時的変化を実施例１と同様にＧＣ－ＭＳ法を用いて測定した結果を図８および表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　測定の結果、反応開始１時間後には、当初投入した４０ｐｐｍのＰＣＢｓは９．０±０．２ｐｐｍまで急速に減少し、３時間後にはさらに３．０±０．１ｐｐｍまで減少した。分解率で表すと９２．６±０．４％と極めて高い分解効率を示した。さらに、反応開始６時間後には、１．２±０．１ｐｐｍ（分解率９６．９±０．３％）まで分解が進み、２４時間後には、０．３±０．０ｐｐｍ（分解率９９．２±０．０％）まで安定して分解し、環境省の定める卒業判定基準である０．５ｐｐｍを下回る極めて高活性および高効率な分解性能を示した。以上の解析は、分析回数ｎ＝３で行った。
［符号の説明］
１　　汚染物質の無害化装置
２　　マイクロバブル発生装置
１０　攪拌槽
１１　スイッチバルブ
１２　レギュレーター
１３　メインバルブ
１４　フィルター・レギュレーター
１５　エアーポンプ（コンプレッサー）
１６　逆止弁
１７　ロータリージョイント
１８　攪拌翼
１９　通気管
２０　バッファータンク
３０　ＰＣＢタンク
４０　微生物製剤投入口
５０　振動伝達体
５１　超音波振動子
５２　気体供給口
５３　気体流路
５４　気体放出口
５５　超音波放射面
５６　ケーブル
５７　振動制御器

Claims (13)

  1. 　酸素添加酵素を含有する組成物を、常温、常圧の大気環境下での飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を含有した水性媒体中に溶解又は分散させることを特徴とする、酸素添加酵素含有組成物の活性化方法。
  2. 　飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を含有した水性媒体中で、酸素添加酵素含有組成物と汚染物質を含む油性成分との混合物を攪拌することを含む、汚染物質の分解又は無害化方法。
  3. 　前記水性媒体中へマイクロバブルを供給することを含む請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 　前記マイクロバブルが、前記水性媒体及び／又は前記水性媒体と油性成分の混合物へ、酸素を流しながら超音波処理を行うことにより発生する請求項３に記載の方法。
  5. 　前記マイクロバブルが、前記水性媒体及び／又は前記水性媒体と油性成分の混合物を、加圧処理することにより発生する請求項３に記載の方法。
  6. 　前記汚染物質が、トルエン、ベンゼン、ダイオキシン類及び／又はポリ塩化ビフェニル類を含む、単環若しくは多環芳香族化合物からなる請求項２～５の何れか一項に記載の方法。
  7. 　前記酸素添加酵素含有組成物が、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを微生物細胞内で発現させた微生物製剤である請求項１～６の何れか一項に記載の方法。
  8. 　前記混合物が、場合により界面活性剤又はアルコールを含み、前記水性媒体と油性成分とのエマルジョンである請求項２～７の何れか一項に記載の方法。
  9. 　通気手段、攪拌手段及び／又は温度制御手段を備えた攪拌槽と、
    　前記攪拌槽と連通し水性媒体及び／又は汚染物質を含む油性成分を導入する試料導入部と、
    　前記攪拌槽内の試料にマイクロバブルを供給するマイクロバブル発生部と
    を備えることを特徴とする、汚染物質の無害化装置。
  10. 　前記マイクロバブル発生部が、前記攪拌槽に備えられた超音波型マイクロバブル発生装置である請求項９に記載の装置。
  11. 　前記マイクロバブル発生部が、前記試料導入部に備えられた加圧型マイクロバブル発生装置である請求項９に記載の装置。
  12. 　請求項２～８の何れかに記載の方法に使用するための請求項９～１１の何れか一項に記載の装置。
  13. 　飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を含有し、当該酸素の少なくとも一部がマイクロバブルとして存在する水性媒体中で、酸素添加酵素含有組成物と汚染物質を含む油性成分とを混合すること、及び
    　前記水性媒体と油性成分との混合物に通気及び攪拌することを含む、汚染物質の分解又は無害化方法。
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