WO2004050875A1 - 新規な芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群及びその用途 - Google Patents

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WO2004050875A1
WO2004050875A1 PCT/JP2003/015102 JP0315102W WO2004050875A1 WO 2004050875 A1 WO2004050875 A1 WO 2004050875A1 JP 0315102 W JP0315102 W JP 0315102W WO 2004050875 A1 WO2004050875 A1 WO 2004050875A1
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peptide
seq
amino acid
acid sequence
dna
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PCT/JP2003/015102
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French (fr)
Inventor
Yuki Kasai
Norihiko Misawa
Kazutoshi Shindo
Original Assignee
Marine Biotechnology Institute Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Marine Biotechnology Institute Co., Ltd. filed Critical Marine Biotechnology Institute Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0095—Oxidoreductases (1.) acting on iron-sulfur proteins as donor (1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y118/00—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18)
    • C12Y118/01—Oxidoreductases acting on iron-sulfur proteins as donors (1.18) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.18.1)
    • C12Y118/01002—Ferredoxin-NADP+ reductase (1.18.1.2)

Definitions

  • the present invention relates to a gene group encoding an aromatic ring dioxygenase (oxygenase), which is an enzyme that is a key enzyme for decomposing various aromatic (aromatic ring) compounds, and water using microorganisms into which the gene group has been introduced and expressed.
  • oxygenase aromatic ring dioxygenase
  • the present invention relates to a method for purifying an environment contaminated with an aromatic compound.
  • the present invention relates to the field of environmental purification using enzyme genes possessed by such microorganisms, and to the synthesis of industrially useful organic low molecular weight compounds.
  • Aromatic dioxygen is usually composed of ferredoxin and ferredoxin reductase (alias: NAD (P) H-ferredoxin reductase), and is further composed of dioxygen.
  • Ring Dioxygenase It is a multi-component enzyme consisting of the main enzyme [consisting of two components, a large subunit ( ⁇ -subunit) and a small subunit—subunit]. Ring Dioxygenase ").
  • various examples of ferredoxinous aromatic dioxygenases are known, and the structures and functions of the genes encoding them are being analyzed.
  • Typical examples of aromatic dioxygenase genes that have been isolated and analyzed so far include toluenecin + xykenzine derived from Pseudomonas putidaj Fl ⁇ , an organic solvent-utilizing bacterium such as toluene and benzene.
  • Cycloclasticus genus Bacteria are marine bacteria belonging to ⁇ -proteobacteria and degrade various aromatic hydrocarbons including polycyclics such as toluene, ethylbenzene, or, nr, £ -xylene, biphenyl, naphthalene, phenanthrene, and alkylnaphthalene.
  • Cycloclasticus sp. A5 strain is most mainly involved in the decomposition of aromatic compounds (petroleum-based aromatic compounds) contained in petroleum spilled into the marine environment, especially polycyclic aromatic hydrocarbons.
  • Non-Patent Document 1 Shindo, K., Ohnishi, Y., Chun, H.-K., Takahashi, H., Hayashi, M., Saito, A., Iguchi, K., Furukawa, ⁇ ., Harayaraa, S , Horinouchi, S., and Misawa, N., Oxygenation reactions of various tricyclic fused aromatic compounds using Escherichia coli and Streptomyces lividans transformants carrying several arene dioxygenase genes. Biosci. Biotechol. Biochem., 65, 2472-2481, 2001).
  • Non-Patent Document 2 Geiselbrecht, AD, Hedlund, BP, Tichi, MA, and Staley, JT, Isolation of marine polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) -degrading Cvcloclasticus strains from the Gulf of Mexico and comparison of their PAH degradation ability with that of Puget Sound Cycloclasticus strain. Appl. Environ. Microbiol., 64, 4703-4710, 1998).
  • PAH polycyclic aromatic hydrocarbon
  • Non-Patent Document 2 cycloclasticus bacteria possess two types of oxygenases, biphenergoxygenase and naphthalenedioxygenase, which contribute to a wide range of resolution for aromatic hydrocarbons.
  • An object of the present invention is to clarify enzymes (genes) responsible for a wide range of resolution of aromatic hydrocarbons of bacterium belonging to the genus Cycloclasticus, and to use the enzymes (genes) for industrially useful It is used for the biochemical conversion to natural substances or the decomposition and purification of environmental toxicants.
  • an aromatic dioxygenase obtained from a strain A5 belonging to the genus Cycloclasticus is phenanthrene naphthalene 1-methylnaphtha. Ren. (L-methylnaphthalene) N 2-methylnaphthalene ⁇ diben Introduces hydroxyl groups into the aromatic ring of a wide range of aromatic compounds such as dibenzofuran, dibenzothiophene, diphenylmethane, and biphenyl, and becomes the first enzyme in the decomposition of these compounds. I found that.
  • (4-hydroxymethyl-naphthalene_1-yl) -methanol obtained from 1,4-dimethylnaphthalene is used as a raw material for resins and 1,4-naphthalenedicarboxylic acid, a raw material for dyes, and as a petroleum component. It is an important synthetic intermediate when bioprocessed from 1,4-dimethylnaphthalene.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention provides a gene encoding the peptide shown in (a) to (1): (a) a peptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5,
  • a peptide having a ferredoxin reductase activity which is a bacterial-derived peptide encoded by a DNA consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 4 or a DNA complementary thereto under a stringent condition.
  • the present invention is also a microorganism obtained by introducing all or a part of the above-mentioned gene, which is capable of introducing a hydroxyl group into an aromatic compound.
  • the present invention further provides a hydroxylated aromatic compound, comprising culturing the microorganism in a medium containing an aromatic compound to obtain a hydroxylated aromatic compound from the culture or the cells. It is a manufacturing method.
  • the present invention is a method for purifying an environment, comprising purifying an environment contaminated with an aromatic compound with the microorganism.
  • the medium containing an aromatic compound is a medium containing 1,4-dimethylnaphthalene or 1,5-dimethylnaphthalene
  • the hydroxylated aromatic compound is an aromatic compound having a methyl group hydroxylated.
  • the present invention relates to a method for producing an aromatic compound wherein a methyl group is hydroxylated by using (4-hydroxymethyl-naphthalene-1-yl) -methanol or (5-methylnaphthalen-1-yl) -methanol.
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of an aromatic compound converted by an aromatic dioxygenase derived from A5 strain of Clusticus sp. And a conversion product (compound 1 to compound 7).
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an aromatic compound converted by an aromatic ring dioxygenase derived from Cycloclasticus sp. Strain A5 and a conversion product (compounds 8 to 9).
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of an aromatic compound converted by an aromatic ring dioxygenase derived from A5 strain of Cycloclasticus and a conversion product (compound 10 to compound 13).
  • the marine bacterium Cycloclasticus sp. Strain A5 which served as the source of the target genes, was obtained from Kamaishi Bay, Iwate Prefecture, using polycyclic aromatic hydrocarbons such as 2-methylnaphthalene and phenanthrene. (Kasai, Y.,
  • This A5 strain was classified as a Cycloclasticus bacterium by analyzing the sequence of the 16S rDNA and gyrB genes. The bacterium was also able to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons contained in crude oil, such as naphthalene, alkylnaphthalene, phenanthrene, alkylphenanthrene, and dibenzothiophene. Cycloclasticus sp. Strain A5 has been deposited on November 15, 2002 (Accession number: FERM P-19107).
  • Aromatic dioxygenase genes (genes of the present invention)
  • the gene group of the present invention is composed of four genes encoding four subunits constituting an aromatic ring dioxygenase.
  • the four subunits are the large (c subunit, the small (
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • b an amino acid sequence having one or more amino acids added, deleted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • an aromatic ring C
  • the peptide of (a) is a peptide consisting of a 460 amino acid sequence that functions as a large subunit of an aromatic dioxygenase obtained from Cycloclasticus A5 strain.
  • PhnAl aromatic ring dioxygenase large subunit
  • the peptide of (b) is a peptide obtained by introducing a mutation into the peptide of (a) to such an extent that it can function as an aromatic dioxygenase large subunit.
  • Such mutations include not only mutations occurring in nature but also artificial mutations.
  • Artificial mutation Examples of the means for generating the force include site-directed mutagenesis (Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982).
  • the number of mutated amino acids is not limited as long as it can function as a large subunit of an aromatic dioxygenase, but is usually within 30 amino acids, preferably within 20 amino acids, and more preferably within 10 amino acids. Within, most preferably within 5 amino acids.
  • the peptide (c) is a peptide which functions as a large unit of a bacterial aromatic dioxygenase obtained by utilizing hybridization between DNAs.
  • the “stringent conditions” in the peptide of (c) refer to conditions under which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are usually about 1X SSC, 0.1% SDS, 37 ° C, and preferably about 0.5X SSC, 0.1% SDS 42 ° C. Preferably, it is about “0.2 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C”.
  • the DNA obtained by hybridization usually has high homology to the DNA represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. High homology refers to homology of 60% or more, preferably 75% or more, more preferably 90% or more.
  • the gene encoding the small subunit of the aromatic ring dioxygenase which is the second gene, encodes the peptide shown in the following (d), (6), or (; 0).
  • a peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (e) an amino acid sequence having one or more amino acids added, deleted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and an aromatic ring dioxygenase A peptide that functions as a small subunit, (f) a peptide derived from a bacterium, which is encoded by a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or a DNA complementary thereto and a DNA that hybridizes under stringent conditions, Peptide that functions as a small submit of cyclic dioxygenase.
  • the peptide of (d) is a peptide (also referred to as PhnA2) consisting of a 177 amino acid sequence that functions as a small subunit of an aromatic dioxygenase obtained from Cycloclasticus A5 strain.
  • PhnA2 a peptide
  • Aminatic ring dioxygenase small subunit “Functions as” means that it forms a complex with the other three subunits constituting the aromatic ring dioxygenase and can exert the aromatic ring dioxygenase activity.
  • the peptide of (e) is a peptide obtained by introducing a mutation into the peptide of (d) such that the peptide can function as a small aromatic dioxygenase subunit.
  • Such mutations include not only mutations occurring in nature but also artificial mutations.
  • the number of mutated amino acids is not limited as long as it can function as an aromatic dioxygenase small subunit, but is usually within 10 amino acids, and more preferably within 5 amino acids.
  • the peptide of (f) is an peptide which functions as a small aromatic aromatic dioxygenase subunit obtained by utilizing hybridization between DNAs.
  • the “stringent conditions” for the peptide of (II) refer to conditions under which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are as described above.
  • the third gene encodes a peptide represented by the following (g), (h), or (i).
  • the peptide of (g) is a peptide (also referred to as PhnA3) consisting of a 104 amino acid sequence which functions as ferredoxin of an aromatic ring dioxygenase obtained from Cycloclasticus A5 strain.
  • the peptide (h) is a peptide obtained by introducing a mutation into the peptide (g) to such an extent that it can function as ferredoxin.
  • Such mutations include not only mutations that occur in nature but also artificial mutations.
  • the number of mutated amino acids is not limited as long as it can function as ferredoxin. And more preferably within 3 amino acids.
  • the peptide of (i) is a peptide that functions as a bacterial ferredoxin obtained by utilizing DNA-hybridization.
  • the “stringent conditions” in the peptide of (i) refer to conditions under which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are as described above.
  • the fourth gene encodes a peptide shown in the following (j), (k), or (1).
  • a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, (k) an amino acid sequence in which one or more amino acids have been added, deleted or substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, And a peptide having ferredoxin reductase activity, (1) a peptide derived from a bacterium encoded by a DNA that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 or a DNA complementary thereto under stringent conditions, A peptide having ferredoxin reductase activity.
  • the peptide of (j) is a peptide consisting of a 340 amino acid sequence having ferredoxin reductase activity of an aromatic dioxygenase obtained from Cycloclasticus sp. strain A5 (also referred to as PhnA4).
  • the peptide of (k) is a peptide obtained by mutating the peptide of (j) to the extent that it has ferredoxin reductase activity.
  • Such mutations include not only mutations that occur in nature but also artificial mutations.
  • the number of mutated amino acids is not limited as long as it has ferredoxin reductase activity, but is usually within 20 amino acids, preferably within 14 amino acids, more preferably within 7 amino acids, Most preferably it is within 4 amino acids.
  • the peptide of (1) is a peptide having a ferredoxin reductase activity derived from a bacterium obtained by utilizing the hybridization between DNAs.
  • the “stringent conditions” in the peptide of (1) refer to conditions under which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Such conditions are as described above.
  • the gene of the present invention can be obtained by the following procedure. First, genomic DNA of the genus Cycloclasticus sp. Strain A5 is prepared, cut with an appropriate restriction enzyme, and ligated to an appropriate vector to prepare a genomic DNA library.
  • vectors various vectors derived from phage I, for example, ⁇ gtlO, ZaplI, Cosmid Vector PRAFR3, etc., or plasmid vectors such as pUC18 and pBluescript II can be used.
  • a clone retaining the target gene an appropriate amount of indole is added to the plate, and a clone that synthesizes blue indigo may be selected.
  • Genes encoding the aromatic ring dioxygenase of Cycloclasticus A5 form clusters.
  • the aromatic ring dioxygena can be obtained.
  • the full length of the DNA encoding the large subunit, the small subunit, the ferredoxin, and the ferredoxin reductase can be isolated.
  • the aromatic ring dioxygenase gene group is introduced into microorganisms such as Escherichia coli, and the resulting recombinant microorganisms are mixed and cultured with various aromatic compounds to form hydroxyl groups specifically on these aromatic compounds. Can be introduced.
  • the aromatic dioxygenase gene group is composed of four genes, and it is desirable that all of these genes be introduced into a host microorganism and expressed.
  • ferredoxin and ferredoxin reductase other than the main enzyme may originally be present in the host and can be used in some cases. In such a case, it is not necessary to introduce them.
  • a hydroxyl group can be introduced into various aromatic compounds such as a polycyclic aromatic compound (including a polycyclic aromatic hydrocarbon having an alkyl group) and an aromatic compound having a fluorine group. it can.
  • a polycyclic aromatic compound including a polycyclic aromatic hydrocarbon having an alkyl group
  • an aromatic compound having a fluorine group it can.
  • the following table illustrates the hydroxylated aromatic compound (conversion product) produced by the method of the present invention and the aromatic compound (substrate) used as a substrate.
  • the aromatic compound produced by the method of the present invention is not limited to these compounds.
  • 1,4-naphthalenedicarboxylic acid a raw material for resins, dyes and pigments, from 1,4-dimethylnaphthalene, a petroleum component, by a bioprocess.
  • 1,4-naphthalenedicarboxylic acid Chemical Substances under Chemical Substances Control Law
  • 1,4-dimethylnaphthalene by petrochemical industry. ing. 4. How to clean the environment contaminated with aromatic compounds
  • the microorganism of the present invention can be used for purifying an environment contaminated with an aromatic compound.
  • the “environment” here includes soil, ocean, air, and wastewater.
  • the purification of the environment is performed by spraying a culture solution of the microorganism cultured under the above conditions or a dry powder obtained by freeze-drying the microorganism into the contaminated environment.
  • the dried powder and the inorganic salts for assisting the growth may be mixed and granulated, and the resulting powdered or granulated preparation may be sprayed on the contaminated environment.
  • the amount of microorganisms used in the process can be arbitrarily determined, usually, if the culture in contaminated soil lm 3 or contaminated waters 100 m 2 0. 02L, dried cells Then it is about 0.1 lg.
  • purification of the contaminated air is performed by adding the culture solution or the dried cells to a gas purifier equipped with an immobilization carrier and ventilating the contaminated air.
  • the contaminated wastewater is purified by mixing the above-mentioned culture solution or dried bacterial cells with the contaminated wastewater and culturing it under aerobic conditions for about 7 to 60 days.
  • Example 1 Preparation of DNA library of Cycloclasticus sp.
  • A5 strain Cycloclasticus sp.
  • A5 strain was transformed into a 1 liter artificial strain containing 0.1% (w / v) phenanthrene. The cells were inoculated in seawater and cultured at 25 ° C for ⁇ days. After collection, long-chain (genomic) DNA of strain A5 was prepared (Ausubel et al. (Eds), Current Protocols in Molecular Biology, Chap. 2, 1994). 0.5 mg of the restriction enzyme ⁇ 3AI was added to 50 mg of the A5 strain DNA and reacted at 37 ° C for 30 minutes to perform partial cleavage.
  • This DNA was fractionated by agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment ranging from 15 kb to 30 kb was recovered.
  • a cosmid vector Lorist6 (Staskawicz et al., J. Bacteriol., 169, 5789-5794, 1987) cut with the restriction enzyme BamHI was prepared.
  • the Sau3AI fragment of the A5 strain DNA was mixed with the above cosmid vector DNA, and Takara After ligation was performed using Ligation kit Ver. 2 and packaging was performed using GigapackTM III Gold Packaging Extract (Stratagene Cloning Systems), the cells were infected with Escherichia coli XL-1 strain. Of the transformed population, 490 clones were maintained and used as a DNA library of Cycloclasticus A5 strain.
  • Example 2 Identification of Cosmid Clone Encoding Aromatic Dioxygenase For all the colonies of the DNA library of Cycloclasticus A5 strain obtained in Example 1, indigo was added to the medium, and indigo phenol was added. Using the color of the DNA as an index, a clone having a DNA fragment containing an aromatic ring (di) oxygenase gene group was screened. As a result, clearly positive signals were observed for the two clones containing the plasmid pHla or pHlb. Restriction enzyme mapping of the input fragments contained in these plasmids revealed that these two input fragments overlapped each other. Thereafter, this pHla was used for determination of subcloning and nucleotide sequences of various regions.
  • Example 3 Determination of base sequence of gene group encoding aromatic ring dioxygenase
  • the cosmid clone pHla obtained in Example 2 was cut out by restriction enzyme treatment, and the cloning vector pBluescript II SK + (Stratagene II :) was subcloned.
  • the T7 and T3 promoters are located on both sides of the ma / reti cloning site of this vector.
  • To determine the nucleotide sequence of the cloned DNA fragment the following DNA primers based on the nucleotide sequence of each promoter were designed and synthesized.
  • T3 primer GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G
  • T7 primer GAA TTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG
  • sequence counter Dye terminator cycle sequencing kit Enorema Co., Ltd.
  • 377 DNA sequencer Perkin Enorema Co., Ltd.
  • the gene capable of encoding a product homologous to the large ( ⁇ subunit) is phnAl (SEQ ID NO: 1)
  • the gene capable of encoding a product homologous to the small ( ⁇ ) subunit is phnA2 (SEQ ID NO: 2)
  • a gene capable of encoding a product homologous to ferredoxin is phnA3 (SEQ ID NO: 3)
  • a gene capable of encoding a product homologous to ferredoxin reductase (ferredoxin reducing enzyme) (ferredoxin NAD (P) H reductase) is designated as phnA4 (sequence). No. 4).
  • PhnAl (SEQ ID NO: 5) of A5 strain of Cycloclasticus consists of a 460 amino acid sequence, and the homology with the aromatic ring dioxygen of other microorganisms is higher in the order of homology with the large subunits of Sphingomonas aromati sibolans.
  • Sphingomonas aromaticivorans F199 strain and Alcaligenes faceal is AFK2 strain, aromatic ring dioxygenase large subunit [BphAlf (accession no.NP- 049062) and PhnAc (accession no. BAA76323)] had beauty 5 2% identity (identity).
  • PhnA2 (SEQ ID NO: 6) of A5 strain of Cycloclasticus consists of a 177 amino acid sequence, and homology with the aromatic subunits of other microorganisms is higher in the order of Sphingomonas arromatisiblance in descending order.
  • PhnA3 (SEQ ID NO: 7) of A5 strain of Cycloclasticus consists of a 104 amino acid sequence, and homology with ferredoxin of other microorganisms is higher than that of Sphingomonas aromatisivorans F199 strain. And Sphingomonas cmbibukensis ferredhesin LBphA3 (accession no.NP_049211) and PhnR (accession no.AAC95320)] and 63% and 63%, respectively. Had the same identity.
  • PhnA4 (SEQ ID NO: 8) of A5 strain of Cycloclasticus consists of a 340 amino acid sequence, and the homology with ferredoxin reductase of other microorganisms is high, in descending order, Pseudomonas stutzeri 0X1 strain.
  • Al mosquito Li Genesu ⁇ ferredoxin reductase of Faseari scan AFK2 share [TouF (accession no. CAA06659) and PhnAa (accession no. BAA76321)] and it respectively, 50% and 47% of identity (identity) Had.
  • Example 4 Preparation of Plasmid Expressing Aromatic Dioxygenase Gene
  • a 2.7 kb Pstl-Sall DNA fragment obtained by cutting plasmid pHla (Example 2) with £ ⁇ 1 [phnAl gene (sequence No. 1) and the phnA2 gene (SEQ ID NO: 2) region] were linked to pBluescript II SK + cleaved with ⁇ II to produce plasmid pISP3.
  • a ferredoxin gene [phnA3 (SEQ ID NO: 3)] and a ferredoxin reductase gene [hnA4 (SEQ ID NO: 4)] were ligated as follows.
  • E. coli JM109 strain Takara
  • pPhn E. coli
  • F-Kp GGG GTA CCA ATC TTA GCT AAT CTT ATT C
  • the E. coli (pPhn) prepared in Example 4 was subjected to liquid culture in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) containing 150 ⁇ g / ml ampicillin (Ap) until the early log phase.
  • a glycerol-preserved strain was prepared by suspending in glycerol so as to have a final concentration of about 30% and placing it in a deep freezer at -70 to -80 ° C.
  • JM109 having the Escherichia coli vector pBluescript II SK + was cultured in the same manner to prepare a Glyceal stock.
  • a transformant of E. coli was picked up from a glycerol-preserved strain with a platinum loop, suspended in 4 ml of LB medium containing 150 ⁇ g / ral Ap, and rotated at 120 rpm. At 30 ° C? Cultured for ⁇ 8 hours (pre-culture). Next, this preculture was grown in M9 medium (Sambrook, J.M.) containing 150 ⁇ g / ml Ap, 0.4% (w / v) glucose, and 10 ⁇ g / ml thiamine. , Fritsch, EF, Maniatis, T., see “Molecular cloning – A laboratory manual.” Cold Spring Harbor Laboratory Pres s, 1989, Appendex A.
  • naphthalene naphthalene
  • 1- methylcarbamoyl Honoré naphthalene 1- methylnaphthalene
  • 2- main Chinorenafu data Len (2- methylnaphthalene) N
  • 4- dimethyl Chinorenafu data Len (1,4-dimethylnaphthalene)
  • 1,5-dimethylnaphthalene (1,5-diraethylnaphthalene) s 2,6-dimethylnaphthalene (2,6-dimethylnaphthalene) ene
  • Ann Bok spiral anthracene; N tragic (pyrene) benzo [a] pyrene (benzo [a] pyrene) ⁇ self - supplied Zofran (dibenzofurane) dibenzo Chio phen (dibenzothiophene) ⁇ Pi,
  • Liquid A water / methanol (50/50)
  • Solution B Methanol / 2_propanol (60/40)
  • the conversion ratio was defined as the area ratio of the peak monitored at the wavelength (max plot) at which the maximum absorption was observed in the range of 210 to 350 nra.
  • the extract is subjected to thin layer chromatography (TLC) using silica gel [0.25 nm Silica Gel 60, (Merck)] to confirm the conversion product, and then a silica gel column [20 X 250 mm, Silica Gel 60 (Merck)]
  • TLC thin layer chromatography
  • silica gel [0.25 nm Silica Gel 60, (Merck)]
  • silica gel column [20 X 250 mm, Silica Gel 60 (Merck)]
  • the product was subjected to column chromatography using, and a pure product was obtained.
  • the developing solvents for TLC for each substrate are as follows.
  • the developing solvents for column chromatography in each substrate are as follows.
  • phenanthrene, hexane—EtOAc (1: 1 naphthalene, hexane—JitOAc (1: 1); dibenzofuran, hexane—EtOAc (5: 1), dibenzothiophene, hexane—EtOAc (3: 1); diphenylmethane, hexane—EtOAc (4: 1); biphenyl, hexane—EtOAc (15: 1); 1-raethylnaphthalene, hexane—EtOAc (4: 1); 2-methylnaphthalene, hexane—EtOAc (4: 1); 1, 4-diraethylnaphthalene, hexane—EtOAc ( 3: 1); 1, 5-dimethylnaphthalene, hexane-EtOAc (3: 1); 2, 6-dimethylnaphthalene, hexane -EtOAc (2: 1).
  • MS spectrum and the RIR spectrum were measured using JEOL JMS-AX505W and BRUKER AMX400, respectively.
  • the crude extract (33.l mg) was subjected to conversion experiment of diphenylmethane using recombinant Escherichia coli and subjected to TLC. As a result, it was found that a product with an Rf value of 0.5 (compound 5) was produced. .
  • This product was purified by silica gel column chromatography to obtain a pure compound 5 (6.2 mg).
  • Compound 5 is based on a comparison of previously reported MS data with thigh R spectrum data (Nakai, Y. and Yamada, F., Org. Magn. Reson., 11, 607-611, 1978). And 2-hydroxydiphenylmethane (IUPAC name: 2-benzylphenol) (FIG. 1).
  • compound 11 was a known compound described in CAS, it is the first report that compound 11 can be produced by a biotransformation reaction using an enzyme (gene) such as an aromatic dioxygenase. Therefore, the method of the present invention is also effective as a method for producing compound 11.
  • This (4-hydroxymethyl-naphthalene-1-yl) -methanol is used to convert 1,4-naphthalenedicarboxylic acid, which is a raw material for resins and a raw material for dyes, to 1,4-dimethyl
  • the present invention provides a large ( ⁇ ) subunit gene, a small () submit gene, a ferredoxin gene, and a ferredoxin reductase gene of an aromatic dioxygenase derived from a bacterium of the genus Cycloclasticus sp.
  • the protein produced from the gene group according to the present invention can introduce a hydroxyl group into an aromatic compound which is an environmental pollutant derived from petroleum or coal tar. That is, the present invention provides a method for specifically hydroxylating these petroleum-based aromatic compounds with a microorganism that has expressed the genes according to the present invention. Since the hydroxylated aromatic compound is easily decomposed by microorganisms and the like, the present invention is useful for environmental purification of contaminated soil and the like. Further, this method can produce an industrially useful hydroxylated aromatic compound.

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Abstract

サイクロクラスティカス属細菌の芳香族炭化水素に対する広範な分解能の原因となっている酵素を明らかにし、その酵素を芳香族炭化水素の生化学的変換、分解、浄化に利用する。サイクロクラスティカス属A5株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群、並びにこの遺伝子群を導入・発現した微生物を利用した水酸化された芳香族化合物の製造法及び芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法。

Description

新規な芳香環ジォキシゲナーゼ遺伝子群及びその用途
<技術分野 >
本発明は、 種々の芳香族 （芳香環） 化合物の分解のキーとなる酵素である芳香 環ジォキシゲナーゼ （酸素添加酵素） をコードする遺伝子群、 並びにこの遺伝子 群を導入 ·発現した微生物を利用した水酸化された芳香族化合物の製造法及ぴ芳 明
香族化合物で汚染された環境の浄化方法に関するものである。
芳香族化合物の多くは毒性または発癌性を持ち環境中においては汚染物質とな 書
る。 その一方で環境中には芳香族化合物を栄養源として利用し、 資化する微生物 が存在する。 本発明は、 このような微生物が有する酵素遺伝子を利用した環境浄 化の分野、 及び産業上有用な有機低分子化合物の合成に関するものである。
<背景技術 >
環境汚染物質となりうる芳香族化合物の細菌による分解、 浄化の研究は、 環境 問題への関心の高まりとあいまって精力的に行われてきた。 これらの研究内容と しては、 特定の芳香族化合物を特異的に分解する細菌の探索、 分解経路の解明、 また、 分解に関与する遺伝子の単離等が挙げられる。 現在までに、 多岐にわたる 細菌種が芳香族化合物を資化する能力を持つものとして単離されてきた。 また、 芳香族化合物は複雑な過程を経て水と二酸化炭素にまで分解されることや、 この 分解に必要な遺伝子は多数存在し、 これらは大きなプラスミド上又は染色体 DNA 上にクラスタ一を形成する場合が多いことが明らかになつてきた。 芳香族化合物 分解の初発酵素である芳香族化合物ォキシゲナーゼ （酸素添加酵素） には、 モノ ォキシゲナーゼとジォキシゲナーゼの 2種類があるが、 いづれも芳香族化合物分 解におけるキー酵素であると考えられている （Harayama, S.， Polycyclic aromatic hydrocarbon bioremediation design. Curr. 0pm. Biotechnol.， 8， 268—273， 1997)。 現在までに多くの芳香族 （芳香環） 化合物ジォキシゲナーゼ [以後、 芳香環ジ ォキシゲナーゼ（aromatic ring dioxygenase)と呼ぶ] に関する研究が行われてき た。 芳香環ジォキシゲ^ "一ゼは、 通常、 フェレドキシン（ferredoxin)及びフェレ ドキシン レダク ターゼ （還元酵素） （ferredoxin reductase, 別名 ： NAD (P) H-ferredoxin reductase)を構成要素とし、 さらにジォキシゲづ "一ゼ本体酵 素 [大サブユニット （α—サブユニット） と小サブユニット —サブユニット） の 2つからなる] からなる多成分酵素 （multi- component enzyme) である （以後 本酵素を 「フェレドキシン性の芳香環ジォキシゲナーゼ」 と呼ぶ場合がある）。 現 在では、種々のフェレドキシン性の芳香環ジォキシゲナ一ゼの例が知られており、 それらをコードする遺伝子の構造や機能の解析も実施されている。 現在までに単 離され解析された代表的な芳香環ジォキシゲナーゼ遺伝子の例を挙げると、 トル ェン、 ベンゼン等の有機溶媒資化細菌シユードモナス · プチダ (Pseudomonas putidaj Fl ^由来の卜ノレェンシ +キシケづ—一 (toluene dioxygenase) ikis子
(.Zylstra, G. J. and Gibson, D. T. , Toluene degradation by Pseudomonas putida Fl : nucleotide sequence of the tod C1C2BADE genes and their expression in Escherichia coli. J. Biol. Chem.， 264, 14940-14946, 1989)、 及び、 シユー ドモナス属 (Pseudomonas sp. ) NCIB9816- 4 株由来のナフタレンジォキシゲナー セ (naphthalene dioxygenase 遗伝ナ (Resnick, S. M.， Lee, K. , and Gibson, D. T.， Diverse reactions catalyzed by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. Strain NCBI 9816. J. Ind. Microbiol. , 17， 438-457, 1996)、 及び、 ポリ 塩化ビフエ-ル（PCB)分解細菌シユードモナス ■ シユー ドアルカ リゲネス
(Pseudomonas pseudoalcaligenes) KF707株由来のビフエニノレジオキシゲナーゼ (biphenyl dioxygenase) (Furukawa, K. , and Miyazaki, T. , し loning of gene cluster encoding biphenyl and chlorobiphenyl degradation in Pseudomonas pseudoalcaligenes. J. Bacteriol. , 166, 392-398, 1986)、 及び、 ノカノレディ オイデス属 (Nocardioides sp. ) KP7株由来のフエナントレン （フエナンスレン） シォキシグナーセ ( Saito, A, I abuchi, T.， and Harayaraa, S. , A novel phenanthrene dioxygenase from Nocardioides sp. strain KP7 : Expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. , 182, 2134 - 2141， 2000) 等が知られている。 最近、 ノカルディオイデス属 KP7株由来のフエナントレンジォキシゲナーゼ遺伝 子を始めとするいくつかの芳香環ジォキシゲナーゼ遺伝子を発現した組換え大腸 菌を用いて、種々の三環式（多環式）芳香族化合物の水酸化反応が報告された（非 特許文献 1参照）。 （通常、 二環式炭化水素であるナフタレン以上が多環式炭化水 素と呼ばれており、 単環式炭化水素に比べて、 分解されにくい傾向がある。） サイクロクラスティカス (Cycloclasticus) 属細菌は、 γ -プロテオバクテリア に属する海洋細菌であり、 トルエン、 ェチルベンゼン、 or、 nr、 £ -キシレン、 ビ フエニル、 ナフタレン、 フエナントレン、 アルキルナフタレン等、 多環式を含む 多種の芳香族炭化水素を分解できることが知られている （Wang, Y.， Lau, P. C. K.， and Button, D. K. , A marine oligobacterium harboring genes known to be part of aromatic hydrocarbon degradation pathways of soil pseudomonads. App丄. Environ. Microbiol. , 62, 2169-2173, 1996)。 また、 サイクロクラスティカス属 (Cycloclasticus sp. ) A5株は、 海洋環境に流出した石油に含まれる芳香族化合 物（石油系芳香族化合物）、特に多環式芳香族炭化水素の分解に最も主体的な役割 を果たす海洋細菌として、 本発明者の 1人らによって釜石湾より単離されたもの である (Kasai, Y. , Kishira, H.， Harayama, S. , Cycloclasticus plays a primary role in the degradation of polyaromatic hydrocarbons released in a marine environment. Appl. Environ. Microbiol. , 68, 5625-5633， 2002)。 石油系芳香 族化合物の分解におけるサイクロクラスティカス属細菌の有用性にもかかわらず、 サイクロクラスティカス属細菌に含まれる芳香環ジォキシゲナーゼゃこれをコー ドする遺伝子の知見は、 ほとんど無いのが現状であった。 わずかに、 Wangらによ つて単離された XylCl、 xylC2と名付けられた遺伝子 （Wang, Y.， Lau, P. C. K. , and Button, D. . , A marine oligobacterium harboring genes known to be part of aromatic hydrocarbon degradation pathways of soi l pseudomonads. Appl. Environ. Microbiol. , 62, 2169—2173, 1996) や Geiselbrechtらによって単離さ れたビフエ二ルジォキシゲナーゼ大サプュニット、 ナフタレンジォキシゲナーゼ 大サブユニットの一部と思われる 2種類の DNA断片 （非特許文献 2参照） などに 関する報告があつたに過ぎない。
非特許文献 1 Shindo, K.， Ohnishi, Y.， Chun, H. - K. , Takahashi, H.， Hayashi, M.， Saito, A.， Iguchi, K. , Furukawa, Κ. , Harayaraa, S.， Horinouchi, S.， and Misawa, N.， Oxygenation reactions of various tricyclic fused aromatic compounds using Escherichia coli and Streptomyces lividans transformants carrying several arene dioxygenase genes. Biosci. Biotechol. Biochem.， 65， 2472-2481, 2001)。
非特許文献 2 Geiselbrecht, A. D. , Hedlund, B. P. , Tichi, M. A.， and Staley, J. T.， Isolation of marine polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) -degrading Cvcloclasticus strains from the Gulf of Mexico and comparison of their PAH degradation ability with that of Puget Sound Cycloclasticus strain. Appl. Environ. Microbiol. , 64, 4703-4710， 1998)。
Geiselbrechtらは、サイクロクラスティカス属細菌がビフエエルジォキシゲナ ーゼとナフタレンジォキシゲナーゼの 2種類のォキシゲナーゼを有しており、 こ れが芳香族炭化水素に対する広範な分解能の原因であると推測した （非特許文献 2参照）。 しかし、 このことは実験的に確認されておらず、 サイクロクラスティカ ス属細菌がどういった理由で多種の芳香族炭化水素を分解できるかについては依 然として不明であった。
本発明の目的は、 サイクロクラスティカス属細菌の芳香族炭化水素に対する広 範な分解能の原因となっている酵素 （遺伝子） を明ら力にし、 その酵素 （遺伝子） を用いて、 産業上有用な物質への生化学的変換、 または、 環境毒物の分解、 浄化 に利用することにある。
<発明の開示 >
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、 サイクロクラス ティカス属の A5株という菌株から得られた芳香環ジォキシゲナーゼが、フヱナン 卜 レン (phenanthrene) ナフタ レン ( naphthalene ) 1 -メチルナフタ レン . (l-methylnaphthalene) N 2-メチルナフタレン (2-methylnaphthalene) ^ ジベン ゾフラン (dibenzofuran)、 ジベンゾチォフェン (dibenzothiophene)、 ジフエ二 ルメタン （diphenylmethane)、 ビフエニル (biphenyl) などの広範な芳香族化合 物の芳香環に水酸基を導入し、 これらの化合物の分解における初発酵素になって いることを見出した。 サイクロクラスティカス属細菌が広範な基質特異性を示す 理由として、 Geiselbrechtが複数のジォキシゲ^ "一ゼの存在を想定したことから もわかるように、 一つの芳香環ジォキシゲ^ "一ゼがフエナントレンやナフタレン 等の多環式芳香族炭化水素だけでなく、 ジフユニルメタンゃビフユ二ル等をも基 質とすることは、 全く予想外のことであった。 さらに本芳香環ジォキシゲナーゼ は、 1， 4 -ジメチルナフタレン （1, 4 - diraethylnaphthalene)、 または、 1, 5 -ジメチ ルナフタレン （l，5_dimethylnaphthalene) を基質とした場合、芳香環ではなくメ チル基に水酸基が導入された水酸化産物を高収率で生産することがわかった。 こ の結果は、 全く予想外のことであった。 特に、 1, 4-ジメチルナフタレンから得ら れた（4-ヒ ドロキシメチル-ナフタレン _1 -ィル) -メタノールは、樹脂原料、染 '顔 料原料である 1，4_ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の 1, 4 -ジメチルナフタレ ンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。
本発明は以上のような知見を基に完成されたものである。
即ち、 本発明は、 （a ) 乃至 （ 1 ) に示すペプチドをコードする遺伝子である ： ( a ) 配列番号 5記載のァミノ酸配列からなるぺプチド、
( b ) 配列番号 5記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付 加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ芳香環ジォキシゲナ一 ゼ大サブュニットとして機能するぺプチド、
( c ) 配列番号 1記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DM とストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュニットとして機能するペプチド、
( d ) 配列番号 6記載のァミノ酸配列からなるぺプチド、
( e ) 配列番号 6記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数個のァミノ酸が付 カロ、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ芳香環ジォキシゲナ一 ゼ小サブュニットとして機能するぺプチド、 ( f ) 配列番号 2記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュニットとして機能するぺプチド、
( g ) 配列番号 7記載のァミノ酸配列からなるぺプチド、
( h ) 配列番号 7記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数個のァミノ酸が付 加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつフェレドキシンとして 機能するペプチド、
( i ) 配列番号 3記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNA とストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 フェレドキシンとして機能するペプチド、
( j ) 配列番号 8記載のァミノ酸配列からなるぺプチド、
( k ) 配列番号 8記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付 加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつフェレドキシンレダク ターゼ活性を有するぺプチド、
( 1 ) 配列番号 4記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 フェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド。
また、 本発明は、 上記の遺伝子のすべて又は一部を導入して得られる微生物で あって、 芳香族化合物に水酸基を導入できる微生物である。
更に、 本発明は、 上記微生物を、 芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又 は菌体から水酸化された芳香族化合物を得ることを特徴とする、 水酸化された芳 香族化合物の製造法である。
更に、 本発明は、 上記微生物で、 芳香族化合物で汚染された環境を浄化すること を特徴とする環境の浄化方法である。
更に、 本発明は、 芳香族化合物を含む培地が、 1, 4-ジメチルナフタレン又は 1, 5- ジメチルナフタレンを含む培地であり、水酸化された芳香族化合物が、 メチル基が 水酸化された芳香族化合物であることを特徴とする、 上記の水酸化された芳香族化 合物の製造法である。 更に、本発明は、 メチル基が水酸化された芳香族化合物が、 （4 -ヒドロキシメチル -ナフタレン- 1-ィル） -メタノール、又は（5-メチルナフタレン -1-ィル）一メタノー ルであることを特徴とする、 上記の水酸化された芳香族化合物の製造法である。
<図面の簡単な説明 >
図 1は、サイク口クラスティカス属 A5株に由来する芳香環ジォキシゲナーゼが 変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図 （化合物 1〜化合物 7 ) であ る。
図 2は、サイクロクラスティカス属 A5株に由来する芳香環ジォキシゲナーゼが 変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図 （化合物 8〜化合物 9 ) であ る。
図 3は、サイクロクラスティカス属 A5株に由来する芳香環ジォキシゲナーゼが 変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図 （化合物 1 0〜化合物 1 3 ) である。
<発明を実施するための最良の形態 >
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 遺伝子源の海洋細菌サイクロクラスティカス属 A5株
目的とする遺伝子群の供給源となつた海洋細菌サイクロクラスティカス属 (Cycloclasticus sp. ) A5株は、 岩手県釜石湾から、 2 -メチルナフタレン、 フエ ナントレン等の多環式芳香族炭化水素の資化菌として単離された （Kasai, Y. ,
Kishira, H. , Harayama, S. , Appl. Environ. Microbiol. , 68， 5625-5633， 2002)。 本 A5株は、 16S rDNAや gyrB遺伝子の配列の分析により、 サイクロクラスティカ ス属細菌に分類されたものである。 本菌はまた、 原油中に含まれる多環式芳香族 炭化水素であるナフタレン、 アルキルナフタレン、 フエナントレン、 アルキルフ ェナントレン、 ジベンゾチォフェン等を分解することができた。 サイクロクラス ティカス属 (Cycloclasticus sp. ) A5株は、 平成 14年 11月 15 日に寄託されて いる （受託番号： FERM P- 19107)。 平成 15年 10月 6日に原寄託よりブタペスト条 約に基づく寄託へ移管 （国際寄託番号 FERM BP- 08505)。 寄託機関：独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566)。
2 . 芳香環ジォキシゲナーゼ遺伝子群 （本発明の遺伝子群）
本発明の遺伝子群は、 芳香環ジォキシゲナーゼを構成する 4つのサブュニット をコードする 4つの遺伝子からなる。 4つのサブユニットとは、 大 （c サブュ ニット、 小 （|3 ) サブユニット、 フェレドキシン、 フェレドキシンレダクターゼ (フェレドキシン還元酵素） である。
1 番目の遺伝子である芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュエツトをコードする遺 伝子は、以下の（a )、 （b )、又は（c )に示すぺプチドをコードするものである。
( a )配列番号 5記載のァミノ酸配列からなるぺプチド、 （ b )配列番号 5記載 のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付加、 欠失もしくは置換 されたアミノ酸配列からなり、 かつ芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュニットとし て機能するペプチド、 （c )配列番号 1記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相 補的な DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNAがコードする 細菌由来のぺプチドであって、 芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュニットとして機 能するぺプチド。
( a ) のペプチドは、サイクロクラスティカス属 A5株から得られた芳香環ジォ キシゲナーゼ大サブュニットとして機能する 460ァミノ酸配列よりなるぺプチド
(PhnAlとも呼ぶ） である。 ここで、 「芳香環ジォキシゲナーゼ大サプユニットと して機能する」 とは、 芳香環ジォキシゲナーゼを構成する他の 3つのサブュニッ トと複合体を形成し、 芳香環ジォキシゲナーゼ活性を発揮できることをいう。
( b ) のペプチドは、 （a ) のペプチドに、芳香環ジォキシゲナーゼ大サブユエ ットとして機能できる程度の変異が導入されたぺプチドである。 このような変異 は、 自然界において生じる変異のほかに、 人為的な変異をも含む。 人為的変異を 生じさせる手段としては、 部位特異的変異誘発法 （Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982)などを挙げることができる力 これに限定されるわけではない。 変異したァミノ酸の数は、 芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュニットとして機能で きる限り、 その個数は制限されないが、 通常は、 30アミノ酸以内であり、 好まし くは 20アミノ酸以内であり、 更に好ましくは 10アミノ酸以内であり、 最も好ま しくは 5アミノ酸以内である。
( c ) のペプチドは、 DNA 同士のハイブリダィゼーシヨンを利用することによ り得られる細菌由来の芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュニットとして機能するぺ プチドである。 （c ) のペプチドにおける 「ストリンジェントな条件」 とは、 特異 的なハイプリダイゼーションのみが起き、 非特異的なハイプリダイゼーションが 起きないような条件をいう。 このような条件は、通常、 「1 X SSC、 0. 1%SDS、 37°C」 程度であり、 好ましくは 「0. 5 X SSC、 0. 1 %SDS 42°C」 程度であり、 更に好まし くは 「0. 2 X SSC、 0. 1%SDS、 65°C」 程度である。 ハイブリダィゼーシヨンにより 得られる DNAは、 配列番号 1記載の塩基配列により表される DNAと通常高い相同 性を有する。高い相同性とは、 60%以上の相同性、好ましくは 75%以上の相同性、 更に好ましくは 90%以上の相同性を指す。
2番目の遺伝子である芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュニットをコードする遺 伝子は、以下の（d )、 （6 )、又は（；0に示すペプチドをコードするものである。
( d )配列番号 6記載のアミノ酸配列からなるペプチド、 （e )配列番号 6記載の アミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付加、 欠失もしくは置換さ れたアミノ酸配列からなり、 かつ芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュニットとして 機能するペプチド、 （f )配列番号 2記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補 的な DNAとストリンジェントな条件下でハイプリダイズする DNAがコードする細 菌由来のペプチドであって、 芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュ-ットとして機能 するペプチド。
( d ) のペプチドは、サイクロクラスティカス属 A5株から得られた芳香環ジォ キシゲナーゼ小サブュニットとして機能する 177ァミノ酸配列よりなるぺプチド (PhnA2とも呼ぶ） である。 ここで、 「芳香環ジォキシゲナーゼ小サブユエットと して機能する」 とは、 芳香環ジォキシゲナーゼを構成する他の 3つのサブュニッ トと複合体を形成し、 芳香環ジォキシゲナーゼ活性を発揮できることをいう。
( e ) のペプチドは、 （d ) のペプチドに、芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュニ ットとして機能できる程度の変異が導入されたペプチドである。 このような変異 は、 自然界において生じる変異のほかに、 人為的な変異をも含む。 変異したアミ ノ酸の数は、 芳香環ジォキシゲナーゼ小サブユニットとして機能できる限り、 そ の個数は制限されないが、 通常は、 10アミノ酸以内であり、 更に好ましくは 5ァ ミノ酸以内である。
( f ) のペプチドは、 DNA 同士のハイブリダィゼーシヨンを利用することによ り得られる細菌由来の芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュニットとして機能するぺ プチドである。 （ί ) のペプチドにおける 「ストリンジェントな条件」 とは、 特異 的なハイプリダイゼーシヨンのみが起き、 非特異的なハイブリダイゼーションが 起きないような条件をいう。 このような条件は、 上記で説明したとおりである。
3番目の遺伝子であるフェレドキシンをコードする遺伝子は、 以下の （g )、 ( h )、 又は （ i ) に示すペプチドをコードするものである。 （g ) 配列番号 7記 載のアミノ酸配列からなるペプチド、 （ h )配列番号 7記載のァミノ酸配列におい て 1もしくは複数個のアミノ酸が付加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列か らなり、かつフェレドキシンとして機能するぺプチド、 （ i )配列番号 3記載の塩 基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNAとス トリンジェントな条件下でハイ ブリダイズする DNAがコードする細菌由来のぺプチドであ-つて、 フェレドキシン として機能するペプチド。
( g ) のペプチドは、 サイクロクラスティカス属 A5株から得られた芳香環ジォ キシゲナーゼのフェレドキシンとして機能する 104アミノ酸配列よりなるぺプチ ド （PhnA3とも呼ぶ） である。
( h ) のペプチドは、 （g ) のペプチドに、 フェレドキシンとして機能できる程 度の変異が導入されたペプチドである。 このような変異は、 自然界において生じ る変異のほかに、 人為的な変異をも含む。 変異したアミノ酸の数は、 フェレドキ シンとして機能できる限り、 その個数は制限されないが、 通常は、 6 アミノ酸以 内であり、 更に好ましくは 3アミノ酸以内である。
( i ) のペプチドは、 DNA 同士のハイブリダィゼーシヨンを利用することによ り得られる細菌由来のフェレドキシンとして機能するぺプチドである。 （ i )のぺ プチドにおける 「ストリンジェントな条件」 とは、 特異的なハイブリダィゼーシ ョンのみが起き、 非特異的なハイブリダィゼーションが起きないような条件をい う。 このような条件は、 上記で説明したとおりである。
4番目の遺伝子であるフェレドキシンレダクタ一ゼをコ一ドする遺伝子は、 以 下の （j )、 （k )、 又は （ 1 ) に示すペプチドをコードするものである。 ) 配 列番号 8記载のァミノ酸配列からなるぺプチド、 （ k )配列番号 8記載のァミノ酸 配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付加、 欠失もしくは置換されたアミ ノ酸配列からなり、 かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するぺプチド、 ( 1 ) 配列番号 4記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 フェレドキシンレダクターゼ活性を有するぺプチド。
( j ) のペプチドは、 サイクロクラスティカス属 A5株から得られた芳香環ジォ キシゲナーゼのフェレドキシンレダクターゼ活性を有する 340アミノ酸配列より なるペプチドで （PhnA4とも呼ぶ） ある。
( k ) のぺプチドは、 ( j ) のぺプチドに、 フェレドキシンレダクターゼ活性を 有する程度の変異 導入されたペプチドである。 このような変異は、 自然界にお いて生じる変異のほかに、 人為的な変異をも含む。 変異したアミノ酸の数は、 フ エレドキシンレダクターゼ活性を有する限り、 その個数は制限されないが、 通常 は、 20アミノ酸以内であり、 好ましくは 14アミノ酸以内であり、 更に好ましく は 7アミノ酸以内であり、 最も好ましくは 4アミノ酸以内である。
( 1 ) のペプチドは、 DNA 同士のハイプリダイゼーシヨンを利用することによ り得られる細菌由来のフェレドキシンレダクターゼ活性を有するぺプチドである。 ( 1 ) のペプチドにおける 「ストリンジェントな条件」 とは、 特異的なハイプリ ダイゼーションのみが起き、 非特異的なハイブリダィゼーションが起きないよう な条件をいう。 このような条件は、 上記で説明したとおりである。 本発明の遺伝子は以下の手順で得ることができる。 先ず、 サイクロクラスティ カス属 (Cvcloclasticus sp. ) A5株のゲノム DNAを調製し、 適当な制限酵素で切 断後、 適当なベクターに連結し、 ゲノム DNAライブラリーを作製する。 ベクター には； Iファージ由来の各種ベクター、 例えば、 ^ gtlOや； Zapl l等、 コスミ ドべ クタ一 PRAFR3等、 又は pUC18 や pBluescript II等のプラスミ ドベクターを用い ることができる。 目的の遺伝子を保持するクローンの選択には、 適当な量のイン ドールをプレートに添加し、 青色のィンディゴを合成するクローンを選択すれば よい。サイクロクラスティカス属 A5株の芳香環ジォキシゲナ一ゼをコ一ドする遺 伝子群はクラスターを形成している。 それゆえ、 選択されたクローン及びそのク ローンの持つ DNAと重複する DNA断片を持つクローンの塩基配列を、 サンガー法 やマキサム一ギルバート法等の一般的な方法により決定することによって、 芳香 環ジォキシゲナ一ゼの大サブユニット、 小サブユニット、 フェレドキシン、 及び フェレドキシンレダクタ一ゼをコ一ドする DNAの全長を単離することができる。
3 . 水酸化された芳香族化合物の製造法
上記の芳香環ジォキシゲナーゼ遺伝子群を大腸菌等の微生物に導入し、 発現さ せた組換え微生物を用いて、 種々の芳香族化合物と混合培養することで、 これら の芳香族化合物に特異的に水酸基を導入することができる。 芳香環ジォキシゲナ ーゼ遺伝子群は 4つの遺伝子から構成されており、 これらすベてを宿主とする微 生物に導入し発現させることが望ましい。 なお、 本体酵素以外のフェレドキシン とフェレドキシンレダクターゼについては、 宿主が元々有しているもので代用可 能な場合があり、 このような場合は必ずしも導入する必要はない。
大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入 ·発現 法は、 多くの実験書に記載されているので （たとえば、 Sambrook, J. , Russel, D. W. , Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001； Hopwood, D. A.， Bibb, M. J. , Chater, K. F.， Bruton, C. J.， Kieser, H. M. , Lydiate, D. J.， Smith, C. P.， Ward, J. M. , Schrempf, H. Genetic manipulation of Streptomyces： A laboratory manual, The John Innes Institute, Norwich, UK, 1985)、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。 本発明の方法により、 多環式芳香族化合物 （アルキル基を有する多環式芳香族 炭化水素を含む） やフユ-ル基を有する芳香族化合物など種々の芳香族化合物に 水酸基を導入することができる。 下表に、 本発明の方法によって製造される水酸 化された芳香族化合物 （変換産物） と基質として用いる芳香族化合物 （基質） を 例示する。 伹し、 本発明の方法によって製造される芳香族化合物は、 これらの化 合物に限定されるわけではない。 表 1
Figure imgf000014_0001
上記の変換産物の中で、 最も産業利用上、 重要な変換産物は （4 -ヒドロキシメ チル -ナフタレン- 1 -ィル) -メタノールである。 本化合物は、 樹脂原料、 染，顔料 原料である 1， 4 -ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の 1， 4-ジメチルナフタレン からバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。 現在、 1, 4 - ナフタレンジカルボン酸（化審法化学物質） は 1, 4 -ジメチルナフタレンから石油 化学工業により作られているが、 環境に優しいバイォプロセス技術への代替技術 の開発が求められている。 4 . 芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法
本発明の微生物は、芳香族化合物で汚染された環境の浄化に利用することができる。 ここでいう 「環境」 には、 土壌、海洋、 大気のほか、 排水なども含まれる。 環境の浄 化は、上記条件で培養した微生物の培養液、 あるいは、微生物を凍結乾燥処理した乾 燥粉末を汚染環境に散布することにより行われる。 この際、乾燥粉末と增殖を補助す る無機塩類を混合 '造粒し、粉末状及び顆粒状等に製剤化したものを汚染環境に散布 しても良い。処理に用いる微生物の量は、土壌及び海水の汚染状況等に応じ、任意に 定めることができるが、 通常、 汚染土壌 lm3あるいは汚染海域 100m2に培養液であれ ば 0. 02L、 乾燥菌体であれば 0. lg程度である。 また、 汚染された大気の浄化は、 上 記培養液あるいは乾燥菌体を固定化担体を設置した気体の浄化装置に添加し、これに 汚染大気を通気することで行う。 さらに、汚染された排水の浄化は、 同じく上記培養 液あるいは乾燥菌体を汚染排水と混合し、好気条件で 7~60日程度培養することで行 ラ。
以下、 実施例により本発明について具体的に説明する。 もっとも、 本発明はこ れにより限定されるものではない。
<実施例 >
[実施例 1 ] サイクロクラスティカス属 A5株の DNAライブラリーの作製 サイクロクラスティカス属 (Cycloclasticus sp. ) A5株を、 0. 1% (w/v)のフ ェナントレンを含む 1リットルの人工海水に植菌し、 25°Cで Ί日間培養した。集 菌した後、 A5株の長鎖 （ゲノム） DNAを調製した （Ausubel et al. (eds)， Current Protocols in Molecular Biology, Chap. 2, 1994)。 50 mgの A5株 DNA に 0. 5ュ エツトの制限酵素 ^3AIを添加して 37°Cで 30分間反応させ、部分切断を行った。 この DNAをァガロースゲル電気泳動により分画し、 15 kbから 30 kbの範囲の DNA 断片を回収した。 一方、 コスミ ドベクター Lorist6 ( Staskawicz et al. , J. Bacteriol. , 169， 5789-5794, 1987)を制限酵素 BamHIで切断したものを用意した。 A5株 DNAの Sau3AI部分切断断片と上記のコスミドベクタ一 DNAを混合し、 Takara ligation kit Ver. 2 により連結し、 GigapackTMIII Gold Packaging Extract (Stratagene Cloning Systems 社） を用いてパッケージングした後、 大腸菌 (Escherichia coli) XL- 1株に感染させた。 形質転換したポピュレーションのう ち 490クローンを維持管理し、これをサイクロクラスティカス属 A5株の DNAライ ブラリーとした。
[実施例 2 ] 芳香環ジォキシゲナーゼをコードするコスミ ドクローンの同定 実施例 1で得られたサイクロクラスティカス属 A5株の DNAライブラリ一のすべ てのコロニーについて、 培地にインドーノレを添加し、 インディゴプノレーの発色を 指標として、 芳香環 （ジ） ォキシゲナーゼ遺伝子群を含む DNA断片を有するクロ ーンのスクリーニングを行った。 その結果、 プラスミ ド pHlaまたは pHlbを含む 2 クローンに関して明らかにポジティブなシグナルが認められた。 これらのプラ スミ ドに含まれる揷入断片の制限酵素マッピングの結果、 これら 2つの揷入断片 は互いにオーバーラップしていることが分かった。 以後、 各種領域のサブクロー ユング及び塩基配列の決定には、 この pHlaを用いた。
[実施例 3 ] 芳香環ジォキシゲナ一ゼをコ一ドする遺伝子群の塩基配列の決定 実施例 2で得られたコスミ ドクローン pHlaを制限酵素処理により切り出し、ク ローニングベクター pBluescript II SK+ (Stratagene ¾：) にサブクローエングし た。このベクターのマ/レチクローニング部位の両サイ ドには T7プロモーター及び T3プロモーターが配備されている。 クローニングされた DNA断片の塩基配列を決 定するため、 それぞれのプロモーターの塩基配列に基づいた以下の DNAプライマ 一を設計し合成した。
T3 プライマー： GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G
T7 プライマー： GAA TTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG なお、 シークェンス反 、は Dye terminator cycle sequencing kit ノ 一キン エノレマ一社） で行い、 377 DNA sequencer (パーキンエノレマ一社） で角军析した。 13 kb領域の塩基配列を明らかにした。 この領域に、 公知の芳香環ジォキシゲナ ゼ の各種サブュニットと、 それぞれ有意な相同性を示す産物をコードし得る遺伝子 が見出された。 そこで、 大 （ο サブユニットと相同の産物をコードし得る遺伝 子を phnAl (配列番号 1 )、 小 ( β ) サブユニットと相同の産物をコードし得る遺 伝子を phnA2 (配列番号 2 )、 フェレドキシンと相同の産物をコードし得る遺伝子 を phnA3 (配列番号 3 )、 そしてフェレドキシンレダクターゼ （フェレドキシン還 元酵素） （フェレドキシン ' NAD (P) Hレダクターゼ） と相同の産物をコードし得る 遺伝子を phnA4 (配列番号 4 ) と名付けた。
サイクロクラスティカス属 A5株の PhnAl (配列番号 5 ) は 460アミノ酸配列よ りなっており、 他の微生物の芳香環ジォキシゲ^ "一ゼ大サブュニットとの相同性 は、 高い順に、 スフインゴモナス ' ァロマティ シボランス ( Sphingomonas aromaticivorans) F199 株、 及びァノレカリゲネス · ファセアリス (Alcaligenes faceal is) AFK2株の芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュニット [BphAlf (access ion no. NP— 049062) および PhnAc (accession no. BAA76323) ] とそれぞれ、 64%及 び 52%の同一性 （identity) を有していた。
サイクロクラスティカス属 A5株の PhnA2 (配列番号 6 ) は 177アミノ酸配列よ りなっており、 他の微生物の芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュニットとの相同性 は、 高い順に、 スフィンゴモナス ·ァロマティシボランス F199株、 及びスフイン ゴピクシス -マクロゴルタビダ (Sphingopyxis macrogoltabida) TFA株の芳香環 ジォキシゲナーゼ小サブユニッ ト [BphA2f (accession no. NP— 049061) および ThnA2 (accession no. AAN26444) ] とそれぞれ、 52%及び 39%の同一性 (identity) を有していた。
サイクロクラスティカス属 A5株の PhnA3 (配列番号 7 ) は 104ァミノ酸配列よ りなっており、 他の微生物のフェレドキシンとの相同性は、 高い順に、 スフイン ゴモナス ·ァロマティシボランス F199株、 及びスフィンゴモナス ·チャングブケ ンシス (Sphingomonas cnungbukensis) のフェレドャシン LBphA3 (accession no. NP_049211) および PhnR (accession no. AAC95320) ] とそれぞれ、 63%及び 63 % の同一性 （identity) を有していた。
サイクロクラスティカス属 A5株の PhnA4 (配列番号 8 ) は 340ァミノ酸配列よ りなっており、 他の微生物のフェレドキシンレダクターゼとの相同性は、 高い順 に、 シユードモナス ' スタツツエリ (Pseudomonas stutzeri) 0X1 株、 及びアル カ リ ゲネス ■ ファセアリ ス AFK2 株のフェレ ドキシンレダクターゼ [TouF (accession no. CAA06659) および PhnAa (accession no. BAA76321) ] とそれぞ れ、 50%及び 47%の同一性 （identity) を有していた。
[実施例 4 ] 芳香環ジォキシゲナーゼ遺伝子を発現するプラスミ ドの作製 プラスミ ド pHla (実施例 2) を £^1と で切断して得た 2. 7 kbの Pstl-Sall DNA断片 [phnAl遺伝子 (配列番号 1 ) 及び phnA2遺伝子 (配列番号 2) 領域を含 む]を、^ IIと で開裂した pBluescript II SK+に連結して、プラスミ ド pISP3 を作製した。 次に、 これに、 フェレドキシン遺伝子 [phnA3 (配列番号 3 ) ] 及び フェレドキシンレダクターゼ遺伝子 [ hnA4 (配列番号 4) ] を以下のようにして 連結した。フェレドキシンレダクターゼ及びフェレドキシン遺伝子を含む 1. 45 kb の DNA断片の両端に制限酵素 rnlと 1認識配列を作るようにデザィンした下 記のプライマー F- Kpと Fr- Xhを用いて、 pHla を鎵型に PCR反応を行った。 増幅 した 1. 5 kb断片を ί^Ιと で切断し、 1. 45 kbの断片を得、 Kpnl及び Xhol で切断して開裂した PISP3と連結させ、プラスミ ド pPhnを作製した。 このプラス ミ ドにおいて各遺伝子は何れも lac プ口モータの支配下にあ り 、 phnAl-phnA2-phnA4-phnA3の順に並んでいる。この pPhnを大腸菌 JM109株（Takara 社） に導入することにより得られた形質転換体 [今後、大腸菌（pPhn)と記述する場 合がある]を以後の実験に用いた。
F-Kp : GGG GTA CCA ATC TTA GCT AAT CTT ATT C
Fr-Xh : TCC CTC GAG TAG GTT AAC AAT GTT TGA AT T JP2003/015102
[実施例 5 ] 組換え大腸菌と基質の共存培養
実施例 4で作製した大腸菌（pPhn)を、 150 μ g/mlのアンピシリン (Ap)を含む LB 培地 （1%トリプトン、 0. 5%酵母エキス、 1% NaCl) で対数期前半まで液体培養し、 最終濃度が約 30%になるようにグリセロールで懸濁し、 - 70〜- 80°Cのディープフ リーザ一に入れることにより、 グリセロール保存株とした。 また、 コントロール として、 大腸菌ベクター pBluescript I I SK+を有する JM109も同様に培養してグ リセ口ール保存株を作製した。
変換反応を開始するにあたって、 まず、 上記のグリセロール保存株から、 大腸 菌形質転換体を白金耳で搔き取り、 150 μ g/ralの Apを含む LB培地 4 mlに懸濁 し、 120 rpm、 30°Cで？〜 8時間培養した （前培養）。 次に、 この前培養を、 150 μ g/mlの Ap、 0. 4% (w/v)のグルコース、 及ぴ 10 β g/mlのチアミン（thiamine)を含 む M9培地 (Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , Maniati s, T.， "Molecular cloning 一 A laboratory manual. " Cold Spring Harbor Laboratory Pres s, 1989， Appendex A. 3参照） 70 mlに入れ、 120 rpm、 30°Cで 16~ 17時間（一晩）培養した（本培養）。 これで、 0D 600 nmが約 1になる。 これを 8， 000 rpm、 5分間、 遠心分離して菌体 のみを集めた後、 最終濃度 1 mMのイソプロピル- 1-チォ- -D-ガラク トビラノシ ド (IPTG) と 7 mgの基質を含む 70 mlの M9培地 （ΙδΟ μ g/mlの Ap、 0. 4% ( /v) のグルコース、 及び 10 μ g/mlのチアミンを含む） に懸濁し、 120 rpm、 30°Cで 2 〜3 日間さらに培養を行った。 なお、 基質として、 多環式芳香族化合物である、 ナフタレン （naphthal ene)、 1—メチノレナフタレン （1— methylnaphthalene)、 2—メ チノレナフ タ レン （ 2- methylnaphthalene ) N 1， 4-ジメ チノレナフ タ レ ン ( 1, 4-dimethylnaphthalene ) , 1, 5- ジ メ チ ル ナ フ タ レ ン ( 1, 5-diraethylnaphthalene ) s 2, 6- ジ メ チ ル ナ フ タ レ ン (2, 6-dimethylnaphthal ene)、 フエナン卜レン (phenanthrene)、 アン卜ラセン (anthracene; N ヒレン (pyrene) ベンゾ [a]ピレン (benzo [a] pyrene) Λ ジべン ゾフラン (dibenzofurane) ジベンゾチォフェン (dibenzothiophene) 及ぴ、 フ ヱ二ル環を含む芳香族化合物であるジフヱニルメタン （diphenyltnethane)、 ビフ ェニノレ (biphenyl)、 2-フエ-ノレべンンキサゾーノレ (2-phenylbenzoxazole) を用 いた。 これらは、 Aldrich Chemical, 和光純薬、 または関東化学から購入した。 これらの基質は、通常 10 mg/mlの濃度になるようにエタノールに溶かしたものを 0. 7 ml加えた。 培養 2〜3日目に 70 ralのメタノールを加え 30分間撹拌すること により脂質を抽出し、 8，000 rptn、 5分間、 遠心分離して上清を集め、 脂質粗抽出 液とした。 たいていの場合、 この状態で、 4°Cで数週間保存可能であつたが、脂質 抽出液はすぐに HPLC分析に供した。
[実施例 6] 変換産物の HPLC分析
実施例 5で調製された脂質粗抽出液 60 1を 1回の injectionに供した。 XTerra MS C18カラム （4. 6 mm X 250 mm、 Waters) を用い、 1 ml/minの速度で HPLCを 行った。 HPLCの本体装置として Waters社のアライアンスシステムを用い、 フォ トダイオードアレイ検出器として Waters 996型を用いた。 展開溶媒の条件は、 以 下の通りである。
A液：水/メタノール (50/50)
B液：メタノール /2_プロパノール (60/40)
0〜5分 （A液）、 5~20分 [A液 → B液：凸型グラジェント (No. 3、 Waters) ] , 20分〜 （B液）
この条件では通常、 31分以内に全化合物が分離された。 210〜350 nraの範囲で 吸収極大値を示した波長 （max plot) でモニターしたピークの面積比をもって変 換率とした。
この分析で変換が確認されたものについて次の精製 '同定のステップに進めた。 なお、 精製 '同定のステップに進める場合は、 培養のスケールを実施例6のスケ ールの 10倍〜 20倍で行った。
この HPLC分析の結果を下の表に示した。 +で示されたものが変換産物が確認さ れたものである。 表 2
Figure imgf000021_0001
+, 1-20%: ++, 21-60%: +++, 61-100%
〔実施例 7〕 変換産物の精製■同定
大腸菌 （pPhn) と、 実施例 6で変換が確認された基質の混合培養液 700 ml〜 1, 400 mlに等量のメタノールを添加し、室温で 2時間撹拌した。これを 7，000rpm, lOmin遠心分離し、 上清を回収した。 上清は減圧下 300 ml〜500 mlまで濃縮し、 等量の酢酸ェチル （EtOAc) で 2度抽出した。 酢酸ェチル層を減圧下濃縮し 生成 物含有エキスを得た。 エキスをシリカゲル [0.25 nm Silica Gel 60, (Merck)]を 用いた薄層クロマトグラフィー（TLC)にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカ ゲルカラム [20 X 250 mm， Silica Gel 60 (Merck) ]を用いたカラムクロマトグラ フィ一に供し、 純品を得た。
なお、 各基質における TLCの展開溶媒は以下の通りである。
phenantnrene, hexane— EtOAc (1： l)； naphthalene, hexane— EtOAc (1:1); dibenzofuran, hexane— EtOAc (5:1); dibenzothiophene, hexane— EtOAc (3:1) ί diphenylmethane, hexane— EtOAc (2:1); biphenyl, hexane— EtOAc (10:1). 1-methylnaphthalene, hexane― EtOAc (4:1); 2-methylnaphthalene, hexane― EtOAc (4:1) ； 1, 4-dimethylnaphthalene, hexane 一 EtOAc (3:1); 1, 5-dimethylnaphthalene, hexane― EtOAc (3:1); 2, 6-dimethylnaphthalene, hexane— EtOAc (2:1).
また、 各基質におけるカラムクロマトグラフィフィ一の展開溶媒は以下の通り である。
phenanthrene, hexane— EtOAc (1:1 naphthalene, hexane— JitOAc (1： 1)； dibenzofuran, hexane— EtOAc (5:1)， dibenzothiophene, hexane— EtOAc (3： 1)； diphenylmethane, hexane— EtOAc (4:1); biphenyl, hexane— EtOAc (15:1). 1-raethylnaphthalene, hexane― EtOAc (4:1); 2-methylnaphthalene, hexane― EtOAc (4:1) ； 1, 4-diraethylnaphthalene, hexane ― EtOAc (3:1); 1, 5-dimethylnaphthalene, hexane― EtOAc (3:1); 2, 6-dimethylnaphthalene, hexane -EtOAc (2:1).
MSスぺク トル、及び麗 Rスぺクトルはそれぞれ、 JEOL JMS- AX505W、及び BRUKER AMX400を用いて測定した。
1. フエナントレンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりフエナントレン（phenanthrene)の変換実験を行った粗抽出 物（84.0mg)を TLCに供したところ、 Rf値 0.2 (化合物 1) の産物が生成している ことが判明した。 本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、 化合物 1 (18.2 mg) の純品を得た。 化合物 1は、 以前に報告された MSと雇 Rの スぺク トルデータとの比較 (Jerina, D. M.， Selander, H. , Yagi, H. , Wells, Μ. C.， Davey, J. F.， Mahadevan, V.， and Gibson, D. T.， J. Am. Chera. Soc.， 98, 5988-5996, 1976) により、 シス - 3， 4 -ジヒ ドロキシ一 3， 4 -ジヒ ドロフエナントレ ン (cis-3, 4-dihydroxy-3, 4-dihydro-phenanthrene) ( IUPAC 名 ： cis-3, 4-dihydrophenanthrene-3, 4-diol) (図 1 ) であると同定した。
2. ナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりナフタレン（naphthalene)の変換実験を行った粗抽出物 (46.2 rag)を TLCに供したところ、 Rf値 0.2 (化合物 2) の産物が生成しているこ とが判明した。 本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、 化 合物 2 (7. 6 rag) の純品を得た。 化合物 2は、 以前に報告された MSと麗 Rのスぺ ク卜ルテータとの比較 (Nojiri, H.， Nam, J, - W. , Kosaka, Μ.， Mori, K.， Takemura, T.， Furihata, K.， Yamane, H.， and Oraori, T.， J. Bacteriol. , 181， 3105 - 3113, 1999 ) に よ り 、 シス _1， 2-ジヒ ドロ キシ- 1， 2-ジヒ ド ロ ナフ タ レ ン tcis-1, 2-dihydroxy-l, 2-dihydro-naphthal ene) ( IUPAC 名 ： cis-l, 2-dihydronaphthalene-l, 2-diol) (図 1 ) であると同定した。
3 . ジベンゾフランの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジベンゾフラン（dibenzofuran)の変換実験を行った粗抽出 物（86. 5 mg)を TLCに供したところ、 Rf値 0. 2 (化合物 3) の産物が生成している ことが判明した。 本産物をシリカゲル力ラムクロマトグラフィーにより精製し、 化合物 3 (21. 0 rag) の純品を得た。 化合物 3は、 以前に報告された MSと丽 Rの スぺク トノレアータとの比車女 (Jia, C.， Piano, D. , Kitamura, T.， and Fujiwara, Υ·.， J. Org. Chem.， 65, 7516 - 7522， 2000) により、 2-ヒ ドロキシジベンゾフラ / (2-hydroxydibenzofuran) (IUPAC ^ ： dibenzo [b, d] furan-2-ol) (図 1 ) であ ると同定した。
4 . ジベンゾチォフェンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジベンゾチォフェン（dibenzothiophene)の変換実験を行つ た粗抽出物（46. 8 mg)を TLCに供したところ、 Rf値 0. 2 (化合物 4) の産物が生成 していることが判明した。 本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一により 精製し、 化合物 4 (7. 2 rag) の純品を得た。 化合物 4は、 以前に報告された MSと 画 Rのスぺク トルデータとの比較 （Mshioka, M. , Castle, R. N. and Lee, M. L.， Synthesis of monoamino ana monohydroxydibenzothiophenes. j . Heterocycl. Chem. , 22, 215-218, 1985 ) によ り、 2-ヒ ドロキシジベンゾチオフヱン (2-hydroxydibenzothiophene) (IUPAC名 ： enzo Lb」benzo [b] thiophen-2- ol) ( |¾ 1 ) であると同定した。 5 . ジフエニルメタンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジフエニルメタン (diphenylmethane)の変換実験を行った 粗抽出物（33. l mg)を TLCに供したところ、 Rf値 0. 5 (化合物 5) の産物が生成し ていることが判明した。 本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一により精 製し、 化合物 5 (6. 2mg) の純品を得た。 化合物 5は、 以前に報告された MSと腿 R のスぺク トノレデータとの比較 (Nakai, Y. and Yamada, F.， Org. Magn. Reson. , 11, 607-611, 1978 ) に よ り 、 2- ヒ ド ロ キ シ ジ フ エ ニ ル メ タ ン (2-hydroxydiphenylmethane) (IUPAC名： 2- benzylphenol) (図 1 ) であると同定 した。
6 . ビフエニルの変換産物の同定
組換え大腸菌によりビフエニル（biphenyl)の変換実験を行った粗抽出物（54. 5 mg)を TLCに供したところ、 Rf値 0. 2 (化合物 6) と Rf値 0. 3 (化合物 7) の 2つ の産物が生成していることが判明した。 両産物をシリ力ゲル力ラムクロマトダラ フィ一により精製し、 化合物 6 (6. 6 mg) 及び化合物 7 (2. 3 mg)の純品を得た。 化 合物 6及ぴ 7は、以前に報告された MSと MRのスぺク トルデータとの比較（Sakurai, H.， Tsukuda, T. , and Hirao, T.， J. Org. Chera.， 67， 2721 - 2722, 2002) によ り、 それぞれ -ビフエ-ノレオール（2- biphenylol) (IUPAC名 ： 2_phenylphenol) 及び -ビフエニノレオーノレ（ίϋ-biphenylol) (IUPAC名： 3- phenylphenol) (図 1 ) で あると同定した。
7 . 1-メチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により 1-メチルナフタレン（1-methylnaphthalene)の変換実験を 行った粗抽出物（28 mg)を TLCに供したところ、 Rf値 0. 2 (化合物 8) の産物が生 成していることが判明した。 本産物をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィーによ り精製し、 化合物 8 (7. 3 mg) の純品を得た。 化合物 8は、 以前に報告された MS と NMRのスペク トルデータとの比較 （Bestetti, G. , Bianchi, D. , Bosetti, A.， Gennaro, P. D.， Galli, E.， Leoni, B.， Pelizzoni, F.， and Sello, G.， Appl. Microbiol. Biotechnol. , 44, 303-313， 1995) により、 シス - 8-メチノレ- 1, 2 -ジヒ ド 口 ナ フ タ レ ン - 1， 2- ジ オ ー ル (cis-8-methyl-l, 2-dihydronaphthalene-l, 2 - diol： IUPAC名） （図 2 ) であると 同定した。
8 . 2-メチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により 1-メチルナフタレン（1- methylnaphthalene)の変換実験を 行った粗抽出物（28 mg)を TLCに供したところ、 Rf値 0. 2 (化合物 9) の産物が生 成していることが判明した。 本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによ り精製し、 化合物 9 ( 1. 8 mg) の純品を得た。 化合物 9は、 以前に報告された MS と蘭 Rのスぺク卜ノレデータとの比較 (Bestetti, G.， Bianchi, D.， Bosetti, A. , Gennaro, P. D. , Gal l i, E. , Leoni, B. , Pe丄 lzzoni, F.， and iello, G. , Appl. Microbiol. Biotechnol. , 44, 303 - 313, 1995) により、 シス -7-メチノレ- 1 , 2-ジヒ ド 口 ナ フ タ レ ン -1, 2- ジ ォ ー ノレ
(cis-7-methyl-l, 2-dihydronaphthalene-l, 2 - diol： IUPAC名） （図 2 ) であると 同定した。
9 . 1, 4-ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により 1， 4-ジメチルナフタレン （1, 4- dimethylnaphthalene) の 変換実験を行った粗抽出物 （176 mg) を TLCに供したところ、 Rf値 0. 2 (化合物 10) , 0. 1 (化合物 11)の産物が生成していることが判明した。 本産物をシリカゲ ルクロマトグラフィーにより精製し、 化合物 10 (4 rag) , 化合物 11 (65 mg) の純 品を得た。
化合物 10 の分子式は、 HR-EIMS [found 190. 0993, ca l cd 190. 0994]より C12H1402 と決定された。 化合物 10の腿 QC及び DQF COSYスぺク トル分析により、 化合物 10は 1， 4- dimethylnaphthaleneの 5, 6位が 1， 2- dihydrodiol となったものであ ると決定された。 これは HMBCスペク トルにおいて、 H-4 ( δ 2. 37)及ぴ Η- 8 ( δ 6. 56) から C-4a ( δ 132. 2)へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。 以上の結果より、 化合物 10は 5， 8 -ジメチル- 1， 2 -ジヒドロナフタレン- 1, 2-ジォ ール （5， 8— dimethyl— 1, 2— dihydro— naphthalene— 1， 2_diol) (図 3) と同定した。 本物質は新規化合物であった。 表 3
5, 8-ジメチル- 1, 2-ジヒドロナフタレン- 1, 2-ジオール （化合物 10) の 400 MHz Ή NMR 100
MHz, ,;,C MRスぺクトルデ一夕 (CDC13中）。
Posi t ion <5„ 8 c
1 132. 0
2 - 6. 97 (d 8. 0) 130. 8
3 6. 91 (d 8. 0) 130. 9
4 134. 9
4a 132. 2
5 4. 71 (dd 1. 5, 5. 4) 66. 8
6 4. 45 (m) 70. 4
7 5. 76 (m) 130. 9
8 6. 56 (dd 2. 7, 9. 8) 127. 3
8a 130. 9
Γ 2. 23 (s) 18. 3
r 2. 33 (s) 18. 9
化合物 11 の分子式は、 HR-EIMS [found 1 88. 0838, ca l cd 188. 0838]より C12H1202 と決定された。 化合物 11の NMRではナフタレン環部分のシグナルには大きな 変化がなく、 メチル基の信号が消失し、 新たに酸素と結合したメチレン基 （δ 4. 94)及びこれとカップリングした水酸基（δ 5. 28)の信号が観測された。 以上の 結果より、 化合物 1 1 は (4-ヒドロキシメチル-ナフタレン- 1 -ィル） -メタノ一ノレ (4-hydroxymethyl-naphthalene-l-yl) -methanol) (図 3) と同定した。 化合物 11 は C A Sに記載されている既知化合物であつたが、化合物 11を芳香環ジォキシゲ ナーゼ等の酵素 （遺伝子） を用いた生変換反応により製造できるという報告はこ れが最初である。従って、化合物 11の製造法としても本発明による方法は有効で ある。 なお、 この（4-ヒ ドロキシメチル-ナフタレン- 1 -ィル） -メタノールは、樹脂 原料、染 '顔料原料である 1， 4-ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の 1，4 -ジメ チルナフタレンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体とな
表 4
(4-ヒドロキシメチル-ナフタレン-卜ィル) -メタノール（化合物 11>の 400 MHz Ή NMR 100
MHz, l3C NMRスペクトルデータ（CDC13中）。
Figure imgf000027_0001
10. 1， 5-ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により 1，5—ジメチノレナフタレン （1， 5- dimethylnaphthalene) の 変換実験を行った粗抽出物 （205 mg) を TLCに供したところ、 Rf値 0. 3 (化合物 12) の産物が生成していることが判明した。 本産物をシリカゲルクロマトグラフ ィ一により精製し、化合物 12 (40 mg)の純品を得た。化合物 12の分子式は、 HR- EIMS [found 172. 0888， cald. 172. 0889]より C12H120と決定された。 化合物 12の ¾ NMR ではナフタレン環部分のシグナルには大きな変化はなく、 メチル基の 1本分の信 号が消失し、 新たに酸素と結合したメチレン基 ( δ 5. 04)が観測された。 以上の 結果よ り 、 化合物 12 は（5-メチル -ナフタ レン- 1 -ィル） -メ タノール (5 - methyl- naphthalene- 1-yl) - methanol) (図 3) と同定した。 化合物 ]^は C A Sに記載されている既知化合物であつたが、化合物 12を芳香環ジォキシゲナーゼ 等の酵素 （遺伝子） を用いた生変換反応により製造できるという報告はこれが最 初である。 従って、 化合物 12の製造法としても本発明による方法は有効である。 表 5
(5-メチル -ナフ夕レン- 1-ィル) -メタノ一ル (化合物 12)の 400 MHz 'H NMR lOO MHz, 13C NMR スぺクトルデータ (CDC13中）。
Figure imgf000028_0001
11. 2, 6-ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により 2， 6-ジメチノレナフタレン （2， 6_dimethylnaphthalene) の変 換実験を行った粗抽出物 （110 mg) を TLCに供したところ、 Rf値 0. 2 (化合物 13) の産物が生成していることが判明した。 本産物をシリカゲルクロマトグラフィー により精製し、 化合物 13 (30. 6 mg) の純品を得た。
化合物 13 は以前に報告された MS と NMR のスぺク トルデータとの比較 LBestetti, G.， Bianchi, D.， Bosetti, A.， Di Gennaro, P.， Galli, E. , Leoni, B.， Pelizzoni, F. , Sello, G.， Bioconversion of substituted naphthalenes to the corresponding 1， 2-dihydro-l, 2-dihydroxy derivatives. Determination of the region - and stereochemistry of the oxidation reactions, Applied Microbiology and Biotechnology, 44, 306 - 13, 1995]により、 3, 7—ジメチル— 1, 2— ジ ヒ ド ロ ナ フ タ レ ン - 1，2_ ジ ォ ー ノレ (3， 7- dimethyl_l, 2- dihydro - naphthalene- 1, 2- diol) (図 3) であると同定した。 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、 本発明の精神と範 囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にと つて明らかである。
本出願は、 2002年 11月 29日出願の日本特許出願 （特願 2002— 347240)、 およ ぴ、 2003年 9月 17出願の日本特許出願 （特願 2003— 324117) に基づくものであ り、 その内容はここに参照として取り込まれる。 ぐ産業上の利用可能性 >
本発明は、 サイクロクラスティカス属 (Cycloclasticus sp. ) 細菌に由来する 芳香環ジォキシゲナ一ゼの大 （α ) サブユニット遺伝子、 小 （ ） サブュュット 遺伝子、 フェレドキシン遺伝子、 及び、 フェレドキシンレダクターゼ遺伝子を提 供する。 本発明による遺伝子群から造られるタンパク質は、 石油やコールタール 由来の環境汚染物質である芳香族化合物に水酸基を導入することができる。 すな わち、 本発明による遺伝子群を発現した微生物により、 これらの石油系芳香族化 合物を特異的に水酸化する方法を提供する。 水酸化された芳香族化合物は、 微生 物等により容易に分解されるようになるので、 本発明は、 汚染土壌等の環境浄化 等に有用である。 また、 この方法により、 産業上有用な水酸化された芳香族化合 物を作ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の （a )、 （b )、 又は （c ) に示すペプチドをコードする遺伝子： ( a ) 配列番号 5記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
( b ) 配列番号 5記载のァミノ酸配列において 1もしくは複数個のァミノ酸が付 加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ芳香環ジォキシゲナ一 ゼ大サブュニットとして機能するぺプチド、
( c ) 配列番号 1記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリ ンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 芳香環ジォキシゲナーゼ大サブュ-ットとして機能するペプチド。
2 . 以下の （d )、 （e )、 又は （f ) に示すペプチドをコードする遺伝子： ( d ) 配列番号 6記载のァミノ酸配列からなるぺプチド、
( e ) 配列番号 6記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数個のァミノ酸が付 加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつ芳香環ジォキシゲナ一 ゼ小サブュニットとして機能するぺプチド、
( f ) 配列番号 2記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 芳香環ジォキシゲナーゼ小サブュ-ットとして機能するぺプチド。
3 . 以下の （g )、 （h )、 又は （ i ) に示すペプチドをコードする遺伝子： ( g ) 配列番号 7記載のァミノ酸配列からなるぺプチド、
( ) 配列番号 7記載のァミノ酸配列において 1もしくは複数個のァミノ酸が付 加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつフェレドキシンとして 機能するペプチド、
( i ) 配列番号 3記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNAとストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 フェレドキシンとして機能するペプチド。
4 . 以下の （ j ) . ( k )、 又は （1 ) に示すペプチドをコードする遺伝子： ( j ) 配列番号 8記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
( k ) 配列番号 8記載のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が付 加、 欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、 かつフェレドキシンレダク ターゼ活性を有するぺプチド、
( 1 ) 配列番号 4記載の塩基配列からなる DNA又はそれと相補的な DNA とストリ ンジェントな条件下でハイプリダイズする DNAがコードする細菌由来のぺプチド であって、 フェレドキシンレダクターゼ活性を有するぺプチド。
5 . 請求項 1乃至 4に記載の遺伝子のすべて又は一部を導入して得られる 微生物であって、 芳香族化合物に水酸基を導入できる微生物。
6 . 微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項 5に記載の微生物。 .
7 . 請求項 5又は 6に記載の微生物を、 芳香族化合物を含む培地で培養し て培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を得ることを特徴とする、 水酸 化された芳香族化合物の製造法。
8 . 請求項 5又は 6に記載の微生物で、芳香族化合物で汚染された環境を浄 化することを特徴とする環境の浄化方法。
9 . 芳香族化合物を含む培地が、 1， 4-ジメチルナフタレン又は 1， 5-ジメチル ナフタレンを含む培地であり、水酸化された芳香族化合物が、 メチル基が水酸化さ れた芳香族化合物であることを特徴とする、 請求項 7記載の水酸化された芳香族化 合物の製造法。
1 0 . メチル基が水酸化された芳香族化合物が、 （4 -ヒドロキシメチル-ナフ タレン- 1 -ィル） -メタノール、 又は (5 -メチルナフタレン十ィル）ーメタノールで あることを特徴とする、 請求項 9記載の水酸化された芳香族化合物の製造法。
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