WO2014192068A1 - 抗アカントアメーバ用組成物及び該抗アカントアメーバ用組成物を含有する眼科用剤 - Google Patents

抗アカントアメーバ用組成物及び該抗アカントアメーバ用組成物を含有する眼科用剤 Download PDF

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正樹 今安
美弥 野町
信一 冨田
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株式会社メニコン
学校法人玉川学園
森永乳業株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-acanthamoeba composition having a high bactericidal action against both vegetative cells and cyst cells of acanthamoeba and an ophthalmic agent containing the anti-acanthamoeba composition.
  • MPS Multi Purpose Solution
  • composition having an anti-acanthamoeba effect for example, an anti-acanthamoeba disinfectant / preservative for contact lenses (Patent Document 1) containing ⁇ -polylysine as an active ingredient, a proteolytic enzyme, an anionic surfactant, Contact lens solution composition consisting of a combination of reducing polyhydric alcohol, boric acid buffer and water-soluble polymer compound (Patent Document 2) and Acanthamoeba inactivating agent containing 4-hexylresorcinol as an active ingredient (patent Document 3) is known.
  • lactoferrin or lactoferricin has an excellent anti-amoeba action (acmebicidal action and cyst formation inhibitory action) against acanthamoeba, and contains lactoferrin or lactoferricin as an active ingredient
  • a composition for amoeba was proposed (Patent Document 4).
  • Acanthamoeba has two forms, a vegetative type (vegetative cell) and a cyst type (cyst cell).
  • Acanthamoeba vegetative cells feed on bacteria in the environment and grow in two divisions, are highly sensitive to drugs, and are relatively easy to disinfect.
  • the environment becomes difficult to live such as environmental degradation and depletion of food sources, only a very small molecule such as water, oxygen, carbon dioxide gas hardly penetrates, and the inner wall is a robust double wall with high drug resistance. It changes into cyst cells that have formed. It is very difficult to disinfect this cyst stage of Acanthamoeba, and there is a demand for a drug having a high anti-amoeba action on cyst cells of Acanthamoeba.
  • the present invention provides an anti-acanthamoeba composition having a high bactericidal action on both vegetative cells and cyst cells of acanthamoeba by the action of a cationic polymer fungicide and lactoferricin, and the antiacantant It aims at providing the technique regarding the ophthalmic agent containing the composition for amoeba.
  • the present invention has been made on the basis of such findings, and provides an anti-acanthamoeba composition characterized by containing a cationic polymer fungicide and lactoferricin as active ingredients. .
  • the present invention also provides an ophthalmic agent containing the anti-acanthamoeba composition.
  • the cationic polymer fungicide and lactoferricin have a high bactericidal action on Acanthamoeba vegetative cells and cyst cells, various infections caused by Acanthamoeba contamination such as It can be used as an ophthalmic agent for preventing amoeba keratitis.
  • the anti-acanthamoeba composition of the present invention contains a cationic polymer fungicide and lactoferricin as active ingredients.
  • the cationic polymer fungicide is not particularly limited as long as it does not impair the object and effect of the present invention, and examples thereof include polyhexanide hydrochloride (PHMB), ⁇ -polylysine, and polyquaterniums.
  • PHMB polyhexanide hydrochloride
  • ⁇ -polylysine polyquaterniums.
  • the lactoferricin is a peptide purified from an enzymatic degradation product obtained by enzymatic degradation of bovine-derived lactoferrin with pepsin, the amino acid sequence of which is Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg- Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val-Arg-Arg-Ala-Phe (corresponds to the 17th to 41st amino acid sequences from the N-terminal amino acid of bovine lactoferrin Peptide consisting of 25 amino acid residues) or Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cys-Val -Arg-Arg-Ala-Phe-Ala ( Sheet consisting of amino acid
  • the concentration of the cationic polymer fungicide is preferably at least 0.1 ppm from the viewpoint of the bactericidal effect of acanthamoeba.
  • the concentration is higher than necessary, there is no difference in the bactericidal action of Acanthamoeba, so the upper limit is 1000 ppm.
  • the concentration of lactoferricin is preferably at least 1.5 ppm from the viewpoint of the bactericidal effect of Acanthamoeba. However, even if the concentration is higher than necessary, there is no difference in the bactericidal action of Acanthamoeba, so the upper limit is 100 ppm.
  • the anti-acanthamoeba composition of this embodiment can be prepared by adding a cationic polymer fungicide and lactoferricin to a solvent not containing sodium salt such as sterilized water or glycerol solution and mixing them. Moreover, when preparing using the solvent containing a sodium salt, since the bactericidal action of an acanthamoeba falls by a sodium salt, it prepares so that the density
  • the anti-acanthamoeba composition of the present embodiment is a pharmacologically acceptable carrier, excipient, or diluent known per se as long as the object and effect of the present invention are not impaired. And can be administered parenterally, for example, in the form of an ophthalmic agent or the like according to a known method.
  • the ophthalmic preparations include not only pharmaceutical preparations but also non-pharmaceutical preparations such as contact lens preparations.
  • non-pharmaceutical preparations such as contact lens preparations.
  • the anti-acanthamoeba composition of this embodiment is used as an ophthalmic agent, a buffer, an isotonic agent, an antiseptic, and a pH adjuster that are usually blended in the ophthalmic agent unless the purpose and effect of the present invention are impaired.
  • Additives such as agents, thickeners, chelating agents, cleaning agents, and bases may be added as appropriate.
  • buffers examples include buffers that do not contain sodium salts such as boric acid, trishydroxymethylaminomethane, and tartaric acid. These buffering agents can be used alone or in combination. Moreover, the density
  • the isotonic agent examples include sugars such as sorbitol, glucose and mannitol, polyhydric alcohols such as glycerin, polyethylene glycol and propylene glycol. These isotonic agents can be used alone or in combination. Further, the concentration of the isotonic agent can be appropriately set according to the purpose of use and the like.
  • preservatives examples include benzalkonium chloride, benzethonium chloride, paraoxybenzoates such as methyl paraoxybenzoate and ethyl paraoxybenzoate, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, sorbic acid, thimerosal, chlorobutanol and the like. it can. These preservatives can be used alone or in combination. Further, the concentration of the preservative can be appropriately set according to the purpose of use and the like.
  • pH adjuster examples include hydrochloric acid, acetic acid, phosphoric acid and the like. These pH adjusters can be used alone or in combination. Further, the concentration of the pH adjusting agent can be appropriately set according to the purpose of use and the like.
  • the thickener examples include hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose and the like. These thickeners can be used alone or in combination. Moreover, the density
  • chelating agents examples include ethylenediaminetetraacetic acid, glycol etherdiaminetetraacetic acid, tetraazacyclododecane-tetraacetic acid, ethylenediamine disuccinic acid, and the like. These chelating agents can be used alone or in combination. Further, the concentration of the chelating agent can be appropriately set according to the purpose of use.
  • cleaning agent examples include anionic surfactants such as stearyldimethylbenzylammonium chloride, amphoteric surfactants such as lauryldimethylcarboxymethylbetaine, and nonionic surfactants such as polysorbate 80. These cleaning agents can be used alone or in combination. The concentration of the cleaning agent can be appropriately set according to the purpose of use.
  • Examples of the base include petrolatum, paraffin, polyethylene glycol and the like. These bases can be used alone or in combination. The concentration of the base can be appropriately set according to the purpose of use.
  • the antiacanthamoeba composition of the present embodiment is used as an ophthalmic agent, it may be used in addition to other disease treatment agents such as antibacterial agents and antifungal agents, as long as the purpose and effect of the present invention are not impaired. You may add 2 or more types suitably.
  • the ophthalmic preparation of this embodiment When used as an eye drop, it can be administered once to several times per day, and can be administered in one to several drops per time.
  • the target contact lens is added to a multipurpose agent solution for contact lenses containing a cationic polymer fungicide and lactoferricin. Disinfection is performed by immersing for more than minutes, preferably for more than 1 hour. After sufficiently disinfecting, it may be put on the eye as it is, or it may be put on the eye after rinsing the contact lens with the contact lens multipurpose agent, physiological saline or rinsing solution. If there is protein or fat stains, the lens may be pre-washed with the multipurpose agent for contact lenses before the start of disinfection.
  • the “multipurpose agent for contact lenses” refers to a disinfectant that can clean, rinse, store, and disinfect contact lenses with a single solution.
  • This invention is applicable with respect to a hydrous soft contact lens, a non-hydrous soft contact lens, or a hard contact lens.
  • Sample Preparation Samples were prepared using 2.5% polyhexanide hydrochloride (PHMB), ⁇ -polylysine (PL), lactoferricin (LFcin) and / or lactoferrin (LF) so as to have the concentrations shown in Table 1. It was prepared by dissolving in glycerol (Glycerol) solution or phosphate buffered saline (PBS solution) containing sodium salt.
  • PHMB polyhexanide hydrochloride
  • PL ⁇ -polylysine
  • LFcin lactoferricin
  • LF lactoferrin
  • the stained amoeba was collected by centrifugation, the amoeba was suspended in 1 mL of PBS, and the fluorescence intensity was measured using a flow cytometer.
  • the fluorescence intensity was measured using an argon laser at an excitation wavelength of 488 nm and a fluorescence wavelength of 610 nm.
  • fluorescence intensity Log histogram of the left peak (fluorescence intensity 10 less than 1) to determine viable cells, the right peak (fluorescence intensity 10 1 or higher) and dead cells were calculated rate of dead cells amoeba (percent).
  • the dead cell rate (%) of the vegetative cells is 73.7 ⁇ 22.9% when treated for 1 hour, 4 In the time treatment, 85.5 ⁇ 19.3%, and in the case of 1 ppm of polyhexanide hydrochloride (PHMB) alone (sample 1), 19.2 ⁇ 6.8% (1 hour treatment) and 29.9 ⁇ 8.3% ( 4 hours treatment) or lactoferricin (LFcin) 30 ppm alone (sample 3) 72.3 ⁇ 23.3% (1 hour treatment) and 74.4 ⁇ 28.0% (4 hours treatment) Each of them showed a high value.
  • lactoferricin enhances the bactericidal effect on vegetative cells of Acanthamoeba in a concentration-dependent manner, and has a higher bactericidal effect compared with the case of them alone when combined with polyhexanide hydrochloride (PHMB).
  • the synergistic effect by the combination of polyhexanide hydrochloride (PHMB) and lactoferricin (LFcin) was obtained.
  • lactoferricin (LFcin) was allowed to act on vegetative cells of Acanthamoeba castellaniii ATCC50370, the dead cell rate (%) was almost the same value when treatment time was 1 hour and when treatment time was 4 hours.
  • lactoferricin LFcin
  • cyst cells as in the case of vegetative cells, by combining polyhexanide hydrochloride (PHMB) and lactoferricin (LFcin), a high bactericidal effect can be obtained as compared with the case of them alone.
  • the synergistic effect by the combination of polyhexanide (PHMB) and lactoferricin (LFcin) was recognized.
  • the Log reduction value increased with time, and the bactericidal effect of cyst cells was time-dependent.
  • lactoferrin did not show a bactericidal effect on the cyst cells, and no bactericidal effect was observed when combined with polyhexanide hydrochloride (PHMB). It was speculated that this was because the molecular weight of lactoferrin was larger than the molecular weight of lactoferricin.
  • ⁇ -polylysine (PL) and lactoferricin (LFcin) a high bactericidal effect is obtained as compared with the case of using them alone, and polyhexanide hydrochloride (PHMB) and lactoferricin (LFcin) A synergistic effect was observed with the combination. It was also found that ⁇ -polylysine (PL) enhances the bactericidal effect of Acanthamoeba on vegetative cells in a concentration-dependent manner.
  • Toxicity test Samples 1 to 5 prepared in the above were subjected to their cytotoxicity test (colony formation inhibition test) according to a conventional method. That is, a 24-well plate seeded with about 50 cells of V79 cells (JCRB0630) per well was held for 24 hours, and then each sample was mixed with MO5 medium at a rate of 10% by volume to each well. Cultivation was performed at 37 ° C. for 6 days under 5% CO 2 in a culture apparatus, and the number of these colonies was measured. At this time, a 2.5% glycerol (Glycerol) solution was used as a control, and AO sep Clear Care (manufactured by CIBA VISION; Lot No. 10175), which is a contact lens care agent containing hydrogen peroxide, was used as a comparative example. . The colony formation rate (%) was calculated with the number of colonies in the control as 100%. The results are shown in Table 7.
  • colony formation rate As shown in Table 7, in AO sep Clear Care (produced by CIBA VISION; Lot No. 10175) containing hydrogen peroxide, colony formation rate (%) was 0%, and strong cytotoxicity was observed. In all of 1-5, the colony formation rate (%) shows a high colony formation rate (%) of 87-110%, polyhexanide hydrochloride (PHMB), lactoferricin (LFcin), and combinations thereof No cytotoxicity was observed for.
  • PHMB polyhexanide hydrochloride
  • LFcin lactoferricin

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Abstract

【課題】アカントアメーバの栄養細胞は、薬剤に対する感受性も高く、消毒は比較的容易であるが、シスト期のアカントアメーバを消毒することは非常に困難であることから、アカントアメーバの栄養細胞及びシスト細胞のいずれに対しても高い殺菌作用を有する抗アカントアメーバ用組成物及び該抗アカントアメーバ用組成物を含有する眼科用剤に関する技術を提供することを目的とする。 【解決手段】カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとを有効成分として含有する抗アカントアメーバ用組成物及び該抗アカントアメーバ用組成物を含有する眼科用剤により解決する。

Description

抗アカントアメーバ用組成物及び該抗アカントアメーバ用組成物を含有する眼科用剤
　本発明は、アカントアメーバの栄養細胞及びシスト細胞のいずれに対しても高い殺菌作用を有する抗アカントアメーバ用組成物及び該抗アカントアメーバ用組成物を含有する眼科用剤に関する。
　アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）による角膜炎は、近年、症例数が増えてきたことで注目されている眼疾病であり、重篤な場合は失明するおそれもある。この疾病はソフトコンタクトレンズ装着者に多く、手入れの簡便化が原因の１つだと考えられている。これまで、ソフトコンタクトレンズの手入れは煮沸が主流であったが、この１０年ほどでコンタクトレンズ用多目的剤（Ｍｕｌｔｉ　Ｐｕｒｐｏｓｅ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ；ＭＰＳ）による手入れ方法が普及した。ＭＰＳは１液でレンズの洗浄、すすぎ、消毒、保存が可能な溶液であるが、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）細胞には無効である。
　従来、抗アカントアメーバ効果を有する組成物としては、例えば、ε－ポリリジンを有効成分とするコンタクトレンズ用抗アカントアメーバ消毒・保存剤（特許文献１）、蛋白質分解酵素、陰イオン界面活性剤、非還元性多価アルコール、ホウ酸系緩衝剤、水溶性高分子化合物の組み合わせからなるコンタクトレンズ用液剤組成物（特許文献２）及び４－ヘキシルレゾルシノールを有効成分とするアカントアメーバ不活性化剤（特許文献３）などが知られている。
　また、本発明者は、ラクトフェリン又はラクトフェリシンが優れたアカントアメーバに対する抗アメーバ作用（殺アメーバ作用及びシスト形成阻害作用）を有することを見出し、ラクトフェリン又はラクトフェリシンを有効成分として含有する抗アカントアメーバ用組成物を提案した（特許文献４）。
特開２００２－１４３２７７号公報 特開２００３－０５７６１０号公報 特開平８－２２５４４４号公報 特開２０１１－２４６４５８号公報
　アカントアメーバには栄養型（栄養細胞）とシスト型（シスト細胞）の二形態が存在する。アカントアメーバの栄養細胞は、環境に存在する細菌を常食し二分裂で増殖する特徴を持ち、薬剤に対する感受性も高く、消毒は比較的容易である。しかし、環境悪化及び食料源の枯渇などの自分が住みにくい環境となると、水、酸素、炭酸ガスなどごく低分子の物質以外はほとんど透過侵入せず、内壁が薬物耐性に富む頑強な二重壁を形成したシスト細胞に変化する。このシスト期のアカントアメーバを消毒することは非常に困難であり、アカントアメーバのシスト細胞に対しても高い抗アメーバ作用を有する薬剤が求められている。
　そこで、本発明は、カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとの作用により、アカントアメーバの栄養細胞及びシスト細胞のいずれに対しても高い殺菌作用を有する抗アカントアメーバ用組成物及び該抗アカントアメーバ用組成物を含有する眼科用剤に関する技術を提供することを目的とする。
　本発明者らが鋭意検討した結果、カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとを作用させることにより、アカントアメーバの栄養細胞及びシスト細胞のいずれに対しても高い殺菌作用を有するとの知見を得た。
　本発明は、かかる知見に基づいてなされたものであり、カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとを有効成分として含有することを特徴とする、抗アカントアメーバ用組成物を提供するものである。
　また、本発明は、前記抗アカントアメーバ用組成物を含有する、眼科用剤を提供するものである。
　本発明によれば、カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとがアカントアメーバの栄養細胞及びシスト細胞に対して高い殺菌作用を有するため、アカントアメーバの汚染によって引き起こされる種々の感染、例えば、アカントアメーバ角膜炎などを防止する眼科用剤として利用することできる。
　本発明の抗アカントアメーバ用組成物は、カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとを有効成分として含有する。
　前記カチオン性高分子殺菌剤は、本発明の目的及び効果を損なわない限り、特に制限されないが、例えば、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）、ε－ポリリジン、ポリクオタニウム類を挙げることができる。
　前記ラクトフェリシンは、ウシ由来のラクトフェリンをペプシンによって酵素分解した酵素分解物から精製されるペプチドであって、そのアミノ酸配列がＰｈｅ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｐｈｅ（ウシ由来ラクトフェリンのＮ末端アミノ酸から１７～４１番目のアミノ酸配列に相当するアミノ酸２５残基からなるペプチド）又はＰｈｅ－Ｌｙｓ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｔｒｐ－Ｇｌｎ－Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｍｅｔ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｃｙｓ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｐｈｅ－Ａｌａ（ウシ由来ラクトフェリンのＮ末端アミノ酸から１７～４２番目のアミノ酸配列に相当するアミノ酸２６残基からなるペプチド）のものをいう。なお、アミノ酸はすべてＬ型である。
　本実施形態における抗アカントアメーバ用組成物において、カチオン性高分子殺菌剤の濃度は、アカントアメーバの殺菌効果の観点から、少なくとも０．１ｐｐｍであることが好ましい。但し、必要以上に高濃度にしてもアカントアメーバの殺菌作用に差異はないため、上限は１０００ｐｐｍとする。
　また、ラクトフェリシンの濃度は、アカントアメーバの殺菌効果の観点から、少なくとも１．５ｐｐｍであることが好ましい。但し、必要以上に高濃度にしてもアカントアメーバの殺菌作用に差異はないため、上限は１００ｐｐｍとする。
　本実施形態の抗アカントアメーバ用組成物は、カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとを滅菌水やグリセロール溶液等のナトリウム塩を含まない溶媒に添加し混合することで調製することができる。また、ナトリウム塩を含有する溶媒を用いて調製する場合は、ナトリウム塩によってアカントアメーバの殺菌作用が低下するため、ナトリウム塩の濃度を０．１％未満となるように調製する。
　本実施形態の抗アカントアメーバ用組成物は、本発明の目的及び効果を損なわない限り、該抗アカントアメーバ用組成物をそれ自体公知の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、公知の方法に従って、例えば、眼科用剤などの形態で非経口的に投与することができる。
　前記眼科用剤は、医薬用の製剤に限らず、コンタクトレンズ用剤などの非医薬用の製剤も含み、例えば、点眼薬、洗眼薬、眼軟膏、コンタクトレンズ用剤（洗浄液、保存液、すすぎ液、消毒液、ＭＰＳ等）等を挙げることができる。
　本実施形態の抗アカントアメーバ用組成物を眼科用剤として用いる場合、本発明の目的及び効果を損なわない限り、眼科用剤に通常配合される緩衝剤、等張化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、増粘剤、キレート剤、洗浄剤、基剤などの添加剤を適宜添加してもよい。
　緩衝剤としては、例えば、ホウ酸、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、酒石酸などのナトリウム塩を含まない緩衝剤を挙げることができる。これらの緩衝剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、緩衝材の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　等張化剤としては、例えば、ソルビトール、グルコース、マンニトールなどの糖類、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどの多価アルコール類などを挙げることができる。これらの等張化剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、等張化剤の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　防腐剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、パラオキシ安息香酸メチル，パラオキシ安息香酸エチルなどのパラオキシ安息香酸エステル類、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ソルビン酸、チメロサール、クロロブタノールなどを挙げることができる。これらの防腐剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、防腐剤の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、酢酸、リン酸などを挙げることができる。これらのｐＨ調整剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、ｐＨ調製剤の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　増粘剤としては、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどを挙げることができる。これらの増粘剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、増粘剤の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、テトラアザシクロドデカン－テトラ酢酸、エチレンジアミンジコハク酸などを挙げることができる。これらのキレート剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、キレート剤の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　洗浄剤としては、例えば、ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロリドなどの陰イオン界面活性剤、ラウリルジメチルカルボキシメチルベタインなどの両性界面活性剤、ポリソルベート８０などの非イオン界面活性剤などが挙げられる。これらの洗浄剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、洗浄剤の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　基剤としては、例えば、ワセリン、パラフィン、ポリエチレングリコールなどを挙げることができる。これらの基剤は、単独で又は併用して用いることができる。また、基剤の濃度は、使用目的等に応じて、適宜設定することができる。
　本実施形態の抗アカントアメーバ用組成物を眼科用剤として用いる場合、本発明の目的及び効果を損なわない限り、さらに、他の疾患治療剤、例えば、抗菌剤、抗真菌剤等の１種又は２種以上を適宜加えてもよい。
　本実施形態の眼科用剤を点眼剤として使用する場合は、１日あたり１回～数回に分けて、１回あたり１滴～数滴を投与することができる。
　本実施形態の眼科用剤をコンタクトレンズ用多目的剤として使用する場合は、例えば、対象となるコンタクトレンズを、カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとを含有するコンタクトレンズ用多目的剤溶液に１０分以上、好ましくは１時間以上浸漬することで消毒を行う。充分に消毒を行った後に、そのまま眼に装着するか、前記コンタクトレンズ用多目的剤、生理食塩水又はすすぎ液にてコンタクトレンズをすすいだ後に眼に装着してもよい。蛋白質や脂肪汚れがある場合には、消毒開始前に前記コンタクトレンズ用多目的剤にて、レンズを予め擦り洗いしてもよい。なお、本実施形態において「コンタクトレンズ用多目的剤」とは、コンタクトレンズの洗浄、すすぎ、保存、消毒を１液で行うことのできる消毒液をいう。
　なお、本発明において対象となるコンタクトレンズとしては特に制限はなく、含水性ソフトコンタクトレンズ、非含水性ソフトコンタクトレンズ又はハードコンタクトレンズなどに対して本発明を適用することができる。
１．試料の調製
　試料は、表１に示した濃度となるように、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）、ε－ポリリジン（ＰＬ）、ラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）及び／又はラクトフェリン（ＬＦ）を用い、２．５％グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）溶液又はナトリウム塩を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）に溶解させて調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．細胞懸濁液の調製
（１）栄養細胞
　アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞懸濁液は、常法に従ってアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）を培養し、得られたアカントアメーバの栄養細胞を１／４リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液に約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度となるように懸濁することで調製した。
（２）シスト細胞
　アカントアメーバ栄養細胞をシスト化培地で２週間培養して調製し、得られたアカントアメーバのシスト細胞を１／４リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液に約１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度となるように懸濁することでシスト細胞懸濁液を調製した。
３．細胞の処理方法
（１）栄養細胞
　上記２．（１）で調製した栄養細胞懸濁液１ｍＬを遠心分離し、回収した栄養細胞（１×１０５ｃｅｌｌｓ）に上記１．（１）で調製した各種試料１ｍＬを添加し、３０℃で１～４時間保持することで該栄養細胞を各種試料で処理した。また、この処理液を遠心分離し、回収した処理アメーバに０．００４％コンゴレッド（ＰＢＳ溶液）１ｍＬを添加し、３０℃で１５分間保持することでアメーバの染色を行った。この染色したアメーバを遠心分離によって回収し、該アメーバをＰＢＳ１ｍＬに懸濁した後、フローサイトメーターを用いて蛍光強度を測定した。なお、蛍光強度の測定は、アルゴンレーザーを使用し、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍで行った。この時、蛍光強度Ｌｏｇヒストグラムの左側ピーク（蛍光強度１０１未満）を生細胞、右側ピーク（蛍光強度１０１以上）を死細胞と判断し、アメーバの死細胞率（％）を算出した。
（２）シスト細胞
　各種試料５ｍＬに上記２．（２）で調製したシスト細胞懸濁液５０μＬを添加し、２３℃で１～４時間保持することで該シスト細胞を処理した。また、この処理液に生残するアメーバ数をＳｐｅａｒｍａｎｎ－Ｋａｒｂｅｒ法によって測定した。また、試料の代わりに１／４リンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液を用いて同様に試験を行うことで初発アメーバ数を求め、初発アメーバ数と生残するアメーバ数からアメーバ数の減少数を対数（Ｌｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値）で示した。
４．結果
（１）栄養細胞に対する塩酸ポリヘキサニド及びラクトフェリシンの殺菌効果
　上記１．で調製した試料１～５を用いて、これら試料の作用によるアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞に対する死細胞率（％）を検討した。また、その結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）との組み合わせた場合について、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍの場合（試料４）では、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞の死細胞率（％）が１時間処理では３５．３±１７．１％、４時間処理では４５．３±９．０％と、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ単独の場合（試料１）の１９．２±６．８％（１時間処理）及び２９．９±８．３％（４時間処理）やラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍ単独の場合（試料２）の１１．９±２．４％（１時間処理）及び１１．３±１．３％（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　また、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍの場合（試料５）においても、該栄養細胞の死細胞率（％）が１時間処理では７３．７±２２．９％、４時間処理では８５．５±１９．３％と、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ単独の場合（試料１）の１９．２±６．８％（１時間処理）及び２９．９±８．３％（４時間処理）やラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍ単独の場合（試料３）の７２．３±２３．３％（１時間処理）及び７４．４±２８．０％（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　以上のように、ラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）は、濃度依存的にアカントアメーバの栄養細胞に対する殺菌効果が増強するとともに、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）と組み合わせることでそれら単独の場合と比べて高い殺菌効果が得られ、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）との組み合わせによる相乗効果が認められた。また、ラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）をアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞に作用させた場合、処理時間が１時間の場合と４時間の場合との死細胞率（％）がほぼ同様の値を示したことから、ラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）はアカントアメーバの栄養細胞を短時間で死滅させる効力があることが分かった。
（２）栄養細胞の殺菌効果に及ぼす塩類の影響
　上記１．で調製した試料１４～１８を用いて、これら試料の作用によるアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞に対する死細胞率（％）を検討した。また、その結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ナトリウム塩濃度が０．９％であるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）を用いて試料を調製した場合（試料１４～試料１８）、いずれの場合においてもアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞の死細胞率（％）が１時間処理では１．５±０．８～３．９±０．８％、４時間処理では３．７±１．８～８．８±３．９％と、表２で示したナトリウム塩を含んでいない２．５％グリセロール溶液で試料を調製した場合（試料１～５）と比べて低い値を示した。このように、ナトリウム塩濃度０．９％存在下では、アカントアメーバの栄養細胞に対する殺菌効果が低下することが分かった。
（３）シスト細胞に対する塩酸ポリヘキサニド及びラクトフェリシンの殺菌効果　
　上記１．で調製した試料１～７を用いて、これら試料の作用によるアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）シスト細胞に対するＬｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値を検討した。なお、Ｌｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値とは、初発のアメーバ数がどのくらい減少したかを対数で示した値をいう。例えば、Ｌｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値が１の場合では初発のアメーバ数が１／１０になったことを意味し、Ｌｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値が２では初発のアメーバ数が１／１００になったことを意味する。また、その結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）とを組み合わせた場合について、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍの場合（試料４）では、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）シスト細胞のＬｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値が１時間処理では０．９２、４時間処理では１．２５と、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ単独の場合（試料１）の０．５８（１時間処理）及び１．１６（４時間処理）やラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍ単独の場合（試料２）の０．１７（１時間処理）及び－０．０８（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　また、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍの場合（試料５）においても、該シスト細胞のＬｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値が１時間処理では０．６７、４時間処理では１．４９と、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ単独の場合（試料１）の０．５８（１時間処理）及び１．１６（４時間処理）やラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍ単独の場合（試料３）の０．１７（１時間処理）及び０．０８（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　一方、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）とラクトフェリン（ＬＦ）とを組み合わせた場合、すなわち、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）１ｐｐｍ及びラクトフェリン（ＬＦ）８０００ｐｐｍの場合（試料７）では、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）シスト細胞のＬｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値が１時間処理では０．０８、４時間処理では０．０８と、該シスト細胞に対して殺菌効果は認められなかった。
　以上のように、シスト細胞においても栄養細胞の場合と同様に、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）とを組み合わせることにより、それら単独の場合と比べて高い殺菌効果が得られ、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）との組み合わせによる相乗効果が認められた。また、時間の経過とともにＬｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値が大きくなり、シスト細胞の殺菌効果は時間依存性が認められた。
　一方、ラクトフェリン（ＬＦ）は、該シスト細胞に対して殺菌効果を示さず、また、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）と組み合わせた場合においても殺菌効果は認められなかった。この要因としては、ラクトフェリンの分子量がラクトフェリシンの分子量よりも大きいことによると推察された。
（４）シスト細胞の殺菌効果に及ぼす塩類の影響
　上記１．で調製した試料１４～２０を用いて、これら試料の作用によるアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）シスト細胞に対するＬｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値を検討した。また、その結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ナトリウム塩濃度が０．９％であるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）を用いて試料を調製した場合（試料１４～試料２０）、いずれの場合においてもアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）シスト細胞のＬｏｇ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ値が１時間処理では－０．３３～０．１７、４時間処理では－０．３３～０．２５と、表４で示したナトリウム塩を含んでいない２．５％グリセロール溶液で試料を調製した場合（試料１～７）と比べて低い値を示した。このように、ナトリウム塩濃度０．９％存在下では、アカントアメーバの栄養細胞に対する殺菌効果が低下することが分かった。
（５）栄養細胞に対するε－ポリリジン及びラクトフェリシン作用
　上記１．で調製した試料８～１３を用いて、これら試料の作用によるアカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞に対する死細胞率（％）を検討した。また、その結果を表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ε－ポリリジン（ＰＬ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）とを組み合わせた場合について、ε－ポリリジン（ＰＬ）５ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍの場合（試料９）では、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ　ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ　ＡＴＣＣ５０３７０）栄養細胞の死細胞率（％）が１時間処理では３４．１％、４時間処理では７８．８％と、ε－ポリリジン（ＰＬ）５ｐｐｍ単独の場合（試料８）の２１．０％（１時間処理）及び３９．３％（４時間処理）や表２で示したラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍ単独の場合（試料２）の１１．９±２．４％（１時間処理）及び１１．３±１．３％（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　また、ε－ポリリジン（ＰＬ）５ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍの場合（試料１０）においても、該栄養細胞の死細胞率（％）が１時間処理では９１．８％、４時間処理では９２．２％と、ε－ポリリジン（ＰＬ）５ｐｐｍ単独の場合（試料８）の２１．０％（１時間処理）及び３９．３％（４時間処理）や表２で示したラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍ単独の場合（試料３）の７２．３±２３．３％（１時間処理）及び７４．４±２８．０％（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　さらに、ε－ポリリジン（ＰＬ）１０ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍの場合（試料１２）では、該栄養細胞の死細胞率（％）が１時間処理では８９．１％、４時間処理では８３．２％と、ε－ポリリジン（ＰＬ）１０ｐｐｍ単独の場合（試料１１）の４４．６％（１時間処理）及び７２．４％（４時間処理）や表２で示したラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３ｐｐｍ単独の場合（試料２）の１１．９±２．４％（１時間処理）及び１１．３±１．３％（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　さらにまた、ε－ポリリジン（ＰＬ）１０ｐｐｍ及びラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍの場合（試料１３）においても、該栄養細胞の死細胞率（％）が１時間処理では８４．９％、４時間処理では８７．９％と、ε－ポリリジン（ＰＬ）１０ｐｐｍ単独の場合（試料１１）の４４．６％（１時間処理）及び７２．４％（４時間処理）や表２で示したラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）３０ｐｐｍ単独の場合（試料３）の７２．３±２３．３％（１時間処理）及び７４．４±２８．０％（４時間処理）の場合と比べてそれぞれ高い値を示した。
　以上のように、ε－ポリリジン（ＰＬ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）と組み合わせることでそれら単独の場合と比べて高い殺菌効果が得られ、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）とラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）との組み合わせによる相乗効果が認められた。また、ε－ポリリジン（ＰＬ）は、濃度依存的にアカントアメーバの栄養細胞に対する殺菌効果が増強することも分かった。
（６）毒性試験
　上記１．で調製した試料１～５について、常法に従い、それらの細胞毒性試験（コロニー形成阻害試験）を行った。すなわち、１ウェルあたり約５０ｃｅｌｌｓのＶ７９細胞（ＪＣＲＢ０６３０）を播種した２４ウェルプレートを２４時間保持した後、各試料を１０容量％の割合でＭＯ５培地と混合したものを各ウェルに置換し、炭酸ガス培養装置内で５％ＣＯ２条件下で３７℃で６日間培養を行い、これらのコロニー数を測定した。この時、対照として２．５％グリセロール（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）溶液を用い、比較例として過酸化水素を含有するコンタクトレンズ用ケア剤であるＡＯ　ｓｅｐｔ　Ｃｌｅａｒ　Ｃａｒｅ（ＣＩＢＡ　ＶＩＳＩＯＮ製；Ｌｏｔ　Ｎｏ．１０１７５）を使用した。なお、コロニー形成率（％）は、対照の場合のコロニー数を１００％として算出した。また、その結果を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示したように、過酸化水素を含有するＡＯ　ｓｅｐｔ　Ｃｌｅａｒ　Ｃａｒｅ（ＣＩＢＡ　ＶＩＳＩＯＮ製；Ｌｏｔ　Ｎｏ．１０１７５）では、コロニー形成率（％）が０％と強い細胞毒性が認められたが、試料１～５の全てにおいては、コロニー形成率（％）が８７～１１０％と高いコロニー形成率（％）を示しており、塩酸ポリヘキサニド（ＰＨＭＢ）、ラクトフェリシン（ＬＦｃｉｎ）及びそれらの組み合わせたものについては細胞毒性が認められなかった。

Claims (8)

  1. 　カチオン性高分子殺菌剤とラクトフェリシンとを有効成分として含有することを特徴とする、抗アカントアメーバ用組成物。
  2. 　前記カチオン性高分子殺菌剤が塩酸ポリヘキサニド、ε－ポリリジン、ポリクオタニウム類からなる群から選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載の抗アカントアメーバ用組成物。
  3. 　前記カチオン性高分子殺菌剤の濃度が少なくとも０．１ｐｐｍである、請求項１又は２に記載の抗アカントアメーバ用組成物。
  4. 　前記ラクトフェリシンの濃度が少なくとも１．５ｐｐｍである、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗アカントアメーバ用組成物。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載の抗アカントアメーバ用組成物を含有する、眼科用剤。
  6. 　コンタクトレンズ用多目的剤である請求項５に記載の眼科用剤。
  7. 　アカントアメーバ角膜炎の治療剤である請求項５に記載の眼科用剤。
  8. 　点眼剤である請求項５に記載の眼科用剤。
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