WO2014178675A1 - 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물 - Google Patents

팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 팔물탕 추출물를 이용하여 골수유래 줄기세포의 증식을 촉진시키는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor)를 개체에 투여하고, 상기 개체에 팔물탕 추출물을 투여하여 골수유래 줄기세포의 증식을 촉진시키는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 줄기세포의 증식 및 분화를 위해 G-CSF만을 단독투여 했던 방법에 의해 야기되었던 비장종대와 같은 부작용을 해결하여, 팔물탕 추출물의 병용투여로 현저히 완화시켰으며, 줄기세포의 증식 및 분화를 보다 촉진시키는 효과가 있다.

Description

팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물
본 발명은 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아, 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 여러 가지 줄기세포 중 혈중 성체줄기세포(adult stem cell)라 함은 골수 유래의 세포로, 인체의 장기와 혈액을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포들을 지칭한다.
그중, 골수유래 줄기세포는 혈액암, 림프종, 및 골수부전 등의 질병의 궁극적인 치료수단으로 여겨지고 있다. 현재 다양한 목적으로 골수 유래 줄기세포의 이식이 수행되고 있고, 특히 말기 신장 및 간 환자에서 장기 이식이 어려운 경우, 자가 골수 유래 줄기세포를 이식함으로써, 간 및 신장의 재생을 촉진하는 방법이 시도되고 있다.
자가 골수 유래 줄기세포를 이식한 후, 분화 및 분열을 촉진하기 위해, 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자 (Human Granulocyte colony-stimulating factor, hG-CSF)를 전 투여하고 있다. 그러나, 대략 5~30%의 환자에서 줄기세포의 증식 또는 혈액으로의 mobilization이 일어나지 않고, hG-CSF의 투여에 의해, 심장 경색, 뇌졸중, 발열, 골통, 비장 종대 (splenomegaly) 및 파열 등 다양한 부작용이 알려져 있으며(Masood et al., 2008; Fox et al., 2009), 특히 고 비용으로 그 사용이 제한되고 있다. 따라서 hG-CSF의 골수유래 줄기세포의 증식 효과를 촉진하거나, 부작용을 경감 시킬 수 있는 새로운 대체 수단이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 팔물탕은 한의학에서 흔히 사용되는 대표적인 보기약으로, 글자 그대로 8개의 약재가 들어간 처방을 말하는 것이다. 기(氣)를 보(補)해주는 보기약(補氣藥)으로 사군자탕(四君子湯)이 있고, 혈(血)을 보(補)해주는 보혈약(補血藥)으로 사물탕(四物湯)이 있는데, 이 두가지 약물을 합한 처방이 즉 팔물탕을 의미한다. 사군자탕에는 인삼, 백출, 감초, 백복령이라는 4가지 약재가 들어가고, 사물탕에는 숙지황, 백작약, 천궁, 당귀 등의 4개의 약재가 들어간다. 사군자탕은 신진대사의 기능을 촉진하고 면역기능을 증강시키며, 증혈작용과 소화흡수의 기능을 개선시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 사물탕은 병후의 쇠약에 응용될 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 팔물탕 추출물를 이용하여 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor) 및 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 자극인자 및 팔물탕 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 자극인자 및 팔물탕 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 팔물탕 추출물 투여기간은 상기 자극인자 투여 후 30분 이내에 시작되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공하는 팔물탕 추출물을 유효성분으로 함유하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물은, 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자(hG-CSF)와 팔물탕 추출물을 포함하는 것으로, 줄기세포의 이식 전에 투여되어, 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 줄기세포의 증식 및 분화 촉진을 위해 hG-CSF를 투여하여 증기세포의 증식을 유도할 경우, 심근경색, 뇌졸중, 발열, 골통, 비장종대 및 파열등의 부작용을 가지고 있었던 종래 기술상의 문제를 해결할 수 있는 새로운 대체 수단으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 hG-CSF의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질 투여에 의해 변화되는 마우스의 체중 및 증체량의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장의 크기를 확인한 결과를 나타낸 도면이다(A: 무처리, B: hG-CSF, C: 팔물탕+hG-CSF, D: 삼출건비탕+hG-CSF, E: 황기+hG-CSF, F: 녹용+hG-CSF, 및 G:당귀+hG-CSF).
도 4 및 도 5는 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 CD34+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타낸 도면이다(A: 무처리, B: hG-CSF, C: 팔물탕+hG-CSF, D:삼출건비탕+hG-CSF, E: 황기+hG-CSF, F: 녹용+hG-CSF, 및 G:당귀+hG-CSF).
도 6 및 도 7은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 CD45+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타낸 도면이다(A: 무처리, B: hG-CSF, C:팔물탕+hG-CSF, D: 삼출건비탕+hG-CSF, E: 황기+hG-CSF, F: 녹용+hG-CSF, 및 G:당귀+hG-CSF).
도 8은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장의 전체 두께 및 단위 면적당 적색 수질 및 백색수질 내 유핵세포를 관찰하여 나타낸 도면이다(A~C: 무처리, D~F: hG-CSF, G~I: 팔물탕+hG-CSF, J~L: 삼출건비탕+hG-CSF, M~O: 황기+hG-CSF, P~R: 녹용+hG-CSF, 및 S~U: 당귀+hG-CSF).
도 9는 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장 및 골수의 CD34 면역반응세포의 수적 증가를 관찰하여 나타낸 도면이다(A~B: 무처리, C~D: hG-CSF, E~F: 팔물탕+hG-CSF, G~H: 삼출건비탕+hG-CSF, I~J: 황기+hG-CSF, K~L: 녹용+hG-CSF, 및 M~N: 당귀+hG-CSF).
도 10은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장 및 골수의 CD45 면역반응세포의 수적 증가를 관찰하여 나타낸 도면이다(A~D: 무처리, E~H: hG-CSF, I~L: 팔물탕+hG-CSF, M~P: 삼출건비탕+hG-CSF, Q~T: 황기+hG-CSF, U~X: 녹용+hG-CSF, 및 Y~AB: 당귀+hG-CSF).
본 발명자들은 골수 유래 줄기세포를 이식한 후 분화 및 분열을 촉진하기 위해 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자를 투여할 경우 나타나는 여러가지 부작용들을 완화시킬 수 있으면서도, 골수 유래 줄기세포의 생산을 보다 증가시킬 수 있는 조성물을 개발하고자, 한약재에 주목하게 되었고, 상기 한약재 중 팔물탕에 뛰어난 줄기세포 증식 및 분화 촉진 효과가 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor) 및 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다:
본 발명에서 쓰는 용어 ‘팔물탕 추출물’은 8개의 약재로부터 추출한 추출물을 의미하는 것이다. 상기 8개의 약재는 인삼, 백출, 감초, 백복령, 숙지황, 백작약, 천궁, 당귀 등의 8개의 약재를 포함하는 것이다.
본 발명의 일구현예로, 상기 자극인자 및 팔물탕 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 될 수 있다.
상기 팔물탕 추출물의 투여 기간은 상기 과립백혈구 집락 자극인자의 투여 후 30분 이내에 수행될 수 있고, 바람직하게는 15분 이내에 수행되어야 하며, 가장 바람직하게는 5분 이내에 수행되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 과립백혈구 집락 자극인자는 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자(Human Granulocyte colony-stimulating factor)인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 과립백혈구 집락 자극인자 및 팔물탕 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 상기 팔물탕 추출물은 경구 투여되는 것이 바람직하나, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 및 기간 등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에서 ‘개체’ 란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유동물을 의미한다.
또한, 본 발명은 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포의 생산을 증가시키는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 300 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/체중kg으로 투여한다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 팔물탕 추출물을 hG-CSF 투여 후에 경구 투여한 결과, 팔물탕 추출물의 5분이내 병용 경구투여에 의해 비장 종대를 완화시킬 수 있다는 것을 확인하였고(실험예 2 참조), 적색 수질내 유핵세포의 증생에 의한 비장 중량 증가 및 비장 종대 소견은 유의성 있게 (p<0.01) 억제되었으며, 전체적인 과립백혈구의 증생에는 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었고(실험예 3 참조), hG-CSF에 의한 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization은 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었다(실험예 4 참조).
따라서, 본 발명의 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물은 골수 유래 줄기세포의 생산을 증가시킬 수 있는 동시에, 기존에 G-CSF를 단독투여하였을 경우에 야기되었던 여러 가지 부작용들을 완화시킬 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 실시예에서는 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀가 hG-CSF의 약효 및 부작용, 특히 줄기세포 mobilization 및 비장종대에 미치는 영향을 hG-CSF에 의한 줄기세포 mobilization에 흔히 사용되고 있는 Balb/c 마우스를 이용하여 평가하였다.
실시예 1. 실험준비
1-1. 재료준비
hG-CSF는 Life Technologies(Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 구조를 도 1에 나타내었다.
팔물탕(PMT)은 한중제약(Daejeon, Korea)으로부터 구매하여 사용하였고, 그 성분과 양은 하기 표 1과 같다.
표 1
Herbs Scientific Names/ Produce Region Amounts (g)
Angelicae Gigantis Radix Angelica gigas N. 2.46
Atractylodis Rhizoma Atractylodes ovata (Thunb.) DC. 2.46
Cnidii Rhizoma Cnidium officinale Makino 2.26
Ginseng Radix Alba Panax ginseng C.A.Meyer. 1.6
Glycyrrhizae Radix Glycyrrhiza uralensis Fisch 1.8
Hoelen Poria cocos Wolf 0.13
Paeoniae Radix Paeonia lactiflora Pall. 1.8
Rehmanniae Radix Preparata Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel 3.33
Total 8 types 15.84
팔물탕의 효과와 비교하기 위한 약재로 삼출건비탕(SCGBT), 황기, 녹용 및 당귀를 선택하여 비교하였다. 상기 약재 중 삼출건비탕의 성분과 양은 표 2에 나타내었다.
표 2
Herbs Scientific Names/ Produce Region Amounts (g)
Amomi Fructus Amomum xanthioides Wallich 0.16
Atractylodis Rhizoma Alba Atractylodes ovata (Thunb.) DC. 0.98
Citri Unshii Pericarpium Citrus unshiu S.Marcov. 0.85
Ginseng Radix Alba Panax ginseng C.A.Meyer. 0.64
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Glycyrrhiza uralensis Fisch 0.36
Hawthorn Fruit(Crataegi Fructus) Crataegus pinnatifida Bunge var. typica Schneider 0.93
Hordei Fructus Germiniatus Hordeum vulgare Linn. 0.34
Zizyphi Fructus Zizyphus jujuba var. inermis (Bunge) Rehder 4.17
Magnoliae Cortex Magnolia officinalis Rehder et Wilson 0.21
Massa Medicata Fermentata Triticum aestivum L. 0.67
Paeoniae Radix Paeonia lactiflora Pall. 0.54
Ponciri Fructus Poncirus trifoliata 0.58
Hoelen Poria cocos Wolf 0.05
Zingiberis Rhizoma Crudus Zingiber officinale Roscoe 0.26
Total 14 types 10.74
1-2 실험 동물 준비
본 실시예에서는 실험 동물로 Balb/c CrSlc 마우스 (6주령 암컷, SLC, Shizuoka, Japan)를 선택하여 사용하였다. 7마리의 건강한 SPF Balb/c 마우스를 입수하여, 34일 간 순화시킨 다음, 체중이 일정한 실험동물만 군당 10 마리씩 선정하여, 하기 표 3과 같이 7개의 군으로 나누어 실험에 사용하였다. 모든 실험 동물들은 hG-CSF 및 약물 투여시작일과 최종 부검일 전 각각 18시간(overnight) 절식을 실시하였으며(음수는 자유롭게 공급), picric acid로 개체를 식별하였다.
표 3
Group Inducer Test substances and dose (mg/kg/day) Animal No.
GCSF-2012-PD: Effects on the hG-CSF-treated mice
Control Saline 10ml/kg Distilled water oral 10ml/kg [Intact vehicle] M01~M10
Control hG-CSF 250μg/kg Distilled water oral 10ml/kg [hG-CSF] M11~M20
Active hG-CSF 250μg/kg PMT oral (200mg/kg) [PMT] M21~M30
Active hG-CSF 250μg/kg SCGBT oral (200mg/kg) [SCGBT] M31~M40
Active hG-CSF 250μg/kg AR oral (200mg/kg) [AR] M41~M50
Active hG-CSF 250μg/kg CCP oral (200mg/kg) [CCP] M51~M60
Active hG-CSF 250μg/kg AGR oral (200mg/kg) [AGR] M61~M70
1-3. 투여방법
hG-CSF 및 후보 약물의 투여
이전의 방법들(Verma et al., 1997; Levesque et al., 2003)에 따라 hG-CSF(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 250 μg/kg을 매일 1회씩 6일간 연속 피하투여하여, 백혈구의 증식 및 골수유래 줄기세포의 mobilization을 촉진하고, hG-CSF 투여 5분 이내에 각각 200mg/kg의 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물을 매일 1회씩 6일간 경구 투여하였다. 모든 5종의 천연물 유래 추출물은 멸균 증류수에 용해시켜 동물 체중 kg 당 10ml의 용량으로 금속제 zonde가 부착된 1mL 주사기(syringe)를 이용하여 강제 경구투여 하였으며, hG-CSF 는 생리식염수에 용해시켜 등쪽 피하부위에 10 ml/kg의 용량으로 피하투여 하였다. hG-CSF 대조군에서는 천연물 유래 추출물 투여대신 동일한 용량의 멸균 증류수만 투여하였으며, 정상 매체 대조군에서는 hG-CSF 및 천연물 유래 추출물 대신 각각 동일한 용량의 생리식염수와 멸균증류수를 5분 간격으로 피하 및 경구 투여하였다. 본 실험에 사용한 천연물 유래 추출물의 투여 용량 즉, 200mg/kg은 각각의 동물실험 결과를 바탕으로 선정하였다.
1-4. 관찰항목
체중 및 비장 중량의 변화, 골수 유핵세포 및 혈중 백혈구 총수와 함께 대표적인 골수 유래 줄기세포 표지 marker인 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수를 Fluoresence Activated Cell sorter (FACs) 방법으로 골수 및 혈액내에서 관찰하였다. 또한 비장 및 골수의 조직표본에서 단위 면적당 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수를 면역조직화학적 방법으로 관찰하였으며, 비장의 전체 두께, 백색 수질의 수 및 직경, 단위 면적당 비장 적색 수질 및 골수내 유핵세포 수 역시 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Quebec, Canada)를 이용하여 평가하였다. 보다 명확한 변화를 관찰하기 위하여, 정상 매체 대조군과 hG-CSF 대조군과의 % change 및 각각의 천연물 유래 추출물 투여군과 hG-CSF 대조군과의 % change를 산출하여, 비교하였다.
실시예 2. 체중 및 증체량의 변화 확인
상기 관찰 결과, 체중 및 증체량의 변화를 측정하여 표 4와 도 2에 도시하였다. 도 2에서 확인할 수 있는 것과 같이, 정상 매체 대조군과 비교하여, hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질 투여와 관련된 의미 있는 체중 및 증체량의 변화는 실험 전 기간동안 인정되지 않았다.
표 4
Groups Body weight(g) Body weight gains (g) during treatment [B-A]
At first treatment [A] Sacrifice [B]
Controls
Intact vehicle 16.24±0.63 17.19±0.56 0.95±0.44
hG-CSF 16.10±0.68 17.24±0.79 1.14±0.36
Natural extract orally co-administered
PMT 16.19±0.51 17.20±1.06 1.01±0.76
SCGBT 16.27±0.93 17.41±0.78 1.14±0.55
AR 16.37±0.89 17.31±0.79 0.94±0.51
CCP 16.10±0.71 17.20±1.16 1.10±0.51
AGR 16.48±1.15 17.67±1.27 1.19±0.57
Values are expressed mean ± S.D. of 10 mice
하지만, hG-CSF 대조군에서는 6일간의 실험 전 기간 동안의 증체량이 정상 매체 대조군에 비해 20.00%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -11.40, 0.00, -17.54, -3.51 및 4.39%의 변화를 나타내었다.
실시예 3. 비장 중량의 변화 확인
본 실험예에서 관찰한 비장 중량의 변화량을 하기 표 5에 나타내었다. hG-CSF 대조군에서는 현저한 비장 종대(splenomegaly)에 따른 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 체중에 대한 상대 중량의 증가가 인정되었고, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 중량의 감소가 각각 인정되었다.
표 5
Groups Spleen weights
Absolute (g) Relative (% of body weight)
Controls
Intact vehicle 0.066±0.005 0.384±0.018
hG-CSF 0.132±0.012a 0.768±0.090a
Natural extract orally co-administered
PMT 0.104±0.008ab 0.608±0.064ab
SCGBT 0.139±0.019a 0.803±0.128a
AR 0.125±0.011a 0.721±0.050a
CCP 0.150±0.018ac 0.871±0.085ac
AGR 0.109±0.008ab 0.618±0.061ab
또한, 도 3에 나타낸 것과 같이, 비장의 크기를 눈으로 확인해본 결과, 정상매체 대조군과 비교하여 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군의 크기는 감소되어있는 것을 확인하였다.
한편 녹용 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 비장 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었으며, 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 비장 중량의 변화는 각각 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 절대 중량이 정상 매체 대조군에 비해 99.55%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -21.08, 5.61, -5.38, 13.65 및 -17.51%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 상대 중량이 정상 매체 대조군에 비해 99.81%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -20.85, 4.57, -6.13, 13.46 및 -19.46%의 변화를 나타내었다.
상기 결과들을 통해, G-CSF와 팔물탕 추출물의 병용투여가 G-CSF에 의한 부작용인 비장종대를 완화시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4. 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포의 수적 확인
본 실험예에서는 혈액 백혈구(Blood leukocytes) 및 골수 유핵세포(Bone marrow nuclear cells)의 수적 변화를 관찰하여 표 6에 그 결과를 나타내었다.
표 6
Groups Total Cell Counts
Blood leukocytes (×103cells/μl) Bone marrow nuclear cells (×104cells/μl)
Controls
Intact vehicle 5.06±2.00 47.10±20.93
hG-CSF 53.40±22.63a 457.90±129.50c
Natural extract orally co-administered
PMT 55.50±17.92a 440.80±115.78c
SCGBT 47.70±13.34a 444.10±105.38c
AR 52.50±11.74a 431.90±127.46c
CCP 73.00±12.94ab 590.10±134.67c
AGR 57.10±16.93a 444.80±92.76c
hG-CSF 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총 수의 증가가 인정되었으나, hG-CSF 대조군에 비해 현저한 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총수의 증가가 녹용 병용 투여군에서 인정된 이외에 의미 있는 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총 수의 변화는 모든 천연물 추출물 병용 투여군에서 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 혈액 백혈구 총수는 정상 매체 대조군에 비해 955.34%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 3.93, -10.67, -1.69, 36.70 및 6.93%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수 유핵세포 총수가 정상 매체 대조군에 비해 872.19%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -3.73, -3.01, -5.68, 28.87 및 -2.86%의 변화를 나타내었다.
따라서, hG-CSF 대조군과 비교할 때, 팔물탕 추출물을 투여한 경우 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총수가 증가하는 것은 아니었으나, 비슷한 증가 수준을 유지할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 5. FACs 결과: 혈액 및 골수 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수적 변화 확인
혈액 및 골수 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수적 변화를 FACs(Fluoresence Activated Cell sorter) 방법으로 관찰하여 표 7에 그 결과를 나타내었다.
표 7
Groups Blood leukocytes Bone marrow nuclear cells
CD34+ cells (×102cells/μl) CD45+ cells (×102cells/μl) CD34+ cells (×102cells/μl) CD45+ cells (×102cells/μl)
Controls
Intact vehicle 7.93±1.05 10.41±1.47 16.60±3.76 13.16±2.32
hG-CSF 26.81±6.02a 42.94±8.62a 30.41±6.69a 24.63±3.82a
Natural extract orally co-administered
PMT 43.40±5.46ab 61.99±3.32ab 45.09±5.83ab 32.35±1.77ab
SCGBT 22.14±5.46a 41.76±6.09a 31.21±1.60a 25.37±2.47a
AR 25.10±6.36a 45.28±8.58a 32.42±3.31a 23.97±2.46a
CCP 40.66±2.59ab 56.79±6.14ab 40.44±1.13ab 28.44±4.73a
AGR 41.25±6.00a 61.28±7.68ab 44.34±3.59ab 31.17±2.59ab
Values are expressed mean ± S.D. of 5 mice
5.1. 혈액 및 골수 CD34+ 세포의 수적변화
도 4 및 5에 CD34+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타내었다. 표 7과 함께 그 결과를 살펴보면, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 및 골수 CD34+ 세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕, 녹용 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 및 골수내 CD34+ 세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액 및 골수 내 CD34+ 세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 혈액내 CD34+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 238.08%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 61.89, -17.41, -6.39, 51.65 및 53.85%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD34+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 83.14%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 48.29, 2.64, 6.62, 33.00 및 45.80%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 통해, G-CSF를 단독 투여한 경우와 비교하여, 팔물탕 추출물을 병용투여할 경우 혈액과 골수 내의 CD34+ 세포의 수가 크게 증가한다는 점을 확인하였다.
5.2. 혈액 및 골수 CD45+ 세포의 수적변화
도 6 및 7에 CD45+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타내었다. 표 7과 함께 그 결과를 살펴보면, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 및 골수 CD45+ 세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕, 녹용 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 현저한 혈액 및 골수내 CD45+ 세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액 및 골수 내 CD45+ 세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 혈액내 CD45+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 312.39%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 44.38, -2.75, 5.45, 32.26 및 42.72%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD45+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 87.18%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 31.35, 3.02, -2.68, 15.47 및 26.58%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 통해, G-CSF를 단독 투여한 경우와 비교하여, 팔물탕 추출물을 병용투여할 경우 혈액과 골수 내의 CD45+ 세포의 수가 크게 증가한다는 점을 확인하였다.
따라서, 실험예 5.1 및 5.2 결과를 볼 때, 팔물탕 추출물의 병용투여는 골수유래 줄기세포의 증식을 현저하게 증가시킨다는 점을 확인할 수 있다.
실시예 6. 조직병리학적 변화 확인
하기 표 8에 8개의 군에 따라 비장(spleen)과 대퇴골 골수(bone marrow)의 조직병리학적 변화를 관찰하여 그 값을 나타내었다.
표 8
Groups Spleen Bone marrow
Total thickness (mm/central regions) Number of white pulp (white pulps/mm2) Mean diameters of white pulp (μm/white pulp) Mean number of red pulp nuclear cells(×102cells/ mm2) Mean number of nuclear cells (×102cells/ mm2)
Controls
Intact vehicle 1.58±1.16 14.50±2.37 459.22±98.51 3.34±0.80 16.30±2.26
hG-CSF 1.86±0.12a 14.60±1.84 478.38±70.00 27.18±5.19a 74.51±18.28a
Natural extract orally co-administered
PMT 1.63±0.07b 14.10±2.33 493.19±68.93 19.09±2.44ab 72.46±11.54a
SCGBT 2.06±0.16ab 14.00±2.98 484.79±84.57 28.92±5.91a 70.77±11.22a
AR 1.85±0.18a 14.80±1.75 482.04±116.86 30.65±6.14a 67.22±10.57a
CCP 2.00±0.34a 14.90±2.60 487.78±65.78 26.76±3.43a 80.03±12.18a
AGR 1.68±0.14b 14.60±2.01 472.34±65.60 17.61±3.18ab 67.30±11.77a
Values are expressed mean ± S.D. of 10 mice
6.1. 비장의 조직병리학적 변화
상기 표 8에서 볼 수 있는 것과 같이, hG-CSF 대조군에서는 현저한 비장 적색 수질내 유핵세포의 침윤에 의한 종대소견이 인정되었다. 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 전체 두께 및 단위 면적당 적색수질 내 유핵세포의 증가가 각각 인정되었으나, 백색수질의 수 및 직경은 정상 매체 대조군과 유사하게 관찰되었다.
도 8는 비장의 전체 두께 및 단위 면적당 적색수질 및 백색수질 내 유핵세포 수를 나타낸 사진이다. 도 8에서 볼 수 있는 것과 같이, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 전체 두께 및 단위 면적당 적색수질내 유핵세포의 감소가 각각 인정되었으나, 삼출건비탕 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 전체 두께 증가가 인정되었고, 황기 및 녹용 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 비장의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 전체 두께가 정상 매체 대조군에 비해 17.47%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -12.02, 10.72, -0.48, 7.81 및 -9.75%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 백색 수질의 수가 정상 매체 대조군에 비해 0.69%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -3.42, -4.11, 1.37, 2.05 및 0.00%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 백색 수질의 평균 직경이 정상 매체 대조군에 비해 4.17%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 3.09, 1.34, 0.77, 1.96 및 -1.26%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 적색 수질 단위 면적당 유핵세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 714.75%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -29.76, 6.39, 12.76, -1.55 및 -35.21%의 변화를 나타내었다.
6.2. 대퇴골 골수의 조직병리학적 변화
상기 표 8에서 볼 수 있는 것과 같이, hG-CSF 대조군에서는 현저한 과립백혈구의 증생이 인정되었다. 도 9에 나타낸 것과 같이, 결과적으로 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 골수 단위 면적당 유핵세포의 증가가 인정되었으나, 모든 천연물 유래 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 대퇴골 골수의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 대퇴골 골수 단위 면적당 유핵세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 357.02%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -2.75, -5.02, -9.79, 7.40 및 -9.68%의 변화를 나타내었다.
상기 실험예 5.1 및 5.2를 통해, 팔물탕의 병용투여는 G-CSF 단독투여에 의한 비장종대와 같은 부작용을 예방하는 동시에, 백혈구를 증가시킬 수 있는 효과가 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 7. 면역조직화학적 변화 확인
하기 표 9에 7개 군에 대한 비장 및 골수에서의 CD34 및 CD45 면역반응 세포 수를 나타내었다.
표 9
Groups Spleen immunoreactive cell numbers (cells/mm2) Bone marrow immunoreactive cell numbers (cells/mm2)
CD34+ CD45+ CD34+ CD45+
Controls
Intact vehicle 16.40±2.72 44.90±15.04 11.40±3.92 35.80±11.86
hG-CSF 133.40±20.30c 303.50±79.69c 46.20±9.74c 325.40±98.79a
Natural extract orally co-administered
PMT 174.60±18.35cd 405.20±64.22cd 74.20±10.88cd 490.10±112.39ab
SCGBT 137.70±20.82c 300.50±70.36c 41.30±6.13c 350.00±70.41a
AR 146.80±14.77c 327.50±46.42c 49.40±8.83c 364.90±116.30a
CCP 125.50±13.74c 478.80±111.65cd 42.20±6.98c 344.40±102.18a
AGR 160.60±14.21cd 462.40±80.42cd 81.00±19.10cd 536.70±82.72ab
Values are expressed mean ± S.D. of 10 mice
7.1. 비장 및 골수 CD34 면역반응세포의 수적변화
표 9 및 도 9에서 볼 수 있는 것과 같이, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수 CD34 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수내 CD34 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 삼출건비탕, 녹용 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 비장 및 골수 내 다위 면적당 CD34 면역반응세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장내 CD34 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 713.41%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 30.88, 3.22, 10.04, -5.92 및 20.39%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD34 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 305.26%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 60.61, -10.61, 6.93, -8.87 및 75.32%의 변화를 나타내었다.
7.2. 비장 및 골수 CD45 면역반응세포의 수적변화
표 9 및 도 10에서 볼 수 있는 것과 같이, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수내 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 녹용 추출물 투여군에서도 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었으나, 골수내 CD45 면역반응세포는 hG-CSF 대조군과 유사하게 관찰되었고, 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액 및 골수 내 CD45+ 세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장내 CD45 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 575.95%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 33.51, -0.99, 7.91, 57.76 및 52.36%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD45 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 808.94%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 50.61, 7.56, 12.14, 5.84 및 64.94%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 통해, 팔물탕의 병용투여가 면역반응 세포의 수를 G-CSF를 단독 투여할 경우 보다 크게 증대시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 실시예 2 내지 7의 결과를 종합하면, hG-CSF 투여에 의해 현저한 비장 중량의 증가, 혈액 및 골수 유핵 세포 총 수의 증가와 함께 혈액 및 골수 내 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수적 증가가 인정되었으며, 조직병리학적으로 비장 전체 두께, 단위 면적당 적색 수질 및 대퇴골 골수 내 유핵세포의 수적 증가가 각각 인정되었고, 면역조직화학적으로 비장 및 골수 내 CD34 및 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 각각 인정되었다.
따라서 팔물탕 추출물의 5분이내 병용 경구투여에 의해 hG-CSF에 의한 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization은 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었고, 적색 수질내 유핵세포의 증생에 의한 비장 중량 증가 및 비장 종대 소견은 유의성 있게 (p<0.01) 억제되었으며, 전체적인 과립백혈구의 증생에는 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
한편 녹용 추출물 투여군에서도 현저한 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization이 인정되었으나, 비장 종대 소견은 오히려 악화 시키는 것으로 관찰되었고, 삼출건비탕과 황기 추출물의 병용 투여는 hG-CSF의 과립백혈구 및 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization 효과에 별 다른 영향을 미치지 않았으며, 비장 종대와 같은 부작용에도 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
따라서 팔물탕 추출물은 hG-CSF의 골수 유래 줄기세포의 mobilization 효과 증가 및 비장 종대와 같은 부작용 경감에 매우 유용한 새로운 양한방 협진 방법을 제공해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (4)

  1. 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor) 및 팔물탕 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진을 통한 혈액암, 림프종 또는 골수부전의 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 자극인자 및 팔물탕 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 자극인자 및 팔물탕 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 팔물탕 추출물 투여기간은 상기 자극인자 투여 후 30분 이내에 시작되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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