WO2014178676A1 - 당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물 - Google Patents

당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물 Download PDF

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WO2014178676A1
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bone marrow
cells
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extract
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이창형
김상경
신임희
김승모
변준석
손기철
구세광
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재단법인 통합의료진흥원
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention provides a composition for promoting bone marrow-derived stem cell proliferation comprising a Angelica extract.
  • Stem cells are cells capable of differentiating into various cells constituting biological tissues, which collectively refer to undifferentiated cells obtained before differentiation, which can be obtained from embryonic, fetal, and adult tissues.
  • the adult stem cells in the blood are bone marrow-derived cells, refers to stem cells having a multi-functionality capable of differentiating into all the organs and blood cells of the human body.
  • bone marrow-derived stem cells are considered to be the ultimate treatment for diseases such as hematologic cancer, lymphoma, and bone marrow failure.
  • diseases such as hematologic cancer, lymphoma, and bone marrow failure.
  • transplantation of bone marrow-derived stem cells has been carried out for various purposes, and in the case where organ transplantation is difficult, especially in terminal kidney and liver patients, a method of promoting regeneration of liver and kidney by transplanting autologous bone marrow-derived stem cells has been attempted. .
  • hG-CSF human recombinant granulocyte colony-stimulating factor
  • Angelica is the perennial herb of Angelica gigas NAKAI, A. sinensis DIELS, A. acutiloba KITAG. As a dry, it is known to have the effect of blood donation blood ( ⁇ ⁇ ⁇ ), landscaping pain ( ⁇ ), yunjojangjang ( ⁇ ⁇ ). Root has sedation, jingyeong, blood pressure lowering, etc. When the solution of root essential oil is used for arthritis, it is said to have analgesic and anti-inflammatory effects. In oriental medicine, it is mainly used for anemia, gynecology, and postpartum recovery of pregnant women. Used for swelling On the other hand, Korean Patent Publication No. 2012-0092754 discloses the contents of promoting the differentiation of stem cells using the herbal medicine Gujeolcho, there is no example that promotes "bone marrow-derived" stem cell differentiation using the Angelica extract.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned prior art needs, and an object thereof is to provide a composition for promoting bone marrow-derived stem cell proliferation using the Angelica extract.
  • the present invention provides a composition for promoting bone marrow-derived stem cell proliferation comprising a granulocyte colony-stimulating factor (Granulocyte colony-stimulating factor) and the Angelica extract.
  • a composition for promoting bone marrow-derived stem cell proliferation comprising a granulocyte colony-stimulating factor (Granulocyte colony-stimulating factor) and the Angelica extract.
  • the stimulating factor and Angelica extract is characterized in that it is formulated by mixing in advance, or formulated separately.
  • the stimulating factor and the Angelica extract is characterized in that it is administered parenterally, orally, locoregionally, or percutaneously.
  • the donkey extract administration period is characterized in that it begins within 30 minutes after administration of the stimulating factor.
  • Stem cell proliferation promoting composition comprising the Angelica extract as provided in the present invention as an active ingredient, comprising a human recombinant granulocyte colony stimulating factor (hG-CSF) and the Angelica extract, which is administered before transplantation of stem cells, stem It has the effect of promoting the proliferation and differentiation of cells.
  • hG-CSF human recombinant granulocyte colony stimulating factor
  • composition of the present invention has a side effect such as myocardial infarction, stroke, fever, bone pain, splenomegaly and rupture when inducing stem cell proliferation by administering hG-SCSF to promote stem cell proliferation and differentiation It can be used as a new alternative means to solve the problems of the prior art.
  • FIG. 1 is a view showing the structure of the hG-CSF used in the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of body weight and weight gain in mice changed by administration of hG-CSF or natural product-derived candidates.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of confirming the size of the spleen of mice administered hG-CSF or natural-derived candidates (A: no treatment, B: hG-CSF, C: Palmultang + hG-CSF, D: exudative tendon) Bite + hG-CSF, E: Astragalus + hG-CSF, F: Deer Antler + hG-CSF, and G: Dangi + hG-CSF).
  • FIGS. 4 and 5 show the results of FAC observation of CD34 + cells of mice administered with hG-CSF or natural product-derived candidates (A: untreated, B: hG-CSF, C: Palmultang + hG-CSF, D : Samchulgunbi-tang + hG-CSF, E: Astragalus + hG-CSF, F: Deer Antler + hG-CSF, and G: Angelica + hG-CSF).
  • A untreated
  • B hG-CSF
  • C Palmultang + hG-CSF
  • D Samchulgunbi-tang + hG-CSF
  • E Astragalus + hG-CSF
  • F Deer Antler + hG-CSF
  • G Angelica + hG-CSF
  • FIGS. 6 and 7 show FAC observation results of CD45 + cells of mice administered with hG-CSF or natural product-derived candidates (A: untreated, B: hG-CSF, C: Palmultang + hG-CSF, D : Samchulgeonbi-tang + hG-CSF, E: Astragalus + hG-CSF, F: Deer Antler + hG-CSF, and G: Angelica + hG-CSF).
  • A untreated
  • B hG-CSF
  • C Palmultang + hG-CSF
  • D Samchulgeonbi-tang + hG-CSF
  • E Astragalus + hG-CSF
  • F Deer Antler + hG-CSF
  • G Angelica + hG-CSF
  • Figure 8 is a view showing the observed nucleated cells in the red and white medulla per total thickness and unit area of the spleen of mice administered hG-CSF or natural product-derived candidates (A ⁇ C: no treatment, D ⁇ F: hG -CSF, G ⁇ I: Palmultang + hG-CSF, J ⁇ L: Samchulgunbitang + hG-CSF, M ⁇ O: Astragalus + hG-CSF, P ⁇ R: Deer Antler + hG-CSF, and S ⁇ U: Angelica + hG-CSF).
  • FIG. 9 is a diagram showing the observed increase in the number of CD34 immune response cells in the spleen and bone marrow of mice administered hG-CSF or natural-derived candidates (A ⁇ B: no treatment, C ⁇ D: hG-CSF, E ⁇ F: Palmultang + hG-CSF, G-H: Samchulgunbitang + hG-CSF, I-J: Astragalus + hG-CSF, K-L: Deer Antler + hG-CSF, and M-N: Angelica + hG- CSF).
  • a ⁇ B no treatment
  • C ⁇ D hG-CSF
  • E ⁇ F Palmultang + hG-CSF
  • G-H Samchulgunbitang + hG-CSF
  • I-J Astragalus + hG-CSF
  • K-L Deer Antler + hG-CSF
  • M-N Angelica + hG- CSF
  • FIG. 10 is a graph showing the increase in the number of CD45 immune-responsive cells in the spleen and bone marrow of mice treated with hG-CSF or natural-derived candidates (A-D: untreated, E-H: hG-CSF, I ⁇ L: Palmultang + hG-CSF, M ⁇ P: Samchulgeonbitang + hG-CSF, Q ⁇ T: Astragalus + hG-CSF, U ⁇ X: Deer Antler + hG-CSF, and Y ⁇ AB: Angelica + hG- CSF).
  • A-D untreated
  • E-H hG-CSF
  • I ⁇ L Palmultang + hG-CSF
  • M ⁇ P Samchulgeonbitang + hG-CSF
  • Q ⁇ T Astragalus + hG-CSF
  • U ⁇ X Deer Antler + hG-CSF
  • Y ⁇ AB Angelica +
  • the present inventors can alleviate various side effects of administering human recombinant granulocyte leukocyte stimulating factor to promote differentiation and division after transplantation of bone marrow-derived stem cells, and further increase the production of bone marrow-derived stem cells.
  • human recombinant granulocyte leukocyte stimulating factor to promote differentiation and division after transplantation of bone marrow-derived stem cells, and further increase the production of bone marrow-derived stem cells.
  • an object of the present invention is to provide a composition for promoting bone marrow-derived stem cell proliferation, including granulocyte colony-stimulating factor and Angelica extract.
  • the stimulating factor and Angelica extract may be formulated by mixing in advance, or may be formulated separately.
  • the administration period of the Angelica extract may be performed within 30 minutes after administration of the granulocyte colony stimulating factor, preferably within 15 minutes, and most preferably within 5 minutes, but is not limited thereto. It is not.
  • Granule leukocyte colony stimulating factor used in the present invention is characterized in that human recombinant granulocyte colony-stimulating factor (Human Granulocyte colony-stimulating factor), but is not limited thereto.
  • the granulocyte leukocyte stimulating factor and Angelica extract may be administered parenterally, orally, locoregionally, or percutaneously.
  • the Angelica extract is preferably administered orally, but may be appropriately selected by those skilled in the art according to the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the duration and the like.
  • 'individual' means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, and cow It means a mammal such as.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for increasing the production of bone marrow-derived stem cells, including Angelica extract.
  • composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include physiological saline, polyethylene glycol, ethanol, vegetable oil, isopropyl myristate, and the like, but is not limited thereto.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the drug form, the route of administration, and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Preferably, however, it is administered at 0.001 to 300 mg / kg body weight per day, more preferably 0.01 to 200 mg / kg body weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like by various routes.
  • the method of administration is not limited and may be administered, for example, by oral, rectal, or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural, or intra cerbroventricular injection.
  • composition for promoting bone marrow-derived stem cell proliferation comprising the Angelica extract of the present invention can increase the production of bone marrow-derived stem cells, and at the same time, alleviate various side effects caused when G-CSF is administered alone. It can be effected.
  • Balb / c which is commonly used for stem cell mobilization by hG-CSF, has the effects of Palmul-tang, Samchul-gunbi-tang, Astragalus, antler, and Angelica on the efficacy and side effects of hG-CSF, in particular, stem cell mobilization and splenomegaly. Evaluation was carried out using mice.
  • hG-CSF was purchased from Life Technologies (Carlsbad, Calif., USA) and used. The structure is shown in FIG.
  • Palmultang was purchased from Hanjung Pharmaceutical (Daejeon, Korea) and used, and its components and amounts are shown in Table 1 below.
  • Balb / c CrSlc mice (6 weeks old female, SLC, Shizuoka, Japan) were selected and used as experimental animals. Seven healthy SPF Balb / c mice were obtained and purified for 34 days, and then only ten animals of a constant weight were selected per group and used in the experiment as shown in Table 3 below. All animals were fasted 18 hours (overnight), respectively, before hG-CSF and drug start and final autopsy days (negative free supply), and the subjects were identified by picric acid.
  • Leukocytes by subcutaneous administration of 250 ⁇ g / kg of hG-CSF (Life Technologies, Carlsbad, Calif., USA) once daily for six consecutive days according to previous methods (Verma et al., 1997; Levesque et al., 2003). Promotes proliferation and mobilization of bone marrow-derived stem cells, and 200 mg / kg of Palmultang, Samchulganbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extracts were orally administered once daily for 6 days within 5 minutes of hG-CSF administration.
  • CD34 + and CD45 + cells representative bone marrow-derived stem cell markers, along with changes in body weight and spleen weight, bone marrow nucleated cells and blood leukocyte counts were observed in bone marrow and blood by Fluoresence Activated Cell sorter (FACs) method.
  • FACs Fluoresence Activated Cell sorter
  • the number of CD34 + and CD45 + cells per unit area of the spleen and bone marrow specimens was observed by immunohistochemical method. The total thickness of spleen, number and diameter of white medulla, splenic red medulla per unit area and number of nucleated cells in bone marrow were also measured.
  • the weight gain during the 6 days before the experiment showed a change of 20.00% compared to the normal medium control group, and the HG- control group in the 200 mg / kg group of Palmul-tang, Samchul-gunbi-tang, Astragalus, Deer Antler, and Angelica extracts, respectively. Changes of -11.40, 0.00, -17.54, -3.51 and 4.39% were compared with the CSF control group.
  • the change in the spleen weight observed in the present experimental example is shown in Table 5 below.
  • a significant (p ⁇ 0.01) increase in the relative weight of the spleen and body weight was observed in the hG-CSF control group compared to the normal medium control group, and compared to the hG-CSF control group.
  • a significant (p ⁇ 0.01) decrease in spleen weight was recognized, respectively.
  • the antler extract administration group showed a significant (p ⁇ 0.05) increase in the absolute and relative weight of the spleen compared to the hG-CSF control group. Was not admitted respectively.
  • the absolute weight of the spleen was 99.55% compared to the normal medium control group.Falmul-tang, Samchul-gunbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extract 200mg / kg were -21.08, 5.61, respectively. , -5.38, 13.65 and -17.51%.
  • the relative weight of the spleen was 99.81% compared to that of the normal medium control group, and Palmul-tang, Samchul-gunbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extract 200 mg / kg were -20.85 and 4.57, respectively, compared to the hG-CSF control group. , -6.13, 13.46 and -19.46%.
  • the hG-CSF control group showed a significant (p ⁇ 0.01) increase in the total number of blood leukocytes and bone marrow nucleated cells compared to the normal medium control group, but a significant increase in the total blood leukocytes and bone marrow nucleated cells compared to the hG-CSF control group combined with antler. In addition to those recognized in the administration group, significant changes in the total number of blood leukocytes and bone marrow nucleated cells were not recognized in all natural product combination combination administration groups.
  • the total number of blood leukocytes was 955.34% compared to that of the normal media control group. , -1.69, 36.70 and 6.93%.
  • the total number of bone marrow nucleated cells in the hG-CSF control group showed a change of 872.19% compared to the normal media control group, and -3.73, compared to the hG-CSF control group in the Palmultang, Samchulganbi-tang, Hwanggi, Deer Antler and Angelica extract 200mg / kg, respectively.
  • the change was -3.01, -5.68, 28.87 and -2.86%.
  • the total amount of blood leukocytes and bone marrow nucleated cells was not increased when the Angelica extract was administered, but it was confirmed that similar levels of increase could be maintained.
  • results with Table 7 show a significant increase in the number of (p ⁇ 0.01) blood and bone marrow CD34 + cells in the hG-CSF control group compared to the normal medium control group, and the hG-CSF control group in the Palmultang, Deer Antler and Angelica extract groups.
  • Significant (p ⁇ 0.01) increase in the number of CD34 + cells in the blood and bone marrow was observed as compared to.
  • no significant change in the number of CD34 + cells in the blood and bone marrow was observed in the Samchulgunbi-tang and Astragalus extract-treated groups compared to the hG-CSF control group.
  • the number of CD34 + cells in the blood showed a change of 238.08% compared to the normal medium control group, and in the group of Palmultang, Samchulgunbi-tang, Astragalus, Deer Antler, and Angelica extract 200mg / kg, 61.89, Changes of -17.41, -6.39, 51.65 and 53.85%.
  • the number of CD34 + cells in the bone marrow showed 83.14% change compared to the normal medium control group, and in the Palmultang, Samchulgeonbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extract 200mg / kg, 48.29, Changes of 2.64, 6.62, 33.00 and 45.80%.
  • the number of CD45 + cells in the blood showed a change of 312.39% compared to the normal media control group, and 44.38, compared with the hG-CSF control group in the 200 mg / kg group of Palmultang, Samchulgunbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extract. -2.75, 5.45, 32.26 and 42.72%.
  • the number of CD45 + cells in the bone marrow showed 87.18% change compared to the normal medium control group, and in the group of Palmultang, Samchulgeonbi-tang, Astragalus, Deer Antler, and Angelica extract 200mg / kg, 31.35, compared with the hG-CSF control group, respectively. 3.02, -2.68, 15.47 and 26.58% change.
  • Table 8 shows the histopathological changes of the spleen and femur bone marrow according to the eight groups.
  • the hG-CSF control group was recognized by the presence of significant infiltration of nucleated cells in the splenic red medulla.
  • Significant (p ⁇ 0.01) increase in spleen total thickness and nucleated cells in the red medulla per unit area were observed compared to the normal media control, but the number and diameter of the white medulla were observed similar to the normal media control.
  • FIG. 8 is a photograph showing the total thickness of the spleen and the number of nucleated cells in the red and white medulla per unit area.
  • p ⁇ 0.01 total spleen thickness
  • nucleated cells in the red medulla per unit area were observed compared to the hG-CSF control group, but the Samchul-gunbitang-administered group.
  • Significant (p ⁇ 0.01) increase in total spleen thickness was observed in hG-CSF control group, and no significant histopathological changes of spleen were observed in Astragalus and antler groups compared to hG-CSF control group.
  • the total thickness of the spleen in the hG-CSF control group was 17.47% compared to the normal media control group, and -12.02, 10.72 compared to the hG-CSF control group in the 200 mg / kg group of Palmul-tang, Samchul-gunbi-tang, Astragalus, and Antler. , -0.48, 7.81 and -9.75%.
  • the mean diameter of splenic white medulla was 4.17% compared to that of the normal medium control group, and Palmul-tang, Samchul-gunbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extract 200mg / kg, respectively, were 3.09 , 1.34, 0.77, 1.96 and -1.26%.
  • the number of nucleated cells per unit area of splenic red medulla was 714.75% compared to that of the normal medium control group, and 200 mg / kg of Palmul-tang, Samchul-gunbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extract, respectively. Compared with -29.76, 6.39, 12.76, -1.55 and -35.21%.
  • the number of nucleated cells per unit area of the femoral bone marrow showed 357.02% change compared to the normal media control group. Changes of -2.75, -5.02, -9.79, 7.40 and -9.68%.
  • Table 9 shows the CD34 and CD45 immunoreactive cell numbers in the spleen and bone marrow for the seven groups.
  • the number of CD34 immune-responsive cells in the spleen was 713.41% compared to that of the normal medium control group. Changes of 30.88, 3.22, 10.04, -5.92 and 20.39%.
  • the number of CD34 immune-responsive cells in the bone marrow showed a change of 305.26% compared to the normal media control group, and in the 200 mg / kg group of Palmultang, Samchulgunbi-tang, Astragalus, Deer Antler and Angelica extract, respectively, 60.61, -10.61, 6.93, -8.87 and 75.32%.
  • the antler extract-administered group showed a significant increase in the number of (p ⁇ 0.01) splenic CD45 immune-responsive cells compared to the hG-CSF control group, but CD45 immune-responsive cells in bone marrow were observed similar to the hG-CSF control group. No significant change in CD45 + cells in the blood and bone marrow was observed in the Astragalus extract-administered group compared to the hG-CSF control group.
  • the number of CD45 immune-responsive cells in the spleen showed a change of 575.95% compared to the normal medium control group. 33.51, -0.99, 7.91, 57.76 and 52.36%.
  • the number of CD45 immune-responsive cells in the bone marrow showed a change of 808.94% compared to the normal medium control group. 50.61, 7.56, 12.14, 5.84 and 64.94%.
  • Examples 2-7 showed that the administration of hG-CSF resulted in a significant increase in spleen weight, an increase in the total number of blood and bone marrow nucleated cells, and an increase in the number of CD34 + and CD45 + cells in the blood and bone marrow, Histopathologically, the total thickness of spleen, the number of red medulla per unit area, and the number of nucleated cells in the femur bone marrow were recognized, respectively.
  • Angelica extract is expected to provide a new method of oriental medicine that is very useful for increasing the mobilization effect of bone marrow-derived stem cells of hG-CSF and reducing side effects such as splenomegaly.

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Abstract

본 발명은 당귀 추출물를 이용하여 골수유래 줄기세포의 증식을 촉진시키는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor)를 개체에 투여하고, 상기 개체에 당귀 추출물을 투여하여 골수유래 줄기세포의 증식을 촉진시키는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은, 줄기세포의 증식 및 분화를 위해 G-CSF만을 단독투여 했던 방법에 의해 야기되었던 비장종대와 같은 부작용을 해결하여, 당귀 추출물의 병용투여로 현저히 완화시켰으며, 줄기세포의 증식 및 분화를 보다 촉진시키는 효과가 있다.

Description

당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물
본 발명은 당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아, 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 여러 가지 줄기세포 중 혈중 성체줄기세포(adult stem cell)라 함은 골수 유래의 세포로, 인체의 장기와 혈액을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포들을 지칭한다.
그중, 골수유래 줄기세포는 혈액암, 림프종, 및 골수부전 등의 질병의 궁극적인 치료수단으로 여겨지고 있다. 현재 다양한 목적으로 골수 유래 줄기세포의 이식이 수행되고 있고, 특히 말기 신장 및 간 환자에서 장기 이식이 어려운 경우, 자가 골수 유래 줄기세포를 이식함으로써, 간 및 신장의 재생을 촉진하는 방법이 시도되고 있다.
자가 골수 유래 줄기세포를 이식한 후, 분화 및 분열을 촉진하기 위해, 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자 (Human Granulocyte colony-stimulating factor, hG-CSF)를 전 투여하고 있다. 그러나, 대략 5~30%의 환자에서 줄기세포의 증식 또는 혈액으로의 mobilization이 일어나지 않고, hG-CSF의 투여에 의해, 심장 경색, 뇌졸중, 발열, 골통, 비장 종대 (splenomegaly) 및 파열 등 다양한 부작용이 알려져 있으며(Masood et al., 2008; Fox et al., 2009), 특히 고 비용으로 그 사용이 제한되고 있다. 따라서 hG-CSF의 골수유래 줄기세포의 증식 효과를 촉진하거나, 부작용을 경감 시킬 수 있는 새로운 대체 수단이 요구되고 있는 실정이다.
당귀(當歸)는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 다년생 초본인 안젤리카 기가스(Angelica gigas NAKAI), 안젤리카 시넨시스(A. sinensis DIELS), 안젤리카 아쿠틸로바(A. acutiloba KITAG.) 및 동속 근연식물의 뿌리를 건조한 것으로서, 보혈화혈(補血和血), 조경지통(調經止痛), 윤조활장(潤燥滑腸)의 효능을 가진다고 알려져 있다. 뿌리는 진정작용, 진경작용, 혈압내림작용 등이 있고, 뿌리정유의 수용액을 관절염에 쓰면 진통작용과 소염작용이 있다고 하며, 한방에서는 빈혈증, 부인병, 임산부의 산후 회복에 주로 쓰이며 이 밖에도 심한 기침, 부스럼 등에 쓰인다. 한편, 국내 공개특허 2012-0092754호에는 한약재인 구절초를 이용하여 줄기세포를 분화 촉진하는 내용에 대해서 개시한 바 있으나, 당귀 추출물을 이용하여 "골수 유래" 줄기세포 분화를 촉진시킨 예는 없다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 요구를 해결하기 위해 안출된 것으로, 당귀 추출물를 이용하여 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor) 및 당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 자극인자 및 당귀 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 자극인자 및 당귀 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 구현예에 있어서, 상기 당귀 추출물 투여기간은 상기 자극인자 투여 후 30분 이내에 시작되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 제공하는 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물은, 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자(hG-CSF)와 당귀 추출물을 포함하는 것으로, 줄기세포의 이식 전에 투여되어, 줄기세포의 증식 및 분화를 촉진하는 효과가 있다.
또한, 본 발명의 조성물은, 줄기세포의 증식 및 분화 촉진을 위해 hG-SCSF를 투여하여 줄기세포의 증식을 유도할 경우, 심근경색, 뇌졸중, 발열, 골통, 비장종대 및 파열등의 부작용을 가지고 있었던 종래 기술상의 문제를 해결할 수 있는 새로운 대체 수단으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 hG-CSF의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질 투여에 의해 변화되는 마우스의 체중 및 증체량의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장의 크기를 확인한 결과를 나타낸 도면이다(A: 무처리, B: hG-CSF, C: 팔물탕+hG-CSF, D: 삼출건비탕+hG-CSF, E: 황기+hG-CSF, F: 녹용+hG-CSF, 및 G:당귀+hG-CSF).
도 4 및 도 5는 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 CD34+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타낸 도면이다(A: 무처리, B: hG-CSF, C: 팔물탕+hG-CSF, D:삼출건비탕+hG-CSF, E: 황기+hG-CSF, F: 녹용+hG-CSF, 및 G:당귀+hG-CSF).
도 6 및 도 7은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 CD45+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타낸 도면이다(A: 무처리, B: hG-CSF, C:팔물탕+hG-CSF, D: 삼출건비탕+hG-CSF, E: 황기+hG-CSF, F: 녹용+hG-CSF, 및 G:당귀+hG-CSF).
도 8은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장의 전체 두께 및 단위 면적당 적색 수질 및 백색수질 내 유핵세포를 관찰하여 나타낸 도면이다(A~C: 무처리, D~F: hG-CSF, G~I: 팔물탕+hG-CSF, J~L: 삼출건비탕+hG-CSF, M~O: 황기+hG-CSF, P~R: 녹용+hG-CSF, 및 S~U: 당귀+hG-CSF).
도 9는 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장 및 골수의 CD34 면역반응세포의 수적 증가를 관찰하여 나타낸 도면이다(A~B: 무처리, C~D: hG-CSF, E~F: 팔물탕+hG-CSF, G~H: 삼출건비탕+hG-CSF, I~J: 황기+hG-CSF, K~L: 녹용+hG-CSF, 및 M~N: 당귀+hG-CSF).
도 10은 hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질을 투여한 마우스의 비장 및 골수의 CD45 면역반응세포의 수적 증가를 관찰하여 나타낸 도면이다(A~D: 무처리, E~H: hG-CSF, I~L: 팔물탕+hG-CSF, M~P: 삼출건비탕+hG-CSF, Q~T: 황기+hG-CSF, U~X: 녹용+hG-CSF, 및 Y~AB: 당귀+hG-CSF).
본 발명자들은 골수 유래 줄기세포를 이식한 후 분화 및 분열을 촉진하기 위해 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자를 투여할 경우 나타나는 여러가지 부작용들을 완화시킬 수 있으면서도, 골수 유래 줄기세포의 생산을 보다 증가시킬 수 있는 조성물을 개발하고자, 한약재에 주목하게 되었고, 상기 한약재 중 당귀에 뛰어난 줄기세포 증식 및 분화 촉진 효과가 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor) 및 당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 자극인자 및 당귀 추출물은 사전에 혼합되어 제형화 되거나, 별도로 제형화 될 수 있다.
상기 당귀 추출물의 투여 기간은 상기 과립백혈구 집락 자극인자의 투여 후 30분 이내에 수행될 수 있고, 바람직하게는 15분 이내에 수행되어야 하며, 가장 바람직하게는 5분 이내에 수행되는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 과립백혈구 집락 자극인자는 사람 재조합 과립백혈구 집락 자극인자(Human Granulocyte colony-stimulating factor)인 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 과립백혈구 집락 자극인자 및 당귀 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여될 수 있다. 상기 당귀 추출물은 경구 투여되는 것이 바람직하나, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 및 기간 등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에서 ‘개체’ 란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유동물을 의미한다.
또한, 본 발명은 당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포의 생산을 증가시키는 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 300 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 200 mg/체중kg으로 투여한다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 당귀 추출물을 hG-CSF 투여 후에 경구 투여한 결과, 당귀 추출물의 5분이내 병용 경구투여에 의해 비장 종대를 완화시킬 수 있다는 것을 확인하였고(실험예 2 참조), 적색 수질내 유핵세포의 증생에 의한 비장 중량 증가 및 비장 종대 소견은 유의성 있게 (p<0.01) 억제되었으며, 전체적인 과립백혈구의 증생에는 별 다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었고(실험예 3 참조), hG-CSF에 의한 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization은 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었다(실험예 4 참조).
따라서, 본 발명의 당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 조성물은 골수 유래 줄기세포의 생산을 증가시킬 수 있는 동시에, 기존에 G-CSF를 단독투여하였을 경우에 야기되었던 여러 가지 부작용들을 완화시킬 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 실시예에서는 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀가 hG-CSF의 약효 및 부작용, 특히 줄기세포 mobilization 및 비장종대에 미치는 영향을 hG-CSF에 의한 줄기세포 mobilization에 흔히 사용되고 있는 Balb/c 마우스를 이용하여 평가하였다.
실시예 1. 실험준비
1-1. 재료준비
hG-CSF는 Life Technologies(Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였으며, 그 구조를 도 1에 나타내었다.
팔물탕(PMT)은 한중제약(Daejeon, Korea)으로부터 구매하여 사용하였고, 그 성분과 양은 하기 표 1과 같다.
표 1
Herbs Scientific Names/ Produce Region Amounts (g)
Angelicae Gigantis Radix Angelica gigas N. 2.46
Atractylodis Rhizoma Atractylodes ovata (Thunb.) DC. 2.46
Cnidii Rhizoma Cnidium officinale Makino 2.26
Ginseng Radix Alba Panax ginseng C.A.Meyer. 1.6
Glycyrrhizae Radix Glycyrrhiza uralensis Fisch 1.8
Hoelen Poria cocos Wolf 0.13
Paeoniae Radix Paeonia lactiflora Pall. 1.8
Rehmanniae Radix Preparata Rehmannia glutinosa Liboschitz ex Steudel 3.33
Total 8 types 15.84
당귀의 효과와 비교하기 위한 약재로 팔물탕, 삼출건비탕(SCGBT), 황기, 및 녹용을 선택하여 비교하였다. 상기 약재 중 삼출건비탕의 성분과 양은 표 2에 나타내었다.
표 2
Herbs Scientific Names/ Produce Region Amounts (g)
Amomi Fructus Amomum xanthioides Wallich 0.16
Atractylodis Rhizoma Alba Atractylodes ovata (Thunb.) DC. 0.98
Citri Unshii Pericarpium Citrus unshiu S.Marcov. 0.85
Ginseng Radix Alba Panax ginseng C.A.Meyer. 0.64
Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Glycyrrhiza uralensis Fisch 0.36
Hawthorn Fruit(Crataegi Fructus) Crataegus pinnatifida Bunge var. typica Schneider 0.93
Hordei Fructus Germiniatus Hordeum vulgare Linn. 0.34
Zizyphi Fructus Zizyphus jujuba var. inermis (Bunge) Rehder 4.17
Magnoliae Cortex Magnolia officinalis Rehder et Wilson 0.21
Massa Medicata Fermentata Triticum aestivum L. 0.67
Paeoniae Radix Paeonia lactiflora Pall. 0.54
Ponciri Fructus Poncirus trifoliata 0.58
Hoelen Poria cocos Wolf 0.05
Zingiberis Rhizoma Crudus Zingiber officinale Roscoe 0.26
Total 14 types 10.74
1-2 실험 동물 준비
본 실시예에서는 실험 동물로 Balb/c CrSlc 마우스 (6주령 암컷, SLC, Shizuoka, Japan)를 선택하여 사용하였다. 7마리의 건강한 SPF Balb/c 마우스를 입수하여, 34일 간 순화시킨 다음, 체중이 일정한 실험동물만 군당 10 마리씩 선정하여, 하기 표 3과 같이 7개의 군으로 나누어 실험에 사용하였다. 모든 실험 동물들은 hG-CSF 및 약물 투여시작일과 최종 부검일 전 각각 18시간(overnight) 절식을 실시하였으며(음수는 자유롭게 공급), picric acid로 개체를 식별하였다.
표 3
Group Inducer Test substances and dose (mg/kg/day) Animal No.
GCSF-2012-PD: Effects on the hG-CSF-treated mice
Control Saline 10ml/kg Distilled water oral 10ml/kg [Intact vehicle] M01~M10
Control hG-CSF 250μg/kg Distilled water oral 10ml/kg [hG-CSF] M11~M20
Active hG-CSF 250μg/kg PMT oral (200mg/kg) [PMT] M21~M30
Active hG-CSF 250μg/kg SCGBT oral (200mg/kg) [SCGBT] M31~M40
Active hG-CSF 250μg/kg AR oral (200mg/kg) [AR] M41~M50
Active hG-CSF 250μg/kg CCP oral (200mg/kg) [CCP] M51~M60
Active hG-CSF 250μg/kg AGR oral (200mg/kg) [AGR] M61~M70
1-3. 투여방법
hG-CSF 및 후보 약물의 투여
이전의 방법들(Verma et al., 1997; Levesque et al., 2003)에 따라 hG-CSF(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 250 μg/kg을 매일 1회씩 6일간 연속 피하투여하여, 백혈구의 증식 및 골수유래 줄기세포의 mobilization을 촉진하고, hG-CSF 투여 5분 이내에 각각 200mg/kg의 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물을 매일 1회씩 6일간 경구 투여하였다. 모든 5종의 천연물 유래 추출물은 멸균 증류수에 용해시켜 동물 체중 kg 당 10ml의 용량으로 금속제 zonde가 부착된 1mL 주사기(syringe)를 이용하여 강제 경구투여 하였으며, hG-CSF 는 생리식염수에 용해시켜 등쪽 피하부위에 10 ml/kg의 용량으로 피하투여 하였다. hG-CSF 대조군에서는 천연물 유래 추출물 투여대신 동일한 용량의 멸균 증류수만 투여하였으며, 정상 매체 대조군에서는 hG-CSF 및 천연물 유래 추출물 대신 각각 동일한 용량의 생리식염수와 멸균증류수를 5분 간격으로 피하 및 경구 투여하였다. 본 실험에 사용한 천연물 유래 추출물의 투여 용량 즉, 200mg/kg은 각각의 동물실험 결과를 바탕으로 선정하였다.
1-4. 관찰항목
체중 및 비장 중량의 변화, 골수 유핵세포 및 혈중 백혈구 총수와 함께 대표적인 골수 유래 줄기세포 표지 marker인 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수를 Fluoresence Activated Cell sorter (FACs) 방법으로 골수 및 혈액내에서 관찰하였다. 또한 비장 및 골수의 조직표본에서 단위 면적당 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수를 면역조직화학적 방법으로 관찰하였으며, 비장의 전체 두께, 백색 수질의 수 및 직경, 단위 면적당 비장 적색 수질 및 골수내 유핵세포 수 역시 자동영상분석장치 (iSolution FL ver 9.1, IMT i-solution Inc., Quebec, Canada)를 이용하여 평가하였다. 보다 명확한 변화를 관찰하기 위하여, 정상 매체 대조군과 hG-CSF 대조군과의 % change 및 각각의 천연물 유래 추출물 투여군과 hG-CSF 대조군과의 % change를 산출하여, 비교하였다.
실시예 2. 체중 및 증체량의 변화 확인
상기 관찰 결과, 체중 및 증체량의 변화를 측정하여 표 4와 도 2에 도시하였다. 도 2에서 확인할 수 있는 것과 같이, 정상 매체 대조군과 비교하여, hG-CSF 또는 천연물 유래 후보물질 투여와 관련된 의미 있는 체중 및 증체량의 변화는 실험 전 기간 동안 인정되지 않았다.
표 4
Groups Body weight(g) Body weight gains (g) during treatment [B-A]
At first treatment [A] Sacrifice [B]
Controls
Intact vehicle 16.24±0.63 17.19±0.56 0.95±0.44
hG-CSF 16.10±0.68 17.24±0.79 1.14±0.36
Natural extract orally co-administered
PMT 16.19±0.51 17.20±1.06 1.01±0.76
SCGBT 16.27±0.93 17.41±0.78 1.14±0.55
AR 16.37±0.89 17.31±0.79 0.94±0.51
CCP 16.10±0.71 17.20±1.16 1.10±0.51
AGR 16.48±1.15 17.67±1.27 1.19±0.57
Values are expressed mean ± S.D. of 10 mice
하지만, hG-CSF 대조군에서는 6일간의 실험 전 기간 동안의 증체량이 정상 매체 대조군에 비해 20.00%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -11.40, 0.00, -17.54, -3.51 및 4.39%의 변화를 나타내었다.
실시예 3. 비장 중량의 변화 확인
본 실험예에서 관찰한 비장 중량의 변화량을 하기 표 5에 나타내었다. hG-CSF 대조군에서는 현저한 비장 종대(splenomegaly)에 따른 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 체중에 대한 상대 중량의 증가가 인정되었고, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 중량의 감소가 각각 인정되었다.
표 5
Groups Spleen weights
Absolute (g) Relative (% of body weight)
Controls
Intact vehicle 0.066±0.005 0.384±0.018
hG-CSF 0.132±0.012a 0.768±0.090a
Natural extract orally co-administered
PMT 0.104±0.008ab 0.608±0.064ab
SCGBT 0.139±0.019a 0.803±0.128a
AR 0.125±0.011a 0.721±0.050a
CCP 0.150±0.018ac 0.871±0.085ac
AGR 0.109±0.008ab 0.618±0.061ab
또한, 도 3에 나타낸 것과 같이, 비장의 크기를 눈으로 확인해본 결과, 정상매체 대조군과 비교하여 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군의 크기는 감소되어있는 것을 확인하였다.
한편 녹용 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 비장 절대 및 상대 중량의 증가가 인정되었으며, 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 비장 중량의 변화는 각각 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 절대 중량이 정상 매체 대조군에 비해 99.55%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -21.08, 5.61, -5.38, 13.65 및 -17.51%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 상대 중량이 정상 매체 대조군에 비해 99.81%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -20.85, 4.57, -6.13, 13.46 및 -19.46%의 변화를 나타내었다.
상기 결과들을 통해, G-CSF와 당귀 추출물의 병용투여가 G-CSF에 의한 부작용인 비장종대를 완화시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4. 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포의 수적 확인
본 실험예에서는 혈액 백혈구(Blood leukocytes) 및 골수 유핵세포(Bone marrow nuclear cells)의 수적 변화를 관찰하여 표 6에 그 결과를 나타내었다.
표 6
Groups Total Cell Counts
Blood leukocytes (×103cells/μl) Bone marrow nuclear cells (×104cells/μl)
Controls
Intact vehicle 5.06±2.00 47.10±20.93
hG-CSF 53.40±22.63a 457.90±129.50c
Natural extract orally co-administered
PMT 55.50±17.92a 440.80±115.78c
SCGBT 47.70±13.34a 444.10±105.38c
AR 52.50±11.74a 431.90±127.46c
CCP 73.00±12.94ab 590.10±134.67c
AGR 57.10±16.93a 444.80±92.76c
hG-CSF 대조군에서는 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총 수의 증가가 인정되었으나, hG-CSF 대조군에 비해 현저한 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총수의 증가가 녹용 병용투여군에서 인정된 이외에 의미 있는 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총 수의 변화는 모든 천연물 추출물 병용 투여군에서 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 혈액 백혈구 총수는 정상 매체 대조군에 비해 955.34%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 3.93, -10.67, -1.69, 36.70 및 6.93%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수 유핵세포 총수가 정상 매체 대조군에 비해 872.19%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -3.73, -3.01, -5.68, 28.87 및 -2.86%의 변화를 나타내었다.
따라서, hG-CSF 대조군과 비교할 때, 당귀 추출물을 투여한 경우 혈액 백혈구 및 골수 유핵세포 총수가 증가하는 것은 아니었으나, 비슷한 증가 수준을 유지할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 5. FACs 결과: 혈액 및 골수 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수적 변화 확인
혈액 및 골수 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수적 변화를 FACs(Fluoresence Activated Cell sorter) 방법으로 관찰하여 표 7에 그 결과를 나타내었다.
표 7
Groups Blood leukocytes Bone marrow nuclear cells
CD34+ cells (×102cells/μl) CD45+ cells (×102cells/μl) CD34+ cells (×102cells/μl) CD45+ cells (×102cells/μl)
Controls
Intact vehicle 7.93±1.05 10.41±1.47 16.60±3.76 13.16±2.32
hG-CSF 26.81±6.02a 42.94±8.62a 30.41±6.69a 24.63±3.82a
Natural extract orally co-administered
PMT 43.40±5.46ab 61.99±3.32ab 45.09±5.83ab 32.35±1.77ab
SCGBT 22.14±5.46a 41.76±6.09a 31.21±1.60a 25.37±2.47a
AR 25.10±6.36a 45.28±8.58a 32.42±3.31a 23.97±2.46a
CCP 40.66±2.59ab 56.79±6.14ab 40.44±1.13ab 28.44±4.73a
AGR 41.25±6.00a 61.28±7.68ab 44.34±3.59ab 31.17±2.59ab
Values are expressed mean ± S.D. of 5 mice
5.1. 혈액 및 골수 CD34+ 세포의 수적변화
도 4 및 5에 CD34+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타내었다. 표 7과 함께 그 결과를 살펴보면, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 및 골수 CD34+ 세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕, 녹용 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 및 골수내 CD34+ 세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액 및 골수 내 CD34+ 세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 혈액내 CD34+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 238.08%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 61.89, -17.41, -6.39, 51.65 및 53.85%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD34+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 83.14%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 48.29, 2.64, 6.62, 33.00 및 45.80%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 통해, G-CSF를 단독 투여한 경우와 비교하여, 당귀 추출물을 병용투여할 경우 혈액과 골수 내의 CD34+ 세포의 수가 크게 증가한다는 점을 확인하였다.
5.2. 혈액 및 골수 CD45+ 세포의 수적변화
도 6 및 7에 CD45+ 세포의 FAC 관찰 결과를 나타내었다. 표 7과 함께 그 결과를 살펴보면, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 혈액 및 골수 CD45+ 세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕, 녹용 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 현저한 혈액 및 골수내 CD45+ 세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액 및 골수 내 CD45+ 세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 혈액내 CD45+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 312.39%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 44.38, -2.75, 5.45, 32.26 및 42.72%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD45+ 세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 87.18%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 31.35, 3.02, -2.68, 15.47 및 26.58%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 통해, G-CSF를 단독 투여한 경우와 비교하여, 당귀 추출물을 병용투여할 경우 혈액과 골수 내의 CD45+ 세포의 수가 크게 증가한다는 점을 확인하였다.
따라서, 실험예 5.1 및 5.2 결과를 볼 때, 당귀 추출물의 병용투여는 골수유래 줄기세포의 증식을 현저하게 증가시킨다는 점을 확인할 수 있다.
실시예 6. 조직병리학적 변화 확인
하기 표 8에 8개의 군에 따라 비장(spleen)과 대퇴골 골수(bone marrow)의 조직병리학적 변화를 관찰하여 그 값을 나타내었다.
표 8
Groups Spleen Bone marrow
Total thickness (mm/central regions) Number of white pulp (white pulps/mm2) Mean diameters of white pulp (μm/white pulp) Mean number of red pulp nuclear cells(×102cells/ mm2) Mean number of nuclear cells (×102cells/ mm2)
Controls
Intact vehicle 1.58±1.16 14.50±2.37 459.22±98.51 3.34±0.80 16.30±2.26
hG-CSF 1.86±0.12a 14.60±1.84 478.38±70.00 27.18±5.19a 74.51±18.28a
Natural extract orally co-administered
PMT 1.63±0.07b 14.10±2.33 493.19±68.93 19.09±2.44ab 72.46±11.54a
SCGBT 2.06±0.16ab 14.00±2.98 484.79±84.57 28.92±5.91a 70.77±11.22a
AR 1.85±0.18a 14.80±1.75 482.04±116.86 30.65±6.14a 67.22±10.57a
CCP 2.00±0.34a 14.90±2.60 487.78±65.78 26.76±3.43a 80.03±12.18a
AGR 1.68±0.14b 14.60±2.01 472.34±65.60 17.61±3.18ab 67.30±11.77a
Values are expressed mean ± S.D. of 10 mice
6.1. 비장의 조직병리학적 변화
상기 표 8에서 볼 수 있는 것과 같이, hG-CSF 대조군에서는 현저한 비장 적색 수질내 유핵세포의 침윤에 의한 종대소견이 인정되었다. 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 전체 두께 및 단위 면적당 적색수질 내 유핵세포의 증가가 각각 인정되었으나, 백색수질의 수 및 직경은 정상 매체 대조군과 유사하게 관찰되었다.
도 8는 비장의 전체 두께 및 단위 면적당 적색수질 및 백색수질 내 유핵세포 수를 나타낸 사진이다. 도 8에서 볼 수 있는 것과 같이, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 전체 두께 및 단위 면적당 적색수질내 유핵세포의 감소가 각각 인정되었으나, 삼출건비탕 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 전체 두께 증가가 인정되었고, 황기 및 녹용 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 비장의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 전체 두께가 정상 매체 대조군에 비해 17.47%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -12.02, 10.72, -0.48, 7.81 및 -9.75%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 백색 수질의 수가 정상 매체 대조군에 비해 0.69%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -3.42, -4.11, 1.37, 2.05 및 0.00%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 백색 수질의 평균 직경이 정상 매체 대조군에 비해 4.17%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 3.09, 1.34, 0.77, 1.96 및 -1.26%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 비장 적색 수질 단위 면적당 유핵세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 714.75%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -29.76, 6.39, 12.76, -1.55 및 -35.21%의 변화를 나타내었다.
6.2. 대퇴골 골수의 조직병리학적 변화
상기 표 8에서 볼 수 있는 것과 같이, hG-CSF 대조군에서는 현저한 과립백혈구의 증생이 인정되었다. 도 9에 나타낸 것과 같이, 결과적으로 정상 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 골수 단위 면적당 유핵세포의 증가가 인정되었으나, 모든 천연물 유래 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 대퇴골 골수의 조직병리학적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 대퇴골 골수 단위 면적당 유핵세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 357.02%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 -2.75, -5.02, -9.79, 7.40 및 -9.68%의 변화를 나타내었다.
상기 실험예 5.1 및 5.2를 통해, 당귀의 병용투여는 G-CSF 단독투여에 의한 비장종대와 같은 부작용을 예방하는 동시에, 백혈구를 증가시킬 수 있는 효과가 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 7. 면역조직화학적 변화 확인
하기 표 9에 7개 군에 대한 비장 및 골수에서의 CD34 및 CD45 면역반응 세포 수를 나타내었다.
표 9
Groups Spleen immunoreactive cell numbers (cells/mm2) Bone marrow immunoreactive cell numbers (cells/mm2)
CD34+ CD45+ CD34+ CD45+
Controls
Intact vehicle 16.40±2.72 44.90±15.04 11.40±3.92 35.80±11.86
hG-CSF 133.40±20.30c 303.50±79.69c 46.20±9.74c 325.40±98.79a
Natural extract orally co-administered
PMT 174.60±18.35cd 405.20±64.22cd 74.20±10.88cd 490.10±112.39ab
SCGBT 137.70±20.82c 300.50±70.36c 41.30±6.13c 350.00±70.41a
AR 146.80±14.77c 327.50±46.42c 49.40±8.83c 364.90±116.30a
CCP 125.50±13.74c 478.80±111.65cd 42.20±6.98c 344.40±102.18a
AGR 160.60±14.21cd 462.40±80.42cd 81.00±19.10cd 536.70±82.72ab
Values are expressed mean ± S.D. of 10 mice
7.1. 비장 및 골수 CD34 면역반응세포의 수적변화
표 9 및 도 9에서 볼 수 있는 것과 같이, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수 CD34 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수내 CD34 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 삼출건비탕, 녹용 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 비장 및 골수 내 다위 면적당 CD34 면역반응세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장내 CD34 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 713.41%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 30.88, 3.22, 10.04, -5.92 및 20.39%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD34 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 305.26%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 60.61, -10.61, 6.93, -8.87 및 75.32%의 변화를 나타내었다.
7.2. 비장 및 골수 CD45 면역반응세포의 수적변화
표 9 및 도 10에서 볼 수 있는 것과 같이, 정상 매체 대조군에 비해 hG-CSF 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었으며, 팔물탕 및 당귀 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군에 비해서도 유의성 있는 (p<0.01) 비장 및 골수내 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었다. 한편 녹용 추출물 투여군에서도 hG-CSF 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비장 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 인정되었으나, 골수내 CD45 면역반응세포는 hG-CSF 대조군과 유사하게 관찰되었고, 삼출건비탕 및 황기 추출물 투여군에서는 hG-CSF 대조군과 비교하여 의미 있는 혈액 및 골수 내 CD45+ 세포의 수적 변화는 인정되지 않았다.
hG-CSF 대조군에서는 비장내 CD45 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 575.95%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 33.51, -0.99, 7.91, 57.76 및 52.36%의 변화를 나타내었다.
hG-CSF 대조군에서는 골수내 CD45 면역반응세포의 수가 정상 매체 대조군에 비해 808.94%의 변화를 나타내었으며, 팔물탕, 삼출건비탕, 황기, 녹용 및 당귀 추출물 200mg/kg 투여군에서는 각각 hG-CSF 대조군에 비해 50.61, 7.56, 12.14, 5.84 및 64.94%의 변화를 나타내었다.
상기 결과를 통해, 당귀 추출물의 병용투여가 면역반응 세포의 수를 G-CSF를 단독 투여할 경우 보다 크게 증대시킬 수 있다는 것을 확인하였다.
상기 실시예 2 내지 7의 결과를 종합하면, hG-CSF 투여에 의해 현저한 비장 중량의 증가, 혈액 및 골수 유핵 세포 총 수의 증가와 함께 혈액 및 골수 내 CD34+ 및 CD45+ 세포의 수적 증가가 인정되었으며, 조직병리학적으로 비장 전체 두께, 단위 면적당 적색 수질 및 대퇴골 골수 내 유핵세포의 수적 증가가 각각 인정되었고, 면역조직화학적으로 비장 및 골수 내 CD34 및 CD45 면역반응세포의 수적 증가가 각각 인정되었다.
따라서 당귀 추출물의 5분 이내 병용 경구투여에 의해 hG-CSF에 의한 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization은 유의성 있게 (p<0.01) 증가되었고, 적색 수질내 유핵세포의 증생에 의한 비장 중량 증가 및 비장 종대 소견은 유의성 있게 (p<0.01) 억제되었으며, 전체적인 과립백혈구의 증생에는 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
한편 녹용 추출물 투여군에서도 현저한 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization이 인정되었으나, 비장 종대 소견은 오히려 악화시키는 것으로 관찰되었고, 삼출건비탕과 황기 추출물의 병용 투여는 hG-CSF의 과립백혈구 및 골수 유래 줄기 세포의 증생과 mobilization 효과에 별다른 영향을 미치지 않았으며, 비장 종대와 같은 부작용에도 별다른 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었다.
따라서 당귀 추출물은 hG-CSF의 골수 유래 줄기세포의 mobilization 효과 증가 및 비장 종대와 같은 부작용 경감에 매우 유용한 새로운 양한방 협진 방법을 제공해 줄 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (4)

  1. 과립백혈구 집락 자극인자(Granulocyte colony-stimulating factor) 및 당귀 추출물을 포함하는 골수유래 줄기세포 증식 촉진용 약학 조성물로, 상기 줄기세포는 CD34+ 세포인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 자극인자 및 당귀 추출물은 사전에 혼합되어 제형화되거나, 별도로 제형화 되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 자극인자 및 당귀 추출물은 비경구, 경구, 부위한정(locoregionally), 또는 경피적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 당귀 추출물 투여기간은 상기 자극인자 투여 후 30분 이내에 시작되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
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