WO2014114530A1 - Verfahren zum anreichern und vereinzeln von zellen mit konzentrationen über mehrere logarithmische stufen - Google Patents

Verfahren zum anreichern und vereinzeln von zellen mit konzentrationen über mehrere logarithmische stufen Download PDF

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cells
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concentration
cell
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Michael Johannes Helou
Lukas RICHTER
Oliver Hayden
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Siemens Aktiengesellschaft
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Definitions

  • the present invention relates to magnetic flow cytometry.
  • the problem to be solved is the provision of a device and a method by means of which a cytometric measurement, eg determination of the concentration of cell samples, can be carried out faster and at low risk of contamination.
  • a cytometric measurement eg determination of the concentration of cell samples
  • the object is achieved by the device according to the invention for flow cytometric measurement according to the patent claim 1.
  • the object of the inventive method according to claim 10 is achieved.
  • the invention is based on the idea of carrying out several enrichment steps within a closed system. This is made possible by the constructional design of a channel of the device according to the invention and the use of a deflection device in the channel.
  • the invention allows a targeted enrichment and separation of cells with concentrations over several orders of magnitude (of, for example, 10 to 10,000 cells / microliter). Above all, the invention makes it possible to measure several orders of magnitude of possible cell concentrations in a single measurement process. Even with limited dynamics of the counter may be as a large dynamic range in a single microfluidic channel ask ⁇ covers within a complex sample without the need of previous dilution, isolation or enrichment steps.
  • the device according to the invention for flow cytometric measurement comprises a chamber and the channel, wherein the channel comprises a magnetic sensor and is arranged downstream of the chamber.
  • the chamber and channel form a closed system with an axis of the channel extending along a flow direction of the channel.
  • a closed system exists when the chamber passes directly into the channel.
  • the device is characterized by a magnet, in particular a permanent magnet, and a deflection device, both of which are arranged on a predetermined side of the channel.
  • the Umlenkeinrich ⁇ tion on at least one segment. Each segment is located in a concentration range of the channel. Each segment has means for guiding cells toward the axis.
  • the deflection device thus makes it possible to accumulate magnetically marked cells, which have been pulled onto the channel side by the magnet in the respective concentration range, on the axis and to guide these cells along the axis to the magnetic sensor.
  • the above object is also solved by the Invention ⁇ process according to enrich for cells of an animal to be detected ones of the cell type of a cell sample for a fürtikzyto- geometry. Initially, magnetically labeled cells of the cell type to be detected are provided. The labeled cells are enriched in the channel of an embodiment of the device according to the invention. For this purpose, the marked cells are pulled by the magnet in the channel to the predetermined side of the channel.
  • lamina ⁇ rer flow in the channel at least a part of the cells of the deflection on the axis, which extends along the flow direction of the channel, steered and here ⁇ enriched by on the axis.
  • This enables an efficient accumulation of cells.
  • complex samples ie non-purified samples containing a variety of different cells and other particles, such as proteins, can thus be used without intermediate steps, in particular undiluted, for a flow cytometry.
  • the provision of the magnetically labeled cells may include labeling the cells.
  • Two marking variants can be used.
  • the cells to be detected in an incubation step by mixing and / or stirring markers, in particular of at least one specific for de ⁇ tektierenden cell type antibody which is connected to at least one magnetic marker, and the cell sample in be marked in the chamber of the device.
  • Variant is preferably used at small total cell concentrations of up to 10 4 cells / microliter.
  • a magnet arranged on one side of the chamber can assist the mixing and / or stirring process.
  • a magnet is arranged correspondingly on a predetermined side of the chamber, which supports the mixing and / or stirring process.
  • the at least one antibody specific for the cell type to be detected which is associated with at least one magnetic marker, can be provided in the channel.
  • the antibody is accumulated on the side of the channel. Thereafter, the introduction of the cell sample in the channel and thus the in-
  • the laminar flows past the side of the Ka ⁇ Nals. This results in a partial labeling of the cells contained in this portion, without dilution or purification steps are necessary.
  • a layered marking of the desired cells is thus achieved.
  • such a partial marking can also be carried out in the chamber by means of the magnet arranged there.
  • the deflection means may comprise one or as a means for guiding of cells in a segment, a plurality of guide elements on ⁇ , for example, form a channel that directs the labeled cells to the axis.
  • at least one segment of the deflection device comprises guide elements arranged as the means for guiding cells but arranged obliquely to the axis. Together or alone, these form at least one in the flow direction tapered funnel shape. This allows the deflection of magnetically labeled cells onto the axis of the channel and thus enrichment.
  • At least one guide element may, for example if it consists wholly or partly of a ferromagnetic material, form in a further embodiment of the device a V-shape tapering in the flow direction, which favors a magnetophoretic guidance of magnetically marked cells.
  • At least two of the guide members may be configured as walls for the cells and staggered along the axis in the flow direction, thereby providing mechanical guidance to the axis by forming bands for the path of movement of the cells.
  • a magnetic web can be arranged along the axis of the channel. This favors the guidance of the magnetically marked cell on the axis of the channel.
  • At least two concentration ranges of the channel are configured differently.
  • a cell sample can thus be enriched in several logarithmic stages. Thus it can be achieved that an enrichment is present, which can be measured with a dynamically limited counter.
  • the at least two concentra ⁇ ons Schemee distinguish opposite side at a predetermined height of the channel between the predetermined page and the predetermined side.
  • a defined volume is determined in each concentration range. Different volumes in different concentration ranges ⁇ effect a first enrichment of the cells by the magnet of the channel before enrichment in the deflecting element, so that a statistically significant and a defined number of cells in each Anrei ⁇ cherungsease is adjustable at a given concentration.
  • the channel width is preferably constant for all concen ⁇ tion areas.
  • the at least two concentration ranges may additionally or alternatively differ by a predetermined width of the deflection device (measured perpendicular to the axis) and / or by a length of the respective segment of the deflection device along the axis of the channel. These dimensions determine the catchment area of the deflection device, thus influencing the degree of enrichment.
  • a cytometry in particular a cell count, is carried out downstream of the deflection device on the axis by means of the magnetic sensor.
  • a concentration for example ⁇ determination of the cell sample.
  • a concentration determination of the cell sample by means of the cytometry downstream of the deflection device preferably comprises the counting of the cells flowing through and enriched on the axis from at least one of the concentration ranges by means of the magnetic sensor.
  • the concentration of the cell sample is determined using the average in counting the enriched cells count value of the concentration range, the Volu ⁇ men of the concentration range, and the width of the segment of the baffle in the concentration range. This is an efficient and time-saving measurement whose evaluation is quickly available.
  • at least the concentration range is selected, for which a count value results which is large enough for a statistically relevant statement and smaller than the maximum counting rate that can be reliably detected by the counter.
  • the respective concentration range, to which a count is determined based on a determined time ⁇ point of the counting of the magnetic sensor determined. In a calibrated device, an assignment of time intervals to the concentration range can thus take place. Under certain circumstances, the flow rate must be considered.
  • FIG. 1 shows a sketch of an embodiment of a device according to Inventive ⁇ in cross-section
  • FIG. 1A shows a schematic cross section and the figure 1B shows a schematic on the channel
  • FIG 3A shows a perspective view of a deflection with mecha African leadership
  • FIG 3B and FIG 3C shows schematic plan views of each one um ⁇ steering device with magnetophoretic guidance
  • a sketch illustrating the enrichment of the cells is illustrated in one embodiment of a method according to the invention in a channel where ⁇ 5A shows a plan view of the channel at a time and FIG. 5B shows a plan view of a segment of the deflection device at different times, and
  • FIG 6 shows a sketch in which the determination of a cell concentration in an embodiment of a method according to the invention and four sections of the channel at different times.
  • the embodiments described in more detail below represent preferred embodiments of the present invention. Functionally identical elements have the same reference numerals in the figures.
  • the coordinate systems K and K ' are used in the figures as a guide, wherein a ver ⁇ tical axis "z" and a vertical horizontal axis "x” facilitate the orientation in cross section (FIG 1A), and wherein the horizontal axis "x" and an axis "y” perpendicular to the horizontal axis "x” and to the vertical axis "z” facilitates orientation in the plan view of the exemplary channel 14 (FIG. 1B).
  • the flow direction P points here in the x direction. 1 shows a schematic diagram of an embodiment of a device 10 according to the invention for flow cytometric measurement.
  • the device 10 comprises a chamber 12 and a channel 14.
  • the flow direction of the laminar flow given during the cytometry is marked with the arrow P both in FIG. 1 and in the following figures.
  • the chamber 12 may comprise on one side (S2) a magnet 16, which is here attached, for example, outside the chamber 12.
  • the channel 14 is, according to the direction of flow through ⁇ P, downstream of the chamber 12 of the chamber 12 and the passage 14 form a closed system.
  • the Ka ⁇ nal 14 further comprises a deflecting device 20 and a magnet 22, in particular a permanent magnet, on a common channel side (Sl), for example, the channel bottom.
  • Sen ⁇ sor 18 may be used, preferably a GMR sensor.
  • the sensor 18 and / or the sensor array is connected to an electronic evaluation device 23 which, for example, comprises a processor of a computer for evaluating the measurement results.
  • the channel 14 comprises on the side of the channel 14 where accumulation of magnetically labeled cells is desired, the deflector 20, here e.g. is arranged at the bottom of the channel 14. Below the deflecting device 20, the magnet 22 is arranged.
  • the channel 14 is in e.g. four concentration ranges Cl, C2, C3, C4 divided. However, the number of concentration ranges of four shown here is not mandatory, i. the channel 14 with any
  • the height h of the channel can differ in the different concentration ranges C1, C2, C3, C4 of the channel 14.
  • the height of the channel is for example the largest in the concentration range Cl, for example 100 micrometers, and decreases with each concentration range C2, C3, C4 following downstream.
  • the height h is preferably the same in all concentration ranges C1, C2, C4, C4, for example, in stages.
  • FIG. 2B illustrates the structure of the deflecting device 20.
  • the deflecting device 20 is divided into, for example, three segments 20-1, 20-2, 20-3, where ⁇ of each in a different one of the concentration ranges C1 , C2, C3 lies.
  • Each segment 20-1, 20-2, 20-3 may comprise as a means for guiding a plurality of cells is oblique to the axis ⁇ guide elements 24 here. For the sake of clarity, only a few guide elements 24 are shown in FIG. mark provided.
  • the individual segments 20-1, 20-2, 20-3 each have a width b and a length a, which depending ⁇ differ wells in segments 20-1, 20-2, 20-3 of different concentration ranges of Cl, C2, C3 can.
  • the width b decreases downstream, so that wide segments upstream and narrow segments downstream angeord ⁇ net are.
  • the width b of the deflection device 20 is that distance which is perpendicular to an axis A of the channel (gestri ⁇ smiled line), which extends along the direction of flow P of the channel 14 extends.
  • the width b is thus the A ⁇ catchment area of the deflection device 20 within the channel 14 along the horizontal "Y" axis.
  • the length a is the length of each segment of the baffle 20 along the axis A of the channel.
  • the channel width for example 100 Micrometer, is constant in each concentration range Cl, C2, C3, C4, for example, a 10 micrometer-wide segment 20-3 then enriches the marked cells 26 by 1/10 of the channel width, ie a logarithmic step less than, for example, the segment 20- 1, if it has a width b of 100 microns.
  • the guide elements 24 may be arranged obliquely to the axis A, preferably at an acute angle between 0 ° and 90 ° to the axis A, in particular between 0 ° and 45 °, and alone or together form at least one in the flow direction P tapered funnel shape.
  • a guide ⁇ element 24 includes, for example, a wall which is mounted here in the example on the inside of the outer wall of the channel 14 and projects into the channel 14.
  • the guide elements 24 can be, for example, barriers made of, for example, photoresist, which mechanically guide the marked cells 26 and thus accumulate on the axis A, or, for example, ferromagnetic "herringbone structures" which magnetically focus and enrich the marked cells, or a combination of the two structures in one or different of the segments 20-1, 20-2, 20-3 of the deflection device 20.
  • FIG. 2B shows the principle of the guide elements 24 which are shown in FIG are shown enlarged.
  • a magnetophoretic guide element 24 is preferably wholly or partly formed from a ferromagnetic material and / or has a wall height of, for example, 10 nanometers to 100 nanometers. Preferably, the wall height is less than 20%, in particular less than
  • the wall height of a guide member 24 to the me chanical ⁇ guide is preferably greater than 20%, in particular 10%, than the diameter of the selected cell 26.
  • an average cell diameter of 3 microns is used as a basis in the example of platelets.
  • FIG. 3A An example of guide elements 24, for example of a segment 20-1 of the deflection device 20, which form a mechanical guide, is shown in FIG. 3A.
  • meh ⁇ eral of the guide elements 24 are offset in the direction of flow P to the axis A. Downstream of the deflection device 20, the sensor 18 is shown in FIG 3A.
  • a magnetically marked cell 26 and the movement of the labeled cell 26, which is guided by the guide elements 24, are shown by the arrow Z.
  • Figures 3B and 3C each illustrate a further embodiment of the deflection device 20, a segment is formed from 20-1 guide elements 24 in the example, which cause a magnetophoresis guide the labeled cell h ⁇ le 26th
  • the guide elements 24 are wholly or partially formed of a magnetic material, so are for example nickel strips.
  • the wall height of such a guide element 24 is preferably 100 nanometers.
  • the researcherssele ⁇ elements 24 are arranged obliquely to the axis A.
  • Two guide elements 24 of the shown in Figure 3B exporting approximately ⁇ example, which are located in respect to the axis A countertransference are not offset in the embodiment of FIG 3B ⁇ against each other. Between them, that is on the axis A, runs a magnetic web 28, a so-called soul, which consists wholly or partly of a magnetic material, for example nickel. disgust can be formed.
  • the magnetic material is preferably not free, but instead is coated by a passivation layer which is eg 100 nanometers thick and thus separated from the cell sample 30.
  • the distance of the web 28 to those ends of the guide elements 24 which point towards the axis A is preferably smaller than the diameter of the marked cell 26.
  • the guide elements 24 shown in the embodiment of FIG. 3C and adjacent to the axis A are offset in the direction of flow P.
  • FIGS. 4A to 6 illustrate movements of magnetically marked cells 26 in embodiments of the method according to the invention, e.g. a flow cytometry, by means of a device 10 according to the invention.
  • a device 10 by means of the method according to the invention, e.g. determines the coagulability of a whole blood sample.
  • an assessment of the coagulation situation e.g. based on the platelet count of the whole blood sample to determine Haemostasestörun- gene.
  • sample such as a whole blood sample, which ⁇ se must first be magnetically labeled with a cell-specific marker, as a complex sample contains different cell h ⁇ len and particles, such as proteins.
  • the labeling is carried out by means of eg superparamagnetic markers, for example with magnetic particles (so-called micro-beads), which are bound to cell-specific or particle-specific antibodies.
  • the magnetic particles may have a diameter of less than 500 nanometers, preferably less than 300 nanometers or between 40 and 300 nanometers.
  • Antibodies as well as the production of cell- or particle-specific antibodies can be used by techniques familiar to the person skilled in the art.
  • a cell-specific labeling can be carried out within a complex sample having a total cell concentration of, for example, 1 to 10 6 cells / microliter.
  • all cells of the desired cell type, the cell sample 30 and the Mark ⁇ ten antibodies are placed in the chamber 12 of the device 10 degrees.
  • the antibodies then bind specifically to the cells to be enriched.
  • stirring the cell solution this process, in which all cells to be enriched are marked, can be supported.
  • the magnet 16 can support the stirring and / or mixing process. This variant is advantageous for cell samples with a total cell concentration of up to 10 4 cells / microliter
  • the labeling can also be carried out partially, eg only a fraction of 1% of all cells to be enriched can be labeled. This is advantageous, above all, in the case of a cell sample having a very high total cell concentration, for example 10 6 cells / microliter, since otherwise a cell count could overtax the dynamic range of the sensor 18.
  • the antibodies linked to the magnetic marker are first introduced into the channel 14 of the device 10. By the magnet 22 on the predetermined side Sl of the channel 14 (see FIG 1), a magnetic field can be generated whose magnetic ⁇ field attracts the magnetically labeled antibody to the predetermined side Sl of the channel 14 and enriched there.
  • the Mag ⁇ net 16 is preferably on the outside of the duct 14 is introduced ⁇ so that it is not contaminated with the channel content.
  • the cell sample 30 is then brought into the channel 14 ⁇ .
  • the channel 14 can be so a defined fraction of cells, eg 1% or 10% of the platelets, are magnetically labeled as these cells are present in a uniform spatial distribution in the channel 14 after the cell sample 30 is input. After labeling, the labeled cells 26 are present.
  • Whether one should mark mixing or only one fraction can be estimated before performing the method according to the invention via a blood picture.
  • the cell sample 30 containing the magnetically-labeled cells 26 is replaced by the laminar flow e.g. With the aid of a suction device, this is conducted into the channel 14 and thus provided for enrichment, as shown in FIG. 4A (method step S10; for the sake of clarity, only individual marked cells 26 are marked with reference symbols in FIGS.
  • each concentration range C1, C2, C3, C4 of the channel 14 is determined by the volume of the concentration range C1, C2, C3, C4, ie by the height h of the channel 14, by the width b and / or the length a of the segment 20-1, 20-2, 20-3 of the deflection device 20 is determined in a concentration range C1, C2, C3.
  • FIG. 4A shows, by way of example, a stochastic distribution of the labeled cells 26 over the deflection device 20 immediately after introduction of the cell sample 30 into the channel 14.
  • the marked cells in each concentration range C1, C2, C3, C4 pulled along the z-axis in the direction of the magnet 22 (FIG 4B and FIG 5A).
  • the number of marked cells 26 drawn onto the respective segment 20-1, 20-2, 20-3 depends on the respective volume of the concentration range C1 (eg 140 to 200 microliters), C2 (eg 70 to 120 micro ⁇ liter), C3 (eg 30 to 60 microliters), C4 (eg 5 to 15 microliters), ie from the respective height h of the channel 14.
  • a defined and statistically meaningful number of marked cells 26 per concentration range C1, C2, C3, C4 can be set.
  • the sample 30 now flows in the flow direction P through the channel 14.
  • the laminar flow causes the marked cells 26 on the deflection device 20 to be pulled toward the sensor 18.
  • the funnel shape of the deflector 20 directs the marked cells 26 to the axis A either by mechanical and / or by magnetophoretic guidance after enrichment. This is exemplified in FIG. 5B which shows the enlarged detail 32 of FIG. 5A at various successive times t1 , t2 and t3 shows.
  • the marked cells 26 are thereby enriched on the axis A.
  • the width b determines the Anreiche ⁇ magnification factor of the selected cells 26 of the cell sample 30 in the respective range of concentrations Cl, C2, C3, C4.
  • V-shaped magnetophoretic guide elements 24 move the marked cells 26 along the axis A, due to the laminar flow of liquid, past the tapered ends of the V-shaped guide elements 24 while remaining due to the ferromagnetic Characteristics of these guide elements 24 adhere to the deflection device 20.
  • the cell 26 then slides in the direction of flow P in the direction of the sensor 18.
  • the cell 26 in FIG. 3B is attracted by the web 28 as soon as it is close to the axis. The flow then presses the cell A in the
  • a guide element 24 with a mechanical guide forms a barrier through which the marked cell 26 is directed to the respective next guide element 24 and finally to the axis A. Due to the flow in the channel 14, the cell 26 is then moved in the flow direction P on the axis A (FIG 3A, arrow Z).
  • the focused labeled cells 26 are directed directly to the sensor 18 on the axis A.
  • Small magnetic strips which may be mounted in front of the sensor, can additionally align the cells 26 with the sensor 18 and bind excess magnetic particles.
  • enriched labeled cells 26 are not deflected by the sensor 18 and background noise due to free markers during the measurement is reduced.
  • FIG. 6 shows the channel 14 of the device 10 in a plan view during e.g. a concentration determination.
  • the platelet count of the cell sample 30 is continuously measured.
  • t1 1
  • t2 2
  • t3 3
  • t4 4"
  • the concentration range C4 in this example does not include a segment of the deflection device 20. Thus, only those cells 26 which are incident on the axis A are detected by the sensor 18.
  • the enriched labeled cells 26 become out of the concentration range C3 directed via the sensor 18 and counted by the evaluation device 23 by means of this.
  • the volumes of the individual concentration ranges Cl, C2, C3, C4 and the width b of the corresponding segment 20-1, 20-2, 20-3 are known or can be easily measured. Using the determined cell count of each concentration range Cl, C2, C3, C4, the cell sample concentration for each
  • Concentration range Cl, C2, C3, C4 are calculated. Ideally, the values should be the same.
  • a time t1, t2, t3 or t4 of the counting process can be determined. It can thus be determined in a calibrated device from which concentration range C1, C2, C3, C4 even cells 26 are counted.
  • the concentration range Cl, C2, C3, C4 can be determined on the basis of the measured time.
  • a determined counting frequency f ie the distance between the marked cells 26 to one another, depends on the magnetic force, the flow velocity and the cell concentration.
  • the counting frequency f can also be used to determine the concentration of the cell sample 30.
  • a time period t * can be determined, in which a predetermined count frequency f is present. The time duration t * is dependent on the selected length a of the respective segments 20-1, 20-2, 20-3 of the deflection device 20.
  • a calibration method can for example be a Be ⁇ rich set of flow rates. It is then determined during the measurement of the cell sample 30 in which time period t a defined volume and thus a specific concentration range Cl, C2, C3, C4 of the labeled cells 26 was performed.
  • the frequency f sets in each concentration range Cl, C2, C3, C4 at the corresponding time tl, t2, t3 or t4.
  • the calibration is preferably performed for each concentration range.
  • each concentration range for today's sensors is calibrated to 1000 counts to achieve stable statistics.
  • a marker specific for the cells In order to quantify specific particles, in particular cells, within a complex sample 30, they must first be labeled with a marker specific for the cells.
  • required markers consist of a superparamagnetic material and are modified with antibodies on their surface. This label can specifically bind to the target particles. This step of the labeling is to be carried out, for example, within a complex sample 30 and does not require any subsequent purification of the sample.
  • the labeling described here takes place, for example, with superparamagnetic markers.
  • the label can mark all cells, ie 100% of the cells, within a sample by stirring processes. However, the marking can also be partial (eg 1%).
  • the labeled antibody can be, for example, first introduced into the channel 14 and accumulated by an external Mag ⁇ netfeld on one side of the channel fourteenth If the sample 30 with particles or cells following in the channel
  • a suitable proportion for example 1%) can be marked by the appropriate design of the channel 14. All other particles do not contact the mark.
  • the enrichment is carried out e.g. by means of a combination of magnetic forces (shown here in the z-direction: see FIG. 2A) and mechanical focusing by means of suitable structures (y-direction: see FIGS. 2A and 2B).
  • a permanent magnet 16 or an electromagnet 16 (FIG. 2) can be positioned on the side at which an enrichment of the particles is desired. If a cell suspension 30 is introduced into the channel 14 (FIG. 4A), the labeled cells or particles 26 are stochastically distributed. Magnetic forces move the marked cells or particles 26 to one side of the channel 14 (FIG. 4B), here in the z-direction.
  • the deflection device 20 can be, for example, barriers made of, for example, photographic paint, which mechanically guide the cells or particles 26, as well as ferromagnetic herringbone structures, which magnetically enrich and focus the marked cells or particles 26. A combination of both methods is possible.
  • FIG. 5 shows an example of such an enrichment route.
  • FIG 5A shows an example of the stochastic distribution mar ⁇ kierter cells 26 via the deflection device 20 30 immediately after introduction of the sample image 3B shows the principle of focusing of labeled cells 26 tl-t3 in the center of the channel 14 at the times.
  • the cell number in this area of the channel 14, for example is also varied. This makes it possible to set a de ⁇ fined, minimum cell count per concentration range Cl, C2, C3, C4. This procedure allows the SET ⁇ development of a statistically significant number of cells.
  • the height h is preferably the same in all concentration ranges C1, C2, C3, C4. Only the layer which is on the side where the labeled antibodies are blocked by e.g. external magnetic field are attracted, is marked and enriched only by the concentration ranges Cl, C2, C3, C4 differently. Due to the freely selectable width b and length a of
  • Bypass 20 (FIG. 2B), it is possible to enrich a defined fraction of the sample 30 (e.g., 50% of the channel width at C3) in the center of the channel 14. Determination of cell or particle concentration:
  • the determination of the concentration of the particles within a sample 30 is possible by determining two parameters.
  • the first parameter is the count frequency f in x-rich tion of the focused cells 26 or in other words, the distance between the particles 30 to each other.
  • the count frequency f depends on the magnetic force, the flow velocity and the cell or particle concentration. Therefore, it can count the frequency f for all concentrations Cl, C2, C3, C4 on the flow velocity and the magnetic force to calib ⁇ Center.
  • the second parameter is the time t at which a certain frequency f occurs.
  • the duration ⁇ in which a specific frequency f is counted gives information about the present concentration range C1, C2, C3, C4.
  • the time t and the duration t * are dependent on the selected length a of the respective deflection device 20. In general, the counting frequency f is lower, the lower the concentration of the sample 30 is.
  • Prerequisite is a calibrated system. That is, a range of flow rates ⁇ vi; vn ⁇ is set, which makes it possible to quantify ren in a subsequent step 26, the focused, avazel ⁇ ten cells. Thus, it can be determined, the period in which a defined volume and therefore a certain concentration range ⁇ Cl, C2, C3 , C4 of the cell sample 30 was performed.
  • the application can be calibrated to a specific count frequency f. Depending on the cell or particle concentration, this frequency f sets itself at the concentration ranges C1, C2, C3 or C4 at the corresponding time t1, t2 t3 or t4.
  • each calibration of a concentration range C1 , C2, C3 or C4 consists of up to 1000 counted cells 26 in order to achieve stable statistics.
  • the concentration range C1, C2, C3, C4 of the sample can be determined. be true. From the known geometry and of the resulting re sulting ⁇ liquid volume in this Konzentrationsbe ⁇ rich Cl, C2, C3, C4, it is possible to quantify cells or particles per volume. The counted cells or particles in this time window indicate a concentration of cells or particles throughout the sample 30.
  • the concentration range Cl, C2, C3, C4 which was calibrated to 1000 counted cells 26 or particles per measurement, determined.
  • the count value can also be determined for this concentration range C1, C2, C3, C4.
  • a further embodiment of the cytometric concentration measurement can be explained with reference to FIG. 6:
  • a sample 30 labeled with superparamagnetic markers with an unknown concentration is present.
  • the flow velocity and / or the strength of the magnetic field it is possible to obtain a desired frequency f of e.g. labeled cells 26 for optimal quantification.
  • the concentration range Cl which has, for example, a volume of 10 microliters, eg a reference sample with a concentration of 10 2 cells / microliter is used. From the unknown sample 30, for example, 300 cells counted, therefore, the unknown sample has a concentration of 30 cells / microliter.
  • Calibration of the concentration range C2 (1 microliter, concentration of the reference sample: 10 3 cells / microliter) is followed, for example, by a measurement of, for example, 400 cells.
  • the unknown sample has a concentration of 400 cells / microliter.
  • the reference sample When calibrating the concentration range C3 (eg 0.1 microliter), the reference sample has, for example, a concentration of 10 4 cells / microliter. In the unknown sample 30 200 cells are counted, the required concentration is 2000 Zel ⁇ len / microliter. After calibration of the concentration range C4 (eg 0.01 microliter, concentration of the reference sample:

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung (10) zur durchflusszytometrischen Messung, die eine Kammer (12), einen Kanal (14) und einen Magnetsensor (18). Der Kanal (14) und die Kammer (12) liegen in einem geschlossenen System vor, wobei sich eine Achse (A) des Kanals (14) entlang einer Durchflussrichtung (P) des Kanals (14) erstreckt. An einer vorbestimmten Seite des Kanals (14) ist ein Magnet (22) und eine Umlenkeinrichtung (20) angeordnet. Die Umlenkeinrichtung (20) ist in mindestens ein Segment (20-1, 20-2, 20-3) eingeteilt und jedes Segment (20-1, 20-2, 20-3) ist in einem Konzentrationsbereich (C1, C2, C3) des Kanals (14) angeordnet. Die Umlenkeinrichtung (20) weist Führungselemente (24) als Mittel zum Führen von Zellen zur Achse (A) hin auf. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur durchflusszytometrischen Messung mithilfe einer solchen Vorrichtung (10). Dazu können Zellen von komplexen Proben vollständig oder partiell markiert werden.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Anreichern und Vereinzeln von Zellen mit Konzentrationen über mehrere logarithmische Stufen
Die vorliegende Erfindung betrifft die magnetische Durch- flusszytometrie .
In heute bekannten Verfahren zur Durchflusszytometrie werden Zellen mittels zusätzlicher Flüssigkeitsströme in einem Kanal in die Mitte des Hauptkanals fokussiert und auf diese Weise vereinzelt (Sheath -Flow-Prinzip) . Diese Vereinzelung ermöglicht, die Zellen in einem anschließenden Messschritt (z.B. optisch oder impedometrisch) zu zählen. Mittels magnetischer Markierung der zu quantifizierenden Partikel ist es möglich, vor der eigentlichen Quantifizierung die Partikel aus einer komplexen Probe zu isolieren und anzureichern.
Um die Funktionalität dieser Technologie aufrecht zu erhal- ten, ist jedoch eine erhebliche Menge an zusätzlicher Flüs¬ sigkeit notwendig, welche den Sheath-Flow generiert. Dieses Verfahren ist auch mit weiteren Aufbereitungen mit z.B. Verdünnungsschritten und Zentrifugationsschritten verbunden, was auch mit einem Kontaminationsrisiko verbunden ist. Die Ver- dünnungsschritte sind notwendig, um eine Zählrate an die mi¬ nimale und maximale Zählrate eines Magnetsensors (also des Zählers) des Zytometers anzupassen.
Die zu lösende Aufgabe ist die Bereitstellung einer Vorrich- tung und eines Verfahrens, mit deren Hilfe eine zytometrische Messung, z.B. Konzentrationsbestimmung von Zellproben, schneller und bei geringem Kontaminationsrisiko durchgeführt werden kann. Die Aufgabe wird von der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur durchflusszytometrischen Messung gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst. Weiterhin wird die Aufgabe von dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Patentanspruch 10 gelöst. Vorteilhafte Wei- terbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben .
Der Erfindung liegt die Idee zugrunde, innerhalb eines ge- schlossenen Systems mehrere Anreicherungsschritte durchzufüh¬ ren. Dies wird durch die bauliche Auslegung eines Kanals der erfindungsgemäßen Vorrichtung und die Verwendung einer Umlenkeinrichtung in dem Kanal ermöglicht. Die Erfindung erlaubt ein zielgerichtetes Anreichern und Vereinzeln von Zel- len mit Konzentrationen über mehrere Zehnerpotenzen (von z.B. 10 bis 10.000 Zellen/Mikroliter) . Die Erfindung erlaubt vor allem, in einem einzigen Messvorgang mehrere Zehnerpotenzen an mögliche Zellkonzentrationen messen zu können. Selbst bei begrenzter Dynamik des Zählers kann so ein großer dynamischer Bereich, in einem einzigen mikrofluidischen Kanal innerhalb einer komplexen Probe ohne die Notwendigkeit vorangegangener Verdünnungs- , Isolations- oder Anreicherungsschritte abge¬ deckt werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur durchflusszytometrischen Messung umfasst hierzu eine Kammer und den Kanal, wobei der Kanal einen Magnetsensor umfasst und stromabwärts von der Kammer angeordnet ist. Die Kammer und der Kanal bilden ein geschlossenes System, wobei sich eine Achse des Kanals ent- lang einer Durchflussrichtung des Kanals erstreckt. Ein geschlossenes System liegt vor, wenn die Kammer direkt in den Kanal übergeht. Die Vorrichtung ist durch einen Magneten, insbesondere einen Permanentmagneten, und eine Umlenkeinrichtung, die beide an einer vorbestimmten Seite des Kanals ange- ordnet sind, gekennzeichnet. Dabei weist die Umlenkeinrich¬ tung mindestens ein Segment auf. Jedes Segment ist in einem Konzentrationsbereich des Kanals angeordnet. Jedes Segment weist Mittel zum Führen von Zellen zur Achse hin auf. Die Umlenkeinrichtung ermöglicht so ein Anreichern magnetisch mar- kierter Zellen, die von dem Magneten in dem jeweiligen Konzentrationsbereich auf die Kanalseite gezogen worden sind, auf der Achse und ein Führen dieser Zellen entlang der Achse zu dem Magnetsensor. Die oben gestellte Aufgabe wird ebenfalls von dem erfindungs¬ gemäßen Verfahren zum Anreichern von Zellen eines zu detek- tierenden Zelltyps einer Zellprobe für eine Durchflusszyto- metrie gelöst. Dabei werden zunächst magnetisch markierte Zellen des zu detektierenden Zelltyps bereitgestellt. Die markierten Zellen werden in dem Kanal einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung angereichert. Dazu werden die markierten Zellen von dem Magneten in dem Kanal auf die vorbestimmte Seite des Kanals gezogen. Dort wird bei lamina¬ rer Strömung in dem Kanal zumindest ein Teil der Zellen von der Umlenkeinrichtung auf die Achse, die sich entlang der Durchflussrichtung des Kanals erstreckt, gelenkt und hier¬ durch auf der Achse angereichert. Dies ermöglicht eine effi- ziente Anreicherung von Zellen. Auch komplexe Proben, also nicht aufgereinigte Proben, die eine Vielzahl verschiedene Zellen und andere Partikel, wie z.B. Proteine, enthalten, können so ohne Zwischenschritte, insbesondere unverdünnt, für eine Durchflusszytometrie benutzt werden.
Das Bereitstellen der magnetisch markierten Zellen kann das Markieren der Zellen umfassen. Dabei können zwei Markierungsvarianten verwendet werden. In einer ersten Variante können die zu detektierenden Zellen in einem Inkubationsschritt durch Vermischen und/oder Rühren von Markern, insbesondere von mindestens einem für den zu de¬ tektierenden Zelltyp spezifischen Antikörper, der mit mindestens einem magnetischen Marker verbunden ist, und der Zell- probe in der Kammer der Vorrichtung markiert werden. Diese
Variante wird bevorzugt bei kleinen Gesamtzellkonzentrationen von bis zu 104 Zellen/Mikroliter verwendet. Ein auf einer Seite der Kammer angeordneter Magnet kann dabei den Misch- und/oder Rührvorgang unterstützen.
In einer Ausführungsform der Vorrichtung ist entsprechend an einer vorbestimmten Seite der Kammer ein Magnet angeordnet, der den Misch- und/oder Rührvorgang unterstützt. Bei Zellproben mit größeren Gesamtzellkonzentration, z.B. von bis zu 106 Zellen/Mikroliter, kann alternativ bei der Markierung der mindestens eine für den zu detektierenden Zelltyp spezifische Antikörper, der mit mindestens einem magnetischen Marker verbunden ist, in dem Kanal bereitgestellt werden. Bei Erzeugen eines magnetischen Felds in dem Kanal mit einem an der Seite des Kanals angeordneten Magneten wird der Antikörper an der Seite des Kanals angereichert. Danach erfolgt das Einbringen der Zellprobe in den Kanal und damit das In-
Kontakt-Bringen des mindestens einen spezifischen Antikörpers mit demjenigen Anteil der Zellprobe, der an der Seite des Ka¬ nals laminar vorbeiströmt. Dadurch erfolgt ein partielles Markieren der in diesem Anteil enthaltenen Zellen, ohne dass Verdünnungs- oder Aufreinigungsschritte notwendig sind. In einem laminaren Durchflusssystem wird damit eine schichtweise Markierung der gewünschten Zellen erreicht. Alternativ kann eine solche partielle Markierung auch in der Kammer mithilfe des dort angeordneten Magneten durchgeführt werden.
Dadurch wird bei fluidischer Strömung in der Kammer nur eine Schicht, also eine definierte Fraktion der Zellprobe, wie z.B. 1% der gewünschten Zellen, in dem geschlossenen System magnetisch markiert.
Die Umlenkungseinrichtung kann als Mittel zum Führen von Zellen in einem Segment ein oder mehrere Führungselemente auf¬ weisen, die z.B. eine Rinne bilden, die die markierten Zellen auf die Achse lenkt. In einer besonders vorteilhaften Ausfüh- rungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst zumindest ein Segment der Umlenkeinrichtung als die Mittel zum Führen von Zellen aber schräg zur Achse angeordnete Führungselemente. Zusammen oder alleine bilden diese mindestens eine in der Durchflussrichtung sich verjüngende Trichterform. Dies ermög- licht die Umlenkung von magnetisch markierten Zellen auf die Achse des Kanals und damit ein Anreichern. Zumindest ein Führungselement kann, wenn es z.B. ganz oder teilweise aus einem ferromagnetischen Material besteht, in einer weiteren Ausführungsform der Vorrichtung eine in der Durchflussrichtung sich verjüngende V-Form bilden, was eine magnetophoretische Führung magnetisch markierter Zellen begünstigt .
Zusätzlich oder alternativ können zumindest zwei der Führungselemente als Wände für die Zellen ausgestaltet sein und in der Durchflussrichtung entlang der Achse versetzt angeordnet sein und dadurch eine mechanische Führung zu der Achse bilden, indem sie Banden für den Bewegungspfad der Zellen bilden . Zusätzlich kann, insbesondere zwischen zwei Führungselementen auf gleicher Achsenhöhe, ein magnetischer Steg entlang der Achse des Kanals angeordnet sein. Dadurch wird die Führung der magnetisch markierten Zelle auf der Achse des Kanals begünstigt .
Vorzugsweise sind mindestens zwei Konzentrationsbereiche des Kanals unterschiedlich ausgestaltet. Eine Zellprobe kann so in mehreren logarithmischen Stufen angereichert werden. So kann erreicht werden, dass eine Anreicherung vorliegt, die mit einem in der Dynamik begrenzten Zähler gemessen werden kann .
Beispielsweise können sich die mindestens zwei Konzentrati¬ onsbereiche in einer vorbestimmten Höhe des Kanals zwischen der vorbestimmten Seite und der der vorbestimmten Seite gegenüberliegenden Seite unterscheiden. Dadurch wird in jedem Konzentrationsbereich ein definiertes Volumen bestimmt. Unterschiedliche Volumina in unterschiedlichen Konzentrations¬ bereichen bewirken eine erste Anreicherung der Zellen durch den Magneten des Kanals vor der Anreicherung in dem Umlenkelement, sodass bei gegebener Konzentration eine statistisch aussagekräftige und eine definierte Zellzahl in jeder Anrei¬ cherungsstufe einstellbar ist. Die Kanalbreite ist dagegen vorzugsweise für alle Konzentra¬ tionsbereiche konstant. Bei konstanter Kanalbreite können sich die mindestens zwei Konzentrationsbereiche zusätzlich oder alternativ durch eine vorbestimmte Breite der Umlenkeinrichtung (senkrecht zur Achse gemessen) und/oder durch eine Länge des jeweiligen Segments der Umlenkeinrichtung entlang der Achse des Kanals unterscheiden. Diese Maße bestimmen den Einzugsbereich der Umlenkeinrichtung, beeinflussen also den Anreicherungsgrad.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird stromabwärts der Umlenkeinrichtung auf der Achse eine Zytometrie, insbesondere eine Zellzählung, mittels des Mag- netsensors durchgeführt. Damit kann z.B. eine Konzentrations¬ bestimmung der Zellprobe erfolgen.
Eine Konzentrationsbestimmung der Zellprobe mittels der Zytometrie stromabwärts der Umlenkeinrichtung umfasst dabei be- vorzugt das Zählen der durchströmenden und auf der Achse angereicherten Zellen aus mindestens einem der Konzentrations¬ bereiche mittels des Magnetsensors. Zu zumindest einem der Konzentrationsbereiche wird die Konzentration der Zellprobe ermittelt mithilfe des beim Zählen der angereicherten Zellen ermittelten Zählwerts des Konzentrationsbereiches, dem Volu¬ men des Konzentrationsbereiches und der Breite des Segments der Umlenkeinrichtung in dem Konzentrationsbereich. Dies ist eine effiziente und zeitsparende Messung deren Auswertung schnell vorliegt. Natürlich wird hierbei zumindest der Kon- zentrationsbereich gewählt, für den sich ein Zählwert ergibt, der groß genug für eine statistisch relevante Aussage und kleiner als die maximal vom Zähler zuverlässig erfassbare Zählrate ist. Unter Umständen muss ermittelt werden, aus welchem Konzentra¬ tionsbereich die zu einem gegebenen Zeitpunkt gerade gezählten Zellen gehören. In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird der jeweilige Konzentrationsbereich, zu dem ein Zählwert ermittelt wird, anhand eines ermittelten Zeit¬ punkts des Zählenvorgangs des Magnetsensors ermittelt. In einer kalibrierten Vorrichtung kann so eine Zuordnung von Zeitintervallen zum Konzentrationsbereich erfolgen. Unter Um- ständen ist die Fließgeschwindigkeit zu berücksichtigen.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Dazu zeigt:
FIG 1 eine Skizze einer Ausführungsform einer erfindungs¬ gemäßen Vorrichtung im Querschnitt,
Skizzen eines Kanals einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei die Figur 1A einen schematischen Querschnitt und die Figur 1B eine schematische Auf sieht des Kanals zeigt,
Skizzen verschiedener Ausführungsformen von Umlenk einrichtungen, wobei die FIG 3A eine perspektivische Darstellung einer Umlenkeinrichtung mit mecha nischer Führung zeigt und die FIG 3B sowie die FIG 3C schematische Aufsichten von jeweils einer Um¬ lenkeinrichtung mit magnetophoretischer Führung zeigt, eine Skizze einer Zellprobe in dem Kanal unmittel¬ bar nach Eingeben der Zellprobe (FIG 4A) und nach Anlegen eines Magnetfelds (FIG 4B) in einer Ausfüh rungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens, eine Skizze, in welcher das Anreichern der Zellen in einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens in einem Kanal veranschaulicht ist, wo¬ bei die FIG 5A eine Aufsicht des Kanals zu einem Zeitpunkt und die Figur 5B eine Aufsicht eines Seg ments der Umlenkeinrichtung zu verschiedenen Zeitpunkten zeigen, und FIG 6 eine Skizze, in welcher das Bestimmen einer Zellkonzentration in einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens und vier Ausschnitte des Kanals zu verschiedenen Zeitpunkten.
Die nachfolgend näher geschilderten Ausführungsbeispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Funktionsgleiche Elemente weisen in den Figuren dieselben Bezugszeichen auf. Die Koordinatensysteme K und K' dienen in den Figuren als Orientierungshilfe, wobei eine ver¬ tikale Achse „z" und eine dazu senkrechte horizontale Achse „x" die Orientierung im Querschnitt erleichtern (FIG 1A) , und wobei die horizontale Achse „x" und eine zu der horizontalen Achse „x" und zu der vertikalen Achse „z" senkrechte Achse „y" die Orientierung in der Aufsicht der beispielhaften Kanals 14 erleichtern (FIG 1B) . Die Flussrichtung P weist hier in x-Richtung. Die FIG 1 zeigt eine Prinzipskizze einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 zur durchflusszyto- metrischen Messung. Die Vorrichtung 10 umfasst eine Kammer 12 und einen Kanal 14. Die Durchflussrichtung der während der Zytometrie gegebenen laminaren Strömung ist, sowohl in der FIG 1 als auch in den folgenden Figuren, mit dem Pfeil P gekennzeichnet. Die Kammer 12 kann an einer Seite (S2) einen Magneten 16 umfassen, der hier z.B. außerhalb der Kammer 12 angebracht ist. Der Kanal 14 liegt, entsprechend der Durch¬ flussrichtung P, stromabwärts von der Kammer 12. Die Kammer 12 und der Kanal 14 bilden ein geschlossenes System. Der Ka¬ nal 14 umfasst weiterhin eine Umlenkeinrichtung 20 und einen Magneten 22, insbesondere einen Permanentmagneten, an einer gemeinsamen Kanalseite (Sl), z.B. der Kanalunterseite. Ein Sensor 18 oder ein Sensorarray zur zytometrischen Messung, insbesondere mit einem Sensorchip, ist an dem Kanal 14 stromabwärts der Umlenkeinrichtung 20 angebracht und ist dazu ausgelegt, magnetisch markierte Zellen zu zählen. Insbesondere können magnetoresistive Widerstände in dem Sen¬ sor 18 eingesetzt werden, vorzugsweise ein GMR-Sensor. Der Sensor 18 und/oder das Sensorarray ist mit einer elektroni- sehen Auswerteeinrichtung 23 verbunden, die z.B. einen Prozessor eines Computers zur Auswertung der Messergebnisse um- fasst .
Mit der Vorrichtung können z.B. Blutproben unverdünnt auf eine Konzentration z.B. der weißen Blutkörperchen hin untersucht werden.
Der Kanal 14 umfasst auf der Seite des Kanals 14, auf der eine Anreicherung von magnetisch markierten Zellen gewünscht ist, die Umlenkeinrichtung 20, die hier z.B. am Boden des Kanals 14 angeordnet ist. Unterhalb der Umlenkeinrichtung 20 ist der Magnet 22 angeordnet. Der Kanal 14 ist in z.B. vier Konzentrationsbereiche Cl, C2, C3, C4 eingeteilt. Die hier gezeigte Anzahl an Konzentrationsbereichen von vier ist je- doch nicht zwingend, d.h. der Kanal 14 mit einer beliebiger
Anzahl an Konzentrationsbereichen ausgestaltet sein. Die Höhe h des Kanals kann in den verschiedenen Konzentrationsberei¬ chen Cl, C2, C3, C4 des Kanals 14 unterscheiden. Im Beispiel der FIG 2A ist die Höhe des Kanals z.B. im Konzentrationsbe- reich Cl am größten, z.B. 100 Mikrometer, und nimmt mit jedem stromabwärts folgenden Konzentrationsbereich C2, C3, C4 ab. Im Falle einer partiellen Markierung von Zellen (siehe unten) ist die Höhe h bevorzugt in allen Konzentrationsbereichen Cl, C2, C4, C4 z.B. stufenweise gleich.
Die FIG 2B veranschaulicht den Aufbau der Umlenkeinrichtung 20. In dem beispielhaften Kanal 14 ist die Umlenkeinrichtung 20 in z.B. in drei Segmente 20-1, 20-2, 20-3 eingeteilt, wo¬ von jedes in einem anderen der Konzentrationsbereiche Cl, C2, C3 liegt. Jedes Segment 20-1, 20-2, 20-3 kann hier als ein Mittel zum Führen von Zellen mehrere schräg zur Achse ange¬ ordnete Führungselemente 24 umfassen. In der FIG 2B sind der Übersicht halber nur einige Führungselemente 24 mit den Be- zugszeichen versehen. Die einzelnen Segmente 20-1, 20-2, 20-3 haben jeweils eine Breite b und eine Länge a, die sich je¬ weils in Segmenten 20-1, 20-2, 20-3 unterschiedlicher Konzentrationsbereiche Cl, C2, C3 unterscheiden können. Bevor- zugt nimmt die Breite b dabei stromabwärts ab, so dass breite Segmente stromauf- und schmale Segmente stromabwärts angeord¬ net sind. Die Breite b der Umlenkeinrichtung 20 ist diejenige Strecke, die senkrecht zu einer Achse A des Kanals (gestri¬ chelte Linie) , die sich entlang der Durchflussrichtung P des Kanals 14 erstreckt, verläuft. Die Breite b ist also der Ein¬ zugsbereich der Umlenkeinrichtung 20 innerhalb des Kanals 14 entlang der horizontalen „y"-Achse. Dementsprechend ist die Länge a die Länge des jeweiligen Segments der Umlenkeinrichtung 20 entlang der Achse A des Kanals. Die Kanalbreite, z.B. 100 Mikrometer, ist dabei in jedem Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 konstant. Ein z.B. 10 Mikrometer breites Segment 20-3 reichert dann die markierten Zellen 26 von 1/10 der Kanalbreite an, also eine logarithmische Stufe weniger als z.B. das Segment 20-1, wenn das eine Breite b von 100 Mikrometer umfasst.
Die Führungselemente 24 können schräg zur Achse A angeordnet sein, bevorzugt in einem spitzen Winkel zwischen 0° und 90° zur Achse A, insbesondere zwischen 0° und 45°, und alleine oder zusammen mindestens eine in der Durchflussrichtung P sich verjüngende Trichterform bilden. Ein solches Führungs¬ element 24 umfasst z.B. eine Wandung, die hier im Beispiel auf der Innenseite der Außenwand des Kanals 14 angebracht ist und in den Kanal 14 hineinragt.
Die Führungselemente 24 können sowohl z.B. Barrieren aus z.B. Fotolack sein, die die markierten Zellen 26 mechanisch führen und so auf der Achse A anreichern, oder z.B. ferromagnetische „Fischgrätenstrukturen", die die markierten Zellen magnetisch fokussieren und anreichern. Auch eine Kombination beider Strukturen in einem oder verschiedenen der Segmente 20-1, 20-2, 20-3 der Umlenkeinrichtung 20 ist möglich. Die FIG 2B zeigt das Prinzip der Führungselemente 24, die in der FIG 3 vergrößert dargestellt sind. Ein magnetophoretisch führendes Führungselement 24 ist vorzugsweise ganz oder teilweise aus einem ferromagnetischen Material gebildet und/oder hat eine Wandhöhe von z.B. 10 Nanometer bis 100 Nanometer. Bevorzugt ist die Wandhöhe kleiner als 20%, insbesondere kleiner als
10 % des durchschnittlichen Zelldurchmessers der zu detektie- renden Zellen. Die Wandhöhe eines Führungselements 24 zur me¬ chanischen Führung ist vorzugsweise größer 20%, insbesondere 10%, als der Durchmesser der markierten Zelle 26. Dabei wird im Beispiel von Thrombozyten ein durchschnittlicher Zelldurchmesser von 3 Mikrometer zugrunde gelegt.
Ein Beispiel für Führungselemente 24 z.B. eines Segments 20-1 der Umlenkeinrichtung 20, die eine mechanische Führung bil- den, ist in der FIG 3A gezeigt. In diesem Beispiel sind meh¬ rere der Führungselemente 24 in der Durchflussrichtung P auf der Achse A versetzt. Stromabwärts der Umlenkeinrichtung 20 ist in der FIG 3A auch der Sensor 18 gezeigt. Weiterhin sind eine magnetisch markierte Zelle 26 und die Bewegung der mar- kierten Zelle 26, die durch die Führungselemente 24 gelenkt wird, durch den Pfeil Z gezeigt.
Die Figuren FIG 3B und die FIG 3C veranschaulichen jeweils eine weitere Ausführungsform der Umlenkeinrichtung 20, bei der z.B. ein Segment 20-1 aus Führungselementen 24 gebildet wird, die eine magnetophoretische Führung der markierten Zel¬ le 26 bewirken. Die Führungselemente 24 werden ganz oder teilweise aus einem magnetischen Material gebildet, sind also z.B. Nickel-Streifen. Die Wandhöhe eines solchen Führungsele- ments 24 beträgt vorzugsweise 100 Nanometer. Die Führungsele¬ mente 24 sind schräg zur Achse A angeordnet.
Zwei Führungselemente 24 des in der FIG 3B gezeigten Ausfüh¬ rungsbeispiels, die sich in Bezug auf die Achse A gegenüber- liegen, sind im Ausführungsbeispiel der FIG 3B nicht gegen¬ einander versetzt. Zwischen ihnen, also auf der Achse A, verläuft ein magnetischer Steg 28, eine sogenannte Seele, die ganz oder teilweise aus einem magnetischen Material, z.B. Ni- ekel gebildet sein kann. Dabei liegt das magnetische Material bevorzugt nicht frei vor, sondern ist von einer z.B. 100 Na- nometer dicken Passivierungsschicht überzogen und so von der Zellprobe 30 getrennt. Der Abstand des Stegs 28 zu denjenigen Enden der Führungselemente 24, die zu der Achse A zeigen, ist vorzugsweise kleiner als der Durchmesser der markierten Zelle 26.
Die in dem Ausführungsbeispiel der FIG 3C gezeigten und in Bezug auf die Achse A benachbarten Führungselemente 24 sind in der Durchflussrichtung P versetzt.
Die FIG 4A bis FIG 6 veranschaulichen Bewegungen magnetisch markierter Zellen 26 bei Ausführungsbeispielen des erfin- dungsgemäßen Verfahrens, z.B. einer Durchflusszytometrie, mithilfe einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 10. In diesen Beispielen wird mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens z.B. die Gerinnungsfähigkeit einer Vollblutprobe ermittelt. Dazu wird z.B. vor einer Operation bei einem Patienten eine Einschätzung der Gerinnungssituation z.B. anhand der Thrombozytenzahl der Vollblutprobe vorgenommen, um Hämostasestörun- gen festzustellen.
Um spezifische Zellen, z.B. Thrombozyten oder CD4+-Zellen, innerhalb einer Zellprobe 30, insbesondere einer komplexen
Probe wie einer Vollblutprobe, zu quantifizieren, müssen die¬ se zuvor mit einer zellspezifischen Markierung magnetisch markiert werden, da eine komplexe Probe unterschiedliche Zel¬ len und Partikel, z.B. Proteine, enthält. Die Markierung er- folgt mittels z.B. superparamagnetischem Markern, z.B. mit Magnetpartikeln (sogenannte Micro-Beads) , die an zell- oder partikelspezifische Antikörper gebunden sind. Die Magnetpartikel können einen Durchmesser von kleiner als 500 Nanometer, vorzugsweise kleiner als 300 Nanometer oder zwischen 40 und 300 Nanometer haben. Zur Verbindung von solchen Markern an
Antikörper sowie die Herstellung zell- oder partikelspezifischer Antikörper können dem Fachmann geläufige Techniken genutzt werden. Mithilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 kann eine zellspezifische Markierung innerhalb einer komplexen Probe mit einer Gesamtzellkonzentration von z.B. 1 bis 106 Zellen/Mik- roliter durchgeführt werden. Zur Markierung aller Zellen des gewünschten Zelltyps werden die Zellprobe 30 und die markier¬ ten Antikörper in die Kammer 12 der Vorrichtung 10 gegeben. Die Antikörper binden dann spezifisch an die anzureichernden Zellen. Durch Rühren der Zelllösung kann dieser Prozess, bei dem alle anzureichernden Zellen markiert werden, unterstützt werden. . Der Magnet 16 kann dabei den Rühr- und/oder Mischvorgang unterstützen. Diese Variante ist vorteilhaft für Zellproben mit einer Gesamtzellkonzentration von bis zu 104 Zellen/Mikroliter
Die Markierung kann alternativ auch partiell erfolgen, z.B. kann nur eine Fraktion von 1% aller anzureichernden Zellen markiert werden. Dies ist vor allem bei einer Zellprobe mit einer sehr hohen Gesamtzellkonzentration, z.B. 106 Zel- len/Mikroliter, vorteilhaft, da ansonsten eine Zellzählung den Dynamikbereich des Sensors 18 überfordern könnte. Hierbei werden die mit dem magnetischen Marker verbundenen Antikörper zuerst in den Kanal 14 der Vorrichtung 10 gegeben. Durch den Magneten 22 an der vorbestimmten Seite Sl des Kanals 14 (sie- he FIG 1) kann ein Magnetfeld erzeugt werden, dessen Magnet¬ feld die magnetisch markierten Antikörper an die vorbestimmte Seite Sl des Kanals 14 zieht und dort angereichert. Der Mag¬ net 16 ist bevorzugt an der Außenseite des Kanals 14 ange¬ bracht, sodass er nicht mit dem Kanalinhalt kontaminiert wird. Die Zellprobe 30 wird anschließend in den Kanal 14 ein¬ gebracht. Die anzureichernden Zellen, also in diesem Beispiel die Thrombozyten, die sich in demjenigen Anteil der Zellprobe 30 befinden, der aufgrund der laminaren Strömung an der vorbestimmten Seite Sl des Kanals 14 vorbeiströmt, kommt so in Kontakt mit den markierten Antikörpern. Hierbei ist es vorteilhaft, wenn eine hohe Anzahl an Markern pro Zelle vor¬ liegt. Alle anderen Zellen treten mit der Markierung nicht in Kontakt. Je nach z.B. Form und Größe des Kanals 14 kann so eine definierte Fraktion von Zellen, z.B. 1% oder 10 % der Thrombozyten, magnetisch markiert werden, da diese Zellen nach Eingeben der Zellprobe 30 in einer gleichmäßigen räumlichen Verteilung in dem Kanal 14 vorliegen. Nach der Markie- rung liegen die markierten Zellen 26 vor.
Ob man Mischen oder nur eine Fraktion markieren soll, kann vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens über ein Blutbild abgeschätzt werden.
In dem Verfahrensschritt der Anreicherung der markierten Zellen 26 wird die Zellprobe 30, die die magnetisch markierten Zellen 26 enthält, durch die laminare Strömung z.B. mithilfe einer Ansaugvorrichtung in den Kanal 14 geleitet und damit, wie in der FIG 4A gezeigt, zum Anreichern bereitgestellt (Verfahrensschritt S10; zur Wahrung der Übersichtlichkeit sind nur einzelne markierte Zellen 26 in den FIG 4A bis 6 mit Bezugszeichen gekennzeichnet) . Der Grad der Anreicherung (oder Fokussierung) in jedem Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 des Kanals 14 wird durch das Volumen des Konzentrationsbereichs Cl, C2, C3, C4, also durch die Höhe h des Kanals 14, durch die Breite b und/oder die Länge a des Segments 20-1, 20-2, 20-3 der Umlenkeinrich- tung 20 in einem Konzentrationsbereich Cl, C2, C3 bestimmt.
FIG 4A zeigt beispielhaft eine stochastische Verteilung der markierten Zellen 26 über der Umlenkeinrichtung 20 unmittelbar nach Einbringen der Zellprobe 30 in den Kanal 14. Bei Er- zeugen eines Magnetfelds durch den Magneten 22 werden die markierten Zellen in jedem Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 entlang der z-Achse in Richtung des Magneten 22 gezogen (FIG 4B und FIG 5A) . Die Anzahl der markierten Zellen 26, die auf das jeweilige Segment 20-1, 20-2, 20-3 gezogen wird, hängt von dem jeweiligen Volumen des Konzentrationsbereiches Cl (z.B. 140 bis 200 Mikroliter ), C2 (z.B. 70 bis 120 Mikro¬ liter ), C3 (z.B. 30 bis 60 Mikroliter), C4 (z.B. 5 bis 15 Mikroliter), also von der jeweiligen Höhe h des Kanals 14 ab. Dadurch kann eine definierte und statistisch aussagekräftige Anzahl markierter Zellen 26 pro Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 eingestellt werden. Die Probe 30 strömt nun in Strömungsrichtung P durch den Kanal 14. Durch die laminare Strömung werden die markierten Zellen 26 auf der Umlenkeinrichtung 20 zum Sensor 18 hin gezogen .
Die Trichterform der Umlenkeinrichtung 20 lenkt die markierten Zellen 26 nach der Anreicherung entweder durch eine mechanische und/oder durch eine magnetophoretische Führung auf die Achse A. Dies ist beispielhaft in der FIG 5B, die den vergrößerten Ausschnitt 32 der FIG 5A zu verschiedenen aufeinanderfolgenden Zeitpunkten tl, t2 und t3 zeigt, veranschaulicht. Die markierten Zellen 26 werden dadurch auf der Achse A angereichert. Die Breite b bestimmt den Anreiche¬ rungsfaktor der markierten Zellen 26 der Zellprobe 30 in dem jeweiligen Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4.
V-förmige magnetophoretisch führende Führungselemente 24, wie sie zu der FIG 2B bereits beschrieben wurden, bewegen sich die markierten Zellen 26 entlang der Achse A aufgrund des laminaren Flüssigkeitsstrom über die sich verjüngenden Enden der V-förmigen Führungselemente 24 hinweg und bleiben dabei aufgrund der ferromagnetischen Eigenschaften dieser Führungselemente 24 an der Umlenkeinrichtung 20 haften.
Alternativ oder zusätzlich kann ein Führungselement 24, wie in der FIG 3B und der FIG 3C gezeigt, die markierte Zelle 26 magnetophoretisch führen (siehe oben) . Durch die Lücke zwischen zwei Führungselementen 24 gleitet die Zelle 26 dann in Durchflussrichtung P in Richtung Sensor 18. Die Zelle 26 in der FIG 3B wird, sobald sie in Achsennähe ist, von dem Steg 28 angezogen. Die Strömung drückt die Zelle A dann in der
Durchflussrichtung auf dem Steg 28 weiter in Richtung Sensor 18. Alternativ oder zusätzlich bildet ein Führungselement 24 mit einer mechanischen Führung, z.B. ein Führungselement wie zur FIG 3A beschrieben, eine Barriere, durch die die markierte Zelle 26 zu dem jeweils nächsten Führungselement 24 und schließlich auf die Achse A gelenkt wird. Durch die Strömung im Kanal 14 wird die Zelle 26 dann in Durchflussrichtung P auf der Achse A bewegt (FIG 3A, Pfeil Z) .
Die fokussierten markierten Zellen 26 werden direkt zu dem Sensor 18 auf der Achse A gelenkt. Kleine Magnetstreifen, die vor dem Sensor angebracht sein können, können die Zellen 26 zusätzlich auf den Sensor 18 ausrichten und überschüssige Magnetpartikel binden. Dadurch werden angereicherte markierte Zellen 26 nicht vom Sensor 18 abgelenkt und ein Hintergrund- rauschen durch freie Marker während der Messung wird reduziert .
Die FIG 6 zeigt den Kanal 14 der Vorrichtung 10 in einer Aufsicht während z.B. einer Konzentrationsbestimmung. Im Bei- spiel wird die Thrombozytenzahl der Zellprobe 30 kontinuierlich gemessen. Der Ausschnitt 32 wird zusätzlich vergrößert zu vier verschiedenen aufeinanderfolgenden Zeitpunkten tl („t=l"), t2 („t=2"), t3 („t=3") und t4 („t=4") gezeigt. In den Vergrößerungen des Ausschnitts 32 ist das letzte Füh- rungselement 24 des Segments 20-3 zu sehen, das eine Breite b, z.B. 10 Mikrometer, hat. Die markierten Zellen 26, die in den jeweiligen Konzentrationsbereichen Cl, C2, C3 und C4 angereicht wurden, fließen auf der Achse A über den Sensor 18. Zu dem Zeitpunkt tl werden markierte Zellen 26 aus dem Kon- zentrationsbereich C4 über den Sensor 18 geleitet. Der Konzentrationsbereich C4 umfasst in diesem Beispiel kein Segment der Umlenkeinrichtung 20. Es werden also nur diejenigen Zellen 26 von dem Sensor 18 erfasst, die zufällig auf der Achse A liegen.
Zu dem späteren Zeitpunkt t2 („t=2") werden die angereicherten markierten Zellen 26 aus dem Konzentrationsbereich C3 über den Sensor 18 gelenkt und mittels diesem von der Auswerteeinrichtung 23 gezählt.
Je breiter und/oder länger ein Segment 20-1, 20-2, 20-3 eines Konzentrationsbereichs Cl, C2, C3 ist, desto größer ist der Einzugsbereichs des jeweiligen Segments 20-1, 20-2, 20-3 und desto mehr markierte Zellen 26 aus dem jeweiligen Konzentra¬ tionsbereich Cl, C2, C3 werden über den Sensor 18 gelenkt und von diesem gezählt. Dementsprechend misst der Sensor 18 ab dem Zeitpunkt t3, wenn die angereicherten markierten Zellen 26 des Konzentrationsbereichs C2 über den Sensor 18 strömen, mehr Zählereignisse als zuvor. Zum Zeitpunkt t4 wird die stark angereicherte Fraktion des Konzentrationsbereichs Cl gemessen .
Die Volumina der einzelnen Konzentrationsbereiche Cl, C2, C3, C4 und die Breite b des entsprechenden Segments 20-1, 20-2, 20-3 sind bekannt oder können leicht gemessen werden. Mit Hilfe der ermittelten Zellzahl jedes Konzentrationsbereichs Cl, C2, C3, C4 kann die Zellprobenkonzentration für jeden
Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 berechnet werden. Idealerweise sollten die Werte gleich sein.
Zusätzlich kann ein Zeitpunkt tl, t2, t3 oder t4 des Zählvor- gangs ermittelt werden. Damit kann in einer kalibrierten Vorrichtung ermittelt werden, aus welchem Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 gerade Zellen 26 gezählt werden. In einer kalibrierten Vorrichtung 10 kann anhand des gemessenen Zeitpunkts der Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 bestimmt wer- den. Eine ermittelte Zählfrequenz f, also der Abstand der markierten Zellen 26 zueinander, hängt von der magnetischen Kraft, der Flussgeschwindigkeit und der Zellkonzentration ab. Die Zählfrequenz f ist geringer, je geringer die Konzentration der Probe ist. In der FIG 6 werden z.B. die Frequenzen „f=l", „f=2", „f=3" und „f=4" ermittelt. Die Zählfrequenz f kann ebenfalls zur Ermittlung der Konzentration der Zellprobe 30 herangezogen werden. Zusätzlich oder alternativ kann eine Zeitdauer t* ermittelt werden, in der eine vorbestimmte Zählfrequenz f vorliegt. Die Zeitdauer t* ist abhängig von der gewählten Länge a der jeweiligen Segmente 20-1, 20-2, 20-3 der Umlenkeinrichtung 20.
Es ist dem Fachmann durch Referenzproben mit einer bekannten Zellkonzentration möglich, die Zählfrequenz f oder die Zeitpunkte tl, t2, t3, t4 für alle Konzentrationsbereiche Cl, C2, C3, C4 auf die Flussgeschwindigkeit und die magnetische Kraft zu kalibrieren.
Bei einer möglichen Kalibrierungsmethode kann z.B. ein Be¬ reich von Durchflussgeschwindigkeiten eingestellt werden. Es wird dann bei der Messung der Zellprobe 30 ermittelt, in wel- ehern Zeitraum t ein definiertes Volumen und damit ein bestimmter Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 der markierten Zellen 26 durchgeführt wurde.
In Abhängigkeit von der Zellkonzentration stellt sich die Frequenz f in jedem Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 zum entsprechenden Zeitpunkt tl, t2, t3 oder t4 ein. Die Kalibration wird vorzugsweise für jeden Konzentrationsbereich durchgeführt. Idealerweise wird jeder Konzentrationsbereich für heutige Sensoren auf 1000 Zählereignisse, kalibriert, um eine stabile Statistik zu erzielen.
Bei der Messung der gewünschten Zellprobe 30 mit einer unbekannten Konzentration kann dann vorzugsweise die Messung desjenigen Konzentrationsbereichs Cl, C2, C3, C4 zur Bestimmung herangezogen werden, bei der die Zählfrequenz nahe 1000, vorzugsweise zusätzlich unterhalb von 1000, liegt.
Zusammengefasst kann die Erfindung auch mit folgenden Worten beschrieben werden:
Um spezifische Partikel, insbesondere Zellen, innerhalb einer komplexen Probe 30 zu quantifizieren, müssen diese zuvor mit für die Zellen spezifische Markierung markiert werden. Die benötigten Marker bestehen z.B. aus einem superparamagneti- schem Material und sind mit Antikörpern an ihrer Oberfläche modifiziert. Diese Markierung kann spezifisch an die Zielpartikel binden. Dieser Schritt der Markierung ist z.B. inner- halb einer komplexen Probe 30 durchzuführen und bedarf keiner darauf folgenden Aufreinigung der Probe. Die hier beschriebene Markierung erfolgt z.B. mit superparamagnetischen Markern.
Die Markierung kann durch Rührprozesse alle gesuchten Zellen, also 100% der gesuchten Zellen, innerhalb einer Probe 30 markieren. Die Markierung kann jedoch auch partiell erfolgen (z.B. 1%) . Hierbei werden die markierten Antikörper z.B. zuerst in den Kanal 14 eingebracht und durch ein externes Mag¬ netfeld an einer Seite des Kanals 14 angereichert. Wenn die Probe 30 mit Partikel oder Zellen im Anschluss in den Kanal
14 eingebracht wird, treten nur jene Zellen oder Partikel in Kontakt mit den Markern, welche sich gerade an der Seite des Kanals 14 befinden. Im Falle einer stochastischen Verteilung kann durch die geeignete Auslegung des Kanals 14 ein bestimm- ter Anteil (z.B. 1%) markiert werden. Alle anderen Partikel treten mit der Markierung nicht Kontakt.
Fokussierung durch magnetische und/oder mechanische Kräfte unter laminaren Flussbedingungen:
Unter Voraussetzung einer superparamagnetischen Markierung der gewünschten Partikel erfolgt die Anreicherung z.B. mittels Kombination aus magnetischen Kräften (hier gezeigt in z-Richtung: siehe FIG 2A) und mechanischer Fokussierung durch geeignete Strukturen (y-Richtung: siehe FIG 2A und 2B) .
An der Seite, an der eine Anreicherung der Partikel gewünscht ist, kann ein Permanentmagnet 16 oder ein Elektromagnet 16 (FIG 2) positioniert werden. Wird eine Zellsuspension 30 in den Kanal 14 eingebracht (FIG 4A) , sind die markierten Zellen oder Partikel 26 stochastisch verteilt. Magnetische Kräfte bewegen die markierten Zellen oder Partikel 26 an eine Seite des Kanals 14 (FIG 4B) , hier in z-Richtung.
Durch eine geeignete Auslegung der Umlenkeinrichtung 20 (Länge a und Breite b) (FIG 2B) an einer der Innenseiten des ver- wendeten Kanals 14 ist es möglich, die Zellen oder Partikel 26 in y-Richtung an einer beliebige Stelle an der Kanalwand (hier: bei y=l/2) anzureichern bzw. zu fokussieren.
Die Umlenkeinrichtung 20 kann z.B. Barrieren aus z.B. Foto- lack sein, die die Zellen oder Partikel 26 mechanisch führen, als auch ferromagnetische Fischgrätenstrukturen, die die markierten Zellen oder Partikel 26 magnetisch anreichern und fokussieren. Auch eine Kombination beider Methoden ist möglich. FIG 5 zeigt ein Beispiel einer solchen Anreicherungsstrecke. FIG 5A zeigt beispielhaft die stochastische Verteilung mar¬ kierter Zellen 26 über der Umlenkeinrichtung 20 unmittelbar nach Einbringung der Probe 30. Bild 3B zeigt das Prinzip der Fokussierung von markierten Zellen 26 in die Mitte des Kanals 14 zu den Zeitpunkten tl-t3.
Auflösung mehrer Zehnerpotenzen:
Wenn die Kanalhöhe h (FIG 2A) über den unterschiedlichen Konzentrationsbereichen Cl, C2, C3, C4 (FIG 2B) beliebig variiert wird, wird die z.B. Zellzahl in diesem Bereich des Ka- nals 14 ebenfalls variiert. Dadurch ist es möglich, eine de¬ finierte, minimale Zellzahl pro Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 einzustellen. Diese Vorgangsweise erlaubt die Einstel¬ lung einer statistisch aussagekräftigen Zellzahl.
Im Falle einer partiellen Markierung ist die Höhe h bevorzugt in allen Konzentrationsbereichen Cl, C2, C3, C4 gleich. Nur die Schicht, die sich auf der Seite befindet, wo auch die markierten Antikörper durch ein z.B. externes Magnetfeld angezogen wurden, wird markiert und ausschließlich durch die Konzentrationsbereiche Cl, C2, C3, C4 unterschiedlich ange- reichert. Durch die frei wählbare Breite b und Länge a der
Umlenkeinrichtung 20 (FIG 2B) ist es möglich, eine definierte Fraktion der Probe 30 (z.B. 50% der Kanalbreite bei C3) in der Mitte des Kanals 14 anzureichern. Ermittlung der Zell- oder Partikelkonzentration:
Die Ermittlung der Konzentration der Partikel innerhalb einer Probe 30 ist durch die Bestimmung von zwei Parametern möglich. Der erste Parameter ist die Zählfrequenz f in x-Rich- tung der fokussierten Zellen 26 oder anders ausgedrückt, der Abstand der Partikel 30 zueinander. Die Zählfrequenz f hängt von der magnetischen Kraft, der Flussgeschwindigkeit und der Zell- oder Partikelkonzentration ab. Es kann daher die Zähl- frequenz f für alle Konzentrationsbereiche Cl, C2, C3, C4 auf die Flussgeschwindigkeit und die magnetische Kraft zu kalib¬ rieren. Der zweite Parameter ist der Zeitpunkt t, zu dem sich eine bestimmte Frequenz f einstellt. Zusätzlich gibt die Dau¬ er t*, in der eine bestimmte Frequenz f gezählt wird, Infor- mationen über den vorliegenden Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4. Der Zeitpunkt t und die Dauer t* sind abhängig von der gewählten Länge a der jeweiligen Umlenkeinrichtung 20. Generell ist die Zählfrequenz f geringer, je geringer die Konzentration der Probe 30 ist.
Voraussetzung ist ein kalibriertes System. Das heißt, dass ein Bereich von Durchflussgeschwindigkeiten {vi; vn} eingestellt wird, der es ermöglicht, die fokussierten, vereinzel¬ ten Zellen 26 in einem anschließenden Schritt zu quantifizie- ren. Es kann also ermittelt werden, in welchem Zeitraum ein definiertes Volumen und damit ein bestimmter Konzentrations¬ bereich Cl, C2, C3, C4 der Zellprobe 30 durchgeführt wurde. Damit ein anschließendes Zählsystem zählen kann, kann die Anwendung auf eine bestimmte Zählfrequenz f kalibriert werden. Abhängig von der Zell- oder Partikelkonzentration stellt sich diese Frequenz f bei den Konzentrationsbereichen Cl, C2, C3 oder C4 zum entsprechenden Zeitpunkt tl, t2 t3 oder t4 ein. Es ist vorteilhaft, wenn die Kalibration für jeden Konzentra¬ tionsbereich Cl, C2, C3, C4 durchgeführt wird. Eine optimale Kalibration erlaubt also, dass eine anschließende Quantifi¬ zierungsmethode die Konzentrationsbereiche C1-C4 auflöst. Idealerweise besteht jede Kalibration eines Konzentrationsbe¬ reiches Cl, C2, C3 oder C4 aus bis zu 1000 gezählten Zellen 26, um eine stabile Statistik zu erzielen.
Bestimmung der Konzentration:
Über eine bestimmte Zählfrequenz f und einen Zeitbereich t kann der Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 der Probe be- stimmt werden. Aus der bekannten Geometrie und des daraus re¬ sultierenden Flüssigkeitsvolumens in diesem Konzentrationsbe¬ reich Cl, C2, C3, C4 ist es möglich, Zellen oder Partikel pro Volumen zu quantifizieren. Die gezählten Zellen oder Partikel in diesem Zeitfenster lassen auf eine Konzentration der Zellen oder Partikel in der gesamten Probe 30 schließen.
Vorgangsweise bei Auswertung:
Zuerst kann ermittelt werden, nach welcher Zeit t eine Zähl- frequenz f erreicht ist. Damit kann der Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4, der auf 1000 gezählte Zellen 26 oder Partikel pro Messung kalibriert wurde, ermittelt. Ebenfalls kann der Zählwert zu diesem Konzentrationsbereich Cl, C2, C3, C4 ermittelt werden.
Eine weitere Ausführungsform der zytometrischen Konzentrationsmessung kann anhand der FIG 6 erläutert werden: Eine mit superparamagnetischen Markern markierte Probe 30 mit einer unbekannten Konzentration liegt vor. Durch die beschriebenen geometrischen Parameter, der Flussgeschwindigkeit und/oder der Stärke des Magnetfelds) ist es möglich, eine gewünschte Frequenz f der z.B. markierten Zellen 26 für eine optimale Quantifizierung einzustellen. FIG 6 zeigt ein Beispiel in dem das System auf f=4 kalibriert wird. Es ist zu sehen, dass sich die gewünschte Frequenz f zum Zeitpunkt t=3 einstellt. Es liegt daher eine Probe 30 mit einem Konzentrationsbereich C2 vor. Steigt die Frequenz f höher als 4, dann ist die Zählung abgeschlossen, da man bereits die Zellen 26 im Anreicherungsbereich Cl zum Zeitpunkt t= 4 zählt.
Einige Messbeispiele, bei denen die Konzentrationsbereiche auf 1000 Zellen kalibriert werden:
Bei der Kalibration des Konzentrationsbereichs Cl, der z.B. ein Volumen von 10 Mikroliter hat, wird z.B. eine Referenzprobe mit einer Konzentration von 102 Zellen/Mikroliter verwendet. Von der unbekannten Probe 30 werden z.B. 300 Zellen gezählt, folglich hat die unbekannte Probe eine Konzentration von 30 Zellen/Mikroliter .
Einer Kalibration des Konzentrationsbereichs C2 (1 Mikroli- ter, Konzentration der Referenzprobe: 103Zellen/Mikroliter) folgt z.B. eine Messung von z.B. 400 Zellen. Die unbekannte Probe Hat eine Konzentration von 400 Zellen/Mikroliter.
Bei der Kalibration des Konzentrationsbereichs C3 (z.B. 0,1 Mikroliter) hat die Referenzprobe z.B. eine Konzentration von 104 Zellen/Mikroliter. In der unbekannten Probe 30 werden 200 Zellen gezählt, die gesuchte Konzentration beträgt 2000 Zel¬ len/Mikroliter. Nach Kalibrierung des Konzentrationsbereichs C4 (z.B. 0,01 Mikroliter, Konzentration der Referenzprobe:
105Zellen/Mikroliter) werden in einer Probe 30 z.B. 800 Zellen gezählt, folglich hat die unbekannte Probe eine Konzent¬ ration von 80.000 Zellen/Mikroliter.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung (10) zur durchflusszytometrischen Messung, umfassend eine Kammer (12) und einen Kanal (14), wobei der Kanal (14) einen Magnetsensor (18) umfasst und stromabwärts von der Kammer (12) liegt und mit der Kammer (12) in einem geschlossenen System vorliegt, wobei sich eine Achse (A) des Kanals (14) entlang einer Durchflussrichtung (P) des Kanals (14) erstreckt,
dadurch gekennzeichnet, dass
an einer vorbestimmten Seite (Sl) des Kanals (14) ein Magnet (22) und eine Umlenkeinrichtung (20) angeordnet sind und wo¬ bei die Umlenkeinrichtung (20) in mindestens ein Segment (20-
1. 20-2, 20-3) eingeteilt ist und jedes Segment (20-1, 20-2, 20-3) in einem Konzentrationsbereich (Cl, C2, C3) des Kanals
(14) angeordnet ist, in welchem die Umlenkeinrichtung (20) Mittel zum Führen von Zellen (26) zur Achse (A) hin aufweist.
2. Vorrichtung (10) nach Anspruch 1, wobei an einer vorbe- stimmten Seite der Kammer (12) ein Magnet (16) angeordnet ist .
3. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Segment (20-1, 20-2, 20-3) der Um- lenkeinrichtung (20) als Mittel zum Führen von Zellen (26) schräg zur Achse (A) angeordnete Führungselemente (24) um¬ fasst, die zusammen oder alleine mindestens eine in der
Durchflussrichtung (P) sich verjüngende Trichterform bilden.
4. Vorrichtung (10) nach Anspruch 3, wobei
- zumindest eines der Führungselemente (24) eine in der
Durchflussrichtung (P) sich verjüngende V-Form bildet und ganz oder teilweise aus einem ferromagnetischen Material besteht, und/oder
- zumindest zwei der Führungselemente (24) in der Durchfluss¬ richtung (P) auf der Achse (A) versetzt sind und dadurch eine mechanische Führung zu der Achse (A) bilden.
5. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 3 oder 4, wobei ein magnetischer Steg (28) entlang der Achse (A) des Kanals (14) angeordnet ist.
6. Vorrichtung (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mindestens zwei Konzentrationsbereiche (Cl, C2, C3, C4) unterschiedlich ausgestaltet sind.
7. Vorrichtung (10) nach Anspruch 6, wobei sich die mindes- tens zwei Konzentrationsbereiche (Cl, C2, C3, C4) in einer vorbestimmten Höhe (h) des Kanals (14) zwischen der vorbestimmten Seite (Sl) und der der vorbestimmten Seite (Sl) gegenüberliegenden Seite unterscheiden.
8. Vorrichtung (10) nach Anspruch 6 oder 7, wobei eine Kanalbreite konstant ist und sich die mindestens zwei Konzent¬ rationsbereiche (Cl, C2, C3) durch eine vorbestimmte Breite (b) der Umlenkeinrichtung (20) unterscheiden.
9. Vorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei jeder Konzentrationsbereich (Cl, C2, C3) durch eine Länge (a) des jeweiligen Segments (20-1, 20-2, 20-3) der Umlenkeinrichtung (20) entlang der Achse (A) des Kanals (14) gekennzeichnet ist.
10. Verfahren zum Anreichern von Zellen eines zu detektie- renden Zelltyps einer Zellprobe (30) für eine Durchflusszyto- metrie, umfassend die Schritte:
- Bereitstellen von magnetisch markierten Zellen (26) des zu detektierenden Zelltyps, und
- Anreichern der markierten Zellen (26) in dem Kanal (14) einer Vorrichtung (10) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wo¬ bei die markierten Zellen (26) von dem Magneten (22) auf die vorbestimmte Seite (Sl) des Kanals (14) gezogen und dort zumindest ein Teil der Zellen (26) von der Umlenkeinrichtung (20) auf die Achse (A) , die sich entlang der
Durchflussrichtung (P) des Kanals (14) erstreckt, gelenkt und hierdurch auf der Achse (A) angereichert werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Bereitstellen der magnetisch markierten Zellen (26) das Markieren der Zellen umfasst und wobei der Markierungsschritt die folgenden
Schritte umfasst:
- Bereitstellen mindestens eines für den zu detektierenden Zelltyp spezifischen Antikörpers, der mit mindestens einem magnetischen Marker verbunden ist, in dem Kanal (14),
- Erzeugen eines magnetischen Felds in dem Kanal (14) mit dem an einer Seite (Sl) des Kanals (14) angeordneten Magneten
(22) und hierdurch Anreichern der Antikörper an der Seite des Kanals ( 14 ) ,
- danach Einbringen der Zellprobe (30) in den Kanal (14), In- Kontakt-Bringen des mindestens einen spezifischen Antikör- pers mit demjenigen Anteil der Zellprobe, der an der Seite
(Sl) des Kanals (14) laminar vorbeiströmt, und dadurch Mar¬ kieren der in diesem Anteil enthaltenen Zellen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei stromabwärts der Umlenkeinrichtung (20) auf der Achse (A) ei¬ ne Zytometrie mittels des Magnetsensors (18) durchgeführt wird .
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei stromabwärts der Um- lenkeinrichtung (20) eine Konzentrationsbestimmung der Zellprobe (30) mittels der Zytometrie durchgeführt wird, umfas¬ send die Schritte:
- Zählen der durchströmenden auf der Achse (A) angereicherten Zellen (26) aus mindestens einem der Konzentrationsbereiche (Cl, C2, C3, C4) mittels des Magnetsensors (18),
- zu zumindest einem der Konzentrationsbereiche (Cl, C2, C3, C4) Ermitteln der Konzentration der Zellprobe (30) aus dem beim Zählen der angereicherten Zellen (26) ermittelten Zählwert des Konzentrationsbereiches (Cl, C2, C3, C4), dem Volumen des Konzentrationsbereiches (Cl, C2, C3, C4) und der Breite (b) der Umlenkeinrichtung (20) .
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei anhand eines ermittel¬ ten Zeitpunkts (tl, t2, t3, t4) des Zählens des Magnetsensors (18) ermittelt wird, aus welchem Konzentrationsbereich (Cl, C2, C3, C4) gerade Zellen gezählt werden.
PCT/EP2014/050642 2013-01-22 2014-01-15 Verfahren zum anreichern und vereinzeln von zellen mit konzentrationen über mehrere logarithmische stufen WO2014114530A1 (de)

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