JP6726680B2 - 多段チャネル乳化のための装置及び方法 - Google Patents
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Description
本明細書において開示される様々な実施形態は、非水性連続相中に複数の水性液滴を含む、油中水エマルジョンを採用する。上記水性液滴の全て又はサブセットは、関心対象の分析物を含有してよい。エマルジョンは、2つの不混和性相(例えば水及び油)を、場合によっては1つ又は複数の界面活性剤の存在下で組み合わせることによって形成される。基本的なタイプのエマルジョンは、水中油(o/w)、油中水(w/o)、及び両連続エマルジョンである。液滴ベースの生物学的アッセイでは、エマルジョンは典型的には、水性相にアッセイ試薬(例えばPCRプライマー、塩、酵素等)が含有された油中水エマルジョンである。「油」相は、単一の油、又は異なる複数の油の混合物であってよい。いずれの好適な非水性流体が、本明細書において開示されるエマルジョンの非水性連続相を形成してよい。いくつかの実施形態では、上記非水性連続相は、鉱油、シリコーン油、又はフッ素化油(例えばFluorinert(登録商標)FC‐40[Sigma‐Aldrich])を含む。
例示的実施形態では、上記液滴を、多用な技法によって撮像してよい。撮像を容易にするために、上記液滴を含有する組成物をある表面上に、上記液滴が上記表面上に略単層として配置されるように分散させてよい。上記撮像表面は例えば、スライド上、又はガラス、プラスチック若しくは石英チャンバといったチャンバ内に存在してよい。上記液滴、及び上記液滴中の標識された分析物又は反応産物は、撮像システムを用いて検出できる。例えば、標識された増幅産物を検出するステップは、上記標識された増幅産物から放出される蛍光波長及び/又は蛍光強度を撮像するステップを含んでよい。上記液滴がコード化マイクロスフィア等のコード化粒子を含有する実施形態では、上記撮像するステップは、上記コード化粒子のデコード画像を取得するステップ、及び上記液滴中の増幅産物を検出するためのアッセイ画像を得るステップを含んでよい。上記デコード画像と上記アッセイ画像との比較により、複数の蛍光体の組み合わせを用いることによるより高い多重化能力が可能となる。本発明の方法は更に、直接又は間接的に標識された増幅産物からの信号を、試料中のDNA又はRNAの濃度と相関させるステップを含んでよい。本明細書において開示される方法及び組成物と共に使用するために適合させることができる撮像システムの例は、米国特許第8,296,088号及び米国公開特許第2012/0288897号に記載されており、これらは参照によって本出願に援用される。
広範な分析物に対する多数のタイプのアッセイを、液滴の内部で実施してよい。液滴内にある分析物は、(DNA又はRNAを含む)核酸、(酵素又は抗体を含む)タンパク質、ホルモン、炭水化物及び細胞を含むがこれらに限定されない、いずれの関心対象の分析物であってよい。検出、増幅、評価等を行われる分析物のタイプに応じて、液滴中に追加の成分を投入してよい。例えば上記分析物が標的核酸である場合、水性液滴は更に、プライマー、ポリメラーゼ、MgCl2、バッファ、標識剤及び/又はdNTPといった、1つ又は複数のPCR試薬を含んでよい。一実施形態では、1種類のプライマーを、上記液滴中に配置された固体支持体に付着させる。上記固体支持体は例えば、マイクロスフィア又はナノスフィアであってよい。更なる例では、上記分析物がタンパク質である場合、上記水性液滴は更に、抗体、酵素、酵素基質、標識剤及び/又はBSAのうちの1つ又は複数を含んでよい。検出を容易にするために、分析物又は反応産物を、蛍光体、量子ドット、希土類金属及び化学発光化合物等の標識剤を用いて、直接又は間接的に標識してよい。上記標識剤は、自由に浮遊してよく、分析物に付着してよく、試薬(例えばプライマー、プローブ若しくは抗体)に付着してよく、磁性粒子に付着してよく、又はこれらのいずれの組み合わせであってよい。特定の実施形態では、上記標識剤は、1つ若しくは複数の標識されたプライマー、又はdsDNA結合染料である。一実施形態では、上記1つ又は複数の標識されたプライマーは、蛍光体/クエンチャのペア又はFRETペアを含む。いくつかの実施形態では、上記標識剤は、ストレプトアビジン結合酵素及び蛍光発生基質を含む。一実施形態では、上記ストレプトアビジン結合酵素は、ストレプトアビジン結合βガラクトシダーゼであり、上記蛍光発生基質は、レゾルフィンβ‐D‐ガラクトピラノシドである。
本開示によるある例示的実施形態の第1の動作例では、液滴を、以下の寸法を有する単一の多段ノズルを備えた乳化デバイスを用いて生成した:CH=20μm、CW=60μm、SH1/CH=1.5、SH2/CH=1.75。上記多段チャネルの表面を、疎水性パーフルオロデシルトリクロロシラン(FDTS)でコーティングした。この例では、界面活性剤(液滴を安定させるため;PFPE‐PEG‐PFPE)と混合された化学的に不活性の油(Fluorinert(登録商標)FC‐40)を、上記デバイス内に配置した。水中の、AP559蛍光染料と結合させたオリゴヌクレオチドの2μM溶液を、流量1〜100nL/秒で、上記多段チャネルの流入口部分へと向けた。1秒あたり1〜30個の液滴という生成速度で、またおよそ3.8%の平均分散パーセンテージで、直径およそ120ミクロンの液滴が形成された。
以下の参考文献は、参照により本出願に援用される:
Sugiura, “Interfacial Tension Driven Monodispersed Droplet Formation from Microfabricated Channel Array”, Langmuir 2001, 17, 5562‐5566.
Dangla, “Droplet microfluidics driven by gradients of confinement”, PNAS; January 15, 2013; vol. 110, no. 3, 853-858.
米国特許第5,736,330号
米国特許第5,981,180号
米国特許第6,057,107号
米国特許第6,268,222号
米国特許第6,449,562号
米国特許第6,514,295号
米国特許第6,524,793号
米国特許第6,528,165号
米国特許第7,842,457号
米国特許第7,927,797号
米国特許第8,048,627号
米国特許第8,296,088号
米国公開特許第2013/0078164号
米国公開特許第2012/0288897号
Claims (25)
- 乳化デバイスであって:
チャネル高さCH及び幅CWを有する流入口部分を有するチャネルであって、比CW/CHは0.2超かつ5.0未満である、チャネル;
前記流入口部分と流体連通している第1段であって:
前記第1段は、踏み板長さT1及び段高さSH1を有し;
SH1は、CHよりも蹴上げ高さR1だけ大きく;
比SH1/CHは、1.0超かつ5.0未満である、第1段;
前記第1段と流体連通している第2段であって:
前記第2段は、踏み板長さT2及び段高さSH2を有し;
SH2は、SH1よりも蹴上げ高さR2だけ大きく;
比SH2/CHは、1.0超かつ5.0未満であり、
比T2/CHは、比T1/CH未満である、第2段;
前記第2段と流体連通している第3段であって:
前記第3段は、段高さSH3を有し;
SH3は、SH2より蹴上げ高さR3だけ大きく;
R3はゼロより大きい、第3段
を備える、乳化デバイス。 - 前記比SH1/CHは、1.0超かつ2.0未満である、請求項1に記載の乳化デバイス。
- R3は50ミクロンより大きい、請求項1に記載の乳化デバイス。
- 比T1/CHは3.0〜4.0である、請求項1に記載の乳化デバイス。
- 比T2/CHは2.0〜4.0である、請求項1に記載の乳化デバイス。
- CHは10ミクロン〜50ミクロンである、請求項1に記載の乳化デバイス。
- 複数の流入口部分であって、前記複数の流入口部分の各流入口部分は、高さCH及び幅CWを有し、比CW/CHは0.2超かつ5.0未満である、複数の流入口部分;
複数の第1段であって、前記複数の第1段の各前記第1段は:
前記複数の流入口部分のうちの1つの流入口部分と流体連通しており;
長さT1及び高さSH1を有し、SH1は、CHよりも蹴上げ高さR1だけ大きく、比SH1/CHは1.0超かつ5.0未満である、複数の第1段;
複数の第2段であって、前記複数の第2段の各前記第2段は:
前記複数の第1段のうちの1つの第1段と流体連通しており;
前記第3段と流体連通しており;
長さT2及び高さSH2を有し、SH2は、SH1よりも蹴上げ高さR2だけ大きく、比SH2/CHは1.0超かつ5.0未満である、複数の第2段
を更に備える、請求項1に記載の乳化デバイス。 - 前記複数の流入口部分は、10〜100個の前記流入口部分を備える、請求項7に記載の乳化デバイス。
- エマルジョンを形成する方法であって、
前記方法は:
請求項1に記載の乳化デバイスを得るステップであって、第1段、第2段及び第3段は、略静止している第1の流体を内包する、ステップ;並びに
第2の流体を、流入口部分に、そして前記第1段、前記第2段及び前記第3段を通して導入するステップ
を含み、
前記第2の流体の部分的な液滴は、前記第1段において形成され;
前記第2の流体の完全な液滴は、前記第2段において形成され;
前記第2の流体の前記完全な液滴は、前記第2段から前記第3段へと向けられる、方法。 - 前記第2の流体は、関心対象の分析物およびアッセイ試薬を含有する、請求項9に記載の方法。
- 前記第1の流体は疎水性液体であり、
前記第2の流体は親水性液体である、請求項9に記載の方法。 - 前記第1の流体は親水性液体であり、
前記第2の流体は疎水性液体である、請求項9に記載の方法。 - 前記第1の流体又は前記第2の流体は、乳化剤を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記乳化剤は、非イオン性界面活性剤またはブロッキングタンパク室を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記第2の流体の前記完全な液滴は、前記第2段において、1秒に1〜30個の完全な液滴という速度で形成される、請求項9に記載の方法。
- 前記第2の流体の前記完全な液滴は、40〜300ミクロンの平均直径を有する、請求項9に記載の方法。
- 前記第1の流体と前記第2の流体との間で形成される前記エマルジョンは、2〜10%の単分散性を有する、請求項9に記載の方法。
- エマルジョンを形成する方法であって、
前記方法は:
請求項7に記載の乳化デバイスを得るステップであって、複数の第1段、複数の第2段及び複数の第3段は、略静止している第1の流体を内包する、ステップ;並びに
第2の流体を、複数の流入口部分に、そして前記複数の第1段、前記複数の第2段及び前記複数の第3段を通して導入するステップ
を含み、
前記第2の流体の部分的な液滴は、前記複数の第1段のそれぞれにおいて形成され;
前記第2の流体の完全な液滴は、前記複数の第1段と前記複数の第2段との間の遷移中に形成され;
前記第2の流体の前記完全な液滴は、前記複数の第2段から前記第3段へと向けられる、方法。 - 1分に少なくとも10000個の前記完全な液滴が、前記複数の第2段から前記第3段へと向けられる、請求項18に記載の方法。
- 前記液滴は、10%未満の平均分散を有する、請求項19に記載の方法。
- 前記第3段における前記液滴の平均液滴直径は、40〜300ミクロンである、請求項18に記載の方法。
- 複数の第1段であって、前記複数の第1段の各前記第1段は:
前記複数の流入口部分のうちのそれぞれと流体連通しており;
長さT1及び高さSH1を有し、SH1は、CHよりも蹴上げ高さR1だけ大きく、比SH1/CHは1.0超かつ5.0未満である、複数の第1段、
を更に備える、請求項7に記載の乳化デバイス。 - 複数の第2段であって、前記複数の第2段の各前記第2段は:
前記複数の第1段のうちの1つの第1段と流体連通しており;
前記第3段と流体連通しており;
長さT2及び高さSH2を有し、SH2は、SH1よりも蹴上げ高さR2だけ大きく、比SH2/CHは1.0超かつ5.0未満である、複数の第2段
を更に備える、請求項22に記載の乳化デバイス。 - 単一の連続した第1段であって、前記単一の連続した第1段の各前記第1段は:
前記複数の流入口部分のうちのそれぞれと流体連通しており;
長さT1及び高さSH1を有し、SH1は、CHよりも蹴上げ高さR1だけ大きく、比SH1/CHは1.0超かつ5.0未満である、複数の第1段、
を更に備える、請求項7に記載の乳化デバイス。 - 単一の連続した第2段であって、前記単一の連続した第2段の各前記第2段は:
前記複数の第1段のうちの1つの第1段と流体連通しており;
前記第3段と流体連通しており;
長さT2及び高さSH2を有し、SH2は、SH1よりも蹴上げ高さR2だけ大きく、比SH2/CHは1.0超かつ5.0未満である、複数の第2段
を更に備える、請求項24に記載の乳化デバイス。
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