CN107427788A - 用于多阶梯通道乳化的仪器和方法 - Google Patents

用于多阶梯通道乳化的仪器和方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于形成微滴的方法和装置。在某些实施方案中，所述方法和装置形成具有不同直径的微滴。本公开内容的示例性实施方案涉及用于形成微滴的系统和方法，其包括多阶梯微通道乳化装置。一个实施方案提供了乳化装置，其包含：具有入口部的通道；与所述入口部流体连通的第一阶梯；与所述第一阶梯流体连通的第二阶梯；以及与所述第二阶梯流体连通的第三阶梯。

Description

用于多阶梯通道乳化的仪器和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年3月16日提交的美国临时专利申请序列号62/133,621和于2015年12月18日提交的美国临时专利申请序列号62/269,289的优先权，其各自的内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明的实施方案涉及用于形成微滴的方法和装置。
背景技术
下面的描述和实例并不因为其包括在本部分中而被承认是现有技术。
区室化(compartmentalization)是一种在分子诊断和生命科学研究领域中越来越受欢迎的技术。应用包括数字聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、两阶段PCR复用(two-stage PCR multiplexing)(包括基因分型)、单细胞分析、靶向测序、多重免疫测定、超灵敏免疫测定和测序用文库制备。每种单独应用对隔室的数量、每个隔室的单分散性(monodispersity)以及每个隔室的体积提出不同的要求。
用于区室化反应的一种方法是通过使用微滴(droplet)，所述微滴是被第二流体或者被第二流体和一个或更多个表面完全包围的第一流体的分离体积。在分子诊断和生命科学研究领域中，这通常是两种不混溶的液体。用于微滴产生(droplet generation)的技术包括共流(co-flow)、流聚焦(flow focusing)和T形接合(T-junction)。共流式微滴产生通过在共流设计中从孔口挤压内流而形成微滴，如例如David Weitz(“Monodisperseemulsion generation via drop break off in a coflowing stream，”Langmuir，2000)所述。Stone和Weitz(“Monodisperse double emulsions generated from amicrocapillary device，”Science，2005)使用修改的共流动技术示出了双重乳剂。流聚焦使用在几何上限制于通道的共流设计来产生微滴(参见例如Stone，“Formation ofdispersions using“flow focusing”in microchannels，”APL，2003)。T形接合式微滴产生方法及其修改(例如，Y形接合、交叉接合、ψ形接合)通常涉及连续相与分散相的相交流(参见例如Quake，“Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidicdevice”，PRL，2001；以及Weitz，D.A.，Stone，H.，“Geometrically mediated breakup ofdrops in microfluidic devices，”PRL，2004)。此外，美国专利No.7,943,671(通过引用并入本文)描述了阶梯乳化技术，其利用单个微通道的纵横比(aspect ratio)的突然变化使受限的共流动流(co-flowing stream)迅速去稳定化。
上述微滴产生技术全部都需要连续相和分散相二者的流动。相比之下，Sugiura等描述了其中微滴形成主要由界面张力驱动的技术(Sugiura，S.，Nakajima，M.“Interfacialtension driven monodispersed droplet formation from microfabricated channelarray，”Langmuir,17：5562-5566(2001))。利用这种技术，通过在从流体通道(fluidicchannel)喷出之后从平台(1edge)落下而产生微滴。最近，Dangla等还描述了通过使用倾斜顶面产生连续提高的间隔高度调节不混溶性液体之间的界面曲率来产生微滴的技术，称为限制梯度(美国专利公开2013/0078164(通过引用并入本文)；Dangla等，“Dropletmicrofluidics driven by gradients of confinement，”PNAS，10(3)：853-858(2013))。该限制梯度与Sugiura等描述的以离散阶梯实现的界面曲率调节具有相似性(参见上文)。
发明概述
本公开内容的一些示例性实施方案涉及用于形成微滴的系统和方法，包括多阶梯微通道乳化装置(multi-step microchannel emulsification device)。
一个实施方案提供了乳化装置，其包含：具有入口部(inlet portion)的通道；与入口部流体连通(fluid communication)的第一阶梯(step)；与第一阶梯流体连通的第二阶梯；以及与第二阶梯流体连通的第三阶梯。在一些实施方案中，乳化装置包含多个入口部；各自与多个入口部中的入口部流体连通的单个连续第一阶梯或多个第一阶梯；各自与单个连续第一阶梯或多个第一阶梯中的第一阶梯流体连通的单个连续第二阶梯或多个第二阶梯；以及各自与单个第二阶梯或多个第二阶梯中的第二阶梯流体连通的单个连续第三阶梯或多个第三阶梯。
具有入口部的通道具有通道高度CH和宽度CW。在某些实施方案中，CW大于CH，而在另一些实施方案中，CH大于CW。在一些具体实施方案中，CW/CH的比值为0.1至10.0、0.2至8.0、0.5至5.0、1.0至4.0、2.0至4.0或2.5至3.5。在某些实施方案中，CW/CH的比值为约3.0。
一些具体实施方案包括与入口部流体连通的第一阶梯，其中第一阶梯具有梯面长度(tread length)T1和阶梯高度(step height)SH1。在某些实施方案中，SH1比CH大(greater than)竖板高度(riser height)R1，其中R1大于零。在一些具体实施方案中，SH1/CH的比值大于1.0且小于10.0，或更特别地大于1.0且小于5.0，或更特别地大于1.0且小于4.0，或更特别地还大于1.0且小于2.0。在一些特别的实施方案中，SH1/CH的比值为约1.5。一些具体实施方案包括与第一阶梯流体连通的第二阶梯，其中第二阶梯具有梯面长度T2和阶梯高度SH2。在一些特别的实施方案中，SH2比SH1大竖板高度R2，其中R2大于零。在某些实施方案中，SH2/CH的比值大于1.0且小于10.0，或更特别地大于1.0且小于5.0，或更特别地大于1.0且小于3.0。在一些具体实施方案中，SH2/CH的比值为约2.0。一些具体实施方案包括与第二阶梯流体连通的第三阶梯，其中第三阶梯具有阶梯高度SH3，其比SH2大竖板高度R3，其中R3大于零。在某些实施方案中，SH3/CH的比值大于1.0且小于15.0，或更特别地大于1.0且小于10.0，或更特别地大于5.0且小于10.0。在一些具体实施方案中，SH3/CH的比值为约7.5。
在一些具体实施方案中，R1大于0.1微米且小于1000微米、大于1.0微米且小于100微米、大于5.0微米且小于100微米、大于5.0微米且小于50微米、大于1.0微米且小于50微米、大于1.0微米且小于20微米、大于3.0微米且小于30微米、或大于5.0微米且小于20.0微米。在某些实施方案中，R1为至少5.0微米。在一些实施方案中，R1为约5微米、10微米或20微米，或者其中可导出的任何范围。在一些特别的实施方案中，R2大于0.1微米且小于1000微米、大于1.0微米且小于100微米、大于5.0微米且小于100微米、大于5.0微米且小于50微米、大于1.0微米且小于50微米、大于1.0微米且小于20微米、大于3.0微米且小于30微米、或大于5.0微米且小于20.0微米。在某些实施方案中，R2为至少5.0微米。在一些实施方案中，R2为约5微米、10微米或20微米，或者其中可导出的任何范围。在一些实施方案中，R1等于R2。在一些特别的实施方案中，R3大于0.1微米且小于1000微米、大于1.0微米且小于1000微米、大于5.0微米且小于1000微米、大于5.0微米且小于500微米、大于10.0微米且小于1000微米、大于10.0微米且小于500微米、大于50微米且小于300微米、或大于100.0微米且小于1000.0微米。在一些实施方案中，R3为约55微米、110微米或275微米，或者其中可导出的任何范围。在某些实施方案中，R3为至少55.0微米。在某些实施方案中，R3为至少275微米。在被配置成产生不同尺寸的微滴的一些特别的实施方案中，CH为10微米、20微米和50微米，并且R1等于R2且为5微米、10微米和25微米。在被配置成产生不同尺寸的微滴的某些实施方案中，R3为55微米、110微米和大于275微米。在一些实施方案中，R1大于R2，R2大于R3。在另一些实施方案中，R3大于R2，且R2大于R1。在一些实施方案中，R1＝R2＝R3。在另一些实施方案中，R1＝R2，且R3大于R1。在一些实施方案中，R3/R1的比值为至少10.0。在一些实施方案中，R3/R2的比值为至少10.0。
在一些具体实施方案中，T1/CH的比值为0.1至7，或更特别地大于1且小于5，或更特别地大于3.0且小于4.0。在某些实施方案中，T1/CH的比值大于1.0。在一些具体实施方案中，T2/CH的比值为0.1至7，或更特别地大于1且小于5，或更特别地大于3.0且小于4.0。在某些实施方案中，T2/CH的比值大于1.0。在某些实施方案中，T2/CH的比值小于T1/CH。
在乳化装置的某些实施方案中，CH为1微米至50微米，或更特别地5微米至30微米，或更特别地6微米至20微米，或更特别地8微米至12微米，或还更特别地约10微米。在某些实施方案中，CH为至少5微米、10微米、20微米或50微米。
在一些特别的实施方案中，第一阶梯的宽度W1大于CW，第二阶梯的宽度W2大于CW，且第三阶梯的宽度W3大于CW。在某些实施方案中，第一阶梯的宽度W1大于CW，第二阶梯的宽度W2等于W1，且第三阶梯的宽度W3大于W1。在某些实施方案中，W1＝W2＝W3。一些特别的实施方案包括多个入口部，其中第一多个入口部中的每个入口部具有高度CH和宽度CW。在某些实施方案中，对于每个入口部，CW/CH的比值大于1.0。在某些实施方案中，对于每个入口部，CW/CH的比值为0.1至10.0、0.2至8.0、0.5至5.0、1.0至4.0、2.0至4.0或2.5至3.5。在某些实施方案中，对于每个入口部，CW/CH的比值为约3.0。某些实施方案包括多个第一阶梯，其中多个第一阶梯中的每个第一阶梯与多个入口部中的入口部流体连通，并且具有长度T1和高度SH1，其中SH1比CH大竖板高度R1。一些实施方案包括与多个入口部中的入口部流体连通并且具有长度T1和高度SH1的连续第一阶梯，其中SH1比CH大竖板高度R1。在一些具体实施方案中，SH1/CH的比值大于1.0。在一些具体实施方案中，SH1/CH的比值大于1.0且小于10.0，或更特别地大于1.0且小于5.0，或更特别地大于1.0且小于4.0，或更特别地还大于1.0且小于2.0。在一些特别的实施方案中，SH1/CH的比值为约1.5。一些具体实施方案包括多个第二阶梯，其中多个第二阶梯中的每个第二阶梯与多个第一阶梯中的第一阶梯或单个连续第一阶梯流体连通，与第三阶梯流体连通，并且具有长度T2和高度SH2，其中SH2比SH1大竖板高度R2。一些实施方案包括与单个连续第一阶梯或多个第一阶梯流体连通，与第三阶梯流体连通，并且具有长度T2和高度SH2的单个连续第二阶梯，其中SH2比SH1大竖板高度R2。在一些具体实施方案中，SH2/CH的比值大于1.0。在某些实施方案中，SH2/CH的比值大于1.0且小于10.0，或更特别地大于1.0且小于5.0，或更特别地大于1.0且小于3.0。在一些特别的实施方案中，SH2/CH的比值为约2.0。在一些实施方案中，单个连续第二阶梯或多个第二阶梯与共同第三阶梯流体连通。另一些实施方案包括多个第三阶梯，其中每个第三阶梯与单个连续第二阶梯或多个第二阶梯中的第二阶梯流体连通。
在一些实施方案中，乳化装置具有单个入口部。在另一些实施方案中，乳化装置具有多个入口部。在一些具体实施方案中，乳化装置具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500或1000个入口部，或者其中可导出的任何范围。多个入口部各自可以与多个第一、第二和/或第三阶梯中专用第一、第二和/或第三阶梯中的一个或更多个流体连通，或者多个入口部可以与共同第一、第二和/或第三阶梯中的一个或更多个流体连通。
在一些实施方案中，乳化装置具有单个喷嘴。在另一些实施方案中，乳化装置具有多个喷嘴。在一些具体实施方案中，乳化装置具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500或1000个喷嘴，或者其中可导出的任何范围。多个喷嘴各自可以与多个第三阶梯中的专用第三阶梯流体连通，或者多个喷嘴可以与共同第三阶梯流体连通。多个喷嘴中的两个或更多个喷嘴可以具有配置成形成两种或更多种不同尺寸的微滴的几何结构(geometry)。例如，乳剂装置可以具有三个喷嘴或通道群，其中第一群的几何结构为CH＝10微米，R1＝5微米，R2＝5微米；第二群的几何形状为CH＝20微米，R1＝10微米，R2＝10微米，且第三族群的几何形状为CH＝50微米，R1＝25微米，R2＝25微米，由此第一、第二和第三喷嘴群分别产生约45微米、120微米和300微米的微滴。不同尺寸的微滴可以收集在共同第三阶梯区域中，或者不同尺寸的微滴可以与相同尺寸的其他微滴一起收集在单独第三阶梯区域中。在装置包含多个空间上分开的第三阶梯区域的情况下，每个第三阶梯可具有与其他第三阶梯区域中一个或更多个不同的竖板高度R3和/或阶梯高度SH3。例如，在微滴为约45微米、120微米和300微米的上述实例中，三个不同第三阶梯区域的R3的值可以是55微米、110微米和275微米。
某些实施方案包括使用根据本公开内容的乳化装置来形成乳剂的方法。在所述方法的一些特别的实施方案中，装置的第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯包含基本上静态的第一流体。所述方法的一些具体实施方案包括将第二流体引入到入口部中并通过第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯。在一些特别的实施方案中，第二流体的部分微滴(partial droplet)在第一阶梯中形成，第二流体的完整微滴(complete droplet)在第二阶梯中(或在多个第一阶梯与第二阶梯之间过渡期间)形成，并且第二流体的完整微滴被从第二阶梯导向第三阶梯。
在一些实施方案中，第二流体的完整微滴在第二阶梯中被压缩，使得在第二阶梯中的完整微滴的高度小于在第二阶梯中的完整微滴的长度。在一些具体实施方案中，第二流体的完整微滴在第三阶梯中被压缩，使得在第三阶梯中的完整微滴的高度小于在第三阶梯中的完整微滴的长度。在其中第二流体的完整微滴在第三阶梯中被压缩的某些实施方案中，微滴直径(在其最短尺寸或“高度”上)＜SH3＜2×微滴直径(在其最长尺寸或“长度”上)。在一些实施方案中，第二流体的完整微滴在第三阶梯中不被压缩，使得在第三阶梯中完整微滴的高度等于在第三阶梯中完整微滴的长度。在一些特别的实施方案中，在第二阶梯中的完整微滴的高度小于在第三阶梯中的完整微滴的高度。在一些具体实施方案中，在第一阶梯上形成的微滴的长度大于T1。在一些特别的实施方案中，在第二阶梯上形成的微滴的长度大于T2。在某些实施方案中，第二流体包含目的分析物。在一些具体实施方案中，第二流体包含一种或更多种测定试剂，并且在一些特别的实施方案中，测定试剂为聚合酶链反应(PCR)引物、盐或酶。在某些实施方案中，在阶梯1和阶梯2上微滴的长度大于相应的梯面长度(例如，T1和T2)，使得与阶梯表面接触的微滴的一部分也与该阶梯上的阶梯边缘接触。
在一些实施方案中，第一流体为油。在一些具体实施方案中，第一流体为疏水性液体，且第二流体为亲水性液体。在另一些实施方案中，第一流体为亲水性液体，且第二流体为疏水性液体。在一些特别的实施方案中，第一流体或第二流体包含乳化剂，并且在某些实施方案中，乳化剂包含非离子型表面活性剂和/或封闭蛋白(blocking protein)。
在所述方法的一些实施方案中，第二流体的完整微滴在第二阶梯中以至少10个完整微滴/秒的速率形成。在所述方法的一些实施方案中，第二流体的完整微滴在第二阶梯中以1至30个完整微滴/秒的速率，或更特别地以10至30个完整微滴/秒的速率，或更特别地以约12、13、14、15、16、17、18、19或20个微滴/秒的速率形成。在一些实施方案中，采用多个喷嘴以每个乳剂装置每秒产生至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000个微滴或其中可导出的任何范围。
在某些实施方案中，第二流体的完整微滴的平均直径为40微米至400微米、45微米至300微米或40微米至50微米。某些实施方案被配置成产生具有不同直径的微滴，包括例如直径为20微米至60微米、80微米至160微米和200微米至400微米的微滴。一些特别地实施方案被配置成产生具有不同直径的微滴，包括例如直径为45微米、120微米和300微米的微滴。在一些具体实施方案中，第一流体与第二流体之间形成的乳剂具有小于10％的单分散性(微滴直径的偏差)。在一些特别的实施方案中，第一流体与第二流体之间形成的乳剂具有1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％或8％的单分散性，或者其中可导出的任何范围。
在某些实施方案中，通道和/或阶梯可以在硅中蚀刻(etch)。在一些特别的实施方案中，可以用玻璃和/或塑料聚合物(塑料、弹性体、橡胶、聚碳酸酯、环烯烃聚合物[cyclo-olefin Polymer，COP]等)(例如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS))覆盖经蚀刻的硅。在一些实施方案中，通道和/或阶梯的表面可以用疏水性组合物涂覆。在一些具体实施方案中，疏水性组合物为全氟癸基三氯硅烷(perfluorodecyltrichlorosilane，FDTS)。
某些实施方案包括形成乳剂的方法，所述方法包括：获得乳化装置，所述乳化装置包含第一多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯；第二多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯；以及第三多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯，其中第一、第二和第三多个通道中的多个第一阶梯、多个第二阶梯和多个第三阶梯包含基本上静态的第一流体。所述方法的一些示例性实施方案还可包括：将第二流体引入多个入口部中并通过第一、第二和第三多个通道的多个第一阶梯、多个第二阶梯和多个第三阶梯，其中：第二流体的部分微滴在第一、第二和第三多个通道的多个第一阶梯的每个中形成；第二流体的第一完整微滴在第一多个通道的每个中在多个第一阶梯与多个第二阶梯之间的交界(transaction)处形成；第二流体的第二完整微滴在第二多个通道的每个中在多个第一阶梯与多个第二阶梯之间的交界处形成；并且第二流体的第三完整微滴在第三多个通道的每个中在多个第一阶梯与多个第二阶梯之间的交界处形成；第二流体的第二完整微滴大于第二流体的第一完整微滴；并且第二流体的第三完整微滴大于第二流体的第二完整微滴。
在所述方法的一些特别的实施方案中：第一完整微滴的直径为25μm至65μm；并且第二完整微滴的直径为80μm至200μm；并且第三完整微滴的直径为200μm至400μm。在所述方法的一些具体实施方案中：第一完整微滴的直径为35μm至55μm；第二完整微滴的直径为100μm至140μm；并且第三完整微滴的直径为250μm至350μm。在所述方法的某些实施方案中：第一完整微滴的直径为约45μm；并且第二完整微滴的直径为约120μm；并且第三完整微滴的直径为约300μm。
术语“偶联”被定义为连接，但是不一定是直接连接，也不一定是机械连接。如果两个物品可以彼此偶联，则其是“可偶联的”，并且当偶联时，其仍可以表征为“可偶联的”。除非上下文另有明确要求，否则可偶联的物品还可以是可分离的，反之亦然。其中第一结构可与第二结构偶联的一种非限制性方式是第一结构被配置成与第二结构偶联(或配置成可与第二结构偶联)。
除非本公开内容另有明确要求，否则没有数量词修饰的名词表示一个/种或更多个/种。
术语“基本上”及其变化形式(例如，“大约”和“约”)被定义为大部分但不一定完全是本领域普通技术人员所理解的指定内容(并且包括完全是指定内容)。在任何公开的实施方案中，术语“基本上”、“大约”和“约”可用“在所指定内容的[一定百分比]内”代替，其中所述百分比包括.1％、1％、5％和10％。
术语“包含”(及其任何形式)、“具有”(及其任何形式)、“包括”(及其任何形式)和“含有”(及其任何形式)是开放式连接动词。因此，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”一个或更多个步骤或元件的方法或装置具有这一个或更多个步骤或元件，但不限于仅具有这一个或更多个元件。同样地，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”一个或更多个特征的方法的步骤或装置的元件具有这一个或更多个特征，但不限于仅具有这一个或更多个特征。例如，包含四个通道的系统可以具有多于四个通道。
“流体”通常是指倾向于流动并且符合其容器的形状的物质。流体可以具有允许流动的任何合适的黏度。在容积中存在两种或更多种流体的情况下，流体可以是例如混溶的、轻微混溶的或不混溶的。如本文中使用的，当一种流体在使用乳剂的条件下不溶于另一种时，则两种流体彼此是不混溶的或不是混溶的。
如本文中使用的“微滴”是完全被第二流体包围或者完全被第二流体和一个或更多个表面包围的第一流体的分离体积。微滴的非限制性实例包括混悬在疏水性液体中的亲水性液体、混悬在亲水性液体中的疏水性液体和混悬在液体中的气泡。
“乳剂”是液体在液体中的混悬液。在一些实施方案中，乳剂可以是“微乳剂”或“纳米乳剂”，即其中分散相的平均直径分别为微米级或纳米级的乳剂。可以例如通过使期望尺寸的微滴进入与所述微滴不混溶的溶液中来产生乳剂。在某些实施方案中，可以在微通道(即，平均截面尺寸为约1μm至1mm的通道或阶梯)中在微尺度上产生流体流或流体微滴。
“基本上静态”的流体是其中流动引起的压力变化可忽略的流体。例如，在本文中公开的多个实施方案中，第一流体在通道中为基本上静态的，并且与第一流体不混溶的第二流体经由入口流入通道。可以通过例如泵使第二流体流过入口。由于由第二流体流入通道使第一流体移位，基本上静态的第一流体可具有一定程度的移动；但不存在将第一流体的流动输送到通道中的另外入口。然而，可以存在容纳由于第二流体而从通道移开的任何第一流体的出口或废物通道。换句话说，第一流体是“被动的”。另外，由于第一流体是被动的并且不与第二流体共流，流量不像在其他共流式微滴形成技术(例如T形接合装置)中那样决定微滴尺寸。
入口部、第一阶梯和第二阶梯在本文中可以被统称为“喷嘴”。乳化装置可以具有单个喷嘴或多个喷嘴。多个喷嘴可以与共同的第三阶梯流体连通，或者多个喷嘴可以各自与多个单独的第三阶梯流体连通。多个喷嘴具有多个入口部，但是第一阶梯可以是与多个入口部流体连通的单个连续阶梯，或者第一阶梯可以是各自与多个入口部中的专用入口部流体连通的多个结构上不同的第一阶梯。同样地，第二阶梯可以是与第一阶梯流体连通的单个连续阶梯，或者第二阶梯可以是各自与多个第一阶梯中的专用第一阶梯流体连通的多个结构上不同的第二阶梯。
此外，以某种方式配置的装置或结构至少以这种方式配置，但也可以以未列出的方式配置。公制单位可以通过应用换算并舍入到最接近的微米由所提供的英制单位推导。
除非本公开内容或实施方案的性质明确禁止，否则即使未描述或说明，一个实施方案的特征也可应用于其他实施方案。
任何所公开的装置和方法的任何实施方案可以由或基本上由任何所描述的元件和/或特征和/或步骤组成(而不是包含/包括/含有/具有所述元件和/或特征和/或步骤)。因此，在任何权利要求中，术语“由...组成”或“基本上由...组成”可代替上述记载的任何开放式连接动词，以根据以其他方式使用开放式连接动词的内容改变给定权利要求的范围。
参照结合附图的一些具体实施方案的以下详细描述，其他特征和相关优点将变得显而易见。
附图简述
通过举例而非限制的方式对以下附图进行说明。为了简洁和清楚起见，给定结构的每个特征可能未在出现该结构的每个图中都标记。相同的附图标记不一定表示相同的结构。而且，相同的附图标记可以用于表示类似的特征或具有类似功能的特征，不相同的附图标记可同样如此。
图1A是根据本公开内容的多阶梯乳化装置的一个示例性实施方案的透视图。
图1B是根据本公开内容的多阶梯乳化装置的一个示例性实施方案的透视图。
图2是图1B的实施方案的截面图。
图3A至3C是在操作期间图1B的实施方案的截面图。
图4是根据本公开内容的包含多个喷嘴的装置的透视图。
图5是示出了单阶梯乳化装置的网络和多阶梯乳化装置的网络的分散度(dispersion)百分比相对于流量的图。
图6是示出了如对于来自图5的装置网络的单阶梯乳化装置和多阶梯乳化装置计算的分散度百分比相对于流量的图。
图7是示出了单阶梯乳化装置和多阶梯乳化装置的微滴尺寸分散度百分比的图。
图8是根据本公开内容的多阶梯乳化装置的一个示例性实施方案的透视图。
图9是图8的实施方案的局部截面图。
图10是图8的实施方案的局部截面图。
图11是图8的实施方案的局部截面图。
图12是由图8的示例性实施方案形成的微滴的示意图。
图13是示出了不同微滴尺寸和面积的不同动态范围的示意图。
图14是根据本公开内容的多阶梯乳化装置的一个示例性实施方案的透视图。
发明详述
参照附图中示出并在以下说明中详细描述的非限制性实施方案对多个特征和有利细节进行更充分说明。然而，应当理解，尽管指明本发明的一些实施方案，但是详细描述和具体实例仅以举例说明的方式而不是以限制的方式给出。根据本公开内容，多种替代、修改、添加和/或重排对于本领域普通技术人员将变得显而易见。
在以下说明中，提供了许多具体细节以提供对所公开的实施方案的透彻理解。然而，相关领域的普通技术人员将认识到，本发明可以在没有一个或更多个具体细节的情况下或者用其他方法、组件、材料等来实施。在另一些情况下，未示出或详细描述公知的结构、材料或操作以避免使本发明的一些方面模糊不清。应当理解，为清楚起见，并未对每个图中可见的每个组件都示出所有附图标记。
应当理解，本发明的装置和方法并不旨在限于所公开的特定形式。相反，其应覆盖落入权利要求书的范围内的所有修改方案、等价方案和替代方案。
图1A以透视图示出了乳化装置190。在该实施方案中，乳化装置190包含具有通道宽度CW和通道高度CH的入口通道195。入口通道195还包含增大的宽度的部分。例如，入口通道195包含具有大于宽度CW的宽度W1的部分。在一些特别的实施方案中，W1/CW的比值可以大于2.0、大于5.0、大于10.0、大于50.0、或大于100.0。在一些具体实施方案中，W1/CW的比值可以是5.0至25.0。在所示实施方案中，入口通道195包含具有增大的宽度W2和W3的另外部分。
图1B和图2分别以透视图和截面图示出了乳化装置100。图1B和图2中的实施方案包含具有竖板110、120和130以及阶梯101、102和103的通道105，如下文进一步描述的。为清楚起见，并未在图1B和图2二者中标记所有元件。在图1B中的实施方案中，通道105包含具有通道宽度CW和通道高度CH的入口部。通道105还包含具有大于CH的宽度W1的部分。在一些实施方案中，多个入口部可以与共同的第一阶梯流体连通，在这种情况下，该共同阶梯的宽度W1将显著大于任何单个入口部的宽度CW。该共同阶梯的宽度W1将大于与该阶梯流体连通的入口部的所有宽度的总和。图3A至3C示出了在操作期间乳化装置100的截面图。
在图1B和图2所示的实施方案中，乳化装置100包含多阶梯配置，其包含具有各自彼此流体连通的入口部107、第一阶梯101、第二阶梯102和第三阶梯103的通道105。此外，乳化装置100包含在入口部107与第一阶梯101的界面处的第一竖板110、在第一阶梯101与第二阶梯102的界面处的第二竖板120、以及在第二阶梯102与第三阶梯103的界面处的第三竖板130。第一阶梯101包含第一阶梯高度SH1和第一梯面长度T1，第二阶梯102包含第二阶梯高度SH2和第二梯面长度T2，且第三阶梯103包含第三阶梯高度SH3和第三梯面长度T3。
如本文中使用的，梯面长度T1等于第一竖板110与第二竖板120之间的距离，梯面长度T2等于第二竖板120与第三竖板130之间的距离，且梯面长度T3等于第三竖板130与乳化装置100的远离入口部107的微滴收集室(droplet collection chamber)的端部之间的距离，或者如果乳剂装置包含一个或更多个另外的阶梯，则梯面长度T3等于第三竖板130与第四竖板之间的距离。此外，SH1等于相对表面115与111之间的距离，SH2等于相对表面115与112之间的距离，且SH3等于相对表面115与113之间的距离。在所示实施方案中，表面115远离第一、第二和第三竖板110、120和130。在所示实施方案中，表面111在第一竖板110与第二竖板120之间延伸，并且表面111平行于表面115。类似地，在该实施方案中，表面112在第二竖板120与第三竖板130之间延伸，并且表面112平行于表面115。此外，表面113平行于表面115并且从竖板130延伸至乳化装置100的远离入口部107的端部。在所示实施方案中，第一、第二和第三竖板110、120和130垂直于表面115。
如下文进一步说明的，通道和阶梯的尺寸和几何结构被配置成通过单流体流动以高频率产生高度单分散的乳剂。如通过下文提供的数据表明的，相对于单阶梯设计，多阶梯配置可以提供单分散性方面的显著改善。不希望受理论束缚，认为单阶梯设计的较差性能可以归因于以下事实：正形成的微滴以不可预测的方式与预先形成的微滴接触，从而影响正形成微滴的尺寸。本文中公开的多阶梯配置解决了单阶梯设计的较差单分散性的问题。特别地，多阶梯配置限定了在微滴形成中用于特定功能的多个部分。
在所示实施方案中，入口部107包含通道高度CH和通道宽度CW(图1中所示)。在一些特别的实施方案中，CW/CH的比值大于0.2且小于5.0。入口部107与第一阶梯101流体连通，所述第一阶梯101包含梯面长度T1和阶梯高度SH1，其中SH1比通道高度CH大竖板高度R1，所述竖板高度R1大于零。在一些具体实施方案中，第一阶梯高度与通道高度的比值SH1/CH大于1.0且小于5.0。尽管本文中示出和描述的示例性实施方案包括以线性配置布置的喷嘴，但是另一些实施方案可包含不同的喷嘴布置，包括例如环形喷嘴布置。
应当理解，例如高度、宽度和长度的尺寸术语仅用于参考目的并且不旨在要求微通道乳化装置100的特定取向。如参照图2和3A至3C所使用的，高度是指垂直尺寸(例如图示页面的顶部到底部)，宽度是指垂直于所示截面图的平面(例如垂直于页面)的尺寸，且长度是指水平尺寸(例如页面的左侧到右侧)。通常来说，术语高度和长度是指在一个平面中的垂直尺寸，而术语宽度是指垂直于高度和长度的平面的尺寸。
在所示实施方案中，SH1比CH大竖板高度R1(例如SH1与CH之间的尺寸差)。此外，SH2比SH1大竖板高度R2，并且SH3比SH2大竖板高度R3。不同竖板高度R1、R2和R3在图2中示出为在垂直方向上向下延伸。然而，应当理解，竖板高度也可以在向上或侧面方向上延伸。微滴保持被限制(即非球形的)在喷嘴中，并且因此，表面张力而非重力是在示例性实施方案的操作期间影响微滴形成的主要力，如果希望的话，允许以任意方向(例如，向下、向上或侧面)形成竖板高度。CH或CW(取尺寸较小者)是决定通过装置100形成的微滴的直径的主要因素，并且SH1或W1是决定通过装置100形成的微滴的直径的次要因素。
在所示实施方案中，通道105的入口部107的宽度/高度比值(CW/CH)大于0.2且小于5.0。在某些实施方案中，CW/CH的比值可以大于1.5且小于4.5，且在一些特别的实施方案中，CW/CH的比值可以大于2.5且小于3.5，且在一些具体实施方案中，CW/CH的比值可以是约3.0。
如先前所述，第一阶梯101与入口部107流体连通，并且第一阶梯101的高度SH1比CH大竖板高度R1。在一些示例性实施方案中，SH1/CH的比值大于1.0且小于5.0、或大于1.25且小于2.75、或大于1.5且小于2.5、或大于1.75且小于2.25、或大于1.25且小于1.75。
乳化装置100还包含与第一阶梯101流体连通的第二阶梯102，并且第二阶梯102的高度SH2比SH1大竖板高度R2。在一些示例性实施方案中，SH2/CH的比值大于0.1且小于5.0。此外，乳化装置100还包含与第二阶梯102流体连通的第三阶梯103，并且第三阶梯103的阶梯高度SH3比SH2大竖板高度R3。在一些示例性实施方案中，R3大于0.1微米且小于1000微米。在所示实施方案中，R1大于R2，且R2大于R3。然而，在另一些实施方案中，R3大于R2，且R2大于R1。在一些实施方案中，R3大于R2，且R2等于R1。此外，所示实施方案包括T1/CH比值为0.1至7.0，且T2/CH的比值小于T1/CH。
在一些具体实施方案中，T1/R1的比值大于2.0、或大于5.0或大于10.0。在某些实施方案中，T2/R2的比值大于2.0、或大于5.0或大于10.0。
图3A至3C示出了在操作期间的乳化装置100。为清楚起见，并未在图3A至3C中标记乳化装置100的所有元件。对于图3A至3C中未标记的元件，可以参照图2。图3A示出了从第一阶梯101过渡到第二阶梯102的部分微滴152。图3B示出了从第二阶梯102过渡到第三阶梯103的微滴153。图3C示出了在第三阶梯103上的微滴154。首先参照图3A，在操作期间，可将流体流151引入(例如，以流动流从较高压力导向较低压力)到入口部107中。入口部107被配置成将样品线状物(thread)151递送至在入口部107与第一阶梯101之间的具有高度R1的第一竖板110。
在一些特别的实施方案中，流体流(fluid stream)151可以是包含亲水性液体的样品线状物，而阶梯101、102和103包含作为疏水性液体的流体155。在一些实施方案中，流体流151可以包含疏水性液体，而流体155包含亲水性液体。在某些实施方案中，在将包含亲水性液体(例如水性流体)的流体流151引入到第一通道101中之前，向阶梯101、102和103填充包含疏水性液体(例如油)的流体155。在一些示例性实施方案中，在将流体流151引入到第一通道105的入口部107中时，流体155为基本上静态的。在下文标题为“乳剂”的部分中提供了在乳化装置100中可用于微滴形成的液体类型的其他实例。
第一阶梯101被配置成开始流体流151的去稳定化(例如，使连续的流体流151转变为包含不连续)，并且在第一阶梯101中形成部分微滴152。在某些实施方案中，在操作期间在第一阶梯101中约90％地形成(按体积测量)部分微滴152。在一些示例性实施方案中，第一阶梯101不提供完整微滴形成，并且部分微滴152与流体流151流体地连接。如图3A所示，部分微滴152通过具有比流体流151或部分微滴152更小的截面面积的区域158(例如，在形成部分微滴152之前，流体流151向下颈缩成区域158)与流体流151流体地连接。部分微滴152被第一阶梯101压缩并延伸第一阶梯101的整个高度SH1。根据流体动力学和物理学原理，部分微滴152将寻求可能的最低能量状态(例如未压缩状态)。因此，部分微滴152将继续朝第二阶梯102行进，直至其与第一竖板110接触，在此由于第二阶梯102的高度SH2大于第一阶梯101的高度SH1，与其在第一阶梯101中相比，微滴将被压缩得更少。
在一些示例性实施方案中，在到达第一阶梯101与第二阶梯102的界面处的第二竖板120之后，部分微滴152将形成完整微滴153(如图3B中所示)。在操作期间，流体流151将在一段时间内被引入到第一通道101中。当一个部分微滴152行进以形成完整微滴153时，在第一阶梯101中将形成随后的部分微滴。第二阶梯102和竖板120(具有竖板高度R2)被配置成形成与部分微滴152(和流体流151)分离的完整微滴153。
第二阶梯102还被配置成提供正形成部分微滴152的第一阶梯101与储存完整微滴154的第三阶梯103之间的保护区。因此，降低或消除已形成的完整微滴与正形成的部分微滴之间的接触。阶梯101和102的长度(例如尺寸T1和T2)被设置成在这些各自部分中容纳微滴，使得每个部分可以适当地实现其功能。用于期望的微滴形成和前进的理论计算表明，梯面长度T1＝3.807(CH)，且梯面长度T2＝1.8585(CH)。实际的梯面长度可与理论计算的尺寸不同。这与连续斜坡配置或具有被布置成近似斜坡的一系列阶梯(在这种情况下每个阶梯的功能相同)的配置形成对比。此外，本文中公开的多阶梯通道还通过允许提高的容差而提供对连续斜坡配置不可用的制造选择。
在一些示例性实施方案中，完整微滴153在阶梯102中被压缩，使得其在形状上不是完全球形的。例如，完整微滴153的高度DH3等于SH2(阶梯102的高度，图2中所示)。此外，微滴153还具有大于DH3的长度DL3。根据流体动力学和物理学原理，微滴153将寻求可能的最低能量状态(例如未压缩状态)。因此，微滴153将继续朝第三阶梯103行进，直至其到达第二竖板120，在此由于第三阶梯103的高度SH3大于第二阶梯102的高度SH2，与其在第二阶梯102中相比，微滴将被压缩得更少。
在所示实施方案中，第三阶梯103被配置成提供微滴154的储存，并任选地通过成像装置157(例如照相机或光敏检测器)对微滴154进行成像。在下文标题为“微滴成像”的部分中提供了关于微滴154的任选成像的另外信息。微滴154也是完整微滴，其可以是或可以不是完全球形的，但是与微滴153相比将被压缩得更少。因此，微滴154的高度DH4大于微滴153的高度DH3，但通常小于微滴154的长度DL4。应当理解，图3C是截面图，并且在操作期间多个微滴154可以位于第三阶梯103中。
图4示出了包含多个喷嘴200的乳化装置250的分解组装透视图(explodedassembly perspective view)。在一些示例性实施方案中，每个喷嘴200可包含具有等同于本文中对于乳化装置100的通道和阶梯所描述特征的特征的通道和阶梯。在所示实施方案中，乳化装置250包含九个平行喷嘴200。另一些实施方案可以包含更大或更小数量的喷嘴。在所示实施方案中，乳化装置250包含由聚二甲基硅氧烷(PDMS)构成的基底220和由玻璃构成的盖210。
图5图示了十六个单阶梯乳化装置的网络和十六个多阶梯喷嘴的网络的相对于流量的分散度百分比。单阶梯乳化装置包含约189μm的阶梯高度。使用CellProfiler软件和成像处理流水线(imaging processing pipeline)来检测荧光标记的微滴。在每个测试期间获取多个图像，其中每个图像约有300个微滴。该软件创建了文件，其中所有文件都具有发现的所有微滴与相关微滴直径的列表，并随后计算直径的平均值和标准偏差。计算分散度并在两种配置之间进行比较，其中分散度是直径的变异系数(coefficient of variation，CV)，并且其中CV等于标准偏差除以平均直径。在该测试期间使用的通道尺寸包括20μm的通道高度、60μm的通道宽度和CH/SH1＝0.666或R1/CH＝0.5的比值。
图6是示出了如对于单阶梯乳化装置和图4所示的多阶梯乳化装置计算的相对于流量的分散度百分比的图。
图7是示出了单阶梯乳化装置和多阶梯乳化装置的微滴尺寸分散度百分比的图。在该测试期间使用的通道尺寸包括25μm的通道高度、60μm的通道宽度和等于0.5的Δ高度/高度。
在某些实施方案中，乳化装置可以被配置成产生多种微滴尺寸。例如，乳化装置可包含具有不同几何结构的多组喷嘴和通道，以产生具有不同尺寸和体积的微滴。
现在参照图8，乳化装置500包含第一多个喷嘴300和第二多个喷嘴400。在所示实施方案中，喷嘴300用流体供应通道355供应流体，而喷嘴400用流体供应通道455供应流体。分别在收集室350和450中收集通过喷嘴300和400形成的微滴。装置500还包含废物通道550，其被配置成允许废料(例如过量的流体或微滴)离开乳化装置500并被导向废物收集室(waste collection chamber)。在一些示例性实施方案中，每个喷嘴300和400可包含具有等同于本文中所述其他实施方案的特征的特征的通道和阶梯。例如，分别如图9和10所示，第一和第二多个喷嘴300和400中的每个喷嘴可包含通道305和405。通道305和405可被配置成具有与本文中对于乳化装置100的通道和阶梯所描述的特征等同的特征。
在操作期间，喷嘴300和400可以被配置成产生具有不同直径的微滴。例如，每个通道405可以被配置成产生直径大于从每个通道305产生的微滴的直径的微滴。此外，乳化装置500可以被配置成控制通过多个通道305和405各自产生的微滴的数量。例如，流体供应通道355和455可以被如此配置以控制供应到通道305和405的流体的量。在某些实施方案中，流体供应通道355和455可以具有不同的直径、长度和/或其他可以影响流体流动通过通道的阻力并使向通道305和405的流体流动的量偏倚的因素。在另一些实施方案中，流体供应通道355和455可以包含阀，其可以被操纵以控制向通道305和405的流体流动的量。这样的配置可以向通道305和405提供不同的流体流动量，允许通过通道305和405形成不同数量的微滴。单独控制向通道305和405的流体流的能力可用于精确控制通过通道405形成的较小直径微滴的百分比以及通过通道305形成的较大直径微滴的百分比。相对于产生大体等同尺寸的微滴的其他乳化装置，产生不同尺寸的微滴的能力可提供显著的优势。例如，通过乳化装置500产生的不同尺寸微滴可用于提高在数字PCR分析期间可用的动态范围。
在一些具体实施方案中，通道305和405可以具有与先前描述的实施方案类似的几何结构。例如，如图9的截面图所示，通道305具有各自彼此流体连通的入口部307、第一阶梯301、第二阶梯302和第三阶梯303。此外，通道305包含在入口部307与第一阶梯301的界面处的第一竖板310(具有竖板高度R31)、在第一阶梯301与第二阶梯302的界面处的第二竖板320(具有竖板高度R32)，以及在第二阶梯302与第三阶梯303的界面处的第三竖板330(具有竖板高度R33)。第一阶梯301包含第一阶梯高度FSH1和第一梯面长度T31，第二阶梯302包含第二阶梯高度FSH2和第二梯面长度T32，且第三阶梯303包含第三阶梯高度FSH3和第三梯面长度T33。
在图9所示的实施方案中，FSH1等于相对表面315与311之间的距离，FSH2等于相对表面315与312之间的距离，FSH3等于相对表面315与313之间的距离。在所示实施方案中，表面315远离第一、第二和第三竖板310、320和330。在所示实施方案中，表面311在第一与第二竖板310和320之间延伸，并且表面311平行于表面315。类似地，在该实施方案中，表面312在第二与第三竖板320和330之间延伸，并且表面312平行于表面315。此外，表面313平行于表面315并且从竖板330延伸到乳化装置300的远离入口部307的端部。在所示实施方案中，第一、第二和第三竖板310、320和330垂直于表面315。
现在参照图10的截面图，通道405具有各自彼此流体连通的入口部407、第一阶梯401、第二阶梯402和第三阶梯403。此外，通道405包含在入口部407与第一阶梯401的界面处的第一竖板410(具有竖板高度R41)、在第一阶梯401与第二阶梯402的界面处的第二竖板420(具有竖板高度R42)，以及在第二阶梯402与第三阶梯403的界面处的第三竖板430(具有竖板高度R43)。第一阶梯401包含第一阶梯高度SSH1和第一梯面长度T41，第二阶梯402包含第二阶梯高度SSH2和第二梯面长度T42，且第三阶梯403包含第三阶梯高度SSH3和第三梯面长度T43。
在图10所示的实施方案中，SSH1等于相对表面415与411之间的距离，SSH2等于相对表面415与412之间的距离，且SSH3等于相对表面415与413之间的距离。在所示实施方案中，表面415远离第一、第二和第三竖板410、420和430。在所示实施方案中，表面411在第一与第二竖板410和420之间延伸，并且表面411平行于表面415。类似地，在该实施方案中，表面412在第二与第三竖板420和430之间延伸，并且表面412平行于表面415。此外，表面413平行于表面415并且从竖板430延伸到乳化装置400的远离入口部407的端部。在所示实施方案中，第一、第二和第三竖板410、420和430垂直于表面315。
在一些示例性实施方案中，SSH1(“第二”通道[例如通道405]的第一阶梯)大于FSH1(“第一”通道[例如通道305]的第一阶梯高度)。此外，SSH2(“第二”通道的第二阶梯高度)大于FSH2(“第一”通道的第二阶梯高度)。因此，通道405的几何结构被配置成形成直径大于通过通道305形成的微滴的直径的微滴。在一些特别的实施方案中，SSH1比FSH1大至少50％，且在某些实施方案中，SSH1比FSH1大至少100％。此外，在一些实施方案中，SSH2可以比FSH2大至少50％。这样的几何结构可以允许通道405产生直径比通过通道305产生的微滴的直径大至少50％的微滴。在某些实施方案中，SSH2可以比FSH2大至少100％，允许通道405产生直径比通过通道305产生的微滴的直径大至少100％的微滴。在一些特别的实施方案中，当通过通道405和305形成的微滴被导向乳化装置500中的共同区域时，SSH3可以等于FSH3(应当理解，除非另有说明，否则附图中的图不是按比例绘制的)。
在一些特别的实施方案(例如图9中描述的那些)中，通过通道305形成的微滴的直径可以主要由入口部307的CH或CW的尺寸(取较小者)决定，并且其次由FSH1决定，如先前在图1至3的讨论中描述的。
现在参照图11，示出了通道305的一个替代实施方案。该实施方案等同于图9所示和描述的实施方案，不同之处在于FSH3的值不等同于SSH3的值，并因此包含提供用于微滴前进的另外阶梯。
通过通道305和405形成的每个微滴的体积与微滴的直径的立方成比例(假设为球形微滴)。在图9和10所示的实施方案中，如果入口部407的尺寸CH和CW中的较小者比入口部307的尺寸CH和CW中的较小者大至少50％，则通过通道405形成的微滴的直径比通过305形成的微滴的直径大至少50％。因此，通过通道405形成的微滴的体积是通过通道305形成的微滴的体积的至少3.375倍大。类似地，如果入口部407的尺寸CH和CW中的较小者比入口部307的尺寸CH和CW中的较小者大至少100％，则通过通道405形成的微滴的直径是通过305形成的微滴的直径的至少两倍。因此，通过通道405形成的微滴的体积是通过通道305形成的微滴的体积的至少八倍大。应当理解，本文中描述的尺寸比值仅是示例性的，并且其他实施方案可以包含具有不同于本公开内容中提供的那些值的通道尺寸。
现在参照图12，通过通道405和305形成的微滴的示意图被显示为包括不同尺寸的微滴。在该实施方案中，通过通道405形成多个微滴454，而通过通道305形成多个微滴354。如所示，多个微滴454中的每个微滴包含大于每个微滴354的直径D3的直径D4。在该实施方案中，D3由入口部307的尺寸CH或CW决定。类似地，D4由入口部407的尺寸CH或CW决定。
产生不同体积的微滴(例如图12所示的微滴)的能力可以在数字PCR分析期间提供许多益处。例如，使用多种体积的微滴根据给定量的空间和总体积提供较大的动态范围。
在使用均一体积的微滴的系统中，检测上限主要由每个微滴的体积来控制。检测下限通常由总体积以及因此在均一微滴系统中产生的微滴的数量来控制。因此，均一微滴系统中的大动态范围需要非常大量的小体积微滴。与均一微滴系统相比，通过产生不同体积的微滴，可以根据所提供的给定体积和面积增大动态范围。可以通过使用体积减小的微滴来提高检测上限。此外，可以通过使用体积增大的微滴来降低检测下限，这允许在相同面积内处理更大的样品体积。
图13提供了不同面积的不同动态范围的图示。如图所示，120μm直径的微滴的低动态范围(例如4-5log)需要317平方毫米。27μm直径的微滴未使用稀释或重新分配(reapportionment)的高动态范围(例如7-8log)需要1,413平方毫米。120μm直径的微滴在两个室中使用100x稀释的类似高动态范围需要634平方毫米。相比之下，27μm直径和120μm直径的微滴使用两室重新分配的7-8log高动态范围仅需要373平方毫米的空间。因此，与使用均一尺寸和体积的微滴的系统相比，使用具有不同直径的微滴可以提供较高的动态范围和/或需要较少的空间。
尽管先前描述的实施方案被配置成产生一种或两种不同直径的微滴，但是另一些实施方案可以被配置成产生三种或更多种不同直径的微滴。现在参照图14，乳化装置900包含分别具有流体供应通道655、755和855的多个通道600、700和800。此外，装置900包含分别用于通道600、700和800的收集室650、750和850。在一些示例性实施方案中，收集室650、750和850可以具有不同的高度以容纳不同直径的微滴。装置900还包含废物通道950，其被配置成允许废料(例如过量的流体或微滴)离开乳化装置900并被导向废物收集室。
乳剂
本文中公开的多个实施方案采用在非水性连续相中包含多个水性微滴的油包水型乳剂。全部或一小组水性微滴可包含目的分析物。乳剂通过通常在一种或更多种表面活性剂存在下合并两个不混溶相(例如，水和油)形成。乳剂的基本类型是水包油型(o/w)、油包水型(w/o)和双连续型(bi-continuous)。在基于微滴的生物测定中，乳剂将通常是在水相中包含测定试剂(例如，PCR引物、盐、酶等)的油包水型乳剂。“油”相可以是单一油或不同油的混合物。任何合适的非水性流体均可形成本文中中公开的乳剂的非水性连续相。在一些实施方案中，非水性连续相包含矿物油、硅油或氟化油(例如，Fluorinert [Sigma-Aldrich])。
可以通过包含一种或更多种乳化剂来稳定乳剂，所述乳化剂在水/油界面处起作用以防止或延迟相的分离。乳化剂还可以用于抑制阵列上相邻微滴的合并。本文中公开的组合物还可含有一种或更多种乳化剂。在一些特别的实施方案中，乳化剂包含非离子型表面活性剂或封闭蛋白。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括Tween 20(聚山梨醇酯20)、TritonTM X-100(4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇)、(失水山梨醇单油酸酯)、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(polyoxyethylemesorbitan monooleate)和辛基苯氧基乙氧基乙醇。例如胆酸钠、牛磺胆酸钠和脱氧胆酸钠的离子表面活性剂也可以用作乳化剂。乳化剂的其他实例包括化学惰性的基于硅酮的表面活性剂，例如聚硅氧烷-聚鲸蜡基-聚乙二醇共聚物；含氟表面活性剂，例如全氟化聚醚(PFPE)和PFPE-PEG共聚物；以及胆固醇。封闭蛋白的非限制性实例包括血清白蛋白，例如牛血清白蛋白和乙酰化牛血清白蛋白。
在某些实施方案中，制备乳剂使得多种试剂或分析物包含在乳剂的微滴内。在某些实施方案中，某些分析物或试剂可以附接于还设置在微滴内的固体支持物。例如，探针和/或引物可以附接于固体支持物。这样的固体支持物可以是例如微球(例如，珠)或其他颗粒，例如微粒、金或其他金属纳米颗粒、量子点或纳米点。在某些方面，颗粒可以是磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。微球、珠和颗粒的实例描述于Fulton的美国专利No.5,736,330、Chandler等的美国专利No.5,981,180、Fulton的美国专利No.6,057,107、Chandler等的美国专利No.6,268,222、Chandler等的美国专利No.6,449,562、Chandler等的美国专利No.6,514,295、Chandler等的美国专利No.6,524,793和Chandler的美国专利No.6,528,165中，其通过引用并入本文。
微滴成像
在一些示例性实施方案中，可通过多种技术对微滴进行成像。为了便于成像，可使含有微滴的组合物分散在表面上，使得微滴基本上以单层布置在表面上。成像表面可以例如在载玻片上或在室(例如玻璃、塑料或石英室)中。可以使用成像系统来检测微滴以及在微滴内的经标记分析物或反应产物。例如，检测经标记的扩增产物可包括对从经标记扩增产物发射的荧光波长和/或荧光强度进行成像。在其中微滴包含经编码颗粒(例如经编码微球)的一些实施方案中，成像可包括获取经编码颗粒的解码图像并获取测定图像以检测微滴中的扩增产物。解码图像和测定图像的比较通过使用荧光团的组合允许更大的多重能力。本发明的方法还可包括使来自经直接或间接标记扩增产物的信号与样品中DNA或RNA的浓度相关联。可适用于本文中公开的方法和组合物的成像系统的实例描述于美国专利No.8,296,088和美国专利公开2012/0288897中，其通过引用并入本文。
可以用任何合适的光源照射微滴。光源可以被配置成使用由光源(例如发光二极管(LED)或激光器)发射并被直接或通过光波导(optical waveguide)传送到成像区的光提供广泛的照明(即，在成像区的全部或相对大面积上同时提供的照明)。或者，照明源可以被配置成提供成像区中相对小点的照明，并且该系统可以被配置成在整个成像区上扫描相对较小的点。以这种方式，照明可以被配置为从一个或更多个LED、一个或更多个激光器、一个或更多个其他合适的光源或者其某些组合产生的聚焦光的相对“微小的飞点(tiny flyingspot)”。对经照射的微滴进行成像可以包括用光敏检测器检测从室的成像区发射或反射的光。光敏检测器的非限制性实例包括光电倍增管(photomultiplier tube，PMT)、雪崩光电二极管(avalanche photo diode)、CCD、CMOS或量子点相机。
微滴可包含标记剂，其包括但不限于：荧光团、量子点、稀土金属和化学发光化合物。标记剂可以自由浮动、附接于分析物、附接于试剂(例如，引物、探针或抗体)、附接于磁性颗粒、或其任意组合。在某些实施方案中，标记剂是一种或更多种经标记的引物或dsDNA结合染料。在一个实施方案中，一种或更多种经标记的引物包含荧光团/猝灭剂对或FRET对。
成像室可以由单一类型的材料或多种材料构成。在一些实施方案中，成像室的至少一部分包含光学透明材料(例如但不限于光学透明的玻璃、塑料或石英)，特别是在成像区附近，使得照明光束可以通过成像室以在成像区中对微滴进行成像。在一些情况下，成像室的对应于至少成像区的背部可以被配置成提供相对于由照明系统发射的光的波长可忽略的反射率和透射率。
测定
可以在微滴内进行很多种分析物的多种类型的测定。设置于微滴内的分析物可以是任何目的分析物，包括但不限于核酸(包括DNA或RNA)、蛋白质(包括酶或抗体)、激素、碳水化合物和细胞。根据被检测、放大、评价等的分析物的类型，可以在微滴中设置另外的组分。例如，当分析物是靶核酸时，水性微滴还可以包含一种或更多种PCR试剂，例如引物、聚合酶、MgCl2、缓冲液、标记剂和/或dNTP。在一个实施方案中，将一种引物附接于设置在微滴内的固体支持物。固体支持物可以是例如微球或纳米球。作为另一个实例，当分析物是蛋白质时，水性微滴还可以包含抗体、酶、酶底物、标记剂和/或BSA中的一种或更多种。为了便于检测，可用例如荧光团、量子点、稀土金属和化学发光化合物的标记剂直接或间接标记分析物或反应产物。标记剂可以自由浮动、附接于分析物、附接于试剂(例如引物、探针或抗体)、附接于磁性颗粒、或其任意组合。在某些实施方案中，标记剂是一种或更多种经标记的引物或dsDNA结合染料。在一个实施方案中，一种或更多种经标记的引物包含荧光团/猝灭剂对或FRET对。在一些实施方案中，标记剂包含链霉亲和素缀合的酶和荧光底物。在一个实施方案中，链霉亲和素缀合的酶是链霉亲和素缀合的β-半乳糖苷酶，且荧光底物是试卤灵(resorufin)β-D-吡喃半乳糖苷。
聚合酶链反应(PCR)是可以在微滴内进行的反应的一个实例。特别地，微滴可用于数字PCR(dPCR)技术。dPCR包括对样品进行分配，使得包含在样品中的单独核酸分子定位在许多单独区域中，例如微孔板中的单独孔中、乳剂的分散相中、或核酸结合表面的阵列中。每个分区(例如，微滴)将包含0或大于零个分子，分别提供阴性或阳性反应。与常规PCR不同，dPCR不依赖于扩增循环数来确定样品中靶核酸的初始量。因此，dPCR消除了依赖于指数数据来量化靶核酸并且提供绝对量化。在乳剂中的珠上克隆扩增核酸的珠乳剂PCR(beademulsion PCR)是其中将反应分配在微滴中的dPCR技术的一个实例。参见例如美国专利No.8,048,627和7,842,457，其在此通过引用并入。当如下更详细讨论的在乳剂中进行dPCR时，乳剂应是热稳定的以使其耐受热循环条件。
存在多种在乳剂中进行dPCR的方式。例如，在一种方法中，将DNA样品稀释至合适的浓度，与PCR试剂(引物、dNTP等)混合，并如上所述包封在乳剂中的微滴中，得到许多离散的反应样品。对微滴进行PCR热循环，并如上所述通过荧光(或其他合适的报道子)成像检测扩增子。
在另一种方法中，在微滴中还包含经编码的微球。所述微球可用于锚定引物。通过将不同的引物锚定至不同的经编码微球，每种不同的引物和相应的扩增子可通过其所附接的经编码微球来鉴定。美国专利No.8,048,627中描述了珠乳剂PCR的实例，其通过引用并入本文。然而，应注意，‘627专利中描述的技术包括破坏乳剂，并随后用磁体分离珠以分析珠上的序列。相比之下，使用本公开内容中描述的方法和组合物可在微滴内检测扩增子(例如，不必破坏乳剂)。
微滴的热循环可通过本领域已知的任何合适的技术进行。例如，可将微滴在可以被加热和冷却的管或室中热循环。在一些实施方案中，所述方法使用连续流动扩增来扩增核酸模板。已经报道了连续流动扩增的多种方法。例如，通过引用并入本文的美国专利No.7,927,797描述了与连续流动PCR结合使用的油包水型乳剂。乳剂通过传热元件的连续流动允许高效且迅速的反应循环，并且可用于热扩增反应(例如，PCR)或等温反应(例如，滚环扩增、全基因组扩增、NASBA或链置换扩增)。在某些实施方案中，乳剂在连续流动扩增后直接流入成像区。
单分子免疫测定和酶测定也可在微滴中进行(参见例如Sakakihara等，“Asingle-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter dropletarray，”Lab on a Chip 10：3355-3362(2010)；Sista等，“Heterogeneous ImmunoassaysUsing Magnetic Beads On a Digital Microfluidic Platform，”Lab Chip.8(12)：2188-2196(2008))。
工作实施例
在根据本公开内容的第一个示例性实施方案的第一工作实施例中，使用具有具有以下尺寸的单个多阶梯喷嘴的乳化装置产生微滴：CH＝20um，CW＝60um，SH1/CH＝1.5SH2/CH＝1.75。多阶梯通道的表面涂覆有疏水性全氟癸基三氯硅烷(FDTS)。在该实施例中，将与表面活性剂(用于稳定微滴；PFPE-PEG-PFPE)混合的化学惰性油( FC-40)置于该装置中。将与AP559荧光染料偶联的寡核苷酸在水中的2μM溶液以1至100nL/s的流量导入多阶梯通道的入口部中。以每秒1至30个微滴的产生速率和约3.8％的平均分散度百分比形成直径为约120微米的微滴。
在根据本公开内容的一个示例性实施方案的第二工作实施例中，使用具有99个喷嘴的乳化装置以每分钟约20,000个微滴的产生速率产生微滴。在该实施例中，微滴的平均直径为约122微米，且分散率(dispersionrate)为约9％。认为由于产生不一致微滴的单个有缺陷喷嘴，该实施例中的分散率高于预期。这些喷嘴在单个喷嘴部分上使用相同的几何结构：CH＝20μm，CW＝60μm，SH1/CH＝1.5，SH2/CH＝1.75，微滴产生速率为每个喷嘴每秒1至30个微滴。连续相流体是表面活性剂(PFPE-PEG-PFPE)在FC-40中的溶液，且分散相是与AP559荧光染料偶联的寡核苷酸在水中的2uM溶液。
上述说明书和实施例提供了示例性实施方案的结构和用途的完整描述。尽管上文已经以一定程度的特殊性或者参考一个或更多个单独实施方案描述了某些实施方案，但是本领域技术人员可在不脱离本发明范围的情况下对所公开的实施方案做出多种改变。因此，本发明装置的举例说明性实施方案并不旨在限于所公开的特定形式。相反，其包括落入权利要求书范围内的所有修改方案和替代方案，并且除所示实施方案之外的实施方案可包括所描述实施方案的一些或全部特征。此外，在适当的情况下，上述任何实例的一些方面可与所描述的任何其他实例的一些方面组合以形成具有相当或不同特性并解决相同或不同问题的另一些实例。类似地，应理解，上述益处和优势可涉及一个实施方案或者可涉及数个实施方案。
权利要求书不应被解释为包括装置加功能或步骤加功能的限制，除非在给定的权利要求中分别使用短语“用于...的装置”或“用于...的步骤”明确地记载了这样的限制。
参考文献
以下参考文献通过引用并入本文：
Sugiura，“Interfacial Tension Driven Monodispersed Droplet Formationfrom Microfabricated Channel Array”，Langmuir 2001，17，5562-5566.
Dangla，“Droplet microfluidics driven by gradients of confinement”，PNAS；January 15，2013；vol.110，n0.3，853-858.
美国专利5,736,330
美国专利5,981,180
美国专利6,057,107
美国专利6,268,222
美国专利6,449,562
美国专利6,514,295
美国专利6,524,793
美国专利6,528,165
美国专利7,842,457
美国专利7,927,797
美国专利8,048,627
美国专利8,296,088
美国专利公开2013/0078164
美国专利公开2012/0288897

Claims (63)

1.乳化装置，其包含：
具有入口部的通道，其具有通道高度CH和宽度CW，其中CW/CH的比值大于0.2且小于5.0；
与所述入口部流体连通的第一阶梯，其中：
所述第一阶梯具有梯面长度T1和阶梯高度SH1，
SH1比CH大竖板高度R1，并且
SH1/CH的比值大于1.0且小于5.0；
与所述第一阶梯流体连通的第二阶梯，其中：
所述第二阶梯具有梯面长度T2和阶梯高度SH2，
SH2比SH1大竖板高度R2，并且
SH2/CH的比值大于1.0且小于5.0；
与所述第二阶梯流体连通的第三阶梯，其中：
所述第三阶梯具有阶梯高度SH3，
SH3比SH2大竖板高度R3，并且
R3大于零。
2.权利要求1所述的乳化装置，其中CW/CH的比值大于2.0且小于4.0。
3.权利要求1所述的乳化装置，其中SH1/CH的比值大于1.0且小于2.0。
4.权利要求1所述的乳化装置，其中SH1/CH的比值为约1.5。
5.权利要求1所述的乳化装置，其中R3大于50微米。
6.权利要求1所述的乳化装置，其中R1等于R2，并且其中R2小于R3。
7.权利要求1所述的乳化装置，其中T1/CH的比值为3.0至4.0。
8.权利要求1所述的乳化装置，其中T2/CH的比值为2.0至4.0。
9.权利要求1所述的乳化装置，其中CH为10微米至50微米。
10.权利要求1所述的乳化装置，其中：
所述第一阶梯的宽度W1大于CW；
所述第二阶梯的宽度W2大于或等于W1；并且
所述第三阶梯的宽度W3大于或等于W1。
11.权利要求1所述的乳化装置，其还包含：
多个入口部，其中第一多个入口部中的每个入口部具有高度CH和宽度CW，并且其中CW/CH的比值大于0.2且小于5.0；
多个第一阶梯，其中所述多个第一阶梯中的每个第一阶梯：
与所述多个入口部中的入口部流体连通，并且
具有长度T1和高度SH1，其中SH1比CH大竖板高度R1，并且其中SH1/CH的比值大于1.0且小于5.0；以及
多个第二阶梯，其中所述多个第二阶梯中的每个第二阶梯：
与所述多个第一阶梯中的第一阶梯流体连通，
与所述第三阶梯流体连通，并且
具有长度T2和高度SH2，其中SH2比SH1大竖板高度R2，并且其中SH2/CH的比值大于1.0且小于5.0。
12.权利要求11所述的乳化装置，其中所述多个入口部包含10至100个入口部。
13.形成乳剂的方法，所述方法包括：
获得根据权利要求1至10、32或33中任一项所述的乳化装置，
其中所述第一阶梯、所述第二阶梯和所述第三阶梯包含基本上静态的第一流体；以及
将第二流体引入所述入口部中并通过所述第一阶梯、所述第二阶梯和所述第三阶梯，其中：
所述第二流体的部分微滴在所述第一阶梯中形成，
所述第二流体的完整微滴在所述第二阶梯中形成，并且
所述第二流体的所述完整微滴被从所述第二阶梯导向所述第三阶梯。
14.权利要求13所述的方法，其中所述第二流体的所述完整微滴在所述第二阶梯中被压缩，使得在所述第二阶梯中的所述完整微滴的高度小于在所述第二阶梯中的所述完整微滴的长度。
15.权利要求13所述的方法，其中所述第二流体的所述完整微滴在所述第三阶梯中被压缩，使得在所述第三阶梯中的所述完整微滴的高度小于在所述阶梯中的所述完整微滴的长度。
16.权利要求15所述的方法，其中在所述第二阶梯中的所述完整微滴的高度小于在所述第三阶梯中的所述完整微滴的高度。
17.权利要求13所述的方法，其中所述第二流体包含目的分析物。
18.权利要求13所述的方法，其中所述第二流体包含测定试剂。
19.权利要求18所述的方法，其中所述测定试剂为聚合酶链反应[PCR]引物、盐或酶。
20.权利要求13所述的方法，其中所述第一流体为油。
21.权利要求13所述的方法，其中所述第一流体为疏水性液体，并且所述第二流体为亲水性液体。
22.权利要求13所述的方法，其中所述第一流体为亲水性液体，并且所述第二流体为疏水性液体。
23.权利要求13所述的方法，其中所述第一流体或所述第二流体包含乳化剂。
24.权利要求23所述的方法，其中所述乳化剂包含非离子型表面活性剂。
25.权利要求23所述的方法，其中所述乳化剂包含封闭蛋白。
26.权利要求13所述的方法，其中所述第二流体的完整微滴在所述第二阶梯中以1至30个完整微滴/秒的速率形成。
27.权利要求13所述的方法，其中所述第二流体的完整微滴在所述第二阶梯中以10至20个微滴/秒的速率形成。
28.权利要求13所述的方法，其中第二流体的所述完整微滴的平均直径为40微米至300微米。
29.权利要求13所述的方法，其中第二流体的所述完整微滴的平均直径为50微米至300微米。
30.权利要求13所述的方法，其中所述第一流体与所述第二流体之间形成的乳剂的单分散性为2％至10％。
31.权利要求13所述的方法，其中所述第一流体与所述第二流体之间形成的乳剂的单分散性为4％至6％。
32.乳化装置，其包含：
具有入口部的通道，其具有通道高度CH；
与所述入口部流体连通的第一阶梯，其中：
所述第一阶梯具有梯面长度T1和阶梯高度SH1，
SH1比CH大竖板高度R1，并且
R1大于零；
与所述第一阶梯流体连通的第二阶梯，其中：
所述第二阶梯具有梯面长度T2和阶梯高度SH2，
SH2比SH1大竖板高度R2，并且
R2大于零；
与所述第二阶梯流体连通的第三阶梯，其中：
所述第三阶梯具有阶梯高度SH3，
SH3比SH2大竖板高度R3，并且
R3大于零。
33.权利要求32所述的乳化装置，其中：
所述通道具有宽度CW；
所述第一阶梯的宽度W1大于CW；
所述第二阶梯的宽度W2等于W1；并且
所述第三阶梯的宽度W3大于W1。
34.权利要求32所述的乳化装置，其还包含：
多个入口部，其中第一多个入口部中的每个入口部具有高度CH；
多个第一阶梯，其中所述多个第一阶梯中的每个第一阶梯：
与所述多个入口部中的入口部流体连通，并且
具有长度T1和高度SH1，其中SH1比CH大竖板高度R1，并且其中R1大于零；
多个第二阶梯，其中所述多个第二阶梯中的每个第二阶梯：
与所述多个第一阶梯中的第一阶梯流体连通，
与所述第三阶梯流体连通，并且
具有长度T2和高度SH2，其中SH2比SH1大竖板高度R2，并且R2大于零。
35.权利要求34所述的乳化装置，其包含2至100个入口部。
36.形成乳剂的方法，所述方法包括：
获得根据权利要求11、12、34或35中任一项所述的乳化装置，
其中多个第一阶梯、多个第二阶梯和多个第三阶梯包含基本上静态的第一流体；以及
将第二流体引入多个入口部中并通过所述多个第一阶梯、所述多个第二阶梯和所述多个第三阶梯，其中：
所述第二流体的部分微滴在所述多个第一阶梯的每个中形成，
所述第二流体的完整微滴在所述多个第二阶梯的每个中在所述多个第一阶梯与所述第二阶梯之间过渡期间形成，并且
所述第二流体的所述完整微滴被从所述多个第二阶梯导向所述第三阶梯。
37.权利要求36所述的方法，其中每分钟至少10,000个完整微滴被从所述多个第二阶梯导向所述第三阶梯。
38.权利要求37所述的方法，其中所述微滴的平均分散度小于10％。
39.权利要求37所述的方法，其中所述微滴的平均分散度小于5％。
40.权利要求36所述的方法，其中在所述第三阶梯中的微滴的平均微滴直径为40至300微米。
41.乳化装置，其包含：
第一多个通道，其包含被配置成形成具有第一直径之微滴的第一几何结构；以及
第二多个通道，其包含被配置成形成具有第二直径之微滴的第二几何结构，所述第二直径大于所述第一直径。
42.权利要求41所述的乳化装置，其中：
所述第一多个通道中的每个通道包含入口部、第一阶梯和第二阶梯；并且
所述第二多个通道中的每个通道包含入口部、第一阶梯和第二阶梯。
43.权利要求42所述的乳化装置，其中：
所述第一多个通道中的每个通道中的第一阶梯包含阶梯高度FSH1；
所述第二多个通道中的每个通道中的第一阶梯包含阶梯高度SSH1；并且
SSH1比FSH1大至少50％。
44.权利要求42所述的乳化装置，其中：
所述第一多个通道中的每个通道中的第一阶梯包含阶梯高度FSH1；
所述第二多个通道中的每个通道中的第一阶梯包含阶梯高度SSH1；并且
SSH1比FSH1大至少100％。
45.权利要求42所述的乳化装置，其中：
所述第一多个通道中的每个通道中的第二阶梯包含阶梯高度FSH2；
所述第二多个通道中的每个通道中的第二阶梯包含阶梯高度SSH2；并且
SSH2比FSH2大至少50％。
46.权利要求42所述的乳化装置，其中：
所述第一多个通道中的每个通道中的第二阶梯包含阶梯高度FSH2；
所述第二多个通道中的每个通道中的第二阶梯包含阶梯高度SSH2；并且
SSH2比FSH2大至少100％。
47.权利要求46所述的乳化装置，其中：
FSH2为10μm至50μm；并且
SSH2为80μm至200μm。
48.权利要求46所述的乳化装置，其中：
FSH2为20μm至30μm；并且
SSH2为100μm至140μm。
49.权利要求46所述的乳化装置，其中：
FSH2为约27μm；并且
SSH2为约120μm。
50.权利要求42所述的乳化装置，其中：
所述第一多个通道中的每个通道包含具有阶梯高度FSH3的第三阶梯；
所述第二多个通道中的每个通道包含具有阶梯高度SSH3的第三阶梯；并且
FSH3等于SSH3。
51.权利要求42所述的乳化装置，其中：
所述第一多个通道中的每个通道包含具有阶梯高度FSH3的第三阶梯；
所述第二多个通道中的每个通道包含具有阶梯高度SSH3的第三阶梯；并且
FSH3小于SSH3。
52.形成乳剂的方法，所述方法包括：
获得包含第一多个通道和第二多个通道的乳化装置，其中：
所述第一多个通道各自包含含有基本上静态的第一流体的一系列阶梯，并且
所述第二多个通道各自包含含有基本上静态的所述第一流体的一系列阶梯；
将第二流体引入所述第一和第二多个通道中，其中：
所述第二流体的第一微滴在所述第一多个通道的每个中形成，
所述第二流体的第二微滴在所述第二多个通道的每个中形成，并且
所述第二微滴的直径大于第一直径。
53.权利要求52所述的方法，其中：
第一直径为10μm至50μm；并且
第二直径为80μm至300μm。
54.权利要求52所述的方法，其中：
第一直径为20μm至30μm；并且
第二直径为100μm至140μm。
55.权利要求52所述的方法，其中：
第一直径为约27μm；并且
第二直径为约120μm。
56.形成乳剂的方法，所述方法包括：
获得乳化装置，其包含：
第一多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯，
第二多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯，其中所述第一和第二多个通道的多个第一阶梯、多个第二阶梯和多个第三阶梯包含基本上静态的第一流体；
将第二流体引入所述第一和第二多个通道的多个入口部中并通过所述多个第一阶梯、所述多个第二阶梯和所述多个第三阶梯，其中：
所述第二流体的部分微滴在所述第一和第二多个通道的所述多个第一阶梯的每个中形成，
所述第二流体的第一完整微滴在所述第一多个通道的每个中在所述多个第一阶梯与所述多个第二阶梯之间的交界处形成，
所述第二流体的第二完整微滴在所述第二多个通道的每个中在所述多个第一阶梯与所述多个第二阶梯之间的交界处形成，并且
所述第二流体的所述第二完整微滴大于所述第二流体的所述第一完整微滴。
57.权利要求56所述的方法，其中：
所述第一完整微滴的直径为10μm至50μm；并且
所述第二完整微滴的直径为80μm至200μm。
58.权利要求56所述的方法，其中：
所述第一完整微滴的直径为20μm至30μm；并且
所述第二完整微滴的第二直径为100μm至140μm。
59.权利要求56所述的方法，其中：
所述第一完整微滴的直径为约27μm；并且
所述第二完整微滴的直径为约120μm。
60.形成乳剂的方法，所述方法包括：
获得乳化装置，其包含：
第一多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯，
第二多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯，
第三多个通道，其各自具有入口部、第一阶梯、第二阶梯和第三阶梯，其中所述第一、第二和第三多个通道的多个第一阶梯、多个第二阶梯和多个第三阶梯包含基本上静态的第一流体；
将第二流体引入所述第一、第二和第三多个通道的多个入口部中并通过所述多个第一阶梯、所述多个第二阶梯和所述多个第三阶梯，其中：
所述第二流体的部分微滴在所述第一、第二和第三多个通道的所述多个第一阶梯的每个中形成，
所述第二流体的第一完整微滴在所述第一多个通道的每个中在所述多个第一阶梯与所述多个第二阶梯之间的交界处形成，
所述第二流体的第二完整微滴在所述第二多个通道的每个中在所述多个第一阶梯与所述多个第二阶梯之间的交界处形成，并且
所述第二流体的第三完整微滴在所述第三多个通道的每个中在所述多个第一阶梯与所述多个第二阶梯之间的交界处形成，
所述第二流体的所述第二完整微滴大于所述第二流体的所述第一完整微滴，并且
所述第二流体的所述第三完整微滴大于所述第二流体的所述第二完整微滴。
61.权利要求60所述的方法，其中：
所述第一完整微滴的直径为25μm至65μm；并且
所述第二完整微滴的直径为80μm至200μm；并且
所述第三完整微滴的直径为200μm至400μm。
62.权利要求60所述的方法，其中：
所述第一完整微滴的直径为35μm至55μm；
所述第二完整微滴的直径为100μm至140μm；并且
所述第三完整微滴的直径为250μm至350μm。
63.权利要求60所述的方法，其中：
所述第一完整微滴的直径为约45μm；并且
所述第二完整微滴的直径为约120μm；并且
所述第三完整微滴的直径为约300μm。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110075934A (zh) * 2019-03-25 2019-08-02 绍兴钠钇光电有限公司 一种3d打印微流控器件及其大通量制备单分散乳液的方法
WO2020069603A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 S.M. Research Inc. A micro-pipette tip for forming micro-droplets
CN112399882A (zh) * 2018-04-16 2021-02-23 派特恩生物技术有限公司 用于形成二维微滴阵列的方法和设备

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016189383A1 (en) * 2015-05-22 2016-12-01 The Hong Kong University Of Science And Technology Droplet generator based on high aspect ratio induced droplet self-breakup
JP7039575B2 (ja) * 2016-09-30 2022-03-22 アモーレパシフィック コーポレーション マイクロ流体チャネルに基づいて瞬時に乳化された乳化物を含有する化粧品組成物調製装置
CN106492716B (zh) * 2016-12-20 2024-01-30 中国工程物理研究院激光聚变研究中心 一体式双重乳粒发生装置及其加工方法
JP7071056B2 (ja) * 2017-02-27 2022-05-18 シスメックス株式会社 液体送液方法および液体送液装置
US10544413B2 (en) 2017-05-18 2020-01-28 10X Genomics, Inc. Methods and systems for sorting droplets and beads
CN117143960A (zh) 2017-05-18 2023-12-01 10X基因组学有限公司 用于分选液滴和珠的方法和系统
US20190064173A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 10X Genomics, Inc. Methods of producing droplets including a particle and an analyte
WO2019083852A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. MICROFLUIDIC CHANNEL NETWORKS FOR PARTITIONING
US10486155B1 (en) * 2018-10-22 2019-11-26 Klaris Corporation Vacuum-loaded, droplet-generating microfluidic chips and related methods
WO2020176882A1 (en) * 2019-02-28 2020-09-03 10X Genomics, Inc. Devices, systems, and methods for increasing droplet formation efficiency
PL3721980T3 (pl) * 2019-04-12 2023-04-17 Paris Sciences Et Lettres Mikroprzepływowe urządzenie do wytwarzania emulsji
US11919002B2 (en) 2019-08-20 2024-03-05 10X Genomics, Inc. Devices and methods for generating and recovering droplets
WO2021035044A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Pattern Bioscience, Inc. Microfluidic chips including a gutter to facilitate loading thereof and related methods
US20210053065A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Pattern Bioscience, Inc. Methods for Screening and Subsequent Processing of Samples Taken from Non-Sterile Sites
US10953404B1 (en) 2020-04-24 2021-03-23 Pattern Bioscience, Inc. Apparatuses for contactless loading and imaging of microfluidic chips and related methods
WO2022086972A1 (en) * 2020-10-19 2022-04-28 Pattern Bioscience, Inc. Microfluidic chips including a gutter having a trough and a ridge to facilitate loading thereof and related methods
EP3991847A1 (en) * 2020-10-27 2022-05-04 Shenzhen Biorain Biotechnology Co., Ltd. Microfluidic chip

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005211857A (ja) * 2004-02-02 2005-08-11 National Food Research Institute 樹脂製マイクロチャネル基板及びその製造方法
CN101448563A (zh) * 2006-05-18 2009-06-03 玛里琳·雷纳 制造膜的方法及用于乳化的膜
CN102580593A (zh) * 2004-11-17 2012-07-18 万罗赛斯公司 使用微通道处理技术的乳化方法
US20140024023A1 (en) * 2012-07-23 2014-01-23 Bio- Rad Laboratories, Inc Droplet generation system with features for sample positioning
CN104159661A (zh) * 2011-12-14 2014-11-19 领先漩涡工艺技术有限公司 改进的动力混合器

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1142002A (en) 1965-03-24 1969-02-05 Fisons Ltd Granulation
US3713780A (en) * 1971-02-01 1973-01-30 Becton Dickinson Co Apparatus for chemical testing
US5455315A (en) 1994-06-06 1995-10-03 Xerox Corporation Emulsion polymerization processes and toners thereof
FR2747321B1 (fr) 1996-04-16 1998-07-10 Centre Nat Rech Scient Procede de preparation d'une emulsion
AU2002320576A1 (en) * 2001-07-17 2003-03-03 Paolo Gasparini Microstructure for particle and cell separation, identification, sorting, and manipulation
DE102005037401B4 (de) 2005-08-08 2007-09-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Bildung einer Emulsion in einem fluidischen Mikrosystem
DE102006036815B4 (de) * 2006-08-07 2010-01-14 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Emulgiereinrichtung und Verfahren zur Bildung einer Emulsion
JP5157629B2 (ja) * 2008-05-14 2013-03-06 ソニー株式会社 流路基板
US9598725B2 (en) * 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
US9464319B2 (en) 2009-03-24 2016-10-11 California Institute Of Technology Multivolume devices, kits and related methods for quantification of nucleic acids and other analytes
US9216413B2 (en) * 2009-07-07 2015-12-22 Boehringer Ingelheim Microparts Gmbh Plasma separation reservoir
FR2950544B1 (fr) 2009-09-29 2011-12-09 Ecole Polytech Circuit microfluidique
US20110236277A1 (en) * 2010-03-24 2011-09-29 Electronics And Telecommunications Research Institute Microfluid control device and method of manufacturing the same
FR2958186A1 (fr) 2010-03-30 2011-10-07 Ecole Polytech Dispositif de formation de gouttes dans un circuit microfluide.
EP2714254B1 (en) * 2011-05-23 2017-09-06 President and Fellows of Harvard College Control of emulsions, including multiple emulsions
US8944083B2 (en) 2011-06-15 2015-02-03 Ut-Battelle, Llc Generation of monodisperse droplets by shape-induced shear and interfacial controlled fusion of individual droplets on-demand
JP2015513451A (ja) * 2012-02-08 2015-05-14 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 流体分割を用いる液滴形成
DE102013200927A1 (de) * 2013-01-22 2014-07-24 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zum Anreichern und Vereinzeln von Zellen mit Konzentrationen über mehrere logarithmische Stufen
US9631179B2 (en) * 2013-03-15 2017-04-25 Angle North America, Inc. Methods for segregating particles using an apparatus with a size-discriminating separation element having an elongate leading edge
US10620120B2 (en) * 2016-06-30 2020-04-14 The University Of North Carolina At Greensboro Nanoplasmonic devices and applications thereof
US20200290048A1 (en) * 2017-08-22 2020-09-17 10X Genomics, Inc. Methods and systems for generating droplets
US20190099751A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Regents Of The University Of Minnesota Compact Open-Channel Microfluidic Diodes Based On Two-Tier Capillary Junctions
EP3724658A1 (en) * 2017-12-12 2020-10-21 10X Genomics, Inc. Systems and methods for single cell processing
US11465148B2 (en) * 2018-04-16 2022-10-11 Pattern Bioscience, Inc. Methods and apparatus for forming 2-dimensional drop arrays
US20210031189A1 (en) * 2018-10-22 2021-02-04 Pattern Bioscience, Inc. Droplet-Generating Microfluidic Chips and Related Methods

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005211857A (ja) * 2004-02-02 2005-08-11 National Food Research Institute 樹脂製マイクロチャネル基板及びその製造方法
CN102580593A (zh) * 2004-11-17 2012-07-18 万罗赛斯公司 使用微通道处理技术的乳化方法
CN101448563A (zh) * 2006-05-18 2009-06-03 玛里琳·雷纳 制造膜的方法及用于乳化的膜
CN104159661A (zh) * 2011-12-14 2014-11-19 领先漩涡工艺技术有限公司 改进的动力混合器
US20140024023A1 (en) * 2012-07-23 2014-01-23 Bio- Rad Laboratories, Inc Droplet generation system with features for sample positioning

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112399882A (zh) * 2018-04-16 2021-02-23 派特恩生物技术有限公司 用于形成二维微滴阵列的方法和设备
CN112399882B (zh) * 2018-04-16 2023-08-01 派特恩生物技术有限公司 用于形成二维微滴阵列的方法和设备
WO2020069603A1 (en) 2018-10-01 2020-04-09 S.M. Research Inc. A micro-pipette tip for forming micro-droplets
CN110075934A (zh) * 2019-03-25 2019-08-02 绍兴钠钇光电有限公司 一种3d打印微流控器件及其大通量制备单分散乳液的方法

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