WO2014107035A1 - Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 - Google Patents

Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 Download PDF

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val
exendin
insulin secreting
glu
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정성엽
황상연
최인영
박성희
권세창
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한미약품 주식회사
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Definitions

  • the present invention relates to a derivative of the insulin secretion peptides modified to have increased insulin secretion activity and hypoglycemic activity and a pharmaceutical composition comprising the same, wherein the insulin secretion peptide derivative according to the invention is characterized in that the N-terminal charge of the insulin secretion peptide It is characterized by being modified to have a neutral or net negative charge.
  • Peptides generally have low stability, are easily denatured, degraded by proteolytic enzymes in the body, and lose their activity. Also, since peptides are relatively small and easily removed through the kidneys, peptides containing pharmacologically active peptides in the blood Peptide drugs need to be frequently administered to patients to maintain concentrations and titers.
  • Peptide drugs are mostly administered to patients in the form of injectables, so that frequent injections are required to maintain blood levels of bioactive peptides, which causes tremendous pain in the patient.
  • efforts are being actively made to maximize the drug efficacy by increasing the blood stability of the peptide drug and maintaining the blood drug concentration for a long time.
  • long-acting formulations of such peptide drugs should increase the stability of the peptide drug while keeping the titer of the drug itself high enough and not elicit an immune response in the patient. Accordingly, there have been attempts to alter specific amino acid sequences sensitive to proteolytic enzymes as a method for stabilizing peptide drugs and inhibiting degradation by proteolytic enzymes.
  • GLP-1 (7-37 or 7-36 amide), which acts to reduce blood glucose levels and is effective in treating type 2 diabetes, has a very short bioactive half-life of less than 4 minutes, which is dipep It is due to the loss of titer of GLP-1 by cleavage between the 8th (Ala) and 9th (Asp) amino acids of GLP-1 by thidyl pepdidase IV (DPP IV). Accordingly, a GLP-1 derivative has been developed that maintains physiological activity while increasing resistance to DPP IV by substituting Ala 8 of GLP-1 with Gly, Leu or D-Ala.
  • the N-terminal amino acid His 7 of GLP-1 is also very important for the activity of GLP-1 and at the same time is a target of DPP IV.
  • the N-terminus was modified with an alkyl or acyl group, or His 7 was N-methylated or alpha-methylated to increase DPP IV resistance and maintain physiological activity.
  • the receptor affinity of the derivatives modified with His 7 was significantly decreased, and the problem of decreasing the secretion ability of cAMP at the same concentration was reported (Gallwitz et al. , Regulatory Peptide 79: 93-102, 1999; Gallwitz et al., Regulatory Peptide 86: 103-111, 2000).
  • exendin-4 is composed of His-Gly rather than His-Ala, which is a sequence of GLP-1 serving as a substrate of DPP IV. It has a physiological activity higher than -1 and thus has a longer half-life in the body than GLP-1.
  • exendin-4 (exenatide, exenatide) should be administered twice daily to the patient, which is still a significant burden on the patient. It can not be.
  • the inventors have made intensive efforts to increase the activity and blood stability of the insulin secreting peptides, and as a result, derivatives that have modified the charge of the N-terminal amino acids of the insulin secreting peptides have superior pharmacokinetics and higher
  • the present invention has been completed by confirming that it exhibits insulin secretion activity.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating diabetes containing the insulin secretion peptide derivative as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating diabetes using the insulin secreting peptide derivative.
  • the present invention provides an insulin secreting peptide derivative in which the N-terminal charge of the insulin secreting peptide is modified.
  • the present invention provides insulin secretory peptide derivatives wherein the N-terminal amino group or amino acid residues of the insulin secreting peptide have been modified to have either a neutral charge or a net negative charge.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is chemically modified to have a neutral or net negative charge by removing or replacing the alpha-amino group of the N-terminal histidine residue of the insulin secreting peptide, or by removing the alpha-carbon. It is characterized by a modification.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is freed from the N-terminal amino group of the insulin secreting peptide; Replacing the N-terminal amino group with a hydroxyl group; Modifying the N-terminal amino group with two methyl residues; Replacing the N-terminal amino group with a carboxyl group; Removing the alpha carbon of the N-terminal histidine residue leaving only the imidazoleacetyl residue; The N-terminal amino group is removed and a chemical modification corresponding to at least one of the C-terminal carboxyl groups substituted with propylamide is introduced.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is a N-terminal histidine residue of the insulin secreting peptide wherein the des-amino-histidyl, dimethyl-histidyl, beta-hydroxy imidazopropionyl, 4 -Is substituted with a material selected from the group consisting of imidazoacetyl and beta-carboxy imidazopropionyl.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention has N-terminal histidine residues of insulin secreting peptides substituted with des-amino-histidyl, and C-terminal carboxyl groups are substituted with propylamide. Characterized in that substituted.
  • the insulin secreting peptide in the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is characterized by having a binding ability to the GLP-1 receptor.
  • the insulin secreting peptide in the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is represented by GLP-1 represented by SEQ ID NO: 1, exendin-4 represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3
  • GLP-1 represented by SEQ ID NO: 1
  • exendin-4 represented by SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 3 To be exendin-3, an auxintomodulin represented by SEQ ID NO: 5, a GIP represented by SEQ ID NO: 6, or an analog thereof.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the invention has an increased dissociation constant (Kd) relative to the native insulin secreting peptide for the GLP-1 receptor due to the modification of the N-terminal charge do.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is a N-terminal histidine residue of GLP-1, exendin-4, exendin-3, oxyntomodulin, GIP or an analog thereof. -Substituted by histidyl, dimethyl-histidyl, beta-hydroxy imidazopropionyl, 4-imidazoacetyl or beta-carboxy imidazopropionyl.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is a N-terminal histidine residue of GLP-1, exendin-4, exendin-3, oxyntomodulin, GIP or an analog thereof is des-amino. -Is substituted with histidyl, and the C-terminal carboxyl group is substituted with propylamide.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention comprises desamino-histidyl-exendin-4, wherein the N-terminal amino group of exendin-4 is removed; Beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4 in which the N-terminal amino group of exendin-4 is substituted with a hydroxyl group; Beta-carboxyimidazopropyl-exendin-4 in which the N-terminal amino group of exendin-4 is substituted with a carboxyl group; Dimethyl-histidyl-exendin-4 wherein the N-terminal amino group of exendin-4 is modified with two methyl residues; And imidazoacetyl-exendin-4 from which alpha carbon of histidine, which is the first amino acid of exendin-4, has been removed.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention removes the N-terminal amino group of exendin-4 and the DA-exendin-4- with its C-terminal carboxyl group substituted with propylamide. It is characterized in that the propyl-amide (DA-Exendin-4-propyl-amide).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating diabetes comprising the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative as described above as an active ingredient.
  • the invention provides a method of treating diabetes in a subject comprising administering to the subject in need thereof a therapeutically effective amount of an N-terminal charge modified insulin secreting peptide derivative as described above. do.
  • N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivatives according to the present invention can be rapidly dissociated from the GLP-1 receptor to prevent clearance of the insulin secreting peptide by the receptor and to cause less desensitization. can do.
  • the insulin secretion peptide derivatives of which the N-terminal charge is modified according to the present invention have increased insulin secretion activity and in vivo blood glucose lowering in comparison with the native insulin secretion peptides due to the above-described changes in binding capacity to the GLP-1 receptor. It can be very useful for treating diabetes.
  • Figures 1a to 1d shows the concentration-specific binding curve of the N-terminal charge-modified insulin secretion peptide derivatives according to the present invention to the GLP-1 receptor
  • Figure 1a is a natural type exendin-4
  • Figure 1b is CA- Exendin-4
  • FIG. 1C shows DA-Exendin-4
  • FIG. 1D shows DA-Exendin-4-propyl-amide
  • FIG. 1E shows HY-Exendin-4.
  • Figure 2 is a result of measuring the insulin secretion activity of the natural type exendin-4 and the N-terminal charge modified CA- exendin-4 derivatives according to the present invention.
  • Figure 3 is a result of measuring the blood glucose lowering ability of the natural type exendin-4 and the N-terminal charge modified CA- exendin-4 derivatives according to the present invention in a diabetic model animal.
  • the present invention relates to insulin secreted peptide derivatives with modified N-terminal charges of the insulin secreted peptide.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is characterized by changing the N-terminal charge of the insulin secreting peptide to cause rapid dissociation with the receptor.
  • insulin secreting peptide derivative refers to the neutral or net negative charge of the N-terminal charge of a naturally occurring insulin secreting peptide, analog or fragment thereof, by means of chemical, genetic or physical manipulation, while possessing intrinsic insulin secretion function. Refers to a modified to have.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is preferably chemically modified such that the N-terminal amino group or amino acid residue of the insulin secreting peptide at neutral pH has a neutral or net negative charge. More preferably, the derivative of which the positive charge of the first amino acid residue at the N-terminus of the insulin secreting peptide according to the invention is modified to a neutral or net negative charge.
  • insulin secreting peptide in the present invention is a peptide having insulin secretory function, which stimulates the synthesis and expression of insulin of pancreatic beta cells.
  • Insulin secreting peptides suitable for the present invention can be used as long as they are capable of binding to the GLP-1 receptor and exhibit physiological activity.
  • GLP-1 (7-37), SEQ ID NO: Exendin-4 of SEQ ID NO: 2, exendin-3 of SEQ ID NO: 3, oxyntomodulin of SEQ ID NO: 5, glucose-dependent insulinotropic polypeptide of SEQ ID NO: 6, GIP), analogs or fragments thereof.
  • analogue of insulin secreting peptide refers to a peptide having insulin secretion function as a peptide having one or more amino acid sequences different from the native insulin secreting peptide.
  • analogues of the insulin secreting peptides according to the invention refer to polypeptides that show homology in an amino acid sequence of at least 80% or more as compared to the native insulin secreting peptide, wherein some groups of amino acid residues are chemically substituted (eg : alpha-methylation, alpha-hydroxylation), removed (eg deamination) or modified (eg N-methylation).
  • analogs of the insulin secreting peptides mean that the insulin secreting function exhibits equal or more compared to the native insulin secreting peptides, but the extent of analogs of the insulin secreting peptides according to the invention is necessarily to this extent. It is not limited to those with levels of insulin secretion.
  • fragment of insulin secreting peptide refers to a form in which one or more amino acids are added or deleted at the N-terminus or C-terminus of a native insulin secreting peptide while retaining insulin secreting function. Amino acids that do not exist in nature (eg D-type amino acids) are possible.
  • GLP-1 is a hormone secreted by the small intestine, which generally promotes insulin biosynthesis and secretion, inhibits glucagon secretion and promotes cellular uptake of glucose.
  • the glucagon precursor is broken down into three peptides: glucagon, GLP-1 and GLP-2.
  • GLP-1 means GLP-1 (1 to 37), and has no insulin secretion function, and is processed to form GLP-1 (7-37) to become active GLP-1 (7-37).
  • GLP-1 (7-37) has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the GLP-1 analog is Arg 34 -GLP-1 (7-37), Gly 8 -GLP-1 (7-36) -amide, Gly 8 -GLP-1 (7-37), Val 8- GLP-1 (7-36) -amide, Val 8 -GLP-1 (7-37), Val 8 Asp 22 -GLP-1 (7-36) -amide, Val 8 Asp 22 -GLP-1 (7- 37), Val 8 Glu 22 -GLP-1 (7-36) -amide, Val 8 Glu 22 -GLP-1 (7-37), Val 8 Lys 22 -GLP-1 (7-36) -amide, Val 8 Lys 22 -GLP-1 (7-37), Val 8 Arg 22 -GLP-1 (7-36) -amide, Val 8 Arg 22 -GLP-1 (7-37), Val 8 His 22 -GLP- 1 (7-36) -amide, Val 8 His 22 -GLP-1 (7-37), Val 8 Trp 16 Glu 22 -GLP-1 (7-37), Val 8 Trp 16 Glu
  • exendin-4 is a polypeptide of 39 amino acids showing 53% amino acid sequence similarity with GLP-1, having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Exendin-3 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, which is an exendin-4 analog that differs only from exendin-4 and amino acids 2 and 3.
  • Exendin-3 may be represented by Ser 2 Asp 3 -exendin-4 (1-39) in which amino acids at positions 2 and 3 of exendin-4 are substituted with serine and aspartic acid, respectively.
  • ZP-10 As another exendin-4 analog, ZP-10, wherein the amino acids at positions 38 and 39 of exendin-4 are substituted with serine and lysine, respectively, is Ser 38 Lys 39 -Exendin-4 (1-39) -LysLysLysLysLys-. It is represented by an amide and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • Oxintomodulin is a peptide made from pre-glucagon, a precursor of glucagon, and is released from L-cells of the small intestine in proportion to nutrient intake with GLP-1.
  • Oxintomodulin is a peptide hormone consisting of 37 amino acids represented by SEQ ID NO: 5, which inhibits food intake, enhances satiety, and shows the lipolytic function of glucagon.
  • Glucose-dependent insulin secreting polypeptide is an incretin that regulates the secretion of insulin in the pancreas in response to glucose concentration in response to intestinal nutrient uptake, consisting of 42 amino acids set forth in SEQ ID NO: 6 and intestine Is secreted from K cells. GIP not only stimulates glucose secretion in beta cells but also promotes insulin synthesis, induces beta cell proliferation, and has an inhibitory effect on death.
  • insulin secreting peptides that differ in one or more amino acid sequences and are deaminated to N-terminal amino acid residues are also included.
  • the natural insulin secreting peptides and modified insulin secreting peptide derivatives used in the present invention can be synthesized through solid phase synthesis, and most natural polypeptides including natural insulin secreting peptides are recombinant. It can also be produced.
  • the GLP-1, Exendin-4, Exendin-3, Oxintomodulin, or analog of GIP may be substituted, deleted, and / or substituted with one or more amino acids of native GLP-1, Exendin-4, or Exendin-3.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the invention is characterized in that the N-terminal amino group or amino acid residue of the native insulin secreting peptide, analog or fragment thereof, is modified to have a neutral or net negative charge.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention is a derivative chemically modified such that the positive charge of the N-terminal first amino acid residue of the insulin secreting peptide has a neutral or net negative charge.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention wherein the N-terminus is modified to have a neutral or net negative charge, is characterized by having a higher dissociation constant (Kd) for the GLP-1 receptor as compared to the native insulin secreting peptide.
  • Kd dissociation constant
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention has a dissociation constant for the GLP-1 receptor that is increased by at least 2 times, more preferably at least 3 times and most preferably at least 6 times compared to the native insulin secreting peptide. Modified to have Kd), but is not limited thereto.
  • Insulin secreted peptide derivatives according to the invention wherein the N-terminal positive charge of the insulin secreting peptide is modified to neutral or net negative charge can be prepared by a variety of methods known in the art, and preferably N of the insulin secreting peptide having a positive charge. It can be modified to have a neutral or net negative charge by removing or replacing the alpha-amino group of the terminal histidine residue or by removing the alpha-carbon.
  • the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative according to the present invention includes a derivative in which the N-terminal amino group of the insulin secreting peptide is removed (desamino-histidyl derivative); A derivative in which its N-terminal amino group is substituted with a hydroxyl group (beta-hydroxy imidazopropionyl-derivative); Derivatives in which the N-terminal amino group thereof is modified with two methyl residues (dimethyl-histidyl-derivative); A derivative in which its N-terminal amino group is substituted with a carboxyl group (beta-carboxy imidazopropionyl-derivative); The imidazoacetyl-derivative may be included by removing the alpha carbon of its N-terminal histidine residue, leaving only the imidazoacetyl group, and may be modified as long as the N-terminal positive charge can be transformed into a neutral or net negative charge.
  • N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative may be represented by the following structural formula.
  • the C-terminal carboxyl group of the desamino-histidyl-derivative having the N-terminal amino group removed is substituted with propylamide.
  • Derivatives may be included.
  • N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative may be represented by the following structural formula.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the invention N-terminal histidine residues of GLP-1, exendin-4, exendin-3, auxintomodulin, GIP, analogs or fragments thereof are des-amino-histidyl, dimethyl-histidyl, beta-hydroxy imide
  • the charge at the N-terminus may be modified by substitution with dazopropionyl, 4-imidazoacetyl or beta-carboxy imidazopropionyl.
  • the N-terminal charge modified insulin secretion peptide derivative according to the invention can be represented by the following formula (1).
  • R 1 is selected from the group consisting of des-amino-histidyl, dimethyl-histidyl, beta-hydroxy imidazopropionyl, 4-imidazoacetyl and beta-carboxy imidazopropionyl,
  • R 2 is —NH 2 or —OH
  • X is Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ila Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly;
  • the insulin secreting peptide derivative is a derivative in which the N-terminal charge of exendin-4 is modified, and desamino-histidyl-exendin-4 from which the N-terminal amino group of exendin-4 is removed.
  • insulin secreting peptide derivative according to the present invention is a N-terminal histidine residue of GLP-1, exendin-4, exendin-3, auxintomodulin, GIP, an analog or fragment thereof is des-amino-histidyl Substituted and its C-terminal carboxyl group may be substituted with propylamide.
  • the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative comprises desamino-histidyl-exendin-4 (DA-exendin-4) wherein the N-terminal amino group of exendin-4 has been removed.
  • the derivatives are those that remove or substitute the alpha-amino group of the amino-terminal histidine residue or remove the alpha-carbon, and the other amino acid sequences are not particularly limited as long as the physiological activity is maintained.
  • Modification of the N-terminal positive charge to a neutral or net negative charge in the insulin secreting peptide derivative of the present invention can induce dissociation with the GLP-1 receptor to prevent clearance of the insulin secreting peptide by the receptor. This may lead to less desensitization, leading to superior physiological activity.
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention increases the insulin secretion activity compared to the natural insulin secreting peptide due to the change in the binding capacity to the GLP-1 receptor due to the change in the N-terminal charge of the insulin secreting peptide neutral or net positive charge In addition, it can exhibit excellent blood glucose lowering ability in vivo .
  • insulin secreting peptide derivatives in which the positive charge of the N-terminal amino acid of the insulin secreting peptide is neutral or net negatively charged has a higher dissociation constant (Kd) than the native insulin secreting peptide for the GLP-1 receptor. It was confirmed that this can repeat the frequent binding / dissociation with the GLP-1 receptor (see Example 1).
  • the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative exhibited about two-fold increased insulin secretion activity compared to the native-type insulin secreting peptide with no charge-modifying (see Example 2).
  • (db / db mice) showed about 5-fold increased blood glucose lowering ability compared to the native insulin secreting peptide (see Example 3).
  • the insulin secreting peptide derivative according to the present invention in which the N-terminal charge of the insulin secreting peptide is modified, increases the dissociation constant for the GLP-1 receptor, that is, increases the dissociation from the GLP-1 receptor, resulting in excellent blood stability and insulin. It can be seen that the secretory ability.
  • altering the N-terminal charge of an insulin secreting peptide to a neutral or net negative charge can increase the binding capacity of the GLP-1 receptor, especially dissociation from the receptor, thereby increasing the biological activity of the insulin secreting peptide.
  • This is the first fact identified in the present invention. Therefore, the excellent blood stability and insulin secretion activity of the insulin secreting peptide derivative according to the present invention will be useful for maximizing the effect of type 2 diabetes treatment.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating diabetes, which contains, as an active ingredient, a modified insulin secreting peptide derivative at the N-terminus of an insulin secreting peptide.
  • N-terminal charge modified insulin secreting peptide derivative is as described above.
  • N-terminal charge-modified insulin secretion peptide derivative according to the present invention has a high insulin secretion activity and blood glucose lowering ability compared to the natural insulin secretion peptide, it can be used as an excellent diabetes treatment.
  • the pharmaceutical composition for treating diabetes of the present invention can effectively treat diabetes by administering to a subject in need thereof.
  • the scope of the present invention includes methods of treating diabetes in a subject comprising administering to a subject in need thereof a therapeutically effective amount of an N-terminal charge modified insulin secreting peptide derivative as described above. .
  • treatment means any action in which the symptoms of diabetes improve or benefit altered by administration of an N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative or a pharmaceutical composition comprising the same.
  • the term “administration” means introducing any substance to a subject, i.e., an N-terminal charge modified insulin secreting peptide derivative or a pharmaceutical composition comprising the same, in any suitable manner, Its route of administration can be administered via any general route so long as the drug can reach the target tissue.
  • the route of administration may be, but is not limited to, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, and the like.
  • the oral composition is preferably formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach. It may preferably be administered in the form of an injection.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device that allows the active substance to migrate to the target cell.
  • compositions comprising derivatives of the invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may be used as oral administration binders, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavoring agents, etc., in the case of injections, buffers, preservatives , A non-solvent, solubilizer, isotonic agent, stabilizer and the like can be used in combination.
  • bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used for topical administration.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, they may be prepared in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. . It may be formulated into other solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained release preparations and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, preservatives and the like may be further included.
  • the N-terminal charge modified insulin secreting peptide derivative or the pharmaceutical composition comprising the same according to the present invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount refers to an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is determined by the type of disease, the severity, the activity of the drug, the drug. Sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative or the pharmaceutical composition comprising the same according to the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage and frequency of the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug which is the active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient and the severity of the disease. Since the pharmaceutical composition of the present invention has excellent persistence and titer in vivo, the frequency and frequency of administration of the pharmaceutical preparations according to the present invention can be significantly reduced.
  • subject means an animal including, but not limited to, humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, axes or guinea pigs, In one embodiment it refers to a mammal and in another embodiment a human.
  • the binding capacity of the GLP-1 receptor and the insulin secreting peptide derivative with the N-terminal charges modified was measured using a surface plasmon resonance (SPR) device (BIACORE 3000, GE Healthcare).
  • SPR surface plasmon resonance
  • N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivatives CA-Exendin-4 (CA-Exendin-4), DA-Exendin-4 (DA-Exendin-4), HY-Exendin-4 (HY -Exendin-4) and DA-Exendin-4-propyl-amide were used.
  • CA-Exendin-4 is a derivative obtained by removing the alpha carbon of the N-terminal histidine residue of Exendin-4; DA-exendin-4 is a derivative from which the N-terminal amino group of exendin-4 is removed; HY-Exendin-4 is a derivative in which the N-terminal amino group of Exendin-4 is substituted with a hydroxyl group; DA-exendin-4-propyl-amide is a derivative in which the N-terminal amino group of exendin-4 is removed and the C-terminal carboxyl group is substituted with propylamide.
  • a natural type exendin-4 (exenatide: Byetta) was used as a control.
  • Exendin-4 derivatives with modified N-terminal charges were synthesized by American Peptide Corporation, and native exendin-4 was obtained from Amylin Pharmaceuticals.
  • the GLP-1 receptor was expressed in hGLP-1R / GST form in CHO-DG44 cells and the expressed hGLP-1R / GST was immobilized on the CM5 chip by amine coupling.
  • the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative was diluted and added to the CM5 chip immobilized with hGLP-1R / GST to measure binding ability with the GLP-1 receptor.
  • the binding force between the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative and the GLP-1 receptor was analyzed according to a 1: 1 Langmuir fitting model, and the results are shown in FIGS. 1A to 1E and Table 1 below. Indicated.
  • the N-terminus of the native exendin-4 has a positive charge
  • the exendin-4 derivatives whose charge is modified to a neutral charge are native exendin-4. It was found to have a significantly higher dissociation constant (kd). The results indicate that more frequent binding / dissociation may occur repeatedly between the GLP-1 receptor and the insulin secreting peptide derivative with the N-terminal charge modified.
  • Such pharmacokinetic changes on the GLP-1 receptor can prevent the clearance of insulin secreting peptide derivatives by the receptor and make desensitization less favorable for increased blood stability.
  • the insulin secretion activity of the exendin-4 derivatives modified with N-terminal charge was compared in RINm5F cells. After thawing, RINm5F cells passaged at least once were inoculated with a culture medium containing FBS (Gibco, # 11082) to 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 96-well plate and 48 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Incubated for To measure insulin secretion activity, the culture medium of cultured RINm5F cells was exchanged with culture medium containing 0.5% FBS and further cultured for 1 hour.
  • FBS Gibco, # 11082
  • N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative and native exendin-4 (exenatide: Byetta) as in Example 1 were diluted with culture medium containing 0.5% FBS and glucose, respectively, at 10 nM to 0.001 nM Prepared until. At this time, a culture medium containing no exendin-4 was used as a control. After removing all of the cultured RINm5F cells and adding the prepared samples, the cells were incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 1 hour, and then all of the wells were recovered. Insulin concentration of the recovered medium was measured using a rat insulin ELISA kit (Mercodia), and the results are shown in FIG. 2 and Table 2 below.
  • the N-terminal charge-modified insulin secretion peptide derivative according to the present invention was found to exhibit about 1.25 times better insulin secretion activity than the native type exendin-4 in the same concentration range It became.
  • Example 3 Comparison of in vivo activity of insulin secreted peptide derivatives with modified N-terminal charges
  • N-terminal charge modified insulin secreting peptide derivatives In order to measure the in vivo activity of N-terminal charge modified insulin secreting peptide derivatives, their hypoglycemic ability in diabetic model animals was compared with native exendin-4. After fasting db / db mice (Jackson Lab, 10-12 weeks of age) for 2 hours, insulin secreting peptides modified with 0.01-1000 mcg / kg native exendin-4 (exenatide: Byetta) and N-terminal charges The derivatives were each administered via the subcutaneous route. At this time, the vehicle was administered in the same manner (vehicle), the blood glucose change according to the administered drug at each dose concentration was calculated as the percentage change value compared to the vehicle.
  • N-terminal charge-modified insulin secretion peptide derivative according to the present invention showed about 5 times increased blood glucose lowering ability than native type exendin-4 .
  • the N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivative according to the present invention has a faster dissociation from the GLP-1 receptor due to the increased dissociation constant for the GLP-1 receptor, which is superior to the native insulin secreting peptide. It can be seen that the present invention shows stability in blood and thus increased insulin secretion ability and hypoglycemic activity. Therefore, the insulin secreting peptide derivative according to the present invention can be very useful for the treatment of type 2 diabetes.
  • N-terminal charge-modified insulin secreting peptide derivatives according to the present invention can be rapidly dissociated from the GLP-1 receptor to prevent clearance of the insulin secreting peptide by the receptor and to cause less desensitization. can do.
  • the insulin secretion peptide derivatives of which the N-terminal charge is modified according to the present invention have increased insulin secretion activity and in vivo blood glucose lowering compared to the native insulin secretion peptides due to the above-described changes in binding capacity to the GLP-1 receptor. It can be very useful for treating diabetes.

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Abstract

본 발명은 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 양전하가 중성 pH에서 중성 전하 또는 알짜 음전하로 변형된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 상기한 바와 같은 N-말단 전하의 변형으로 인해 GLP-1 수용체로부터의 해리가 신속히 진행되어 혈중 안정성을 유지하면서 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 증가된 인슐린 분비능과 혈당 저하능을 나타내므로, 제2형 당뇨병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｎ-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체
본 발명은 증가된 인슐린 분비 활성 및 혈당 저하능을 갖도록 변형된 인슐린 분비 펩티드의 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 전하가 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 변형된 것을 특징으로 한다.
펩티드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 체내 단백질 가수 분해 효소에 의해 분해되어 그 활성을 잃으며, 또한 상대적으로 크기가 작아 신장을 통해 쉽게 제거되기 때문에 약리학적 활성성분으로 펩티드를 포함하는 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 펩티드 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다.
그러나 펩티드 약물은 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되고, 따라서 생리활성 펩티드의 혈중 농도를 유지하기 위해서는 그만큼 빈번한 주사가 요구되는데, 이는 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 펩티드 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 활발하게 진행되고 있다.
특히, 이러한 펩티드 약물의 지속형 제제는 펩티드 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다. 이에, 펩티드 약물을 안정화시키고 단백질 가수분해효소에 의한 분해를 억제하기 위한 방법으로, 단백질 가수분해효소에 민감한 특정 아미노산 서열을 변경하는 시도가 있어 왔다.
예를 들어, 혈중 글루코스 농도를 감소시키는 작용을 하여 제2형 당뇨병 치료 효능을 갖는 GLP-1(7-37 또는 7-36 아미드)의 경우 생리활성 반감기가 4분 이하로 매우 짧은데, 이는 다이펩티딜 펩티다아제(dipeptidyl pepdidase IV, DPP IV)에 의한 GLP-1의 8번째(Ala) 및 9번째(Asp) 아미노산 사이의 절단에 의한 GLP-1의 역가 상실에 기인한다. 이에 GLP-1의 Ala8를 Gly, Leu 또는 D-Ala로 치환하여 DPP IV에 대한 저항성을 증가시키면서 생리활성을 그대로 유지하는 GLP-1 유도체가 개발되었다. 또한 GLP-1의 N-말단 아미노산 His7은 GLP-1의 활성에 매우 중요하며 동시에 DPP IV의 타겟이다. 이에 N-말단을 알킬기 또는 아실기로 변형하거나 His7을 N-메틸화(N-methylation) 또는 알파-메틸화(alpha-methylation)시켜 DPP IV 저항성을 증가시키고 생리활성을 유지하였다. 그러나 이 경우 DPP IV 저항성 증가로 인해 안정성이 좋아짐을 확인하였지만 His7을 변형시킨 유도체들의 수용체 친화도(receptor affinity)가 상당히 감소하며 동일 농도에서 cAMP의 분비능이 저하되는 문제점이 보고되었다(Gallwitz et al., Regulatory Peptide 79: 93-102, 1999; Gallwitz et al., Regulatory Peptide 86: 103-111, 2000).
또한, GLP-1과 같은 인슐린 분비 펩티드 중에서 엑센딘-4는 DPP IV의 기질로 작용하는 GLP-1의 서열인 His-Ala가 아닌 His-Gly의 서열로 이루어져 있어 DPP IV 에 대한 저항성과 함께 GLP-1보다 높은 생리활성을 가지며, 따라서 GLP-1에 비해 더 긴 체내 반감기를 갖는다. 그러나 엑센딘-4의 체내 반감기가 GLP-1보다 길다고 하더라도 현재 시판 중인 엑센딘-4(엑세나티드, exenatide)의 경우 환자에게 하루 2회 주사를 통해 투여되어야 하는데 이는 여전히 환자에게 큰 부담이 아닐 수 없다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 인슐린 분비 펩티드의 활성 및 혈중 안정성을 증가시키기 위해 예의 노력한 결과, 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 아미노산의 전하를 변형시킨 유도체가 그의 천연형 인슐린 분비 펩티드보다 우월한 약물동력학 및 높은 인슐린 분비 활성을 나타낸다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인슐린 분비 활성이 증가하여 혈당 저하능이 우수한 인슐린 분비 펩티드 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체를 이용하여 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 전하(charge)가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 제공한다.
하나의 구체예로서, 본 발명은 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기가 중성 전하(neutral charge) 또는 알짜 음전하(net negative charge)를 갖도록 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 제공한다.
다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파-아미노 그룹을 제거 또는 치환하거나, 알파-카본을 제거함으로써 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 화학적으로 변형된 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 아미노 그룹이 제거되고; 상기 N-말단 아미노 그룹을 히드록실 그룹으로 치환하고; 상기 N-말단 아미노 그룹을 2개의 메틸 잔기로 수식하고; 상기 N-말단 아미노 그룹을 카르복실 그룹으로 치환하고; 상기 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 제거하여 이미다졸아세틸 잔기만을 남겨두거나; 상기 N-말단 아미노 그룹을 제거하고 C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드(propylamide)로 치환된 것 중의 하나 이상에 해당하는 화학적 변형이 도입된 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜, 다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 및 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 구성되는 군에서 선택되는 물질로 치환된 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜로 치환되고, C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드(propylamide)로 치환된 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체에서 인슐린 분비 펩티드는 GLP-1 수용체에 대해 결합능을 갖는 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체에서 인슐린 분비 펩티드는 서열번호: 1로 표시되는 GLP-1, 서열번호: 2로 표시되는 엑센딘-4, 서열번호: 3으로 표시되는 엑센딘-3, 서열번호: 5로 표시되는 옥신토모듈린, 서열번호: 6으로 표시되는 GIP 또는 이들의 유사체인 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 N-말단 전하의 변형으로 인해 GLP-1 수용체에 대해 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 증가된 해리 상수(Kd)를 갖는 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 GLP-1, 엑센딘-4, 엑센딘-3, 옥신토모듈린, GIP 또는 이의 유사체의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜, 다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 또는 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 치환된 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는GLP-1, 엑센딘-4, 엑센딘-3, 옥신토모듈린, GIP 또는 이의 유사체의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜로 치환되고, C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4(desamino-histidyl-exendin-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 히드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 카르복실 그룹으로 치환한 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 2개의 메틸 잔기로 수식한 다이메틸-히스티딜-엑센딘-4 (dimethyl-histidyl-exendin-4); 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(imidazoacetyl-exendin-4)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거하고 그의 C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 DA-엑센딘-4-프로필-아미드(DA-Exendin-4-propyl-amide)인 것을 특징으로 한다.
다른 양태로서, 본 발명은 전술한 바와 같은 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 바와 같은 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 이를 필요로 하는 대상에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에게서 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 GLP-1 수용체로부터 신속하게 해리되어 상기 수용체에 의한 인슐린 분비 펩티드의 소거(clearance)를 방지할 수 있으며 탈감각(desensitization)을 덜 일어나게 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 상기한 GLP-1 수용체에 대한 결합력 변화로 인해 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 증가된 인슐린 분비 활성 및 생체 내(in vivo) 혈당 저하능을 나타내어 당뇨병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1d는 GLP-1 수용체에 대한 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체들의 농도별 결합곡선을 나타내 것으로, 도 1a는 천연형 엑센딘-4, 도 1b는 CA-엑센딘-4, 도 1c는 DA-엑센딘-4, 도 1d는 DA-엑센딘-4-프로필-아미드, 도 1e는 HY-엑센딘-4에 대한 결과이다.
도 2는 천연형 엑센딘-4와 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 CA-엑센딘-4 유도체의 인슐린 분비 활성을 측정한 결과이다.
도 3은 천연형 엑센딘-4와 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 CA-엑센딘-4 유도체의 혈당 저하능력을 당뇨 모델 동물에서 측정한 결과이다.
본 발명은 인슐린 분비 펩티드의 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체에 관한 것이다.
본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 전하를 변화시켜 수용체와의 빠른 해리를 일으키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 "인슐린 분비 펩티드 유도체"는 고유의 인슐린 분비 기능을 보유하면서 화학적, 유전적 또는 물리적 조작에 의해 천연형 인슐린 분비 펩티드, 이의 유사체 또는 단편의 N-말단 전하가 양전하에서 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 변형된 것을 지칭한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 중성 pH에서 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기가 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 화학적으로 변형된 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드의 N-말단의 첫 번째 아미노산 잔기의 양전하가 중성 또는 알짜 음전하로 변형된 유도체이다.
본 발명에서 용어 "인슐린 분비 펩티드"는 인슐린 분비 기능을 보유한 펩티드로서 췌장 베타세포의 인슐린의 합성 및 발현을 자극한다. 본 발명에 적합한 인슐린 분비 펩티드는 GLP-1 수용체와 결합하여 생리학적 활성을 나타내는 것이라면 그 종류에 제한 없이 사용될 수 있으며, 비제한적인 예로서 서열번호: 1의 GLP-1(7-37), 서열번호: 2의 엑센딘-4, 서열번호: 3의 엑센딘-3, 서열번호: 5의 옥신토모듈린(oxyntomodulin), 서열번호: 6의 글루코스-의존성 인슐린 분비 폴리펩티드(glucose-dependent insulinotropic polypeptide, GIP), 이들의 유사체 또는 단편일 수 있다.
본 발명에서 용어 "인슐린 분비 펩티드의 유사체"는 천연형 인슐린 분비 펩티드와 아미노산 서열이 하나 이상 다른 펩티드로서 인슐린 분비 기능을 보유한 펩티드를 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드의 유사체는 천연형 인슐린 분비 펩티드와 비교 시 최소한 80% 이상 아미노산 서열에서 상동성을 보이는 폴리펩티드를 지칭하는 것으로, 아미노산 잔기의 일부 그룹이 화학적으로 치환(예: alpha-methylation, alpha-hydroxylation), 제거(예: deamination) 또는 수식(예: N-methylation)된 형태일 수 있다.
발명의 일 바람직한 실시형태에서, 인슐린 분비 펩티드의 유사체는 인슐린 분비 기능이 천연형 인슐린 분비 펩티드와 비교하여 동등 또는 그 이상을 나타내는 것을 의미하지만 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드의 유사체의 범위가 반드시 이 정도 수준의 인슐린 분비 기능을 지니는 것들로만 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "인슐린 분비 펩티드의 단편"은 인슐린 분비 기능을 보유하면서 천연형 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 하나 또는 그 이상 아미노산이 추가 또는 삭제된 형태를 의미하며 추가된 아미노산은 천연에 존재하지 않는 아미노산(예: D형 아미노산)도 가능하다.
GLP-1은 소장에서 분비되는 호르몬으로서 일반적으로 인슐린 생합성 및 분비를 촉진하고 글루카곤 분비를 억제하며 세포 내 글루코스 흡수를 촉진한다. 소장에서 글루카곤 전구체는 3개의 펩티드, 즉 글루카곤, GLP-1 및 GLP-2로 분해된다. 여기서 GLP-1은 GLP-1(1~37)을 의미하며 인슐린 분비 기능이 없는 형태이고 GLP-1(7-37) 형태로 프로세싱되어 활성형 GLP-1(7-37)이 된다. GLP-1(7-37)은 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다.
바람직하게는, GLP-1 유사체는 Arg34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)-아미드, Gly8-GLP-1(7-37), Val8-GLP-1(7-36)-아미드, Val8-GLP-1(7-37), Val8Asp22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Asp22-GLP-1(7-37), Val8Glu22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Glu22-GLP-1(7-37), Val8Lys22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Lys22-GLP-1(7-37), Val8Arg22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Arg22-GLP-1(7-37), Val8His22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8His22-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37), Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37), Val8Glu22His37-GLP-1(7-37), Val8Glu22,Il33-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37), Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37), 및 Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
또 다른 유형의 인슐린 분비 펩티드로서 엑센딘-4는 GLP-1과 53%의 아미노산 서열 유사성을 보이는 39개 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드로서, 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 엑센딘-3은 서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는데, 엑센딘-4와 2번 및 3번 위치 아미노산만이 상이한 엑센딘-4 유사체이다. 엑센딘-3은 엑센딘-4의 2번 및 3번 위치의 아미노산이 각각 세린 및 아스파르트산으로 치환된 것으로 Ser2Asp3-엑센딘-4(1-39)로 표시될 수 있다. 또 다른 엑센딘-4 유사체로서 엑센딘-4의 38번 및 39번 위치의 아미노산이 각각 세린 및 라이신으로 치환된 ZP-10은 Ser38Lys39-엑센딘-4(1-39)-LysLysLysLysLys-아미드로 표시되며 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는다.
옥신토모듈린(oxyntomodulin)은 글루카곤의 전구체인 프리-글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어지는 펩티드로서, GLP-1과 함께 영양소 섭취에 비례하여 소장의 L-세포로부터 방출된다. 옥신토모듈린은 서열번호: 5로 표시되는 37개의 아미노산으로 구성된 펩티드 호르몬으로서 음식물 섭취 저해, 포만감 증진 효력과 글루카곤의 지방분해 기능을 나타낸다.
글루코스-의존성 인슐린 분비 폴리펩티드(GIP)는 장내 영양분 흡수에 반응하여 글루코스 농도에 의존적으로 췌장에서 인슐린의 분비를 조절하는 인크레틴(incretin)으로서, 서열번호: 6으로 기재되는 42개의 아미노산으로 구성되며 소장의 K 세포에서 분비된다. GIP는 베타세포에서 글루코스 의존적으로 인슐린 분비를 자극시킬 뿐만 아니라 인슐린의 합성을 촉진하고, 베타세포 증식을 유도하며, 사멸에는 억제적인 효과를 가지고 있다.
상기한 바와 같은 천연형 인슐린 분비 펩티드, 이의 유사체 또는 단편에서 각각 사용된 제조방법은 독립적으로 사용될 수 있고 조합도 가능하다. 예를 들어 아미노산 서열이 하나 이상 다르고 N-말단 아미노산 잔기에 탈아미노화(deamination)된 인슐린 분비 펩티드도 포함된다.
구체적인 일 양태로서, 본 발명에서 사용한 천연형 인슐린 분비 펩티드와 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 고상(Solid phase) 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 천연형 인슐린 분비 펩티드를 포함한 대부분의 천연형 폴리펩티드는 재조합 방법으로도 생산 가능하다.
상기 GLP-1, 엑센딘-4, 엑센딘-3, 옥신토모듈린 또는 GIP의 유사체는 천연형의 GLP-1, 엑센딘-4 또는 엑센딘-3의 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 것이거나 하나 이상의 아미노산 잔기가, 예컨대, 알킬화, 아실화, 에스테르화 형성 또는 아미드 형성 등에 의해 화학적으로 변형된 펩티드를 지칭하며, 천연형의 인슐린 분비 활성을 지닌 것을 말한다.
이러한 GLP-1, 엑센딘-3 또는 엑센딘-4의 유사체에 대해서는, GLP-1 또는 엑센딘-4의 C-말단을 일부 삭제하거나 비천연형 아미노산인 노르류우신(norleucine)으로 치환한 엑센딘 변형체에 관한 WO97/46584; 펜틸글리신(pentylglycine), 호모프롤린(homoproline), 3급-부틸글리신(tert-butylglycine)과 같이 비천연형 아미노산을 포함한 엑센딘의 아미노산을 치환한 변형체에 관한 WO99/07404; 엑센딘-4의 C-말단 아미노산 잔기 일부를 절단하여 천연형 보다 짧은 아미노산 서열로 구성되게 하거나 다른 아미노산으로 치환한 엑센딘 변형체에 관한 US2008/0119390 등에 개시되어 있으며, 이들은 참고문헌으로서 본 명세서에 병합된다.
본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 상기한 바와 같은 천연형 인슐린 분비 펩티드, 이의 유사체 또는 단편의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기가 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 변형된 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 첫 번째 아미노산 잔기의 양전하가 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 화학적으로 변형된 유도체이다.
상기와 같이 N-말단이 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 변형된 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 GLP-1 수용체에 대해 더 높은 해리 상수(Kd)를 갖는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 2배 이상, 더욱 바람직하게는 3배 이상, 가장 바람직하게는 6배 이상 증가된 GLP-1 수용체에 대한 해리 상수(Kd)를 갖도록 변형된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
인슐린 분비 펩티드의 N-말단 양전하가 중성 또는 알짜 음전하로 변형된 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 바람직하게는 양전하를 갖는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파-아미노 그룹을 제거 또는 치환하거나, 알파-카본을 제거함으로써 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 변형시킬 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체에는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 아미노 그룹이 제거된 유도체(desamino-histidyl derivative); 그의 N-말단 아미노 그룹을 히드록실 그룹으로 치환한 유도체(beta-hydroxy imidazopropionyl-derivative); 그의 N-말단 아미노 그룹을 2개의 메틸(methyl) 잔기로 수식한 유도체(dimethyl-histidyl-derivative); 그의 N-말단 아미노 그룹을 카르복실 그룹으로 치환한 유도체(beta-carboxy imidazopropionyl-derivative); 그의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 제거하여 이미다졸아세틸(imidazoacetyl) 그룹만을 남겨둔 유도체(imidazoacetyl-derivative) 등이 포함될 수 있으며, N-말단의 양전하를 중성 또는 알짜 음전하로 변형시킬 수 있는 것이라면 임의의 형태의 아미노-말단 아미노 그룹 변형 유도체가 또한 본 발명의 범주에 속한다.
상기와 같이 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 하기 구조식으로 표시될 수 있다.
Figure PCTKR2014000025-appb-I000001
나아가, 본 발명에 따른 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체에는 N-말단 아미노 그룹을 제거한 상기 데스아미노-히스티딜-유도체의 C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드(propylamide)로 치환된 유도체가 포함될 수 있다.
상기와 같이 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 하기 구조식으로 표시될 수 있다.
Figure PCTKR2014000025-appb-I000002
더욱 더 바람직하게는, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 GLP-1, 엑센딘-4, 엑센딘-3, 옥신토모듈린, GIP, 이의 유사체 또는 단편의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜, 다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 또는 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 치환되어 N-말단의 전하가 변형된 것일 수 있다.
발명의 일 실시양태에서, 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
R1-X-R2 <화학식 1>
상기 식에서, R1은 데스-아미노-히스티딜, 다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 및 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 구성되는 군으로부터 선택되고,
R2는 -NH2 또는 -OH이고,
X는 Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly;
Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser;
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser; 또는
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala임.
발명의 바람직한 실시양태에서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체는 엑센딘-4의 N-말단 전하가 변형된 유도체로서, 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4(desamino-histidyl-exendin-4, DA-엑센딘-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 히드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4, HY-엑센딘-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 카르복실 그룹으로 치환한 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4, CX-엑센딘-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 2개의 메틸 잔기로 수식한 다이메틸-히스티딜-엑센딘-4 (dimethyl-histidyl-exendin-4, DM-엑센딘-4); 또는 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(imidazoacetyl-exendin-4, CA-엑센딘-4)일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 GLP-1, 엑센딘-4, 엑센딘-3, 옥신토모듈린, GIP, 이의 유사체 또는 단편의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜로 치환되고 그의 C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 것일 수 있다.
발명의 다른 실시양태에서, 상기 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체에는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4(DA-엑센딘-4)의 C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 DA-엑센딘-4-프로필-아미드(DA-Exendin-4-propyl-amide)가 포함될 수 있다.
상기 유도체들은 아미노-말단 히스티딘 잔기의 알파-아미노 그룹을 제거 또는 치환하거나 알파-카본을 제거한 것으로서, 그 외의 아미노산 서열은 생리학적 활성이 유지되는 한, 특별히 제한되지 않는다.
상기 엑센딘-4 유도체와 같이 다른 종류의 인슐린 분비 펩티드, 예컨대 엑센딘-3, GLP-1, 옥신토모듈린 및 GIP의 N-말단에도 이러한 치환 또는 제거가 모두 적용될 수 있으며, 인슐린 분비 활성이 유지되는 한 이의 유사체 및 단편에도 모두 적용될 수 있다.
본 발명의 인슐린 분비 펩티드 유도체에서 N-말단 양전하의 중성 또는 알짜 음전하로의 변형은 GLP-1 수용체와의 해리를 신속하게 유도하여 상기 수용체에 의한 인슐린 분비 펩티드의 소거(clearance)를 방지할 수 있으며, 탈감각(desensitization)을 덜 일어나게 하여 우월한 생리활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 인슐린 분비 펩티드의 N-말단의 전하가 중성 또는 순 양전하로 변형되어 GLP-1 수용체에 대한 결합력 변화로 인해 인슐린 분비 활성이 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 증가되고, 생체 내(in vivo)에서 우수한 혈당 저하능을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 아미노산의 양전하를 중성 또는 알짜 음전하로 변형시킨 인슐린 분비 펩티드 유도체가 GLP-1 수용체에 대해 천연형 인슐린 분비 펩티드보다 높은 해리 상수(Kd)를 가지며, 이로 인해 GLP-1 수용체와의 빈번한 결합/해리를 반복할 수 있음을 확인하였다(실시예 1 참조). 또한, 상기 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 전하가 변형되지 않은 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 약 2배 정도 증가된 인슐린 분비 활성을 나타내었고(실시예 2 참조), 당뇨병 동물 모델(db/db 마우스)에서 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 약 5배 정도 증가된 혈당 저하능을 나타내었다(실시예 3 참조).
따라서, 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 전하가 변형된 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 GLP-1 수용체에 대한 해리 상수가 증가하여, 즉 GLP-1 수용체로부터의 해리가 증가되어 우수한 혈중 안정성 및 인슐린 분비능을 나타냄을 알 수 있다.
전술한 바와 같이, 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 전하를 중성 또는 알짜 음전하로 변형시키면 GLP-1 수용체와의 결합력, 특히 상기 수용체로부터의 해리가 증가되어 인슐린 분비 펩티드의 생물학적 활성을 증가시킬 수 있음은 본 발명에서 최초로 규명된 사실이다. 따라서, 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체의 우수한 혈중 안정성 및 인슐린 분비 활성은 제2형 당뇨병 치료의 효과를 극대화시키는데 유용할 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 인슐린 분비 펩티드의 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 높은 인슐린 분비 활성 및 혈당 저하능을 갖고 있는 바, 우수한 당뇨병 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명의 당뇨병 치료용 약학적 조성물은 당뇨병 치료가 필요한 개체에 투여함으로써 당뇨병을 효과적으로 치료할 수 있다.
따라서, 본 발명의 범주에는 전술한 바와 같은 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 이를 필요로 하는 대상에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에게서 당뇨병을 치료하는 방법이 포함된다.
본 발명에서 용어 "치료"는 본 발명에 따른 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물의 투여로 당뇨병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 대상에게 소정의 물질, 즉 본 발명에 따른 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 이의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예컨대, 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 유도체를 포함한 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구 투여용의 경우에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여용의 경우에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 치료학적 유효량으로 투여된다. 본 발명에서 용어 "치료학적 유효량"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 N-말단의 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 또는 이를 포함하는 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명에 따른 약학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명에서 "대상"은 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 또끼 또는 기니아 피그를 포함하나 이에 한정되지 아니하는 동물을 의미하고, 일 실시예에서는 포유류를, 또 다른 실시예에서는 인간을 의미한다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체의 GLP-1 수용체에 대한 결합력 비교
GLP-1 수용체와 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체의 결합력을 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 장치(BIACORE 3000, GE Healthcare)를 사용하여 측정하였다. 이때, N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체로 CA-엑센딘-4(CA-Exendin-4), DA-엑센딘-4(DA-Exendin-4), HY-엑센딘-4(HY-Exendin-4) 및 DA-엑센딘-4-프로필-아미드(DA-Exendin-4-propyl-amide)를 사용하였다. 상기 CA-엑센딘-4는 엑센딘-4의 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 제거한 유도체이고; DA-엑센딘-4는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거한 유도체이고; HY-엑센딘-4는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 히드록실 그룹으로 치환한 유도체이고; DA-엑센딘-4-프로필-아미드는 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거하고 C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 유도체이다. 아울러, 대조군으로 천연형 엑센딘-4(exenatide: Byetta)를 사용하였다. N-말단 전하가 변형된 엑센딘-4 유도체들은 American Peptide Corporation사를 통해 합성하였으며, 천연형 엑센딘-4는 Amylin Pharmaceuticals사로부터 입수하였다.
GLP-1 수용체를 CHO-DG44 세포에서 hGLP-1R/GST 형태로 발현시키고 발현된 hGLP-1R/GST를 CM5 칩에 아민 결합법(amine coupling)으로 고정화하였다. hGLP-1R/GST가 고정된 CM5 칩에 상기 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 농도별로 희석한 후 첨가하여 GLP-1 수용체와의 결합력을 측정하였다. 이때 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체와 GLP-1 수용체 사이의 결합력은 1:1 랑무이르 적합 모델(Langmuir fitting model)에 따라 분석하였고, 그 결과를 도 1a 내지 1e와 하기 표 1에 나타내었다.
표 1
시료 pH 7.4에서 N-말단 전하 ka(1/Ms, ×105) kd(1/s, ×104) KD(nM)
천연형 엑센딘-4 양전하 3.70±0.06 5.26±0.11 1.4±0.05
CA-엑센딘-4 중성 전하 1.20±0.11 31.5±0.56 26.3±2.08
DA-엑센딘-4 1.13±0.08 36.5±1.40 32.2±1.89
DA-엑센딘-4-프로필-아미드 1.04±0.11 33.5±1.40 32.6±4.17
HY-엑센딘-4 0.90±0.07 38.3±1.92 42.7±4.10
상기 표 1 및 도 1a 내지 1e에 나타난 바와 같이, 천연형 엑센딘-4의 N-말단은 양전하를 띠는 반면, 이의 전하가 중성 전하로 변형된 엑센딘-4 유도체들은 천연형 엑센딘-4보다 현저히 증가된 해리상수(kd)를 갖는 것으로 확인되었다. 상기 결과는 GLP-1 수용체와 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 사이에 보다 빈번한 결합/해리가 반복적으로 일어날 수 있음을 나타내는 것이다.
GLP-1 수용체에 대한 이러한 약물동력학적 변화는 상기 수용체에 의한 인슐린 분비 펩티드 유도체의 소거를 방지할 수 있으며 탈감각을 덜 일어나게 하여 혈중 안정성 증가에 유리하다.
실시예 2: N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체의 인슐린 분비 활성 측정
RINm5F 세포를 대상으로 N-말단 전하가 변형된 엑센딘-4 유도체의 인슐린 분비 활성(insulinotropic activity)을 비교하였다. 해동 후 1회 이상 계대 배양한 RINm5F 세포를 96-웰 플레이트에 1×105 세포/웰이 되도록 FBS(Gibco, #11082) 함유 배양 배지와 함께 접종하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 인슐린 분비 활성 측정을 위해, 배양한 RINm5F 세포의 배지를 0.5% FBS 함유 배양 배지로 교환한 후 1시간 동안 추가 배양하였다.
상기 실시예 1에서와 같은 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체와 천연형 엑센딘-4(exenatide: Byetta)를 각각 0.5% FBS와 글루코스를 함유한 배양 배지로 희석하여 10 nM에서 0.001 nM까지 준비하였다. 이때, 엑센딘-4를 함유하지 않는 배양 배지를 대조군으로 사용하였다. 배양된 RINm5F 세포의 배지를 모두 제거하고 준비한 시료들을 첨가한 후 1시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한 후, 각 웰의 배지를 모두 회수하였다. 랫트 인슐린 ELISA 키트(Mercodia사)를 이용하여 회수한 배지의 인슐린 농도를 측정하였으며, 그 결과를 도 2 및 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
시료 대조군 대비 최대 인슐린 분비량의 비율
N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 198.9 %
천연형 엑센딘-4 159.0 %
상기 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 동일 농도 범위에서 천연형 엑센딘-4보다 약 1.25배 정도 우수한 인슐린 분비 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 3: N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체의 생체 내 활성 비교
N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체의 생체 내(in vivo) 활성을 측정하기 위해, 당뇨 모델 동물에서 이들의 혈당 저하능을 천연형 엑센딘-4와 비교하였다. db/db 마우스(Jackson Lab, 10-12주령)를 2시간 동안 절식시킨 후, 0.01 내지 1000 mcg/kg의 천연형 엑센딘-4(exenatide: Byetta)와 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체를 각각 피하 경로를 통해 투여하였다. 이때 대조군으로 비히클(vehicle)을 동일하게 투여하였으며, 각 투여 농도에서 투여 약물에 따른 혈당 변화는 비히클 대비 % 변화 값으로 계산하였다.
약물 투여 1시간 후에 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈당 측정기로 혈당을 측정하였고, 각 투여 농도에서 비히클 대비 혈당 저하 효과는 프리즘(Prism) 프로그램을 이용하여 그 활성(ED50)을 구하였다.
표 3
시료 ED50(mcg/kg) R2
N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체 2.30 0.99
천연형 엑센딘-4 9.92 0.98
상기 표 3 및 도 3에 나타난 바와 같이, 당뇨 모델 동물에서 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 천연형 엑센딘-4보다 약 5배 정도 증가된 혈당 저하능을 나타내었다.
상기 결과들로부터 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 GLP-1 수용체에 대한 해리 상수 증가로 인해 GLP-1 수용체로부터의 해리가 신속히 진행되어 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 우수한 혈중 안정성을 나타내고, 따라서 증가된 인슐린 분비능 및 혈당 저하능을 나타내는 것임을 알 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체는 제2형 당뇨병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당 업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 GLP-1 수용체로부터 신속하게 해리되어 상기 수용체에 의한 인슐린 분비 펩티드의 소거(clearance)를 방지할 수 있으며 탈감각(desensitization)을 덜 일어나게 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 N-말단 전하가 변형된 인슐린 분비 펩티드 유도체는 상기한 GLP-1 수용체에 대한 결합력 변화로 인해 천연형 인슐린 분비 펩티드에 비해 증가된 인슐린 분비 활성 및 생체 내(in vivo) 혈당 저하능을 나타내어 당뇨병 치료에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (17)

  1. 인슐린 분비 펩티드 유도체로서, 상기 유도체가 천연형 인슐린 분비 펩티드의 N-말단 전하(charge)에 변형이 있는, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체가 천연형 인슐린 분비 펩티드, 그 유사체 또는 단편의 N-말단 아미노 그룹 또는 아미노산 잔기의 양전하가 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 화학적으로 변형된 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 천연형 인슐린 분비 펩티드, 그 유사체 또는 단편은 그의 N-말단 잔기가 히스티딘이고, 상기 변형은 상기 히스티딘 잔기의 알파-아미노 그룹을 제거 또는 치환하거나, 알파-카본을 제거함으로써 중성 또는 알짜 음전하를 갖도록 한 변형인 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변형은 천연형 인슐린 분비 펩티드, 그 유사체 또는 단편의 N-말단 아미노 그룹이 제거되고; 상기 N-말단 아미노 그룹을 히드록실 그룹으로 치환하고; 상기 N-말단 아미노 그룹을 2개의 메틸 잔기로 수식하고; 상기 N-말단 아미노 그룹을 카르복실 그룹으로 치환하고; 상기 N-말단 히스티딘 잔기의 알파 카본을 제거하여 이미다졸아세틸 잔기만을 남겨두거나; 상기 N-말단 아미노 그룹을 제거하고 C-말단의 카르복실 그룹을 프로필아미드(propylamide)로 치환하는 것 중의 하나 이상을 포함하는 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체는 천연형 인슐린 분비 펩티드, 그 유사체 또는 단편의 N-말단 잔기가 데스-아미노-히스티딜, 다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 및 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 구성되는 군에서 선택되는 물질로 치환된 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체는 천연형 인슐린 분비 펩티드, 그 유사체 또는 단편의 N-말단 잔기가 데스-아미노-히스티딜로 치환되고, C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체가 GLP-1 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 천연형 인슐린 분비 펩티드가 서열번호: 1로 표시되는 GLP-1, 서열번호: 2로 표시되는 엑센딘-4, 서열번호: 3으로 표시되는 엑센딘-3, 서열번호: 5로 표시되는 옥신토모듈린, 서열번호: 6으로 표시되는 GIP, 이들의 유사체 또는 단편인 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 천연형 인슐린 분비 펩티드 또는 그의 유사체가 GLP-1 유사체이고, Arg34-GLP-1(7-37), Gly8-GLP-1(7-36)-아미드, Gly8-GLP-1(7-37), Val8-GLP-1(7-36)-아미드, Val8-GLP-1(7-37), Val8Asp22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Asp22-GLP-1(7-37), Val8Glu22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Glu22-GLP-1(7-37), Val8Lys22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Lys22-GLP-1(7-37), Val8Arg22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8Arg22-GLP-1(7-37), Val8His22-GLP-1(7-36)-아미드, Val8His22-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37), Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37), Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37), Val8Glu22His37-GLP-1(7-37), Val8Glu22,Il33-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37), Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37), Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37), 및 Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  10. 제8항에 있어서, 상기 천연형 인슐린 분비 펩티드 또는 그의 유사체가 서열번호: 4의 ZP-10(Ser38Lys39-엑센딘-4(1~39)-LysLysLysLysLys-아미드) 엑센딘-4 유사체인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  11. 제1항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체가 그의 천연형 인슐린 분비 펩티드와 비교하여 GLP-1 수용체에 대해 더 큰 해리 상수(Kd)를 갖는 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  12. 제5항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체가 하기 화학식 1로 표시되는 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체:
    R1-X-R2 <화학식 1>
    상기 식에서, R1은 데스-아미노-히스티딜, 다이메틸-히스티딜, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐, 4-이미다조아세틸 및 베타-카르복시 이미다조프로피오닐로 구성되는 군으로부터 선택되고,
    R2는 -NH2 또는 -OH이고,
    X는 Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly;
    Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser;
    Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser; 또는
    Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala임.
  13. 제6항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체가 GLP-1, 엑센딘-4, 엑센딘-3, 옥신토모듈린, GIP 또는 이의 유사체의 N-말단 히스티딘 잔기가 데스-아미노-히스티딜로 치환되고, C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  14. 제12항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체가 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거한 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4(desamino-histidyl-exendin-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 히드록실 그룹으로 치환한 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 카르복실 그룹으로 치환한 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4); 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 2개의 메틸 잔기로 수식한 다이메틸-히스티딜-엑센딘-4 (dimethyl-histidyl-exendin-4); 및 엑센딘-4의 첫 번째 아미노산인 히스티딘의 알파 탄소를 제거한 이미다조아세틸-엑센딘-4(imidazoacetyl-exendin-4)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  15. 제13항에 있어서, 상기 인슐린 분비 펩티드 유도체가 엑센딘-4의 N-말단 아미노 그룹을 제거하고 그의 C-말단 카르복실 그룹이 프로필아미드로 치환된 DA-엑센딘-4-프로필-아미드(DA-Exendin-4-propyl-amide)인 것인, 인슐린 분비 펩티드 유도체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체를 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 인슐린 분비 펩티드 유도체를 이를 필요로 하는 대상에게 치료학적 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 대상에게서 당뇨병을 치료하는 방법.
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