CN104918954A - N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物及包含其的药物组合物，具体而言，所述胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，胰岛素分泌肽的N-末端正电荷在中性pH值下变化为中性电荷或净负电荷。本发明的胰岛素分泌肽衍生物因如上所述的N-末端电荷的变化而从GLP-1受体迅速解离，一面维持在血液中的稳定性，一面呈现出比天然胰岛素增加的胰岛素分泌能力与降血糖能力，因此可非常有用地使用在2型糖尿病的治疗。

Description

N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物
技术领域
本发明涉及一种以具有增加的促胰岛素分泌活性及降血糖能力的方式变化的胰岛素分泌肽的衍生物及包含其的药物组合物，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，以使胰岛素分泌肽的N-末端电荷具有中性或净负电荷的方式变化。
背景技术
肽通常因稳定性较低而容易发生变化，且被体内的蛋白质水解酶分解而失去其活性，而且因大小相对较小而容易通过肾脏去除，因此为了维持包含肽作为药理学活性成分的医药品在血液中的浓度及效价，需要经常向患者投用肽药物。
但是，肽药物大部分是以注射剂形态投用给患者，因此为了维持生理活性肽在血液中的浓度，需要相应地进行频繁的注射，而这会给患者带来极大的痛苦。为了克服这种问题，正不断地进行增加肽药物在血液中的稳定性，并长时间较高地持续血液中的药物浓度而将药效极大化的努力。
尤其，这种肽药物的持续型制剂既需要在提高肽药物的稳定性的同时，充分较高地维持药物本身的效价，又不应对患者引发免疫反应。为此，作为用以使肽药物稳定化且抑制因蛋白质水解酶引起的分解的方法，不断进行变更对蛋白质水解酶敏感的特定氨基酸序列的尝试。
例如，在发挥减少血液中的葡萄糖浓度的作用，具有2型糖尿病治疗功效的GLP-1(7-37或7-36酰胺)的情况下，生理活性半衰期非常短为4分钟以下，其原因在于，因二肽基肽酶(dipeptidyl pepdidase IV，DPP IV)产生的GLP-1的第八个(Ala)与第九个(Asp)氨基酸之间的截断引起的GLP-1效价丧失。为此，开发出以Gly、Leu或D-Ala取代GLP-1的Ala8，增加对DPP IV的抵抗性，并且维持原有的生理活性的GLP-1衍生物。另外，GLP-1的N-末端氨基酸His7对GLP-1的活性而言非常重要，而且是DPP IV的靶向。为此，将N-末端变化为烷基或酰基、或对His7进行N-甲基化(N-methylation)或α-甲基化(alpha-methylation)来增加DPP IV抵抗性，并维持生理活性。但是，在这种情况下，虽确认到因DPP IV抵抗性增加而稳定性变良好，但存在使His7变化而成的衍生物的受体亲和力(receptor affinity)变得极小，在相同浓度下cAMP的分泌能力下降的问题(Gallwitz et al.,Regulatory Peptide 79:93-102,1999；Gallwitz et al.,Regulatory Peptide 86:103-111,2000)。
另外，在如GLP-1的胰岛素分泌肽中，艾塞那肽-4由His-Gly的序列构成，而并非由作为DPP IV的基质而发挥作用的GLP-1的序列即His-Ala构成，因此连同对DPP IV的抵抗性一并具有高于GLP-1的生理活性，从而具有长于GLP-1的体内半衰期。但是，即便艾塞那肽-4的体内半衰期长于GLP-1，在目前在市场上销售的艾塞那肽-4(依泽那太，exenatide)的情况下，也需要每天向患者投用两次，而这对于患者而言仍为较大的负担。
在这种背景下，本发明人等为了增加胰岛素分泌肽的活性及在血液中的稳定性而不断进行努力，结果确认到如下事实而完成了本发明：使胰岛素分泌肽的N-末端氨基酸的电荷变化而成的衍生物呈现出比其天然胰岛素分泌肽更优异的药物动力学、及高于其天然胰岛素分泌肽的促胰岛素分泌活性。
发明内容
[发明要解决的问题]
本发明的目的在于提供一种促胰岛素分泌活性增加，降血糖能力优异的胰岛素分泌肽衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种含有所述胰岛素分泌肽衍生物作为有效成分的糖尿病治疗用药物组合物。
本发明的又一目的在于提供一种利用所述胰岛素分泌肽衍生物治疗糖尿病的方法。
[解决问题的技术手段]
作为用以解决所述问题的一实施方式，本发明提供一种胰岛素分泌肽的N-末端电荷(charge)发生变化的胰岛素分泌肽衍生物。
作为一具体例，本发明提供一种以胰岛素分泌肽的N-末端氨基或氨基酸残基具有中性电荷(neutral charge)或净负电荷(net negative charge)的方式变化而成的胰岛素分泌肽衍生物。
作为另一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，以通过去除或取代胰岛素分泌肽的N-末端组氨酸残基的α-氨基、或去除α-碳而具有中性或净负电荷的方式化学变化。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，导入如下化学变化中的一个以上：去除胰岛素分泌肽的N-末端氨基；以羟基取代所述N-末端氨基；以两个甲基残基修饰所述N-末端氨基；以羧基取代所述N-末端氨基；去除所述N-末端组氨酸残基的α-碳，仅保留乙酰基咪唑残基；或去除所述N-末端氨基，且C-末端羧基被丙基酰胺(propylamide)取代。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，其是胰岛素分泌肽的N-末端组氨酸残基被选自由脱氨基组氨酰基、二甲基组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、及β-羧基咪唑并丙酰基构成的群组中的物质取代而成。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，胰岛素分泌肽的N-末端组氨酸残基被脱氨基组氨酰基取代，且C-末端羧基被丙基酰胺(propylamide)取代而成。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，胰岛素分泌肽对GLP-1受体具有亲和力。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，胰岛素分泌肽为以序列号：1表示的GLP-1、以序列号：2表示的艾塞那肽-4、以序列号：3表示的艾塞那肽-3、以序列号：5表示的胃泌酸调节素、以序列号：6表示的GIP、或它们的类似物。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，因N-末端电荷的变化而对GLP-1受体具有比天然胰岛素分泌肽增加的解离常数(Kd)。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，GLP-1、艾塞那肽-4、艾塞那肽-3、胃泌酸调节素、GIP、或它们的类似物的N-末端组氨酸残基被脱氨基组氨酰基、二甲基组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、或β-羧基咪唑并丙酰基取代。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，GLP-1、艾塞那肽-4、艾塞那肽-3、胃泌酸调节素、GIP、或它们的类似物的N-末端组氨酸残基被脱氨基组氨酰基取代，且C-末端羧基被丙基酰胺取代。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，选自由去除艾塞那肽-4的N-末端氨基的脱氨基组氨酰基-艾塞那肽-4(desamino-histidyl-exendin-4)；以羟基取代艾塞那肽-4的N-末端氨基的β-羟基咪唑并丙酰基-艾塞那肽-4(beta-hydroxyimidazopropionyl-exendin-4)；以羧基取代艾塞那肽-4的N-末端氨基的β-羧基咪唑并丙酰基-艾塞那肽-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4)；以两个甲基残基修饰艾塞那肽-4的N-末端氨基的二甲基组氨酰基-艾塞那肽-4(dimethyl-histidyl-exendin-4)；及去除作为艾塞那肽-4的第一个氨基酸的组氨酸的α-碳的咪唑并乙酰基-艾塞那肽-4(imidazoacetyl-exendin-4)构成的群组。
作为又一具体例，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，其为去除艾塞那肽-4的N-末端氨基，且其C-末端羧基被丙基酰胺取代而成的DA-艾塞那肽-4-丙基-酰胺(DA-Exendin-4-propyl-amide)。
作为另一实施方式，本发明提供一种包含如上所述的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物作为有效成分的糖尿病治疗用药物组合物。
作为又一实施方式，本发明提供一种将如上所述的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物按照治疗有效量投用给需要其的受试者的治疗受试者糖尿病的方法。
[发明效果]
本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物可从GLP-1受体迅速解离而防止因所述受体引起的胰岛素分泌肽的清除(clearance)，可更少地引起脱敏作用(desensitization)。另外，本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物因对所述GLP-1受体的结合力的变化而呈现出比天然胰岛素分泌肽增加的促胰岛素分泌活性及在生物体内(in vivo)的降血糖能力，从而可非常有用地使用在糖尿病的治疗中。
附图说明
图1a至图1d是表示本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物在不同浓度下相对于GLP-1受体的结合曲线，图1a是天然艾塞那肽-4的结果，图1b是CA-艾塞那肽-4的结果，图1c是DA-艾塞那肽-4的结果，图1d是DA-艾塞那肽-4-丙基-酰胺的结果，图1e是HY-艾塞那肽-4的结果。
图2是测定天然艾塞那肽-4与本发明的N-末端电荷发生变化的CA-艾塞那肽-4衍生物的促胰岛素分泌活性的结果。
图3是在糖尿病动物模型中测定天然艾塞那肽-4与本发明的N-末端电荷发生变化的CA-艾塞那肽-4衍生物的降血糖能力的结果。
具体实施方式
本发明涉及一种胰岛素分泌肽的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物。
本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，使胰岛素分泌肽的N-末端电荷发生变化而实现与受体的迅速解离。
在本发明中，术语“胰岛素分泌肽衍生物”是指，拥有固有的胰岛素分泌功能，并且以通过化学、遗传、或物理操作而使天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段的N-末端电荷从正电荷变为中性或净负电荷的方式变化。
具体而言，本发明的胰岛素分泌肽衍生物优选为以在中性pH值下使胰岛素分泌肽的N-末端氨基或氨基酸残基具有中性或净负电荷的方式化学变化而成。更优选为本发明的胰岛素分泌肽的N-末端的第一个氨基酸残基的正电荷变化为中性或净负电荷的衍生物。
在本发明中，术语“胰岛素分泌肽”作为拥有胰岛素分泌功能的肽，刺激胰腺β细胞的胰岛素的合成及表达。适于本发明的胰岛素分泌肽只要是与GLP-1受体结合而呈现出生理活性的胰岛素分泌肽，则其种类可不受限制地使用，作为非限制性的例，可为序列号：1的GLP-1(7-37)、序列号：2的艾塞那肽-4、序列号：3的艾塞那肽-3、序列号：5的胃泌酸调节素(oxyntomodulin)、序列号：6的葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)、它们的类似物或片段。
在本发明中，术语“胰岛素分泌肽的类似物”是指作为一个以上的氨基酸序列不同于天然胰岛素分泌肽的肽，拥有胰岛素分泌功能的肽。优选地，本发明的胰岛素分泌肽的类似物是指与天然胰岛素分泌肽相比，最少80％以上的氨基酸序列呈现出相同性的多肽，可为氨基酸残基的一部分基团被化学取代(例如，α-甲基化、α-羟基化)、去除(例如，脱氨基)或修饰(例如，N-甲基化)的形态。
在本发明的一优选的实施方式中，胰岛素分泌肽的类似物是指胰岛素分泌功能与天然胰岛素分泌肽等同、或为其以上的胰岛素分泌肽，但本发明的胰岛素分泌肽的类似物的范围并不仅仅限定于具有这种程度的胰岛素分泌功能的胰岛素分泌肽的类似物。
在本发明中，术语“胰岛素分泌肽的片段”是指拥有胰岛素分泌功能，并且在天然胰岛素分泌肽的N-末端或C-末端追加或删除一个或其以上的氨基酸的形态，所追加的氨基酸也可为并非天然存在的氨基酸(例如，D型氨基酸)。
GLP-1作为从小肠分泌的荷尔蒙，通常促进胰岛素的生物合成及分泌，抑制胰高血糖素分泌，并促进细胞内的葡萄糖的吸收。在小肠中，胰高血糖素前体被分解为三个肽、即胰高血糖素、GLP-1、及GLP-2。其中，GLP-1是指GLP-1(1～37)，呈无胰岛素分泌功能的形态，并被处理成GLP-1(7-37)形态而成为活性GLP-1(7-37)。GLP-1(7-37)具有以序列号：2表示的氨基酸序列。
优选地，GLP-1类似物可选自由Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、及Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)构成的群组，但并不限制于此。
作为又一类型的胰岛素分泌肽，艾塞那肽-4作为由与GLP-1呈现出53％的氨基酸序列类似性的39个氨基酸所构成的多肽，具有以序列号：2表示的氨基酸序列。艾塞那肽-3具有以序列号：3表示的氨基酸序列，为与艾塞那肽-4仅第二及第三位置的氨基酸不同的艾塞那肽-4类似物。艾塞那肽-3是艾塞那肽-4的第二及第三位置的氨基酸分别被丝氨酸及天冬氨酸取代而成，可表示为Ser2Asp3-艾塞那肽-4(1-39)。作为又一艾塞那肽-4类似物，艾塞那肽-4的第38及第39位置的氨基酸分别被丝氨酸及赖氨酸取代而成的ZP-10表示为Ser38Lys39-艾塞那肽-4(1-39)-LysLysLysLysLys-酰胺，具有序列号：4的氨基酸序列。
胃泌酸调节素(oxyntomodulin)是从作为胰高血糖素的前体的前胰高血糖素(pre-glucagon)制成的肽，所述胃泌酸调节素与GLP-1一同与营养素摄取成正比而从小肠的L-细胞分泌。胃泌酸调节素作为由以序列号：5表示的37个氨基酸构成的肽荷尔蒙，发挥抑制食物的摄取、增进饱腹感、及分解胰高血糖素的脂肪的功能。
葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽(GIP)作为与肠内营养成分吸收对应地依赖葡萄糖浓度而在胰腺中调节胰岛素的分泌的肠促胰岛素(incretin)，由以序列号：6记载的42个氨基酸构成，且从小肠的K细胞分泌。GIP不仅在β细胞中依赖葡萄糖而刺激胰岛素的分泌，而且促进胰岛素的合成，引导β细胞的增殖，对死灭具有抑制效果。
分别使用在如上所述的天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段中的制造方法可单独使用，也可组合使用。例如，还包含一个以上的氨基酸序列不同，且对N-末端氨基酸残基进行脱氨化(deamination)而成的胰岛素分泌肽。
作为具体的一实施方式，在本发明中所使用的天然胰岛素分泌肽与经变化的胰岛素分泌肽衍生物可通过固相(Solid phase)合成法而合成，包含天然胰岛素分泌肽的大部分天然多肽也可通过重组方法而生产。
所述GLP-1、艾塞那肽-4、艾塞那肽-3、胃泌酸调节素、或GIP的类似物是指天然GLP-1、艾塞那肽-4、或艾塞那肽-3中的一个以上的氨基酸被取代、缺失、及/或附加而成的肽、或一个以上的氨基酸残基通过例如烷化、酰化、酯化或形成酰胺等而化学变化而成的肽，且指具有天然促胰岛素分泌活性的肽。
这种GLP-1、艾塞那肽-3、或艾塞那肽-4的类似物已公开在关于部分删除GLP-1或艾塞那肽-4的C-末端、或以作为非天然氨基酸的正亮氨酸(norleucine)取代的艾塞那肽变体的WO97/46584；关于取代像戊基甘氨酸(pentylglycine)、高脯氨酸(homoproline)、叔丁基甘氨酸(tert-butylglycine)一样包含非天然氨基酸的艾塞那肽的氨基酸而成的变体的WO99/07404；关于截断艾塞那肽-4的C-末端氨基酸残基的一部分而以短于天然氨基酸的氨基酸序列构成、或者以其他氨基酸取代而成的艾塞那肽变体的US2008/0119390等，这些文献作为参照文献而合并在本说明书中。
本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，以如上所述的天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段的N-末端氨基或氨基酸残基具有中性或净负电荷的方式变化。
优选地，本发明的胰岛素分泌肽衍生物为以胰岛素分泌肽的N-末端的第一个氨基酸残基的正电荷具有中性或净负电荷的方式化学变化而成的衍生物。
如上所述，以N-末端具有中性或净负电荷的方式变化的本发明的胰岛素分泌肽衍生物的特征在于，与天然胰岛素分泌肽相比，对GLP-1受体具有更高的解离常数(Kd)。优选地，本发明的胰岛素分泌肽衍生物是以具有比天然胰岛素分泌肽增加2倍以上、更优选为3倍以上、最优选为6倍以上的对GLP-1受体的解离常数(Kd)的方式变化而成的衍生物，但并不限制于此。
胰岛素分泌肽的N-末端正电荷变化为中性或净负电荷的本发明的胰岛素分泌肽衍生物可通过所属领域内公知的多种方法制造，优选地，能够以通过去除或取代具有正电荷的胰岛素分泌肽的N-末端组氨酸残基的α-氨基、或去除α-碳而具有中性或净负电荷的方式变化。
更优选地，本发明的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物可包含：去除胰岛素分泌肽的N-末端氨基的衍生物(脱氨基-组氨酰基衍生物)；以羟基取代所述胰岛素分泌肽的N-末端氨基的衍生物(β-羟基咪唑并丙酰基衍生物)；以两个甲基(methyl)残基修饰所述胰岛素分泌肽的N-末端氨基的衍生物(二甲基-组氨酰基-衍生物)；以羧基取代所述胰岛素分泌肽的N-末端氨基的衍生物(β-羧基咪唑并丙酰基-衍生物)；去除所述胰岛素分泌肽的N-末端组氨酸残基的α-碳，仅保留咪唑并乙酰基(imidazoacetyl)基团的衍生物(咪唑并乙酰基-衍生物)等；只要是可使N-末端的正电荷变化为中性或净负电荷的胰岛素分泌肽，则任意形态的氨基-末端氨基修饰的衍生物也属于本发明的范畴。
如上所述，N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物可由下述结构式表示。
进而，在本发明的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物中，可包含去除N-末端氨基的脱氨基组氨酰基衍生物的C-末端羧基被丙基酰胺(propylamide)取代而成的衍生物。
如上所述，N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物可由下述结构式表示。
更优选地，本发明的胰岛素分泌肽衍生物可为GLP-1、艾塞那肽-4、艾塞那肽-3、胃泌酸调节素、GIP、及它们的类似物或片段的N-末端组氨酸残基被脱氨基组氨酰基、二甲基组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、或β-羧基咪唑并丙酰基取代而N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物。
在本发明的一实施方式中，本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物可由下述化学式1表示。
R1-X-R2＜化学式1＞
在所述式中，R1选自由脱氨基组氨酰基、二甲基组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、及β-羧基咪唑并丙酰基构成的群组，
R2为-NH2或-OH，
X为Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys GluPhe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly；
Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuPhe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser；
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuPhe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser；或
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp PheVal Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala。
在本发明的优选的实施方式中，所述胰岛素分泌肽衍生物作为艾塞那肽-4的N-末端电荷发生变化的衍生物，可为去除艾塞那肽-4的N-末端氨基的脱氨基组氨酰基-艾塞那肽-4(desamino-histidyl-exendin-4，DA-艾塞那肽-4)；以羟基取代艾塞那肽-4的N-末端氨基的β-羟基咪唑并丙酰基-艾塞那肽-4(beta-hydroxy imidazopropionyl-exendin-4，HY-艾塞那肽-4)；以羧基取代艾塞那肽-4的N-末端氨基的β-羧基咪唑并丙酰基-艾塞那肽-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4，CX-艾塞那肽-4)；以两个甲基残基修饰艾塞那肽-4的N-末端氨基的二甲基组氨酰基-艾塞那肽-4(dimethyl-histidyl-exendin-4，DM-艾塞那肽-4)；或去除作为艾塞那肽-4的第一个氨基酸的组氨酸的α-碳的咪唑并乙酰基-艾塞那肽-4(imidazoacetyl-exendin-4，CA-艾塞那肽-4)。
另外，本发明的胰岛素分泌肽衍生物可为GLP-1、艾塞那肽-4、艾塞那肽-3、胃泌酸调节素、GIP、及它们的类似物或片段的N-末端组氨酸残基被脱氨基组氨酰基取代，且其C-末端羧基被丙基酰胺取代而成的衍生物。
在本发明的其他实施方式中，所述N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物可包含去除艾塞那肽-4的N-末端氨基的脱氨基组氨酰基-艾塞那肽-4(DA-艾塞那肽-4)的C-末端羧基被丙基酰胺取代而成的DA-艾塞那肽-4-丙基-酰胺(DA-Exendin-4-propyl-amide)。
所述衍生物是去除或取代氨基-末端组氨酸残基的α-氨基、或去除α-碳的衍生物，除此之外的氨基酸序列只要维持生理活性，则并无特别限制。
如所述艾塞那肽-4衍生物，其他种类的胰岛素分泌肽、例如艾塞那肽-3、GLP-1、胃泌酸调节素、及GIP的N-末端也可全部适用这种取代或去除，只要维持促胰岛素分泌活性，则其类似物及片段也可全部适用这种取代或去除。
在本发明的胰岛素分泌肽衍生物中，N-末端正电荷向中性或净负电荷的变化可迅速诱发与GLP-1受体的解离，防止因所述受体引起的胰岛素分泌肽的清除(clearance)，且更少地引起脱敏作用(desensitization)而可呈现出优异的生理活性。
另外，在本发明的胰岛素分泌肽衍生物中，胰岛素分泌肽的N-末端的电荷变化为中性或净正电荷，从而因对GLP-1受体的结合力的变化而促胰岛素分泌活性比天然胰岛素分泌肽增加，可在生物体内(in vivo)呈现出优异的降血糖能力。
在本发明的一实施例中，确认到将胰岛素分泌肽的N-末端氨基酸的正电荷变化为中性或净负电荷而成的胰岛素分泌肽衍生物对GLP-1受体具有高于天然胰岛素分泌肽的解离常数(Kd)，由此可反复进行与GLP-1受体的频繁的结合/解离(参照实施例1)。另外，所述N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物呈现出较电荷未发生变化的天然胰岛素分泌肽增加约2倍左右的促胰岛素分泌活性(参照实施例2)，在糖尿病动物模型(db/db小鼠)中，呈现出较天然胰岛素分泌肽增加约5倍左右的降血糖能力(参照实施例3)。
因此，可知胰岛素分泌肽的N-末端电荷发生变化的本发明的胰岛素分泌肽衍生物对GLP-1受体的解离常数增加，即，从GLP-1受体的解离增加而呈现出优异的在血液中的稳定性及胰岛素分泌能力。
在本发明中最初发现如下事实：如上所述，如果将胰岛素分泌肽的N-末端电荷变化为中性或净负电荷，则与GLP-1受体的结合力、尤其是从所述受体的解离增加，从而可增加胰岛素分泌肽的生物学活性。因此，本发明的胰岛素分泌肽衍生物的优异的在血液中的稳定性及促胰岛素分泌活性在将2型糖尿病的治疗效果极大化的方面有用。
作为其他实施方式，本发明提供一种包含胰岛素分泌肽的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物作为有效成分的糖尿病治疗用药物组合物。
对于N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物的说明与上述内容相同。
本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物具有高于天然胰岛素分泌肽的促胰岛素分泌活性及降血糖能力，可用作优异的糖尿病治疗剂。
本发明的糖尿病治疗用药物组合物可通过向需要治疗糖尿病的个体投用而有效地治疗糖尿病。
因此，在本发明的范畴中包含将如上所述的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物按照治疗有效量投用给需要其的受试者的治疗受试者糖尿病的方法。
在本发明中，术语“治疗”是指通过投用本发明的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物或包含其的药物组合物而使糖尿病症状好转或向有利方向发展的所有行为。
在本发明中，术语“投用”是指通过任意适当的方法向受试者导入指定物质、即本发明的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物或包含其的药物组合物，只要药物可到达目标组织，则其投用途径可使用任一通常的途径。例如，投用途径可为腹腔内投用、静脉投用、肌肉内投用、皮下投用、皮内投用、口服投用、局部投用、鼻内投用、肺内投用、直肠内投用等，但并不限制于此。但是，口服投用时肽会被消化，因此口服用组合物优选为将活性药剂被覆、或实现制剂化而以便不会被胃分解。优选地，能够以注射剂形态投用。另外，可利用活性物质可向靶细胞移动的任意的装置投用药物组合物。
包含本发明的衍生物的药物组合物可包含可在药剂学上允许的载体。在口服投用的情况下，药剂学上允许的载体可使用结合剂、滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、色素、香料等，在注射剂的情况下，可混合使用缓冲剂、保护剂、无痛剂、增溶剂、等张剂、稳定剂等，在局部投用的情况下，可使用基剂、赋形剂、润滑剂、保护剂等。本发明的药物组合物的剂型可与如上所述的在药剂学物上允许的载体混合而以各种方式制造。例如，在口服投用的情况下，可制造成片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸等形态，在注射剂的情况下，可制造成单位投用安瓶或多次投用形态。还可剂型化成其他溶液、悬浮液、片剂、药丸、胶囊、缓释剂等。
另一方面，作为适于制剂化的载体、赋形剂、及稀释剂的例，可使用乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、或矿物油等。另外，还可追加包含填充剂、抗凝聚剂、润滑剂、湿润剂、香料、防腐剂等。
本发明的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物或包含其的药物组合物是按照治疗有效量投用。在本发明中，术语“治疗有效量”是指足够按照可应用在医学治疗中的合理性的受益/危险比率治疗疾病的量，有效容量水准可根据患者疾病的种类、严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、投用时间、投用途径及排出比率、治疗时间、包含同时使用的药物的要素、及其他医学领域内公知的要素而决定。本发明的N-末端的电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物或包含其的药物组合物可作为单独治疗剂而投用、或与其他治疗剂一并投用，且可与以往的治疗剂依次或同时投用，可单一投用或多重投用。重要的是考虑所述所有因素，投用无副作用而能够以最少的量获得最大效果的量，投用量可由所属领域技术人员容易地决定。
本发明的药物组合物的投用量与次数是连同所要治疗的疾病、投用途径、患者的年龄、性别、体重、及疾病的严重程度等多个相关因素一并根据作为活性成分的药物的种类而决定。本发明的药物组合物在生物体内的持续性及效价优异，因此可明显减少本发明的药物制剂的投用次数及频率。
在本发明中，术语“受试者”是指包含人、猴子、牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、或豚鼠但并不限定于此的动物，在一实施例中指哺乳类，在另一实施例中指人。
以下，通过下述实施例，进一步详细地对本发明进行说明。但是，下述实施例仅用以例示本发明，本发明的范围并不限定于此。
实施例1：N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物对GLP-1受体的结合力的比较
使用表面等离子共振(surface plasmon resonance：SPR)装置(BIACORE 3000，GEHealthcare)测定GLP-1受体与N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物的结合力。此时，使用CA-艾塞那肽-4(CA-Exendin-4)、DA-艾塞那肽-4(DA-Exendin-4)、HY-艾塞那肽-4(HY-Exendin-4)、及DA-艾塞那肽-4-丙基-酰胺(DA-Exendin-4-propyl-amide)作为N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物。所述CA-艾塞那肽-4为去除艾塞那肽-4的N-末端组氨酸残基的α-碳的衍生物；DA-艾塞那肽-4为去除艾塞那肽-4的N-末端氨基的衍生物；HY-艾塞那肽-4为以羟基取代艾塞那肽-4的N-末端氨基的衍生物；DA-艾塞那肽-4-丙基-酰胺为去除艾塞那肽-4的N-末端氨基，且C-末端羧基被丙基酰胺取代的衍生物。并且，使用天然艾塞那肽-4(依泽那太：Byetta)作为对照组。通过American PeptideCorporation公司合成N-末端电荷发生变化的艾塞那肽-4衍生物，从AmylinPharmaceuticals购得天然艾塞那肽-4。
在CHO-DG44细胞中以hGLP-1R/GST形态表达GLP-1受体，通过氨基偶联法(aminecoupling)而将所表达的hGLP-1R/GST固定在CM5芯片。按照不同浓度稀释所述N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物后添加到固定有hGLP-1R/GST的CM5芯片，测定与GLP-1受体的结合力。此时，根据1∶1朗缪尔拟合模型(Langmuir fitting model)分析N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物与GLP-1受体之间的结合力，将其结果示于图1a至图1e及下述表1。
表1
[Table 1]
如表1及图1a至图1e所示，确认到天然艾塞那肽-4的N-末端带有正电荷，相反地，其电荷变化为中性电荷的艾塞那肽-4衍生物具有比天然型艾塞那肽-4明显增加的解离常数(kd)。根据所述结果，可知可在GLP-1受体与N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物之间反复进行更加频繁的结合/解离。
对GLP-1受体的这种药物动力学变化可防止因所述受体引起的胰岛素分泌肽衍生物的清除，且更少地引起脱敏作用，有利于增加在血液中的稳定性。
实施例2：测定N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物的促胰岛素分泌活性
将RINm5F细胞作为受试者，对N-末端电荷发生变化的艾塞那肽-4衍生物的促胰岛素分泌活性(insulinotropic activity)进行比较。将在解冻后进行一次以上的传代培养的RINm5F细胞与含有FBS(Gibco，#11082)的培养基一同接种到96-孔板，使其成为1×105细胞/孔，在37℃、5％CO2培养基中培养48小时。为了测定促胰岛素分泌活性，在以含有0.5％FBS的培养基更换培养的RINm5F细胞的培养基后，追加培养1小时。
分别利用含有0.5％FBS与葡萄糖的培养基稀释如所述实施例1的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物与天然艾塞那肽-4(依泽那太：Byetta)，准备10nM至0.001nM。此时，使用不含艾塞那肽-4的培养基作为对照组。在全部取出所培养的RINm5F细胞的培养基并添加准备的试样后，在37℃、5％CO2培养基中培养1小时，之后回收各孔的所有培养基。利用大鼠胰岛素ELISA试剂盒(Mercodia公司)测定回收的培养基的胰岛素浓度，将其结果示于图2及下述表2。
表2
[Table 2]
试样 最大胰岛素分泌量与对照组的比率
N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物 198.9％
天然艾塞那肽-4 159.0％
如所述表2及图2所示，确认到本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物在相同的浓度范围内呈现出比天然艾塞那肽-4优异约1.25倍左右的促胰岛素分泌活性。
实施例3：N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物在生物体内的活性比较
为了测定N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物在生物体内(in vivo)的活性，在糖尿病动物模型中，与天然艾塞那肽-4比较降血糖能力。使db/db小鼠(Jackson Lab，10-12周龄)绝食两小时后，通过皮下途径分别投用0.01至1000mcg/kg的天然艾塞那肽-4(依泽那太：Byetta)与N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物。此时，作为对照组，以相同的方式投用媒剂(vehicle)，并在各个投用浓度下，以与媒剂的％变化值计算因投用药物引起的血糖变化。
在投用药物1小时后，从尾巴采集血液，利用血糖测定仪测定血糖，在各个投用浓度下，利用棱柱(Prism)程序求出与媒剂对比的降血糖效果的活性(ED50)。
表3
[Table 3]
试样 ED50(mcg/kg) R2
N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物 2.30 0.99
天然艾塞那肽-4 9.92 0.98
如所述表3及图3所示，在糖尿病动物模型中，本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物呈现出比天然艾塞那肽-4增加约5倍左右的降血糖能力。
根据所述结果可知，本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物因对GLP-1受体的解离常数增加而从GLP-1受体迅速解离，呈现出优于天然胰岛素分泌肽的在血液中的稳定性，因此呈现出增加的胰岛素分泌能力及降血糖能力。因此，本发明的胰岛素分泌肽衍生物可非常有用地使用在2型糖尿病的治疗中。
根据以上说明，本发明所属技术领域内的技术人员可理解本发明可不变更其技术思想或必要的特征而以其他具体形态实施。与此相关，应理解以上所述的实施例在所有方面均仅为例示，并不具限定性。相比所述详细说明，本发明的范围应解释为从权利要求书的内容及范围、以及其等效概念导出的所有变更或变化的形态均包含在本发明的范围内。
[产业上的可利用性]
本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物可从GLP-1受体迅速解离而防止因所述受体引起的胰岛素分泌肽的清除，可更少地引起脱敏作用。另外，本发明的N-末端电荷发生变化的胰岛素分泌肽衍生物因对所述GLP-1受体的结合力的变化而呈现出比天然胰岛素分泌肽增加的促胰岛素分泌活性及在生物体内的降血糖能力，可有用地使用在糖尿病的治疗中。

Claims (17)

1.一种胰岛素分泌肽衍生物，其天然胰岛素分泌肽的N-末端电荷(charge)发生变化。
2.根据权利要求1所述的胰岛素分泌肽衍生物，其以使天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段的N-末端氨基、或氨基酸残基的正电荷具有中性或净负电荷的方式化学变化而成。
3.根据权利要求2所述的胰岛素分泌肽衍生物，其中所述天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段的N-末端残基为组氨酸，所述变化是以通过去除或取代所述组氨酸残基的α-氨基、或去除α-碳而具有中性或净负电荷的方式进行的变化。
4.根据权利要求3所述的胰岛素分泌肽衍生物，其中所述变化包含：去除天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段的N-末端氨基；以羟基取代所述N-末端氨基；以两个甲基残基修饰所述N-末端氨基；以羧基取代所述N-末端氨基；去除所述N-末端组氨酸残基的α-碳，仅保留乙酰基咪唑残基；或去除所述N-末端氨基，并以丙基酰胺(propylamide)取代C-末端的羧基；中的一个以上。
5.根据权利要求4所述的胰岛素分泌肽衍生物，其是天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段的N-末端残基被选自由脱氨基组氨酰基、二甲基组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、及β-羧基咪唑并丙酰基构成的群组中的物质取代而成。
6.根据权利要求4所述的胰岛素分泌肽衍生物，其是天然胰岛素分泌肽及其类似物或片段的N-末端残基被脱氨基组氨酰基取代，且C-末端羧基被丙基酰胺取代而成。
7.根据权利要求1所述的胰岛素分泌肽衍生物，其具有对GLP-1受体的亲和力。
8.根据权利要求1所述的胰岛素分泌肽衍生物，其中所述天然胰岛素分泌肽为以序列号：1表示的GLP-1、以序列号：2表示的艾塞那肽-4、以序列号：3表示的艾塞那肽-3、以序列号：5表示的胃泌酸调节素、以序列号：6表示的GIP、及它们的类似物或片段。
9.根据权利要求8所述的胰岛素分泌肽衍生物，其中所述天然胰岛素分泌肽或其类似物为GLP-1类似物，选自由Arg34-GLP-1(7-37)、Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、及Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)构成的群组。
10.根据权利要求8所述的胰岛素分泌肽衍生物，其中所述天然胰岛素分泌肽或其类似物为序列号：4的ZP-10(Ser38Lys39-艾塞那肽-4(1～39)-LysLysLysLysLys-酰胺)艾塞那肽-4类似物。
11.根据权利要求1所述的胰岛素分泌肽衍生物，其与其天然胰岛素分泌肽相比，对GLP-1受体具有更大的解离常数(Kd)。
12.根据权利要求5所述的胰岛素分泌肽衍生物，其以下述化学式1表示，
R1-X-R2＜化学式1＞；
在所述式中，R1选自由脱氨基组氨酰基、二甲基组氨酰基、β-羟基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙酰基、及β-羧基咪唑并丙酰基构成的群组，
R2为-NH2或-OH，
X为Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys GluPhe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly；
Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuPhe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser；
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg LeuPhe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser；或
Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp PheVal Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala。
13.根据权利要求6所述的胰岛素分泌肽衍生物，其是GLP-1、艾塞那肽-4、艾塞那肽-3、胃泌酸调节素、GIP或其类似物的N-末端组氨酸残基被脱氨基组氨酰基取代，且C-末端羧基被丙基酰胺取代而成。
14.根据权利要求12所述的胰岛素分泌肽衍生物，其选自由去除艾塞那肽-4的N-末端氨基的脱氨基组氨酰基-艾塞那肽-4(desamino-histidyl-exendin-4)；以羟基取代艾塞那肽-4的N-末端氨基的β-羟基咪唑并丙酰基-艾塞那肽-4(beta-hydroxyimidazopropionyl-exendin-4)；以羧基取代艾塞那肽-4的N-末端氨基的β-羧基咪唑并丙酰基-艾塞那肽-4(beta-carboxyimidazopropionyl-exendin-4)；以两个甲基残基修饰艾塞那肽-4的N-末端氨基的二甲基组氨酰基-艾塞那肽-4(dimethyl-histidyl-exendin-4)；及去除作为艾塞那肽-4的第一个氨基酸的组氨酸的α-碳的咪唑并乙酰基-艾塞那肽-4(imidazoacetyl-exendin-4)构成的群组。
15.根据权利要求13所述的胰岛素分泌肽衍生物，其为去除艾塞那肽-4的N-末端氨基，且其C-末端羧基被丙基酰胺取代的DA-艾塞那肽-4-丙基-酰胺(DA-Exendin-4-propyl-amide)。
16.一种糖尿病治疗用药物组合物，其含有根据权利要求1至15中任一项所述的胰岛素分泌肽衍生物作为有效成分。
17.一种治疗受试者糖尿病的方法，其包含将根据权利要求1至15中任一项所述的胰岛素分泌肽衍生物按照治疗有效量投用给需要其的受试者。
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