WO2014104200A1 - カロテノイド組成物の製造方法 - Google Patents

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WO2014104200A1
WO2014104200A1 PCT/JP2013/084911 JP2013084911W WO2014104200A1 WO 2014104200 A1 WO2014104200 A1 WO 2014104200A1 JP 2013084911 W JP2013084911 W JP 2013084911W WO 2014104200 A1 WO2014104200 A1 WO 2014104200A1
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yeast
washing
extraction
weight
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PCT/JP2013/084911
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健登 金谷
木下　浩一
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Kaneka Corp
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Kaneka Corp
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
    • C07C403/24—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains substituted by six-membered non-aromatic rings, e.g. beta-carotene
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/12—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring
    • C07C2601/16—Systems containing only non-condensed rings with a six-membered ring the ring being unsaturated

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a carotenoid composition. More specifically, the present invention relates to a method for producing a carotenoid composition, wherein carotenoids such as astaxanthin are extracted from a yeast of the genus Xanthophyllomyces.
  • Carotenoids are known as natural pigments that are widely distributed in nature and have a yellow, orange, red, or purple color.
  • astaxanthin a kind of it, is widely used in animal feed as a color frying agent for fish and eggs. Yes. Astaxanthin is also recognized as a food additive, and is widely used in processed oil and fat foods, proteinaceous foods, aqueous liquid foods, health foods, and the like.
  • astaxanthin has been used for its excessive activity in the body by utilizing its antioxidant activity against lipid peroxidation induced by its free radicals and singlet oxygen scavenging that reaches several hundred times that of ⁇ -tocopherol. It is expected to be used as cosmetics, functional foods, and pharmaceuticals such as suppressing active oxygen, improving spots and wrinkles, preventing cataracts, arteriosclerosis and heart disease, strengthening immunity and preventing cancer.
  • Astaxanthin is widely distributed in nature such as fish such as salmon, trout and red sea bream, crustaceans such as crab, shrimp and krill, and also belongs to the genus Paracoccus, Brevibacterium, and the like, Hematococcus -Algae such as Pumabia (Hematococcus pluviaris), and microorganisms such as yeasts such as Xanthophyllomyces dendrhaus (also known as Phaffia rhodozyma) are also produced.
  • carotenoids such as astaxanthin and zeaxanthin
  • chemically synthesized products are widely used at present due to supply stability and cost problems.
  • chemical synthetic products are worried about contamination with impurities derived from the manufacturing process, particularly powerful drugs harmful to the human body used in the synthesis reaction, and from the viewpoint of safety, it is desired to supply products made of natural raw materials.
  • Patent Document 2 A method for obtaining 0.5 to 60% astaxanthin without using any organic solvent has been reported (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 A method for obtaining 0.5 to 60% astaxanthin without using any organic solvent has been reported (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 A method for obtaining 0.5 to 60% astaxanthin without using any organic solvent has been reported (Patent Document 2).
  • Patent Document 2 A method for obtaining 0.5 to 60% astaxanthin without using any organic solvent has been reported (Patent Document 2).
  • this method requires special equipment for mass production, requires a long extraction operation to achieve a sufficient yield, and requires a separate concentration operation to obtain a high content of astaxanthin. For example, it is not satisfactory for industrial production of a high content of carotenoid composition.
  • yeast cells are extracted in a mixed solvent of n-hexane-ethanol while being pulverized with a compression grinder, and the extract is concentrated.
  • a method of increasing the concentration of astaxanthin by removing free fatty acids and triglycerides by suspending and filtering the oily substance in a cooled state at ⁇ 50 ° C. and further removing residual free fatty acids in the pigment oil by metal soap.
  • yeast of the genus Xanthophyllomyces contains about 25% by weight of lipid per dry cell weight, and the composition of the extract obtained from the yeast is mainly composed of the lipid.
  • the concentrate obtained by concentrating such an extract becomes a sticky viscous liquid. Therefore, in order to obtain a composition containing astaxanthin at a high concentration using the yeast of the genus Xanthophyllomyces, it is necessary to remove many impurities such as lipids during the production. It is necessary to use an organic solvent such as hexane, which involves complicated and non-industrial means as described above, or is harmful to the human body and has restrictions on the remaining amount in the final product. Under these circumstances, there has been a demand for a method for producing a naturally-derived carotenoid composition containing astaxanthin at a high concentration by a method that is easy to handle and has little residual solvent or does not cause a problem with residual solvent.
  • Patent Documents 5 and 6 when the present inventors actually applied the methods of Patent Documents 5 and 6 to yeasts belonging to the genus Xanthophyllomyces, a large amount of lipid remains in the precipitate, and operations such as filtration can be performed in the washing step. It was found that it was difficult to manufacture with satisfactory efficiency.
  • the present invention provides a high concentration of astaxanthin and the like from a culture of Xanthophyllomyces yeast without requiring special extraction equipment or complicated purification steps, and without necessarily using an organic solvent harmful to the human body.
  • An object of the present invention is to provide a production method capable of efficiently industrially producing a naturally occurring carotenoid composition.
  • the present invention relates to a method for producing a carotenoid composition having the following steps (1) to (3).
  • (2) Xanthophyllomyces after the washing A heat treatment step in which the yeast is heat treated in a heat treatment solvent at a high temperature condition of 65 ° C. or higher (3)
  • the yeast after the heat treatment is contacted with an extraction solvent in the yeast at a temperature of 10 to 70 ° C.
  • the extraction step (3) is preferably performed by adding an extraction solvent to the yeast after the heat treatment, and the carotenoid is astaxanthin.
  • the yeast of Xanthophyllomyces is further washed with an extraction solvent having a water content of less than 3% by weight.
  • the extraction temperature in the extraction step (3) is 10 to 45 ° C.
  • the extraction solvent is at least one organic solvent selected from the group consisting of alcohols, hydrocarbons and ethers.
  • the heat treatment solvent, the washing solvent and the extraction solvent are all ethanol.
  • the production method of the present invention not only removes most of the contaminants such as lipids contained in the yeast of the genus Xanthophyllomyces in advance, but further heat-treats the yeast after washing, thereby extracting carotenoids thereafter.
  • a method for producing a carotenoid composition derived from a natural product that can be efficiently carried out is simple, and is suitable for industrial production.
  • the production method of the present invention comprises (1) a washing step of washing a carotenoid-containing Xanthophyllomyces genus yeast at least once using a washing solvent having a water content of 3 to 50% by weight, (2) the washing A heat treatment step of subjecting the subsequent yeast of the genus Xanthophyllomyces to a heat treatment in a heat treatment solvent at a high temperature condition of 65 ° C. or higher; (3) contacting the yeast after the heat treatment with an extraction solvent;
  • a method for producing a carotenoid composition comprising performing three steps of an extraction step of extracting carotenoid in yeast at a temperature of ⁇ 70 ° C.
  • the carotenoid in the present invention is not particularly limited, and specifically, carotenes such as ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, ⁇ -carotene, lycopene, lutein, zeaxanthin, canthaxanthin, fucoxanthin, astaxanthin, anthaxanthin and the like Xanthophylls and the like can be mentioned, and among them, the production method of the present invention is particularly suitable for obtaining astaxanthin as a carotenoid.
  • the obtained astaxanthin includes an embodiment obtained as a mixture with a carotenoid other than astaxanthin.
  • the yeast of the genus Xanthophyllomyces used as a raw material for the production method of the present invention is not particularly limited as long as it produces carotenoids, but is particularly preferable as a specific example of a yeast of the genus Xanthophyllomyces that produces astaxanthin as a carotenoid.
  • Xanthophyllomyces dendrrous also known as Phaffia rhodozyma
  • the present invention not only the wild strain of the yeast of the genus Xanthophilomyces, but also, for example, the transcription and translational activity of genes involved in the biosynthesis of the target carotenoids of the yeast of the genus Xanthophylomyces Alternatively, a mutant or recombinant in which the enzyme activity of the expressed protein is modified or improved can be preferably used.
  • carotenoids are produced by culturing the yeast of the genus Xanthophyllomyces.
  • the culture method is not particularly limited, and a culture method suitable for a target yeast of the genus Xanthophyllomyces or suitable for production of a target carotenoid may be appropriately selected.
  • the carbon source used for the culture include, but are not limited to, sucrose, glucose, xylose, maltose, corn syrup, molasses, starch, glycerin, ethanol, acetic acid, lactic acid, citric acid, and succinic acid. is not. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more kinds for the purpose of improving the carotenoid content in the bacterial cells.
  • the carbon sources may be added to the medium at the same time, or the carbon sources added during the culture may be changed.
  • the first half of the culture is cultured with glucose and the second half of the culture with xylose as a carbon source.
  • the first half is cultured with glucose
  • the second half is cultured with maltose
  • the first half is cultured with glucose
  • the second half is cultured with ethanol.
  • the method includes culturing with glucose in the first half, glycerin in the second half, and culturing with glucose in the first half and citric acid in the second half, but is not limited to these combinations, and any combination of carbon sources is the same. Can be implemented.
  • Examples of the nitrogen source used for culture include, but are not limited to, ammonia, ammonium salts, urea, amino acids, yeast extract, peptone, corn steep liquor and the like. These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more as in the case of the carbon source.
  • Examples of nutrients other than the carbon source and nitrogen source include phosphorus sources such as phosphoric acid, minerals such as magnesium, potassium, sodium, copper, iron, zinc, manganese, and molybdenum, and vitamins such as biotin. However, it is not limited to these.
  • the carbon source, nitrogen source, and other nutrients can be supplied by a method such as batch addition, divided addition, or continuous addition.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is preferably in the range of 15 to 26 ° C.
  • the pH of the culture solution is not particularly limited, but is preferably in the range of 3-7.
  • the yeast after culturing is first washed as it is.
  • the said Xanthophyllomyces genus yeast can be crushed by making it into a cell crushed material if desired, and this crushed material can be used for a washing
  • any of yeast cells themselves, those dried by freeze-drying, spray-drying, etc., and those subjected to cell disruption described below are used. That is the subject.
  • disruption of yeast cells contributes to efficient extraction of carotenoids produced and accumulated in Xanthophyllomyces yeasts.
  • the cell disruption treatment is not always necessary, but if the cells are not disrupted, the recovery efficiency of the carotenoid produced and accumulated in the cells is lowered.
  • the disruption of the yeast cell in the present invention is not limited as long as the surface structure such as the cell wall is damaged to the extent that the target carotenoid can be extracted, and the cell wall is not necessarily completely broken or the yeast cell needs to be fragmented. There is no.
  • the form of the yeast of the genus Xanthophyllomyces that is the target of the above-described cell disruption and / or washing step described later is a culture solution containing the yeast, a concentrate of the culture solution, and pressure filtration and vacuum filtration from the culture solution.
  • Xanthophyllomyces yeast collected as a wet cell by a general method such as natural filtration, centrifugation, decantation, etc., a product obtained by washing the wet cell, a wet cell (for example, water) Suspended in physiological saline, buffer solution, etc.), dried cells obtained by drying the wet cells, and solvents (for example, water, saline, buffer, etc.) And any of them may be used.
  • the form of the yeast of the genus Xanthophyllomyces that is subject to cell disruption is preferably an aqueous suspension in which the yeast of the genus Xanthophyllomyces is suspended in an aqueous solvent, from the viewpoint of operability, More preferably, a culture solution containing the yeast of Xanthophyllomyces itself, a concentrate of the culture solution, or a suspension of wet cells of Xanthophyllomyces yeast in a solvent is xanthophyllomycin. It can be used as an aqueous suspension of Seth yeast.
  • Crushing of the above Xanthophyllomyces genus yeast is performed by performing one or several of the following crushing methods in an arbitrary order.
  • Examples of the crushing method include physical treatment, chemical treatment, enzymatic treatment, heat treatment, autolysis, osmotic pressure dissolution, protoplast dissolution, and the like.
  • Examples of the physical treatment include the use of a high-pressure homogenizer, a rotary blade homogenizer, an ultrasonic homogenizer, a French press, a ball mill, or a combination thereof.
  • Examples of the chemical treatment include treatment using an acid such as hydrochloric acid and sulfuric acid (preferably a strong acid), treatment using a base such as sodium hydroxide and potassium hydroxide (preferably a strong base), and combinations thereof. Can be mentioned.
  • an acid such as hydrochloric acid and sulfuric acid (preferably a strong acid)
  • a base such as sodium hydroxide and potassium hydroxide (preferably a strong base)
  • combinations thereof can be mentioned.
  • Examples of the enzymatic treatment include methods using lysozyme, zymolyase, glucanase, novozyme, protease, cellulase, etc., and these may be used in combination as appropriate.
  • Examples of the heat treatment include a treatment at 60 to 140 ° C. for about 30 minutes to 3 hours.
  • Examples of the self-digestion include treatment with a solvent such as ethyl acetate, and treatment such as heating at 30 to 60 ° C. for about 1 to 48 hours.
  • a solvent such as ethyl acetate
  • treatment with a solution different from the intracellular salt concentration can cause osmotic lysis and protoplast lysis of the cells.
  • this method is preferably used in combination with the physical treatment, chemical treatment, enzymatic treatment, heat treatment, self-digestion and the like as described above.
  • physical treatment and chemical treatment particularly acid treatment, preferably strong acid (for example, acid having a pKa of 2.5 or less in an aqueous solution) or heat treatment are preferred, and physical treatment is performed from the viewpoint of crushing efficiency.
  • Chemical treatment is more preferred.
  • the yeast of the genus Xanthophyllomyces containing carotenoids prepared as described above is first washed at least once using a washing solvent having a water content of 3 to 50% by weight.
  • the washing is preferably performed in a state where the carotenoid-containing yeast of the genus Xanthophyllomyces is a wet cell, a dry cell, or an aqueous suspension.
  • the moisture content of the wet cells and the dried cells and the concentration of the cells in the aqueous suspension are not particularly limited.
  • the moisture content is usually in the range of 20 to 75% by weight.
  • the moisture content is usually preferably in the range of 0.01 to 20% by weight.
  • the concentration of cells in terms of dry weight is usually 1 to 25% by weight. Ranges can be used.
  • the water content of the mixed solution of Xanthophyllomyces yeast and washing solvent at the first washing is preferably in the range of 10 to 40% by weight, more preferably in the range of 15 to 35% by weight, A range of 30% by weight is particularly preferred. Therefore, the water content of the washing solvent, the amount of use thereof, etc. may be adjusted as appropriate according to the form of the Xanthophyllomyces yeast to be washed and the amount of moisture so as to obtain such a moisture content. it can.
  • the washing solvent used in the washing step is not particularly limited, but a solvent that does not have a high solubility in the washing conditions for the target carotenoid is preferable.
  • a washing solvent for example, organic solvents such as ketones, alcohols, hydrocarbons, ethers and fatty acid esters can be preferably used in a water-containing state if necessary.
  • Preferred organic solvents are ketones, alcohols and ethers, particularly preferably alcohols.
  • the ketones are not particularly limited, and those having 3 to 6 carbon atoms are preferably used. Specific examples include acetone, methyl ethyl ketone, methyl butyl ketone, methyl isobutyl ketone, and the like. Preferred are acetone and methyl ethyl ketone, and most preferred is acetone.
  • the alcohols are not particularly limited regardless of whether they are cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but saturated alcohols are generally preferably used. Usually, it has 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms. Of these, monohydric alcohols having 1 to 5 carbon atoms, dihydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms, and trihydric alcohols having 3 carbon atoms are preferable.
  • these alcohols include, for example, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, tert-butyl alcohol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3 -Pentanol, 2-methyl-1-butanol, isopentyl alcohol, tert-pentyl alcohol, 3-methyl-2-butanol, neopentyl alcohol, 1-hexanol, 2-methyl-1-pentanol, 4-methyl- 2-pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 1-octanol, 2-octanol, 2-ethyl-1-hexanol, 1-nonanol, 1-decanol, 1 -Undecanol, 1-Dodecano Monohydric alcohols such as sodium, allyl alcohol,
  • the monohydric alcohol is preferably methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, tert-butyl alcohol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pen Tanol, 2-methyl-1-butanol, isopentyl alcohol, tert-pentyl alcohol, 3-methyl-2-butanol, neopentyl alcohol, 1-hexanol, 2-methyl-1-pentanol, 4-methyl-2- Pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 1-octanol, 2-octanol, 2-ethyl-1-hexanol, 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol 1-Dodecanol, Be Benzyl alcohol, cyclohexanol, 1-methylcyclo
  • Particularly preferred are methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, 2-methyl-1-butanol, isopentyl alcohol and the like, and most preferred is ethanol.
  • 1,2-ethanediol, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol and the like are preferable, and 1,2-ethanediol is most preferable.
  • trihydric alcohol glycerin is preferable.
  • the hydrocarbons are not particularly limited, and examples thereof include aliphatic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, and halogenated hydrocarbons. Of these, aliphatic hydrocarbons and aromatic hydrocarbons are preferable, and aliphatic hydrocarbons are more preferable.
  • the aliphatic hydrocarbon is not particularly limited regardless of whether it is cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but saturated hydrocarbons are generally preferably used. Usually, those having 3 to 20 carbon atoms, preferably 5 to 12 carbon atoms, more preferably 5 to 8 carbon atoms are used.
  • the aromatic hydrocarbon is not particularly limited, but usually an aromatic hydrocarbon having 6 to 20 carbon atoms, preferably 6 to 12 carbon atoms, more preferably 7 to 10 carbon atoms is used. Specific examples include, for example, benzene, toluene, xylene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, ethylbenzene, cumene, mesitylene, tetralin, butylbenzene, p-cymene, cyclohexylbenzene, diethylbenzene, pentylbenzene, dipentylbenzene. , Dodecylbenzene, styrene and the like.
  • the halogenated hydrocarbon is not particularly limited regardless of whether it is cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but generally non-cyclic hydrocarbons are preferably used. More preferred are chlorinated hydrocarbons and fluorinated hydrocarbons, and even more preferred are chlorinated hydrocarbons. Further, those having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms are suitably used. Specific examples include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichloroethane, 1,1,1-trichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1,1,2, and the like.
  • dichloromethane chloroform, carbon tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichloroethane, 1,1,1-trichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1-dichloroethylene, 1,2-dichloroethylene Trichloroethylene, chlorobenzene, 1,1,1,2-tetrafluoroethane and the like. More preferred are dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethylene, trichloroethylene, chlorobenzene, 1,1,1,2-tetrafluoroethane and the like.
  • the ethers are not particularly limited regardless of whether they are cyclic or non-cyclic, and whether saturated or unsaturated, but saturated ones are generally preferably used. Usually, those having 3 to 20 carbon atoms, preferably 4 to 12 carbon atoms, more preferably 4 to 8 carbon atoms are used.
  • Specific examples include, for example, diethyl ether, methyl tert-butyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, dihexyl ether, ethyl vinyl ether, butyl vinyl ether, anisole, phenetol, butyl phenyl ether, methoxy toluene, dioxane, furan, 2 -Methyl furan, tetrahydrofuran, tetrahydropyran, ethylene glycol dimethyl ether, ethylene glycol diethyl ether, ethylene glycol dibutyl ether, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether and the like.
  • diethyl ether methyl tert-butyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, dihexyl ether, anisole, phenetol, butyl phenyl ether, methoxytoluene, dioxane, 2-methylfuran, tetrahydrofuran, tetrahydropyran, ethylene glycol dimethyl ether
  • Ethylene glycol diethyl ether ethylene glycol dibutyl ether, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, and the like.
  • the fatty acid esters are not particularly limited, and examples thereof include propionic acid esters, acetic acid esters, formic acid esters and the like. Preferred are acetate esters and formate esters, and more preferred are acetate esters.
  • the ester group is not particularly limited, but is usually an alkyl ester having 1 to 8 carbon atoms, an aralkyl ester having 7 to 12 carbon atoms, preferably an alkyl ester having 1 to 6 carbon atoms, more preferably 1 to 1 carbon atom. 4 alkyl esters are used.
  • propionic acid ester examples include, for example, methyl propionate, ethyl propionate, butyl propionate, isopentyl propionate, and the like. Preferred is ethyl propionate.
  • acetate ester examples include, for example, methyl acetate, ethyl acetate, propyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, isobutyl acetate, sec-butyl acetate, pentyl acetate, isopentyl acetate, sec-hexyl acetate, cyclohexyl acetate, benzyl acetate and the like. Can be mentioned.
  • formate ester examples include, for example, methyl formate, ethyl formate, propyl formate, isopropyl formate, butyl formate, isobutyl formate, sec-butyl formate, pentyl formate, and the like.
  • Preferred are methyl formate, ethyl formate, propyl formate, butyl formate, isobutyl formate, pentyl formate, and the like. Most preferred is ethyl formate.
  • the above organic solvent can be used alone (mixed with water if necessary), or two or more kinds can be used in combination.
  • the washing solvent preferably has a melting point of about ⁇ 250 to 10 ° C., preferably about ⁇ 150 to ⁇ 30 ° C., more preferably about ⁇ 100 to ⁇ 50 ° C. Also preferred are those having a boiling point of, for example, about 30 to 300 ° C., preferably about 40 to 250 ° C., more preferably about 50 to 150 ° C. Alternatively, those that can be mixed with water at a temperature of 25 ° C. without separation at a temperature of 25 ° C. are also preferred.
  • the solvent satisfying the melting point, boiling point and miscibility with water is, for example, 50% by weight or more, preferably 70% by weight or more, more preferably 90% by weight or more, particularly 100% by weight in the total washing solvent. Is recommended.
  • the amount of the washing solvent used is not particularly limited as long as it is an amount that can be separated from the yeast cells of the genus Xanthophyllomyces after washing, but for example, 0. 1 part by weight or more, preferably 1 part by weight or more, more preferably 5 parts by weight or more.
  • the upper limit of the amount of the cleaning solvent used is not particularly limited, but is, for example, 200 parts by weight or less, preferably 50 parts by weight or less, and more preferably 20 parts by weight or less with respect to 1 part by weight of the dry weight of the cells. .
  • ketones or alcohols it is preferable to use ketones or alcohols as the washing solvent, and among these, acetone or ethanol is more preferably used.
  • ethanol is used.
  • the amount used when acetone or ethanol is used as the washing solvent is not particularly limited, but is preferably 0.1 parts by weight or more, more preferably 1 part per 1 part by weight of the dry weight of the bacterial cells. It is at least 5 parts by weight, more preferably at least 5 parts by weight, preferably at most 200 parts by weight, more preferably at most 50 parts by weight, even more preferably at most 20 parts by weight.
  • the water content of the washing solvent used for at least the first washing is not particularly limited as long as it is in the range of 3 to 50% by weight, but is preferably in the range of 5 to 30% by weight. A range of ⁇ 20% by weight is particularly preferred. If the water content in the cleaning solvent is less than 3% by weight, the cleaning efficiency of the carotenoids other than carotenoids derived from Xanthophyllomyces yeasts is high, but the solubility of the target substance carotenoids in the cleaning solvent increases. There is a problem that the recovery rate of carotenoids deteriorates. On the other hand, when the water content in the cleaning solvent exceeds 50% by weight, the carotenoid recovery rate is good, but the removal rate of contaminants other than carotenoids is remarkably reduced, which is not preferable from the viewpoint of the cleaning process.
  • the “cleaning with a cleaning solvent having a water content of 3 to 50% by weight” may be performed once or twice or more.
  • “washing with a washing solvent having a water content of less than 3% by weight” described later is further implemented, “washing with a washing solvent having a moisture content of 3 to 50% by weight” can provide a sufficient washing effect even once. I can do it.
  • impurities other than carotenoids derived from Xanthophyllomyces yeasts can be removed by performing the above “washing with a washing solvent having a water content of 3 to 50% by weight” at least once.
  • a washing solvent having a water content of 3 to 50% by weight at least once, at least 1 using a washing solvent having a water content of less than 3% by weight. Washing twice is preferable.
  • the “washing solvent having a water content of less than 3% by weight” is not particularly limited as long as the water content is less than 3%, but the water content is preferably 1.5% by weight or less.
  • washing with a cleaning solvent having a water content of 3 to 50% by weight and “washing with a cleaning solvent having a water content of less than 3% by weight” may use different types of organic solvents, but the water content is high. It is preferred to use the same organic solvent except that they are different.
  • washing with ethanol having a water content of 3 to 50% by weight is carried out at least once. Is particularly preferred.
  • the washing with a washing solvent having a water content of 3 to 50% by weight and the washing with a washing solvent having a water content of less than 3% by weight are carried out once.
  • the temperature condition in the washing step is not particularly limited, but the condition where the temperature of the mixed solution of the washing solvent and Xanthophyllomyces yeast is 30 ° C. or lower is preferable, and the condition of 20 ° C. or lower is more preferable. Preferably, 10 ° C. or less is more preferable.
  • the lower limit of the washing temperature can be appropriately set, and is, for example, about ⁇ 50 ° C., preferably about ⁇ 20 ° C., more preferably about 0 ° C.
  • the washing pressure can be appropriately set within the range in which the washing solvent becomes a liquid, and is, for example, about 0.5 to 2 atm, preferably about 0.8 to 1.2 atm, and more preferably atmospheric pressure ( About 1 atm).
  • the washing method when washing the yeast belonging to the genus Xanthophyllomyces containing a carotenoid using a washing solvent is carried out by bringing the yeast cells into contact with the washing solvent and then containing the impurities.
  • the yeast cells can be separated from the yeast, there is no particular limitation.
  • the yeast of the genus Xanthophyllomyces on the filter plate at the time of mixing with a stirring blade, a static mixer, a flow column, a pump, or the filtration operation of the cells A washing solvent may be added to and filtered and washed, but from the viewpoint of washing efficiency, the washing solvent and a carotenoid-containing Xanthophyllomyces genus yeast are contacted and mixed for a certain period of time using a stirring blade, and then the It is preferable to perform the washing operation by separating Xanthophyllomyces yeast and the washing solvent.
  • the washing time (that is, the contact time between the washing solvent and the carotenoid-containing yeast of the genus Xanthophyllomyces) is not particularly limited, but is preferably within 24 hours, more preferably within the range of 1 minute to 6 hours. More preferably, it is in the range of 10 minutes to 3 hours.
  • the loss of carotenoid during the cleaning can be suppressed to some extent by appropriately adjusting the cleaning time.
  • there is no particular limitation on the type of separation operation between the Xanthophyllomyces yeast and the washing solvent after washing and general methods such as pressure filtration, vacuum filtration, natural filtration, centrifugation, decantation, etc. Needless to say, these operations can be performed in combination. When performing filtration operation, you may use a filter aid for efficiency of operation.
  • Xanthophyllomyces containing a large amount of lipid in the microbial cells is preliminarily washed with a washing solvent before the extraction operation as described above.
  • Most of the contaminants derived from bacterial cells including lipids are removed from the genus yeast, the content of the target carotenoid composition that can be finally produced is increased, the viscosity is reduced when an oily composition is used, and the powder composition.
  • the stickiness caused by residual lipid is suppressed in the production process, and problems such as adhesion in the device are greatly improved.
  • Productivity can be improved.
  • the heat treatment step in the production method of the present invention will be described.
  • the manufacturing method of this invention after implementing the said washing
  • the Xanthophyllomyces yeast after washing is heat-treated in contact with the heat-treatment solvent, improving the extraction efficiency in the subsequent extraction process and used in the next extraction process The amount of solvent to be reduced can be greatly reduced.
  • a part of carotenoid may be extracted from Xanthophyllomyces yeast.
  • the heat treatment solvent used in the heat treatment step is not particularly limited as long as it acts so that carotenoids can be easily extracted from the yeast of the genus Xanthophyllomyces.
  • alcohols and hydrocarbons And ethers can be preferably applied, alcohols and ethers can be more preferably applied, and alcohols can be most preferably applied.
  • the alcohols are not particularly limited regardless of whether they are cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but saturated alcohols are generally preferably used. Usually, it has 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 12 carbon atoms, more preferably 1 to 6 carbon atoms. Of these, monohydric alcohols having 1 to 5 carbon atoms, dihydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms, and trihydric alcohols having 3 carbon atoms are preferable.
  • these alcohols include, for example, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, tert-butyl alcohol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3 -Pentanol, 2-methyl-1-butanol, isopentyl alcohol, tert-pentyl alcohol, 3-methyl-2-butanol, neopentyl alcohol, 1-hexanol, 2-methyl-1-pentanol, 4-methyl- 2-pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 1-octanol, 2-octanol, 2-ethyl-1-hexanol, 1-nonanol, 1-decanol, 1 -Undecanol, 1-Dodecano Monohydric alcohols such as sodium, allyl alcohol,
  • the monohydric alcohol is preferably methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, tert-butyl alcohol, 1-pentanol, 2-pentanol, 3-pen Tanol, 2-methyl-1-butanol, isopentyl alcohol, tert-pentyl alcohol, 3-methyl-2-butanol, neopentyl alcohol, 1-hexanol, 2-methyl-1-pentanol, 4-methyl-2- Pentanol, 2-ethyl-1-butanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 1-octanol, 2-octanol, 2-ethyl-1-hexanol, 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol 1-Dodecanol, Be Benzyl alcohol, cyclohexanol, 1-methylcyclo
  • Particularly preferred are methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutyl alcohol, 2-methyl-1-butanol, isopentyl alcohol and the like, and most preferred is ethanol.
  • 1,2-ethanediol, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol and the like are preferable, and 1,2-ethanediol is most preferable.
  • trihydric alcohol glycerin is preferable.
  • the hydrocarbons are not particularly limited, and examples thereof include aliphatic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, and halogenated hydrocarbons. Of these, aliphatic hydrocarbons and aromatic hydrocarbons are preferable, and aliphatic hydrocarbons are more preferable.
  • the aliphatic hydrocarbon is not particularly limited regardless of whether it is cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but saturated hydrocarbons are generally preferably used. Usually, those having 3 to 20 carbon atoms, preferably 5 to 12 carbon atoms, more preferably 5 to 8 carbon atoms are used.
  • the aromatic hydrocarbon is not particularly limited, but usually an aromatic hydrocarbon having 6 to 20 carbon atoms, preferably 6 to 12 carbon atoms, more preferably 7 to 10 carbon atoms is used. Specific examples include, for example, benzene, toluene, xylene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, ethylbenzene, cumene, mesitylene, tetralin, butylbenzene, p-cymene, cyclohexylbenzene, diethylbenzene, pentylbenzene, dipentylbenzene. , Dodecylbenzene, styrene and the like.
  • the halogenated hydrocarbon is not particularly limited regardless of whether it is cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but generally non-cyclic hydrocarbons are preferably used. More preferred are chlorinated hydrocarbons and fluorinated hydrocarbons, and even more preferred are chlorinated hydrocarbons. Further, those having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, more preferably 1 to 2 carbon atoms are suitably used. Specific examples include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichloroethane, 1,1,1-trichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1,1,2, and the like.
  • dichloromethane chloroform, carbon tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichloroethane, 1,1,1-trichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1-dichloroethylene, 1,2-dichloroethylene Trichloroethylene, chlorobenzene, 1,1,1,2-tetrafluoroethane and the like. More preferred are dichloromethane, chloroform, 1,2-dichloroethylene, trichloroethylene, chlorobenzene, 1,1,1,2-tetrafluoroethane and the like.
  • the ethers are not particularly limited regardless of whether they are cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but saturated ones are generally preferably used. Usually, those having 3 to 20 carbon atoms, preferably 4 to 12 carbon atoms, more preferably 4 to 8 carbon atoms are used.
  • Specific examples include, for example, diethyl ether, methyl tert-butyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, dihexyl ether, ethyl vinyl ether, butyl vinyl ether, anisole, phenetole, butyl phenyl ether, methoxy toluene, dioxane, furan, 2 -Methyl furan, tetrahydrofuran, tetrahydropyran, ethylene glycol dimethyl ether, ethylene glycol diethyl ether, ethylene glycol dibutyl ether, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, ethylene glycol monobutyl ether and the like.
  • diethyl ether methyl tert-butyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, dihexyl ether, anisole, phenetol, butyl phenyl ether, methoxytoluene, dioxane, 2-methylfuran, tetrahydrofuran, tetrahydropyran, ethylene glycol dimethyl ether
  • Ethylene glycol diethyl ether ethylene glycol dibutyl ether, ethylene glycol monomethyl ether, ethylene glycol monoethyl ether, and the like.
  • the heat treatment solvent in the present invention can be used alone or in combination of two or more.
  • the heat treatment solvent preferably has a melting point of, for example, about ⁇ 250 to 10 ° C., preferably about ⁇ 150 to ⁇ 30 ° C., more preferably about ⁇ 100 to ⁇ 50 ° C. Also preferred are those having a boiling point of, for example, about 30 to 300 ° C., preferably about 40 to 250 ° C., more preferably about 50 to 150 ° C. It is recommended that the solvent satisfying these melting points and boiling points be, for example, 50% by weight or more, preferably 70% by weight or more, more preferably 90% by weight or more, and particularly 100% by weight in the total heat treatment solvent.
  • the amount of the heat treatment solvent used in the heat treatment step is not particularly limited as long as the yeast of the genus Xanthophyllomyces is sufficiently heated, and the fluidity of the mixed solution during the heat treatment can be ensured.
  • about 1 to 100 parts by weight, more preferably about 5 to 50 parts by weight of the heat treatment solvent can be used.
  • the temperature in the heat treatment step is not particularly limited as long as it is 65 ° C. or higher from the viewpoint of the carotenoid recovery rate in the subsequent extraction step, but the upper limit of the heat treatment temperature is the boiling point of the solvent, the operating pressure, and the thermal stability of the carotenoid.
  • the heat treatment solvent may have a boiling point or lower (about 78 ° C. in the case of ethanol).
  • the temperature of the heat treatment step is preferably in the range of 70 to 80 ° C., more preferably in the range of 70 to 76 ° C.
  • the heating time in the heat treatment step is not particularly limited, but from the viewpoint of improving the extraction rate in the subsequent extraction step, the time during which the mixed liquid of Xanthophyllomyces yeast and the heat treatment solvent is 65 ° C. or higher, preferably 10 seconds or longer More preferably, it is carried out so that it takes 1 minute or more, and more preferably 15 minutes or more.
  • the upper limit of the heating time is not particularly limited, but is preferably 10 hours or shorter, more preferably 120 minutes or shorter, and particularly preferably 60 minutes or shorter from the viewpoint of production efficiency and carotenoid decomposition suppression.
  • the pressure of the heat treatment step can be appropriately set within the range in which the liquid state of the heat treatment solvent can be maintained, and is, for example, about 0.8 to 5 atmospheres, preferably about 1 to 1.5 atmospheres, and more preferably atmospheric pressure. (About 1 atmosphere).
  • the heat treatment method is not particularly limited.
  • a heat-treated solvent heated to a predetermined temperature may be added to the yeast of the genus Xanthophyllomyces after the washing step, or the mixed solution may be heated to a predetermined temperature after adding the room-temperature heat-treated solvent.
  • the mixed solution of the heat treatment solvent and the yeast of the genus Xanthophyllomyces may be in a stationary state or in a stirred state, but is preferably in a properly stirred state.
  • the stirring method is not particularly limited, and a mixing method and / or apparatus used in the extraction step described later can be used as it is.
  • the heat treatment solvent may or may not be separated from the bacterial cells.
  • carotenoids can be recovered from the heat-treated solvent after separation.
  • the heat treatment solvent can also serve as an extraction solvent described later.
  • the extraction step refers to a step of performing extraction by bringing the yeast after the heat treatment into contact with an extraction solvent.
  • the extraction solvent any of the heat treatment solvent remaining in the heat treatment step without being separated from the cells and the newly used solvent can be used, or both of them may be used. That is, in the extraction process, (I) adding an extraction solvent as necessary to the yeast of the genus Xanthophyllomyces after the heat treatment (which may contain a heat treatment solvent), (Ii) Add Xanthophyllomyces yeast after heat treatment (which may contain a heat treatment solvent) to the extraction solvent to be used, or (iii) Xanthophilomyces sp.
  • the yeast and heat treatment solvent mixed Carotenoids in the yeast are extracted at a temperature of 10 to 70 ° C.
  • a part or all of the heat treatment solvent may be removed and then the extraction step may be carried out, but the heat treatment solvent after heat treatment and the yeast of Xanthophyllomyces sp. It is preferable that the liquid is subsequently subjected to the present extraction step as it is.
  • the extraction solvent is further added to the Xanthophyllomyces yeast in which the heat-treated solvent remains, and this is subjected to the main extraction step.
  • the extraction solvent used in the extraction step is not particularly limited as long as the target carotenoid can be efficiently extracted.
  • alcohols, hydrocarbons and ethers can be preferably applied.
  • ethers can be more preferably applied, and alcohols can be most preferably applied.
  • Specific examples and preferred examples of these alcohols, hydrocarbons and ethers are the same as those for the heat treatment solvent.
  • the washing solvent, the heat treatment solvent, and the extraction solvent may be the same or different from each other. From the viewpoint of recovery and reuse of the used solvent, the washing solvent, the heat treatment solvent, and the extraction solvent are used. It is preferable to use the same organic solvent as the solvent. Further, from the viewpoint that the residual solvent does not become a problem, it is preferable that all of the washing solvent, the heat treatment solvent and the extraction solvent are selected from alcohols, and most preferably ethanol is used.
  • the amount of the extraction solvent used is not particularly limited, but when the amount of the extraction solvent used is significantly larger than the dry weight of the cells, the carotenoid concentration in the resulting extract becomes extremely dilute. Therefore, an efficient purification process becomes difficult.
  • the amount of extraction solvent used is extremely small relative to the dry weight of the cells, a high-concentration carotenoid extract can be obtained, but the carotenoids in the cells are efficiently used from the viewpoint of the saturated solubility of the extraction solvent in the carotenoids. It is extremely difficult to extract well.
  • the preferable amount of the extraction solvent newly used after the heat treatment step in the production method of the present invention is 1 part by weight or more, more preferably 5 parts by weight with respect to 1 part by weight of the dry weight of the cells. Part or more, and most preferably 10 parts by weight or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 1000 parts by weight or less, more preferably 500 parts by weight or less, and most preferably 300 parts by weight or less. Alternatively, it may be 200 parts by weight or less, particularly 100 parts by weight or less.
  • the total amount of the solvent used in this extraction step is the dry weight of the microbial cell 1 weight 1 part by weight or more, preferably 2 parts by weight or more, more preferably 5 parts by weight or more, still more preferably 10 parts by weight or more, more preferably 15 parts by weight or more. Preferably it is 20 weight part or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is 1100 parts by weight or less, preferably 600 parts by weight or less, more preferably 400 parts by weight or less, still more preferably 300 parts by weight or less, and most preferably 200 parts by weight. Less than parts by weight.
  • the ratio of the amount of the heat treatment solvent (residual amount) used in the main extraction step after the heat treatment step and the amount of the extraction solvent newly used after the heat treatment step (weight basis) is not particularly limited, but the operation time cycle, solvent use From the viewpoint of the amount, the amount of the extraction solvent used relative to the remaining amount of the heat treatment solvent is preferably in the range of 0.1 times to 20 times, more preferably in the range of 0.3 times to 10 times, 0.8 A range of double to 5 times is particularly preferable. If the temperature of the extraction solvent to be newly used is about room temperature (for example, 0 to 40 ° C.), the temperature of the solvent after the heat treatment can be lowered without a special cooling means as the amount of the extraction solvent added increases. preferable.
  • the temperature during extraction in the extraction step is not particularly limited as long as it is in the range of 10 to 70 ° C., but is preferably 20 ° C. or higher, more preferably 25 ° C. or higher from the viewpoint of extraction efficiency.
  • the extraction efficiency improves as the temperature during extraction increases, but when the extraction temperature exceeds 70 ° C., there is a problem that the structure of the carotenoid is altered, for example, a part of astaxanthin in the carotenoid becomes cis form.
  • the extraction step is preferably performed at a temperature lower than that of the previous heat treatment step, for example, 60 ° C. or less, more preferably 50 ° C. or less, particularly 45 ° C. or less. preferable.
  • the extraction step may be performed after cooling the heat-treated Xanthophyllomyces yeast to a desired temperature, or after the heat treatment.
  • the extraction temperature in the extraction step can also be set to a predetermined temperature by adding an extraction solvent whose temperature is appropriately adjusted to Santophilomyces yeast. In the present invention, even if the extraction step is carried out in a state that is relatively close to room temperature, it can be said that this is a useful method because astaxanthin can be efficiently extracted by carrying out the heat treatment step.
  • the pressure in the extraction step may be the same as that in the heat treatment step, and is, for example, about 0.8 to 5 atm, preferably about 1 to 1.5 atm, and more preferably atmospheric (about 1 atm). It is.
  • the mixing method of the extraction solvent and the yeast of the genus Xanthophyllomyces when performing the extraction operation using the extraction solvent is not particularly limited, for example, a stirring blade, a stationary mixer, a distribution
  • a crushing / emulsifying device such as a high-pressure column, a pump, a high-pressure homogenizer, a rotary blade homogenizer, or an ultrasonic homogenizer can also be used. Needless to say, these devices can be combined for extraction.
  • the extraction means either batch extraction or continuous extraction can be employed, and these operations can be repeated a plurality of times.
  • countercurrent multistage extraction is particularly preferable among continuous extractions.
  • the stirring time for batch extraction is not particularly limited, but is usually 5 minutes or longer, and the average residence time for continuous extraction is not particularly limited, but is usually 10 minutes or longer.
  • the number of batch extractions is not particularly limited, and extraction can be performed efficiently even with one extraction, but it is preferable from the viewpoint of yield to repeat the extraction twice or more.
  • the heat treatment process and the extraction process may be repeated at least twice each time, such as performing a heat treatment process before each batch extraction. The rate can be improved.
  • the yeast of the genus Xanthophyllomyces and the extraction solvent are separated.
  • the type of separation operation there is no particular limitation on the type of separation operation, and it can be performed by a general method such as pressure filtration, vacuum filtration, natural filtration, centrifugation, decantation, etc. Needless to say, these operations are performed in combination. You can also.
  • carotenoids such as astaxanthin contained in yeast of the genus Xanthophyllomyces can be extracted with high efficiency, and the extraction rate is usually 70% or more, more preferably 80%. More preferably, it is 85% or more.
  • the carotenoid composition can be obtained by processing the carotenoid extract obtained as described above as it is or appropriately.
  • the properties of the carotenoid composition obtained by the production method of the present invention are not particularly limited, but are preferably an oily composition or a powder composition obtained by performing the treatment described below.
  • the oily composition can be produced by concentrating a carotenoid extract with an extraction solvent. There is no particular limitation on the method of concentration operation in this case, and operations such as reduced pressure concentration, flash concentration, and thin film concentration in the tank can be applied.
  • the concentration operation is preferably carried out until the washing solvent or extraction solvent in the oily composition is sufficiently removed.
  • the residual concentration of the washing solvent and the extraction solvent in the oily composition is not particularly limited as long as it does not harm the human body as a food, cosmetic, or pharmaceutical product, but the residual amount in the oily composition is 1% by weight or less. Preferably, it is 0.1% by weight or less, more preferably 0.01% by weight or less.
  • the temperature conditions in the concentration operation are not particularly limited as long as the carotenoid decomposition and cis-formation are not significantly changed during the concentration, and are preferably in the range of 10 to 80 ° C., more preferably It is in the range of 20 to 70 ° C, more preferably in the range of 25 to 60 ° C.
  • the operation may be performed under reduced pressure as necessary.
  • the concentrate obtained by the above concentration when the concentrate obtained by the above concentration is oily, it can be used as it is as an oily composition, but when the concentrate is obtained as a dry solid or as an oily product, Even when it is obtained, from the viewpoint of ease of handling as other products, a desired oil composition may be prepared by adding and mixing liquid fats and oils to the concentrate.
  • the “oil composition” in the present invention includes not only a case where carotenoids and other components are uniformly mixed in an oily state, but also a form in which carotenoids are partially precipitated to form a slurry. .
  • the liquid fat that can be added is not particularly limited as long as it can dissolve or disperse a carotenoid concentrate such as astaxanthin, and may be, for example, a natural fat from animals or plants. Or processed oils and fats. More preferably, it is acceptable for food, cosmetics or medicine.
  • vegetable oils and fats for example, palm oil, palm oil, palm kernel oil, linseed oil, camellia oil, brown rice germ oil, rapeseed oil, rice oil, peanut oil, corn oil, wheat germ oil, soybean oil, sesame oil, Examples include cottonseed oil, sunflower seed oil, kapok oil, evening primrose oil, shea fat, monkey fat, cacao fat, sesame oil, safflower oil, olive oil, etc.
  • animal fats examples include pork fat, milk fat, fish oil, beef tallow
  • fats and oils for example, hardened oil
  • medium chain fatty acid triglycerides MCT
  • medium-chain fatty acid triglycerides examples include triglycerides in which the fatty acid has 6 to 12 carbon atoms, preferably 8 to 12 carbon atoms.
  • oils and fats vegetable oils, synthetic oils and processed oils and fats are preferable from the viewpoint of ease of handling, odor, etc., and more preferable specific examples thereof include coconut oil, palm oil, palm kernel oil, rapeseed oil, rice oil, large oil Examples include bean oil, cottonseed oil, safflower oil, olive oil, MCT and the like.
  • the liquid oil may be prepared by adding and mixing a carotenoid extract concentrate after preparation, or preparing an oil composition of the desired carotenoid in advance or before or during the extraction operation or concentration operation. It may be added and the subsequent processing may be performed.
  • the carotenoid content in the oily composition containing carotenoid in the present invention is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended use of the target product.
  • the upper limit of the astaxanthin content in the oily composition is, for example, 30% by weight or less, preferably 20% by weight or less, more preferably 15% by weight or less. It is.
  • the lower limit of the astaxanthin content in the oily composition is not particularly limited, and is, for example, 0.1% by weight or more, preferably 1% by weight or more, more preferably 3% by weight or more.
  • carotenoids are precipitated by subjecting the carotenoid extract obtained in the extraction step to treatment such as concentration, cooling and / or addition of a poor solvent, and the resulting precipitates are solidified.
  • treatment such as concentration, cooling and / or addition of a poor solvent
  • a powder composition containing astaxanthin at a high concentration can be produced as a carotenoid composition.
  • the method for precipitating carotenoid is not particularly limited.
  • a method of evaporating crystallization while concentrating the extract, or adding a poor solvent for carotenoid to the extract as it is or appropriately concentrating examples thereof include a method of precipitating carotenoid, a method of cooling and crystallizing an extract as it is or appropriately concentrated under conditions exceeding the saturated solubility of carotenoid.
  • the present invention can be produced by combining these operations. From the viewpoint of yield and operability, the extract is concentrated, and a carotenoid crystal is precipitated to some extent. It is desirable to precipitate carotenoids by cooling.
  • the concentration ratio of the extract is 10 to 1000. It is preferable to concentrate to a range of double, more preferably to a range of 50 to 500 times.
  • the organic solvent used for extraction and the precipitate are subjected to solid-liquid separation.
  • solid-liquid separation operations can be applied to the solid-liquid separation, and examples include decantation, centrifugation, pressure filtration, vacuum filtration, natural filtration, and cake washing as necessary.
  • the carotenoid composition can be obtained as a dry powder by performing a drying treatment such as vacuum drying to remove the remaining organic solvent and the like.
  • a powder composition containing carotenoids (eg astaxanthin) derived from Xanthophyllomyces sp By the method, for example, a powder composition containing a high concentration of carotenoid (eg astaxanthin) in the range of 20 to 80% by weight in the powder composition can be produced.
  • the carotenoid can be recovered from a yeast of the genus Xanthophyllomyces with a high yield. Furthermore, it is possible to remarkably suppress the mixing of the solvent used in washing, extraction, heat treatment and the like.
  • the present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • cleaning, heat processing, and extraction used the thing of purity 99% or more (moisture content of less than 1%) unless the moisture content was described in particular.
  • the culture solution is transferred to a 5000 mL jar fermenter containing 2500 mL medium (containing 1.3% ammonium phosphate, 0.7% potassium phosphate, 0.3% yeast extract, 1% glucose) at 20 ° C.
  • Culture was performed to obtain a culture solution containing cells containing astaxanthin and HDCO.
  • the pH was controlled between 4.4 and 5.6, and glucose was fed so that the dissolved oxygen concentration was 30 to 80% of saturation.
  • 400 g of sulfuric acid was added to 3000 mL and stirred at 70 ° C. for 1 hour. Thereafter, 1300 g of 30% sodium hydroxide was added to neutralize the culture broth, followed by filtration under reduced pressure to prepare wet cells (water content 60% by weight, cell content 20% by weight (dry weight)).
  • Example 1 100 mL of water-containing ethanol (water content 12 wt%) cooled to 10 ° C. was added to 36.7 g of wet cells (containing 0.15 g of astaxanthin) obtained in Production Example 1, and the mixture was stirred at that temperature for 30 minutes. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-1 and filtrate-1. The concentration of astaxanthin in filtrate-1 was measured by high performance liquid chromatography and found to be 0.005% by weight. 100 mL of ethanol cooled to 10 ° C. was added to the obtained cake-1 and stirred at that temperature for 30 minutes. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-2 and filtrate-2.
  • the concentration of astaxanthin in filtrate-2 was measured by high performance liquid chromatography and found to be 0.006% by weight.
  • Ethanol 375 mL was added to the obtained cake-2, and the mixture was stirred at 75 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 375 mL of ethanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-3 and filtrate-3.
  • the amount of astaxanthin in filtrate-3 was 0.13 g.
  • This solution was concentrated under reduced pressure to 1/50, 1.5 g of medium chain fatty acid triglyceride (MCT) was added, and the concentration was further continued.
  • the astaxanthin content in 2.3 g of the obtained oil was 5.6% by weight. Further, the residual ethanol content in the obtained oily substance was measured by gas chromatography and found to be 0.1% by weight or less.
  • Example 2 100 mL of water-containing ethanol (water content 6 wt%) cooled to 10 ° C. was added to 36.7 g of wet cells (containing 0.15 g of astaxanthin) obtained in Production Example 1, and the mixture was stirred at that temperature for 30 minutes. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-1 and filtrate-1. The concentration of astaxanthin in filtrate-1 was measured by high performance liquid chromatography and found to be 0.007% by weight. 100 mL of ethanol cooled to 10 ° C. was added to the obtained cake-1 and stirred at that temperature for 30 minutes. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-2 and filtrate-2.
  • the concentration of astaxanthin in filtrate-2 was measured by high performance liquid chromatography and found to be 0.006% by weight.
  • Ethanol 375 mL was added to the obtained cake-2, and the mixture was stirred at 75 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 375 mL of ethanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-3 and filtrate-3.
  • the amount of astaxanthin in filtrate-3 was 0.13 g.
  • This solution was concentrated under reduced pressure to 1/50, 2.4 g of safflower oil was added, and the concentration was further continued.
  • the astaxanthin content in 3.3 g of the obtained oily substance was 3.9% by weight. Further, the residual ethanol content in the obtained oily substance was measured by gas chromatography and found to be 0.1% by weight or less.
  • Example 3 100 mL of water-containing ethanol (water content 12 wt%) cooled to 10 ° C. was added to 36.7 g of wet cells (containing 0.15 g of astaxanthin) obtained in Production Example 1, and the mixture was stirred at that temperature for 30 minutes. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-1 and filtrate-1. The concentration of astaxanthin in filtrate-1 was measured by high performance liquid chromatography and found to be 0.005% by weight. Ethanol (375 mL) was added to the obtained cake-1 and stirred at 75 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 375 mL of ethanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour.
  • Example 4 To cake-2 obtained in Example 1, 250 mL of ethanol was added and stirred at 70 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 750 mL of ethanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-3 and filtrate-3. To the obtained cake-3, 250 mL of ethanol was added, and the mixture was again stirred at 70 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 750 mL of ethanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-4 and filtrate-4. The amount of astaxanthin in the combined liquid of filtrate-3 and filtrate-4 was 0.14 g.
  • the solution was concentrated under reduced pressure to 1/100, 1.6 g of MCT was added, and the concentration was further continued.
  • the astaxanthin content in 2.7 g of the obtained oily substance was 5.2% by weight. Further, the residual ethanol content in the obtained oily substance was measured by gas chromatography and found to be 0.1% by weight or less.
  • Example 5 Ethanol (375 mL) was added to cake-2 obtained in Example 1, and the mixture was stirred at 75 ° C. for 3 hours. Thereafter, 375 mL of ethanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-3 and filtrate-3. The amount of astaxanthin in filtrate-3 was 0.13 g. The solution was concentrated under reduced pressure to 1/50, 2.6 g of safflower oil was added, and the concentration was further continued. The astaxanthin content in 3.5 g of the obtained oily product was 3.7% by weight. Further, the residual ethanol content in the obtained oily substance was measured by gas chromatography and found to be 0.1% by weight or less.
  • Example 6 Ethanol (375 mL) was added to cake-2 obtained in Example 1, and the mixture was stirred at 65 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 375 mL of ethanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-3 and filtrate-3. The amount of astaxanthin in the filtrate-3 was 0.12 g. This solution was concentrated under reduced pressure to 1/50, 2.5 g of safflower oil was added, and the concentration was further continued. The astaxanthin content in 3.2 g of the obtained oil was 3.8% by weight. Further, when the residual ethanol content in the obtained oily substance was measured by gas chromatography, it was 0.1% by weight or less.
  • Example 7 100 mL of water-containing methanol (water content 12 wt%) cooled to 10 ° C. was added to 36.7 g of wet cells (containing 0.15 g of astaxanthin) obtained in Production Example 1, and the mixture was stirred at that temperature for 30 minutes. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-1 and filtrate-1. The concentration of astaxanthin in filtrate-1 was measured by high performance liquid chromatography and found to be 0.002% by weight. 100 mL of methanol cooled to 10 ° C. was added to the obtained cake-1 and stirred at that temperature for 30 minutes. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-2 and filtrate-2.
  • the concentration of astaxanthin in filtrate-2 was measured by high performance liquid chromatography and found to be 0.003% by weight.
  • To the obtained cake-2 375 mL of 2-propanol was added, and the mixture was stirred at 75 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 375 mL of 2-propanol was further added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour. It was filtered under reduced pressure to obtain cake-3 and filtrate-3.
  • the amount of astaxanthin in filtrate-3 was 0.13 g.
  • This solution was concentrated under reduced pressure to 1/50, 2.4 g of safflower oil was added, and the concentration was further continued.
  • the astaxanthin content in 3.3 g of the obtained oily substance was 3.9% by weight. Further, the residual methanol and 2-propanol contents in the obtained oily substance were measured by gas chromatography and found to be not more than 0.1% by weight, respectively.
  • Example 8 Filtrate-3 obtained in Example 1 was concentrated under reduced pressure to 1/100, and then the concentrated solution was filtered under reduced pressure to separate into solid and liquid. Further, the obtained solid content was dried under reduced pressure at room temperature to obtain a black purple color. Of powder was obtained. The astaxanthin content in 0.20 g of the obtained powder was 50.8% by weight.
  • Table 1 shows the charging conditions in Examples 1 to 8 and Comparative Examples 1, 2, 4, and 5, and the results of the astaxanthin content in the obtained carotenoid oil.

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Abstract

　本発明の解決課題は、キサントフィロマイセス属酵母の培養物から、特殊な抽出設備、煩雑な精製工程を要することなく、また必ずしも人体に有害な有機溶媒を使用することなく、アスタキサンチンなどを高含量に含んだ天然物由来のカロテノイド組成物を効率的に工業生産できる製造法を提供することにある。　本発明に係るカロテノイド組成物の製造方法は、（１）カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒を用いて少なくとも１回洗浄する洗浄工程、（２）上記洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母を、熱処理溶媒中にて６５℃以上の高温条件で熱処理を施す熱処理工程、（３）上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母を抽出溶媒と接触させ、１０～７０℃の温度で酵母中のカロテノイドを抽出する抽出工程、という３つの工程を含有する点に特徴を有する。

Description

カロテノイド組成物の製造方法
　本発明はカロテノイド組成物の製造方法に関する。さらに詳しくは、キサントフィロマイセス属酵母から、アスタキサンチンなどのカロテノイドを抽出することを特徴とする、カロテノイド組成物の製造方法に関する。
　カロテノイドは、自然界に広く分布する、黄色、橙色から赤色、または紫色を呈する天然色素として知られており、中でもその一種であるアスタキサンチンは、魚類、鶏卵の色揚げ剤として飼料用途に広く使われている。またアスタキサンチンは食品添加物としても認められており、油脂加工食品、蛋白質性食品、水性液状食品、健康食品などに幅広く使用されている。さらに近年、アスタキサンチンは、そのフリーラジカルによって誘起される脂質の過酸化に対する抗酸化活性、α－トコフェロールの数百倍に達する一重項酸素消去作用などの強力な抗酸化作用を利用し、体内の過剰な活性酸素を抑え、シミやしわの改善、白内障、動脈硬化や心臓病等の予防、免疫力強化やがんの予防等、化粧品類や機能性食品、医薬品としての用途が期待されている。
　アスタキサンチンは、サケ、マス、マダイ等の魚類、カニ、エビ、オキアミ等の甲殻類など広く自然界に分布すると共に、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属等に属する細菌類、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）等の藻類、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（別名：ファフィア・ロードジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ））等の酵母類といった微生物によっても生産される。アスタキサンチンやゼアキサンチン等のカロテノイドは、供給の安定性やコストの問題から現在では化学合成品が広く用いられている。しかしながら化学合成品には製法由来の不純物、とくに合成反応に用いられる人体に有害な劇薬類の混入の不安があり、安全性の面から天然由来の原料からなる製品の供給が望まれている。
　このような背景から特に、工業規模での大量生産に適していると考えられる天然物の藻類や微生物を利用した、アスタキサンチン等のカロテノイドの製造方法が数多く報告されている。例えば、ヘマトコッカス藻類の場合、培養した藻類のシスト細胞を熱アセトン処理し、夾雑物であるクロロフィルを溶出させた後、エタノールでアスタキサンチンを抽出する方法が報告されている（特許文献１）。しかしながら、同法で得られるカロテノイド組成物には多くの生体由来の夾雑物が含まれるため、産業上、十分なアスタキサンチン含量を含んだカロテノイド組成物を製造することは難しいことに加えて、製造に使用するアセトンを例えば食品添加物使用の規定値以下のレベルまで除去することは困難であるという問題がある。
　また、細胞壁を破壊したヘマットコッカス藻類を、水、グリセリン等の補助溶剤と混練して形成した成形体を抽出槽内に充填し、超臨界流体を供給してアスタキサンチンを抽出し、人体に有害な有機溶媒を使用することなく０．５～６０％含量のアスタキサンチンを得る方法が報告されている（特許文献２）。しかしながら、同法では大量生産の際に特殊な設備が必要となるほか、十分な収率を達成するため長時間の抽出操作を要する上、高含量アスタキサンチンの取得には別途濃縮操作が必要になるなど、高含量のカロテノイド組成物を工業生産するには簡便性、経済性を満足できるものではない。
　キサントフィロマイセス属（ファフィア属）酵母を用いる方法として、該酵母の菌体をｎ－ヘキサン－エタノールの混合溶媒中、圧縮粉砕機で粉砕しつつ抽出し、抽出物を濃縮して得られた油状物質を－５０℃の冷却状態で懸濁、濾過することにより遊離脂肪酸とトリグリセリドを除き、さらに色素油中の残存遊離脂肪酸を金属セッケン化して除くことでアスタキサンチンを高濃度化する方法が開示されている（特許文献３）。また、キサントフィロマイセス属（ファフィア属）酵母の破砕菌体を有機溶媒で抽出し、抽出液を濃縮して得られた油状の粗抽出エキスを、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等の精製手段でアスタキサンチンまたはそのエステルを得る方法が開示されている（特許文献４）。しかしこれらの方法はいずれも工程が複雑であり、特に後者では低濃度のアスタキサンチンの粗液を複数のカラムクロマトグラフィーにて精製を行うという煩雑な工程をとっているため、工業化が困難である。
　一方、アスタキサンチンを生産する新規な細菌（Ｅ－３９６株）を用い、低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合物を用いて８０℃以上の温度で抽出し、その後濃縮して得られた沈殿物を低級アルコール類で洗浄することにより、アスタキサンチン含量４０％以上の乾燥物を得た例が報告されている（特許文献５、６）。同法ではエタノール等の安全性の高い溶媒と水のみで高含量のアスタキサンチン組成物の製造が可能であるものの、密閉式の圧力容器中で処理する必要があり、また、８０℃を越える高温操作では、天然由来のフリー体トランス型アスタキサンチンの一部がシス型化する可能性があり、目的の構造を有するアスタキサンチンの精製収率が低下する問題がある。更に同法は、実際にその製造が確認された新規な細菌以外で、適用可能かどうか不明である。
　上記以外に、培養後のキサントフィロマイセス属（ファフィア属）酵母菌体をアセトンで抽出し、得られた抽出液を濃縮して得られる粗抽出物に炭化水素系溶剤を加え、晶析させる製造方法が報告されている（特許文献７）。同法は簡便性が高く、組成物中のアスタキサンチン含量が４０％以上の高含量のものが得られるなどの利点があるが、製造過程で炭化水素系溶剤を使用するため、最終的に得られる組成物中にこれらの溶剤が残留する懸念がある。
　特に、キサントフィロマイセス属酵母は、乾燥菌体重量当たり２５重量％前後もの脂質を含むことが知られており、該酵母から得られる抽出液の組成は、該脂質が主成分となるため、このような抽出液を濃縮して得られる濃縮物はべとついた粘性液となってしまう。従って、キサントフィロマイセス属酵母を使用して、アスタキサンチンが高濃度に含まれる組成物を得るためには、脂質を始めとする多くの夾雑物を製造中に除去する必要があり、その結果、上述のような複雑かつ非工業的な手段を伴うか、人体に有害で最終製品中の残存量に規制を伴うヘキサン等の有機溶媒を使用する必要があった。
　こうした状況から、取扱いが容易で、なおかつ残留溶剤の少ない、もしくは残留溶剤が問題とならない方法によりアスタキサンチンを高濃度で含有する天然由来のカロテノイド組成物を製造する方法が求められていた。
特開平１１－５６３４６号公報 特開２００４－４１１４７号公報 特開平７－１０１８２７号公報 特開平１０－２７６７２１号公報 ＷＯ２００９／０２８６４３号公報 特開２００７－３１９０１５号公報 特開２００４－２０８５０４号公報
　上述したように、従来の天然由来のカロテノイド組成物の製造方法では、アスタキサンチン等を高濃度で含有する組成物を得るためには、抽出操作に特殊な設備が必要であったり、菌体由来の脂質等の夾雑物を除去するために複雑かつ非工業的な手段を要したりするなど、操作の煩雑化、コストの増大を招くという問題があった。さらには製造過程で炭化水素系溶剤など、食用用途に適さない有機溶媒を使用する場合は、残留溶剤の除去が問題となっていた。特に、脂質含量の多いキサントフィロマイセス属酵母では、細菌や藻類など他の原料を使用する場合に適切とされる製造方法をそのまま応用しても、高濃度のアスタキサンチンを得るための精製操作が困難であるか、可能でも非常に煩雑なものとなっており、規制の関係もあって、アスタキサンチンを高濃度に含有し、流動性に優れた油状組成物や粉体特性に優れた粉末組成物の製造は工業的レベルでは事実上不可能と考えられていた。例えば、上記特許文献５や６の方法を、本発明者がキサントフィロマイセス属酵母に実際に適用したところ、沈殿物中に多量の脂質が残存し、洗浄工程で濾過等の操作が行えず、満足な効率にて製造することが難しいことがわかった。
　本発明は、キサントフィロマイセス属酵母の培養物から、特殊な抽出設備や煩雑な精製工程を要することなく、また必ずしも人体に有害な有機溶媒を使用することなく、アスタキサンチンなどを高濃度に含んだ天然由来のカロテノイド組成物を効率的に工業生産できる製造法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、キサントフィロマイセス属酵母からカロテノイドを抽出する前に、特定の条件で該酵母を洗浄し、かつ、洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母に熱処理を施すことによって、当該酵母からアスタキサンチン等のカロテノイドを効率的に抽出できること、また該方法は、工業生産にも適していることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、下記（１）～（３）の工程を有する、カロテノイド組成物の製造方法に関する。
（１）カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒を用いて少なくとも１回洗浄する洗浄工程
（２）上記洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母を、熱処理溶媒中にて６５℃以上の高温条件で熱処理を施す熱処理工程
（３）上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母を抽出溶媒と接触させ、１０～７０℃の温度で酵母中のカロテノイドを抽出する抽出工程
　さらに本発明では、抽出工程（３）が、上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母にさらに抽出溶媒を加えて行われるものであることが好ましく、カロテノイドがアスタキサンチンであることが好ましく、また、上記洗浄工程（１）において、キサントフィロマイセス属酵母を、含水率３重量％未満の抽出溶媒を用いてさらに洗浄することが好ましく、抽出工程（３）での抽出温度が１０～４５℃であるのが好ましい。
　抽出溶媒が、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類からなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒であることが好ましい。
　また本発明は、熱処理溶媒、洗浄溶媒及び抽出溶媒が、いずれもエタノールであるのが好ましい。
　本発明の製造方法では、キサントフィロマイセス属酵母に含まれる脂質等の夾雑物の大半を事前に除去するだけでなく、さらに洗浄後の該酵母を熱処理することで、その後のカロテノイドの抽出、濃縮操作を効率良く実施でき、簡便で、工業生産にも適した、天然物由来のカロテノイド組成物の製造方法を提供できる。また本発明の製造方法では、食用用途に適用可能な安全な溶媒のみで操作することも可能であり、取扱いが容易で、なおかつ残留溶剤の少ない、もしくは残留溶剤が問題とならない方法にて製造することが可能である。
　以下に本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本発明の製造方法は、（１）カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒を用いて少なくとも１回洗浄する洗浄工程、（２）上記洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母を、熱処理溶媒中にて６５℃以上の高温条件で熱処理を施す熱処理工程、（３）上記熱処理後のキサントフィロマイセス酵母を抽出溶媒と接触させ、１０～７０℃の温度で酵母中のカロテノイドを抽出する抽出工程、という３つの工程を実施することを特徴とする、カロテノイド組成物の製造方法である。
　本発明におけるカロテノイドとしては特に限定されないが、具体的には、αカロテン、βカロテン、γカロテン、δカロテン、リコペン等のカロテン類、ルテイン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、フコキサンチン、アスタキサンチン、アンテラキサンチン等のキサントフィル類等が挙げられ、特にその中でも、本発明の製造方法は、カロテノイドとして、特にアスタキサンチンを得るのに適している。この場合、得られるアスタキサンチンとしては、アスタキサンチン以外のカロテノイドとの混合物として得られる態様も含まれる。
　本発明の製造方法の原料として用いるキサントフィロマイセス属酵母は、カロテノイドを生産するものであれば特に限定されないが、特にカロテノイドとしてアスタキサンチンを製造するキサントフィロマイセス属酵母の好ましい具体例として、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）（別名：ファフィア・ロードジーマ（Ｐｈａｆｆｉａ　ｒｈｏｄｏｚｙｍａ））等が挙げられる。
　なお、本発明においては、上記キサントフィロマイセス属酵母の野生株のみならず、例えば、上記キサントフィロマイセス属酵母の目的とするカロテノイド類の生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良した変異体や組換え体も好ましく使用することができる。
　本発明では、上記キサントフィロマイセス属酵母を培養することで、カロテノイドを産生させる。培養方法は特に限定されず、対象となるキサントフィロマイセス属酵母に適した、あるいは目的とするカロテノイドの生産に適した培養方法を適宜選択すればよい。培養に用いる炭素源としては、例えば、スクロース、グルコース、キシロース、マルトース、コーンシロップ、糖蜜、デンプン、グリセリン、エタノール、酢酸、乳酸、クエン酸、コハク酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの炭素源は単独で用いてもよく、菌体中のカロテノイド含有量の向上を目的として、２種以上組み合わせて用いてもよい。２種以上の炭素源を組み合わせて用いる場合、それらの炭素源を同時に培地中に添加してもよく、培養の途中で添加する炭素源を変更してもよい。後者の例として、培養の前半はグルコースを、培養の後半はキシロースを炭素源として培養する方法、同様に、前半はグルコース、後半はマルトースで培養する方法、前半はグルコース、後半はエタノールで培養する方法、前半はグルコース、後半はグリセリンで培養する方法、および、前半はグルコース、後半はクエン酸で培養する方法等が挙げられるが、これらの組み合わせに限定されず、如何なる炭素源の組み合わせでも、同様に実施しうる。培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニア、アンモニウム塩、尿素、アミノ酸類、酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの窒素源は単独で用いてもよく、炭素源の場合と同様に、２種以上組み合わせて用いてもよい。炭素源、窒素源以外の栄養素としては、例えば、リン酸等のリン源、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、銅、鉄、亜鉛、マンガン、モリブデン等のミネラル類、ビオチン等のビタミン類等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。炭素源、窒素源、および、その他の栄養素は、一括添加、分割添加、或いは連続添加等の方法で供給することができる。培養温度は特に限定されないが、１５～２６℃の範囲が好ましい。培養液のｐＨは特に限定されないが、３～７の範囲が好ましい。
　本発明の製造方法においては、上述したような培養によって得られるキサントフィロマイセス属酵母から、酵母細胞中のカロテノイドを抽出するに際して、培養後のキサントフィロマイセス属酵母をそのまま最初の洗浄工程に供することもできるが、所望により前記キサントフィロマイセス属酵母を破砕して細胞破砕物とし、該破砕物を洗浄工程に供し、引き続き熱処理工程を経た後に抽出を実施することもできる。従って、本発明の製造方法で用いられる「キサントフィロマイセス属酵母」としては、酵母細胞そのもの、凍結乾燥、噴霧乾燥等により乾燥したもの、以下に記載する細胞破砕処理を施したもののいずれもその対象である。特に酵母細胞の破砕は、キサントフィロマイセス属酵母中に生産・蓄積されたカロテノイドの効率的な抽出に寄与する。細胞破砕処理は、必ずしも必要ではないが、細胞が破砕されていないと、細胞中に生産・蓄積されたカロテノイドの回収効率は低下する。なお、本発明における酵母細胞の破砕は、目的とするカロテノイドの抽出が可能である程度に細胞壁等の表面構造が損傷を受ければよく、必ずしも細胞壁が完全に破れる、あるいは酵母細胞が断片化される必要はない。
　上記細胞破砕及び／又は後述の洗浄工程の対象となるキサントフィロマイセス属酵母の形態は、該酵母を含む培養液、その培養液を濃縮したもの、それら培養液から加圧濾過、減圧濾過、自然濾過、遠心分離、デカンテーション等の一般的な方法によりキサントフィロマイセス属酵母を湿菌体として採取したもの、該湿菌体を洗浄したもの、湿菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの、前記湿菌体を乾燥させた乾燥菌体、これら乾燥菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの等が挙げられ、そのいずれでもよい。また、上記濾過操作を行う場合、操作の効率化のために濾過助剤を使用してもよく、その場合、使用した濾過助剤を除去することなく湿菌体又は乾燥菌体として以降の操作を実施することもできる。上記細胞破砕の対象となるキサントフィロマイセス属酵母の形態は、好ましくはキサントフィロマイセス属酵母が水性の溶媒に懸濁している水性懸濁液であり、操作性等の面から、より好ましくは、キサントフィロマイセス属酵母を含む培養液そのもの、該培養液を濃縮したものや、キサントフィロマイセス属酵母の湿菌体を溶媒に懸濁させたものがキサントフィロマイセス属酵母の水性懸濁液として使用できる。
　上記キサントフィロマイセス属酵母の破砕は、以下の１つ、または幾つかの破砕方法を任意の順序で行うことにより行われる。破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理、酵素的処理の他、加熱処理、自己消化、浸透圧溶解、原形質溶解等を挙げることができる。
　上記物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、回転刃式ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、あるいは、これらの組み合わせを挙げることができる。
　上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。
　上記酵素的処理としては、例えば、リゾチーム、ザイモリアーゼ、グルカナーゼ、ノボザイム、プロテアーゼ、セルラーゼ等を用いる方法を挙げることができ、適宜これらを組み合わせて用いても良い。
　上記加熱処理としては、例えば、６０～１４０℃で３０分～３時間程度の処理を挙げることができる。
　上記自己消化としては、例えば、酢酸エチル等の溶媒による処理のほか、３０～６０℃で１～４８時間程度、加温するといった処理等を挙げることができる。
　また、細胞内の塩濃度と異なる溶液で処理することにより、細胞の浸透圧溶解や原形質溶解を引き起こすこともできる。ただし、この方法のみでは細胞破砕効果が不十分な場合が多いため、上記のような物理的処理、化学的処理、酵素的処理、加熱処理、自己消化等と合わせて用いるのが好ましい。上記破砕方法の中でも、物理的処理、化学的処理（特に酸処理、好ましくは強酸（例えば、水溶液中におけるｐＫａが２．５以下の酸）や加熱処理が好ましく、破砕効率の点から物理的処理、化学的処理がより好ましい。
　本発明の製造方法における洗浄工程について説明する。本発明の製造方法においては、上記のようにして調製されたカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、まず、含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒を用いて少なくとも１回洗浄を行う。ここで、洗浄は、カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、湿菌体、乾燥菌体、または水性懸濁液とした状態で行うのが好ましい。また、その場合の湿菌体、乾燥菌体の含水率や、水性懸濁液中の菌体濃度は特に制限されないが、湿菌体であれば、含水率が通常２０～７５重量％の範囲、乾燥菌体であれば、含水率が通常０．０１～２０重量％の範囲が好ましく、また、水性懸濁液であれば、乾燥重量換算の菌体濃度として、通常１～２５重量％の範囲のものが使用できる。なお、１回目の洗浄時のキサントフィロマイセス属酵母と洗浄溶媒の混合液の水分含量としては、１０～４０重量％の範囲が好ましく、１５～３５重量％の範囲がより好ましく、２０～３０重量％の範囲が特に好ましい。従って、そのような水分含量となるように、洗浄対象となるキサントフィロマイセス属酵母の形態とその水分量に応じて、洗浄溶媒の含水率や、その使用量などを適宜調整することもできる。
　本発明の製造方法において、洗浄工程で用いる洗浄溶媒としては、特に限定されないが、目的とするカロテノイドに対する洗浄条件での溶解度があまり高くないものが好ましい。そのような洗浄溶媒としては、例えば、ケトン類、アルコール類、炭化水素類、エーテル類、脂肪酸エステル類などの有機溶媒を、必要に応じて含水状態として、好ましく使用できる。好ましい有機溶媒は、ケトン類、アルコール類、エーテル類であり、特に好ましくはアルコール類である。
　上記ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３～６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。
　上記アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１～２０、好ましくは炭素数１～１２、より好ましくは炭素数１～６である。なかでも、炭素数１～５の１価アルコール、炭素数２～５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
　これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール、１－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ブタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、３－ヘプタノール、１－オクタノール、２－オクタノール、２－エチル－１－ヘキサノール、１－ノナノール、１－デカノール、１－ウンデカノール、１－ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１－メチルシクロヘキサノール、２－メチルシクロヘキサノール、３－メチルシクロヘキサノール、４－メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２－エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１，５－ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
　１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール、１－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ブタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、３－ヘプタノール、１－オクタノール、２－オクタノール、２－エチル－１－ヘキサノール、１－ノナノール、１－デカノール、１－ウンデカノール、１－ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１－メチルシクロヘキサノール、２－メチルシクロヘキサノール、３－メチルシクロヘキサノール、４－メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール、１－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、エタノールである。
　２価アルコールとしては、１，２－エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール等が好ましく、１，２－エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
　上記炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。このなかでも脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
　脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３～２０、好ましくは炭素数５～１２、より好ましくは炭素数５～８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２－メチルブタン、ヘキサン、２－メチルペンタン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２－メチルヘキサン、３－メチルヘキサン、２，３－ジメチルペンタン、２，４－ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３－トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５－トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２－ペンテン、１－ヘキセン、１－ヘプテン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ－メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２－メチルブタン、ヘキサン、２－メチルペンタン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、ヘプタン、２－メチルヘキサン、３－メチルヘキサン、２，３－ジメチルペンタン、２，４－ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３－トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５－トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ－メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２－メチルブタン、ヘキサン、２－メチルペンタン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、ヘプタン、２－メチルヘキサン、３－メチルヘキサン、２，３－ジメチルペンタン、２，４－ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３－トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等であり、さらに好ましくは、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等であり、特に好ましくは、酸化からの防護効果が特に高いという点から、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくはヘプタンである。
　芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６～２０、好ましくは炭素数６～１２、より好ましくは炭素数７～１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ－シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ－シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
　ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１～６、好ましくは炭素数１～４、より好ましくは炭素数１～２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１－ジクロロエタン、１，２－ジクロロエタン、１，１，１－トリクロロエタン、１，１，２－トリクロロエタン、１，１，１，２－テトラクロロエタン、１，１，２，２－テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１－ジクロロエチレン、１，２－ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２－ジクロロプロパン、１，２，３－トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２－テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１－ジクロロエタン、１，２－ジクロロエタン、１，１，１－トリクロロエタン、１，１，２－トリクロロエタン、１，１－ジクロロエチレン、１，２－ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２－テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２－テトラフルオロエタン等である。
　上記エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３～２０、好ましくは炭素数４～１２、より好ましくは炭素数４～８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２－メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２－メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。
　上記脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１～８のアルキルエステル、炭素数７～１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１～６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１～４のアルキルエステルが用いられる。
　プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。
　酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ－ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ－ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ－ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ－ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
　ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ－ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。
　本発明における洗浄溶媒は、言うまでもなく上記有機溶媒を単一で（必要に応じて水と混合して）使用することも可能であるし、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
　前記洗浄溶媒としては、融点が例えば－２５０～１０℃程度、好ましくは－１５０～－３０℃程度、より好ましくは－１００～－５０℃程度のものが好ましい。また沸点が例えば３０～３００℃、好ましくは４０～２５０℃、より好ましくは５０～１５０℃程度のものも好ましい。或いは１体積倍以上、好ましくは１０体積倍以上、より好ましくは１００体積倍以上の水と温度２５℃で分離することなく混和し得るものも好ましい。これら融点、沸点、及び水との混和性を満足する溶媒を、全洗浄溶媒中、例えば５０重量％以上、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、特に１００重量％にするのが推奨される。
　洗浄溶媒の使用量は、洗浄後にキサントフィロマイセス属酵母菌体との分離が可能な量である限り特に限定されないが、該菌体の乾燥重量１重量部に対して、例えば、０．１重量部以上、好ましくは１重量部以上、さらに好ましくは５重量部以上である。また洗浄溶媒の使用量の上限は特に限定されないが、前記菌体の乾燥重量１重量部に対して、例えば、２００重量部以下、好ましくは５０重量部以下、より好ましくは２０重量部以下である。
　本発明の製造方法においては、特に、カロテノイドとしてアスタキサンチンを得ることを目的とする場合、洗浄溶媒としては、ケトン類、アルコール類を使用するのが好ましく、その中でもアセトン又はエタノールを使用するのがさらに好ましく、エタノールを使用するのがより好ましい。例えば、洗浄溶媒としてアセトン又はエタノールを使用する場合の使用量としては、特に限定されないが、例えば、菌体の乾燥重量１重量部に対して、好ましくは０．１重量部以上、より好ましくは１重量部以上、さらに好ましくは５重量部以上であり、また、好ましくは２００重量部以下、より好ましくは５０重量部以下、さらに好ましくは２０重量部以下である。
　本発明の洗浄工程において、少なくとも１回目の洗浄に使用される洗浄溶媒の含水率は、３～５０重量％の範囲であれば特に限定されないが、５～３０重量％の範囲がより好ましく、１０～２０重量％の範囲が特に好ましい。洗浄溶媒中の含水率が３重量％未満では、キサントフィロマイセス属酵母由来のカロテノイド以外の夾雑物の洗浄効率は高くなるものの、目的物質であるカロテノイドの洗浄溶媒に対する溶解度が大きくなるため、カロテノイドの回収率が悪化するという問題がある。一方、洗浄溶媒中の含水率が５０重量％を超える条件では、カロテノイドの回収率は良好となるものの、カロテノイド以外の夾雑物の除去率が著しく低下するため、洗浄工程の観点からは好ましくない。
　本発明の製造方法においては、上記「含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒による洗浄」は、１回でも良く、２回以上実施しても良い。特に後述する「含水率が３重量％未満の洗浄溶媒による洗浄」をさらに実施する場合は、「含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒による洗浄」は１回でも十分に洗浄効果を得ることが出来る。
　さらに本発明の製造方法においては、上記「含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒による洗浄」を少なくとも１回実施すれば、キサントフィロマイセス属酵母由来のカロテノイド以外の夾雑物を除去できるが、さらにその除去効果を高めるため、上記「含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒による洗浄」を少なくとも１回実施した後に、さらに含水率が３重量％未満の洗浄溶媒を用いて少なくとも１回洗浄することが好ましい。この場合、「含水率が３重量％未満の洗浄溶媒」としては含水率が３％未満であれば特に限定されないが、その含水率は１．５重量％以下であるのが好ましく、当然ながら水を全く含まない溶媒を用いることもできる。工業的には、一般に入手できる規格の有機溶媒を、特に含水させることなく用いるのが好ましい。なお、「含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒による洗浄」と「含水率が３重量％未満の洗浄溶媒による洗浄」は、異なる種類の有機溶媒を使用しても良いが、含水率が異なる以外は同じ有機溶媒を使用するのが好ましい。本発明の製造方法においては、洗浄工程として、含水率が３～５０重量％のエタノールによる洗浄を少なくとも１回行った後に、含水率が３重量％未満のエタノールによる洗浄を少なくとも１回実施するのが特に好ましい。含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒による洗浄と含水率が３重量％未満の洗浄溶媒による洗浄は、それぞれ１回づつ実施するのが最も好ましい。
　本発明の製造方法において、洗浄工程における温度条件は特に限定されないが、洗浄溶媒とキサントフィロマイセス属酵母の混合液の温度が３０℃以下となる条件が好ましく、２０℃以下の条件がより好ましく、１０℃以下がさらに好ましい。洗浄時の混合液の温度が３０℃を超えると、洗浄液中のカロテノイド含有率が高くなり、結果、酵母中から抽出し得るカロテノイド量が低下し、カロテノイドの回収率が悪化するという問題がある。洗浄温度の下限は適宜設定でき、例えば、－５０℃程度、好ましくは－２０℃程度、より好ましくは０℃程度である。
　洗浄の圧力は、前記洗浄溶媒が液体となる範囲で適宜設定でき、例えば、０．５気圧～２気圧程度、好ましくは０．８気圧～１．２気圧程度であり、より好ましくは大気圧（約１気圧）である。
　本発明の製造方法において、洗浄溶媒を用いてカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を洗浄する際の洗浄方式は、該酵母菌体と洗浄溶媒とを接触させ、次いで不純物を含む洗浄溶媒から酵母菌体を分離し得る限り特に制限はなく、例えば、攪拌翼や静止型ミキサー、流通式カラム、ポンプ等による混合や、菌体の濾過操作時に濾板上のキサントフィロマイセス属酵母に洗浄溶媒を添加し、濾過洗浄しても良いが、洗浄効率の観点から攪拌翼を用いて洗浄溶媒とカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を一定時間接触・混合させ、その後、該キサントフィロマイセス属酵母と洗浄溶媒を分離することで洗浄操作を行うことが好ましい。その場合の洗浄時間（すなわち洗浄溶媒とカロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母の接触時間）は、特に制限されないが、２４時間以内が好ましく、より好ましくは１分～６時間の範囲であり、さらに好ましくは、１０分～３時間の範囲である。なおここで、洗浄時間を適宜調整することで、洗浄時のカロテノイドの損失をある程度抑えることもできる。また、洗浄終了後のキサントフィロマイセス属酵母と洗浄溶媒との分離操作の種類には特に制限は無く、加圧濾過、減圧濾過、自然濾過、遠心分離、デカンテーション等の一般的な方法により実施することができ、言うまでもなく、これらの操作を組み合わせて行うこともできる。濾過操作を行う場合、操作の効率化のために濾過助剤を使用しても良い。
　本発明の製造方法においては、上記のようにして抽出操作の前に洗浄溶媒を用いてキサントフィロマイセス属酵母を予め洗浄することで、菌体内に多量の脂質を含むキサントフィロマイセス属酵母から、脂質をはじめとする菌体由来の夾雑物の大半が除去され、最終的に製造し得る目的のカロテノイド組成物の高含有量化、油状組成物とした場合の粘性低下や、粉末組成物として得た場合の粉体流動性の向上が図れるほか、製造過程においても残存脂質に起因して生じるべとつきが抑えられ、装置内の付着等の問題が大幅に改善されるなど、生産効率や生産性を向上させることができる。
　次に、本発明の製造方法における熱処理工程について説明する。本発明の製造方法では、上記洗浄工程を実施した後に、洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母を、熱処理溶媒中にて６５℃以上の高温とすることで熱処理を実施する。抽出工程の前に、洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母を、熱処理溶媒と接触させた状態で熱処理を行うことで、その後の抽出工程での抽出効率を向上させ、次の抽出工程で使用する溶媒量を大幅に低減させることができる。なお、本熱処理工程において、キサントフィロマイセス属酵母からカロテノイドが一部抽出されても良い。
　本発明の製造方法において、熱処理工程に用いる熱処理溶媒としては、キサントフィロマイセス属酵母からカロテノイドが抽出されやすくなるよう作用するものであれば特に限定されないが、例えば、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類が好ましく適用でき、アルコール類及びエーテル類がより好ましく適用でき、アルコール類が最も好ましく適用できる。
　上記アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１～２０、好ましくは炭素数１～１２、より好ましくは炭素数１～６である。なかでも、炭素数１～５の１価アルコール、炭素数２～５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
　これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール、１－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ブタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、３－ヘプタノール、１－オクタノール、２－オクタノール、２－エチル－１－ヘキサノール、１－ノナノール、１－デカノール、１－ウンデカノール、１－ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１－メチルシクロヘキサノール、２－メチルシクロヘキサノール、３－メチルシクロヘキサノール、４－メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２－エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール、１，２－ブタンジオール、１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオール、２，３－ブタンジオール、１，５－ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
　１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール、１－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ブタノール、１－ヘプタノール、２－ヘプタノール、３－ヘプタノール、１－オクタノール、２－オクタノール、２－エチル－１－ヘキサノール、１－ノナノール、１－デカノール、１－ウンデカノール、１－ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１－メチルシクロヘキサノール、２－メチルシクロヘキサノール、３－メチルシクロヘキサノール、４－メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール、１－ヘキサノール、２－メチル－１－ペンタノール、４－メチル－２－ペンタノール、２－エチル－１－ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ－ブチルアルコール、１－ペンタノール、２－ペンタノール、３－ペンタノール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ－ペンチルアルコール、３－メチル－２－ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、イソブチルアルコール、２－メチル－１－ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、エタノールである。
　２価アルコールとしては、１，２－エタンジオール、１，２－プロパンジオール、１，３－プロパンジオール等が好ましく、１，２－エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
　上記炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。このなかでも脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
　脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３～２０、好ましくは炭素数５～１２、より好ましくは炭素数５～８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２－メチルブタン、ヘキサン、２－メチルペンタン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２－メチルヘキサン、３－メチルヘキサン、２，３－ジメチルペンタン、２，４－ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３－トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５－トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２－ペンテン、１－ヘキセン、１－ヘプテン、１－オクテン、１－ノネン、１－デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ－メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２－メチルブタン、ヘキサン、２－メチルペンタン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、ヘプタン、２－メチルヘキサン、３－メチルヘキサン、２，３－ジメチルペンタン、２，４－ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３－トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５－トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ－メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２－メチルブタン、ヘキサン、２－メチルペンタン、２，２－ジメチルブタン、２，３－ジメチルブタン、ヘプタン、２－メチルヘキサン、３－メチルヘキサン、２，３－ジメチルペンタン、２，４－ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３－トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等であり、さらに好ましくは、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等であり、特に好ましくは、酸化からの防護効果が特に高いという点から、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくはヘプタンである。
　芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６～２０、好ましくは炭素数６～１２、より好ましくは炭素数７～１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ－シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ－シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ－キシレン、ｍ－キシレン、ｐ－キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
　ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１～６、好ましくは炭素数１～４、より好ましくは炭素数１～２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１－ジクロロエタン、１，２－ジクロロエタン、１，１，１－トリクロロエタン、１，１，２－トリクロロエタン、１，１，１，２－テトラクロロエタン、１，１，２，２－テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１－ジクロロエチレン、１，２－ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２－ジクロロプロパン、１，２，３－トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２－テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１－ジクロロエタン、１，２－ジクロロエタン、１，１，１－トリクロロエタン、１，１，２－トリクロロエタン、１，１－ジクロロエチレン、１，２－ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２－テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２－ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２－テトラフルオロエタン等である。
　上記エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３～２０、好ましくは炭素数４～１２、より好ましくは炭素数４～８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２－メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２－メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルである。
　本発明における熱処理溶媒は、言うまでもなく上記溶媒を単一で使用することも可能であるし、２種類以上を組み合わせて使用することもできる。
　前記熱処理溶媒としては、融点が例えば－２５０～１０℃程度、好ましくは－１５０～－３０℃程度、より好ましくは－１００～－５０℃程度のものが好ましい。また沸点が例えば３０～３００℃、好ましくは４０～２５０℃、より好ましくは５０～１５０℃程度のものも好ましい。これら融点及び沸点を満足する溶媒を、全熱処理溶媒中、例えば５０重量％以上、好ましくは７０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、特に１００重量％にするのが推奨される。
　熱処理工程における熱処理溶媒の使用量は、キサントフィロマイセス属酵母が十分に加熱され、なおかつ熱処理中の混合液の流動性が確保できれば特に制限はなく、菌体の乾燥重量１重量部に対し、好ましくは１～１００重量部、より好ましくは５～５０重量部程度の熱処理溶媒を使用することができる。
　熱処理工程における温度は後工程の抽出工程におけるカロテノイドの回収率の観点から、６５℃以上の条件であれば特に限定されないが、熱処理温度の上限は、溶媒の沸点、操作圧力、カロテノイドの熱安定性などの観点から適宜設定でき、例えば、熱処理溶媒の沸点以下（エタノールの場合は約７８℃）にしてもよい。熱処理工程の温度は、好ましくは７０～８０℃の範囲、より好ましくは７０～７６℃の範囲で実施される。
　熱処理工程における加熱時間は、特に限定されないが、後の抽出工程における抽出率向上の観点から、キサントフィロマイセス酵母と熱処理溶媒の混合液が６５℃以上となる時間が、好ましくは１０秒以上、より好ましくは１分以上、さらに好ましくは１５分以上となるように実施するのが好ましい。加熱時間の上限も特に限定されないが、製造効率及びカロテノイドの分解抑制の観点から、１０時間以下が好ましく、１２０分以下がより好ましく、６０分以下が特に好ましい。
　熱処理工程の圧力は、前記熱処理溶媒の液体状態を維持できる範囲で適宜設定でき、例えば、０．８気圧～５気圧程度、好ましくは１気圧～１．５気圧程度であり、より好ましくは大気圧（約１気圧）である。
　熱処理方法としては特に限定されず、例えば、洗浄工程後のキサントフィロマイセス属酵母を熱処理溶媒中で加温できる限り、該酵母と熱処理溶媒の添加方向や加熱のタイミングは適宜設定できるが、好ましくは洗浄工程後のキサントフィロマイセス属酵母に、所定温度に加温した熱処理溶媒を加えてもよいし、常温の熱処理溶媒を加えた後に当該混合液を所定温度まで加温してもよい。また熱処理時において熱処理溶媒とキサントフィロマイセス属酵母の混合液は静置状態でも攪拌された状態でもかまわないが、適宜攪拌された状態であるのが好ましい。その場合の攪拌方式には特に制限はなく、後述する抽出工程において使用する混合方法及び／又は装置がそのまま使用できる。
　熱処理終了後、熱処理溶媒は、その一部または全部を菌体と分離してもよく、分離しなくてもよい。分離する場合は、分離後の熱処理溶媒からもカロテノイドを回収できる。分離しない場合は、熱処理溶媒は、後述の抽出溶媒を兼ねることができる。
　次に、本発明の製造方法における抽出工程について説明する。抽出工程とは、上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母を抽出溶媒と接触させて抽出を行う工程をいう。抽出溶媒としては、菌体と分離されることなく熱処理工程で残った熱処理溶媒と、新たに用いられる溶媒のいずれも用いることができ、それら両方を用いてもよい。すなわち抽出工程では、
（ｉ）上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母（熱処理溶媒を含んでいてもよい）に、必要に応じて抽出溶媒を加えるか、
（ii）用いる抽出溶媒に、上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母（熱処理溶媒を含んでいてもよい）を加えるか、或いは
（iii）抽出溶媒を用いることなく、キサントフィロマイセス属酵母と熱処理溶媒を混合させたままにしておき、
　１０～７０℃の温度で当該酵母中のカロテノイドを抽出する。本発明の製造方法においては、上記熱処理工程後、熱処理溶媒を一部又は全量除去してから、抽出工程を実施してもよいが、熱処理後の熱処理溶媒とキサントフィロマイセス属酵母の混合液をそのまま、引き続き本抽出工程に供するのが好ましい。熱処理溶媒が残っているキサントフィロマイセス酵母に、さらに抽出溶媒を加え、本抽出工程に供するのが最も好ましい態様である。
　本発明の製造方法において、抽出工程に用いる抽出溶媒としては、目的のカロテノイドを効率よく抽出できるものであれば特に限定されないが、例えば、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類が好ましく適用でき、アルコール類及びエーテル類がより好ましく適用でき、アルコール類が最も好ましく適用できる。これらアルコール類、炭化水素類及びエーテル類の具体例及び好ましい例は、熱処理溶媒の説明と同じである。
　また、本発明の製造方法において、洗浄溶媒、熱処理溶媒、及び抽出溶媒は、それぞれ同一でも異なっていても良いが、使用した溶媒の回収・再利用の点からは、洗浄溶媒、熱処理溶媒及び抽出溶媒は同一の有機溶媒を使用するのが好ましい。また、残留溶剤が問題とならないという観点では、洗浄溶媒、熱処理溶媒及び抽出溶媒は、いずれもアルコール類から選択するのが好ましく、すべてエタノールを使用するのが最も好ましい。
　本発明の製造方法において、抽出溶媒の使用量は特に限定されないが、抽出溶媒の使用量が菌体の乾燥重量に対し著しく多い場合、得られる抽出液中のカロテノイド濃度が極端に希薄となってしまい、効率的な精製処理が困難となる。一方、菌体の乾燥重量に対し、抽出溶媒の使用量が著しく少ない場合は、高濃度のカロテノイド抽出液が得られるものの、抽出溶媒のカロテノイドに対する飽和溶解度の観点から、菌体中のカロテノイドを効率良く抽出することは極めて難しい。そのような観点から、本発明の製造方法における、熱処理工程後に新たに使用する抽出溶媒の好ましい使用量は、菌体の乾燥重量１重量部に対し１重量部以上であり、より好ましくは５重量部以上であり、最も好ましくは１０重量部以上である。また、その上限も特に限定されないが、好ましくは１０００重量部以下であり、より好ましくは５００重量部以下であり、最も好ましくは３００重量部以下である。或いは２００重量部以下、特に１００重量部以下であってもよい。
　なお、熱処理後に熱処理溶媒の一部又は全部を除去せずそのまま本抽出を行う場合、抽出工程において新たに抽出溶媒を追加しないで抽出を行うことも可能であり、それも本発明の範囲内である。本抽出工程において使用する溶媒の合計量（抽出工程において熱処理溶媒が残存する場合はその残存量と、必要に応じて新たに使用される抽出溶媒の合計量）は、菌体の乾燥重量１重量部に対し１重量部以上であり、好ましくは２重量部以上であり、より好ましくは５重量部以上であり、更に好ましくは１０重量部以上であり、より好ましくは１５重量部以上であり、最も好ましくは２０重量部以上である。また、その上限も特に限定されないが、１１００重量部以下であり、好ましくは６００重量部以下であり、より好ましくは４００重量部以下であり、更に好ましくは３００重量部以下であり、最も好ましくは２００重量部以下である。
　前述の熱処理工程後本抽出工程において使用する熱処理溶媒の量（残存量）と熱処理工程後に新たに使用する抽出溶媒の量の比率（重量基準）も特に制限されないが、運転のタイムサイクル、溶媒使用量の観点から、熱処理溶媒の残存量に対する抽出溶媒の使用量として、０．１倍量～２０倍量の範囲が好ましく、０．３倍量～１０倍量の範囲がより好ましく、０．８倍量～５倍量の範囲が特に好ましい。新たに使用する抽出溶媒の温度が室温程度（例えば、０～４０℃）であれば、抽出溶媒の添加量が増える程、特段の冷却手段なしに熱処理後の溶媒の温度を下げることができるため好ましい。
　本発明の製造方法において、抽出工程での抽出時の温度は、１０～７０℃の範囲であれば特に限定されないが、抽出効率の観点から２０℃以上が好ましく、２５℃以上がより好ましい。１０℃未満の抽出温度では、抽出溶媒に対するカロテノイドの溶解度が低いため、満足な収率を得ることが困難となる。一方、抽出時の温度は高いほど抽出効率は向上するが、抽出温度が７０℃を超える場合、カロテノイド中のアスタキサンチンの一部がシス体化するなど、カロテノイドの構造が変質する問題がある。そのような観点から、抽出工程はその前の熱処理工程よりも低い温度、例えば６０℃以下で実施するのが好ましく、５０℃以下で実施するのがより好ましく、４５℃以下で実施するのが特に好ましい。なお、熱処理工程の温度よりも抽出工程の温度が低い場合は、熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母を所望の温度まで冷却した後、抽出工程を実施しても良いし、熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母に適宜温度を調整した抽出溶媒を添加することで、抽出工程における抽出温度を所定の温度に設定することもできる。本発明では、抽出工程を比較的室温に近い状態で実施したとしても、熱処理工程の実施により効率良くアスタキサンチンを抽出することができるため、有用な方法と言える。
　抽出工程の圧力は、前記熱処理工程と同様であってよく、例えば、０．８気圧～５気圧程度、好ましくは１気圧～１．５気圧程度であり、より好ましくは大気圧（約１気圧）である。
　本発明の製造方法においては、抽出溶媒を用いた抽出操作を行う際の、抽出溶媒とキサントフィロマイセス属酵母の混合方式には特に制限はなく、例えば、攪拌翼や静止型ミキサー、流通式カラム、ポンプ等や、高圧ホモジナイザー、回転刃式ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー等の破砕・乳化装置を用いることもでき、言うまでもなく、これらの装置を組み合わせて抽出することもできる。
　本発明の製造方法において、抽出手段としては、回分抽出、連続抽出のどちらの方法でも採用することができ、これらの操作を複数回繰り返すこともできるが、工業的には連続抽出が生産性の面で好ましく、連続抽出の中でも向流多段抽出が特に好ましい。回分抽出の場合の攪拌時間は、特に制限されないが、通常５分以上であり、連続抽出の場合の平均滞留時間は、特に制限されないが、通常１０分以上である。また回分抽出の回数も特に限定されず、１回の抽出でも効率よく抽出できるが、２回以上抽出を繰り返すのが収率の観点からは好ましい。抽出工程において、２回以上の回分抽出を適用する場合、それぞれの回分抽出の前に熱処理工程を実施するなど、熱処理工程と抽出工程をそれぞれ２回目以上繰り返しても良く、その場合よりカロテノイドの回収率を向上させることができる。
　上記抽出工程が完了した後、キサントフィロマイセス属酵母と抽出溶媒との分離を行う。分離操作の種類には特に制限は無く、加圧濾過、減圧濾過、自然濾過、遠心分離、デカンテーション等の一般的な方法により実施することができ、言うまでもなく、これらの操作を組み合わせて行うこともできる。
　本発明の製造方法においては、キサントフィロマイセス属酵母中に含まれるアスタキサンチンなどのカロテノイドを高い効率で抽出することが可能であり、その抽出率は、通常７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上である。
　本発明の製造方法においては、上記のようにして得られたカロテノイドの抽出液をそのまま、あるいは適宜加工することでカロテノイド組成物とすることが出来る。本発明の製造方法によって得られるカロテノイド組成物の性状は特に限定されないが、好ましくは、以下に説明するような処理を行って得られる、油状組成物、または粉末組成物である。上記油状組成物は、抽出溶媒によるカロテノイドの抽出液を濃縮することで製造できる。この場合の濃縮操作の方式には特に制限は無く、タンク内での減圧濃縮、フラッシュ濃縮、薄膜濃縮等の操作を適用することができる。
　上記濃縮操作は油状組成物中の洗浄溶媒、または抽出溶媒が十分に除去されるまで実施するのが好ましい。油状組成物中の洗浄溶媒及び抽出溶媒の残存濃度は、食品、化粧品、医薬品として人体に害を及ぼさない程度であれば特に制限はないが、油状組成物中の残存量として１重量％以下が好ましく、より好ましくは０．１重量％以下であり、さらに好ましくは０．０１重量％以下である。
　上記濃縮操作における温度条件は、濃縮中にカロテノイドの分解やシス体化等の変質が著しく生じることのない条件であれば特に制限はなく、好ましくは１０～８０℃の範囲であり、より好ましくは２０～７０℃の範囲であり、さらに好ましくは２５～６０℃の範囲である。また、本発明における濃縮操作においては、必要に応じて、減圧下で操作してもよい。
　本発明の製造方法においては、上記濃縮により得られる濃縮物が油状である場合、それをそのまま油状組成物として利用することもできるが、濃縮物が乾固物として得られた場合や油状物として得られた場合でもその他製品としての取り扱い易さの観点から、該濃縮物に液体油脂を添加、混合することで、目的とする油状組成物を調製しても良い。なお、本発明における「油状組成物」とは、カロテノイドとその他の成分が均一に油状状態で混合している場合だけでなく、カロテノイドが一部析出し、スラリー状となっている形態も含まれる。
　上記添加することのできる液体油脂としては、アスタキサンチンなどのカロテノイドの濃縮物を溶解または分散させることのできる油脂であれば特に制限はなく、例えば、動植物からの天然油脂であってもよく、合成油脂や加工油脂であってもよい。より好ましくは、食品、化粧品又は医薬用に許容されるものである。例えば、植物油脂としては、例えば、ヤシ油、パーム油、パーム核油、アマニ油、つばき油、玄米胚芽油、菜種油、米油、落花生油、コーン油、小麦胚芽油、大豆油、エゴマ油、綿実油、ヒマワリ種子油、カポック油、月見草油、シア脂、サル脂、カカオ脂、ゴマ油、サフラワー油、オリーブ油等を挙げることができ、動物油脂としては、例えば、豚脂、乳脂、魚油、牛脂等を挙げることができ、さらに、これらを分別、水素添加、エステル交換等により加工した油脂（例えば、硬化油）も挙げることができる。言うまでもなく、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）も使用しうる。又、これらの混合物を使用しても良い。中鎖脂肪酸トリグリセリドとしては、例えば、脂肪酸の炭素数が各々６～１２、好ましくは８～１２のトリグリセリドを挙げることができる。
　上記、油脂のうち、取り扱い易さ、臭気等の面から植物油脂、合成油脂や加工油脂等が好ましく、そのより好ましい具体例として、ヤシ油、パーム油、パーム核油、菜種油、米油、大豆油、綿実油、サフラワー油、オリーブ油、ＭＣＴ等を挙げることができる。
　上記液体油脂は、カロテノイドの抽出液の濃縮物を作製後に添加、混合することで目的とするカロテノイドの油状組成物を調製してもよいし、抽出操作、または濃縮操作の前やその途中で予め添加しておき、その後の処理を行っても良い。
　本発明におけるカロテノイドを含有する油状組成物中のカロテノイド含量としては特に限定されず、目的とする製品の求められる用途に応じて適宜選択しうるが、例えばカロテノイドとしてアスタキサンチンを目的とする場合、取り扱いやすい粘度・性状を有する油状組成物を調製するという観点においては、油状組成物中のアスタキサンチン含有量の上限として、例えば、３０重量％以下、好ましくは、２０重量％以下、より好ましくは１５重量％以下である。また油状組成物中のアスタキサンチン含有量の下限としては特に限定されず、例えば０．１重量％以上、好ましくは１重量％以上、より好ましくは３重量％以上である。
　一方、本発明の製造方法では、抽出工程で得られたカロテノイドの抽出液に対し、濃縮、冷却及び／又は貧溶媒添加などの処理を行うことにより、カロテノイドを析出させ、得られる析出物を固液分離することで、カロテノイド組成物として、アスタキサンチンが高濃度に含まれた粉末組成物を製造することもできる。
　本発明の製造方法において、カロテノイドを析出させる方法には特に制限は無く、例えば抽出液を濃縮しながら蒸発晶析する方法、抽出液をそのままあるいは適宜濃縮したものにカロテノイドに対する貧溶媒を添加してカロテノイドを析出させる方法、抽出液をそのままあるいは適宜濃縮したものをカロテノイドの飽和溶解度を超える条件に冷却し晶析する方法等が挙げられる。本発明は、言うまでもなく、これらの操作を組み合わせて製造することもできるが、収率や操作性の観点から、抽出液を濃縮し、ある程度カロテノイド結晶が析出した状態で、貧溶媒を添加するか冷却することでカロテノイドを析出させることが望ましい。
　上記粉末組成物の製造において、抽出液の濃縮操作を行う場合、抽出液の濃縮倍率が低すぎると、目的のカロテノイドのほとんどが母液側に溶解したままとなり、製造し得る粉末組成物の総量は少なくなり、満足な収率、生産性は得られない傾向がある。一方、抽出液の濃縮倍率が高すぎる場合、カロテノイド以外のキサントフィロマイセス属酵母由来の夾雑物の析出が顕著となり、製造し得る粉末組成物中のアスタキサンチン含有量が低下する問題がある。従って、粉末組成物の製造にあたっては、十分な収率、生産性、含有量を満たすためには適切な濃縮倍率まで抽出液を濃縮するのがよく、例えば、抽出液の濃縮倍率が１０～１０００倍の範囲まで濃縮するのが好ましく、５０～５００倍の範囲まで濃縮するのがより好ましい。
　粉末組成物の製造においては、次に、上記カロテノイドを析出させた後、抽出に用いた有機溶媒と析出物の固液分離を行う。上記固液分離には通常の固液分離操作を適用することができ、例えば、デカンテーション、遠心分離、加圧濾過、減圧濾過、自然濾過等が挙げられ、さらに、必要に応じてケーキ洗浄を行い、さらに、真空乾燥などの乾燥処理を行って残存する有機溶媒等を除去することにより、カロテノイド組成物を乾燥粉末として取得することができる。
　従来の製造方法では、キサントフィロマイセス属酵母由来のカロテノイド（アスタキサンチンなど）を高濃度で含有し、夾雑物が少ない粉末組成物を得ることは事実上困難であったが、本発明の製造方法によって、例えば粉末組成物中に２０～８０重量％の範囲の高濃度のカロテノイド（アスタキサンチンなど）を含有した粉末組成物を製造することもできる。好ましくは前記カロテノイドをキサントフィロマイセス属酵母から高い収率で回収できる。さらには洗浄、抽出、熱処理などで用いた溶媒の混入を著しく抑制することも可能である。
　本願は、２０１２年１２月２７日に出願された日本国特許出願第２０１２－２８５１６６号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１２年１２月２７日に出願された日本国特許出願第２０１２－２８５１６６号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、洗浄や熱処理、抽出に使用した有機溶媒は、含水率を特に記載していない限り、純度９９％以上（含水率１％未満）のものを使用した。
　（高速液体クロマトグラフィー分析条件）
カラム：ＦｉｎｅＰａｋ　ＳＩＬ　Ｃ１８Ｔ－５、４．６×２５０ｍｍ（日本分光（株）製）
移動相：アセトニトリル／酢酸エチル／蟻酸／蒸留水＝６００／３００／６０／４０
流速：０．８ｍＬ／分
検出波長：４７１ｎｍ
　（ガスクロマトグラフィー分析条件）
カラム：Ｊ＆Ｗ　ＤＢ－６２４、３０ｍ×０．３２ｍｍ、Ｆｉｌｍ　ｔｈｉｃｈｎｅｓｓ１．８μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
ガス：Ｈｅ（７０ｋＰａ）、Ａｉｒ（５０ｋＰａ）、Ｈ２（６０ｋＰａ）
検出：ＦＩＤ
　（製造例１）
　５ｍＬのＹＭ培地（ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、モルトエキス０．３％、グルコース１．０％）を含む試験管４本に、キサントフィロマイセス・デンドロアス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ）ＮＢＲＣ　１０１２９株（独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）より入手）をＮＴＧで変異処理して得られた変異株であるＫＮＫ－１１株を接種し、２０℃で４８時間培養した。培養液を５０ｍＬのＹＭ培地を含む５００ｍＬ容の坂口フラスコ４本に移し、２０℃で４８時間の培養を行なった。培養液を２５００ｍＬの培地（リン酸アンモニウム１．３％、リン酸カリウム０．７％、酵母エキス０．３％、グルコース１％を含む）を含む５０００ｍＬ容のジャーファーメンターに移し、２０℃で培養し、アスタキサンチンおよびＨＤＣＯを含有する菌体を含む培養液を得た。培養中は、ｐＨを４．４～５．６の間にコントロールし、溶存酸素濃度は飽和の３０～８０％となるようにグルコースを流加した。
　得られた培養液のうち、３０００ｍＬに硫酸４００ｇを添加し、７０℃で１時間攪拌を行った。その後、３０％水酸化ナトリウムを１３００ｇ添加して中和した培養液を減圧濾過し、湿菌体（水分含量６０重量％、菌体含量２０重量％（乾燥重量として））を調製した。
　（実施例１）
　製造例１にて得られた湿菌体３６．７ｇ（アスタキサンチン０．１５ｇ含有）に１０℃に冷却した含水エタノール（含水率１２重量％）１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－１と濾液－１を得た。濾液－１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ－１に１０℃に冷却したエタノール１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－２と濾液－２を得た。濾液－２中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００６重量％であった。得られたケーキ－２にエタノール３７５ｍＬを加え、７５℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール３７５ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。濾液－３中のアスタキサンチン量は０．１３ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ＭＣＴ）１．５ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物２．３ｇ中のアスタキサンチン含有量は５．６重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％以下であった。
　（実施例２）
　製造例１にて得られた湿菌体３６．７ｇ（アスタキサンチン０．１５ｇ含有）に１０℃に冷却した含水エタノール（含水率６重量％）１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－１と濾液－１を得た。濾液－１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００７重量％であった。得られたケーキ－１に１０℃に冷却したエタノール１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－２と濾液－２を得た。濾液－２中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００６重量％であった。得られたケーキ－２にエタノール３７５ｍＬを加え、７５℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール３７５ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。濾液－３中のアスタキサンチン量は０．１３ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油２．４ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物３．３ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．９重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％以下であった。
　（実施例３）
　製造例１にて得られた湿菌体３６．７ｇ（アスタキサンチン０．１５ｇ含有）に１０℃に冷却した含水エタノール（含水率１２重量％）１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－１と濾液－１を得た。濾液－１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ－１にエタノール３７５ｍＬを加え、７５℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール３７５ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－２と濾液－２を得た。濾液－２中のアスタキサンチン量は０．１３ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油２．８ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物３．８ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．４重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％以下であった。
　（実施例４）
　実施例１にて得られたケーキ－２にエタノール２５０ｍＬを加え、７０℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール７５０ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。得られたケーキ－３にエタノール２５０ｍＬを加え、再度７０℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール７５０ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－４と濾液－４を得た。濾液－３と濾液－４を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１４ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、ＭＣＴ１．６ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物２．７ｇ中のアスタキサンチン含有量は５．２重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％以下であった。
　（実施例５）
　実施例１にて得られたケーキ－２にエタノール３７５ｍＬを加え、７５℃にて３時間攪拌した。その後さらにエタノール３７５ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。濾液－３中のアスタキサンチン量は０．１３ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油２．６ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物３．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．７重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％以下であった。
　（実施例６）
　実施例１にて得られたケーキ－２にエタノール３７５ｍＬを加え、６５℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール３７５ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。濾液－３中のアスタキサンチン量は０．１２ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油２．５ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物３．２ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．８重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％以下であった。
　（実施例７）
　製造例１にて得られた湿菌体３６．７ｇ（アスタキサンチン０．１５ｇ含有）に１０℃に冷却した含水メタノール（含水率１２重量％）１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－１と濾液－１を得た。濾液－１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００２重量％であった。得られたケーキ－１に１０℃に冷却したメタノール１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－２と濾液－２を得た。濾液－２中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００３重量％であった。得られたケーキ－２に２－プロパノール３７５ｍＬを加え、７５℃にて３０分攪拌した。その後さらに２－プロパノール３７５ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。濾液－３中のアスタキサンチン量は０．１３ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油２．４ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物３．３ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．９重量％であった。また、得られた油状物中の残存メタノールと２－プロパノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、それぞれ０．１重量％以下であった。
　（実施例８）
　実施例１にて得られた濾液－３を１／１００になるまで減圧濃縮した後、濃縮液を減圧濾過して固液分離し、さらに得られた固形分を室温で減圧乾燥して黒紫色の粉末を得た。得られた粉末０．２０ｇ中のアスタキサンチン含有量は５０．８重量％であった。
　（比較例１）
　製造例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）にアセトン１６００ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキと濾液を得た。濾液中のアスタキサンチン量は０．１２ｇであった。この液を減圧濃縮した後、ＭＣＴ１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．９ｇ中のアスタキサンチン含有量は３．５重量％であった。また、得られた油状物中の残存アセトン含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．２重量％であった。
　（比較例２）
　製造例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）にエタノール８００ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－１と濾液－１を得た。得られたケーキ－１に更にエタノール８００ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－２と濾液－２を得た。濾液－１と濾液－２を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を減圧濃縮した後、ＭＣＴ１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物３．６ｇ中のアスタキサンチン含有量は２．８重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。
　（比較例３）
　製造例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）にエタノール８００ｍＬを加え、８５℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキと濾液を得た。濾液中のアスタキサンチン量は０．１２ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、得られた濃縮液から沈殿物を固液分離するため減圧濾過を試みたが、沈殿物のべとつきが著しく、濾過することができなかった。
　（比較例４）
　実施例１にて得られたケーキ－２にエタノール２５０ｍＬを加え、６０℃にて３０分攪拌した。その後さらにエタノール５００ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。濾液－３中のアスタキサンチン量は０．０８６ｇであった。この液を１／５０になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油２．０ｇを加え、さらに濃縮を継続した。得られた油状物２．８ｇ中のアスタキサンチン含有量は２．８重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％以下であった。
　（比較例５）
　製造例１にて得られた湿菌体３２．３ｇ（アスタキサンチン０．１３ｇ含有）に５℃に冷却したエタノール１００ｍＬを加え、その温度で３０分攪拌した。それを減圧濾過しケーキ－１と濾液－１を得た。濾液－１中のアスタキサンチン濃度を高速液体クロマトグラフィーにて測定したところ、０．００５重量％であった。得られたケーキ－１にエタノール８００ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－２と濾液－２を得た。得られたケーキ－２に更にエタノール８００ｍＬを加え、４０℃にて１時間攪拌した。それを減圧濾過し、ケーキ－３と濾液－３を得た。濾液－２と濾液－３を合わせた液中のアスタキサンチン量は０．１１ｇであった。この液を１／１００になるまで減圧濃縮した後、サフラワー油１．６３ｇを加え、更に濃縮を継続した。得られた油状物２．５ｇ中のアスタキサンチン含有量は４．０重量％であった。また、得られた油状物中の残存エタノール含量をガスクロマトグラフィーにて測定したところ、０．１重量％であった。
　表１に実施例１～８、比較例１、２、４、５における仕込み条件と、得られたカロテノイド油状物中のアスタキサンチン含有量の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001

Claims (12)

  1. 下記（１）～（３）の工程を含有する、カロテノイド組成物の製造方法。
    （１）カロテノイドを含有するキサントフィロマイセス属酵母を、含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒を用いて少なくとも１回洗浄する洗浄工程
    （２）上記洗浄後のキサントフィロマイセス属酵母を、熱処理溶媒中にて６５℃以上の高温条件で熱処理を施す熱処理工程
    （３）上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母を抽出溶媒と接触させ、１０～７０℃の温度で酵母中のカロテノイドを抽出する抽出工程
  2. 抽出工程（３）が、上記熱処理後のキサントフィロマイセス属酵母にさらに抽出溶媒を加えて行われるものである請求項１に記載のカロテノイド組成物の製造方法。
  3. カロテノイドがアスタキサンチンである、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 洗浄工程（１）において、キサントフィロマイセス属酵母を、含水率が３～５０重量％の洗浄溶媒を用いて洗浄した後に、さらに含水率３重量％未満の洗浄溶媒を用いて洗浄する、請求項１～３いずれか１項に記載の製造方法。
  5. 洗浄溶媒が、ケトン類、アルコール類、炭化水素類、エーテル類及び脂肪酸エステル類からなる群より選択される少なくとも１種類の有機溶媒である請求項１～４いずれか１項に記載の製造方法。
  6. 熱処理溶媒が、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類からなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒である請求項１～５いずれか１項に記載の製造方法。
  7. 抽出溶媒が、アルコール類、炭化水素類及びエーテル類からなる群より選択される少なくとも１種の有機溶媒である請求項１～６いずれか１項に記載の製造方法。
  8. 洗浄溶媒、熱処理溶媒及び抽出溶媒が、いずれもエタノールである請求項１～４いずれか１項に記載の製造方法。
  9. 熱処理工程（２）における熱処理時間が１０秒～１０時間である請求項１～８いずれか１項に記載の製造方法。
  10. 抽出工程（３）での抽出温度が１０～４５℃である請求項１～９いずれか１項記載の製造方法。
  11. 得られたカロテノイドの抽出液を濃縮して油状組成物とする工程をさらに含む、請求項１～１０いずれか１項記載の製造方法。
  12. 得られる油状組成物中のアスタキサンチン含有量が１～２０重量％である請求項１１に記載の製造方法。
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