WO2014097888A1 - 遺伝子型解析装置及び遺伝子型解析方法 - Google Patents

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基博 山▲崎▼
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Definitions

  • the present invention relates to a genotype analyzer using electrophoresis and an analysis method thereof.
  • DNA analysis by DNA polymorphism analysis is currently widely used for the purpose of investigating crimes and determining related relationships.
  • the DNAs of the same species have substantially similar base sequences, but have different base sequences in some places.
  • Such diversity in the base sequence on the DNA among individuals is called DNA polymorphism, and is related to the formation of individual differences at the gene level.
  • STR Short Tandem Repeat
  • microsatellite One form of DNA polymorphism is Short Tandem Repeat (STR) or microsatellite.
  • STR is a characteristic sequence pattern in which a short sequence of about 2 to 7 bases is repeated several to several tens of times, and the number of repetitions is known to vary from individual to individual. Analyzing the combination of the number of STR repeats at a particular gene locus is called STR analysis.
  • STR analysis using the property that the combination of the number of STR iterations differs among individuals is used.
  • the FBI Federal Bureau of Investigation
  • the International criminal police Organization define 10 to 10 or more STR loci used for DNA testing as DNA markers, and analyze the pattern of the number of repetitions of these STR sequences. Since the difference in the number of STR repeats appears due to the difference in alleles (alleles), the number of STR repeats in each DNA marker is hereinafter referred to as an allele.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Electrophoresis is performed to measure the fragment length of the target DNA fragment obtained by PCR. Electrophoresis is a method for separating DNA fragments using the fact that the migration speed in a charged migration path differs depending on the length of the DNA fragment (the longer the DNA fragment, the lower the migration speed). As an electrophoresis method, capillary electrophoresis using a capillary as an electrophoresis path has been frequently used in recent years.
  • capillary electrophoresis a thin tube called a capillary is filled with an electrophoresis medium such as a gel, and a sample DNA fragment is migrated in the capillary. Then, the length of the DNA fragment is examined by measuring the time required for the sample to migrate by a certain distance (usually from the end of the capillary to the end). Each sample, that is, each DNA fragment is labeled with a fluorescent dye, and the fluorescent signal of the migrated sample is detected by an optical detector placed at the end of the capillary.
  • an optical detector placed at the end of the capillary.
  • Fluorescent dyes for labeling DNA fragments have different spectra, but they are not sharp and the fluorescent dyes overlap each other. Therefore, in the optical detector at the end of the capillary, when DNA fragments labeled with different fluorescent dyes have the same fragment length, the spectrum obtained by the optical detector is the spectrum of the different fluorescent dye (hereinafter referred to as the fluorescent spectrum). ), That is, a weighted sum. Therefore, in order to obtain the signal intensity of each fluorescent dye, a linear coefficient of the spectrum of each fluorescent dye constituting this spectrum, that is, a weight value may be obtained from the spectrum obtained by the optical detector. This weight value corresponds to the signal intensity of each fluorescent dye.
  • each fluorescence spectrum In order to obtain the signal intensity of this fluorescent dye, each fluorescence spectrum must be known in advance. Each fluorescence spectrum is originally determined by the fluorescent dye and the electrophoresis medium regardless of the device, but in an actual device, it is imaged on the optical detector by the positional relationship between the capillary and the fluorescence signal detector. Shifts the fluorescence spectrum. For this reason, when replacing the capillary, calibration (hereinafter, spectral calibration) is required in which the fluorescence spectrum is obtained in advance and the position of the fluorescence spectrum is adjusted before subjecting the target sample to electrophoresis. When performing electrophoresis on a plurality of samples simultaneously using a capillary array in which a plurality of capillaries are arranged, it is necessary to obtain a fluorescence spectrum for each capillary.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an image formed on the optical detector installed at the capillary end.
  • An image obtained by irradiating the capillary terminal portion with laser light of a specific wavelength and obtained by exciting each fluorescent dye in the wavelength direction by a diffraction grating is detected by an image sensor such as a CCD.
  • This figure shows a diffraction grating image when a capillary array in which eight capillaries (1) to (8) are arranged is irradiated with laser light (lower part of the figure).
  • the vertical axis indicates the capillary array direction
  • the horizontal axis indicates the wavelength direction
  • the upper part shows the signal intensity corresponding to the AA ′ direction of the capillary (4) shown in the lower stage.
  • FIG. The figure (upper stage) shows the signal intensity distribution when the vertical axis represents the luminance value representing the signal intensity and the horizontal axis represents the wavelength.
  • a spectrum in a specific capillary can be obtained as a waveform with the signal intensity in the capillary as the vertical axis and the wavelength as the horizontal axis.
  • FIG. 2 shows an example in which the spectrum is measured continuously using a diffraction grating (actually, discrete for each pixel).
  • the spectrum is data obtained by sampling the above spectrum at a wider wavelength interval. May be. For example, as shown in the figure, only the luminance values at 20 wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19) may be acquired for each capillary. Further, an average of luminance values in the vicinity of the wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19) may be taken.
  • a filter that filters only the wavelength band with the highest sensitivity for each fluorescent dye may be switched at high speed to perform imaging.
  • an imaging device and a filter corresponding to each fluorescent dye may be provided as many as the number of fluorescent dyes, and each fluorescent dye may be imaged simultaneously. Such a case corresponds to sampling the spectrum at the sample position corresponding to each fluorescent dye in the spectrum of the figure, and the means of the present invention described below can be similarly applied.
  • FIG. 3 is a diagram showing a processing flow of spectral calibration.
  • a sample called a matrix standard is subjected to electrophoresis.
  • the matrix standard is a reagent for performing electrophoresis for the purpose of obtaining a fluorescence spectrum and obtaining a matrix described later.
  • FIGS. 4A and 4B it is assumed that fluorescence spectra of five types of fluorescent dyes (LIZ, PET, NED, VIC, 6FAM) are obtained.
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity and the horizontal axis indicates the time, and the five types of fluorescent dyes show sharp peak values at the times corresponding to the respective fluorescent dyes. Therefore, in order to obtain the fluorescence spectrum of each fluorescent dye, it is only necessary to obtain the spectrum at the time when only the fluorescent dye emits light (t0, t1, t2, t3, t4 in FIG. 4A). Therefore, in the matrix standard, five types of DNA fragments having different lengths are labeled with different fluorescent dyes. Information on the length of the DNA fragment corresponding to each fluorescent dye or the order of the length is known.
  • step 302 the intensity of each fluorescent dye is calculated from the spectrum at each time obtained by electrophoresis in step 301. Details of this processing will be described later. This process may be performed for each scan time, or may be performed after spectrum data for a certain time interval is accumulated. An example of the resulting fluorescence intensity waveform is shown in FIG. 4A.
  • FIG. 4A shows a state where the signal intensity (hereinafter referred to as fluorescence intensity) waveform of each fluorescent dye with the scan time as the horizontal axis is superimposed on one graph.
  • a peak is seen in the fluorescence intensity waveform, and this peak time corresponds to the DNA fragment length.
  • at each peak time (t0, t1, t2, t3, t4) Emits light alone.
  • step 303 the peak time of the fluorescence intensity (signal intensity) waveform in FIG. 4A is detected.
  • FIG. 4A shows how peak times t0, t1, t2, t3, and t4 are obtained.
  • LIZ is emitted at time t0
  • PET is emitted at time t1
  • NED is emitted at time t2
  • VIC is emitted at time t3
  • 6FAM is emitted individually at time t4. That is, each time spectrum corresponds to the fluorescence spectrum of each fluorescent dye. Therefore, what is necessary is just to acquire the spectrum of each peak time (refer FIG. 4B).
  • a matrix to be described later is calculated using each fluorescence spectrum.
  • This matrix is a matrix for obtaining the intensity of each fluorescent dye from the spectrum waveform obtained by the detector.
  • the process of calculating this matrix is called spectral calibration.
  • spectral calibration When there are a plurality of capillaries, it is necessary to calculate this matrix for each capillary. In addition, this spectral calibration must be performed every time a capillary is installed or a part is replaced.
  • the above-described spectral calibration of the prior art has a problem that it takes time and effort because it is necessary to separately perform electrophoresis on the matrix standard before electrophoresis of the sample to be actually analyzed. It was. Further, since the matrix standard is necessary as a consumable item, there is a problem that the price increases for the apparatus user.
  • an object of the present invention is to provide a technique for realizing spectral calibration simultaneously with electrophoresis of a sample to be analyzed without performing electrophoresis using a special matrix standard that requires labor and cost. .
  • a reference fluorescence spectrum using a size standard and an allelic ladder which are known DNA fragment information used in electrophoresis of an actual sample. It is characterized by obtaining.
  • the amount of shift in the fluorescence spectrum of the size standard is detected, and the fluorescence spectrum is calculated by shifting the reference fluorescence spectrum using this amount of shift, thereby performing spectrum calibration. It is characterized by performing an action.
  • spectrum calibration is performed by directly using the result of electrophoresis of an actual sample without using the above shift amount.
  • spectral calibration can be realized in a short time and at a low cost.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of a genotype analyzer according to Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating an example of an image formed on an optical detector of the electrophoresis apparatus according to Embodiment 1.
  • FIG. It is a figure which shows the processing flow of the spectral calibration by a prior art. It is a figure for demonstrating the outline
  • 1 is a diagram illustrating a schematic configuration of an electrophoresis apparatus according to Example 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing an electrophoresis processing flow according to Example 1. It is a figure which shows the example of the preservation
  • FIG. It is a figure which shows the example of the fluorescence intensity waveform of an allelic ladder. It is a figure which shows the example of the fluorescence intensity waveform of a real sample. It is a figure for demonstrating the outline
  • FIG. It is a figure for demonstrating the outline
  • FIG. 3 is a diagram for explaining an outline of acquisition of a reference fluorescence spectrum according to Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing a flow of reference fluorescence spectrum acquisition processing according to Example 1. It is a figure for demonstrating an example of the allele information contained in an allelic ladder.
  • FIG. 6 is a diagram for explaining an example of extraction of monochromatic peak times according to the first embodiment.
  • FIG. 5 is a diagram showing a flow of a fluorescence spectrum calculation process according to Example 1. 2 is a diagram illustrating an example of a reference fluorescence spectrum according to Example 1.
  • FIG. FIG. 5 is a diagram for explaining an outline of fluorescence spectrum calculation according to Example 1.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining an outline of fluorescence spectrum calculation according to Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a processing flow of STR analysis according to the first embodiment.
  • 6 is a diagram for explaining an outline of reference fluorescence spectrum acquisition according to Example 2.
  • 6 is a diagram for explaining an example of correction of a reference fluorescence spectrum according to Example 2.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram for explaining an example of determination processing in correction of a reference fluorescence spectrum according to Example 2.
  • 6 is a diagram for explaining the concept of fluorescence spectrum acquisition according to Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the processing flow of the genotype analyzer by Example 3.
  • FIG. It is a figure which shows the processing flow of the genotype analyzer by Example 4.
  • FIG. It is a figure which shows an example of the Raman spectrum by Example 4.
  • It is a figure for demonstrating the concept of the baseline signal of the measurement spectrum by Example 1.
  • FIG. 10 is a diagram showing a processing flow of the gene analyzing apparatus according to Example 5. It is a figure for demonstrating the determination conditions of the pseudo peak of the gene analyzer by Example 5.
  • FIG. It is a figure which shows the example of a user interface screen of the gene-analysis apparatus by Example 5.
  • FIG. 10 is a diagram showing a processing flow of the gene analyzing apparatus according to Example 5. It is a figure for demonstrating the determination conditions of the pseudo peak of the gene analyzer by Example 5.
  • FIG. It is a figure which shows the example of a user interface screen of the gene-analysis apparatus by Example 5.
  • the present invention provides a technique for realizing spectral calibration simultaneously with electrophoresis of an actual sample.
  • the configuration of the genotype analyzer of Example 1 of the present invention is shown in FIG.
  • the genotype analysis apparatus 101 includes a data analysis apparatus 112 and an electrophoresis apparatus 105.
  • the data analysis device 112 stores a central control unit 102 that controls electrophoresis, data processing, and the like, a user interface unit 103 that presents information to the user and inputs information from the user, and stores data and device setting information. And a storage unit 104.
  • the central control unit 102 includes a sample information setting unit 106, an electrophoresis apparatus control unit 108, a fluorescence intensity calculation unit 110, a peak detection unit 107, a matrix calculation unit 109, and an STR analysis unit 111. Each function will be described later.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the electrophoresis apparatus 105. The configuration of the electrophoresis apparatus 105 will be described with reference to FIG.
  • the electrophoresis apparatus 105 includes a detection unit 516 for optically detecting a sample, a thermostatic chamber 518 for keeping the capillary at a constant temperature, a transporter 525 for transporting various containers to the capillary cathode end, and a high voltage across the capillary.
  • a high voltage power source 504 for applying current a first ammeter 505 for detecting current generated from the high voltage power source, a second ammeter 512 for detecting current flowing through the anode side electrode, and one or a plurality of capillaries 502
  • the configured capillary array 517 includes a pump mechanism 503 for injecting a polymer into the capillaries.
  • the capillary array 517 is an exchange member including a plurality of (for example, eight) capillaries, and includes a load header 529, a detection unit 516, and a capillary head.
  • the capillary is composed of a glass tube having an inner diameter of several tens to several hundreds of microns and an outer diameter of several hundreds of microns, and the surface is coated with polyimide to improve the strength.
  • the light irradiation portion irradiated with the laser light has a structure in which the polyimide coating is removed so that internal light emission is likely to leak to the outside.
  • the inside of the capillary 502 is filled with a separation medium for giving a migration speed difference during electrophoresis. Although the separation medium has both fluidity and non-fluidity, a fluid polymer is used in this embodiment.
  • the detection unit 516 is a member that acquires information depending on the sample.
  • information light fluorescence having a wavelength depending on the sample
  • the information light is dispersed in the wavelength direction by the diffraction grating 532, and the sampled light is analyzed by detecting the dispersed information light by the optical detector 515.
  • the capillary cathode side end 527 is fixed through a metal hollow electrode 526, and the capillary tip protrudes from the hollow electrode 526 by about 0.5 mm. Further, all the hollow electrodes provided for each capillary are integrally attached to the load header 529. Further, all the hollow electrodes 526 are electrically connected to a high-voltage power source 504 mounted on the apparatus main body, and operate as cathode electrodes when it is necessary to apply a voltage such as electrophoresis or sample introduction.
  • the capillary end (other end) opposite to the capillary cathode end 527 is bundled together by a capillary head.
  • the capillary head can be connected to the block 507 in a pressure-tight and air-tight manner.
  • the syringe 506 fills the capillary with the new polymer from the other end. Refilling the polymer in the capillary is performed for each measurement in order to improve the measurement performance.
  • the pump mechanism 503 includes a syringe 506 and a mechanism system for pressurizing the syringe.
  • a block 507 is a connection part for communicating the syringe 506, the capillary array 517, the anode buffer container 510, and the polymer container 509.
  • the optical detection unit includes a light source 514 for irradiating the detection unit 516, an optical detector 515 for detecting light emission in the detection unit 516, and a diffraction grating 532.
  • the light source 514 irradiates the detection unit 516 of the capillary, and the light emitted from the detection unit 516 is dispersed by the diffraction grating 532 and detected by the optical detector 515.
  • the thermostat 518 is covered with a heat insulating material to keep the thermostat at a constant temperature, and the temperature is controlled by the heating / cooling mechanism 520. Further, the fan 519 circulates and stirs the air in the thermostatic chamber, and keeps the temperature of the capillary array 517 uniform and constant in position.
  • the transfer machine 525 includes three electric motors and a linear actuator, and is movable in three axes in the vertical direction, the horizontal direction, and the depth direction. Further, at least one or more containers can be placed on the moving stage 530 of the transporter 525. Furthermore, the movable stage 530 is provided with an electric grip 531 so that each container can be grasped and released. For this reason, the buffer container 521, the cleaning container 522, the waste liquid container 523, and the sample container 524 can be conveyed to the capillary cathode end 527 as needed. Note that unnecessary containers are stored in a predetermined container in the apparatus.
  • the electrophoresis apparatus 105 is used in a state where it is connected to the data analysis apparatus 112 with a communication cable.
  • the operator can control the functions of the apparatus using the data analysis apparatus 112 and can exchange data detected by a detector in the apparatus.
  • step 601 an electrophoresis process is performed on an actual sample to be analyzed.
  • step 602 the fluorescence intensity of each fluorescent dye is calculated from the spectral waveform data obtained by electrophoresis.
  • step 603 a peak is detected from the fluorescence intensity waveform.
  • step 604 the correspondence between the time and the DNA fragment length is obtained by mapping the obtained peak time and the known DNA fragment length information of the size standard. This process is called Size Calling.
  • step 605 a fluorescence spectrum in the reference capillary is acquired.
  • the reference capillary means a capillary in which electrophoresis is performed to an allelic ladder described later.
  • step 606 the fluorescence spectra of other capillaries are calculated.
  • step 607 a matrix is calculated using the obtained fluorescence spectrum.
  • step 608 the fluorescence intensity of each fluorescent dye is calculated using the obtained matrix.
  • step 609 STR analysis is performed using the obtained fluorescence intensity data.
  • step 610 shown in the processing flow shown in FIG. 6 skips an intermediate step and proceeds directly to step 609 to indicate that STR analysis may be performed. The specific case will be described later.
  • FIG. 7 shows the flow of electrophoresis processing of an actual sample in step 601.
  • step 701 sample preparation (step 701), start of analysis (step 702), loading of loading medium (step 703), preliminary electrophoresis (step 704), sample introduction (step 705), and electrophoresis analysis (step 706).
  • step 702 start of analysis
  • step 703 loading of loading medium
  • step 704 preliminary electrophoresis
  • step 705 sample introduction
  • step 706 electrophoresis analysis
  • Step 701 The operator of the apparatus sets a sample or a reagent in the apparatus as a sample preparation (Step 701) before starting the analysis. More specifically, first, the buffer container 521 and the anode buffer container 510 shown in FIG.
  • the buffer solution is, for example, an electrolyte solution that is commercially available for electrophoresis from various companies.
  • the sample to be analyzed is dispensed into the well of the sample plate 524.
  • the sample is, for example, a DNA PCR product.
  • a cleaning solution for cleaning the capillary cathode end 527 is dispensed into the cleaning container 522.
  • the cleaning solution is pure water, for example.
  • a separation medium for electrophoresis of the sample is injected into the syringe 506.
  • the electrophoresis medium is, for example, a polyacrylamide separation gel commercially available for electrophoresis from various companies.
  • the samples set on the sample plate 524 include positive samples, negative controls, and allelic ladders in addition to the actual DNA samples to be analyzed, and are electrophoresed in different capillaries.
  • the positive control is, for example, a PCR product containing known DNA, and is a sample for a control experiment for confirming that DNA is correctly amplified by PCR.
  • the negative control is a PCR product that does not contain DNA, and is a sample for a control experiment for confirming that the PCR amplification product does not contain contamination such as operator DNA or dust.
  • allelic ladder is an artificial sample containing many alleles that may be generally contained in DNA markers, and is usually provided by a reagent manufacturer as a reagent kit for DNA testing.
  • the allelic ladder is used for the purpose of finely adjusting the correspondence between the DNA fragment length of each DNA marker and the allele. The allelic ladder will be described later.
  • a known DNA fragment labeled with a specific fluorescent dye is mixed with all of the actual sample, the positive control, the negative control, and the allelic ladder.
  • the type of fluorescent dye assigned to the size standard varies depending on the reagent kit used. For example, in the size standard reagent illustrated in FIG. 12A, it is assumed that a known DNA fragment having a length between 80 bp and 480 bp is labeled with the fluorescent dye LIZ.
  • the size standard is mixed with respect to all capillary samples for the purpose of obtaining the correspondence between the scan time and the DNA fragment length in Size Calling described later.
  • the operator designates the type of allelic ladder, the type of size standard, the type of fluorescent reagent, the type of sample set in each capillary (the corresponding well on the sample plate 524), and the like.
  • any one of a real sample, a positive control, a negative control, and an allelic ladder is designated as the sample type.
  • the setting of these pieces of information is set in the sample information setting unit 106 on the data analysis apparatus 112 via the user interface unit 103.
  • Step 702 After the sample preparation as described above (step 701) is completed, the operator operates the user interface unit 103 on the data analysis apparatus 112 shown in FIG. 1 to instruct the start of analysis.
  • This analysis start instruction is passed to the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • the electrophoresis apparatus control unit 108 transmits an analysis start signal to the electrophoresis apparatus 105, so that the analysis is started.
  • Step 703 Next, in the electrophoresis apparatus 105 shown in FIG. 1, loading of the electrophoresis medium (step 703) is started. This step may be performed automatically after the analysis is started, or may be performed by sequentially transmitting a control signal from the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • the loading of the electrophoresis medium is a procedure for filling the capillary 502 with a new electrophoresis medium and forming a migration path.
  • step 703 In the loading of the electrophoresis medium in the first embodiment (step 703), first, the waste liquid container 523 is transported directly below the load header 529 by the transporter 525 shown in FIG. 1, and the used electrophoresis medium discharged from the capillary cathode end 527 is removed. Try to be taken. Then, the syringe 503 is driven to fill the capillary 502 with a new electrophoresis medium, and the used electrophoresis medium is discarded. Finally, the capillary cathode end 527 is immersed in the cleaning solution in the cleaning container 522, and the capillary cathode end 527 soiled with the electrophoresis medium is cleaned.
  • Step 704 Next, preliminary electrophoresis (step 704) is performed. This step may be performed automatically or sequentially by transmitting a control signal from the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • the pre-electrophoresis is a procedure for applying a predetermined voltage to the electrophoretic medium so that the electrophoretic medium is in a state suitable for electrophoresis.
  • the capillary cathode end 527 is immersed in the buffer solution in the buffer container 521 by the carrier 525 to form a current path.
  • a voltage of about several to several tens of kilovolts is applied to the electrophoresis medium for several to several tens of minutes by the high-voltage power source 504 so that the electrophoresis medium is in a state suitable for electrophoresis.
  • the capillary cathode end 527 is immersed in the cleaning solution in the cleaning container 522, and the capillary cathode end 527 soiled with the buffer solution is cleaned.
  • Step 705 Next, sample introduction (step 705) is performed. This step may be performed automatically or sequentially by transmitting a control signal from the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • sample introduction step 705
  • sample components are introduced into the migration path.
  • the capillary cathode end 527 is immersed in the sample held in the well of the sample plate 524 by the transporter 525. As a result, an energization path is formed, and the sample component is introduced into the migration path. Then, a pulse voltage is applied to the energization path by the high voltage power source 504 to introduce the sample component into the migration path. Finally, the capillary cathode end 527 is immersed in the cleaning solution in the cleaning container 522, and the capillary cathode end 527 soiled with the sample is cleaned.
  • Step 706 Next, electrophoresis analysis (step 706) is performed. This step may be performed automatically or sequentially by transmitting a control signal from the electrophoresis apparatus control unit 108.
  • electrophoresis analysis step 706
  • each sample component contained in the sample is separated and analyzed by electrophoresis.
  • electrophoretic analysis (step 706) in the present embodiment first, the capillary cathode end 527 is immersed in the buffer solution in the buffer container 521 by the carrier 525 to form a current path. Next, a high voltage of about 15 kV is applied to the energization path by the high voltage power source 504 to generate an electric field in the migration path.
  • each sample component in the migration path moves to the detection unit 516 at a speed depending on the property of each sample component. That is, the sample components are separated by the difference in moving speed. And it detects in order from the sample component which reached the detection part 516. For example, when the sample includes a large number of DNAs having different base lengths, a difference occurs in the moving speed depending on the base length, and the detection unit 516 is reached in order from the DNA having the shorter base length. Each DNA is attached with a fluorescent dye depending on its terminal base sequence.
  • the detection unit 516 is irradiated with excitation light from the light source 514, information light (fluorescence having a wavelength depending on the sample) is generated from the sample and emitted to the outside.
  • This information light is detected by an optical detector 515.
  • An example of an image detected by the optical detector 515 is shown in FIG.
  • the optical detector 515 detects this information light at regular time intervals and transmits image data to the data analysis device 112.
  • the luminance of only a partial area in the image data may be transmitted instead of the image data.
  • the luminance values only at the wavelength positions at regular intervals may be transmitted for each capillary.
  • luminance value data at 20 wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19) for each capillary is transmitted to the data analysis device 112 in the above image data.
  • This luminance value data represents the spectrum of each capillary.
  • This spectrum is stored in the storage unit 104 (see FIG. 8).
  • the storage unit 104 stores the spectra of all capillaries at all the detection times during the electrophoresis analysis. In the present embodiment, it is desirable to store spectra at all detection times. However, if only a specific peak time is important in the STR analysis, a spectrum only around the specific time may be stored. Good.
  • Step 707 Finally, when the planned image data has been acquired, the voltage application is stopped and the electrophoretic analysis is terminated (step 707).
  • the above is an example of the electrophoresis process (step 601) in FIG. ⁇ Description of Step 602> Next, an example of the fluorescent dye intensity calculation process in FIG. 6 will be described.
  • the intensity of each fluorescent dye is calculated from the image data obtained by the above-described electrophoresis process (step 601) (step 602).
  • This fluorescence intensity calculation process is performed in the fluorescence intensity calculation unit 110 in FIG.
  • the spectrum of each capillary at each time is multiplied by the intensity ratio of each fluorescent dye at each wavelength in ⁇ (0) to ⁇ (19). Good. This can be expressed as a matrix as shown in (Equation 1).
  • the vector C is a fluorescence intensity vector
  • its elements C F , C V , C N , C P , and C L represent the fluorescence intensity of 6FAM, VIC, NED, PET, and LIZ, respectively.
  • a vector f is a measurement spectrum vector, and its elements f 0 to f 19 represent signal intensities (luminance values) at wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19), respectively.
  • the elements f 0 to f 19 may be addition averages of signal intensities near the wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19), respectively.
  • the measurement signals of the individual wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19) detected by the optical detector 515 are based on Raman scattered light from the polymer filled in the capillary in addition to the signal from the fluorescent dye. It is included as a line signal. For this reason, when calculating the vector f, it is necessary to remove this baseline signal in advance (see FIG. 28).
  • a spectrum of Raman scattered light is obtained in advance before shipment of the apparatus, and this spectrum is stored in the storage unit 104 as a baseline signal. Then, by subtracting this baseline signal from the measurement signal at each time, a signal by the fluorescent dye is obtained, and this may be used as the measurement spectrum vector f.
  • the baseline signal may be removed by applying a high-pass filter that removes the low-frequency component to the measurement signal of each wavelength ( ⁇ (0) to ⁇ (19)).
  • the minimum value near each time may be the baseline signal value at that time.
  • the matrix M is a matrix for converting the measurement spectrum f into a fluorescence intensity vector, and the element corresponds to the intensity ratio of each fluorescent dye at each wavelength.
  • the element W F0 of the matrix M in Formula 1 is the ratio of the fluorescence intensity of the fluorescent dye 6FAM at the wavelength ⁇ (0). A higher value means a higher contribution to the intensity of the fluorescent dye at that wavelength.
  • the matrix M is originally determined in a unified manner depending on the type of fluorescent dye and the conditions of the migration path. However, since the matrix M may actually fluctuate depending on the positional relationship between the capillary and the detector, when the capillary is replaced, etc. It is necessary to calculate. A series of processes for obtaining the matrix M is spectral calibration.
  • the initial value of the matrix is obtained in advance by measurement. Further, it is assumed that a fluorescence spectrum to be described later for obtaining an initial matrix is also obtained in the same manner.
  • an initial matrix predetermined by measurement and a fluorescence spectrum (to be described later) for obtaining this initial matrix are stored in the storage unit 104 for each type and product of the fluorescent reagent supported by the genotype analyzer. It is assumed that Alternatively, the matrix obtained by the previous spectral calibration and the fluorescence spectrum at that time may be stored in the storage unit 104 as initial values. However, as will be described later, since the matrix can be obtained from the fluorescence spectrum and the fluorescence spectrum can be obtained from the matrix, only one of the information may be stored.
  • the initial value of the matrix corresponding to the type of the fluorescent reagent is the fluorescence intensity calculating unit. 110.
  • the matrix obtained by the previous spectral calibration is stored in the storage unit 104 and the type of the fluorescent reagent at that time is the same as the type of the fluorescent reagent at this time, the previous matrix is used as an initial value. Also good.
  • the fluorescence intensity of each fluorescent dye is calculated from the measured spectrum according to (Equation 1).
  • time series data of the fluorescence intensity of each capillary can be obtained.
  • this time series data of the fluorescence intensity is referred to as a fluorescence intensity waveform.
  • FIG. 9 and FIG. 10 show examples of temporal changes in the fluorescence intensity obtained in step 602 after electrophoresis (step 601).
  • FIG. 9 is an example of a fluorescence intensity waveform when an allelic ladder is subjected to electrophoresis.
  • FIG. 10 is an example of a fluorescence intensity waveform of an actual sample. The time at which the peak of each fluorescence intensity stands corresponds to the length of the DNA fragment labeled with each fluorescent dye, and this difference in length corresponds to the difference in allele. Since the allelic ladder is an artificial sample that contains many alleles that are generally contained in DNA markers, it can be seen that many peaks are observed in the fluorescence intensity waveform of FIG. In the fluorescence intensity waveform of the actual sample in FIG.
  • FIG. 10 shows an example in which one person contributes to the DNA of the sample. If the sample is a mixed sample in which DNAs of a plurality of persons are mixed, one DNA marker is selected according to the contribution ratio of the plurality of persons. In some cases, there are three or more peaks.
  • the peak detection is performed on the above-described fluorescence intensity waveform obtained by the fluorescence intensity calculation process (step 602) in FIG.
  • the center position (peak time), peak height, and peak width are mainly important.
  • the center position of the peak corresponds to the DNA fragment length and is most important for allele identification.
  • the peak height is used for homozygous / heterozygous identification and quality evaluation such as the DNA concentration in the sample.
  • the peak width is also important in evaluating the quality of the sample and the electrophoresis results.
  • Gaussian fitting which is a known technique can be used.
  • Fig. 11 shows the concept of Gaussian fitting.
  • Gaussian fitting calculates parameters (average value ⁇ , standard deviation ⁇ , and maximum amplitude value A) such that Gaussian function g best approximates real data for real data in a certain interval. It is processing to do.
  • parameters can be optimized using a conventional method such as the Gauss-Newton method.
  • a method for improving accuracy such as a case where two or more peak waveforms are mixed or a case where data around a peak is asymmetrical as disclosed in Patent Document 1 is applied. Also good.
  • the variance ⁇ of the Gaussian function g is determined, its full width at half maximum (FWHM: Full Width at Half Maximum) is obtained by the equation shown in FIG. This value can be used as the peak width.
  • “Size Calling” is a process of associating the time required until a DNA fragment is detected by electrophoresis with the length of the DNA fragment.
  • the STR analysis unit 111 in the data analysis apparatus 112 performs this process. Shall be.
  • electrophoresis is performed on a reagent containing a DNA fragment of a known length called a size standard and labeled with a specific fluorescent dye.
  • a size standard reagent illustrated in FIG. 12A a known DNA fragment having a length of 80 to 480 bp is labeled with the fluorescent dye LIZ.
  • a known DNA fragment length is associated with the peak center position (ie, peak time) obtained by the above-described peak detection (step 603). From the combination of the peak time and the known DNA fragment length, a corresponding equation between the electrophoresis time and the DNA fragment length can be obtained.
  • f (t) a quadratic expression, a cubic expression, or the like may be used to perform approximation that minimizes the square error.
  • the user may specify what approximate expression to use to the STR analysis unit 111 via the user interface unit 103.
  • the reference fluorescence spectrum is a fluorescence spectrum serving as a reference for obtaining a fluorescence spectrum of another capillary by shifting the reference fluorescence spectrum.
  • a capillary that performs electrophoresis on an allelic ladder is called a reference capillary
  • a fluorescence spectrum in the reference capillary is called a reference fluorescence spectrum.
  • this processing is performed by the matrix calculation unit 109 in the data analysis apparatus 112 of FIG.
  • the initial fluorescence spectrum in the reference capillary (assumed to be stored in the storage unit 104) may be used as the reference fluorescence spectrum.
  • the STR analysis may be performed using the fluorescence intensity waveform to which the initial matrix is applied by the pass 610.
  • FIG. 13 schematically shows the fluorescence intensity waveform of each fluorescent dye in the reference capillary, that is, the waveform shown in FIG.
  • the figure shows the fluorescence intensity waveforms of the allelic ladder and the size standard.
  • the allelic ladder is labeled with 6FAM, VIC, NED, and PET, and the size standard is labeled with LIZ.
  • FIG. 14 is a flowchart showing a process flow of the reference fluorescence spectrum acquisition process (step 605).
  • the time hereinafter, monochromatic peak time
  • the time is extracted from the above five fluorescence intensity waveforms of the reference capillary (step 1401). ).
  • the monochromatic peak time is extracted from the above five fluorescence intensity waveforms of the reference capillary (step 1401). ).
  • step 1402 by obtaining a spectrum at this monochromatic peak time (step 1402), it is regarded as a fluorescence spectrum of that color.
  • T (V), T (N), T (F), T (P), and T (L) are the monochrome peak times of the fluorescent dyes VIC, NED, 6FAM, PET, and LIZ, respectively. Yes, at each time, it is considered that there is no contribution to the fluorescence intensity by other fluorescent dyes.
  • the above single color peak time can be determined according to the type of allelic ladder and size standard set in the electrophoresis apparatus. That is, allelic ladder and size standard always disclose information on the length of the DNA fragment contained in the reagent, and this information is used in the STR analysis described later. As described above, the known DNA fragment length of the size standard is used in Size ⁇ Calling to obtain a relational expression between the electrophoresis time and the DNA fragment length.
  • the fluorescence intensity waveform of the allelic ladder is as shown in FIG. 9, and the peak observed in the figure corresponds to the length of each DNA fragment contained in the allelic ladder. A part of the information on the DNA fragment contained in the allelic ladder is shown in FIG.
  • the DNA marker (locus) D10S1248 is labeled with 6FAM, and its alleles include 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, and the DNA fragment length.
  • (Unit: bp) is 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 109, 113, 117, respectively.
  • All the alleles have an allowable width of plus 0.5 bp and minus 0.5 bp. This allele corresponds to one peak of the fluorescence intensity waveform.
  • FIG. 15 shows only an example of information of the DNA marker D10S1248, but the above information is disclosed for all loci included in the allelic ladder.
  • Such allelic ladder DNA fragment length information is stored in the storage unit 104 in advance, and when the type of allelic ladder is set in the above-described sample preparation (step 701 in FIG. 7), the storage unit From 104, DNA fragment length information of a set type of allelic ladder may be read into the matrix calculation unit 109. Therefore, since the DNA fragment length is known for all the peaks of the fluorescence intensity waveform of the allelic ladder shown in FIG. 9, the single color peak time may be extracted using this known information.
  • FIG. 16 shows an example of extracting a single color peak time using the DNA fragment length information attached to the allelic ladder.
  • the peak position of each fluorescence intensity waveform is shown.
  • the horizontal axis in the figure is not the electrophoresis time but the DNA fragment length, but both are essentially the same because they are associated one-to-one by Size Calling.
  • FIG. 2A shows the peaks of all the fluorescent dyes included in the DNA fragment length from 113 bp to 130 bp.
  • the maximum allowable width of each peak is plus or minus 0.5 bp from the peak center. From the positional relationship of peaks in FIG.
  • FIG. 6A shows the peaks of all fluorescent dyes included in the vicinity of 380 bp. From the figure, it can be seen that a peak 1604 (DNA fragment length 384.5 bp) can be extracted as a single color peak time in PET.
  • FIG. 2C shows the peak of all fluorescent dyes around 460 bp.
  • the peak 1605 (DNA fragment length 460 bp) can be extracted as the single color peak time in the fluorescent dye LIZ. If the monochromatic peak time as described above cannot be obtained, the STR analysis may be performed by using the fluorescence intensity waveform to which the initial matrix is applied through the pass 610.
  • step 1402 the reference fluorescence spectrum acquisition process (step 1402) in FIG. 14 will be described.
  • spectra at all detection times of all capillaries are stored in the storage unit 104. Therefore, in step 1401 described above, the single color peak time in the reference capillary is extracted based on the known DNA fragment length information of the allelic ladder and the size standard, and the spectrum at that time is acquired from the storage unit 104. This is the reference fluorescence spectrum.
  • the reference fluorescence spectrum acquisition process step 605) in FIG. 6 is performed.
  • Step 606 Next, an example of the fluorescence spectrum calculation process in FIG. 6 will be described.
  • This process is a process for obtaining a fluorescence spectrum of capillaries other than the reference capillary based on the reference fluorescence spectrum obtained in step 605.
  • this processing is performed using a fluorescence spectrum of a size standard in which electrophoresis is performed in all capillaries.
  • FIG. 17 shows a processing flow of the fluorescence spectrum calculation process (step 606).
  • the fluorescence spectrum calculation process (step 606) is performed on capillaries other than the reference capillary.
  • the monochromatic peak time of the size standard is detected (step 1701).
  • the example of the fluorescence intensity waveform in the actual sample has already been described with reference to FIG.
  • the fluorescence intensity waveform of the fluorescent dye LIZ in FIG. 10 many peak values corresponding to known DNA fragment lengths are observed, and the peak times in all the fluorescence intensity waveforms have already been detected in step 603.
  • the monochromatic peak time of the fluorescent dye LIZ is extracted. That is, similar to the monochromatic peak time detection (step 1401) in FIG.
  • a peak corresponding to this maximum DNA fragment length may be set as a monochromatic peak time.
  • the peak 1605 (DNA fragment length is 460 bp) is the maximum DNA fragment length. If there is no LIZ monochromatic peak time in step 1701 due to the influence of noise or the like, the STR analysis may be performed with the initial matrix applied to this capillary by the path 610 in FIG. Good.
  • the fluorescence spectrum of LIZ at the monochromatic peak time of this LIZ is acquired (step 1702).
  • this processing is performed by acquiring the spectrum at the monochromatic peak time of LIZ from the spectra of all capillaries at all times stored in the storage unit 104. Good. This is the fluorescence spectrum of LIZ.
  • the shift amount of the fluorescence spectrum in the capillaries other than the reference capillary (hereinafter referred to as other capillaries) from the reference fluorescence spectrum is calculated (step 1703).
  • the fluorescence spectrum of a fluorescent dye (LIZ in this embodiment) that labels the size standard is used.
  • the calculation of the shift amount will be described with reference to FIGS. 18 and 19A and 19B.
  • FIG. 18 is an example of the reference fluorescence spectrum described above.
  • the peak heights of the fluorescence spectra of all the fluorescent dyes are normalized.
  • a known spline interpolation or the like is performed in advance to set a sufficiently small sampling interval for the fluorescence spectrum.
  • the data is interpolated so that the sampling interval is the same for the fluorescence spectrum waveform of LIZ in other capillaries.
  • a shift amount ⁇ between the LIZ fluorescence spectrum 1801 in the reference fluorescence spectrum and the fluorescence spectrum 1901 in the other capillary is calculated (see FIG. 19A).
  • This shift amount can be calculated by, for example, assuming that the fluorescence spectrum 1801 (the waveform subjected to the above interpolation) is f (n) and the fluorescence spectrum 1901 (the waveform subjected to the above interpolation) is g (n).
  • the above-described Gaussian fitting may be performed on the fluorescence spectrum 1801 and the fluorescence spectrum 1901 to obtain respective peak wavelengths, and the difference between the peak wavelengths may be used as the shift amount ⁇ .
  • the fluorescence spectra in other capillaries are obtained by shifting the reference fluorescence spectra of all the fluorescent dyes by the above-mentioned ⁇ (step 1704 in FIG. 17).
  • the reference fluorescence spectra of all the fluorescent dyes obtained in FIG. 18 may be shifted by ⁇ .
  • a waveform value at a sampling wavelength before interpolation ( ⁇ (0) to ⁇ (19) in this embodiment) may be newly obtained from the interpolated fluorescence spectrum.
  • the matrix M is calculated using the fluorescence spectrum of each capillary obtained in step 606 (step 607). In the present embodiment, this processing is performed by the matrix calculation unit 109.
  • vector S F of LIZ, S V, S N, S P is denoted by S L.
  • the number of dimensions of the vectors S F , S V , S N , S P , and S L is 20. That is, as described above, the element of each vector is the signal intensity of each fluorescence spectrum at wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19).
  • a spectrum measured at a certain time is a vector f, and a fluorescence intensity vector at that time is C. This vector f and vector C are the same as in (Equation 1).
  • the elements C F , C V , C N , C P , and C L of the vector C represent the fluorescence intensity of 6FAM, VIC, NED, PET, and LIZ, respectively.
  • Elements f 0 to f 19 of vector f represent signal intensities (luminance values) of wavelengths ⁇ (0) to ⁇ (19), respectively.
  • the matrix M can be obtained by calculating the pseudo inverse matrix of (Equation 3) for the fluorescence spectrum matrix S obtained from the fluorescence spectrum obtained in step 606. .
  • the matrix as described above is obtained for all the capillaries and held.
  • the reliability of the matrix M is evaluated. If it is determined that the reliability is low, the matrix M is not used and the initial matrix is determined by the path 610 in FIG. STR analysis may be performed using the applied fluorescence intensity waveform.
  • the reliability index of the matrix M for example, the condition number (Condition Number) of the matrix obtained by the product of the transposed matrix of S and S with respect to the fluorescence spectrum matrix S shown in (Expression 2)
  • the condition number of a matrix is expressed by the product of the norm of the matrix and the norm of the inverse matrix, which is shown in (Expression 5).
  • L1 norm sum of absolute values of matrix elements
  • L2 norm sum of squares of matrix elements
  • the condition number represented by (Equation 5) indicates whether the inverse matrix is obtained by numerical analysis, and the condition is good. If the condition number increases, the accuracy of the obtained inverse matrix deteriorates. That is, since the accuracy of the inverse matrix of (S t S) when the matrix M is obtained by (Equation 3) is deteriorated, the reliability of the matrix M obtained from this inverse matrix is also lowered.
  • the fluorescence intensity of each fluorescent dye is calculated using the matrix M (step 608).
  • this processing is performed by the fluorescence intensity calculation unit 110.
  • each element C F , C V of the fluorescence intensity vector C is expressed by (Equation 1) using the matrix M obtained in step 607. determines the C N, C P, and C L. If this fluorescence intensity vector C is obtained for each time and plotted as time-series data of signal intensity for each fluorescent dye, a fluorescence intensity waveform as shown in FIGS. 9 and 10 can be obtained.
  • STR analysis is performed using the fluorescence intensity waveform for each fluorescent dye (step 609).
  • this processing is performed by the STR analysis unit 111.
  • FIG. 20 is a diagram showing a processing flow of STR analysis.
  • the STR analysis process includes three steps of peak detection (step 2001), Size Calling (step 2002), and Allele Calling (step 2003).
  • peak detection (step 2001) and size calling (step 2002) are the same as the processing of peak detection (step 603) and size calling (step 604) described above, respectively. That is, compared with the case where the processing of Step 603 and Step 604 is performed, the matrix M is changed in Step 607 and the fluorescence intensity waveform is also changed in Step 608, so that the peak detection and the Size Calling processing are performed again.
  • Allele Calling is a process for finely adjusting the correspondence between alleles (corresponding to the number of STR repetitions as described above) and DNA fragment length.
  • the type of reagent used as the allelic ladder information on all the loci included in the allelic ladder (see FIG. 15) has already been obtained, and individual alleles are obtained from this allelic ladder information. And the corresponding DNA fragment length.
  • a slight deviation usually occurs between the DNA fragment length obtained from each peak in the fluorescence intensity waveform of the actual allelic ladder (FIG. 9) and the DNA fragment length included in the allelic ladder information of FIG. .
  • This deviation is stored in the storage unit 104 for each allele as offset information.
  • a peak is detected from the fluorescence intensity waveform of the actual sample (step 2001), and the peak time is determined from the size standard peak time and the known DNA fragment length information. And the DNA fragment length are calculated (Step 2002), and the DNA fragment length for the known allele in the allelic ladder is determined to fine-tune the correspondence between the allele and the DNA fragment length. Based on this correspondence, The allele is determined from the peak of the fluorescence intensity in the actual sample (step 2003).
  • Example 1 a standard fluorescence spectrum is obtained using a size standard and an allelic ladder, and a shift amount from the standard fluorescence spectrum is obtained by referring to the fluorescence spectrum of the size standard.
  • the reference fluorescence spectrum is shifted by the shift amount to calculate the fluorescence spectrum in all capillaries, and the matrix M is calculated from the fluorescence spectrum.
  • the fluorescence intensity waveform of each fluorescent dye can be obtained from the measured spectrum.
  • a genotype analyzer according to Example 2 of the present invention will be described.
  • the capillary on which electrophoresis is performed on the allelic ladder is used as a reference capillary, the monochromatic peak times of the allelic ladder and the size standard in the reference capillary are extracted, and the spectrum at this time is obtained.
  • the reference fluorescence spectrum was used.
  • the matrix M of all the capillaries was calculated by shifting the reference fluorescence spectrum to obtain the fluorescence spectra in all capillaries other than the reference capillary.
  • the fluorescence spectrum of each fluorescent dye is ideally determined by the type of the fluorescent dye, the wavelength of the excitation light for this, and the characteristics of the capillary migration medium, regardless of the device. .
  • the reference fluorescence spectrum is determined not only from the monochromatic peak time of the allelic ladder, but also from the fluorescence dye determined by the type of the fluorescent dye, the excitation light wavelength, the electrophoresis medium characteristics, and the like as described above. It is characterized in that a reference fluorescence spectrum is obtained by measuring in advance and comparing and correcting it.
  • this unique fluorescence spectrum measured in advance is referred to as an ideal fluorescence spectrum. It is assumed that the ideal fluorescence spectrum waveform is measured in advance by the device manufacturer before shipment of the genotype analyzer, or is measured by service engineers at the time of installation of the device and stored in the device.
  • the ideal fluorescence spectrum waveform is measured in advance by the device manufacturer before shipment of the genotype analyzer, or is measured by service engineers at the time of installation of the device and stored in the device.
  • the configuration of the genotype analyzer according to Example 2 is the same as that of Example 1 shown in FIG.
  • the difference between the first embodiment and the second embodiment is only the difference in the processing for obtaining the reference fluorescence spectrum performed in the matrix calculation unit 109, and the other processing is the same as in the first embodiment.
  • FIG. 21 is a diagram illustrating a concept of processing for calculating a reference fluorescence spectrum in the matrix calculation unit 109 according to the second embodiment.
  • the processing of the monochrome peak time detection (step 2101) and the fluorescence spectrum acquisition (step 2102) in the figure is the same as the monochrome peak time detection (step 1401) in the reference fluorescence spectrum acquisition processing (step 605) described in FIG. Since this is the same as the reference fluorescence spectrum acquisition process (step 1402), description thereof is omitted.
  • the ideal fluorescence spectrum 2107 stored in the storage unit 104 is acquired.
  • the ideal fluorescence spectrum 2107 is measured by a device manufacturer in advance before shipment of the genotype analyzer, or measured by service engineers at the time of installation of the device, and stored in the storage unit 104 in the device. Assume that it is stored.
  • the spectrum of one type of fluorescent dye is shown as the fluorescent spectrum, but the same processing is performed for all the fluorescent dyes.
  • the final reference fluorescence spectrum 2108 is obtained by correcting the reference fluorescence spectrum 2106 based on the comparison between the ideal fluorescence spectrum 2107 and the reference fluorescence spectrum 2106.
  • An example of the correction process (step 2104) will be described with reference to FIG.
  • the reference fluorescence spectrum 2106 and the ideal fluorescence spectrum 2107 are data respectively acquired from the spectrum stored in the storage unit 104 as described above.
  • alignment in these wavelength directions is performed (2201).
  • the same method as the process for calculating the shift amount from the reference capillary (step 1703 in FIG. 17) during the calculation of the fluorescence spectrum in Example 1 can be used.
  • the shift between the two spectra can be corrected, that is, the positions can be aligned.
  • the Gaussian fitting described above may be applied to both spectra, and the difference between the peak center positions may be used as the shift amount.
  • a difference spectrum is obtained by subtracting the ideal fluorescence spectrum 2107 from the reference fluorescence spectrum 2106 (2202).
  • the difference spectrum (2202) is clipped with a predetermined maximum difference (DMAX) and minimum difference (DMIN).
  • DMAX and DMIN are the maximum and minimum allowable differences based on the offset value in the figure, DMAX is the maximum positive difference, and DMIN is the minimum negative difference.
  • Offset is a value representing the overall signal intensity difference of the reference fluorescence spectrum 2106 with respect to the ideal fluorescence spectrum 2107.
  • the average value of the difference spectrum may be Offset.
  • the range of the difference spectrum is determined as [Offset + DMIN, Offset + DMAX]. Of the data of the difference spectrum, data that does not fall within this range is clipped with the maximum value or the minimum value of this range.
  • the allowable range is determined in advance for the difference from the ideal fluorescence spectrum, and the clipping process is performed to reduce the spectrum noise generated during the measurement.
  • the above correction process is an example, and the present invention is not limited to this example. Various processes can be applied as long as the reference fluorescence spectrum is corrected based on comparison with the ideal fluorescence spectrum.
  • step 2104 an example in which the difference from the ideal fluorescence spectrum is clipped has been shown. However, if it is determined that the reliability of the measured reference fluorescence spectrum is low In the correction process (step 2104), the reference fluorescence spectrum may be replaced with the ideal fluorescence spectrum.
  • a value indicating the reliability of the reference fluorescence spectrum is compared with a predetermined threshold value.
  • the higher the Q value, the lower the reliability of the reference fluorescence spectrum As an example of the index of the Q value, for example, as described in (Equation 5), the condition number (Condition Number) of the matrix obtained by the product of the transposed matrix of S and S with respect to the fluorescence spectrum matrix S Is mentioned.
  • the high condition number obtained by (Equation 5) indicates that the degree of overlapping of the fluorescence spectra of the fluorescence spectrum matrix S is strong due to some reason such as noise in the detection system or deterioration of the electrophoresis medium. This means that the reliability of the measured fluorescence spectrum matrix S is low.
  • the ideal fluorescence spectrum is used as a reference without using the measured reference fluorescence spectrum.
  • the fluorescence spectrum is replaced (step 2303).
  • the ideal fluorescence spectrum may be aligned with the wavelength direction of the reference fluorescence spectrum as described in FIG.
  • step 2301 determines that the reference fluorescence spectrum is highly reliable, and the correction process of the reference fluorescence spectrum as described in the explanation of FIG. 22 is performed.
  • the replacement of the reference fluorescence spectrum with the ideal fluorescence spectrum (step 2302) described above can also be applied to genotype analysis that does not use an allelic ladder.
  • alleles can be identified without using an allelic ladder if the genotype analysis (for example, food inspection) is used in such a way that high base resolution is not required in the STR analysis.
  • the reference fluorescence spectrum cannot be acquired using the information of the allelic ladder.
  • the fluorescence spectrum can be obtained by replacing the ideal fluorescence spectrum with the reference fluorescence spectrum and obtaining the shift amount for each capillary as in Step 2302.
  • the reference fluorescence spectrum is not only based on the monochromatic peak time of the allelic ladder, but also the type of the fluorescent dye, the excitation light wavelength, the electrophoresis medium characteristics, and the like.
  • Spectral calibration is performed by measuring in advance the ideal fluorescence spectrum determined in advance and obtaining a reference fluorescence spectrum by comparison and correction. In this way, by correcting the reference fluorescence spectrum by comparison with the ideal fluorescence spectrum, it becomes possible to reduce the influence of noise and the like generated at the time of spectral calibration.
  • a genotype analyzer according to Example 3 of the present invention will be described.
  • the capillary used for electrophoresis on the allelic ladder was used as the reference capillary, and the reference fluorescence spectrum in the reference capillary was obtained. Then, the shift amount between the reference fluorescence spectrum and the spectrum other than the reference capillary is obtained, and by shifting the reference fluorescence spectrum by this amount, the fluorescence spectrum in all capillaries other than the reference capillary is obtained, and the matrix M of all capillaries is calculated. did.
  • the fluorescence spectrum of each capillary is obtained by shifting from the reference fluorescence spectrum in the reference capillary, so that the shape of the fluorescence spectrum changes between capillaries. Is not assumed. Actually, the shape of the fluorescence spectrum may be slightly different due to some factor of the optical system or the measurement system. Therefore, the third embodiment of the present invention is characterized in that the fluorescence spectrum is obtained by using the spectrum of electrophoresis performed on the actual sample in each capillary instead of the shift from the reference fluorescence spectrum as described above. To do. Details of the genotype analyzer according to Example 3 will be described below with reference to the drawings. The configuration of the genotype analyzer according to Example 3 is the same as the configuration shown in FIG.
  • FIG. 24 is a diagram showing a concept of processing for obtaining a fluorescence spectrum using a spectrum of electrophoresis performed on an actual sample.
  • Example 1 as shown in FIG. 13 and FIG. 16, the monochromatic peak time of each fluorescent dye is detected from the waveform of the fluorescence intensity of the allelic ladder, and the spectrum at the monochromatic peak time is determined for each fluorescent dye.
  • the monochromatic peak time is detected from the waveform of the fluorescence intensity obtained by electrophoresis on the actual sample to be measured in each capillary, and the spectrum at the monochromatic peak time is determined as the fluorescence spectrum of each fluorescent dye.
  • the single color peak times, T (F), T (V (5) of the five fluorescent dyes, 6FAM, VIC, NED, PET, and LIZ. ), T (N), T (P), and T (L) are extracted. At each time, only one fluorescent dye has a peak, and such time may be detected.
  • a pseudo peak may appear at the same peak position as the main peak in addition to the main peak of a certain fluorescent color (see FIG. 30).
  • This pseudo peak can be caused by the overlap of the fluorescence spectra of the respective colors, and when the initial matrix is not appropriate, the influence due to the overlap is greatly observed. Further, when there are a plurality of main peaks, this pseudo peak is observed in all the main peaks.
  • C1 The difference between the peak time (T1) of the main peak and the peak time (T2) of the pseudo peak is within a predetermined time difference (that is, T1 ⁇ T2) (FIG. 32 (a )).
  • C2) The peak height (H1) of the main peak, the peak height (H2) of the pseudo peak, and the ratio (H1 / H2) thereof are within a predetermined range (FIG. 32 ( b)).
  • C3 There are at least a predetermined number of main peak and pseudo peak patterns satisfying the above (FIG. 32 (c)).
  • C4 There is no main peak alone (FIG. 32 (c)).
  • Example 3 a pseudo peak pattern satisfying the above conditions is searched for in a time-series fluorescence intensity waveform, and the fluorescence spectrum is obtained using the time of the pseudo peak as the above-described monochromatic peak time.
  • Example 3 after determining whether or not a desired monochromatic peak time has been detected from an actual sample, a fluorescence spectrum is obtained using the spectrum of the actual sample only when a monochromatic peak exists.
  • FIG. 25 shows a process flow of the genotype analyzer according to the third embodiment.
  • electrophoresis is performed on the capillaries of all samples including the allelic ladder and the control sample. This electrophoresis process is the same as the electrophoresis process in Example 1 (step 601 in FIG. 6).
  • step 2502 the fluorescence intensity is calculated based on the spectrum data of the obtained electrophoresis result.
  • This process is the same as the fluorescence intensity calculation process (step 602 in FIG. 6) in Example 1, and the fluorescence intensity waveform of each fluorescent dye is obtained according to the calculation of (Equation 1) using the initial matrix M. be able to.
  • step 2503 peak detection processing is performed on the fluorescence intensity waveform obtained in step 2502.
  • This process is the same as the peak detection process (step 603 in FIG. 6) in the first embodiment, and a known technique such as Gaussian fitting can be used.
  • a reference fluorescence spectrum is acquired. This process is the same as the reference fluorescence spectrum acquisition process (step 605 in FIG. 6) in the first embodiment.
  • the capillary including the allelic ladder is used as the reference capillary to detect the monochromatic peak time in the reference capillary and the reference fluorescence. Acquire the spectrum.
  • the reference fluorescence spectrum may be further corrected by comparison with the ideal fluorescence spectrum (see FIG. 21). If the reference fluorescence spectrum is not obtained because the monochromatic peak time is not detected in the reference capillary, the process proceeds to step 2506a.
  • Step 2506a a monochromatic peak time is detected in a capillary (capillary other than the reference capillary) containing the actual sample, and it is determined whether or not this peak is a desirable monochromatic peak for obtaining a fluorescence spectrum, that is, Judgment of presence or absence of pseudo peak.
  • criteria for determining whether or not a monochromatic peak is desirable for obtaining a fluorescence spectrum include (1) the degree of overlap with other fluorescent dyes and (2) peak height.
  • the determination criterion based on the degree of overlap with other fluorescent dyes in (1) above may be based on whether the fluorescence intensity of the other fluorescent dyes at the peak time is sufficiently small. In addition, it is desirable to be separated from the peak time of other fluorescent dyes as much as possible.
  • the standard for determining the peak height in (2) above has a reasonably large intensity of the monochromatic peak. Also, peaks whose peak height is too large and exceeds the dynamic range of the optical detection system should be excluded. Therefore, an upper limit value and a lower limit value of the allowable range of the intensity of the monochromatic peak should be set in advance, and a peak time that falls within this allowable range should be used.
  • step 2506a when there is a monochromatic peak time that satisfies both of the determination criteria (1) and (2) (when there is a pseudo peak), the spectrum at that peak time is acquired. This may be a fluorescence spectrum (step 2507).
  • step 2506a when there is no monochromatic peak time that satisfies both of the determination criteria (1) and (2) (when there is no pseudo peak), the process proceeds to step 2506b, and the reference in step 2505
  • the process proceeds to step 2508, and the same process as the fluorescence spectrum calculation process described in step 606 of FIG. That is, from the size standard spectrum of the reference fluorescence spectrum in the reference capillary and the waveform of the size standard spectrum in the other capillary, the shift amount of the spectrum in the other capillary from the reference fluorescence spectrum is calculated as shown in FIGS. 19A and 19B.
  • the fluorescence spectrum of the other capillary is calculated by shifting the reference fluorescence spectrum by the shift amount (step 2509).
  • the reference fluorescence spectrum in step 2508 may be the fluorescence spectrum of the allelic ladder and the size standard as in Example 1, or the fluorescence spectrum acquired from the actual sample and the size standard already exists in other capillaries. In this case, this may be replaced with a reference fluorescence spectrum. Further, the above-described initial fluorescence spectrum (assumed to be stored in the storage unit 104) may be used as the reference fluorescence spectrum.
  • a reference fluorescence spectrum can be acquired in step 2505. If there is no reference fluorescence spectrum, or if it is not related to the presence or absence of the above-mentioned reference fluorescence spectrum, the process proceeds to path 2513, the calculation of the new matrix M is not performed, and the fluorescence to which the initial matrix is applied. STR analysis may be performed on the intensity waveform.
  • step 2510 matrix calculation processing is performed.
  • This process is the same as the matrix calculation process in the first embodiment (step 607 in FIG. 6), and the matrix M is calculated by (Expression 2) and (Expression 3) based on the obtained fluorescence spectrum. Similar to step 607, the reliability of the matrix M is evaluated by (Equation 5). If the reliability of the matrix M is low, the process proceeds to the path 2513 without using the matrix M, and the initial matrix is applied. STR analysis may be performed on the fluorescence intensity waveform.
  • step 2511 fluorescence intensity calculation processing is performed. This process is the same as the fluorescence intensity calculation process in Example 1 (step 608 in FIG. 6). By multiplying the spectrum at each time by the matrix M according to (Equation 1), the fluorescence of each fluorescent dye is calculated. Get the intensity waveform.
  • step 2512 STR analysis is performed.
  • This process is the same as the STR analysis process (step 609 in FIG. 6) in the first embodiment.
  • the peak detection process step 2001
  • the Size Calling process step 2002
  • the Allele By performing the calling process (step 2003), alleles for all loci are obtained, and the combination pattern of these alleles becomes genotype information for personal identification.
  • the monochromatic peak is not used by shifting from the reference fluorescence spectrum but using the spectrum of electrophoresis performed on the actual sample in each capillary.
  • Spectral calibration is performed by detecting a fluorescence spectrum based on the detected fluorescence spectrum.
  • the genotyping apparatus according to Example 3 of the present invention does not use the reference fluorescence spectrum, spectral calibration is performed using the electrophoretic results for the actual sample even for genotype analysis without using the allelic ladder. It can be carried out.
  • Example 4 A genotype analyzer according to Example 4 of the present invention will be described.
  • the reference fluorescence spectrum was acquired in the reference capillary, and the fluorescence spectrum in each capillary was calculated by shifting the reference fluorescence spectrum for other capillaries.
  • the monochromatic peak time was detected by using the electrophoresis spectrum of the actual sample in each capillary, and the fluorescence spectrum was obtained.
  • the fluorescence spectrum was calculated by shifting the reference fluorescence spectrum as in Example 1 or Example 2.
  • the shift amount of the reference fluorescence spectrum was calculated using the size standard spectrum. That is, as described above in FIGS. 19A and 19B, the shift amount of the wavelength between both spectra was calculated from the spectrum of the size standard in the reference capillary and the spectrum of the size standard in the other capillaries.
  • a peak pattern of the Raman spectrum in a state where only the electrophoresis medium is filled in the capillary is used before the electrophoresis. The shift amount is calculated.
  • FIG. 26 is a diagram showing a processing flow of the genotype analyzer in Example 4. Hereinafter, the processing of steps 2601 to 2611 shown in FIG. 26 will be described.
  • Step 2601 In the genotype analyzer in Example 4, a Raman spectrum is acquired before electrophoresis (step 2601).
  • a light source 514 used in an actual electrophoresis process detects Raman scattered light generated by irradiating a capillary filled with an electrophoretic medium by an optical detector 515, and a captured image. Get. This captured image is similar to the image obtained in FIG. 2, and a Raman spectrum in each capillary can be obtained.
  • FIG. 27 shows an example of a Raman spectrum in a certain capillary.
  • the shape of the Raman spectrum depends on the wavelength of the light source and the electrophoresis medium, and is common to all capillaries. However, a shift in the wavelength direction may occur depending on the positional relationship between the capillaries and the detector.
  • Step 2602 Therefore, by calculating the shift amount in the wavelength direction of the shape of the Raman spectrum between the capillaries, this is set as the shift amount of the reference fluorescence spectrum.
  • the same method as the shift amount calculation processing from the reference capillary in the first embodiment (step 1703 in FIG. 17) can be used. That is, as described above, after interpolating data for each Raman spectrum by a known technique such as spline interpolation, the cross-correlation function of the two spectra may be calculated to obtain the shift amount that maximizes the value. .
  • the above-described Gaussian fitting may be performed on each Raman spectrum. That is, in the Raman spectrum, since the wavelength of the light source and the migration medium are both known, the number of peaks in the Raman spectrum, the peak wavelength, the individual signal intensity ratio, and the like are obtained by measuring in advance.
  • the individual peak wavelength can be obtained.
  • a plurality of such peak wavelengths may be obtained for the Raman spectra in all capillaries, and the shift amount of each peak wavelength between the capillaries may be calculated.
  • Step 2603 Next, electrophoresis is performed on the actual sample. This process is the same as the electrophoresis process (FIG. 7) in Example 1. However, the electrophoresis medium filling process (step 703) in the figure may be omitted because the electrophoresis medium is already filled in the Raman spectrum acquisition process (step 2601).
  • Step 2604 Next, the fluorescence intensity is calculated based on the obtained spectrum data of the electrophoresis result. This process is the same as the fluorescence intensity calculation process (step 602 in FIG. 6) in Example 1, and the fluorescence intensity waveform of each fluorescent dye is obtained according to the calculation of (Equation 1) using the initial matrix M. be able to.
  • Step 2605 Next, peak detection processing is performed on the fluorescence intensity waveform obtained in Step 2604. This process is the same as the peak detection process (step 603 in FIG. 6) in the first embodiment, and a known technique such as Gaussian fitting can be used.
  • Step 2607 Next, a reference fluorescence spectrum is acquired. This process is the same as the reference fluorescence spectrum acquisition process (step 605 in FIG. 6) in the first embodiment.
  • the capillary including the allelic ladder is used as the reference capillary to detect the monochromatic peak time in the reference capillary and the reference fluorescence. Acquire the spectrum. Further, as described in Example 2, the reference fluorescence spectrum may be further corrected by comparison with the ideal fluorescence spectrum (see FIG. 21).
  • the above-described initial fluorescence spectrum (storage unit 104) in the reference capillary is described above. May be used as a reference fluorescence spectrum. Or it progresses to the path 612 and you may perform STR analysis using the fluorescence intensity waveform to which the initial matrix was applied.
  • Step 2608 Next, the fluorescence spectrum is calculated. This process is the same as the fluorescence spectrum calculation process (step 606 in FIG. 17) in the first embodiment. However, for the calculation of the shift amount, the shift amount obtained in step 2602 is used without using the spectrum of the size standard as shown in FIG. 19A. Then, the fluorescence spectrum of capillaries other than the reference capillary is calculated by shifting the reference fluorescence spectrum by the shift amount. However, if the above shift amount cannot be obtained correctly because the signal intensity of the Raman spectrum is low in step 2602, the shift amount can be obtained from the size standard spectrum as in step 606 of the first embodiment. Good.
  • step 2602 If the shift amount is not obtained from step 2602 and the shift amount is not obtained from the size standard (because there is no monochromatic peak time of LIZ due to noise or the like), the process proceeds to path 2612. A new matrix may not be calculated, and the STR analysis may be performed using a fluorescence intensity waveform to which the initial matrix is applied.
  • Step 2609 Thereafter, matrix calculation processing is performed. This process is the same as the matrix calculation process in the first embodiment (step 607 in FIG. 6), and the matrix M is calculated by (Expression 2) and (Expression 3) based on the obtained fluorescence spectrum. Similar to step 607, the reliability of the matrix M is evaluated by (Equation 5). If the reliability of the matrix M is low, the process proceeds to the path 2612 without using the matrix M, and the initial matrix is applied. STR analysis may be performed on the fluorescence intensity waveform.
  • Step 2610 Thereafter, a fluorescence intensity calculation process is performed. This process is the same as the fluorescence intensity calculation process in Example 1 (step 608 in FIG. 6). By multiplying the spectrum at each time by the matrix M according to (Equation 1), the fluorescence of each fluorescent dye is calculated. Get the intensity waveform.
  • Step 2611 Then, STR analysis is performed. This process is the same as the STR analysis process (step 609 in FIG. 6) in the first embodiment. As described in FIG. 20, the peak detection process (step 2001), the Size Calling process (step 2002), and the Allele By performing the calling process (step 2003), alleles for all loci are obtained, and the combination pattern of these alleles becomes genotype information for personal identification.
  • the genotype analyzer according to Example 4 of the present invention when obtaining the shift amount from the reference fluorescence spectrum, not the size standard spectrum, but the Raman spectrum measured before electrophoresis It is characterized by using. This makes it possible to obtain the shift amount obtained from the Raman spectrum even when the peak value of the fluorescence intensity of the size standard is small or a monochromatic peak cannot be obtained due to superimposition with other fluorescent dye signals. By using this, it is possible to calculate the fluorescence spectrum of each capillary by shifting from the reference fluorescence spectrum.
  • Example 4 when the Raman spectrum is used as an alternative to the size standard spectrum, the condition of the size standard spectrum as the condition should be carefully determined. That is, if the quality of the fluorescence intensity data of the size standard in the specific capillary is extremely deteriorated, there is a possibility that Size ⁇ ⁇ Calling may not be performed properly, so that the accuracy of the result of the STR analysis itself deteriorates. It is considered that the STR analysis itself should be stopped for the capillary in such a situation. For this reason, when Example 4 is applied, conditions under which the Raman spectrum should be used should be determined within a range in which the quality of Size Calling is not lowered. Alternatively, the shift amount may always be calculated according to the fourth embodiment regardless of the quality of the size standard.
  • a genotype analyzer according to Example 5 of the present invention will be described.
  • the fluorescence spectrum was obtained in each capillary using the spectrum of electrophoresis performed on the actual sample. At that time, a time at which a pseudo peak in a single fluorescent color can be observed was searched from a fluorescence intensity waveform obtained from an actual sample, and a fluorescence spectrum was obtained using this time as a monochromatic peak time.
  • Example 3 when the above-described monochromatic peak time is not observed, the capillary for performing electrophoresis on the allelic ladder is used as the reference capillary, as in the genotype analyzer according to Example 1 or Example 2.
  • the reference fluorescence spectrum in the reference capillary was obtained. Then, the shift amount between the reference fluorescence spectrum and the spectrum other than the reference capillary is obtained, and by shifting the reference fluorescence spectrum by this amount, the fluorescence spectrum in all capillaries other than the reference capillary is obtained, and the matrix M of all capillaries is calculated. did.
  • Example 3 since the fluorescence spectrum of each capillary is obtained by shifting from the reference fluorescence spectrum in the reference capillary, it is not assumed that the shape of the fluorescence spectrum changes between capillaries. . Actually, the shape of the fluorescence spectrum may be slightly different due to some factor of the optical system or the measurement system.
  • the gene analyzer according to Example 5 is characterized in that, as a modification of Example 3, the fluorescence spectrum is obtained only from the fluorescence intensity waveform in each capillary without obtaining the reference fluorescence spectrum by the allelic ladder.
  • FIG. 31 is a diagram showing a processing flow of the genotype analyzer in Example 5. Hereinafter, the processing of steps 3101 to 3107 shown in FIG. 31 will be described.
  • step 3101 electrophoresis is performed on the actual sample. This process is the same as the electrophoresis process (FIG. 7) in Example 1. In Example 5, the allelic ladder is handled in the same manner as the actual sample.
  • step 3102 the fluorescence intensity is calculated.
  • the calculation method of the fluorescence intensity is the same as that in Example 1.
  • step 3102 is the first fluorescence intensity calculation, the calculation is performed using the initial matrix as in the first embodiment. That is, it is assumed that the initial matrix and the fluorescence spectrum for obtaining the initial matrix are obtained in advance by measurement, and the fluorescence intensity waveform of each fluorescent color is calculated by (Equation 1) using this initial matrix.
  • step 3102 is the second and subsequent fluorescence intensity calculations, that is, if the matrix calculation according to this embodiment has already been performed, the previously calculated matrix (step 3106 described later) is used to The fluorescent intensity waveform of each fluorescent color may be calculated according to 1).
  • step 3103 peak detection is performed on the fluorescence intensity waveform of each fluorescent color. This process is the same as that in the first embodiment (step 603 in FIG. 6).
  • step 3104 the presence or absence of a pseudo peak is determined.
  • the pseudo peak is located at the same peak position as the main peak with respect to the main peak of a certain fluorescent color. May appear. Therefore, in step 3104, such a pseudo peak in each fluorescent color is searched from the peaks detected in step 3103.
  • a fluorescence spectrum corresponding to the matrix used in step 3102 is adopted. That is, this process corresponds to replacing a column vector in the fluorescence spectrum matrix S of (Equation 2) corresponding to the initial matrix with a spectrum at the pseudo peak time.
  • the fluorescence spectrum is deemed appropriate and the spectrum of the fluorescent color is not changed. If no pseudo peak is detected in all fluorescent colors, the matrix used in step 3102 is adopted as the final matrix, and the process proceeds to STR analysis in step 3107.
  • the processing contents of the STR analysis in step 3107 are the same as those in the first embodiment.
  • Step 3104 when a pseudo peak is detected in one or more fluorescent colors, the process proceeds to Step 3105, and a fluorescence spectrum is acquired.
  • step 3105 The processing in step 3105 is the same as that in the third embodiment, and the time when the pseudo peak exists is set as a monochromatic peak time, and in step 3105, the measurement spectrum at this time is set as the fluorescence spectrum of the fluorescent color.
  • step 3106 a matrix is calculated from the obtained fluorescence spectrum by (Equation 3). This process is the same as in the first embodiment. Thereafter, the process returns to step 3104 using the obtained matrix, and the pseudo peak determination (step 3104) is performed again through the above-described fluorescence intensity calculation (step 3102) and peak detection (step 3103). By repeating such processing until no pseudo peak is detected, the matrix is updated.
  • a matrix in which the pseudo peak is not detected can be usually obtained by repeating the above process a predetermined number of times. However, if the search for the pseudo peak is not appropriate, the pseudo peak may be detected even if the above process is repeated. In preparation for such a case, an initial matrix is adopted in which an upper limit is actually set for the number of repetitions described above, and when the number of repetitions reaches the upper limit, for example, a matrix having the lowest pseudo peak level is adopted. It is desirable to perform processing such as adopting
  • means for changing the pseudo peak determination condition and calculating the matrix again may be provided by the user interface unit 103.
  • Examples of such conditions for determining the pseudo peak include the ratio of the height of the pseudo peak to the height of the main peak as described in Example 3, and the maximum of each of the heights of the main peak and the pseudo peak. Examples include a value and a minimum value, a time difference between the time of the main peak and the time of the pseudo peak, the number of times the matrix is repeated.
  • FIG. 3 An example of such a presentation form is shown in FIG. This figure shows an example in which an area (3302) in which the fluorescence intensity waveforms of the respective fluorescences are superimposed and an area (3303) for setting the above-described pseudo peak determination condition value are presented on the screen (3301).
  • the user may set these values using an input means (for example, a mouse pointer or a keyboard) not shown in the user interface unit 103.
  • the automatic calculation result (3304) of the single color peak time by the pseudo peak determination as described above is confirmed on the screen (3301), and the single color peak time of each color can be manually changed as necessary. I have to. In this way, if the monochromatic peak time can be confirmed and changed by the user, a more stable matrix can be obtained.
  • the genotype analyzer according to Example 5 of the present invention instead of shifting from the reference fluorescence spectrum, the monochromatic peak is used in each capillary using the spectrum of electrophoresis performed on the actual sample. Spectral calibration is performed by detecting a fluorescence spectrum based on the detected fluorescence spectrum. At this time, a more appropriate matrix can be obtained by searching for a pseudo peak in the actual sample and repeatedly calculating a matrix in which the pseudo peak is not detected.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiments, and appropriate modifications are allowed within the scope of the gist of the present invention.
  • a microchip type electrophoresis apparatus in which a sample channel is formed may be used.
  • the capillary in this specification may be read as a flow path.
  • the present invention can be similarly applied to an electrophoresis apparatus using a slab gel.
  • the present invention can also be realized by a program code of software that realizes the functions of the embodiments.
  • a storage medium in which the program code is recorded is provided to the system or apparatus, and the computer (or CPU or MPU) of the system or apparatus reads the program code stored in the storage medium.
  • the program code itself read from the storage medium realizes the functions of the above-described embodiments, and the program code itself and the storage medium storing it constitute the present invention.
  • a storage medium for supplying such program code for example, a flexible disk, CD-ROM, DVD-ROM, hard disk, optical disk, magneto-optical disk, CD-R, magnetic tape, nonvolatile memory card, ROM Etc. are used.
  • an OS operating system
  • the computer CPU or the like performs part or all of the actual processing based on the instruction of the program code.
  • the program code is stored in a storage means such as a hard disk or memory of a system or apparatus, or a storage medium such as a CD-RW or CD-R
  • the computer (or CPU or MPU) of the system or apparatus may read and execute the program code stored in the storage means or the storage medium when used.
  • the configuration requirements of the present invention that can be grasped from the above embodiment are as follows.
  • a genotype analysis method for calculating the fluorescence intensity of each DNA sample labeled with a fluorescent dye a reference fluorescence spectrum of a plurality of fluorescent dyes is obtained based on the spectrum obtained by electrophoresis of the DNA sample, and the reference
  • a genotype analysis method characterized by obtaining a fluorescence spectrum of each channel by shifting a fluorescence spectrum in a wavelength direction.
  • the reference fluorescence spectrum is extracted from a spectrum of a sample containing a DNA fragment of a known length, and a spectrum due to emission of a single fluorescent dye is extracted.
  • Method. (3) A genotype analysis method according to (1), wherein the ideal fluorescence spectrum measured in advance is used as the reference fluorescence spectrum. (4) The genotype analysis method according to (2), wherein the reference fluorescence spectrum is corrected with reference to a previously measured ideal fluorescence spectrum. (5) The gene according to (1), wherein the reference fluorescence spectrum is obtained by extracting a spectrum due to emission of a single fluorescent dye from a spectrum of an actual sample which is a target of genotype analysis. Type analysis method.
  • any one of the above (1) to (5) by extracting a single fluorescence spectrum of the fluorescent dye that labels the size standard in each channel, the wavelength direction of the fluorescence spectrum between the channels A genotype analysis method characterized by obtaining a shift amount and shifting the reference fluorescence spectrum by the shift amount.
  • (7) in any one of the above (1) to (5), by measuring a Raman spectrum in each flow channel, a shift amount in the wavelength direction of the fluorescence spectrum between the flow channels is obtained, and only the amount of the shift amount A method for genotyping, characterized in that the reference fluorescence spectrum is shifted.
  • An electrophoretic device comprising, and a data analysis device for exchanging information with the electrophoretic device,
  • a DNA sample having DNA fragments labeled with a plurality of fluorescent dyes is put into the flow channel array, and excitation light is emitted from the light source to the flow channel array while moving the DNA fragments in the flow channel array using a voltage source.
  • the light emitted from the flow channel array by the irradiation is dispersed to form a spectrum on the photodetector.
  • the reference fluorescence spectrum of a plurality of fluorescent dyes is based on the imaged spectrum.
  • a genotype analyzer characterized in that the fluorescence spectrum of each channel is obtained by shifting the reference fluorescence spectrum in the wavelength direction.

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Abstract

　手間と費用が掛る特別なマトリクススタンダードを用いて電気泳動を行うことなく、実際の解析対象サンプルの電気泳動と同時にスペクトラルキャリブレーションを実現する技術を提供する。遺伝子型解析装置において、実際のサンプルの電気泳動の際に使用される既知のＤＮＡ断片情報である、サイズスタンダードとアレリックラダーとを用いて基準蛍光スペクトルを得ることを特徴とし、アレリックラダーを用いないキャピラリに対しては、サイズスタンダードの蛍光スペクトルのシフト量を検出し、このシフト量を用いて基準蛍光スペクトルをシフトさせることで蛍光スペクトルを計算することで、スペクトルキャリブレーションを行うことを特徴とする。

Description

遺伝子型解析装置及び遺伝子型解析方法
　本発明は、電気泳動を用いた遺伝子型解析装置及びその解析方法に関する。
　ＤＮＡ多型の解析によるＤＮＡ鑑定が現在、犯罪捜査や血縁関係の判定などの目的で広く行われている。同じ種の生物のＤＮＡはほぼ似通った塩基配列を有するが、一部の箇所では異なった塩基配列を有している。このように個体間でＤＮＡ上の塩基配列に多様性が見られることをＤＮＡ多型とよび、遺伝子レベルでの個体差の形成に関わる。
　ＤＮＡ多型の形態の一つとしてShort Tandem Repeat（ＳＴＲ）、もしくはマイクロサテライトがある。ＳＴＲとは、２塩基から７塩基長程度の短い配列が数回から数十回反復されるような特徴的な配列パターンのことであり、この反復回数が個体によって異なることが知られている。特定の遺伝子の座位におけるＳＴＲの反復回数の組み合わせを解析することをＳＴＲ解析と呼ぶ。
　犯罪捜査などを目的としたＤＮＡ鑑定においては、ＳＴＲの反復回数の組み合わせが個体間で異なる性質を利用したＳＴＲ解析が用いられている。ＦＢＩ（米国連邦捜査局）や国際刑事警察機構では、ＤＮＡ鑑定に用いるＳＴＲの座位（ローカス）をＤＮＡマーカとして十～十数個定義し、これらのＳＴＲの配列の反復回数のパターンを解析する。このＳＴＲの反復回数の違いはアレル（対立遺伝子）の違いによって出現するものであるため、以降、個々のＤＮＡマーカにおけるＳＴＲの反復回数をアレルと記す。
　ＤＮＡマーカとして用いられるＳＴＲの箇所のＤＮＡを一定量抽出するために、ＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)が行われる。ＰＣＲは、ターゲットのＤＮＡの両端において、プライマ配列と呼ばれる一定の塩基配列を指定することで、プライマ配列の間にはさまれるＤＮＡ断片のみを繰り返し増幅することにより、一定量のターゲットＤＮＡのサンプルを取得する技術である。
　ＰＣＲにより得られたターゲットＤＮＡ断片の断片長を計測するために電気泳動が行われる。電気泳動とは、ＤＮＡ断片の長さによって、荷電された泳動路における泳動速度が異なる（長いＤＮＡ断片ほど泳動速度が小さい）ことを利用したＤＮＡ断片の分離方法である。電気泳動の手法としては、泳動路としてキャピラリを用いたキャピラリ電気泳動が近年多く用いられている。
　キャピラリ電気泳動では、キャピラリと呼ばれる細い管にゲル等の泳動媒体を充填し、このキャピラリ内でサンプルのＤＮＡ断片を泳動させる。そしてサンプルが一定距離（通常はキャピラリの端から端まで）だけ泳動し終えるまでに要した時間を計測することで、ＤＮＡ断片長を調べる。各サンプル、すなわち各ＤＮＡ断片は蛍光色素で標識されており、キャピラリ終端部に置かれた光学検出器により、泳動されたサンプルの蛍光シグナルを検出する。
　ＤＮＡ断片を標識する各蛍光色素はそれぞれ異なるスペクトルを有しているが、それらはシャープではなく、各々の蛍光色素同士が重なりをもっている。よってキャピラリ終端部における光学検出器において、異なる蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片が同程度の断片長をもつ場合には、光学検出器で得られるスペクトルは、異なる蛍光色素のスペクトル（以降、蛍光スペクトル）の線形和、すなわち重みづけ和となる。よって、各々の蛍光色素の信号強度を求めるためには、光学検出器で得られるスペクトルから、このスペクトルを構成する各蛍光色素のスペクトルの線形係数、すなわち重み値を求めればよい。この重み値が各蛍光色素の信号強度に相当する。
　この蛍光色素の信号強度を求めるためには、各蛍光スペクトルが予め既知でなければならない。各蛍光スペクトルは、本来は装置に係りなく蛍光色素や泳動媒体によって一元的に決められるものであるが、実際の装置では、キャピラリと蛍光シグナル検出器の位置関係によって、光学検出器に結像される蛍光スペクトルがシフトする。このため、キャピラリの交換の際には、ターゲットサンプルを電気泳動にかける前に、予め蛍光スペクトルを求め、蛍光スペクトルの位置を調整するキャリブレーション（以降、スペクトラルキャリブレーション）が必要となる。なお、キャピラリを複数並べたキャピラリアレイを用いて、複数サンプルに対して同時に電気泳動を行う場合には、各々のキャピラリに対して蛍光スペクトルを求めておく必要がある。
　次に、従来技術におけるスペクトラルキャリブレーションの一例を、図２から図３を参照して説明する。
  図２は、キャピラリ終端部に設置された上記の光学検出器に結像される画像の例を示す図である。キャピラリ終端部に特定の波長のレーザ光を照射して得られる各蛍光色素の励起光を、回折格子によって波長方向に分離された画像をＣＣＤ等の撮像素子にて検出する。同図はキャピラリ（１）～（８）が８本並べられたキャピラリアレイに対してレーザ光を照射したときの回折格子像である（図中の下段）。同図（下段）は、縦軸がキャピラリの配列方向、横軸が波長方向を示し、同図（上段）は、下段に示すキャピラリ（４）のＡ－Ａ’方向に対応する信号強度を示す図である。同図（上段）は、縦軸に信号強度を表わす輝度値を取り、横軸に波長を取った時の信号強度分布を示している。同図（上段）で示されるように、特定のキャピラリにおけるスペクトルは、そのキャピラリにおける信号強度を縦軸、波長を横軸とするような波形として得ることができる。
　なお、図２では回折格子を用いて連続的（実際は画素毎に離散的）はスペクトルを計測した例を示しているが、実用においては、上記のスペクトルをさらに広い波長間隔でサンプリングしたデータであってもよい。例えば、同図に示すように、各キャピラリに対し、２０個の波長λ（０）～λ（１９）における輝度値のみを取得してもよい。また上記λ（０）～λ（１９）のそれぞれの波長の近傍の輝度値の加算平均をとってもよい。
　また、回折格子を用いずに、各蛍光色素に対して最も感度の高い波長帯域のみをろ過するフィルタを高速に切り換えて撮像してもよい。もしくは蛍光色素の数だけ、撮像素子と、その各蛍光色素に対応するフィルタとを備え、同時に各蛍光色素を撮像してもよい。このような場合は、同図のスペクトルにおいて、各蛍光色素に対応するサンプル位置にてスペクトルをサンプリングしたことに相当するため、以降の本発明の手段が同様に適用できる。
　図３は、スペクトラルキャリブレーションの処理フローを示す図である。ステップ３０１において、マトリクススタンダードと呼ばれるサンプルを電気泳動にかける。マトリクススタンダードとは、蛍光スペクトルを取得し、後述するマトリクスを得る目的で電気泳動を行うための試薬である。
　ここで図４Ａ，４Ｂを用いて、マトリクススタンダードの概要を説明する。図４Ａ，４Ｂでは５種類の蛍光色素（LIZ、PET、NED、VIC、6FAM）の蛍光スペクトルを得ることを想定している。図４Ａでは、縦軸に蛍光強度を取り、横軸に時刻を取っていて、前記の５種類の蛍光色素が、それぞれの蛍光色素に対応した時刻に鋭いピーク値を示している。従って、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルを得るためには、その蛍光色素のみが発光している時刻（図４Ａでは、t0,t1,t2,t3,t4）におけるスペクトルを取得すればよい。そこでマトリクススタンダードでは、長さの異なる５種類のＤＮＡ断片がそれぞれ異なる蛍光色素で標識されている。各々の蛍光色素に対応するＤＮＡ断片の長さ、もしくは長さの順序の情報は既知である。
　次にステップ３０２において、ステップ３０１の電気泳動で得られる各時刻のスペクトルから各蛍光色素の強度を計算する。この処理の詳細は後述する。この処理は各々のスキャン時刻に対して行ってもよいし、一定の時間間隔分のスペクトルデータを蓄積した後に行ってもよい。得られる蛍光強度の波形の例を、図４Ａに示す。
　図４Ａでは、スキャン時刻を横軸とした各蛍光色素の信号強度（以下、蛍光強度と称する）波形を一つのグラフに重ねた様子を示している。蛍光強度波形にはピークが見られ、このピーク時刻がＤＮＡ断片長に相当する。上で述べたように、マトリクススタンダードには、長さの異なるＤＮＡ断片に対してそれぞれ異なる蛍光色素で標識されているため、各ピーク時刻（t0,t1,t2,t3,t4）では各蛍光色素が単独で発光している。
　そこで、ステップ３０３において、図４Ａの蛍光強度（信号強度）波形のピーク時刻を検出する。このピーク検出処理については後述する。図４Ａでは、ピーク時刻t0、t1、t2、t3、t4が得られた様子を示している。前述のように、各々の蛍光色素に対応するピーク時刻の出現順序が既知であることから、各々のピーク時刻に対応する蛍光色素の種類が同定できる。同図では、時刻t0ではLIZが、時刻t1ではPETが、時刻t2ではNEDが、時刻t3ではVICが、時刻t4では6FAMがそれぞれ単独で発光している様子を示している。つまり、各々の時刻のスペクトルが、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルに相当する。よって、各々のピーク時刻のスペクトルを取得すればよい（図４Ｂ参照）。
　そして、ステップ３０４において、この各蛍光スペクトルを用いて、後述するマトリクスを計算する。このマトリクスは、検出器で得られるスペクトル波形から各々の蛍光色素の強度を得るためのマトリクスである。このマトリクスを計算する処理を、スペクトラルキャリブレーションと呼ぶ。キャピラリが複数本ある場合には、各々のキャピラリに対してこのマトリクスを計算する必要がある。また、このスペクトラルキャリブレーションは、キャピラリ設置や部品交換などを行う度に行う必要がある。
ＵＳ２００９／０２２８２４５明細書
　しかし、上記の従来技術のスペクトラルキャリブレーションでは、実際の解析対象のサンプルの電気泳動を行う前に、マトリクススタンダードに対して別途電気泳動を行う必要があるため、手間や時間がかかるという問題があった。またマトリクススタンダードが消耗品として必要であるため、装置使用者にとっては価格が増してしまうという問題があった。
　そこで、本発明の目的は、手間と費用が掛る特別なマトリクススタンダードを用いて電気泳動を行うことなく、実際の解析対象サンプルの電気泳動と同時にスペクトラルキャリブレーションを実現する技術を提供するものである。
　上記課題を達成する手段として、本発明の遺伝子型解析装置では、実際のサンプルの電気泳動の際に使用される既知のＤＮＡ断片情報である、サイズスタンダードとアレリックラダーとを用いて基準蛍光スペクトルを得ることを特徴とする。
　そして、アレリックラダーを用いないキャピラリに対しては、サイズスタンダードの蛍光スペクトルのシフト量を検出し、このシフト量を用いて基準蛍光スペクトルをシフトさせることで蛍光スペクトルを計算することで、スペクトルキャリブレーションを行うことを特徴とする。
　また、アレリックラダーを用いないキャピラリに対しては、上記のシフト量を用いずに、実際のサンプルの電気泳動の結果を直接用いて、スペクトルキャリブレーションを行うことを特徴とする。
　本発明によれば、特別なマトリクススタンダードを用いて電気泳動を行う必要がなくなるため、短時間かつ低コストでスペクトラルキャリブレーションを実現することができる。
実施例１による遺伝子型解析装置の概略構成を示す図である。 実施例１による電気泳動装置の光学検出器に結像される画像の例を示す図である。 従来技術によるスペクトラルキャリブレーションの処理フローを示す図である。 従来技術によるスペクトラルキャリブレーションの概要を説明するための図である。 従来技術によるスペクトラルキャリブレーションの概要を説明するための図である。 実施例１による電気泳動装置の概略構成を示す図である。 実施例１による遺伝子型解析装置の処理フローを示す図である。 実施例１による電気泳動処理フローを示す図である。 実施例１によるスペクトルデータの保存の例を示す図である。 アレリックラダーの蛍光強度波形の例を示す図である。 実サンプルの蛍光強度波形の例を示す図である。 ガウシアンフィッティングの概要を説明するための図である。 実施例１によるSize Callingの概要を説明するための図である。 実施例１によるSize Callingの概要を説明するための図である。 実施例１による基準蛍光スペクトルの取得の概要を説明するための図である。 実施例１による基準蛍光スペクトル取得処理のフローを示す図である。 アレリックラダーに含まれるアレル情報の一例を説明するための図である。 実施例１による単色ピーク時刻の抽出の一例を説明するための図である。 実施例１による蛍光スペクトル計算処理のフローを示す図である。 実施例１による基準蛍光スペクトルの一例を示す図である。 実施例１による蛍光スペクトル計算の概要を説明するための図である。 実施例１による蛍光スペクトル計算の概要を説明するための図である。 実施例１によるＳＴＲ解析の処理フローを示す図である。 実施例２による基準蛍光スペクトル取得の概要を説明するための図である。 実施例２による基準蛍光スペクトルの修正の一例を説明するための図である。 実施例２による基準蛍光スペクトルの修正における判定処理の一例を説明するための図である。 実施例３による蛍光スペクトル取得の概念を説明するための図である。 実施例３による遺伝子型解析装置の処理フローを示す図である。 実施例４による遺伝子型解析装置の処理フローを示す図である。 実施例４によるラマンスペクトルの一例を示す図である。 実施例１による計測スペクトルのベースライン信号の概念を説明するための図である。 実施例１による計測スペクトルの時系列データにおけるベースライン信号の概念を説明するための図である。 疑似ピークの概念を説明するための図である。 実施例５による遺伝子解析装置の処理フローを示す図である。 実施例５による遺伝子解析装置の疑似ピークの判定条件を説明するための図である。 実施例５による遺伝子解析装置のユーザインタフェース画面例を示す図である。
　本発明は、実際のサンプルの電気泳動と同時にスペクトラルキャリブレーションを実現する技術を提供するものである。
　以下、添付図面を参照して実施例について説明する。ただし、本実施例は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
　本発明の実施例１の遺伝子型解析装置の構成を図１に示す。遺伝子型解析装置１０１は、データ解析装置１１２と電気泳動装置１０５から構成される。データ解析装置１１２は、電気泳動の制御やデータ処理等を行う中央制御部１０２と、ユーザへの情報提示やユーザからの情報入力を行うユーザインタフェース部１０３と、データや装置の設定情報を格納する記憶部１０４とから構成される。
  中央制御部１０２は、サンプル情報設定部１０６と、電気泳動装置制御部１０８と、蛍光強度計算部１１０と、ピーク検出部１０７と、マトリクス計算部１０９と、ＳＴＲ解析部１１１とから構成される。各々の機能については後述する。
　図５は電気泳動装置１０５の概略図である。図５を参照して電気泳動装置１０５の構成について説明する。
　電気泳動装置１０５は、サンプルを光学的に検出するための検出部５１６、キャピラリを恒温に保つための恒温槽５１８、キャピラリ陰極端に様々な容器を搬送するための搬送機５２５、キャピラリに高電圧を加えるための高圧電源５０４、高圧電源から発せられる電流を検出するための第１電流計５０５、陽極側電極に流れる電流を検出するための第２電流計５１２、単数もしくは複数本のキャピラリ５０２により構成されるキャピラリアレイ５１７、キャピラリにポリマーを注入するためのポンプ機構５０３により構成される。
　キャピラリアレイ５１７は、複数本（例えば、８本）のキャピラリを含む交換部材であり、ロードヘッダ５２９、検出部５１６、及びキャピラリヘッドを含む。また、キャピラリに破損や品質の劣化が見られたとき、新品のキャピラリアレイに交換する。
  キャピラリは、内径数十～数百ミクロン、外形数百ミクロンのガラス管で構成され、強度を向上させるために表面をポリイミドでコーティングしている。ただし、レーザ光が照射される光照射部は、内部の発光が外部に漏れやすいように、ポリイミド被膜が除去された構造になっている。キャピラリ５０２の内部は、電気泳動時に泳動速度差を与えるための分離媒体が充填される。分離媒体は流動性と、非流動性の双方が存在するが、本実施例では流動性のポリマーを用いる。
　検出部５１６は、サンプルに依存した情報を取得する部材である。検出部５１６に光源５１４から励起光が照射されると、サンプルから情報光（サンプルに依存した波長を有する蛍光）が生じ、外部に放出される。この情報光は回折格子５３２によって波長方向に分光され、分光された情報光を光学検出器５１５により検出して、サンプルを分析する。
　キャピラリ陰極側端５２７は、それぞれ金属製の中空電極５２６を通して固定されており、キャピラリ先端が中空電極５２６から０．５ｍｍ程度突き出た状態になっている。また、キャピラリ毎に装備された中空電極はすべてが一体となってロードヘッダ５２９に装着される。さらに、すべての中空電極５２６は装置本体に搭載されている高圧電源５０４と導通しており、電気泳動やサンプル導入など電圧を印加する必要がある際に陰極電極として動作する。
　キャピラリ陰極端側５２７と反対側のキャピラリ端部（他端部）は、キャピラリヘッドにより一つに束ねられている。キャピラリヘッドは、ブロック５０７に耐圧気密で接続できる。そして、シリンジ５０６により、他端部からキャピラリ内に新規ポリマーが充填される。キャピラリ中のポリマー詰め替えは、測定の性能を向上するために測定ごとに実施される。
　ポンプ機構５０３は、シリンジ５０６とこのシリンジを加圧するための機構系で構成される。また、ブロック５０７はシリンジ５０６、キャピラリアレイ５１７、陽極バッファ容器５１０、およびポリマー容器５０９をそれぞれ連通させるための接続部である。
　光学検出部は、検出部５１６を照射するための光源５１４と、検出部５１６内の発光を検出するための光学検出器５１５、回折格子５３２で構成されている。電気泳動により分離されたキャピラリ中のサンプルを検出するときは、光源５１４でキャピラリの検出部５１６を照射し、検出部５１６からの発光を回折格子５３２で分光し、光学検出器５１５で検出する。
　恒温槽５１８は、恒温槽内を一定の温度に保つために、断熱材で覆われ、加熱冷却機構５２０により温度が制御される。また、ファン５１９が恒温槽内の空気を循環及び攪拌させ、キャピラリアレイ５１７の温度を位置的に均一かつ一定に保つ。
　搬送機５２５は、３つの電動モータとリニアアクチュエータを備えており、上下、左右、および奥行き方向の３軸に移動可能である。また、搬送機５２５の移動ステージ５３０には少なくとも１つ以上の容器を載せることができる。さらに移動ステージ５３０には電動のグリップ５３１が備えられており、各容器を掴むことや放すことができる。このため、バッファ容器５２１、洗浄容器５２２、廃液容器５２３及びサンプル容器５２４を必要に応じて、キャピラリ陰極端５２７まで搬送できる。尚、不必要な容器は、装置内の所定収容所に保管されている。
　電気泳動装置１０５は、データ解析装置１１２と通信ケーブルで接続された状態で使用される。オペレータは、データ解析装置１１２により、装置の保有する機能を制御し、装置内の検出器で検出されるデータを授受できる。
　図６を参照して、本実施例により遺伝子型解析装置の処理フローの概要を説明する。
  まず、ステップ６０１において解析対象の実サンプルの電気泳動処理を行う。
  次に、ステップ６０２において、電気泳動で得られたスペクトル波形データから各蛍光色素の蛍光強度を計算する。
  そしてステップ６０３において、蛍光強度の波形からピークを検出する。
  次に、ステップ６０４において、得られたピーク時刻とサイズスタンダードの既知のＤＮＡ断片長の情報とのマッピングをとることで、時刻とＤＮＡ断片長との対応関係を得る。この処理をSize Callingと呼ぶ。
  その後、ステップ６０５において、基準キャピラリにおける蛍光スペクトルを取得する。ここで、基準キャピラリとは後述するアレリックラダーへ電気泳動が行われるキャピラリを意味する。
  次に、ステップ６０６において、その他のキャピラリの蛍光スペクトルを計算する。
  その後、ステップ６０７において、得られた蛍光スペクトルを用いてマトリクスを計算する。
  そしてステップ６０８において、得られたマトリクスを用いて各蛍光色素の蛍光強度を計算する。
  その後ステップ６０９にて、得られた蛍光強度データを用いてＳＴＲ解析を行う。
　なお、図６で示す処理フローに示すステップ６１０は、途中のステップを飛ばして直接にステップ６０９へ進み、ＳＴＲ解析する場合もあることを示す。その具体的なケースに関しては、後述する。
　以下、図面を参照して、上記の各々のステップ６０１～６０９における処理の詳細を述べる。
＜ステップ６０１の説明＞
  図７は、ステップ６０１における、実サンプルの電気泳動処理のフローを示している。
　電気泳動の基本的手順は、サンプル準備（ステップ７０１）、分析開始（ステップ７０２）、泳動媒体充填（ステップ７０３）、予備泳動（ステップ７０４）、サンプル導入（ステップ７０５）、及び泳動分析（ステップ７０６）に大別できる。
  以下に、各ステップにおける処理について詳述する。
　ステップ７０１：本装置のオペレータは、分析開始前のサンプル準備（ステップ７０１）として、サンプルや試薬を本装置にセットする。より具体的には、まず、図５で示すバッファ容器５２１と陽極バッファ容器５１０に、通電路の一部を形成する緩衝液を満たす。緩衝液は、例えば、各社から電気泳動用として市販されている電解質液である。また、サンプルプレート５２４のウェル内に、分析対象であるサンプルを分注する。サンプルは、例えば、ＤＮＡのＰＣＲ産物である。また、洗浄容器５２２に、キャピラリ陰極端５２７を洗浄する為の洗浄溶液を分注する。洗浄溶液は、例えば、純水である。また、シリンジ５０６内に、サンプルを電気泳動する為の分離媒体を注入する。泳動媒体は、例えば各社から電気泳動用として市販されているポリアクリルアミド系分離ゲルである。さらに、キャピラリ５０２の劣化が予想される場合や、キャピラリ５０２の長さを変更する場合、キャピラリアレイ５１７を交換する。
　このときに、サンプルプレート５２４にセットされるサンプルとしては、解析の対象であるＤＮＡの実サンプルの他、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、アレリックラダーとがあり、それぞれ異なるキャピラリにおいて電気泳動される。ポジティブコントロールは、例えば既知のＤＮＡを含むＰＣＲ産物であり、ＰＣＲによってＤＮＡが正しく増幅されていることを確認するための対照実験用のサンプルである。ネガティブコントロールとは、ＤＮＡを含まないＰＣＲ産物であり、ＰＣＲの増幅物にオペレータのＤＮＡや塵などのコンタミネーションが生じていないことを確認するための対照実験用のサンプルである。
　アレリックラダーとは、ＤＮＡマーカに一般的に含まれる可能性のあるアレルを多く含む人工的なサンプルであり、通常、ＤＮＡ鑑定用の試薬キットとして試薬メーカから提供される。アレリックラダーは、個々のＤＮＡマーカのＤＮＡ断片長とアレルとの対応関係を微調整する目的で使用される。アレリックラダーについては後述する。
　また上記の実サンプル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、及びアレリックラダー、のサンプル全てに対して、サイズスタンダードと呼ばれる、特定の蛍光色素で標識された既知のＤＮＡ断片が混ぜられる。使用する試薬キットによってサイズスタンダードに割り当てられる蛍光色素の種類は異なる。例えば図１２Ａに例示するサイズスタンダード試薬では、長さが８０ｂｐから４８０ｂｐの間の既知のＤＮＡ断片が、蛍光色素LIZで標識されているものとする。サイズスタンダードは、後述するSize Callingにおいて、スキャン時刻とＤＮＡ断片長との対応関係を得る目的で、全てのキャピラリのサンプルに対して混合される。
　オペレータは、アレリックラダーの種類やサイズスタンダードの種類、蛍光試薬の種類、それぞれのキャピラリ（に対応するサンプルプレート５２４上のウェル）にセットされたサンプルの種類などを指定する。本実施例ではサンプルの種類として、実サンプル、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、及びアレリックラダーのいずれかの種類が指定される。これらの情報の設定は、データ解析装置１１２上にて、ユーザインタフェース部１０３を介し、サンプル情報設定部１０６に設定される。
　ステップ７０２：そして、上記のようなサンプル準備（ステップ７０１）が完了した後、オペレータは図１で示すデータ解析装置１１２上にて、ユーザインタフェース部１０３を操作して、分析開始を指示する。この分析開始の指示は電気泳動装置制御部１０８に渡される。電気泳動装置制御部１０８が、分析開始の信号を電気泳動装置１０５に送信することで、分析が開始される。
　ステップ７０３：次に、図１で示す電気泳動装置１０５では、泳動媒体充填（ステップ７０３）が開始される。このステップは、分析開始後に自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部１０８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。泳動媒体充填とは、キャピラリ５０２内に新しい泳動媒体を充填し、泳動路を形成する手順である。
　本実施例１における泳動媒体充填（ステップ７０３）では、まず、図１で示す搬送機５２５により廃液容器５２３をロードヘッダ５２９の直下に運び、キャピラリ陰極端５２７から排出される使用済の泳動媒体を受け止められるようにする。そして、シリンジ５０３を駆動して、キャピラリ５０２に新しい泳動媒体を充填し、使用済の泳動媒体を廃棄する。最後に、洗浄容器５２２内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端５２７を浸し、泳動媒体により汚れたキャピラリ陰極端５２７を洗浄する。
　ステップ７０４：次に、予備泳動（ステップ７０４）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部１０８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。予備泳動とは、泳動媒体に所定の電圧を印加し、泳動媒体を電気泳動に適した状態にする手順である。本実施例における予備泳動（ステップ７０４）では、まず、搬送機５２５により、バッファ容器５２１内の緩衝液にキャピラリ陰極端５２７を浸し、通電路を形成する。そして、高圧電源５０４により、泳動媒体に数～数十キロボルト程度の電圧を数～数十分間加え、泳動媒体を電気泳動に適した状態とする。最後に、洗浄容器５２２内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端５２７を浸し、緩衝液により汚れたキャピラリ陰極端５２７を洗浄する。
　ステップ７０５：次に、サンプル導入（ステップ７０５）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部１０８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。サンプル導入（ステップ７０５）では、サンプル成分が泳動路に導入される。本実施例におけるサンプル導入（ステップ７０５）では、まず、搬送機５２５により、サンプルプレート５２４のウェル内に保持されたサンプルにキャピラリ陰極端５２７を浸す。これにより、通電路が形成され、泳動路にサンプル成分を導入することが状態となる。そして、高圧電源５０４によりパルス電圧を通電路に印加し、泳動路にサンプル成分を導入する。最後に、洗浄容器５２２内の洗浄溶液にキャピラリ陰極端５２７を浸し、サンプルにより汚れたキャピラリ陰極端５２７を洗浄する。
　ステップ７０６：次に、泳動分析（ステップ７０６）が行われる。このステップは、自動的に行われてもよいし、逐次、電気泳動装置制御部１０８から制御信号が送信されることによって行われてもよい。泳動分析（ステップ７０６）では、電気泳動により、サンプル中に含まれる各サンプル成分が分離分析される。本実施例における泳動分析（ステップ７０６）では、まず、搬送機５２５により、バッファ容器５２１内の緩衝液にキャピラリ陰極端５２７を浸し、通電路を形成する。次に、高圧電源５０４により、通電路に１５ｋＶ前後の高電圧を印加し、泳動路に電界を発生させる。発生した電界により、泳動路内の各サンプル成分は、各サンプル成分の性質に依存した速度で検出部５１６へ移動する。つまり、サンプル成分は、その移動速度の差により分離される。そして、検出部５１６に到達したサンプル成分から順番に検出される。例えば、サンプルが、塩基長の異なるＤＮＡを多数含む場合は、その塩基長により移動速度に差が生じ、塩基長の短いＤＮＡから順に検出部５１６に到達する。各ＤＮＡには、その末端塩基配列に依存した蛍光色素が取り付けられている。検出部５１６に光源５１４から励起光が照射されると、サンプルから情報光（サンプルに依存した波長を有する蛍光）が生じ、外部に放出される。この情報光を光学検出器５１５により検出する。光学検出器５１５にて検出された画像の一例が図２である。泳動分析中は、光学検出器５１５では、一定の時間間隔でこの情報光を検出し、画像データをデータ解析装置１１２へ送信する。もしくは送信する情報量を減らすため、画像データではなく、画像データ中の一部の領域のみの輝度を送信してもよい。例えば、キャピラリ毎に、一定間隔の波長位置のみの輝度値を送信してもよい。
　本実施例では上記の画像データのうち、図２の説明で述べたように、キャピラリ毎に２０の波長λ（０）～λ（１９）における輝度値データのみが、データ解析装置１１２へ送信されるものとする。この輝度値データは各キャピラリのスペクトルを表している。このスペクトルが記憶部１０４へ格納される（図８参照）。図８で示すように、記憶部１０４では、上記の泳動分析中の全ての検出時刻における全キャピラリのスペクトルが格納される。なお、本実施例においては全ての検出時刻のスペクトルが格納されることが望ましいが、特定のピーク時刻のみがＳＴＲ解析において重要である場合には、特定時刻周辺のみのスペクトルが格納されていてもよい。
　ステップ７０７：最後に、予定していた画像データを取得し終えたら電圧印加を停止し、泳動分析を終了する（ステップ７０７）。
  以上が、図６における電気泳動処理（ステップ６０１）の処理の一例である。
＜ステップ６０２の説明＞
　次に、図６における蛍光色素強度計算の処理の一例を説明する。
　上述の電気泳動処理（ステップ６０１）で得られた画像データから、各蛍光色素の強度が計算される（ステップ６０２）。この蛍光強度計算処理は、図１中の蛍光強度計算部１１０において行われる。蛍光強度計算処理（ステップ６０２）においては、各々の時刻における各々のキャピラリのスペクトルに対し、λ（０）～λ（１９）におけるそれぞれの波長における、各蛍光色素の強度比率を掛けて足し合わせればよい。これを行列で表現すると（式１）のようになる。
　ここでベクトルＣは蛍光強度ベクトルであり、その要素ＣＦ、ＣＶ、ＣＮ、ＣＰ、及びＣＬはそれぞれ、6FAM、VIC、NED、PET、及びLIZの蛍光強度を表している。
　ベクトルｆは、計測スペクトルベクトルであり、その要素ｆ０からｆ１９はそれぞれ、波長λ（０）からλ（１９）における信号強度（輝度値）を表している。もしくは要素ｆ０からｆ１９はそれぞれ、波長λ（０）からλ（１９）の近傍の信号強度の加算平均などであってもよい。なお、光学検出器５１５で検出される、個々の波長λ（０）からλ（１９）の計測信号には、蛍光色素による信号に加え、キャピラリ内に充填されるポリマーからのラマン散乱光がベースライン信号として含まれている。このため、ベクトルｆの算出の際には、このベースライン信号を予め除去しておく必要がある（図２８参照）。
　このベースライン信号の除去方法の一例としては、装置の出荷前に予めのラマン散乱光のスペクトルを求め、これをベースライン信号として記憶部１０４に格納に格納しておく。そして各々の時刻における計測信号から、このベースライン信号を引くことで、蛍光色素による信号を求め、これを計測スペクトルベクトルｆとしてよい。もしくは、図２９に示すように、各々の波長（λ（０）からλ（１９））の計測信号を、時系列データとして観測すると、蛍光色素による信号と、それ以外のベースライン信号とが直観的に区別できる。そこで各々の波長（λ（０）からλ（１９））の計測信号に対し、低周波成分を除去するようなハイパスフィルタをかけることで、ベースライン信号を除去してもよい。もしくは各時刻の近傍の最小値を、その時刻におけるベースライン信号値としてもよい。
　マトリクスＭは、計測スペクトルｆを、蛍光強度ベクトルに変換するマトリクスであり、その要素は各々の波長における各々の蛍光色素の強度比率に相当する。例えば、式１のマトリクスＭの要素ＷＦ０は、波長λ（０）における、蛍光色素6FAMの蛍光強度の比率である。この値が高いほど、その波長においてその蛍光色素の強度への寄与が高いことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　マトリクスＭは、本来は、蛍光色素の種類と泳動路の条件によって一元的に定められるものであるが、実際にはキャピラリと検出器の位置関係によって変動し得るため、キャピラリの交換等の際に計算する必要がある。このマトリクスＭを求める一連の処理が、スペクトラルキャリブレーションである。
　本実施例では、予め計測によってマトリクスの初期値が得られているものと仮定する。また初期マトリクスを得るための、後述する蛍光スペクトルも同様に得られているものと仮定する。そして本実施例では、遺伝子型解析装置が対応する蛍光試薬の種類や商品毎に、予め計測によって定められた初期マトリクス、及びこの初期マトリクスを得るための蛍光スペクトル（後述）が記憶部１０４に格納されているものとする。もしくは、前回のスペクトラルキャリブレーションで得られたマトリクス、及びそのときの蛍光スペクトルが初期値として、記憶部１０４に格納されていてもよい。ただし、後述するように、蛍光スペクトルからマトリクス、及びマトリクスから蛍光スペクトルを得ることができるため、いずれか一方の情報のみが格納されていてもよい。
　そして、図７における電気泳動処理のサンプル準備（ステップ７０１）において、蛍光試薬の種類をサンプル情報設定部１０６に設定した際に、その蛍光試薬の種類に応じたマトリクスの初期値が蛍光強度計算部１１０に渡される。
  もしくは前回のスペクトラルキャリブレーションで得られたマトリクスが記憶部１０４に格納され、かつその際の蛍光試薬の種類が今回の蛍光試薬の種類と同じである場合には、この前回のマトリクスを初期値としてもよい。
　このマトリクスＭの初期値を用いて、（式１）により計測スペクトルから各蛍光色素の蛍光強度を計算する。この処理を各時刻の各キャピラリのスペクトルに対して行うことで、各キャピラリの蛍光強度の時系列データを得ることができる。以降、この蛍光強度の時系列データを蛍光強度波形と記す。
　図９と図１０に、電気泳動（ステップ６０１）後、ステップ６０２で得られた蛍光強度の時間変化の例を示している。図９はアレリックラダーを電気泳動にかけたときの蛍光強度波形の例である。図１０は、実サンプルの蛍光強度波形の例である。各々の蛍光強度のピークが立っている時刻が、各々の蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片の長さに相当し、この長さの違いがアレルの違いに相当する。アレリックラダーは、ＤＮＡマーカに一般的に含まれるアレルが多く含まれた人工的なサンプルであるため、図９の蛍光強度波形では、たくさんのピークが観測されていることがわかる。図１０の実サンプルの蛍光強度波形では、個々のＤＮＡマーカに対して１つか、もしくは２つのピークが含まれており、ピークが一つの場合、そのピークの蛍光強度はピークが２つのマーカの蛍光強度に比べて高くなっていることがわかる。ピークが１つの場合はホモ接合（父親由来のアレルと母親由来のアレルとが同一）、ピークが２つの場合はヘテロ接合（父親由来のアレルと母親由来のアレルとが異なる）ことを意味している。なお、図１０ではサンプルのＤＮＡに対して一人が寄与する例であり、もしも複数人のＤＮＡが混合するような混合サンプルである場合には、その複数人の寄与率に応じ、一つのＤＮＡマーカに対してピークが３つ以上存在する場合がある。
＜ステップ６０３の説明＞
　次に、図６におけるピーク検出の処理の一例を説明する。
　図６における蛍光強度計算処理（ステップ６０２）によって得られた、上記の蛍光強度波形に対して、ピーク検出（ステップ６０３）を行う。ピーク検出では主に、ピークの中心位置（ピーク時刻）、ピークの高さ、及びピークの幅が重要である。ピークの中心位置はＤＮＡ断片長に対応し、アレルの識別のために最も重要である。またピークの高さはホモ接合・ヘテロ接合の識別や、サンプル中のＤＮＡ濃度の大小等の品質評価に用いられる。ピークの幅も、サンプルや電気泳動結果の品質を評価する上で重要である。このような実データのピークパラメータを推定する手法の一つとして、既知技術であるガウシアンフィッティングを用いることができる。
　図１１にガウシアンフィッティングの概念を示す。同図で示すようにガウシアンフィッティングとは、一定区間の実データに対し、ガウス関数ｇが最もよく実データを近似するようなパラメータ（平均値μ、標準偏差σ、及び最大振幅値Ａ）を計算する処理である。実データの近似の程度を表す指標としては、実データとガウス関数値との最小二乗誤差が多く用いられる。この最小二乗誤差を最小するような数値計算手法として、ガウスニュートン法などの従来手法を用いてパラメータを最適化することができる。その他にも、特許文献１に開示されるような、２つ以上のピーク波形が混合している場合や、ピーク周辺のデータが非対称である場合などの精度を向上させるような手法を適用してもよい。そしてガウス関数ｇの分散σが定まれば、その半値全幅（ＦＷＨＭ：Full Width at Half Maximum）は、図１１中に示す式で得られる。この値をピーク幅とすることができる。
　このようにして全ての蛍光色素の蛍光強度波形に対してピークパラメータを求める。この際、ピーク幅やピークの高さが予め定められた閾値条件を満たさない場合には、ピークから除外してもよい。
＜ステップ６０４の説明＞
　次に、図６におけるSize Callingの処理の一例を説明する。
　Size Callingとは、ＤＮＡ断片が電気泳動によって検出されるまでに要した時間とＤＮＡ断片長との対応付けを行う処理であり、本実施例ではデータ解析装置１１２中のＳＴＲ解析部１１１にて行われるものとする。具体的には前述のように、サイズスタンダードと呼ばれる、既知の長さのＤＮＡ断片を含み、かつそれらが特定の蛍光色素で標識された試薬に対して電気泳動を行う。例えば、図１２Ａで例示するサイズスタンダード試薬では、長さが８０ｂｐから４８０ｂｐの間の既知のＤＮＡ断片に対して、蛍光色素LIZで標識されている。前述のピーク検出（ステップ６０３）によって得られたピークの中心位置（すなわちピーク時刻）に対し、既知のＤＮＡ断片長が対応づけられる。これらの、ピーク時刻と既知のＤＮＡ断片長との組み合わせから、電気泳動時間とＤＮＡ断片長の対応式を得ることができる。
　図１２ＢはこのＤＮＡ泳動時間（ｔ）とＤＮＡ断片長（ｙ）の関係式「ｙ＝ｆ（ｔ）」を求める様子を示した図である。サイズスタンダードの既知のＤＮＡ断片長と、それに対応するピーク時刻とをプロットし、このプロットを最もよく近似するような関係式ｙ＝ｆ（ｔ）を求める。ｆ（ｔ）としては二次式、もしくは三次式等を用いて、その二乗誤差を最小にするような近似を行ってもよい。またどのような近似式を用いるかをユーザが、ユーザインタフェース部１０３を介してＳＴＲ解析部１１１に指定してもよい。このようにして得られる、ＤＮＡ泳動時間（ｔ）とＤＮＡ断片長（ｙ）との関係式「ｙ＝ｆ（ｔ）」を、全てのキャピラリに対して求め、保持しておく。この関係式を用いて、各キャピラリで計測される蛍光強度波形のピーク時刻から、そのときのＤＮＡ断片長を求めることができる。
＜ステップ６０５の説明＞
　次に、図６における基準蛍光スペクトル取得の処理の一例を説明する。
　基準蛍光スペクトルとは、これをシフトすることで他のキャピラリの蛍光スペクトルを求めるための基準となる蛍光スペクトルである。本明細書では、アレリックラダーに対して電気泳動が行われるキャピラリを基準キャピラリと呼び、基準キャピラリにおける蛍光スペクトルを、基準蛍光スペクトルと呼ぶこととする。本実施例では、この処理は図１のデータ解析装置１１２における、マトリクス計算部１０９にて行われるものとする。
　もしも上記のような基準蛍光スペクトル処理の取得が失敗した場合には、前述した、基準キャピラリにおける初期の蛍光スペクトル（記憶部１０４に保存済と仮定）を基準蛍光スペクトルとしてもよい。もしくはパス６１０により、初期のマトリクスが適用された蛍光強度波形を用いてＳＴＲ解析を行ってもよい。
　図１３と図１４を用いて、基準蛍光スペクトル取得処理（ステップ６０５）を説明する。図１３は、基準キャピラリにおける各蛍光色素の蛍光強度波形、すなわち図９にしめした波形を模式的に示している。同図は、アレリックラダーとサイズスタンダードの蛍光強度波形を示しており、アレリックラダーは6FAM、VIC、NED、PETで標識されており、サイズスタンダードはLIZで標識されているものとする。
　図１４は、基準蛍光スペクトル取得処理（ステップ６０５）の処理フローを示すフローチャートである。
同図で示すように、本実施例では、基準キャピラリの上記５つの蛍光強度波形のうち、単一の蛍光色素のみでピークが観測される時刻（以降、単色ピーク時刻）を抽出する（ステップ１４０１）。そしてこの単色ピーク時刻におけるスペクトルを取得する（ステップ１４０２）ことで、その色の蛍光スペクトルとみなす。
　以下、ステップ１４０１における単色ピーク時刻の検出処理について説明する。
  図１３では、T(V)、T(N)、T(F)、T(P)、及びT(L)が、それぞれ、蛍光色素VIC、NED、6FAM、PET、及びLIZの単色ピーク時刻であり、それぞれの時刻では互いに他の蛍光色素による蛍光強度への寄与が無いとみなされる。
　上記の単一色ピーク時刻は、電気泳動装置にセットしたアレリックラダーとサイズスタンダードの種類に応じて決めることができる。すなわちアレリックラダーとサイズスタンダードには、その試薬に含まれるＤＮＡ断片長の情報が必ず開示されており、これらの情報は後述するＳＴＲ解析において用いられる。サイズスタンダードの既知のＤＮＡ断片長については、既に述べたようにSize Callingにおいて、電気泳動時間とＤＮＡ断片長の関係式を得るために用いられる。アレリックラダーの蛍光強度波形は図９に示されるようなものであり、同図で観測されるピークは、アレリックラダーに含まれる各ＤＮＡ断片の長さに相当する。このアレリックラダーに含まれるＤＮＡ断片の情報の一部を図１５に示す。
　同図では、アレリックラダーの情報として、各蛍光色素（Dye）が標識するローカス名（Locus）と、そのローカスに含まれるアレル名（Allele）と、そのアレルに対応するＤＮＡ断片長（Length）、及び各アレルの中心位置からの許容塩基長幅（Ｍｉｎ／Ｍａｘ）の情報を示している。例えば同図ではＤＮＡマーカ（ローカス）Ｄ１０Ｓ１２４８は6FAMで標識されており、そのアレルとして８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８が含まれ、そのＤＮＡ断片長（単位はｂｐ）はそれぞれ７７、８１、８５、８９、９３、９７、１０１、１０９、１１３、１１７である。全てのアレルはプラス０．５ｂｐ、マイナス０．５ｂｐの許容幅を持つことを示している。このアレルが蛍光強度波形の１ピークに相当する。図１５ではＤＮＡマーカＤ１０Ｓ１２４８の情報の例のみを示しているが、アレリックラダーに含まれる全ローカスに対して、上記のような情報が開示されている。このようなアレリックラダーのＤＮＡ断片長情報は、予め記憶部１０４に格納されており、前述のサンプル準備（図７中のステップ７０１）において、アレリックラダーの種類を設定した際に、記憶部１０４から、設定された種類のアレリックラダーのＤＮＡ断片長情報がマトリクス計算部１０９に読み込まれてもよい。従って、図９に示されるアレリックラダーの蛍光強度波形の全てのピークに対して、そのＤＮＡ断片長が既知であるので、この既知情報を用いて単一色ピーク時刻を抽出すればよい。
　図１６に、アレリックラダーに付属するＤＮＡ断片長情報を用いて、単一色ピーク時刻を抽出する例を示す。同図では各蛍光強度波形のピーク位置を示している。なお、同図の横軸は電気泳動時間ではなく、ＤＮＡ断片長で表されているが、Size Callingによって両者は一対一で対応づけられるため、どちらでも本質的には同様である。同図（ａ）に、ＤＮＡ断片長が１１３ｂｐから１３０ｂｐまでの間に含まれる全ての蛍光色素のピークを並べて示している。それぞれのピークの最大の許容幅はピーク中心からプラスマイナス０．５ｂｐである。同図（ａ）におけるピークの位置関係から、6FAMではピーク１６０１（ＤＮＡ断片長は１１７ｂｐ）、VICではピーク１６０２（ＤＮＡ断片長は１２５ｂｐ）、NEDではピーク１６０３（ＤＮＡ断片長は１２７．３ｂｐ）がそれぞれの蛍光色素の単一色ピーク時刻として抽出できることがわかる。同様に同図（ｂ）に、３８０ｂｐ近辺に含まれる全蛍光色素のピークを並べて示している。同図から、ＰＥＴではピーク１６０４（ＤＮＡ断片長３８４．５ｂｐ）が単一色ピーク時刻として抽出できることがわかる。同様に同図（ｃ）に、４６０ｂｐ付近の全蛍光色素のピークを示している。同図から、蛍光色素LIZではピーク１６０５（ＤＮＡ断片長４６０ｂｐ）が単一色ピーク時刻として抽出できることがわかる。
  もしも上記のような単色ピーク時刻が得られなかった場合には、パス６１０により、初期のマトリクスが適用された蛍光強度波形を用いてＳＴＲ解析を行ってもよい。
　次に、図１４における基準蛍光スペクトル取得処理（ステップ１４０２）について述べる。
既に図８の説明で述べたように、本実施例では、全てのキャピラリの全ての検出時刻におけるスペクトルは記憶部１０４に格納される。よって上述のステップ１４０１において、アレリックラダーとサイズスタンダードの既知ＤＮＡ断片長情報を元に、基準キャピラリにおける単一色ピーク時刻を抽出し、その時刻におけるスペクトルを記憶部１０４から取得する。これを基準蛍光スペクトルとする。以上のようにして、図６における基準蛍光スペクトル取得処理（ステップ６０５）が行われる。
＜ステップ６０６の説明＞
　次に、図６における蛍光スペクトル計算の処理の一例を説明する。
　この処理は、ステップ６０５で得られた基準蛍光スペクトルを元に、基準キャピラリ以外におけるキャピラリの蛍光スペクトルを求める処理である。本実施例では、全てのキャピラリで電気泳動が行われている、サイズスタンダードの蛍光スペクトルを用いて、この処理を行う。
　図１７に、蛍光スペクトル計算処理（ステップ６０６）の処理フローを示す。本実施例では、蛍光スペクトル計算処理（ステップ６０６）は、基準キャピラリ以外のキャピラリに対して行う。初めに、サイズスタンダードの単色ピーク時刻を検出する（ステップ１７０１）。実サンプルにおける蛍光強度波形の一例については、図１０の説明について既に述べた。図１０における蛍光色素LIZの蛍光強度波形には、既知のＤＮＡ断片長に対応するピーク値が多数観測され、既にステップ６０３において全ての蛍光強度波形におけるピーク時刻が検出されている。このピーク時刻情報を用いて、蛍光色素LIZの単色ピーク時刻を抽出する。すなわち、図１４における単色ピーク時刻検出（ステップ１４０１）と同様に、蛍光色素LIZのみでピークが存在する時刻を見つければよい。通常、サイズスタンダードは、実サンプルの電気泳動で想定される最大値よりも大きいＤＮＡ断片長をもつことが多いため、この最大のＤＮＡ断片長に相当するピークを単色ピーク時刻としてもよい。例えば、図１６の例では、ピーク１６０５（ＤＮＡ断片長は４６０ｂｐ）がこの最大長のＤＮＡ断片長である。もしもノイズ等の影響により、ステップ１７０１において、LIZの単色ピーク時刻が存在しない場合には、図６中のパス６１０により、このキャピラリにおいては初期のマトリクスを適用した状態で、ＳＴＲ解析を行ってもよい。
　次に、このLIZの単色ピーク時刻における、LIZの蛍光スペクトルを取得する（ステップ１７０２）。この処理は、図１４における基準蛍光スペクトル取得（ステップ１４０２）と同様に、記憶部１０４に格納された全ての時刻の全てのキャピラリのスペクトルの中から、LIZの単色ピーク時刻におけるスペクトルを取得すればよい。これがLIZの蛍光スペクトルとなる。
　次に、基準キャピラリ以外のキャピラリ（以降、他キャピラリと記す）における蛍光スペクトルの、基準蛍光スペクトルからのシフト量を計算する（ステップ１７０３）。このシフト量の計算には、サイズスタンダードを標識する蛍光色素（本実施例ではＬＩＺ）の蛍光スペクトルを用いる。以下、図１８と図１９Ａ，Ｂを用いて、このシフト量の計算について説明する。
　図１８は、上で述べた基準蛍光スペクトルの一例である。なお同図では、全蛍光色素の蛍光スペクトルのピーク高さを正規化している。また後述するシフト量に対し、この蛍光スペクトルのデータのサンプリング間隔が大きい場合には、予め、既知のスプライン補間等を施して、蛍光スペクトルに対して十分に小さいサンプリング間隔としておく。同様に、他キャピラリにおけるLIZの蛍光スペクトル波形に対しても同じサンプリング間隔になるようにデータを補間しておく。
　そして上記の基準蛍光スペクトルにおけるLIZの蛍光スペクトル１８０１と、他キャピラリにおける蛍光スペクトル１９０１との間のシフト量Δλを計算する（図１９Ａ参照）。このシフト量の計算には、例えば蛍光スペクトル１８０１（上記の補間が行われた波形）をｆ（ｎ）、蛍光スペクトル１９０１（上記の補間が行われた波形）をｇ（ｎ）とすると、相互相関関数ｈ（ｍ）＝Σｆ（ｎ）＊ｇ（ｍ－ｎ）を計算し、その値が最大値となるシフト量ｍを求め、これをΔλとしてもよい。あるいは、蛍光スペクトル１８０１と蛍光スペクトル１９０１に対して、前述のガウシアンフィッティングを行い、それぞれのピーク波長を求め、そのピーク波長の差分をシフト量Δλとしてもよい。
　次に全ての蛍光色素の基準蛍光スペクトルを、上記のΔλだけシフトさせることで、他キャピラリにおける蛍光スペクトルを求める（図１７中のステップ１７０４）。この処理は図１９Ｂで示すように、図１８で得られた全ての蛍光色素の基準蛍光スペクトルをΔλだけシフトさせればよい。その後、補間された蛍光スペクトルから、補間前のサンプリング波長（本実施例ではλ（０）からλ（１９））における波形の値を新たに求めればよい。
　以上のようにして他キャピラリにおける蛍光スペクトルが得られる。このような処理を、基準キャピラリ以外の全てのキャピラリに対して行うことで、各キャピラリに対しての蛍光スペクトルを求める。
＜ステップ６０７の説明＞
　次に、図６におけるマトリクス計算の処理の一例を説明する。
　図６のフローにおいて、ステップ６０６で得られた各キャピラリの蛍光スペクトルを用いてマトリクスＭを計算する（ステップ６０７）。本実施例ではこの処理はマトリクス計算部１０９にて行われる。
　以下、ある一つのキャピラリにおけるマトリクス計算処理の実施例を述べるが、他のキャピラリについても同様の処理を適用できる。
　あるキャピラリにおける、ステップ６０６で得られた５種類の蛍光色素6FAM、VIC、NED、PET、及びLIZの蛍光スペクトルをそれぞれベクトルＳＦ、ＳＶ、ＳＮ、ＳＰ、ＳＬで表記する。ここでベクトルＳＦ、ＳＶ、ＳＮ、ＳＰ、ＳＬの次元数は２０とする。すなわち前述のように、それぞれのベクトルの要素は、波長λ（０）～λ（１９）における各々の蛍光スペクトルの信号強度であるとする。そして、ある時刻に計測されたスペクトルをベクトルｆ、そのときの蛍光強度ベクトルをＣとする。このベクトルｆとベクトルＣは（式１）と同様である。すなわちベクトルＣの要素ＣＦ、ＣＶ、ＣＮ、ＣＰ、及びＣＬはそれぞれ、6FAM、VIC、NED、PET、及びLIZの蛍光強度を表している。ベクトルｆの要素ｆ０からｆ１９はそれぞれ、波長λ（０）からλ（１９）の信号強度（輝度値）を表している。
　このとき、蛍光スペクトルのベクトルＳＦ、ＳＶ、ＳＮ、ＳＰ、ＳＬを列として構成される行列Ｓを蛍光スペクトル行列と記すと、（式２）の関係式が成り立つ。（式１）と（式２）との対比から、マトリクスＭは、蛍光スペクトル行列Ｓの逆行列に相当することがわかる。しかし、蛍光スペクトル行列Ｓは非正方行列（（式２）では２０×５）であるため、このままの形ではその逆行列を得ることはできない。このことは、未知数５（ＣＦ、ＣＶ、ＣＮ、ＣＰ、及びＣＬ）に対して、条件式の数が２０と条件過多であるため、条件式全てを満たす未知数を得ることができないことに相当する。
　そこで、蛍光スペクトル行列Ｓの逆行列ではなく、（式３）で示すような行列（ＳｔＳ）－１ＳｔによってマトリクスＭを求められることが知られている。この（ＳｔＳ）－１Ｓｔは疑似逆行列と呼ばれる。また（式３）は、５つの未知数（ＣＦ、ＣＶ、ＣＮ、ＣＰ、及びＣＬ）を、最小二乗法によって求めることに等価であることが導かれることから、疑似逆行列（ＳｔＳ）－１Ｓｔは、最小二乗型一般逆行列とも呼ばれている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　従って、ステップ６０７のマトリクス計算処理においては、ステップ６０６で得られた蛍光スペクトルから得られる蛍光スペクトル行列Ｓに対し、（式３）の疑似逆行列を計算することにより、マトリクスＭを得ることができる。以上のようなマトリクスを全てのキャピラリに対して求め、これらを保持しておく。
　なお、（式１）と（式２）の関係から（式３）と同様に（式４）が得られるため、マトリクスの情報から蛍光スペクトルの情報を容易に計算することができる。
　なおステップ６０７のマトリクス計算処理においては、マトリクスＭの信頼性を評価し、信頼性が低いと判断される場合にはこのマトリクスＭを用いずに、図６中のパス６１０により、初期のマトリクスが適用された蛍光強度波形を用いてＳＴＲ解析を行ってもよい。このマトリクスＭの信頼性の指標の一例としては、例えば、（式２〕で示される蛍光スペクトル行列Ｓに対して、Ｓの転置行列とＳとの積で得られる行列の条件数（Condition Number）などが上げられる。行列の条件数は、その行列のノルムと、その逆行列のノルムの積であらわされる。これを式に示すと（式５）のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
ノルムの定義としては、Ｌ１ノルム（行列要素の絶対値の総和）やＬ２ノルム（行列要素の２乗の総和）などがある。（式５）で示される条件数は、その逆行列を数値解析によって求める際の条件の良し悪しを示しており、この条件数が大きくなると、得られる逆行列の精度が悪くなる。すなわち、（式３）にてマトリクスＭを求める際の、（ＳｔＳ）の逆行列の精度が悪くなるため、この逆行列から得られるマトリクスＭの信頼性も低くなる。（式５）で得られる条件数が高いことは、検出系のノイズや泳動媒体の劣化等の何かしらの理由により、蛍光スペクトル行列Ｓの各蛍光スペクトルの互いの重なり度合いが強くなってしまい、計測された蛍光スペクトル行列Ｓの信頼性が低いことを意味する。
＜ステップ６０８の説明＞
　次に、図６における蛍光強度計算の処理の一例を説明する。
　図６のフローにおいて、上記のマトリクスＭを用いて、各蛍光色素の蛍光強度を計算する（ステップ６０８）。本実施例ではこの処理は蛍光強度計算部１１０にて行われる。この蛍光強度計算処理（ステップ６０８）は、ステップ６０２で述べた処理と同様に、ステップ６０７で得られたマトリクスＭを用いて、（式１）によって蛍光強度ベクトルＣの各要素ＣＦ、ＣＶ、ＣＮ、ＣＰ、及びＣＬを求める。この蛍光強度ベクトルＣを各時刻に対して求め、蛍光色素毎に信号強度の時系列データとしてプロットすれば、図９や図１０のような蛍光強度波形を得ることができる。
＜ステップ６０９の説明＞
　次に、図６におけるＳＴＲ解析の処理の一例を説明する。
　図６のフローにおいて、上記の蛍光色素毎の蛍光強度波形を用いて、ＳＴＲ解析を行う（ステップ６０９）。本実施例ではこの処理はＳＴＲ解析部１１１にて行われる。
　図２０は、ＳＴＲ解析の処理フローを示す図である。同図で示すように、ＳＴＲ解析処理は、ピーク検出（ステップ２００１）とSize Calling（ステップ２００２）、及びAllele Calling（ステップ２００３）の３ステップから成る。このうち、ピーク検出（ステップ２００１）とSize Calling(ステップ２００２)とは、それぞれ前に述べたピーク検出(ステップ６０３)とSize Calling（ステップ６０４）の処理と同様である。すなわち、ステップ６０３とステップ６０４の処理を行ったときと比べて、マトリクスＭがステップ６０７で変更され、蛍光強度波形もステップ６０８で変更されたため、再度ピーク検出とSize Calling処理を行っている。
　次に、Allele Calling（ステップ２００３）の処理について述べる。Allele Callingとはアレル（前述のように、ＳＴＲの繰り返し回数に相当）とＤＮＡ断片長との対応関係を微調整する処理である。本実施例では、アレリックラダーとして用いる試薬の種類を選択することで、アレリックラダーに含まれる全ローカスの情報（図１５参照）が既に得られており、このアレリックラダー情報から個々のアレルとそのＤＮＡ断片長との対応関係が得られる。しかし、実際のアレリックラダーの蛍光強度波形（図９）における個々のピークから得られるＤＮＡ断片長と、図１５のアレリックラダー情報に含まれるＤＮＡ断片長とでは、通常は微小なずれが生じる。このずれをオフセット情報として各アレルに対して記憶部１０４に保持しておく。このオフセット情報を用いて、図１５のアレリックラダー情報を微調整することで、アレルとＤＮＡ断片長の対応関係が微調整され、実サンプルの蛍光強度のピークに対するアレル判定の精度が向上する。
　以上をまとめると、ＳＴＲ解析処理（ステップ６０９）では、実サンプルの蛍光強度波形からピークを検出し（ステップ２００１）、そのうち、サイズスタンダードのピーク時刻と既知のＤＮＡ断片長の情報とから、ピーク時刻とＤＮＡ断片長との対応式を求め（ステップ２００２）、アレリックラダーにおける既知のアレルに対するＤＮＡ断片長を求めることでアレルとＤＮＡ断片長との対応を微調整し、この対応関係を元に、実サンプルにおける蛍光強度のピークからアレルを判定する（ステップ２００３）。
　このようにして全てのローカスに対するアレルが求められ、このアレルの組み合わせパターンが、個人識別のための遺伝子型の情報となる。
　以上に述べたように、実施例１では、サイズスタンダードとアレリックラダーとを用いて基準蛍光スペクトルを取得し、この基準蛍光スペクトルからのシフト量を、サイズスタンダードの蛍光スペクトルを参照することで求め、そのシフト量の分だけ基準蛍光スペクトルをシフトさせることで全てのキャピラリにおける蛍光スペクトルを算出し、この蛍光スペクトルから、マトリクスＭを算出する。このマトリクスを用いて、計測されたスペクトルから、各蛍光色素の蛍光強度波形を得ることができる。このような方法により、特別なマトリクススタンダードを用いて電気泳動を行うことなく、実サンプルの電気泳動と同時にスペクトラルキャリブレーションを行い、蛍光強度波形を取得することができるので、スペクトラルキャリブレーションに要する時間とコストを軽減することが可能となる。
　本発明の実施例２による遺伝子型解析装置について説明する。
  実施例１による遺伝子型解析装置では、アレリックラダーに対して電気泳動が行われるキャピラリを基準キャピラリとし、基準キャピラリにおける、アレリックラダーとサイズスタンダードの単色ピーク時刻を抽出し、この時刻におけるスペクトルを、基準蛍光スペクトルとした。そして基準蛍光スペクトルをシフトさせることで、基準キャピラリ以外の全てのキャピラリにおける蛍光スペクトルを求めることで、全キャピラリのマトリクスＭを計算した。
  しかし前述のように、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルは、理想的には装置に係りなく蛍光色素の種類と、これに対する励起光の波長、キャピラリの泳動媒体の特性によって一意に決められるものである。
　そこで本発明の実施例２では、基準蛍光スペクトルを、アレリックラダーの単色ピーク時刻のみからではなく、上述のように蛍光色素の種類、励起光波長、泳動媒体特性等によって、決められる蛍光スペクトルを予め計測しておき、これとの比較、修正によって基準蛍光スペクトルを求めることを特徴する。以下、この予め計測される一意な蛍光スペクトルを、理想蛍光スペクトルと記す。理想蛍光スペクトル波形は、遺伝子型解析装置の出荷前に予め装置メーカによって計測されているか、もしくは装置の設置時にサービスエンジニアらによって計測され、装置内に記憶されているものとする。以下に、本発明の実施例２について図面を参照して詳細を説明する。
　実施例２による遺伝子型解析装置の構成は、図１に示される実施例１の構成と同様である。実施例１と実施例２の違いは、マトリクス計算部１０９において行われる基準蛍光スペクトルを求める処理の違いのみであり、それ以外の処理は実施例１と同様である。
　図２１は実施例２によるマトリクス計算部１０９における、基準蛍光スペクトルを計算する処理の概念を示す図である。
  同図中の単色ピーク時刻検出（ステップ２１０１）、及び蛍光スペクトル取得（ステップ２１０２）の処理は図１４で述べた、基準蛍光スペクトル取得処理（ステップ６０５）における、単色ピーク時刻検出（ステップ１４０１）と基準蛍光スペクトル取得処理（ステップ１４０２）と同様であるので、説明は省略する。
　次に、図２１における理想蛍光スペクトル取得処理（ステップ２１０３）では、記憶部１０４に格納された理想蛍光スペクトル２１０７を取得する。この理想蛍光スペクトル２１０７は、上で述べたように、遺伝子型解析装置の出荷前に予め装置メーカによって計測されているか、もしくは装置の設置時にサービスエンジニアらによって計測され、装置内の記憶部１０４に格納されているものとする。なお、同図では蛍光スペクトルとして一種類の蛍光色素のスペクトルのみが描かれているが、全ての蛍光色素に対して、同様の処理が行われる。
　次に、図２１における修正処理（ステップ２１０４）では、理想蛍光スペクトル２１０７と、基準蛍光スペクトル２１０６との比較に基づき、基準蛍光スペクトル２１０６を修正することで、最終的な基準蛍光スペクトル２１０８を得る。
  図２２を参照して、修正処理（ステップ２１０４）の一例を説明する。
同図中、基準蛍光スペクトル２１０６と理想蛍光スペクトル２１０７は、上で述べたように、記憶部１０４に格納されたスペクトルからそれぞれ取得されたデータである。まず、これらの波長方向での位置あわせを行う（２２０１）。この処理は実施例１における蛍光スペクトル計算（図６中のステップ６０６）中の、基準キャピラリからのシフト量計算（図１７中のステップ１７０３）の処理と同様な方法を用いることができる。すなわち、両スペクトルの相互相関関数を計算し、その値が最大値となるようなシフト量を求めることで、双方のスペクトルのずれを補正する、すなわち位置あわせすることができる。もしくは前に述べた、ガウシアンフィッティングを両スペクトルに適用し、そのピークの中心位置の差分を、上記のシフト量としてもよい。
　このようにして波長方向での位置あわせを行った後、基準蛍光スペクトル２１０６から理想蛍光スペクトル２１０７を差し引いた、差分スペクトルを求める（２２０２）。同図では、この差分スペクトル（２２０２）の値を、予め定められた最大差分(DMAX)と最小差分(DMIN)とでクリッピングする様子を示している。同図中、DMAXとDMINはそれぞれ、図中のOffset値を基準とした許容される差分の最大値と最小値であり、DMAXはプラスの差分の最大値を、DMINはマイナスの差分の最小値である。同図では、Offsetは基準蛍光スペクトル２１０６の、理想蛍光スペクトル２１０７に対する全体的な信号強度差を表す値であり、例えば差分スペクトルの平均値をOffsetとしてもよい。このOffsetを基準として、差分スペクトルの値域を［Offset＋DMIN, Offset＋DMAX］と定める。そして差分スペクトルのデータのうち、この値域に入らないデータに関しては、この値域の最大値、もしくは最小値でクリッピングする。
　このように実施例２の、基準蛍光スペクトルの修正処理（ステップ２１０４）では、理想蛍光スペクトルからの差分に対して許容幅を予め定め、クリッピング処理を行うことで、計測時に生じるスペクトルのノイズを軽減することが可能である。なお、上記の修正処理は一例であり、この例に限定されるものではなく、理想蛍光スペクトルとの比較に基づいて基準蛍光スペクトルを修正するものであれば、様々な処理が適用できる。
　上述の基準蛍光スペクトルの修正処理（ステップ２１０４）の例では、理想蛍光スペクトルからの差分をクリップする例を示したが、もしも計測された基準蛍光スペクトルの信頼性が低いと判断される場合には、修正処理（ステップ２１０４）において、基準蛍光スペクトルを理想蛍光スペクトルで置き換えてもよい。
　このような処理の一例を、図２３を用いて説明する。同図中、ステップ２３０１では、基準蛍光スペクトルの信頼性を示す値（Ｑ値）と、予め定められた閾値との比較を行う。同図では、このＱ値は、その値が高いほど基準蛍光スペクトルの信頼性が低いものとする。このＱ値の指標の一例としては、例えば（式５）で述べたような、蛍光スペクトル行列Ｓに対して、Ｓの転置行列とＳとの積で得られる行列の条件数(Condition Number)などが挙げられる。前述のように、（式５）で得られる条件数が高いことは、検出系のノイズや泳動媒体の劣化等の何かしらの理由により、蛍光スペクトル行列Ｓの各蛍光スペクトルの互いの重なり度合いが強くなってしまい、計測された蛍光スペクトル行列Ｓの信頼性が低いことを意味する。
　従って、ステップ２３０１における比較により、上記のＱ値が閾値よりも高い場合には、その基準蛍光スペクトルは信頼性が低いと判断し、計測された基準蛍光スペクトルを用いずに、理想蛍光スペクトルを基準蛍光スペクトルとして置き換える（ステップ２３０３）。ただし必要に応じて、図２１中で述べたように、理想蛍光スペクトルを基準蛍光スペクトルの波長方向に対して位置合わせをしてもよい。
　一方、ステップ２３０１における比較により、上記のＱ値が閾値よりも低い場合には、その基準蛍光スペクトルは信頼性が高いと判断し、図２２の説明で述べたような基準蛍光スペクトルの修正処理を行う（ステップ２３０３）。
  なお、上で述べた、理想蛍光スペクトルによる基準蛍光スペクトルの置き換え（ステップ２３０２）は、アレリックラダーを用いない遺伝子型解析に対しても適用できる。すなわちＳＴＲ解析において高い塩基分解能が要求されないような用途の遺伝子型解析（例えば食品検査等）であれば、アレリックラダーを用いなくとも、アレルの識別が可能である。このような場合には実施例１で述べたように、アレリックラダーの情報を用いて基準蛍光スペクトルを取得することができない。このような場合には、ステップ２３０２のように、理想蛍光スペクトルを基準蛍光スペクトルとして置き換え、各々のキャピラリに対してのシフト量を求めることで、蛍光スペクトルを得ることができる。
　以上に述べたように、本発明の実施例２による遺伝型解析装置では、基準蛍光スペクトルを、アレリックラダーの単色ピーク時刻のみからではなく、蛍光色素の種類、励起光波長、泳動媒体特性等によって、決められる理想蛍光スペクトルを予め計測しておき、これとの比較、修正によって基準蛍光スペクトルを求めることで、スペクトラルキャリブレーションを行うことを特徴する。このように、理想蛍光スペクトルとの比較によって基準蛍光スペクトルを修正することで、スペクトラルキャリブレーションの際、計測時に生じるノイズ等の影響を軽減することが可能となる。
　本発明の実施例３による遺伝子型解析装置について説明する。
  実施例１、及び実施例２による遺伝子型解析装置では、アレリックラダーに対して電気泳動が行われるキャピラリを基準キャピラリとし、基準キャピラリにおける基準蛍光スペクトルを求めた。そして基準蛍光スペクトルと、基準キャピラリ以外のスペクトル間のシフト量を求め、この量だけ基準蛍光スペクトルをシフトさせることで、基準キャピラリ以外の全てのキャピラリにおける蛍光スペクトルを求め、全キャピラリのマトリクスＭを計算した。
　しかし、実施例１と実施例２では、上述のように、各々のキャピラリの蛍光スペクトルを、基準キャピラリにおける基準蛍光スペクトルからのシフトにより求めているため、キャピラリ間で蛍光スペクトルの形状が変化することは想定していない。実際には、光学系や計測系の何らかの要因により、蛍光スペクトルの形状が微小に異なる可能性がある。
  そこで、本発明の実施例３では、上記のような基準蛍光スペクトルからのシフトではなく、各キャピラリにおいて、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、蛍光スペクトルを求めることを特徴とする。
  以下、図面を参照して実施例３による遺伝子型解析装置の詳細を説明する。実施例３による遺伝子型解析装置の構成は、図１に示される構成と同様である。
　図２４は、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、蛍光スペクトルを求める処理の概念を示す図である。
  実施例１においては、図１３及び図１６で示したように、アレリックラダーの蛍光強度の波形から、各蛍光色素の単色ピーク時刻を検出し、その単色ピーク時刻におけるスペクトルを、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルとした。
　同様に、実施例３では各キャピラリにおいて計測対象の実サンプルに対する電気泳動によって得られる蛍光強度の波形から、単色ピーク時刻を検出し、その単色ピーク時刻におけるスペクトルを、各々の蛍光色素の蛍光スペクトルとする。図２４では、実サンプルに対する電気泳動から得られた蛍光強度の波形を基に、５つの蛍光色素、6FAM、VIC、NED、PET、LIZのそれぞれの単色ピーク時刻、T(F)、T(V)、T(N)、T(P)、T(L)を抽出している例を示している。それぞれの時刻では、一つの蛍光色素でのみピークが立っており、このような時刻を検出すればよい。
　ただし、このような単色ピーク時刻では、初期のマトリクスが適切でない場合、ある蛍光色の主ピークに加え、主ピークと同じピーク位置に疑似ピークが出現する可能性がある（図３０参照）。この疑似ピークは、各色の蛍光スペクトルの重なりによって生じ得るものであり、初期のマトリクスが適切でない場合、この重なりによる影響が大きく観測される。また、この疑似ピークは、主ピークが複数ある場合には、その全ての主ピークにおいて観測される。
　ＳＴＲ解析においては、異なる蛍光色のピークが同じ時刻に存在する可能性がある。このような場合には、小さい方のピークを大きい方のピークの疑似ピークとみなすことはできない。すなわち、小さいピークは真のピークであるため、真のピークを消してしまうようなマトリクスを求めてしまうことになるためである。
　よって、疑似ピークであるか真のピークであるかの判定は慎重に行われることが望ましい。以下に図３２を参照して疑似ピークと判定するための条件（Ｃ１）～（Ｃ４）の一例を示す。
（Ｃ１）：主ピークのピーク時刻(T1)と、疑似ピークのピーク時刻(T2)との差が予め定められた時刻差内に収まっている（すなわち、T1≒T2）こと（図３２（ａ））。
（Ｃ２）：主ピークのピーク高さ(H1)と、疑似ピークのピーク高さ(H2)、及びこれらの比(H1/H2)がそれぞれ予め定められた値域に収まっていること（図３２（ｂ））。
（Ｃ３）：上記を満たす主ピークと疑似ピークのパターンが予め定められた個数以上存在すること（図３２（ｃ））。
（Ｃ４）：主ピーク単独のピークが存在しないこと（図３２（ｃ））。
などが挙げられる。
　上記の条件（Ｃ３）と（Ｃ４）は、異なる蛍光色で真ピークが全て同じ時刻になるような確率が極めて低いことから、真ピークを疑似ピークと誤検出することを防ぐために有効と考えられる。
　そして実施例３では、時系列の蛍光強度波形の中で、上記のような条件を満たす疑似ピークのパターンを探索し、この疑似ピークの時刻を上記の単色ピーク時刻とし、蛍光スペクトルを求める。
　なお、上記で複数見つけられた疑似ピーク時刻のうち、単色ピーク時刻として用いるためには、さらに主ピークと疑似ピークの蛍光色以外の蛍光色素が発光していないような時刻を選択することが望ましい（図３２（ｄ））。
　なお、図３０や図３２では一つの主ピークに対して一つの疑似ピークが存在する例を示しているが、一つの主ピークに対して複数の疑似ピークが存在していても、同様の条件を適用できる。また、上で述べた条件は一例であり、本発明は上記の条件のみに限定されるものではない。
　ただし、実サンプルに対する電気泳動では、サンプルに含まれる遺伝子型の特性や、サンプル中のＤＮＡ濃度の過不足等によって、必ずしも蛍光スペクトルを求めるのに適した単色ピーク時刻が必ず得られるという保証はない。すなわち、蛍光色素間でピーク位置が重なっている、もしくはピークの幅が広いなどの理由により、上記のような単一の蛍光色素のみによる疑似ピークが存在しない現象や、そもそもピークの強度が小さい、もしくは大きすぎるといった現象が生じている可能性がある。また、初期マトリクスが適切であれば、上記のような疑似ピークは観測されない。
　そこで実施例３では、実サンプルから望ましい単色ピーク時刻を検出できたか否かの判定を行った上で、単色ピークが存在した場合にのみ、実サンプルのスペクトルを用いて蛍光スペクトルを求めることを特徴とする。
　図２５に、実施例３による遺伝型解析装置の処理フローを示す。
  ステップ２５０１にて、アレリックラダー、コントロールサンプルを含めた、全てのサンプルのキャピラリに対して電気泳動を行う。この電気泳動処理は、実施例１における電気泳動処理（図６中、ステップ６０１）と同様である。
　次に、ステップ２５０２にて、得られた電気泳動結果のスペクトルデータを基に、蛍光強度を計算する。この処理は、実施例１における蛍光強度計算処理（図６中、ステップ６０２）と同様であり、初期のマトリクスＭを用いて、（式１）の計算に従って、各蛍光色素の蛍光強度波形を得ることができる。
　次に、ステップ２５０３にて、ステップ２５０２で得られた蛍光強度波形に対して、ピーク検出処理を行う。この処理は、実施例１におけるピーク検出処理（図６中、ステップ６０３）と同様であり、ガウシアンフィッティング等の既知の手法を用いることができる。
　次に、ステップ２５０４にて、Size Calling処理を行う。この処理は、実施例１におけるSize Calling処理（図６中、ステップ６０４）と同様であり、サイズスタンダードに割り当てられた蛍光色素（本実施例では、LIZ）のピーク時刻と、既知のＤＮＡ断片長情報とから、電気泳動時間とＤＮＡ断片長の関係式「ｙ＝ｆ（ｔ）」を得る。
　次に、ステップ２５０５にて、基準蛍光スペクトルを取得する。この処理は、実施例１における基準蛍光スペクトル取得処理（図６中、ステップ６０５）と同様であり、アレリックラダーを含むキャピラリを基準キャピラリとして、基準キャピラリにおける単色ピーク時刻を検出して、基準蛍光スペクトルを取得する。また、実施例２で述べたように、さらに理想蛍光スペクトルとの比較により、基準蛍光スペクトルの修正を行ってもよい（図２１参照）。もしも基準キャピラリにおいて単色ピーク時刻を検出されないことで基準蛍光スペクトルが得られなかった場合も、ステップ２５０６ａに進む。
　次に、ステップ２５０６ａにて、実サンプルを含むキャピラリ（基準キャピラリ以外のキャピラリ）において、単色ピーク時刻を検出し、このピークが蛍光スペクトル取得のために望ましい単色ピークであるか否かの判定、即ち疑似ピーク有無の判定を行う。単色ピークが、蛍光スペクトルの取得のために望ましいか否かの判定基準の一例としては、（１）他の蛍光色素との重なり具合と（２）ピーク高さなどが挙げられる。
　上記（１）の他の蛍光色素との重なり具合による判定基準は、そのピーク時刻における他の蛍光色素の蛍光強度が十分に小さいかどうかを基準とすればよい。またなるべく、他の蛍光色素のピーク時刻と離れていることが望ましい。
　上記（２）のピークの高さの判定基準は、単色ピークの強度が適度に大きいことが望ましい。またピークの高さが大きすぎて、光学検出系のダイナミックレンジを超えてしまっているようなピークは除外すべきである。よって、予め単色ピークの強度の許容範囲の上限値と下限値を設定しておき、この許容範囲内に収まるピーク時刻を用いるべきである。
　上記のステップ２５０６ａの判定処理において、上記（１）、（２）両方の判定基準を満たす単色ピーク時刻が存在する場合（疑似ピーク有の場合）には、そのピーク時刻におけるスペクトルを取得することで、これを蛍光スペクトルとすればよい（ステップ２５０７）。
　上記のステップ２５０６ａの判定処理において、上記（１）、（２）両方の判定基準を満たす単色ピーク時刻が存在しない場合（疑似ピーク無の場合）は、ステップ２５０６ｂへ進み、かつ、ステップ２５０５において基準蛍光スペクトルが取得できている場合（基準蛍光スペクトル有の場合）には、ステップ２５０８へ進み、実施例１における図１７のステップ６０６で述べた蛍光スペクトル計算処理と同様の処理を行う。すなわち、基準キャピラリにおける基準蛍光スペクトルのサイズスタンダードのスペクトルと、他キャピラリにおけるサイズスタンダードのスペクトルの波形とから、図１９Ａ，Ｂで示すように基準蛍光スペクトルからの、他キャピラリにおけるスペクトルのシフト量を計算し（ステップ２５０８）、そのシフト量の分だけ、基準蛍光スペクトルをシフトすることで、他キャピラリの蛍光スペクトルを計算する（ステップ２５０９）。なお、ステップ２５０８における基準蛍光スペクトルとしては、実施例１と同様にアレリックラダーとサイズスタンダードの蛍光スペクトルでもよいし、他のキャピラリにおいて、実サンプルとサイズスタンダードとから取得された蛍光スペクトルが既に存在する場合には、これを基準蛍光スペクトルとして置き換えてもよい。また、前述した、初期の蛍光スペクトル（記憶部１０４に保存済と仮定）を基準蛍光スペクトルとしてもよい。
　もしも、上記のステップ２５０６の判定処理において、上記（１）、（２）両方の判定基準を満たす単色ピーク時刻が存在しない場合（疑似ピーク無の場合）で、ステップ２５０５において基準蛍光スペクトルが取得できていない場合（基準蛍光スペクトル無の場合）、もしくは、上記の基準蛍光スペクトルの有無に係りない場合には、パス２５１３へ進み、新たなマトリクスＭの計算は行わず、初期マトリクスが適用された蛍光強度波形に対してＳＴＲ解析を行ってもよい。
　その後、ステップ２５１０にてマトリクス計算処理を行う。この処理は、実施例１におけるマトリクス計算処理（図６中、ステップ６０７）と同様であり、得られた蛍光スペクトルを基に、（式２）及び（式３）によりマトリクスＭを計算する。ステップ６０７と同様に、マトリクスＭの信頼性を（式５）により評価し、マトリクスＭの信頼性が低い場合には、このマトリクスＭを用いることなく、パス２５１３へ進み、初期マトリクスが適用された蛍光強度波形に対してＳＴＲ解析を行ってもよい。
　その後、ステップ２５１１にて、蛍光強度計算処理を行う。この処理は、実施例１における蛍光強度計算処理（図６中、ステップ６０８）と同様であり、（式１）により、各時刻におけるスペクトルに対してマトリクスＭを掛けることにより、各蛍光色素の蛍光強度波形を得る。
　その後、ステップ２５１２にて、ＳＴＲ解析を行う。この処理は、実施例１におけるＳＴＲ解析処理（図６中、ステップ６０９）と同様であり、図２０で述べたような、ピーク検出処理（ステップ２００１）、Size Calling処理（ステップ２００２）、及びAllele Calling処理（ステップ２００３）を行うことで、全てのローカスに対するアレルが求められ、このアレルの組み合わせパターンが、個人識別のための遺伝子型の情報となる。
　以上に述べたように、本発明の実施例３による遺伝型解析装置では、基準蛍光スペクトルからのシフトではなく、各キャピラリにおいて、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、単色ピークを検出し、これを基に蛍光スペクトルを求めることでスペクトラルキャリブレーションを行うことを特徴とする。実施例３により、実サンプルの良好な単色ピークを用いることで、実施例１や実施例２に比べて、キャピラリ間での蛍光スペクトルの波形の微小な違いを反映し、よりよい精度でスペクトラルキャリブレーションを行うことが可能となる。
　また、本発明の実施例３による遺伝子型解析装置では、基準蛍光スペクトルを用いないため、アレリックラダーを用いない遺伝子型解析に対しても、実サンプルに対する電気泳動結果を用いてスペクトラルキャリブレーションを行うことができる。
　本発明の実施例４による遺伝子型解析装置について説明する。
  実施例１と実施例２では、基準キャピラリにおいて基準蛍光スペクトルを取得し、他キャピラリに対しては、基準蛍光スペクトルをシフトすることで、各キャピラリにおける蛍光スペクトルを計算した。実施例３では、各キャピラリにおける実サンプルの電気泳動によるスペクトルを用いて、単色ピーク時刻を検出し、蛍光スペクトルをそれぞれ取得した。ただし実施例３においても、望ましい単色ピーク時刻を検出できなかった場合には、実施例１もしくは実施例２のように基準蛍光スペクトルをシフトさせることで蛍光スペクトルを計算した。
　これら上述の実施例においては、基準蛍光スペクトルのシフト量を、サイズスタンダードのスペクトルを用いて計算した。すなわち図１９Ａ，Ｂにて前に述べたように、基準キャピラリにおけるサイズスタンダードのスペクトルと、他キャピラリにおけるサイズスタンダードのスペクトルとから、両方のスペクトル間の波長のシフト量を計算した。
　上記のようなサイズスタンダードを用いたシフト量の計算を行うための条件としては、サイズスタンダードの蛍光強度の波形から、単色ピーク時刻を問題なく検出できることを前提としていた。しかしながら、実際には基準キャピラリ、もしくは他キャピラリにおけるサイズスタンダードの濃度不足等でピーク強度が前述の許容範囲外である場合や、単色ピーク時刻に、他の蛍光色素によるノイズが重畳されている可能性などがある。このような場合には、サイズスタンダードを用いて前述のシフト量の計算を行うことは適切ではないと考えられる。
　そこで、本実施例４では、この基準キャピラリ間のシフト量を計算するために、電気泳動を行う前に、泳動媒体のみをキャピラリに充填した状態におけるラマンスペクトルのピークパターンを用いて、キャピラリ間のシフト量を計算することを特徴とする。
　以下、図面を参照して実施例４における遺伝子型解析装置の処理を説明する。実施例４による遺伝子型解析装置の構成は、図１に示される構成と同様である。
　図２６は、実施例４における遺伝子型解析装置の処理フローを示す図である。
  以下に、図２６に示すステップ２６０１～２６１１の処理を説明する。
　ステップ２６０１：実施例４における遺伝子型解析装置では、電気泳動を行う前にラマンスペクトルを取得する（ステップ２６０１）。ラマンスペクトルを取得する際には、実際の電気泳動処理で用いる光源５１４により、電気泳動媒体が充填されたキャピラリを照射することで生じるラマン散乱光を、光学検出器５１５にて検出して撮影画像を得る。この撮影画像は図２で得られる画像と同様であり、個々のキャピラリにおけるラマンスペクトルを得ることができる。
　図２７に、あるキャピラリにおけるラマンスペクトルの例を示す。ラマンスペクトルの形状は、光源の波長と泳動媒体に依存するものであり、全てのキャピラリで共通であるが、キャピラリと検出器の位置関係によって波長方向でのずれは生じ得る。
　ステップ２６０２：そこで、キャピラリ間での、上記のラマンスペクトルの形状の波長方向のシフト量を計算することで、これを基準蛍光スペクトルのシフト量とする。
　このシフト量の計算方法としては、実施例１における基準キャピラリからのシフト量計算処理（図１７中、ステップ１７０３）と同様の手法を用いることができる。すなわち、前述のように、個々のラマンスペクトルをスプライン補間等の既知技術によってデータを補間した上で、２つのスペクトルの相互相関関数を計算し、その値が最大となるシフト量を求めてもよい。
  もしくは個々のラマンスペクトルに対して、前述のガウシアンフィッティングを行ってもよい。すなわち、ラマンスペクトルでは、光源の波長と泳動媒体とはいずれも既知であるため、ラマンスペクトルのピークの数やそのピーク波長、個々の信号強度比などは予め計測することで求められる。そこで閾値処理などによって個々のピークの大まかな位置を検出し、そのピークの周辺のデータに対して前述のガウシアンフィッティング（図１１参照）を適用することで、個々のピーク波長を得ることができる。全てのキャピラリにおけるラマンスペクトルに対して、このような複数のピーク波長を求め、キャピラリ間で各々のピーク波長のシフト量を計算してもよい。
　ステップ２６０３：次に、実サンプルに対して電気泳動を行う。この処理は実施例１における電気泳動処理（図７）と同様である。ただし、同図中の泳動媒体充填処理（ステップ７０３）は、前述のラマンスペクトル取得処理（ステップ２６０１）において、既に泳動媒体が充填されているため、これを省略してもよい。
　ステップ２６０４：次に、得られた電気泳動結果のスペクトルデータを基に、蛍光強度を計算する。この処理は、実施例１における蛍光強度計算処理（図６中、ステップ６０２）と同様であり、初期のマトリクスＭを用いて、（式１）の計算に従って、各蛍光色素の蛍光強度波形を得ることができる。
　ステップ２６０５：次に、ステップ２６０４で得られた蛍光強度波形に対して、ピーク検出処理を行う。この処理は、実施例１におけるピーク検出処理（図６中、ステップ６０３）と同様であり、ガウシアンフィッティング等の既知の手法を用いることができる。
　ステップ２６０６：次に、Size Calling処理を行う。この処理は、実施例１におけるSize Calling処理（図６中、ステップ６０４）と同様であり、サイズスタンダードに割り当てられた蛍光色素（本実施例ではLIZ）のピーク時刻と、既知のＤＮＡ断片長情報とから、電気泳動時間とＤＮＡ断片長の関係式「ｙ＝ｆ（ｔ）」を得る。
　ステップ２６０７：次に、基準蛍光スペクトルを取得する。この処理は、実施例１における基準蛍光スペクトル取得処理（図６中、ステップ６０５）と同様であり、アレリックラダーを含むキャピラリを基準キャピラリとして、基準キャピラリにおける単色ピーク時刻を検出して、基準蛍光スペクトルを取得する。また、実施例２で述べたように、さらに理想蛍光スペクトルとの比較により、基準蛍光スペクトルの修正を行ってもよい（図２１参照）。実施例１のステップ６０５と同様に、もしも上記のような単色ピーク時刻が得られずに、基準蛍光スペクトルを取得できなかった場合には、前述した、基準キャピラリにおける初期の蛍光スペクトル（記憶部１０４に保存済と仮定）を基準蛍光スペクトルとしてもよい。もしくは、パス６１２へ進み、初期のマトリクスが適用された蛍光強度波形を用いてＳＴＲ解析を行ってもよい。
　ステップ２６０８：次に、蛍光スペクトルを計算する。この処理は、実施例１における蛍光スペクトル計算処理（図１７のステップ６０６）と同様の処理を行う。ただし、シフト量の計算には、図１９Ａに示すようなサイズスタンダードのスペクトルは用いずに、ステップ２６０２で得られたシフト量を用いる。そしてそのシフト量の分だけ、基準蛍光スペクトルをシフトすることで、基準キャピラリ以外のキャピラリの蛍光スペクトルを計算する。ただしステップ２６０２でラマンスペクトルの信号強度が低い等の理由により、正しく上記のシフト量が得られなかった場合には、実施例１のステップ６０６と同様にサイズスタンダードのスペクトルからシフト量を求めてもよい。また、ステップ２６０２からもシフト量が得られず、さらにサイズスタンダードからもシフト量が得られなかった場合（ノイズ等によりLIZの単色ピーク時刻が存在しない等の理由により）にはパス２６１２へ進み、新規のマトリクスの計算は行わず、初期のマトリクスが適用された蛍光強度波形を用いてＳＴＲ解析を行ってもよい。
　ステップ２６０９：その後、マトリクス計算処理を行う。この処理は、実施例１におけるマトリクス計算処理（図６中、ステップ６０７）と同様であり、得られた蛍光スペクトルを基に、（式２）及び（式３）によりマトリクスＭを計算する。ステップ６０７と同様に、マトリクスＭの信頼性を（式５）により評価し、マトリクスＭの信頼性が低い場合には、このマトリクスＭを用いることなく、パス２６１２へ進み、初期マトリクスが適用された蛍光強度波形に対してＳＴＲ解析を行ってもよい。
　ステップ２６１０：その後、蛍光強度計算処理を行う。この処理は、実施例１における蛍光強度計算処理（図６中、ステップ６０８）と同様であり、（式１）により、各時刻におけるスペクトルに対してマトリクスＭを掛けることにより、各蛍光色素の蛍光強度波形を得る。
　ステップ２６１１：その後、ＳＴＲ解析を行う。この処理は、実施例１におけるＳＴＲ解析処理（図６中、ステップ６０９）と同様であり、図２０で述べたような、ピーク検出処理（ステップ２００１）、Size Calling処理（ステップ２００２）、及びAllele Calling処理（ステップ２００３）を行うことで、全てのローカスに対するアレルが求められ、このアレルの組み合わせパターンが、個人識別のための遺伝子型の情報となる。
　以上に述べたように、本発明の実施例４による遺伝型解析装置では、基準蛍光スペクトルからのシフト量を求める際に、サイズスタンダードのスペクトルではなく、電気泳動よりも前に計測されるラマンスペクトルを用いることを特徴とする。このことにより、サイズスタンダードの蛍光強度のピーク値が小さい、もしくは他の蛍光色素の信号と重畳している等によって単色ピークが得られないような場合であっても、ラマンスペクトルから求められるシフト量を用いることで、基準蛍光スペクトルからシフトさせることで各キャピラリの蛍光スペクトルを計算することが可能となる。
　なお、本実施例４に際して、サイズスタンダードのスペクトルの代替としてラマンスペクトルを用いる際には、その条件となるサイズスタンダードのスペクトルの条件は慎重に定めるべきである。すなわち、特定のキャピラリにおいてサイズスタンダードの蛍光強度データの品質が極度に悪くなると、Size Callingが適切に行われない可能性があるため、ＳＴＲ解析の結果そのもの精度が劣化する。このような状況のキャピラリに対しては、ＳＴＲ解析自体を中止すべきと考えられる。このため、実施例４を適用する際には、Size Callingの品質を下げない範囲で、かつラマンスペクトルを用いるべき条件を定めるべきである。もしくは、サイズスタンダードの品質に依らず、常に本実施例４によってシフト量を計算してもよい。
　本発明の実施例５による遺伝子型解析装置について説明する。
  実施例３による遺伝子解析装置では、各キャピラリにおいて、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、蛍光スペクトルを求めた。その際、実サンプルから得られる蛍光強度波形から、単一蛍光色における疑似ピークが観測できるような時刻を探索し、この時刻を単色ピーク時刻として、蛍光スペクトルを求めた。
　実施例３では、上記のような単色ピーク時刻が観測されない場合には、実施例１や実施例２による遺伝子型解析装置と同様に、アレリックラダーに対して電気泳動が行われるキャピラリを基準キャピラリとし、基準キャピラリにおける基準蛍光スペクトルを求めた。そして基準蛍光スペクトルと、基準キャピラリ以外のスペクトル間のシフト量を求め、この量だけ基準蛍光スペクトルをシフトさせることで、基準キャピラリ以外の全てのキャピラリにおける蛍光スペクトルを求め、全キャピラリのマトリクスＭを計算した。
　しかし、実施例３において述べたように、各々のキャピラリの蛍光スペクトルを、基準キャピラリにおける基準蛍光スペクトルからのシフトにより求めているため、キャピラリ間で蛍光スペクトルの形状が変化することは想定していない。実際には、光学系や計測系の何らかの要因により、蛍光スペクトルの形状が微小に異なる可能性がある。
　このため、疑似ピークが観測できない場合、上記のような基準蛍光スペクトルからのシフトによる蛍光スペクトルでは、適切なマトリクスが得られない可能性がある。そもそも、疑似ピークが観測できないときは、初期マトリクスが適切である可能性もあるため、実施例３による方法では、初期マトリクスよりも不適切なマトリクスが得られてしまう可能性がある。
　そこで、実施例５による遺伝子解析装置では、実施例３の変形例として、アレリックラダーによる基準蛍光スペクトルを求めることなく、個々のキャピラリにおける蛍光強度波形のみから蛍光スペクトルを求めることを特徴とする。
　以下、図面を参照して実施例５における遺伝子型解析装置の処理を説明する。実施例５による遺伝子型解析装置の構成は、図１に示される構成と同様である。
　図３１は、実施例５における遺伝子型解析装置の処理フローを示す図である。
  以下に、図３１に示すステップ３１０１～３１０７の処理に関して説明する。
　ステップ３１０１にて、実サンプルに対して電気泳動を行う。この処理は実施例１における電気泳動処理（図７）と同様である。なお実施例５ではアレリックラダーを実サンプルと同様に扱う。
　次に、ステップ３１０２にて、蛍光強度を計算する。この蛍光強度の計算手法は実施例１と同様である。なお本実施例では、ステップ３１０２が初回の蛍光強度計算であれば、実施例１と同様、初期マトリクスを用いて計算する。すなわち予め計測によって初期マトリクス、及び初期マトリクスを得るための蛍光スペクトルが得られているものと仮定し、この初期マトリクスを用いて、（式１）により各蛍光色の蛍光強度波形を計算する。
  もしもステップ３１０２が２回目以降の蛍光強度計算である場合、すなわち既に本実施例によるマトリクス計算が行われている場合には、前回で算出されたマトリクス（後述するステップ３１０６）を用いて、（式１）により各蛍光色の蛍光強度波形を計算してもよい。
　次に、ステップ３１０３にて、各蛍光色の蛍光強度波形に対してピーク検出を行う。この処理は実施例１（図６のステップ６０３）と同様である。
　次に、ステップ３１０４にて、疑似ピークの有無を判定する。実施例３における図３０で述べたように、ステップ３１０２における蛍光強度波形の計算に用いられたマトリクスが適切でない場合、ある蛍光色の主ピークに対して、疑似ピークが主ピークと同じピーク位置に出現する可能性がある。そこで、ステップ３１０４では、ステップ３１０３で検出されたピークの中から、このような各蛍光色における疑似ピークを探索する。
  ある蛍光色の主ピークに対して疑似ピークが検出されなかった場合には、ステップ３１０２で用いられたマトリクスに対応する蛍光スペクトルを採用する。すなわち、この処理は、初期マトリクスに対応する（式２）の蛍光スペクトル行列Ｓのある列ベクトルを、疑似ピーク時刻におけるスペクトルで置き換えることに相当する。
  もしもある蛍光色に対する疑似ピークが存在しない場合はその蛍光スペクトルが適切であると見なし、その蛍光色のスペクトルは変更しない。そして全ての蛍光色において疑似ピークが検出されなかった場合に、ステップ３１０２で用いられたマトリクスを最終的なマトリクスとして採用し、ステップ３１０７のＳＴＲ解析に進む。このステップ３１０７のＳＴＲ解析の処理内容は、実施例１と同様である。
　ステップ３１０４において、一つ以上の蛍光色において疑似ピークが検出された場合には、ステップ３１０５に進み、蛍光スペクトルを取得する。
　ステップ３１０５の処理は、実施例３と同様であり、疑似ピークが存在する時刻を単色ピーク時刻として、ステップ３１０５においてこの時刻における計測スペクトルを、その蛍光色の蛍光スペクトルとする。
　その後、ステップ３１０６において、得られた蛍光スペクトルから（式３）によってマトリクスを算出する。この処理は実施例１と同様である。その後、得られたマトリクスを用いてステップ３１０４に戻り、前述した蛍光強度計算（ステップ３１０２）、ピーク検出（ステップ３１０３）を経て、再度疑似ピーク判定（ステップ３１０４）を行う。このような処理を疑似ピークが検出されなくなるまで繰り返すことで、マトリクスを更新する。
　ステップ３１０４における疑似ピークの探索が適切に行われていれば、通常は、上記の処理を一定回数繰り返すことで疑似ピークが検出されなくなるようなマトリクスが得ることができる。しかし疑似ピークの探索が適切でない場合には、上記の処理を繰り返しても疑似ピークが検出されてしまう可能性がある。
  このような場合に備え、実際には上記の繰り返し回数に上限を設けておき、上記の繰り返し数が上限に達した場合には、例えば、最も疑似ピークのレベルが低いマトリクスを採用する、初期マトリクスを採用する、などの処理を行うことが望ましい。
　また、ステップ３１０４における上記の疑似ピークの探索の際、疑似ピークの判定条件を変更して再度マトリクスを算出する手段がユーザインタフェース部１０３によって提供されてもよい。このような疑似ピークの判定条件の項目としては、例えば、実施例３で述べたような主ピークの高さに対する疑似ピークの高さの比や、主ピークと疑似ピークの高さの各々の最大値と最小値、主ピークの時刻と疑似ピークの時刻との時刻差や、マトリクスの繰り返し回数などが挙げられる。
　このような提示形態の一例を図３３に示す。同図では画面（３３０１）中に、各蛍光の蛍光強度波形を重ねて示す領域（３３０２）、上記の疑似ピーク判定条件値を設定する領域（３３０３）などが提示されている例を示す。ユーザはこれらの値を、ユーザインタフェース部１０３における、図示しない入力手段（例えばマウスポインタやキーボード）を用いて設定してもよい。
　また、図３３では、上記のような疑似ピーク判定による単色ピーク時刻の自動計算結果（３３０４）を画面（３３０１）で確認し、必要に応じて各々の色の単色ピーク時刻を手動で変更できるようにしている。このように、単色ピーク時刻をユーザで確認及び変更することができれば、より安定したマトリクスを得ることができる。
以上に述べたように、本発明の実施例５による遺伝型解析装置では、基準蛍光スペクトルからのシフトではなく、各キャピラリにおいて、実サンプルに対して行われる電気泳動のスペクトルを用いて、単色ピークを検出し、これを基に蛍光スペクトルを求めることでスペクトラルキャリブレーションを行うことを特徴とする。この際、実サンプルにおける疑似ピークを探索し、この疑似ピークが検出されなくなるようなマトリクスを繰り返し算出することで、より適切なマトリクスを得ることが可能となる。
　以上、本発明を実施するための最良の形態について説明したが、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容されるものである。例えば、サンプルの流路が内部に形成されたマイクロチップ式の電気泳動装置を用いてもよい。この場合には本明細書におけるキャピラリを流路と読み替えればよい。また、スラブゲルを用いた電気泳動装置にも同様に本発明を適用できる。
　また、本発明は、実施例の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードによっても実現できる。この場合、プログラムコードを記録した記憶媒体をシステム或は装置に提供し、そのシステム或は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出す。この場合、記憶媒体から読み出されたプログラムコード自体が前述した実施例の機能を実現することになり、そのプログラムコード自体、及びそれを記憶した記憶媒体は本発明を構成することになる。このようなプログラムコードを供給するための記憶媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ－ＲＯＭ、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ－Ｒ、磁気テープ、不揮発性のメモリカード、ＲＯＭなどが用いられる。
　また、プログラムコードの指示に基づき、コンピュータ上で稼動しているＯＳ（オペレーティングシステム）などが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。さらに、記憶媒体から読み出されたプログラムコードが、コンピュータ上のメモリに書きこまれた後、そのプログラムコードの指示に基づき、コンピュータのＣＰＵなどが実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によって前述した実施の形態の機能が実現されるようにしてもよい。
　また、実施の形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムコードを、ネットワークを介して配信することにより、それをシステム又は装置のハードディスクやメモリ等の記憶手段又はＣＤ－ＲＷ、ＣＤ－Ｒ等の記憶媒体に格納し、使用時にそのシステム又は装置のコンピュータ（又はＣＰＵやＭＰＵ）が当該記憶手段や当該記憶媒体に格納されたプログラムコードを読み出して実行するようにしても良い。
　上記実施形態から把握できる本発明の構成要件は以下の通りである。
（１）複数の流路からなる流路アレイに励起光を照射し、流路アレイにおける発光を分光して光検出器上にスペクトルを結像する電気泳動手段により得られるスペクトルを基に、複数の蛍光色素で標識されたＤＮＡサンプルにおける各々の蛍光強度を計算する遺伝子型解析方法において、そのＤＮＡサンプルに対する電気泳動で得られるスペクトルを基に、複数の蛍光色素の基準蛍光スペクトルを求め、該基準蛍光スペクトルを波長方向にシフトさせることで、各流路の蛍光スペクトルを求める、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（２）上記（１）において、基準蛍光スペクトルを、既知の長さのＤＮＡ断片を含むサンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出する、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（３）上記（１）において、基準蛍光スペクトルとして、予め計測された理想蛍光スペクトルとする、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（４）上記（２）において、基準蛍光スペクトルを、予め計測された理想蛍光スペクトルを参照して修正する、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（５）上記（１）において、基準蛍光スペクトルを、遺伝子型解析の対象である実サンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出することにより求める、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（６）上記（１）乃至（５）のいずれかにおいて、各流路における、サイズスタンダードを標識する蛍光色素の単一の蛍光スペクトルを抽出することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、前記基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（７）上記（１）乃至（５）のいずれかにおいて、各流路における、ラマンスペクトルを計測することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（８）上記（１）において、蛍光スペクトルを、遺伝子型解析の対象である実サンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出できるか否かを判定し、該判定が否である場合には、基準蛍光スペクトルをシフトさせることで前記の蛍光スペクトルを求める、ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
（９）励起光を照射する光源と、複数の流路からなる流路アレイと流路アレイの両端部に電圧を印加する電圧源と流路アレイから発光する光を検出する光検出器とを具備してなる電気泳動装置と、電気泳動装置と情報の授受を行うデータ解析装置とを有し、
　前記流路アレイに複数の蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片を有するＤＮＡサンプルを投入し、電圧源を用いて流路アレイ中のＤＮＡ断片を移動させながら、流路アレイに対して光源から励起光を照射し、照射により前記流路アレイから放出される発光を分光して光検出器上にスペクトルを結像させ、データ解析装置において、結像したスペクトルを基に複数の蛍光色素の基準蛍光スペクトルを求め、該基準蛍光スペクトルを波長方向にシフトさせることで、各流路の蛍光スペクトルを求めることを特徴とする遺伝子型解析装置。
（１０）上記（９）において、基準蛍光スペクトルを求め、該基準蛍光スペクトルを波長方向にシフトさせることで、各流路の蛍光スペクトルを求める、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
（１１）上記（９）において、基準蛍光スペクトルを、既知の長さのＤＮＡ断片を含むサンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出する、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
（１２）上記（９）において、基準蛍光スペクトルとして、予め計測された理想蛍光スペクトルとする、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
（１３）上記（１０）において、基準蛍光スペクトルを、予め計測された理想蛍光スペクトルを参照して修正する、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
（１４）上記（９）において、基準蛍光スペクトルを、遺伝子型解析の対象である実サンプルのスペクトルのうち、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出することにより求める、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
（１５）上記（９）乃至（１４）のいずれかにおいて、各流路における、サイズスタンダードを標識する蛍光色素の単一の蛍光スペクトルを抽出することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、前記基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
（１６）上記（９）乃至（１４）のいずれかにおいて、各流路における、ラマンスペクトルを計測することで、流路間の蛍光スペクトルの波長方向のシフト量を求め、該シフト量の分だけ、前記基準蛍光スペクトルをシフトする、ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
　１０１…遺伝子型解析装置、
　１０２…中央制御部、
　１０３…ユーザインタフェース部、
　１０４…記憶部、
　１０５…電気泳動装置、
　１０６…サンプル情報設定部、
　１０７…ピーク検出部、
　１０８…電気泳動装置制御部、
　１０９…マトリクス計算部、
　１１０…蛍光強度計算部、
　１１１…ＳＴＲ解析部、
　１１２…データ解析装置。

Claims (12)

  1. 　複数の流路からなる流路アレイのそれぞれに、複数の蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片を有するＤＮＡサンプルを投入し、
    　電気泳動手段を用いて前記流路アレイ中を移動させながら前記ＤＮＡ断片に対して励起光を照射し、
    　照射により前記流路アレイから放出される発光を分光して得られたスペクトルを基に、前記ＤＮＡ断片の各々に対する蛍光強度波形を算出し、
    　算出した前記各々の蛍光強度波形を基に、前記複数の蛍光色素の蛍光スペクトルを求める、
    ことを特徴とする遺伝子型解析方法。
  2. 　前記ＤＮＡサンプルとして遺伝子型解析の対象である実サンプルを準備し、
    　分光して得られた前記実サンプルのスペクトルの中から、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出し、抽出した前記スペクトルに基づき前記蛍光スペクトルを求める、
    ことを特徴とする請求項１に記載の遺伝子型解析方法。
  3. 　前記単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを、前記蛍光強度波形の疑似ピークを探索することにより抽出する、
    ことを特徴とする請求項２に記載の遺伝子型解析方法。
  4. 　前記疑似ピークが検出されないか、もしくは繰り返し回数が設定上限値に到達するか、のいずれかを満たすまで、前記疑似ピークの探索と前記蛍光強度波形の算出とを繰り返し実行する、
    ことを特徴とする請求項３に記載の遺伝子型解析方法。
  5. 　前記蛍光スペクトルを、以前に求められた蛍光スペクトルとする、
    ことを特徴とする請求項２乃至４のいずれか一つに記載の遺伝子型解析方法。
  6. 　前記疑似ピークの探索において、前記疑似ピークの検出条件、もしくは前記疑似ピークの検出結果を表示し、該表示を参照しながら前記検出条件もしくは前記検出結果をユーザによる変更ができる、
    ことを特徴とする請求項５に記載の遺伝子型解析方法。
  7. 　励起光を照射する光源と、
    　複数の流路からなる流路アレイと、前記流路アレイの両端部に電圧を印加する電圧源と、前記流路アレイから発光する光を検出する光検出器と、を具備してなる電気泳動装置と、
    　前記電気泳動装置と情報の授受を行うデータ解析装置と、を有し、
    　前記流路アレイに複数の蛍光色素で標識されたＤＮＡ断片を有するＤＮＡサンプルを投入し、
    　前記電圧源を用いて前記流路アレイ中の前記ＤＮＡ断片を移動させながら、前記流路アレイに対して前記光源から励起光を照射し、
    　照射により前記流路アレイから放出される発光を分光して前記光検出器上にスペクトルを結像させ、
    　前記データ解析装置において、結像したスペクトルを基に前記ＤＮＡ断片の各々に対する蛍光強度波形を算出し、算出した前記各々の蛍光強度波形を基に、前記複数の蛍光色素の蛍光スペクトルを求める、
    ことを特徴とする遺伝子型解析装置。
  8. 　前記ＤＮＡサンプルとして遺伝子型解析の対象である実サンプルを用いる場合であって、
    　前記データ解析装置において、分光して得られた前記実サンプルのスペクトルの中から、単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを抽出し、抽出した前記スペクトルに基づき前記蛍光スペクトルを求める、
    ことを特徴とする請求項７に記載の遺伝子型解析装置。
  9. 　前記データ解析装置において、前記単一の蛍光色素の発光によるスペクトルを、前記蛍光強度波形の疑似ピークを探索することにより抽出する、
    ことを特徴とする請求項８に記載の遺伝子型解析装置。
  10. 　前記データ解析装置において、前記疑似ピークが検出されないか、もしくは繰り返し回数が設定上限値に到達するか、のいずれかを満たすまで、前記疑似ピークの探索と前記蛍光強度波形の算出とを繰り返し実行する、
    ことを特徴とする請求項９に記載の遺伝子型解析装置。
  11. 　前記蛍光スペクトルを、以前に求められた蛍光スペクトルとする、
    ことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一つに記載の遺伝子型解析装置。
  12. 　前記データ解析装置における前記疑似ピークの探索において、前記疑似ピークの検出条件、もしくは前記疑似ピークの検出結果を表示し、該表示を参照しながら前記検出条件もしくは前記検出結果をユーザが変更できる、
    ことを特徴とする請求項１１に記載の遺伝子型解析装置。
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