WO2014080703A1 - ガレクチン９の改変タンパク質 - Google Patents

ガレクチン９の改変タンパク質 Download PDF

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WO2014080703A1
WO2014080703A1 PCT/JP2013/077514 JP2013077514W WO2014080703A1 WO 2014080703 A1 WO2014080703 A1 WO 2014080703A1 JP 2013077514 W JP2013077514 W JP 2013077514W WO 2014080703 A1 WO2014080703 A1 WO 2014080703A1
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galectin
protein
seq
peptide
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PCT/JP2013/077514
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French (fr)
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西　望
愛子 伊藤
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国立大学法人香川大学
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    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
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    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a modified protein of galectin-9.
  • Wild type galectin 9 has a function of correcting the breakdown of the immune system such as suppression of excessive immune reaction or activation of immunity against cancer through T cell differentiation or homeostasis.
  • Wild-type galectin 9 is composed of two sugar chain recognition domains (Carbohydrate Recognition Domain: CRD) and a linked peptide region connecting them.
  • CRD Carbohydrate Recognition Domain
  • Wild-type galectin-9 which is a recombinant produced using E. coli as a host, acts directly on tumor cells (ie, the activity of inducing tumor cell-cell adhesion and tumor cell apoptosis) and the immune system. It has been suggested that this action induces suppression and regression of cancer metastasis.
  • wild type galectin 9 does not act on non-activated lymphocytes and induces apoptosis of activated T cells, particularly CD4 positive T cells that cause hyperimmune reactions. Furthermore, it has been clarified that it has a strong apoptosis-inducing ability for synovial cells involved in joint deformation and the like in rheumatism.
  • Such a function of wild type galectin 9 indicates that wild type galectin 9 is useful as a therapeutic agent for various diseases.
  • Patent Document 1 no effective solution has been reported for the problems of low solubility and low yield of recombinant protein. Therefore, in order to commercialize a medicine using the excellent function of wild-type galectin 9, it is strongly demanded to provide a modified galectin 9 having excellent solubility and yield.
  • an object of the present invention is to provide a modified galectin 9 that retains substantially the same physiological activity as wild-type galectin 9 and is excellent in protease stability and solubility.
  • the present invention is a protein or a salt thereof comprising NCRD and CCRD, wherein the NCRD C-terminus and CCRD N-terminus are bound directly or indirectly,
  • the NCRD is (N1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (N2) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a sugar-binding ability, or (N3) a peptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a sugar-binding ability,
  • the CCRD is: A peptide consisting of an N-terminal region and a C-terminal region and having a sugar-binding ability;
  • the N-terminal region is (C-N1) a peptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 17 amino acids are deleted in the amino acid sequence represented by
  • the nucleic acid of the present invention is characterized by having a base sequence encoding the protein of the present invention.
  • the expression vector of the present invention is characterized by having the nucleic acid of the present invention.
  • the transformant of the present invention has the nucleic acid of the present invention or the expression vector of the present invention.
  • the medicament of the present invention comprises at least one of the protein of the present invention and a salt thereof, the nucleic acid of the present invention, and the expression vector of the present invention.
  • the protein of the present invention or a salt thereof is a modified form of wild type galectin 9, and hereinafter referred to as a modified form of galectin 9 of the present invention.
  • the modified galectin 9 of the present invention retains the same physiological activity as wild-type galectin 9, and is excellent in protease stability (also referred to as resistance or sensitivity) and solubility. Excellent yield when manufactured as a recombinant protein.
  • the modified galectin 9 of the present invention not only retains the physiological activity of wild-type galectin, but also has excellent stability, handleability, and yield during production, and thus is extremely useful as a pharmaceutical raw material. I can say that.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the sequence of stabilized galectin-9.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of SDS-PAGE of galectin-9 variant in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the concentration of a deletion type galectin-9 variant in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the concentration of a deletion / substitution type galectin-9 variant in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing protease stability in Example 1 of the present invention.
  • the galectin 9 variant of the present invention has NCRD and CCRD, and a protein in which the C-terminal of NCRD and the N-terminus of CCRD are bound directly or indirectly or Its salt
  • the NCRD is (N1) a peptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (N2) a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a sugar-binding ability, or (N3) a peptide comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having a sugar-binding ability
  • the CCRD is: A peptide consisting of an N-terminal region and a C-terminal region and having a sugar-binding ability; The N-terminal region is (C-N1) a peptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 17 amino
  • Wild type galectin 9 is a protein having two sugar recognition domains (CRD) as described above.
  • the modified galectin 9 of the present invention has substantially the same physiological activity as wild-type galectin 9, and exhibits superior protease stability and solubility compared to wild-type galectin 9. Furthermore, the modified galectin 9 of the present invention exhibits an excellent yield at the time of production as a recombinant protein due to the solubility, for example.
  • “substantially the same physiological activity” means, for example, that the physiological activity of the modified galectin 9 is the same type of activity as that of the wild-type galectin 9 or a similar type of activity. means.
  • the physiological activity of wild-type galectin 9 is, for example, specific binding activity to a specific sugar chain, cytotoxic activity, apoptosis-inducing activity, anti-inflammatory activity, anti-allergic activity, immunoregulatory activity, physiological activity or biological activity. Etc. Furthermore, in the present invention, “substantially the same physiological activity as wild-type galectin 9” means, for example, a physiological activity related to treatment of a disease and the like. And the meaning of yield is not included.
  • the modified galectin 9 of the present invention preferably has substantially the same or higher physiological activity as, for example, wild type galectin 9.
  • “Substantially the same physiological activity as wild-type galectin 9” means that the physiological activity substantially the same as that of wild-type galectin 9 is comparable.
  • Substantially the same or higher is, for example, about 0.001 to about 100 times, preferably about 0.01 to about 100 times, more preferably about about 100 times the physiological activity of wild-type galectin 9. Examples thereof include 0.1 to about 100 times, more preferably about 0.5 to about 100 times.
  • solubility means, for example, solubility in an aqueous medium.
  • aqueous medium include various buffers such as water, physiological saline, and phosphate buffer, and mixtures thereof. Is given.
  • the NCRD is an N-terminal C-type sugar recognition domain (CRD)
  • the CCRD is a C-terminal C-type sugar recognition site (CRD).
  • the NCRD is any one of the peptides (N1), (N2) and (N3) as described above.
  • the NCRD is a peptide having a sugar binding ability as described above.
  • the peptide (N1) is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the peptide (N2) is a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence (N1).
  • the peptide of (N2) is not particularly limited as long as it has a function equivalent to that of the peptide of (N1), and specifically, it only needs to have a sugar binding ability.
  • the one or several is, for example, 1 to 45, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, further preferably 1 to 7, particularly preferably 1, 2, or 3. is there.
  • the peptide (N3) is a peptide consisting of an amino acid sequence showing 70% or more identity with the amino acid sequence (N1).
  • the peptide of (N3) is not particularly limited as long as it has a function equivalent to that of the peptide of (N1), and specifically, it only needs to have a sugar binding ability.
  • the identity is, for example, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more. 98% or more and 99% or more.
  • the CCRD is a peptide having an N-terminal region and a C-terminal region and having a sugar binding ability.
  • the N-terminal region and the C-terminal region are shown below, respectively, and these may have a sugar-binding ability as the CCRD in a linked state.
  • the N-terminal region in the CCRD is the peptide of (C-N1), that is, a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 17 amino acids are deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • C-N1 a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 17 amino acids are deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 3 the 10th and 11th amino acids (X) are proline or histidine, and preferably one of them is proline, and XX is, for example, Pro-Pro (PP), Pro-His (PH ) Or His-Pro (HP).
  • the 12th and 13th amino acid residues (X) are proline or alanine, and preferably one of them is proline, and XX is, for example, Pro-Pro (PP), Pro-Ala (PA) or Ala-Pro (AP) is preferred.
  • the lower limit of the number of amino acid residues to be deleted in the peptide (C-N1) is 1, preferably 6, and more preferably 8, and the upper limit thereof is 17.
  • the number is preferably 14, more preferably 13, more preferably 12, and the range is, for example, preferably 6-14, more preferably 8-14 or 9-14. More preferably 8 to 13 or 9 to 13, particularly preferably 10 to 12.
  • description of a numerical range also means disclosure of values included in the range.
  • a description of 6-14 means disclosure of 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, and 14.
  • the amino acid deletion in the peptide (C-N1) may be, for example, either a continuous amino acid deletion or a discontinuous amino acid deletion.
  • the deletion is preferably a deletion of consecutive amino acids, and particularly preferably a deletion consecutive from the N-terminal amino acid. Further, in the N-terminal region, both continuous amino acid deletion and discontinuous amino acid deletion may exist.
  • the deletion of consecutive amino acids it is preferable that the N-terminal amino acid is first, for example, the aforementioned number of amino acids is deleted. As a specific example, for example, 6 to 14 amino acids are preferable, more preferably 8 amino acids. -14 or 9-14, more preferably 8-13 or 9-13, particularly preferably 10-12.
  • a proline residue is preferably conserved.
  • at least one amino acid residue selected from the group consisting of the 10th, 11th, 12th, 13th, 15th and 17th is proline. It is preferable.
  • at least one of the 10th and 11th amino acid residues is proline as described above.
  • at least one of the 12th and 13th amino acid residues is proline as described above, for example, Pro-Pro (PP), Pro-Ala (PA) or Ala-Pro (AP) is preferred.
  • peptide (C-N1) examples include the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 7 to 20.
  • the peptide (C-N1) is not limited to the following amino acid sequences.
  • the peptide in the C-terminal region of the CCRD is any one of the peptides (C-C1), (C-C2), and (C-C3).
  • the peptide (C-C1) is a peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 5 129aa FITTILGGLYPSKSILLSGTVLPSAQRFHINLCSGNHIAFHLNPRFDENAVVRNTQIDNSWGSEERSLPRKMPFVRGQSFSVWILCEAHCLKVAVDGQHLFEYYHRLRNLPTINRLEVGGDIQLTHVQT
  • the peptide (C-C2) is a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence (C-C1).
  • the one or several is, for example, 1 to 39, preferably 1 to 26, more preferably 1 to 13, further preferably 1 to 6, particularly preferably 1, 2 or 3. is there.
  • the peptide (C-C3) is a peptide consisting of an amino acid sequence showing 70% or more identity with the amino acid sequence (C-C1).
  • the identity is, for example, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more. 98% or more and 99% or more.
  • CCRD composed of the N-terminal region and the C-terminal region
  • CCDR peptide is not limited to the following sequences.
  • the NCRD and the CCRD may be a directly bound protein or an indirectly bound protein as described above, and preferably the former.
  • the NCRD C-terminal and the CCRD N-terminal may be indirectly bonded via a linker, for example.
  • the linker include amino acids and peptides.
  • the number of amino acid residues of the peptide is not particularly limited, but is preferably short, for example, 2 to 5, preferably 4 or less, 3 or less, 2 or less, or 1.
  • the sequence of the peptide is not particularly limited and can be set arbitrarily.
  • Specific examples of the peptides include His-Met (HM), Arg-Ile-Pro (RIP), Asn-Leu (NL), Asp-Phe-Val (DFV), and Gly-Ser-Ala (GSA). And the like, and peptides comprising the above sequences.
  • modified galectin 9 of the present invention include peptides consisting of any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35 to 48 shown in Table 3 below.
  • the galectin-9 variant of this invention is not restrict
  • each amino acid may be substituted with, for example, another amino acid or amino acid analog in the class to which each belongs.
  • the class include a class classified by chemical characteristics and / or physical characteristics. Examples of the characteristics include hydrophobicity and hydrophilicity, charge, size, and the like. Specific examples include nonpolar amino acids (hydrophobic amino acids), polar amino acids (neutral amino acids), positively charged amino acids (acidic amino acids). ), Negatively charged amino acids (acidic amino acids) and the like.
  • nonpolar amino acids examples include alanine, phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, proline, tryptophan, methionine, and the like, and examples of the polar amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine, and glutamine.
  • the positively charged amino acid examples include arginine, lysine, and histidine
  • examples of the negatively charged amino acid include aspartic acid and glutamic acid.
  • the salt of the protein is not particularly limited, and the above-described protein may be in a salt form.
  • amino acid residues may be further modified.
  • modification include partial decomposition of amino acid residues, modification to a derivative, bonding of a protecting group, bonding of a sugar chain, and the like. Specific examples include amidation or carboxylation such as a C-terminus. Examples include esterification.
  • the method for producing the galectin-9 variant of the present invention is not particularly limited, and for example, it may be produced by a genetic engineering technique or a synthetic technique based on its amino acid sequence.
  • the former may be, for example, a cell system using a host or a cell-free protein synthesis system.
  • a genetic engineering technique for example, a nucleic acid having a base sequence corresponding to the amino acid sequence, an expression vector having the nucleic acid, and the like can be used.
  • the method for producing the galectin-9 variant, the nucleic acid encoding the galectin-9 variant and the expression vector will be described later.
  • Nucleic acid, expression vector and transformant (1) Nucleic acid The nucleic acid of the present invention is characterized by having a base sequence encoding the modified galectin 9 of the present invention.
  • the modified galectin 9 of the present invention can be produced by using the nucleic acid of the present invention and expressing the protein encoded by the nucleic acid in a host or a cell-free protein synthesis system by, for example, genetic engineering techniques.
  • the base sequence of the nucleic acid of the present invention is not particularly limited, and can be designed by replacing with a codon based on the amino acid sequence of the modified galectin 9 of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention can be synthesized by, for example, genetic engineering techniques or organic synthetic techniques, and can also be referred to as synthetic DNA such as cDNA or synthetic RNA.
  • the nucleic acid of the present invention may be, for example, either a sense strand or an antisense strand, or a hybrid thereof.
  • the nucleic acid of the present invention includes, for example, the polynucleotide encoding the NCRD (NCRD polynucleotide) and the polynucleotide encoding the CCRD (CCRD polynucleotide), and the CCRD polynucleotide is located at the 3 ′ end of the NCRD polynucleotide.
  • Examples include polynucleotides in which the 5 ′ end of the nucleotide is bound directly or indirectly.
  • the NCRD polynucleotide and the CCRD polynucleotide are linked so that the respective reading frames correspond to the amino acids of the NCRD and the CCRD.
  • a linker may be provided between the NCRD polynucleotide and the CCRD polynucleotide. In this case, it is preferable to design the linker sequence so that the reading frame of the CCRD polynucleotide does not change.
  • the linker is, for example, a polynucleotide.
  • the (n1) polynucleotide encoding the peptide (N1) is represented by the base sequence of SEQ ID NO: 2, for example.
  • SEQ ID NO: 2 atggccttcagcggttcccaggctccctacctgagtccagctgtccccttttctgggactattcaaggaggtctccaggacggacttcagatcactgtcaatgggaccgttctcagctccagtggaaccaggtttgctgtgaactttcagactggcttcagtggaaatgacattgccttccacttcaaccctcggtttgaagatggagggtacgtggtgtgcaacacgaggcagaacggaagctgggtgtgcaacacgaggcagaacggaagctgggggtgtgcaacac
  • the (c-n1) polynucleotide encoding the peptide (C-N1) which is the N-terminal region of the CCRD, has, for example, a set of three consecutive bases in the base sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the codon is represented by a base sequence from which 1 to 17 sets are deleted.
  • the number of codon sets to be deleted and the position of the codon to be deleted correspond to, for example, the number of amino acid residues to be deleted and the position of the amino acid to be deleted described in the peptide (C-N1).
  • the underlined base is a sequence encoding the 10th to 13th amino acids in SEQ ID NO: 3, and can be set according to the amino acid.
  • SEQ ID NO: 4 actcccgccatcccacctatgatgtacnnnnnnnnnnnnnnntatccgatgcct
  • polynucleotide (c-n1) polynucleotide examples include the following base sequences.
  • the polynucleotide (c-n1) is not limited to the following sequences.
  • the (c-c1) polynucleotide encoding the peptide (C-C1) is represented by the base sequence of SEQ ID NO: 6, for example.
  • SEQ ID NO: 6 ttcatcaccaccattctgggagggctgtacccatccaagtccatcctcctgtcaggcactgtcctgcccagtgctcagaggttccacatcaacctgtgctctgggaaccacatcgccttccacctgaacccccgttttgatgagaatgctgtggtccgcaacacccagatcgacaactcctgggggtctgaggagcgaagtctgccccgaaaaatgccttcccgtggccagagcttctcagtgtggatcttgtgtgtgaaaatgccctccgt
  • a polynucleotide encoding the CCRD consisting of the N-terminal region and the C-terminal region has a sequence number 6 at the 3 ′ end of the base sequence of each sequence number shown in Table 2 above.
  • are base sequences in which the 5 ′ ends of these base sequences are linked SEQ ID NOs: 63 to 76 shown in Table 2).
  • the CCRD polynucleotide is not limited to these sequences.
  • nucleic acid encoding the galectin-9 variant of the present invention include a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 77 to 90 shown in Table 3 above.
  • the nucleic acid of the present invention is not limited to these examples.
  • the nucleic acid may be, for example, a polynucleotide, for example, DNA or RNA.
  • RNA include a base sequence in which T is replaced with U in the base sequence of the exemplified DNA.
  • DNA include sequences containing deoxyribonucleotides and sequences composed of deoxyribonucleotides.
  • RNA include sequences containing ribonucleotides and sequences composed of ribonucleotides.
  • the nucleic acid may be, for example, a sequence made of an artificial nucleic acid, or the DNA or RNA may be a sequence further containing an artificial nucleic acid. Examples of the artificial nucleic acid include LNA, PNA, BNA and the like.
  • the expression vector of the present invention comprises the nucleic acid of the present invention.
  • the galectin-9 variant of the present invention can be produced by introducing the expression vector of the present invention into a host, for example, and expressing the protein encoded by the nucleic acid in the obtained transformant.
  • the expression vector of the present invention only needs to functionally contain the nucleic acid of the present invention so that the modified galectin 9 of the present invention can be expressed, and other configurations are not particularly limited.
  • the expression vector only needs to express the modified galectin-9 of the present invention by, for example, introduction into a non-human host.
  • the non-human host is not particularly limited and can be appropriately selected.
  • the non-human host include microorganisms, animal cells, insect cells, plant cells, or cultured cells thereof.
  • the microorganism include prokaryotes and eukaryotes.
  • the prokaryote include, for example, Escherichia such as Escherichia coli, Bacillus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas putida such as Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, etc.
  • bacteria of the genus Rhizobium include bacteria of the genus Rhizobium.
  • Examples of the eukaryote include yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe.
  • Examples of the animal cells include COS cells and CHO cells, and examples of the insect cells include Sf9 cells and Sf21 cells.
  • the expression vector can be prepared, for example, by inserting the nucleic acid into a backbone vector (hereinafter also referred to as “basic vector”).
  • the type of the basic vector is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of the host into which the expression vector is introduced.
  • examples of the basic vector include pET vector (Merck), pCold vector (Takara Bio), PQE vector (QIAGEN) and the like.
  • examples of the basic vector include pYE22m, and a commercially available yeast expression vector such as pYES (Invitrogen) or pESC (Stratagene) is used. You can also.
  • the basic vector is preferably a binary vector, and examples thereof include pBI121, pPZP202, pBINPLUS, and pBIN19.
  • the expression vector preferably has a regulatory sequence that regulates, for example, nucleic acid expression and protein expression.
  • the regulatory sequence include a promoter, terminator, enhancer, polyadenylation signal sequence, origin of replication sequence (ori) and the like.
  • the origin of the promoter is not particularly limited, and examples thereof include cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV-40), muscle ⁇ -actin promoter, herpes simplex virus (HSV) and the like. can give.
  • a tissue-specific promoter such as a thymidine kinase promoter, a regulatory promoter such as a growth hormone regulatory promoter, a promoter under the control of the lac operon sequence, an inducible such as a zinc-inducible metallothionein promoter Promoters and the like.
  • the arrangement of the regulatory sequences is not particularly limited.
  • the regulatory sequence only needs to be arranged so that, for example, nucleic acid expression and protein expression can be functionally regulated, and can be arranged based on a known method.
  • the regulatory sequence for example, a sequence provided in advance in the basic vector may be used, the regulatory sequence may be further inserted into the basic vector, and the regulatory sequence provided in the basic vector It may be replaced with the regulatory sequence.
  • the expression vector may further include a selection marker coding sequence, for example.
  • a selection marker include drug resistance markers, fluorescent protein markers, enzyme markers, cell surface receptor markers, and the like.
  • transformant of the present invention is characterized by having the nucleic acid of the present invention or the expression vector of the present invention.
  • the transformant of the present invention only needs to functionally contain the nucleic acid of the present invention so that the modified galectin 9 of the present invention can be expressed, and other configurations are not particularly limited.
  • the transformant can be obtained, for example, by introducing the nucleic acid of the present invention into a host.
  • the host is not particularly limited, and examples thereof include the non-human hosts described above.
  • the transformant of the present invention may have, for example, the nucleic acid of the present invention as the expression vector of the present invention. In this case, for example, by introducing the expression vector of the present invention into a host. can get.
  • the method for introducing the nucleic acid or the expression vector into the host is not particularly limited, and can be performed by a known method.
  • the introduction method can be appropriately set depending on, for example, the type of the host.
  • Examples of the introduction method include introduction method using gene gun such as particle gun, calcium phosphate method, polyethylene glycol method, lipofection method using liposome, electroporation method, ultrasonic nucleic acid introduction method, DEAE-dextran method, micro glass tube, etc.
  • Examples include a direct injection method using a hydrogel, a hydrodynamic method, a cationic liposome method, a method using an introduction aid, and a method using Agrobacterium.
  • Examples of the liposome include lipofectamine and cationic liposome, and examples of the introduction aid include atelocollagen, nanoparticles, and polymers.
  • the method for producing a galectin 9 variant of the present invention includes, for example, a step of expressing the nucleic acid of the present invention. According to the production method of the present invention, for example, a modified galectin 9 can be obtained with an excellent yield as compared with the case where wild-type galectin 9 is produced as a recombinant protein.
  • the production method of the present invention is characterized in that, by expressing the nucleic acid of the present invention, the nucleic acid is transcribed and translated into a protein encoded by the nucleic acid to synthesize the galectin-9 variant of the present invention, Other processes and conditions are not particularly limited.
  • the expression of the nucleic acid of the present invention may be performed, for example, in a cell system using a host or in a cell-free protein synthesis system as described above.
  • the modified galectin 9 of the present invention can be synthesized by introducing the nucleic acid of the present invention into a host.
  • the host is, for example, as described above, and the introduction of the nucleic acid of the present invention into the host may be the introduction of the expression vector of the present invention.
  • the culturing step are not particularly limited and can be appropriately determined according to the type of the host.
  • the expressed galectin-9 variant of the present invention may be used as it is after expression, or may be purified.
  • the purification method is not particularly limited, and examples thereof include salting out, electrophoresis, and various chromatography.
  • the galectin 9 variant of the present invention can be used as a medicine.
  • the variant of galectin 9 includes, for example, the activity of wild-type galectin 9, such as cytotoxic activity against malignant tumors, apoptosis inducing activity against malignant tumors, antitumor activity against malignant tumors, activated T cells (for example, CD4-positive T cells) or activated B cells are preserved in apoptosis-inducing activity, immunomodulating activity, anti-inflammatory activity and / or anti-allergic activity.
  • the galectin-9 modified body of this invention can mention the pharmaceutical use similar to the wild type galectin 9, for example.
  • the medicament of the present invention contains at least one of the galectin-9 variant (protein or salt thereof) of the present invention, the nucleic acid of the present invention, and the expression vector of the present invention, and an immunoregulator (immunosuppressive). Including a meaning of an agent), an antitumor agent, a tumor metastasis inhibitor, an analgesic agent, an anti-inflammatory agent, and an anti-inflammatory agent.
  • the medicament of the present invention can be used, for example, for treatment or prevention of a disease, and the treatment may be, for example, any of causal therapy and symptomatic therapy, and disappearance of symptoms, alleviation (improvement) of symptoms, and symptoms Any of inhibition of progression of the above may be used.
  • the administration target of the medicament of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human animals other than humans.
  • non-human animals include mammals such as mice, rats, rabbits, horses, sheep, cows, pigs, dogs and cats, birds such as fish and chickens, helminths, insects, reptiles and amphibians.
  • the administration method of the medicament of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined according to the type of disease.
  • the administration method may be, for example, oral administration or parenteral administration, and may be direct administration or indirect administration.
  • parenteral administration include topical, transdermal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intradermal and intraperitoneal administration.
  • the dose is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on the administration subject, the type of disease, the degree of disease, and the like.
  • the daily dose is, for example, 5 ⁇ g to 5 mg, preferably 50 ⁇ g to 500 ⁇ g, more preferably 100 ⁇ g to 500 ⁇ g, and further preferably 200 ⁇ g to 250 ⁇ g per kg body weight.
  • the number of administrations per day is, for example, 1 to 3 times.
  • the administration method may be, for example, either in vivo or ex vivo .
  • the nucleic acid of the present invention may be administered to a living body of a patient.
  • the tissue or cell is It may be introduced into the patient's living body.
  • the dosage is not particularly limited, and can be appropriately determined depending on the administration subject, the type of disease, the degree of the disease, and the like.
  • the dose is preferably, for example, an amount that expresses the above-described modified galectin-9 of the present invention.
  • the daily dose is, for example, 100 ng to 200 mg, preferably 500 ng to 50 mg, more preferably 1 ⁇ g to 2 mg per human tissue. More preferably, it is 5 ⁇ g to 500 ⁇ g.
  • the number of administrations per day is, for example, 1 to 3 times.
  • the form of the medicament of the present invention can be appropriately determined according to, for example, the administration method as described above.
  • Examples of the form include solution preparations, dispersion preparations, semisolid preparations, granular preparations, molded preparations, and leachable preparations.
  • Specific examples include tablets, coated tablets, dragees, pills, troches, hard capsules, soft capsules, microcapsules, implants, powders, powders, granules, fine granules , Injection, liquid, elixir, emulsion, irrigation, syrup, water, emulsion, suspension, liniment, lotion, aerosol, spray, inhalant, spray, ointment, plaster , Patches, pasta, cataplasms, creams, oils, suppositories (eg rectal suppositories), tinctures, skin solutions, eye drops, nasal drops, ear drops, coatings, infusions, injections Liquid preparations, powder preparations for preparing liquid preparations, freeze-dried preparations and gel preparations.
  • the medicament of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable additive in addition to the galectin-9 variant of the present invention, the nucleic acid of the present invention or the expression vector of the present invention.
  • the additive is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the form of the medicine, and a known substance in the production of the medicine can be used.
  • the additive amount of the additive is not particularly limited as long as it does not inhibit the properties of the galectin-9 variant of the present invention contained as an active ingredient.
  • the additive examples include a carrier, an adjuvant, an excipient, an excipient, a diluent, a flavor, a fragrance, a sweetener, a vehicle, an antiseptic, a stabilizer, a binder, a pH adjuster, and a buffer.
  • a carrier an adjuvant, an excipient, an excipient, a diluent, a flavor, a fragrance, a sweetener, a vehicle, an antiseptic, a stabilizer, a binder, a pH adjuster, and a buffer.
  • Surfactant base, solvent, filler, extender, solubilizer, solubilizer, tonicity agent, emulsifier, suspending agent, dispersant, thickener, gelling agent, curing agent, Absorbers, pressure-sensitive adhesives, elastic agents, plasticizers, disintegrating agents, propellants, preservatives, antioxidants, light-shielding agents, moisturizers, relaxation agents, antistatic agents
  • Example 1 As described above, in International Publication No. WO2005 / 093064, stabilized galectin 9 consisting of an amino acid sequence in which the region from the 149th proline to the 177th serine of wild type galectin 9M is deleted is reported.
  • the amino acid sequence of the stabilized galectin 9 is shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 91), and the stabilized galectin 9 retains the physiological activity of wild-type galectin 9M, and compared with wild-type galectin 9M.
  • FIG. 1 SEQ ID NO: 91
  • the stabilized galectin 9 retains the physiological activity of wild-type galectin 9M, and compared with wild-type galectin 9M.
  • the galectin-9 variant was a protein comprising an amino acid sequence in which NCRD and CCRD were directly linked.
  • the amino acid sequence of NCRD SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the C-terminal region of CCRD SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 17.
  • Residue the amino acid sequence in which 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 12, 13, 16 or 16 amino acid residues have been deleted from the N-terminus did.
  • galectin-9 variant was named galectin-9 variant mC4, mC6, mC8, mC9m, mC10, mC11, mC12, mC13, mC14, mC16 depending on the number of deleted amino acids in the N-terminal region of CCRD.
  • the amino acid sequence and base sequence of the CCRD N-terminal region and the full-length amino acid sequence and base sequence of the stabilized galectin 9 and each galectin 9 variant are shown below.
  • An expression vector for expressing the galectin-9 variant was constructed by the following method.
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 91) of the stabilized galectin 9 (hereinafter also referred to as G9Null) in Example 1 of International Publication No. WO2005 / 093064 is shown in FIG.
  • the G9Null coding sequence (SEQ ID NO: 92) was inserted into the cloning site (BamHI site) of pET-11a, and the G9Null expression vector pET-G9Null was prepared by a conventional method. It has been confirmed in International Publication No. WO 2005/093064 that the stabilized galectin 9 has the cell death-inducing activity of wild-type galectin 9 and is significantly superior in protease stability compared to wild-type galectin 9 It is done.
  • NCRD polynucleotide (SEQ ID NO: 2) encoding the NCRD peptide (SEQ ID NO: 1) is amplified by PCR using the pET-G9Null as a target sequence and the following primers A1 and A2, and purified by agarose gel electrophoresis did.
  • A1 5′-CGTCCTCGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAGGCT-3 ′ (SEQ ID NO: 93)
  • A2 5′-CTGGAAGCTGATGTAGGACAGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 94)
  • CCRD1 to CCRD10, 10 types a polyd encoding CCRD (CCRD1 to CCRD10, 10 types) of each variant Nucleotides were amplified and purified by agarose gel electrophoresis.
  • B1 5'-TACATCAGCTTCCAGCCACCTATGATGTACCCCCACCCC-3 '(SEQ ID NO: 95)
  • C1 5'-TACATCAGCTTCCAGATGATGTACCCCCACCCCGCCTAT-3 '(SEQ ID NO: 96)
  • D1 5′-TACATCAGCTTCCAGTACCCCCACCCCGCCTATCCGATG-3 ′
  • E1 5′-TACATCAGCTTCCAGCCCCACCCCGCCTATCCGATGCCT-3 ′
  • F1 5'-TACATCAGCTTCCAGCACCCCGCCTATCCGATGCCTTTC-3 '(SEQ ID NO: 99)
  • G1 5′-TACATCAGCTTCCAGCCCGCCTATCCGATGCCTTTCATC-3 ′
  • H1 5'-TACATCAGCTTCCAGGCCTATCCGATGCCTTTCATCACC-3 '(SEQ ID NO: 100)
  • H1 5'-TACATCAGCTTCCAGGCCTATCCGATGC
  • NCRD polynucleotide
  • CCRD1 to CCRD10 polynucleotides
  • primer A1 and the primer A4 described below are used for these mixtures.
  • Stage PCR was performed, and the resulting PCR product was purified by agarose gel electrophoresis.
  • the purified PCR product was cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI, purified, and then ligated to the pET-11a vector cleaved with the same restriction enzymes, and a clone containing the correct sequence was selected according to a standard method. These clones were used as expression vectors for each galectin-9 variant.
  • E. coli The product was introduced into E. coli BL21 (DE3) to prepare a transformant for expressing the recombinant protein, and stored at ⁇ 80 ° C. in the presence of about 15% glycerin.
  • galectin 9 variant a protein in which the amino acid in the N-terminal region of the CCRD was further substituted for the galectin 9 variants mC9 to mC12 was designed.
  • the following shows the type, amino acid sequence and base sequence of the N-terminal region, and full-length amino acid sequence and base sequence for each galectin-9 variant.
  • the underlined portion indicates the amino acid residue substituted for the amino acid sequence of mC9 to mC12.
  • An expression vector for expressing the galectin-9 variant was constructed by the following method. First, PCR was performed using the expression vectors of mC9, mC10, mC11 and mC12 as target sequences, respectively, using the primer A1 and the following primers L2 to W2 containing the mutated sequence corresponding to the substituted amino acid sequence. The PCR products were purified by agarose gel electrophoresis (muNCRD1 to muNCRD12, 12 types).
  • PCR was performed using the expression vectors of mC9, mC10, mC11 and mC12 as the target sequences, respectively, using the primer A4 and the following primers L1 to W1 containing the mutant sequence corresponding to the substituted amino acid sequence.
  • the obtained PCR products were purified by agarose gel electrophoresis (muCCRD1 to muCCRD12, 12 types).
  • L1 5′-AGCTTCCAGCACCCGCCCGCCTATCCGATGCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 118)
  • M1 5′-TTCCAGCACGCCGCCTATCCGATGCCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 119)
  • N1 5′-CCCGCCTATGCGATGCCTTTCATCACCA-3 ′ (SEQ ID NO: 120)
  • O1 5′-TATCCGATGGCTTTCATCACCACCATTC-3 ′ (SEQ ID NO: 121)
  • P1 5'-TTCCAGCACGCCGCCTATGCGATGGCTTTCATCACCACCATTC-3 '(SEQ ID NO: 122)
  • Q1 5′-CTATCCGCCGCCTTTCATCACCACCATT-3 ′ (SEQ ID NO: 123)
  • R1 5′-CCCCGCCCCGCCGATGCCTTTCATCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 124)
  • S1 5'-CAGCACCCCCTATCCGATGCCTTTCA-3 '
  • the former PCR product (muNCRD1 to muNCRD12) and the latter PCR product (muCCRD1 to muCCRD12) are mixed, and the second stage PCR using the primers A1 and A4 is performed on these mixtures.
  • the obtained PCR product was purified by agarose gel electrophoresis.
  • the purified PCR product was cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI, purified, and then ligated to the pET-11a vector cleaved with the same restriction enzymes, and a clone containing the correct sequence was selected according to a standard method. These clones were used as expression vectors for each galectin-9 variant.
  • E. coli The product was introduced into E. coli BL21 (DE3) to prepare a transformant, which was stored at ⁇ 80 ° C. in the presence of about 15% glycerin.
  • Galectin 9 variant is expressed by the following method, and a test sample of the recombinant protein immediately after expression ( Yield was measured for a test sample of recombinant protein (also referred to as a sample after 3 months of storage) from which insolubles were removed after storage for 3 months after expression.
  • the transformant was added to LB-broth containing 100 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight.
  • the flask was shaken and cultured at 37 ° C. until A600 nm reached about 0.7.
  • Noside (IPTG) was added and cultured at 20 ° C. overnight (16-20 hours). And the microbial cell was collect
  • the collected cells were suspended in 80 mL of extraction buffer per flask.
  • the composition of the extraction buffer was 10 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mol / L NaCl, 1 mmol / L dithiothreitol (DTT), 1 mmol / L phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and 1% Triton X-100.
  • lactose-agarose suspension 50% [v / v] in PBS, 1.5 ml as a gel
  • the mixture was stirred at 4 ° C. for 1 hour.
  • the lactose-agarose gel was recovered by centrifugation at 2,000 ⁇ g for 5 minutes, and the TBS containing 0.03% 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] propanesulfonic acid (CHAPS) was collected. Suspended and packed into a minicolumn.
  • the gel was washed with TBS containing 0.03% CHAPS 10 times the amount of the gel, and then the protein was eluted with 3 mL of eluate.
  • the composition of the eluate was 20 mmol / L Tris-HCl (pH 7.5), 0.15 mol / L NaCl, and 0.2 mol / L lactose.
  • the eluate was dialyzed against PBS, centrifuged at 25,000 ⁇ g for 20 minutes to remove insoluble matters, and the resulting supernatant was sterilized by filtration to obtain a final sample. This is hereinafter referred to as a test sample immediately after preparation.
  • test sample immediately after this preparation was further stored at 4 ° C. for 3 months. After storage, the sample was centrifuged at 25,000 ⁇ g for 20 minutes to remove insoluble matter, and the resulting supernatant was sterilized by filtration to obtain a test sample after storage for 3 months. Then, similarly to the test sample immediately after the preparation, the protein concentration was measured based on a conventional method, and the yield of each galectin-9 variant was calculated. This was taken as the yield of recombinant protein after 3 months of storage.
  • the expression vector pET-G9Null of the stabilized galectin 9 was used, and protein expression and evaluation were performed in the same manner.
  • FIG. 2 shows a photograph of SDS-PAGE.
  • lane M is a molecular weight marker
  • each lane shows a test sample immediately after preparation of each galectin-9 variant.
  • FIG. 2 and FIG. 3 it was confirmed that any of the galectin-9 variants were expressed in E. coli and further highly purified by affinity chromatography using lactose-agarose.
  • FIG. 3 shows the concentrations of the deletion-type galectin-9 variant and stabilized galectin-9 prepared in (1-1) above.
  • A is the result of the test sample immediately after preparation
  • B is the result of the test sample after 3 months of storage.
  • the vertical axis represents the concentration ( ⁇ g / ml) of the galectin 9 variant or the stabilized galectin 9 in the sample
  • the galectin 9 variant represents the average value of two expression experiments
  • the stabilized galectin 9 showed an average value and standard deviation of 12 times.
  • the galectin 9 variants mC8, mC9, mC10, mC11, mC12, mC13 and mC14 have a protein concentration higher than that of the stabilized galectin 9 (G9Null). Significantly higher. Among them, mC9, mC10, mC12 and mC14 showed extremely high protein concentrations. Also in the test sample after 3 months of storage, the galectin 9 variants mC10, mC11, mC12, and mC13 had significantly higher protein concentrations than the stabilized galectin 9 (G9Null).
  • Stabilized galectin 9 exceeded the maximum solubility in the elution step from the column when the final sample (test sample immediately after preparation) was prepared after expression, and thus some stabilized galectin 9 was insolubilized. . And this insoluble matter was removed by the centrifugation process and filtration process after the said elution process. Therefore, as shown in FIG. 3, the stabilized galectin 9 resulted in a low protein concentration in the test sample as described above. On the other hand, in the galectin-9 variant, insolubilization in the elution step was significantly suppressed as compared with the stabilized galectin-9. Therefore, as shown in FIG. 3, the modified galectin 9 resulted in a significantly higher protein concentration in the test sample than the stabilized galectin 9.
  • the concentration of the galectin 9 variant in the test sample is significantly higher than the concentration of the stabilized galectin 9 in the test sample, which means that the solubility of the galectin 9 variant is stabilized galectin 9 Means significantly higher than the solubility of.
  • the high concentration of the galectin-9 variant in the test sample means that the galectin-9 variant could be recovered in a high yield.
  • the solubilization of the protein is generally used in an aqueous solvent such as a buffer solution. Is done. For this reason, as the solubility of the protein is higher, for example, the loss of the protein in the recovery is prevented, and the handleability is also improved. Since the modified galectin 9 of the present invention has excellent solubility as described above, it can be said that it is superior in the production, purification, formulation and the like of the above-mentioned stabilized galectin 9 having the same physiological activity. .
  • FIG. 4 shows the concentrations of the deletion / substitution-type galectin-9 variant prepared in (1-2) and the deletion-type galectin-9 variant prepared in (1-1).
  • A is the result of the test sample immediately after preparation
  • B is the result of the test sample after 3 months of storage.
  • the vertical axis represents the concentration ( ⁇ g / ml) of the galectin-9 variant in the test sample
  • the galectin-9 variant shows the average value of two expression experiments
  • the stabilized galectin 9 showed the average value and standard deviation of 12 times.
  • deletion / substitution type galectin-9 variants mC9-HP, mC10-1P1A1, mC10-1P1A2, mC10-HPAP, mC10-HPPY, mC11- AP and mC11-PP had higher protein concentrations compared to stabilized galectin-9.
  • mC10-HPAP, mC10-HPPY and mC11-AP which are deletion / substitution-type variants of galectin 9 have a protein concentration higher than that of stabilized galectin 9. it was high.
  • mC10-HPAP, mC10-HPPY, mC11-AP and mC11-PP which are deletion / replacement type galectin-9 variants
  • the protein concentration was higher than that of the deletion-type galectin-9 variant.
  • mC10-HPPY and mC11-AP which are deletion / substitution-type galectin-9 variants, each have a higher protein concentration than the corresponding galectin-9 variant. It was.
  • a deletion / substitution type mC10- in which a proline residue is conserved and a tyrosine residue is substituted with a proline residue compared to the deletion type mC10.
  • HPPY increased the protein concentration approximately 3.3-fold.
  • the deletion / substitution type mC11-AP in which proline-alanine was substituted with alanine-proline compared to the deletion type mC11 increased the protein concentration by about 2.2 times.
  • the N-terminal region of the CCRD preserves the 12th or 15th and 17th proline residues of SEQ ID NO: 3, and further has a substitution for a proline residue, thereby It was found that the solubility could be further improved.
  • the number of cells was measured in the same manner using the stabilized galectin 9 (G9Null) instead of the galectin 9 variant.
  • the galectin 9 variant and the stabilized galectin 9 were determined to obtain a concentration (LD50) that reduces the number of Jurkat cells by 50%, and each galectin 9 variant when the LD50 of the stabilized galectin 9 was taken as 100%. Relative value (%) was determined as specific activity. The results are shown in Table 7 below.
  • the galectin-9 variant had significantly higher cell death-inducing activity against Jurkat cells compared to stabilized galectin-9 (G9Null). From this result, it was found that the modified galectin 9 has sufficient physiological activity of the stabilized galectin 9 and has excellent solubility as described above.
  • the galectin 9 variant is dissolved in 100 mmol / L Tris-HCl (pH 8.0) containing 150 mmol / L NaCl and 1 mmol / L CaCl 2 so as to be 0.06 mg / mL, and further protease is mixed. And incubated at 37 ° C.
  • elastase trade name: Elastase, manufactured by Elastin Products Company, Inc.
  • MMP-3 matrix metalloproteinase-3, trade name: Matrix Metalloproteinase-3, manufactured by Biogenesis
  • MMP-3 was subjected to activation treatment (37 ° C., 8 hours) with 20 mmol / L Aminophenyl mercurate before use. Sampling was performed over time in an incubator, and each sample was subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie Brilliant Blue R-250.
  • wild type galectin 9 preparation (G9S, amino acid sequence of SEQ ID NO: 131) or stabilized galectin 9 (G9Null) prepared in the above (2) was used in place of the galectin 9 variant.
  • FIG. 5 shows a photo of SDS-PAGE.
  • A is the result using elastase
  • B is the result using MMP-3.
  • lane M is a molecular weight marker.
  • the wild-type G9S was already confirmed to be degraded at 0.5 hours from the start of the incubation, and was largely degraded at 2 hours.
  • mC10-HPPY which is a modified galectin 9
  • the modified galectin 9 of the present invention is superior in solubility to the stabilized galectin 9, maintains the physiological activity of the wild type galectin 9, and is superior in protease stability to the wild type galectin. confirmed.
  • all the galectin 9 variants have significantly increased solubility (ie, yield) compared to the stabilized galectin 9, and among them, mC10, mC11, mC12, mC10-HPPY, mC10-HPAP and mC11-AP showed more than a 5-fold increase compared to stabilized galectin-9.
  • mC10-HPPY could stably exist in PBS up to a concentration of at least 2.5 mg / mL, which was confirmed to be about 7 times the concentration of stabilized galectin-9.
  • any of the galectin 9 variants exhibits cell death-inducing activity against Jurkat cells, which is one of the physiological activities of wild-type galectin 9, and among them, mC10, mC11, mC12, mC10-HPPY, mC10-HPAP and mC11-AP showed 2-2.5 fold activity compared to stabilized galectin-9.
  • the modified galectin 9 showed significant protease stability than the wild type galectin 9. From these results, it can be said that the modified galectin 9 has excellent properties as a highly productive pharmaceutical raw material, and mC10-HPPY has extremely excellent properties.
  • the test sample (the galectin 9 variant) just prepared after filtration sterilization prepared in Example 1 (2) was stored at 4 ° C. for about 1 year (344 days).
  • the protein concentrations of the test samples were adjusted to 1.88 mg / mL for mC10-HPPY, 1.16 mg / mL for mC10-HPAP and 1.14 mg / mL for mC11-AP, respectively.
  • the test sample after storage was centrifuged at 25,000 ⁇ g for 20 minutes to remove insoluble matters, and the supernatant was recovered. About the said test sample after 1-year preservation
  • each well was washed once with an activity measurement buffer solution (20 mmol / L HEPES-NaOH (pH 7.5), Hank's balanced salt solution containing 1 mg / mL bovine serum albumin), and 90 ⁇ L of the activity measurement buffer solution per well.
  • 10 ⁇ L of a sample containing the modified galectin 9 was added.
  • each galectin of Example 1 (1) was adjusted so that the concentration of the galectin 9 variant in each well was 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1 ⁇ mol / L.
  • Nine variants were prepared by diluting with PBS.
  • TNP anti-2,4,6-trinitrophenyl
  • TNP mouse monoclonal antibody
  • concentration concentration
  • IgE IgE
  • TNP-labeled bovine serum albumin were added and incubated for 1 hour.
  • the cells cultured with 0.1% Triton X-100 are solubilized, and ⁇ -hexosaminidase ( ⁇ -HEX) activity in the recovered medium and cell lysate is obtained. It was measured.
  • the total ⁇ -HEX activity in the medium and the cell lysate was defined as total ⁇ -HEX activity, and the ratio (%) of ⁇ -HEX activity in the medium to the total ⁇ -HEX activity was determined. This ratio was used as an index of degranulation. This assay was performed as a set of 3 wells.
  • Example 1 As a control, 10 ⁇ L of PBS was used instead of the sample, and as a comparative example, the stabilized galectin 9 (G9Null) of Example 1 was added instead of the modified galectin 9 and the same measurement was performed. It was.
  • each galectin-9 variant exhibited degranulation inhibitory activity against RBL-2H3 cells in the same manner as the stabilized galectin 9 (G9Null).
  • mC8, mC9, mC10, mC11, mC12, mC13, mC10-HPPY, mC10-HPAP and mC11-AP showed significantly higher degranulation inhibitory activity compared to the stabilized galectin 9 (G9Null). . From these results, it was found that the modified galectin 9 sufficiently maintained the physiological activity of the stabilized galectin 9.
  • the galectin-9 variant of the present invention maintained excellent solubility even after long-term storage. Moreover, it was confirmed that the galectin-9 variant of the present invention maintains the physiological activity of wild-type galectin-9. Specifically, as shown in the above (1), none of the modified galectin 9 mutants maintained almost the same solubility even after long-term storage, with almost no change in protein concentration after storage for about 1 year. did.
  • any of the galectin 9 variants maintains the degranulation inhibitory activity against RBL-2H3 cells, which is one of the physiological activities of the wild type galectin 9, and among them, mC8, mC9, mC10, mC11, mC12, mC13, mC10-HPPY, mC10-HPAP and mC11-AP showed 1.5 to 2.5-fold activity compared to the stabilized galectin 9. From these results, it can be said that the modified galectin-9 has excellent properties as a highly stable pharmaceutical raw material.
  • the modified galectin 9 of the present invention retains the same physiological activity as that of the wild-type galectin 9, is excellent in protease stability and solubility, and is produced as a recombinant protein. Also excellent.
  • the modified galectin 9 of the present invention not only retains the physiological activity of wild-type galectin, but also has excellent stability, handleability, and yield during production, and thus is extremely useful as a pharmaceutical raw material. I can say that.

Abstract

　野生型ガレクチン９と実質的に同質の生理活性を保持し、且つ、プロテアーゼ安定性、溶解性および収率に優れるガレクチン９改変体を提供する。　本発明のガレクチン９改変体は、Ｎ末端領域およびＣ末端領域からなる下記ＮＣＲＤと下記ＣＣＲＤとを有し、前記ＮＣＲＤのＣ末端と前記ＣＣＲＤのＮ末端とが、直接的または間接的に結合したタンパク質である。 前記ＮＣＲＤは、（Ｎ１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド。 前記ＣＣＲＤのＮ末端領域は、（Ｃ－Ｎ１）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１～１７個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチドであり、 前記Ｃ末端領域は、（Ｃ－Ｃ１）配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド。

Description

ガレクチン９の改変タンパク質
　本発明は、ガレクチン９の改変タンパク質に関する。
　野生型ガレクチン９は、Ｔ細胞の分化またはホメオスタシス等を通じて、過剰な免疫反応の抑制または癌に対する免疫の活性化等の免疫システムの破綻を修正する機能を有する。野生型ガレクチン９は、二つの糖鎖認識ドメイン（Carbohydrate　Recognition　Domain：ＣＲＤ）と、それらをつなぐリンクペプチド領域とからなる。そして、大腸菌を宿主として生産されたリコンビナントである野生型ガレクチン９は、腫瘍細胞に対する直接的な作用（すなわち、腫瘍細胞の細胞間接着と、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する活性）および免疫系を介した作用によって、癌の転移抑制と退縮とを誘導することが示唆されている。また、野生型ガレクチン９は、非活性化リンパ球には作用せず、活性化Ｔ細胞、特に過剰免疫反応の原因となるＣＤ４陽性Ｔ細胞のアポトーシスを誘導することも明らかにされている。さらに、リウマチにおいて関節の変形等に関与する滑膜細胞に対し、強力なアポトーシス誘導能を持つことも明らかとなっている。
　このような野生型ガレクチン９の機能は、野生型ガレクチン９が、様々な疾患に対する治療薬として有用となることを示している。しかし、野生型ガレクチン９を、実際に治療薬として流通させるには、プロテアーゼ感受性、低溶解性および組換えタンパク質の低収量という３つの問題が存在する。そして、これらの問題のうち、野生型ガレクチン９のプロテアーゼ感受性の問題については、本発明者により、プロテアーゼに対してより安定な分子構造を有する安定化ガレクチン９が報告されている（特許文献１）。しかしながら、低溶解性および組換えタンパク質の低収量の問題については、有効な解決手段が報告されていない。したがって、野生型ガレクチン９の優れた機能を利用した医薬を製品化するために、溶解性および収量に優れたガレクチン９改変体の提供が、強く求められている。
国際公開番号ＷＯ２００５／０９３０６４号パンフレット
　そこで、本発明は、野生型ガレクチン９と実質的に同質の生理活性を保持し、且つ、プロテアーゼ安定性および溶解性に優れるガレクチン９改変体の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明は、ＮＣＲＤとＣＣＲＤとを有し、前記ＮＣＲＤのＣ末端と前記ＣＣＲＤのＮ末端とが、直接的または間接的に結合したタンパク質またはその塩であって、
前記ＮＣＲＤは、
　（Ｎ１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、
　（Ｎ２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ糖結合能を有するペプチド、または、
　（Ｎ３）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ糖結合能を有するペプチド
であり、
前記ＣＣＲＤは、
　Ｎ末端領域およびＣ末端領域からなり、且つ糖結合能を有するペプチドであり、
前記Ｎ末端領域は、
　（Ｃ－Ｎ１）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１～１７個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記Ｃ末端領域は、
　（Ｃ－Ｃ１）配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、
　（Ｃ－Ｃ２）配列番号５で表わされるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、または、
　（Ｃ－Ｃ３）配列番号５で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるペプチドである
ことを特徴とする。
　本発明の核酸は、前記本発明のタンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする。
　本発明の発現ベクターは、前記本発明の核酸を有することを特徴とする。
　本発明の形質転換体は、前記本発明の核酸または前記本発明の発現ベクターを有することを特徴とする。
　本発明の医薬は、前記本発明のタンパク質およびその塩、前記本発明の核酸、ならびに前記本発明の発現ベクターの少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする。
　本発明のタンパク質またはその塩は、野生型ガレクチン９の改変体であり、以下、本発明のガレクチン９改変体という。
　本発明のガレクチン９改変体は、野生型ガレクチン９と同質の生理活性を保持し、且つ、プロテアーゼ安定性（抵抗性または感受性ともいう）および溶解性に優れ、前記溶解性によって、例えば、さらに、組換えタンパク質として製造した際の収率にも優れる。このように、本発明のガレクチン９改変体は、野生型ガレクチンの生理活性を保持するだけでなく、その安定性、取扱性および製造時の収率にも優れることから、医薬原料として極めて有用といえる。
図１は、安定化ガレクチン９の配列を示す概略図である。 図２は、本発明の実施例１において、ガレクチン９改変体のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す写真である。 図３は、本発明の実施例１において、欠失型のガレクチン９改変体の濃度を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例１において、欠失・置換型のガレクチン９改変体の濃度を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例１において、プロテアーゼ安定性を示すグラフである。
１．ガレクチン９改変体
　本発明のガレクチン９改変体は、前述のように、ＮＣＲＤとＣＣＲＤとを有し、前記ＮＣＲＤのＣ末端と前記ＣＣＲＤのＮ末端とが、直接的または間接的に結合したタンパク質またはその塩であって、
前記ＮＣＲＤは、
　（Ｎ１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、
　（Ｎ２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ糖結合能を有するペプチド、または、
　（Ｎ３）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ糖結合能を有するペプチド
であり、
前記ＣＣＲＤは、
　Ｎ末端領域およびＣ末端領域からなり、且つ糖結合能を有するペプチドであり、
前記Ｎ末端領域は、
　（Ｃ－Ｎ１）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１～１７個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチドであり、
前記Ｃ末端領域は、
　（Ｃ－Ｃ１）配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、
　（Ｃ－Ｃ２）配列番号５で表わされるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、または、
　（Ｃ－Ｃ３）配列番号５で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるペプチドである
ことを特徴とする。
　野生型ガレクチン９は、前述のように、２つの糖認識ドメイン（ＣＲＤ）を有するタンパク質である。本発明のガレクチン９改変体は、野生型ガレクチン９と実質的に同質の生理活性を有し、且つ、野生型ガレクチン９と比較して、優れたプロテアーゼ安定性および溶解性を示す。さらに、本発明のガレクチン９改変体は、例えば、前記溶解性によって、組換えタンパク質としての製造時において、優れた収率を示す。本発明において、「実質的に同質の生理活性」とは、例えば、前記ガレクチン９改変体の生理活性が、野生型ガレクチン９の生理活性と同じ種類の活性または類似する種類の活性であることを意味する。野生型ガレクチン９の生理活性は、例えば、特定の糖鎖に対する特異的な結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、免疫調節活性、生理的活性または生物学的活性等があげられる。また、本発明において、「野生型ガレクチン９と実質的に同質の生理活性」とは、例えば、疾患の治療等に関連する生理活性を意味し、本発明の課題であるプロテアーゼ安定性、溶解性および収率の意味は含まない。
　本発明のガレクチン９改変体は、例えば、野生型ガレクチン９と実質的に同等またはそれ以上の生理活性を有することが好ましい。「野生型ガレクチン９と実質的に同等の生理活性」とは、野生型ガレクチン９と実質的に同質の生理活性が、同程度であることを意味する。実質的に同程度またはそれ以上とは、野生型ガレクチン９の生理活性に対して、例えば、約０．００１～約１００倍であり、好ましくは約０．０１～約１００倍、より好ましくは約０．１～約１００倍、さらに好ましくは約０．５～約１００倍が例示できる。
　本発明において、「溶解性」とは、例えば、水性媒体に対する溶解性を意味し、前記水性媒体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液等の各種緩衝液、これらの混合液等があげられる。
　本発明のガレクチン９改変体において、前記ＮＣＲＤは、Ｎ末端側のＣ型糖認識ドメイン（ＣＲＤ）であり、前記ＣＣＲＤは、Ｃ末端側のＣ型糖認識部位（ＣＲＤ）である。
　本発明のガレクチン９改変体において、前記ＮＣＲＤは、前述のように、（Ｎ１）、（Ｎ２）および（Ｎ３）のいずれかのペプチドである。前記ＮＣＲＤは、前述のように、糖結合能を有するペプチドである。
　前記（Ｎ１）のペプチドは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドである。
配列番号１：１４８ａａ
MAFSGSQAPYLSPAVPFSGTIQGGLQDGLQITVNGTVLSSSGTRFAVNFQTGFSGNDIAFHFNPRFEDGGYVVCNTRQNGSWGPEERKTHMPFQKGMPFDLCFLVQSSDFKVMVNGILFVQYFHRVPFHRVDTISVNGSVQLSYISFQ
　前記（Ｎ２）のペプチドは、前記（Ｎ１）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。前記（Ｎ２）のペプチドは、特に制限されず、前記（Ｎ１）のペプチドと同等の機能を有していればよく、具体的に、糖結合能を有していればよい。前記１または数個は、例えば、１～４５個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～７個、特に好ましくは、１個、２個または３個である。
　前記（Ｎ３）のペプチドは、前記（Ｎ１）のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるペプチドである。前記（Ｎ３）のペプチドは、特に制限されず、前記（Ｎ１）のペプチドと同等の機能を有していればよく、具体的に、糖結合能を有していればよい。前記同一性は、例えば、７５％以上が好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
　前記ＣＣＲＤは、前述のように、Ｎ末端領域およびＣ末端領域からなり、且つ糖結合能を有するペプチドである。前記Ｎ末端領域および前記Ｃ末端領域を、それぞれ以下に示すが、これらは、連結した状態で、前記ＣＣＲＤとして糖結合能を有していればよい。
　前記ＣＣＲＤにおける前記Ｎ末端領域は、前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチド、すなわち、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１～１７個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチドである。前記Ｎ末端領域が、このようなアミノ酸の欠失を有することによって、前述のような本発明の効果を示すガレクチン９改変体が構成される。配列番号３において、１０番目および１１番目のアミノ酸（Ｘ）は、プロリンまたはヒスチジンであり、好ましくはいずれか一方がプロリンであり、ＸＸは、例えば、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＰＰ）、Ｐｒｏ－Ｈｉｓ（ＰＨ）またはＨｉｓ－Ｐｒｏ（ＨＰ）が好ましい。また、配列番号３において、１２番目および１３番目のアミノ酸残基（Ｘ）は、プロリンまたはアラニンであり、好ましくは、いずれか一方がプロリンであり、ＸＸは、例えば、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ（ＰＰ）、Ｐｒｏ－Ａｌａ（ＰＡ）またはＡｌａ－Ｐｒｏ（ＡＰ）が好ましい。
配列番号３：１７ａａ
TPAIPPMMYXXXXYPMP
　前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドにおいて欠失するアミノ酸残基数は、その下限が、１個であり、好ましくは６個であり、より好ましくは８個であり、その上限が、１７個であり、好ましくは１４個であり、より好ましくは１３個であり、さらに好ましくは１２個であり、その範囲は、例えば、６～１４個が好ましく、より好ましくは８～１４個または９～１４個であり、さらに好ましくは８～１３個または９～１３個、特に好ましくは、１０～１２個である。なお、本発明において、数値範囲の記載は、その範囲内に含まれる値の開示も意味する。すなわち、例えば、６～１４個の記載は、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個および１４個の開示を意味する。
　前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドにおけるアミノ酸の欠失は、例えば、連続したアミノ酸の欠失および不連続のアミノ酸の欠失のいずれでもよい。好ましくは、連続したアミノ酸の欠失であり、特に、Ｎ末端のアミノ酸から連続する欠失であることが好ましい。また、前記Ｎ末端領域において、連続したアミノ酸の欠失と不連続のアミノ酸の欠失の両方が存在してもよい。連続したアミノ酸の欠失としては、Ｎ末端のアミノ酸を１番目として、例えば、前述の個数のアミノ酸を欠失することが好ましく、具体例として、例えば、６～１４個が好ましく、より好ましくは８～１４個または９～１４個であり、さらに好ましくは８～１３個または９～１３個、特に好ましくは、１０～１２個である。
　前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドにおいて、プロリン残基が保存されていることが好ましい。具体的には、配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１５番目および１７番目からなる群から選択された少なくとも一つのアミノ酸残基が、プロリンであることが好ましい。また、前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１０番目および１１番目のアミノ酸残基は、前述のように、少なくとも一方がプロリンであり、例えば、Ｐｒｏ-Ｐｒｏ（ＰＰ）、Ｐｒｏ－Ｈｉｓ（ＰＨ）またはＨｉｓ－Ｐｒｏ（ＨＰ）であることが好ましい。前記配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１２番目および１３番目のアミノ酸残基は、前述のように、少なくとも一方がプロリンであり、例えば、Ｐｒｏ-Ｐｒｏ（ＰＰ）、Ｐｒｏ－Ａｌａ（ＰＡ）またはＡｌａ－Ｐｒｏ（ＡＰ）であることが好ましい。
　前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドは、具体例として、例えば、配列番号７～２０のアミノ酸配列が例示できる。なお、本発明において、前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドは、以下のアミノ酸配列に制限されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前記ＣＣＲＤにおけるＣ末端領域のペプチドは、前述のように、（Ｃ－Ｃ１）、（Ｃ－Ｃ２）および（Ｃ－Ｃ３）のいずれかのペプチドである。
　前記（Ｃ－Ｃ１）のペプチドは、配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチドである。
配列番号５：１２９ａａ
FITTILGGLYPSKSILLSGTVLPSAQRFHINLCSGNHIAFHLNPRFDENAVVRNTQIDNSWGSEERSLPRKMPFVRGQSFSVWILCEAHCLKVAVDGQHLFEYYHRLRNLPTINRLEVGGDIQLTHVQT
　前記（Ｃ－Ｃ２）のペプチドは、前記（Ｃ－Ｃ１）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドである。前記１または数個は、例えば、１～３９個、好ましくは１～２６個、より好ましくは１～１３個、さらに好ましくは１～６個、特に好ましくは、１個、２個または３個である。
　前記（Ｃ－Ｃ３）のペプチドは、前記（Ｃ－Ｃ１）のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるペプチドである。前記同一性は、例えば、７５％以上が好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは、８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
　前記Ｎ末端領域と前記Ｃ末端領域とからなる前記ＣＣＲＤは、具体例として、例えば、配列番号２１～３４のアミノ酸配列が例示できる。なお、本発明において、前記ＣＣＤＲのペプチドは、以下の配列に制限されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　本発明のガレクチン９改変体において、前記ＮＣＲＤと前記ＣＣＲＤとは、前述のように、直接的に結合したタンパク質でもよいし、間接的に結合したタンパク質でもよく、好ましくは、前者である。
　後者の場合、前記ＮＣＲＤのＣ末端と前記ＣＣＲＤのＮ末端は、例えば、リンカーを介して間接的に結合してもよい。前記リンカーは、例えば、アミノ酸またはペプチドがあげられる。前記ペプチドのアミノ酸残基数は、特に制限されないが、短いことが好ましく、例えば、２個～５個、好ましくは、４個以下、３個以下、２個以下、１個である。
　前記ペプチドの配列は、特に制限されず、任意に設定できる。前記ペプチドは、具体例として、例えば、Ｈｉｓ－Ｍｅｔ（ＨＭ）、Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ（ＲＩＰ）、Ａｓｎ-Ｌｅｕ（ＮＬ）、Ａｓｐ-Ｐｈｅ-Ｖａｌ（ＤＦＶ）およびＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａ（ＧＳＡ）等の配列を含むペプチド、前記配列からなるペプチド等が例示できる。
　本発明のガレクチン９改変体は、具体例として、下記表３に示す配列番号３５～４８のいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドがあげられる。なお、本発明のガレクチン９改変体は、これらの例示には制限されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明のガレクチン９改変体のアミノ酸配列において、各アミノ酸は、例えば、それぞれが属するクラスにおける他のアミノ酸またはアミノ酸類縁体に置換されてもよい。前記クラスは、例えば、化学的特性および／または物理的特性により分類されたクラスがあげられる。前記特性としては、例えば、疎水性と親水性、電荷、大きさ等があげられ、具体例として、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）、極性アミノ酸（中性アミノ酸）、陽電荷性アミノ酸（酸性アミノ酸）、陰電荷性アミノ酸（酸性アミノ酸）等があげられる。前記非極性アミノ酸は、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニン等があげられ、前記極性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン等があげられ、前記陽電荷性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン等があげられ、陰電荷性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。
　本発明のガレクチン９改変体において、前記タンパク質の塩は、特に制限されず、前述したタンパク質が塩となった形態でもよい。
　本発明のガレクチン９改変体は、本発明の効果を奏する限りにおいて、例えば、さらに、アミノ酸残基が修飾されもよい。前記修飾は、例えば、アミノ酸残基に対する部分的な分解、誘導体への改変、保護基の結合、糖鎖の結合等があげられ、具体例としては、Ｃ末端等のカルボキシル基に対する、アミド化またはエステル化等があげられる。
　本発明のガレクチン９改変体の製造方法は、特に制限されず、例えば、そのアミノ酸配列に基づいて、遺伝子工学的手法により製造してもよいし、合成手法により製造してもよい。前者は、例えば、宿主を用いた細胞系でもよいし、無細胞タンパク質合成系でもよい。前記遺伝子工学的手法の場合、例えば、前記アミノ酸配列に対応する塩基配列の核酸、および、前記核酸を有する発現ベクター等が使用できる。前記ガレクチン９改変体の製造方法、前記ガレクチン９改変体をコードする核酸および前記発現ベクターに関しては、後述する。
２．核酸、発現ベクターおよび形質転換体
（１）核酸
　本発明の核酸は、前記本発明のガレクチン９改変体をコードする塩基配列を有することを特徴とする。本発明の核酸を使用し、例えば、遺伝子工学的手法により、宿主または無細胞タンパク質合成系において、前記核酸がコードするタンパク質を発現させることによって、前記本発明のガレクチン９改変体を製造できる。
　本発明の核酸の塩基配列は、特に制限されず、前記本発明のガレクチン９改変体のアミノ酸配列に基づいてコドンに置き換えることで設計できる。本発明の核酸は、例えば、遺伝子工学的手法または有機合成的手法によって合成でき、ｃＤＮＡ等の合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡということもできる。また、本発明の核酸は、例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれであってもよく、そのハイブリッドでもよい。
　本発明の核酸は、例えば、前記ＮＣＲＤをコードするポリヌクレオチド（ＮＣＲＤポリヌクレオチド）、前記ＣＣＲＤをコードするポリヌクレオチド（ＣＣＲＤポリヌクレオチド）を有し、前記ＮＣＲＤポリヌクレオチドの３’末端に、前記ＣＣＲＤポリヌクレオチドの５’末端が、直接的または間接的に結合したポリヌクレオチドがあげられる。前記ＮＣＲＤポリヌクレオチドと前記ＣＣＲＤポリヌクレオチドとは、例えば、それぞれの読み枠が、前記ＮＣＲＤおよび前記ＣＣＲＤのアミノ酸に対応するように、結合している。間接的な結合の場合、前記ＮＣＲＤポリヌクレオチドと前記ＣＣＲＤポリヌクレオチドとの間に、リンカーを有してもよい。この場合、前記ＣＣＲＤポリヌクレオチドの読み枠が変らないように、前記リンカーの配列を設計することが好ましい。前記リンカーは、例えば、ポリヌクレオチドである。
　前記ＮＣＲＤの中でも、前記（Ｎ１）のペプチドをコードする（ｎ１）ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号２の塩基配列で表わされる。
配列番号２
atggccttcagcggttcccaggctccctacctgagtccagctgtccccttttctgggactattcaaggaggtctccaggacggacttcagatcactgtcaatgggaccgttctcagctccagtggaaccaggtttgctgtgaactttcagactggcttcagtggaaatgacattgccttccacttcaaccctcggtttgaagatggagggtacgtggtgtgcaacacgaggcagaacggaagctgggggcccgaggagaggaagacacacatgcctttccagaaggggatgccctttgacctctgcttcctggtgcagagctcagatttcaaggtgatggtgaacggtatcctcttcgtgcagtacttccaccgcgtgcccttccaccgtgtggacaccatctccgtcaatggctctgtgcagctgtcctacatcagcttccag
　前記ＣＣＲＤの前記Ｎ末端領域である前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドをコードする（ｃ－ｎ１）ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４の塩基配列において、３個の連続する塩基を１セットとするコドンが、１～１７セット欠失した塩基配列で表わされる。前記欠失するコドンのセット数および欠失するコドンの位置は、例えば、前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドにおいて説明した、欠失するアミノ酸残基数および欠失するアミノ酸の位置に対応する。配列番号４において、下線部の塩基は、配列番号３における１０番目～１３番目の４つのアミノ酸をコードする配列であり、前記アミノ酸に応じて設定できる。
配列番号４
actcccgccatcccacctatgatgtacnnnnnnnnnnnntatccgatgcct
　前記（ｃ－ｎ１）ポリヌクレオチドは、具体例として、例えば、以下の塩基配列が例示できる。なお、本発明において、前記（ｃ-ｎ１）のポリヌクレオチドは、以下の配列に制限されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　前記ＣＣＲＤのＣ末端領域の中でも、前記（Ｃ－Ｃ１）のペプチドをコードする（ｃ－ｃ１）ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号６の塩基配列で表わされる。
配列番号６
ttcatcaccaccattctgggagggctgtacccatccaagtccatcctcctgtcaggcactgtcctgcccagtgctcagaggttccacatcaacctgtgctctgggaaccacatcgccttccacctgaacccccgttttgatgagaatgctgtggtccgcaacacccagatcgacaactcctgggggtctgaggagcgaagtctgccccgaaaaatgcccttcgtccgtggccagagcttctcagtgtggatcttgtgtgaagctcactgcctcaaggtggccgtggatggtcagcacctgtttgaatactaccatcgcctgaggaacctgcccaccatcaacagactggaagtggggggcgacatccagctgacccatgtgcagacatag
　前記Ｎ末端領域と前記Ｃ末端領域とからなる前記ＣＣＲＤをコードするポリヌクレオチド（ＣＣＲＤポリヌクレオチド）は、具体例として、前記表２に示す各配列番号の塩基配列の３’末端に、配列番号６の塩基配列の５’末端が連結している塩基配列があげられる（表２に示す配列番号６３～７６）。なお、本発明において、前記ＣＣＲＤポリヌクレオチドは、これらの配列に制限されない。
　本発明のガレクチン９改変体をコードする核酸は、具体例として、前記表３に示す配列番号７７～９０のいずれか一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。なお、本発明の核酸は、これらの例示には制限されない。
　前記核酸は、例えば、ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＲＮＡは、例えば、例示したＤＮＡの塩基配列において、ＴをＵに置換した塩基配列が例示できる。ＤＮＡは、例えば、デオキシリボヌクレオチドを含む配列、デオキシリボヌクレオチドからなる配列等があげられ、ＲＮＡは、例えば、リボヌクレオチドを含む配列、リボヌクレオチドからなる配列等があげられる。また、前記核酸は、例えば、人工核酸からなる配列でもよいし、前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、さらに人工核酸を含む配列でもよい。人工核酸は、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡ等があげられる。
（２）発現ベクター
　本発明の発現ベクターは、前記本発明の核酸を有することを特徴とする。本発明の発現ベクターは、例えば、宿主に導入し、得られた形質転換体で前記核酸がコードするタンパク質を発現させることによって、前記本発明のガレクチン９改変体を製造できる。本発明の発現ベクターは、前記本発明のガレクチン９改変体を発現可能なように、前記本発明の核酸を機能的に有していればよく、その他の構成は、特に制限されない。
　前記発現ベクターは、例えば、非ヒト宿主に導入することで、前記本発明のガレクチン９改変体を発現できればよい。前記非ヒト宿主は、特に制限されず、適宜選択できる。前記非ヒト宿主は、例えば、微生物、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、またはこれらの培養細胞等があげられる。前記微生物は、例えば、原核生物および真核生物等があげられる。前記原核生物は、例えば、大腸菌（Escherichia　coli）等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス（Bacillus　subtilis）等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas　putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium　meliloti）等のリゾビウム属等の細菌があげられる。前記真核生物は、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces　cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces　pombe）等の酵母等があげられる。前記動物細胞は、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等があげられ、前記昆虫細胞は、例えば、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞等があげられる。
　前記発現ベクターは、例えば、骨格となるベクター（以下、「基本ベクター」ともいう）に、前記核酸を挿入することで作製できる。前記基本ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターを導入する前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。大腸菌等の細菌に形質転換を行う場合、前記基本ベクターとして、例えば、ｐＥＴベクター（Merck社）、ｐＣｏｌｄベクター（タカラバイオ株式会社）、ＰＱＥベクター（QIAGEN社）等があげられる。酵母等の真核生物に形質転換を行う場合、前記基本ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられ、また、ｐＹＥＳ（Invitrogen社）、ｐＥＳＣ（Stratagene社）等の市販の酵母発現用ベクターを用いることもできる。前記基本ベクターは、アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合、例えば、バイナリーベクターが好ましく、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＰＺＰ２０２、ｐＢＩＮＰＬＵＳおよびｐＢＩＮ１９等があげられる。
　前記発現ベクターは、例えば、核酸の発現およびタンパク質の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記プロモーターの由来は、特に制限されず、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス－４０（ＳＶ－４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等があげられる。前記プロモーターは、この他に、例えば、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター等の調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は、特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、核酸の発現およびタンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記基本ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記基本ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記基本ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
　前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
（３）形質転換体
　本発明の形質転換体は、前記本発明の核酸または前記本発明の発現ベクターを有することを特徴とする。本発明の形質転換体は、前記本発明のガレクチン９改変体を発現可能なように、前記本発明の核酸を機能的に有していればよく、その他の構成は、特に制限されない。
　前記形質転換体は、例えば、宿主に前記本発明の核酸を導入することによって得られる。前記宿主は、特に制限されず、前述した非ヒト宿主があげられる。また、本発明の形質転換体は、例えば、前記本発明の核酸を、前記本発明の発現ベクターとして有してもよく、その場合、例えば、宿主に前記本発明の発現ベクターを導入することによって得られる。
　前記核酸または前記発現ベクターを前記宿主に導入する方法は、特に制限されず、公知の方法により行うことができる。前記導入方法は、例えば、前記宿主の種類に応じて、適宜設定できる。
　前記導入方法は、例えば、パーティクルガン等の遺伝子銃による導入法、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法、アグロバクテリウムを介する方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。
３．ガレクチン９改変体の製造方法
　本発明のガレクチン９改変体の製造方法は、例えば、前記本発明の核酸を発現させる工程を有することを特徴とする。本発明の製造方法によれば、例えば、野生型ガレクチン９を組換えタンパク質として製造する場合と比較して、優れた収率でガレクチン９改変体を得ることができる。
　本発明の製造方法は、前記本発明の核酸の発現により、前記核酸の転写および前記核酸がコードするタンパク質への翻訳を行い、前記本発明のガレクチン９改変体を合成することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。
　本発明の製造方法において、前記本発明の核酸の発現は、例えば、前述のように、宿主を用いた細胞系で行ってもよいし、無細胞タンパク質合成系で行ってもよい。
　前記細胞系の場合、例えば、宿主に前記本発明の核酸を導入することで、本発明のガレクチン９改変体を合成できる。前記宿主は、例えば、前述の通りであって、前記宿主への前記本発明の核酸の導入は、前記本発明の発現ベクターの導入でもよい。
　そして、さらに、前記宿主への前記本発明の核酸の導入によって得られた形質転換体を、培養する工程を含むことが好ましい。前記培養工程における条件は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて適宜決定できる。
　発現させた前記本発明のガレクチン９改変体は、例えば、発現後そのまま使用してもよいし、精製したものを使用してもよい。精製方法は、特に制限されず、例えば、塩析、電気泳動、各種クロマトグラフィー等があげられる。
４．ガレクチン９改変体の用途
　本発明のガレクチン９改変体は、医薬としての用途があげられる。具体的に、前記ガレクチン９改変体は、例えば、野生型ガレクチン９の活性、例えば、悪性腫瘍に対する細胞傷害活性、悪性腫瘍に対するアポトーシス誘導活性、悪性腫瘍に対する抗腫瘍活性、活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４陽性Ｔ細胞）または活性化Ｂ細胞のアポトーシス誘導活性、免疫調節活性、抗炎症活性および／または抗アレルギー活性等が保存されている。このため、本発明のガレクチン９改変体は、例えば、野生型ガレクチン９と同様の医薬用途があげられる。
　すなわち、本発明の医薬は、前記本発明のガレクチン９改変体（タンパク質またはその塩）、前記本発明の核酸および前記本発明の発現ベクターの少なくともいずれか一つを含み、免疫調節剤（免疫抑制剤の意味も含む）、抗腫瘍剤、腫瘍転移阻害剤、鎮痛剤、抗炎症剤および消炎剤からなる群から選択された少なくとも一つの用途に使用する医薬であることを特徴とする。本発明の医薬が、前記本発明の核酸または前記本発明の発現ベクターを含む場合、例えば、投与した患者の体内で、前記核酸から前記本発明のガレクチン９改変体が発現できればよい。
　なお、本発明の医薬は、例えば、疾患の治療または予防に使用でき、前記治療は、例えば、原因療法および対症療法のいずれでもよく、また、症状の消失、症状の緩和（改善）、および症状の進行の阻害等のいずれでもよい。
　本発明の医薬の投与対象は、特に制限されず、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等の哺乳類、魚類、ニワトリ等の鳥類、蠕虫類、昆虫類、爬虫類、両生類等があげられる。
　本発明の医薬の投与方法は、特に制限されず、疾患の種類に応じて適宜決定できる。前記投与方法は、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよく、また、直接的な投与でも間接的な投与でもよい。非経口投与は、例えば、局所、経皮、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および腹腔内等の投与があげられる。
　本発明の医薬が前記本発明のガレクチン９改変体を含む場合、その投与量は、特に制限されず、投与対象、疾患の種類、疾患の程度等によって、適宜決定できる。具体例として、１日の投与量は、体重１ｋｇあたり、例えば、５μｇ～５ｍｇであり、好ましくは５０μｇ～５００μｇであり、より好ましくは１００μｇ～５００μｇであり、さらに好ましくは２００μｇ～２５０μｇである。１日の投与回数は、例えば、１～３回である。
　本発明の医薬が前記本発明の核酸を含む場合、投与方法は、例えば、in　vivoおよびex　vivoのいずれでもよい。前者の場合、例えば、前記本発明の核酸を患者の生体に投与すればよく、後者の場合、例えば、単離した組織または細胞に、前記本発明の核酸を導入した後、前記組織または細胞を、患者の生体に導入すればよい。
　本発明の医薬が前記本発明の核酸を含む場合、その投与量は、特に制限されず、投与対象、疾患の種類、疾患の程度等によって、適宜決定できる。前記投与量は、例えば、前述した量の前記本発明のガレクチン９改変体を発現する量であることが好ましい。具体例として、前記核酸を局所的に投与する場合、１日の投与量は、ヒトの組織あたり、例えば、１００ｎｇ～２００ｍｇであり、好ましくは５００ｎｇ～５０ｍｇであり、より好ましくは１μｇ～２ｍｇであり、さらに好ましくは５μｇ～５００μｇである。１日の投与回数は、例えば、１～３回である。
　本発明の医薬の形態は、例えば、前述のような投与方法に応じて適宜決定できる。前記形態は、例えば、溶液製剤、分散製剤、半固形製剤、粉粒体製剤、成型製剤、浸出製剤等があげられる。具体例として、例えば、錠剤、被覆錠剤、糖衣を施した剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、マイクロカプセル剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、灌注剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤、クリーム剤、油剤、坐剤（例えば、直腸坐剤）、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、注射用液剤、液体製剤を調製するための粉末剤、凍結乾燥製剤およびゲル調製品等があげられる。
　本発明の医薬は、前記本発明のガレクチン９改変体、前記本発明の核酸または前記本発明の発現ベクターの他に、薬学的に許容できる添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、特に制限されず、医薬の形態に応じて適宜選択でき、医薬の製造における公知の物質が使用できる。また、医薬において、前記添加剤の添加量は、特に制限されず、有効成分として含まれる前記本発明のガレクチン９改変体の性質を阻害しない範囲であればよい。前記添加剤としては、例えば、担体、アジュバント剤、賦形剤、補形剤、希釈剤、香味剤、香料、甘味剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、界面活性剤、基剤、溶剤、充填剤、増量剤、溶解補助剤、可溶化剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、増粘剤、ゲル化剤、硬化剤、吸収剤、粘着剤、弾性剤、可塑剤、崩壊剤、噴射剤、保存剤、抗酸化剤、遮光剤、保湿剤、緩和剤、帯電防止剤および無痛化剤等があげられ、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。
　以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明は、実施例に記載された態様に限定されるものではない。
［実施例１］
　前述のように、国際公開第ＷＯ２００５／０９３０６４号において、野生型ガレクチン９Ｍの１４９番目のプロリンから１７７番目のセリンまでの領域を欠失したアミノ酸配列からなる安定化ガレクチン９が報告されている。前記安定化ガレクチン９のアミノ酸配列を、図１に示す（配列番号９１）そして、前記安定化ガレクチン９について、野生型ガレクチン９Ｍの生理活性を保持すること、および、野生型ガレクチン９Ｍと比較して、優れたプロテアーゼ安定性を有することが証明されている。そこで、前記安定化ガレクチン９を改変したガレクチン９改変体について、溶解性、生理活性およびプロテアーゼ安定性を確認した。
（１）発現ベクターの構築
（１－１）欠失型のガレクチン９改変体
　ガレクチン９改変体は、ＮＣＲＤとＣＣＲＤとが直接連結したアミノ酸配列からなるタンパク質とした。各改変体の間において、ＮＣＲＤのアミノ酸配列（配列番号１）およびＣＣＲＤのＣ末端領域のアミノ酸配列（配列番号５）は共通とし、ＣＣＲＤのＮ末端領域のみ、配列番号３のアミノ酸配列（１７アミノ酸残基）において、Ｎ末端から４個、６個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１６個のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列に設定した。各ガレクチン９改変体は、前記ＣＣＲＤのＮ末端領域における欠失アミノ酸の個数に応じて、ガレクチン９改変体ｍＣ４、ｍＣ６、ｍＣ８、ｍＣ９ｍ、ｍＣ１０、ｍＣ１１、ｍＣ１２、ｍＣ１３、ｍＣ１４、ｍＣ１６とした。以下に、前記安定化ガレクチン９および各ガレクチン９改変体について、ＣＣＲＤのＮ末端領域のアミノ酸配列と塩基配列ならびに全長のアミノ酸配列と塩基配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 ※１　配列番号４において、12個の連続する塩基は、PHPA（配列番号１３２）をコードするccccaccccgcc（配列番号１３０）
　前記ガレクチン９改変体を発現する発現ベクターを、以下の方法により構築した。国際公開第ＷＯ２００５／０９３０６４号の実施例１における前記安定化ガレクチン９（以下、Ｇ９Ｎｕｌｌともいう）のアミノ酸配列（配列番号９１）を、図１に示す。まず、前記Ｇ９Ｎｕｌｌのコード配列（配列番号９２）を、ｐＥＴ－１１ａのクローニングサイト（ＢａｍＨＩサイト）に挿入し、前記Ｇ９Ｎｕｌｌの発現ベクターｐＥＴ－Ｇ９Ｎｕｌｌを、定法により作製した。前記安定化ガレクチン９について、野生型ガレクチン９の細胞死誘導活性を有し、且つ、前記野生型ガレクチン９と比較して、プロテアーゼ安定性が有意に優れることは、国際公開ＷＯ２００５／０９３０６４号において確認済みである。
配列番号９２
ATGGCCTTCAGCGGTTCCCAGGCTCCCTACCTGAGTCCAGCTGTCCCCTTTTCTGGGACTATTCAAGGAGGTCTCCAGGACGGACTTCAGATCACTGTCAATGGGACCGTTCTCAGCTCCAGTGGAACCAGGTTTGCTGTGAACTTTCAGACTGGCTTCAGTGGAAATGACATTGCCTTCCACTTCAACCCTCGGTTTGAAGATGGAGGGTACGTGGTGTGCAACACGAGGCAGAACGGAAGCTGGGGGCCCGAGGAGAGGAAGACACACATGCCTTTCCAGAAGGGGATGCCCTTTGACCTCTGCTTCCTGGTGCAGAGCTCAGATTTCAAGGTGATGGTGAACGGTATCCTCTTCGTGCAGTACTTCCACCGCGTGCCCTTCCACCGTGTGGACACCATCTCCGTCAATGGCTCTGTGCAGCTGTCCTACATCAGCTTCCAGCATATGACTCCCGCCATCCCACCTATGATGTACCCCCACCCCGCCTATCCGATGCCTTTCATCACCACCATTCTGGGAGGGCTGTACCCATCCAAGTCCATCCTCCTGTCAGGCACTGTCCTGCCCAGTGCTCAGAGGTTCCACATCAACCTGTGCTCTGGGAACCACATCGCCTTCCACCTGAACCCCCGTTTTGATGAGAATGCTGTGGTCCGCAACACCCAGATCGACAACTCCTGGGGGTCTGAGGAGCGAAGTCTGCCCCGAAAAATGCCCTTCGTCCGTGGCCAGAGCTTCTCAGTGTGGATCTTGTGTGAAGCTCACTGCCTCAAGGTGGCCGTGGATGGTCAGCACCTGTTTGAATACTACCATCGCCTGAGGAACCTGCCCACCATCAACAGACTGGAAGTGGGGGGCGACATCCAGCTGACCCATGTGCAGACATAG
　そして、前記ｐＥＴ－Ｇ９Ｎｕｌｌを標的配列とし、下記プライマーＡ１およびＡ２を用いたＰＣＲによって、ＮＣＲＤペプチド（配列番号１）をコードするＮＣＲＤポリヌクレオチド（配列番号２）を増幅し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。
（プライマー）
Ａ１：5'-CGTCCTCGTCCTCATATGGCCTTCAGCGGTTCCCAGGCT-3'（配列番号９３）
Ａ２：5'-CTGGAAGCTGATGTAGGACAGCTG-3'（配列番号９４）
　同様に、前記ｐＥＴ－Ｇ９Ｎｕｌｌを標的配列として、下記プライマーＡ４および各改変体に応じた下記プライマーＢ１～Ｋ１を用いたＰＣＲによって、各改変体のＣＣＲＤ（ＣＣＲＤ１～ＣＣＲＤ１０、１０種類）をコードするポリヌクレオチドを増幅し、アガロースゲル電気泳動によって精製した。
（プライマー）
Ｂ１：5'-TACATCAGCTTCCAGCCACCTATGATGTACCCCCACCCC-3'（配列番号９５）
Ｃ１：5'-TACATCAGCTTCCAGATGATGTACCCCCACCCCGCCTAT-3'（配列番号９６）
Ｄ１：5'-TACATCAGCTTCCAGTACCCCCACCCCGCCTATCCGATG-3'（配列番号９７）
Ｅ１：5'-TACATCAGCTTCCAGCCCCACCCCGCCTATCCGATGCCT-3'（配列番号９８）
Ｆ１：5'-TACATCAGCTTCCAGCACCCCGCCTATCCGATGCCTTTC-3'（配列番号９９）
Ｇ１：5'-TACATCAGCTTCCAGCCCGCCTATCCGATGCCTTTCATC-3'（配列番号１００）
Ｈ１：5'-TACATCAGCTTCCAGGCCTATCCGATGCCTTTCATCACC-3'（配列番号１０１）
Ｉ１：5'-TACATCAGCTTCCAGTATCCGATGCCTTTCATCACCACC-3'（配列番号１０２）
Ｊ１：5'-TACATCAGCTTCCAGCCGATGCCTTTCATCACCACCATT-3'（配列番号１０３）
Ｋ１：5'-TACATCAGCTTCCAGCCTTTCATCACCACCATTCTGGGA-3'（配列番号１０４）
　つぎに、前記ＮＣＲＤをコードするポリヌクレオチド（ＮＣＲＤ）と前記ＣＣＲＤをコードする各ポリヌクレオチド（ＣＣＲＤ１～ＣＣＲＤ１０）とを混合し、これらの混合物に対して、前記プライマーＡ１および下記プライマーＡ４を用いた２段階目のＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製した。精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、精製した後、同じ制限酵素で切断したｐＥＴ－１１ａベクターにライゲーションし、定法にしたがって、正しい配列を含むクローンを選択した。これらのクローンを、各ガレクチン９改変体の発現ベクターとした。
（プライマー）
Ａ４：5'-CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAGCTG-3'（配列番号１０５）
　そして、前記クローンを、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、組換えタンパク質発現用の形質転換体を作製し、約１５％のグリセリン存在下、－８０℃で保存した。
（１－２）欠失・置換型のガレクチン９改変体
　ガレクチン９改変体として、前記ガレクチン９改変体ｍＣ９～ｍＣ１２について、さらに、前記ＣＣＲＤのＮ末端領域のアミノ酸を置換したタンパク質を設計した。以下に、各ガレクチン９改変体について、種類、前記Ｎ末端領域のアミノ酸配列および塩基配列、全長のアミノ酸配列および塩基配列を示す。下記配列において、下線部は、ｍＣ９～ｍＣ１２のアミノ酸配列に対して、置換したアミノ酸残基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　前記ガレクチン９改変体を発現する発現ベクターを、以下の方法により構築した。まず、ｍＣ９、ｍＣ１０、ｍＣ１１およびｍＣ１２の発現ベクターを、それぞれ標的配列として、前記プライマーＡ１と、前記置換したアミノ酸配列に対応する変異配列を含む下記プライマーＬ２～Ｗ２を用いたＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製した（ｍｕＮＣＲＤ１～ｍｕＮＣＲＤ１２、１２種類）。
（プライマー）
Ｌ２：5'-ATAGGCGGGCGGGTGCTGGAAGCTGATGTAGGA-3'（配列番号１０６）
Ｍ２：5'-GATAGGCGGCGTGCTGGAAGCTGATGTA-3'（配列番号１０７）
Ｎ２：5'-AAGGCATCGCATAGGCGGGGTGCTGGAA-3'（配列番号１０８）
Ｏ２：5'-TGATGAAAGCCATCGGATAGGCGGGGTG-3'（配列番号１０９）
Ｐ２：5'-TGATGAAAGCCATCGCATAGGCGGCGTGCTGGAAGCTGATG-3'（配列番号１１０）
Ｑ２：5'-TGAAAGGCGGCGGATAGGGGGGGTGCTG-3'（配列番号１１１）
Ｒ２：5'-GGCATCGGCGGGGCGGGGTGCTGGAAGCT-3'（配列番号１１２）
Ｓ２：5'-TCGGATAGGGGGGGTGCTGGAAGCTGAT-3'（配列番号１１３）
Ｔ２：5'-CGGATAGGGGGCCTGGAAGCTGATGTAGGA-3'（配列番号１１４）
Ｕ２：5'-TCGGATAGGGGGGCTGGAAGCTGATGTA-3'（配列番号１１５）
Ｖ２：5'-TGGTGATGAAAGCCATCGCATAGGCCTGGAAGCTGAT-3'（配列番号１１６）
Ｗ２：5'-AGGCATCGGAGGGGCCTGGAAGCTGATGTA-3'（配列番号１１７）
　同様に、ｍＣ９、ｍＣ１０、ｍＣ１１およびｍＣ１２の発現ベクターを、それぞれ標的配列として、前記プライマーＡ４と、前記置換したアミノ酸配列に対応する変異配列を含む下記プライマーＬ１～Ｗ１を用いたＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製した（ｍｕＣＣＲＤ１～ｍｕＣＣＲＤ１２、１２種類）。
（プライマー）
Ｌ１：5'-AGCTTCCAGCACCCGCCCGCCTATCCGATGCCT-3'（配列番号１１８）
Ｍ１：5'-TTCCAGCACGCCGCCTATCCGATGCCTT-3'（配列番号１１９）
Ｎ１：5'-CCCGCCTATGCGATGCCTTTCATCACCA-3'（配列番号１２０）
Ｏ１：5'-TATCCGATGGCTTTCATCACCACCATTC-3'（配列番号１２１）
Ｐ１：5'-TTCCAGCACGCCGCCTATGCGATGGCTTTCATCACCACCATTC-3'（配列番号１２２）
Ｑ１：5'-CTATCCGCCGCCTTTCATCACCACCATT-3'（配列番号１２３）
Ｒ１：5'-CCCCGCCCCGCCGATGCCTTTCATCACC-3'（配列番号１２４）
Ｓ１：5'-CAGCACCCCCCCTATCCGATGCCTTTCA-3'（配列番号１２５）
Ｔ１：5'-TTCCAGGCCCCCTATCCGATGCCTTTCA-3'（配列番号１２６）
Ｕ１：5'-CCAGCCCCCCTATCCGATGCCTTTCATC-3'（配列番号１２７）
Ｖ１：5'-TTCCAGGCCTATGCGATGGCTTTCATCACCACCATTC-3'（配列番号１２８）
Ｗ１：5'-TTCCAGGCCCCTCCGATGCCTTTCATCACC-3'（配列番号１２９）
　つぎに、前者のＰＣＲ産物（ｍｕＮＣＲＤ１～ｍｕＮＣＲＤ１２）と後者のＰＣＲ産物（ｍｕＣＣＲＤ１～ｍｕＣＣＲＤ１２）とを混合し、これらの混合物に対して、前記プライマーＡ１およびＡ４を用いた２段階目のＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で精製した。精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、精製した後、同じ制限酵素で切断したｐＥＴ－１１ａベクターにライゲーションし、定法にしたがって、正しい配列を含むクローンを選択した。これらのクローンを、各ガレクチン９改変体の発現ベクターとした。
　そして、前記クローンを、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、形質転換体を作製し、約１５％のグリセリン存在下、－８０℃で保存した。
（２）ガレクチン９改変体の発現および収量の測定
　前記（１）で作製した形質転換体を用いて、以下の方法によりガレクチン９改変体を発現させ、発現直後の組換えタンパク質の被検サンプル（発現直後の標品ともいう）と、発現後３ヶ月保存した後に不溶物を除去した組換えタンパク質の被検サンプル（保存３ヶ月後の標品ともいう）について、収量の測定を行った。
　前記形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ－ｂｒｏｔｈに添加して、３７℃で一夜培養した。１０００ｍＬフラスコに、４００ｍＬの２ＸＹＴ、４ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬアンピシリンおよび前記培養で得られたＥ．ｃｏｌｉ培養液８ｍＬを加えた。ついで、前記フラスコを振とうしながら、Ａ６００ｎｍが約０．７になるまで３７℃で培養し、さらに、前記フラスコあたり０．４ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌ　イソプロピル－β－Ｄ（－）チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えて、２０℃で一夜（１６～２０時間）培養した。そして、遠心分離により前記培養液から菌体を回収した。
　回収した前記菌体を、前記フラスコあたり８０ｍＬの抽出用緩衝液に懸濁した。前記抽出用緩衝液の組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍｍｏｌ／Ｌ　フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００とした。そして、前記懸濁液を、ｏｕｔ　ｐｕｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ＝５、％ｄｕｔｙ　ｃｙｃｌｅ＝１００の条件で、超音波波処理した後、４℃で３０分間攪拌した。前記超音波処理は、２分間の処理および１分間の休止を１サイクルとして、４サイクル繰り返した。ついで、前記懸濁液を、１５，０００ｘｇで３０分間遠心分離して、不溶物を除去し、上清を回収した。
　得られた上清に、３ｍＬのラクトース－アガロース懸濁液（５０％［ｖ／ｖ］ｉｎ　ＰＢＳ、ゲルとして１．５ｍｌ）を加えて、４℃で１時間攪拌した。さらに、２，０００ｘｇで５分間遠心分離して前記ラクトース－アガロースゲルを回収し、０．０３％の３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）を含むＴＢＳに懸濁して、ミニカラムに充填した。ついで、ゲルの１０倍量の０．０３％ＣＨＡＰＳ含有ＴＢＳでゲルを洗浄した後、３ｍＬの溶出液でタンパク質を溶出した。前記溶出液の組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌおよび０．２ｍｏｌ／Ｌラクトースとした。前記溶出液をＰＢＳに対して透析した後、２５，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、不溶物を除去し、得られた上清をろ過滅菌して最終サンプルを得た。これを、以下、調製直後の被検サンプルという。前記サンプル３μｇについてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルーＲ－２５０で染色した。そして、定法に基づいて、前記ＳＤＳ－ＰＡＧＥによるタンパク質の純度検定およびタンパク質濃度の測定を行い、各ガレクチン９改変体の収量を算出した。これを、調製直後の組換えタンパク質の収量とした。
　また、この調製直後の被検サンプルを、さらに４℃で３ヶ月間保存した。保存後、前記サンプルを、２５，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、不溶物を除去し、得られた上清をろ過滅菌して、３ヶ月保存後の被検サンプルを得た。そして、前記調製直後の被検サンプルと同様に、定法に基づいて、タンパク質濃度の測定を行い、各ガレクチン９改変体の収量を算出した。これを、保存３ヶ月後の組換えタンパク質の収量とした。
　また、比較例として、前記安定化ガレクチン９の発現ベクターｐＥＴ－Ｇ９Ｎｕｌｌを使用し、同様にしてタンパク質の発現ならびに評価を行った。
　図２に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真を示す。図２において、レーンＭは、分子量マーカーであり、各レーンは、各ガレクチン９改変体の調製直後の被検サンプルを示す。図２および図３に示すように、いずれのガレクチン９改変体も大腸菌内で発現し、さらに、ラクトース－アガロースを利用したアフィニティークロマトグラフィーによって、高度に精製できることが確認された。
　図３に、前記（１－１）で調製した欠失型のガレクチン９改変体および安定化ガレクチン９の濃度を示す。図３において、Ａは、調製直後の被検サンプルの結果であり、Ｂは、保存３ヶ月後の被検サンプルの結果である。図３において、縦軸は、前記サンプルにおける前記ガレクチン９改変体または前記安定化ガレクチン９の濃度（μｇ／ｍｌ）であり、前記ガレクチン９改変体は、２回の発現実験の平均値を示し、前記安定化ガレクチン９は、１２回の平均値と標準偏差を示した。
　図３に示すように、調製直後の被検サンプルの場合、ガレクチン９改変体ｍＣ８、ｍＣ９、ｍＣ１０、ｍＣ１１、ｍＣ１２、ｍＣ１３およびｍＣ１４は、安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）と比較して、タンパク質濃度が有意に高かった。中でも、ｍＣ９、ｍＣ１０、ｍＣ１２およびｍＣ１４は、極めて高いタンパク質濃度を示した。また、保存３ヶ月後の被検サンプルにおいても、ガレクチン９改変体ｍＣ１０、ｍＣ１１、ｍＣ１２，ｍＣ１３は、安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）と比較して、タンパク質濃度が有意に高かった。
　安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）は、発現後に最終サンプル（調製直後の被検サンプル）を調製する際、前記カラムからの溶出工程で、最大溶解度を超えたため、一部の安定化ガレクチン９が不溶化した。そして、この不溶物は、前記溶出工程後の遠心工程およびろ過工程により除去された。このため、図３に示すように、安定化ガレクチン９は、前述のように、前記被検サンプルにおけるタンパク質濃度が低いという結果となった。他方、ガレクチン９改変体は、前記溶出工程における不溶化が、安定化ガレクチン９と比較して、有意に抑制されていた。このため、図３に示すように、ガレクチン９改変体は、安定化ガレクチン９と比較して、前記被検サンプルにおけるタンパク質濃度が、有意に高い結果となった。
　本実施例では、いずれの組換えタンパク質についても、同じ条件で一定体積の最終サンプル（調製直後の被検サンプル）を調製した。このため、前記被検サンプルにおけるガレクチン９改変体の濃度が、前記被検サンプルにおける安定化ガレクチン９の濃度と比較して、有意に高いということは、ガレクチン９改変体の溶解度が安定化ガレクチン９の溶解度よりも有意に高いことを意味する。また、前記被検サンプルにおけるガレクチン９改変体の濃度の高さは、ガレクチン９改変体が高い収率で回収できたことを意味する。
　目的のタンパク質の合成、遠心処理やろ過処理等を伴う前記タンパク質の精製、また、前記タンパク質の製剤化においては、一般的に、緩衝液等の水性溶媒に対して、前記タンパク質の可溶化が利用される。このため、前記タンパク質の溶解度が高い程、例えば、回収における前記タンパク質のロスが防止され、また、取扱性にも優れることとなる。本発明のガレクチン９改変体は、前述のように優れた溶解度であることから、同様の生理活性を有する前記安定化ガレクチン９よりも、タンパク質の製造、精製および製剤化等において優れているといえる。
　図４に、前記（１－２）で調製した欠失・置換型のガレクチン９改変体および前記（１－１）で調製した欠失型のガレクチン９改変体の濃度を示す。図４において、Ａは、調製直後の被検サンプルの結果であり、Ｂは、保存３ヶ月後の被検サンプルの結果である。図４において、縦軸は、前記被検サンプルにおける前記ガレクチン９改変体の濃度（μｇ／ｍｌ）であり、前記ガレクチン９改変体は、２回の発現実験の平均値を示し、前記安定化ガレクチン９は、１２回の平均値と標準偏差を示した。
　図４に示すように、調製直後の被検サンプルの場合、欠失・置換型のガレクチン９改変体であるｍＣ９－ＨＰ、ｍＣ１０－１Ｐ１Ａ１、ｍＣ１０－１Ｐ１Ａ２、ｍＣ１０－ＨＰＡＰ、ｍＣ１０－ＨＰＰＹ、ｍＣ１１－ＡＰおよびｍＣ１１－ＰＰは、安定化ガレクチン９と比較して、タンパク質濃度が高かった。また、３ヵ月保存後の被検サンプルの場合、欠失・置換型のガレクチン９改変体であるｍＣ１０－ＨＰＡＰ、ｍＣ１０－ＨＰＰＹおよびｍＣ１１－ＡＰは、安定化ガレクチン９と比較して、タンパク質濃度も高かった。
　また、図４に示すように、調製直後の被検サンプルの場合、欠失・置換型のガレクチン９改変体であるｍＣ１０－ＨＰＡＰ、ｍＣ１０－ＨＰＰＹ、ｍＣ１１－ＡＰおよびｍＣ１１－ＰＰは、それぞれ対応する欠失型のガレクチン９改変体と比較して、タンパク質濃度が高かった。また、３ヵ月保存後の被検サンプルにおいても、欠失・置換型のガレクチン９改変体であるｍＣ１０－ＨＰＰＹおよびｍＣ１１－ＡＰは、それぞれ対応するガレクチン９改変体と比較して、タンパク質濃度が高かった。中でも、３ヶ月保存後の被検サンプルで比較した場合、欠失型のｍＣ１０に対して、プロリン残基が保存され且つチロシン残基がプロリン残基に置換された欠失・置換型のｍＣ１０－ＨＰＰＹは、タンパク質濃度が約３．３倍に増加した。また、欠失型のｍＣ１１に対して、プロリン－アラニンがアラニン－プロリンに置換された欠失・置換型のｍＣ１１－ＡＰは、タンパク質濃度が約２．２倍に増加した。この結果から、前記ＣＣＲＤのＮ末端領域が、配列番号３の１２番目または１５番目および１７番目のプロリン残基を保存し、さらに、プロリン残基への置換を有することによって、ガレクチン９改変体の溶解性をより向上できることがわかった。
（３）Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する、ガレクチン９改変体の細胞死誘導活性の測定
　ＲＰＭＩ１６４０－１０％ＦＢＳ培地中で培養したＪｕｒｋａｔ細胞を遠心分離により回収し、３ｘ１０４細胞／９０μＬの濃度となるように新たな培地に懸濁した。得られた懸濁液を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり９０μＬ播種した。そして、炭酸ガス培養器中で３時間培養した後、ガレクチン９改変体を含むサンプル１０μＬを各ウェルに加えた。前記サンプルは、各ウェルにおける前記ガレクチン９改変体の濃度が、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１μｍｏｌ/Ｌとなるように、前記（１）の各ガレクチン９改変体をＰＢＳで希釈して調製した。つぎに、２４時間培養した後、１０μＬのＷＳＴ－８試薬を各ウェルに加えて、さらに３時間培養した。そして、１０μＬの１．２％ＳＤＳを各ウェルに加えて、マイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍにおける吸光度の差を算出した。このアッセイは、３ウェルを一組として行った。また、コントロールとして、前記サンプルに代えて１０μｌのＰＢＳを添加し、同様の測定を行った。そして、コントロールの算出値を１００％として、前記サンプルを添加した場合の算出値について、相対値（％）を求めた。この相対値を、細胞数を示す値とした。
　また、比較例として、前記ガレクチン９改変体に代えて、前記安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）を使用し、同様にして細胞数の測定を行った。
　この結果から、ガレクチン９改変体および安定化ガレクチン９が、Ｊｕｒｋａｔ細胞の数を５０％減少させる濃度（ＬＤ５０）を求め、安定化ガレクチン９のＬＤ５０を１００％とした時の、各ガレクチン９改変体の相対値（％）を比活性として求めた。この結果を、下記表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表７に示すように、前記ガレクチン９改変体は、安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）と比較して、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する細胞死誘導活性が有意に高かった。この結果から、十分に安定化ガレクチン９の生理活性を維持し、且つ、前述のように溶解性にも優れるガレクチン９改変体であることがわかった。
（４）プロテアーゼ安定性
　前記（２）で調製したガレクチン９改変体ｍＣ１０－ＨＰＰＹについて、ヒト組織中に存在するプロテアーゼに対する安定性を確認した。
　０．０６ｍｇ／ｍＬとなるように、ガレクチン９改変体を１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌと１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２を含む１００ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に溶解し、さらにプロテアーゼを混合し、３７℃でインキュベートした。ガレクチン９変異体（Ｇ）に対するプロテアーゼ（Ｐ）の添加割合は、重量比でＧ：Ｐ＝１００：１とした。プロテアーゼは、エラスターゼ（商品名Ｅｌａｓｔａｓｅ、Ｅｌａｓｔｉｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｉｎｃ．社製）またはマトリックスメタロプロテイナーゼ－３（ＭＭＰ－３、商品名Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製）を使用した。ＭＭＰ－３は、使用前に２０ｍｍｏｌ／ＬのＡｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ　ｍｅｒｃｕｒｉｃ　ａｃｅｔａｔｅによる活性化処理（３７℃、８時間）を行った。インキュベータ中に経時的にサンプリングを行い、各サンプルについてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルーＲ－２５０で染色した。また、比較例として、ガレクチン９改変体に代えて、野生型ガレクチン９標品（Ｇ９Ｓ、配列番号１３１のアミノ酸配列）または前記（２）で作製した安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）を使用した。
　図５に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの写真を示す。図５において、Ａは、エラスターゼを使用した結果であり、Ｂは、ＭＭＰ－３を使用した結果である。図５において、レーンＭは、分子量マーカーである。図５のＡおよびＢに示すように、野生型Ｇ９Ｓは、インキュベート開始から０．５時間で、すでに分解が確認され、２時間で大部分が分解された。これに対して、ガレクチン９改変体であるｍＣ１０－ＨＰＰＹは、国際公開第ＷＯ２００５／０９３０６４号においてプロテアーゼ安定性が確認されている安定化ガレクチン９と同様に、２時間のインキュベートによっても分解は確認されなかった。この結果から、ｍＣ１０－ＨＰＰＹは、プロテアーゼ安定性にも優れることが確認された。なお、他のガレクチン９改変体についても同様である。
　以上のように、本発明のガレクチン９改変体は、安定化ガレクチン９よりも溶解性に優れ、野生型ガレクチン９の生理活性を維持し、且つ、野生型ガレクチンよりもプロテアーゼ安定性に優れることが確認された。具体的には、前記（２）に示すように、いずれのガレクチン９改変体も、安定化ガレクチン９と比較して、溶解性（すなわち収率）が有意に増加し、中でも、ｍＣ１０、ｍＣ１１、ｍＣ１２、ｍＣ１０－ＨＰＰＹ、ｍＣ１０－ＨＰＡＰおよびｍＣ１１－ＡＰは、安定化ガレクチン９と比較して、５倍以上の増加を示した。特に、ｍＣ１０－ＨＰＰＹは、ＰＢＳ中で、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬの濃度まで安定に存在でき、これは、安定化ガレクチン９の約７倍の濃度であることが確認できた。また、前記（３）に示すように、いずれのガレクチン９改変体も、野生型ガレクチン９の生理活性の一つである、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する細胞死誘導活性を示し、中でも、ｍＣ１０、ｍＣ１１、ｍＣ１２、ｍＣ１０－ＨＰＰＹ、ｍＣ１０－ＨＰＡＰおよびｍＣ１１－ＡＰは、安定化ガレクチン９と比較して、２～２．５倍の活性を示した。さらに、前記（４）に示すように、ガレクチン９改変体は、野生型ガレクチン９よりも有意なプロテアーゼ安定性を示した。これらの結果から、前記ガレクチン９改変体は、生産性が高い医薬原料として優れた性質を備えており、中でも、ｍＣ１０－ＨＰＰＹは、極めて優れた性質を備えているといえる。
［実施例２］
　前記ガレクチン９改変体について、長期保存による溶解性への影響およびＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対する、ガレクチン９改変体の脱顆粒抑制活性を確認した。
（１）長期保存時の溶解性への影響
　前記ガレクチン９改変体を、４℃で約１年間（３４４日間）保存した後、この長期保存による溶解性への影響を確認した。
　前記実施例１（２）で調製したろ過滅菌済の調製直後の被検サンプル（前記ガレクチン９改変体）を、４℃で約１年間（３４４日間）保存した。前記被検サンプルのタンパク質濃度は、それぞれ、ｍＣ１０－ＨＰＰＹが１．８８ｍｇ／ｍＬ、ｍＣ１０－ＨＰＡＰが１．１６ｍｇ／ｍＬ、ｍＣ１１－ＡＰが１．１４ｍｇ／ｍＬに調整した。つぎに、保存後の前記被検サンプルを２５，０００ｘｇで２０分間遠心分離して、不溶物を除去し、上清を回収した。１年保存後の前記被検サンプルについて、２８０ｎｍの吸光度を測定してタンパク質濃度を算出した。そして、保存前の被検サンプルにおけるガレクチン９改変体のタンパク質濃度を１００％として、保存後の被検サンプルにおけるガレクチン９改変体のタンパク質濃度について、相対値（％）を求めた。これらの結果を下記表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表８に示すように、ｍＣ１０－ＨＰＰＹおよびｍＣ１０－ＨＰＡＰは、約１年間の保存後も、タンパク質濃度がほとんど変化せず、長期保存後においても、優れた溶解性を維持できることがわかった。
（２）ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対する、ガレクチン９改変体の脱顆粒抑制活性の測定
　ＲＰＭＩ１６４０－１０％ＦＢＳ培地中で培養したＲＢＬ－２Ｈ３細胞をトリプシン処理により回収し、２ｘ１０４細胞／１００μＬの濃度となるように新たな培地に懸濁した。得られた懸濁液を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００μＬ播種した後、炭酸ガス培養器中で２４時間培養した。
　活性測定用緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含むハンクス平衡塩類溶液）で各ウェルを一度洗浄し、１ウェルあたり９０μＬの前記活性測定用緩衝液を加え、さらに前記ガレクチン９改変体を含むサンプル１０μＬを加えた。前記サンプルは、各ウェルにおける前記ガレクチン９改変体の濃度が、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１μｍｏｌ/Ｌとなるように、前記実施例１（１）の各ガレクチン９改変体をＰＢＳで希釈して調製した。つぎに、１０分間静置した後、各ウェルにおける濃度が、それぞれ０．３μｇ／ｍＬおよび０．０４８μｇ／ｍＬとなるように、抗２，４，６－トリニトロフェニル（ＴＮＰ）マウスモノクローナル抗体（ＩｇＥ）とＴＮＰ－標識ウシ血清アルブミンとを加え、１時間培養した。そして、前記各ウェルから培地を回収した後、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で培養した細胞を可溶化し、回収した培地中および細胞可溶化液中のβ－ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ（β－ＨＥＸ）活性を測定した。前記培地中および前記細胞可溶化液中のβ－ＨＥＸ活性の合計を総β－ＨＥＸ活性とし、前記総β－ＨＥＸ活性に対する培地中のβ－ＨＥＸ活性の割合（％）を求めた。この割合を、脱顆粒の指標とした。このアッセイは、３ウェルを一組として行った。
　また、コントロールとして、前記サンプルに代えて１０μＬのＰＢＳを、比較例として、前記ガレクチン９改変体に代えて、前記実施例１の前記安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）を添加し、同様の測定を行った。
　この結果から、前記ガレクチン９改変体および前記安定化ガレクチン９が、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞の脱顆粒を５０％減少させる濃度（ＬＤ５０）を求め、前記安定化ガレクチン９のＬＤ５０を１００％として、各ガレクチン９改変体の相対値（％）を求め、これを脱顆粒抑制活性（％）とした。これらの結果を下記表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表９に示すように、各ガレクチン９改変体は、前記安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）と同様にＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対する脱顆粒抑制活性を示した。中でも、ｍＣ８、ｍＣ９、ｍＣ１０、ｍＣ１１、ｍＣ１２、ｍＣ１３、ｍＣ１０－ＨＰＰＹ、ｍＣ１０－ＨＰＡＰおよびｍＣ１１－ＡＰは、前記安定化ガレクチン９（Ｇ９Ｎｕｌｌ）と比較して、有意に高い脱顆粒抑制活性を示した。これらの結果から、前記ガレクチン９改変体は、十分に前記安定化ガレクチン９の生理活性を維持していることがわかった。
　以上のように、本発明のガレクチン９改変体は、長期保存後も、優れた溶解性を維持することが確認された。また、本発明のガレクチン９改変体は、野生型ガレクチン９の生理活性を維持していることが確認された。具体的には、前記（１）に示すように、いずれのガレクチン９改変体も、約１年間の保存後も、タンパク質濃度がほとんど変化せず、長期保存後においても、優れた溶解性を維持した。また、前記（２）に示すように、いずれのガレクチン９改変体も、前記野生型ガレクチン９の生理活性の一つである、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞に対する脱顆粒抑制活性を維持し、中でも、ｍＣ８、ｍＣ９、ｍＣ１０、ｍＣ１１、ｍＣ１２、ｍＣ１３、ｍＣ１０－ＨＰＰＹ、ｍＣ１０－ＨＰＡＰおよびｍＣ１１－ＡＰは、前記安定化ガレクチン９と比較して１．５～２．５倍の活性を示した。これらの結果から、前記ガレクチン９改変体は、安定性が高い医薬原料として優れた性質を備えているといえる。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
　この出願は、２０１２年１１月２０日に出願された日本出願特願２０１２－２５４３４９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　以上のように、本発明のガレクチン９改変体は、野生型ガレクチン９と同質の生理活性を保持し、且つ、プロテアーゼ安定性および溶解性に優れ、さらに、組換えタンパク質として製造した際の収率にも優れる。このように、本発明のガレクチン９改変体は、野生型ガレクチンの生理活性を保持するだけでなく、その安定性、取扱性および製造時の収率にも優れることから、医薬原料として極めて有用といえる。

Claims (19)

  1. ＮＣＲＤとＣＣＲＤとを有し、前記ＮＣＲＤのＣ末端と前記ＣＣＲＤのＮ末端とが、直接的または間接的に結合したタンパク質またはその塩であって、
    前記ＮＣＲＤは、
    　（Ｎ１）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（Ｎ２）配列番号１で表わされるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ糖結合能を有するペプチド、または、
    　（Ｎ３）配列番号１で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つ糖結合能を有するペプチド
    であり、
    前記ＣＣＲＤは、
    　Ｎ末端領域およびＣ末端領域からなり、且つ糖結合能を有するペプチドであり、
    前記Ｎ末端領域は、
    　（Ｃ－Ｎ１）配列番号３で表わされるアミノ酸配列において、１～１７個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるペプチドであり、
    前記Ｃ末端領域は、
    　（Ｃ－Ｃ１）配列番号５で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド、
    　（Ｃ－Ｃ２）配列番号５で表わされるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるペプチド、または、
    　（Ｃ－Ｃ３）配列番号５で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなるペプチドである
    ことを特徴とするタンパク質またはその塩。
  2. 前記ＣＣＲＤの前記Ｎ末端領域のアミノ酸の欠失が、連続したアミノ酸の欠失または不連続のアミノ酸の欠失である、請求項１記載のタンパク質またはその塩。
  3. 前記ＣＣＲＤの前記Ｎ末端領域のアミノ酸の欠失が、連続したアミノ酸の欠失である、請求項１記載のタンパク質またはその塩。
  4. 前記ＣＣＲＤの前記Ｎ末端領域のアミノ酸の欠失が、Ｎ末端のアミノ酸から連続する欠失である、請求項３記載のタンパク質またはその塩。
  5. 前記ＣＣＲＤの前記Ｎ末端領域において欠失するアミノ酸残基数が、６～１４個である、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩。
  6. 前記ＣＣＲＤの前記Ｎ末端領域において欠失するアミノ酸残基数が、８～１４個である、請求項５記載のタンパク質またはその塩。
  7. 前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドにおいて、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１５番目および１７番目からなる群から選択された少なくとも一つのアミノ酸残基が、プロリンである、請求項１から６のいずれか一記記載のタンパク質またはその塩。
  8. 前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドにおいて、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の１０番目および１１番目のアミノ酸残基が、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｐｒｏ－ＨｉｓまたはＨｉｓ－Ｐｒｏである、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩。
  9. 前記（Ｃ－Ｎ１）のペプチドにおいて、配列番号３で表わされるアミノ酸配列の１２番目および１３番目のアミノ酸残基が、Ｐｒｏ－Ｐｒｏ、Ｐｒｏ－ＡｌａまたはＡｌａ－Ｐｒｏである、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩。
  10. 前記ＮＣＲＤとＣＣＲＤとが、リンカーを介して間接的に結合しており、
    前記リンカーが、アミノ酸またはペプチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩。
  11. 前記リンカーがペプチドであり、そのアミノ酸残基数が、２～８個である、請求項１０記載のタンパク質またはその塩。
  12. 前記リンカーが、Ｈｉｓ－Ｍｅｔ、Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｐｒｏ、Ａｓｎ-Ｌｅｕ、Ａｓｐ-Ｐｈｅ-ＶａｌおよびＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ａｌａからなる群から選択された少なくとも一つの配列を含むペプチド、または、前記配列からなるペプチドである、請求項１１記載のタンパク質またはその塩。
  13. 前記ＣＣＲＤのＮ末端領域が、配列番号７～２０のいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩。
  14. 前記ＣＣＲＤが、配列番号２１～３４のいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩。
  15. 前記タンパク質が、配列番号３５～４８のいずれか一つのアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のタンパク質またはその塩。
  16. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする、核酸。
  17. 請求項１６記載の核酸を有することを特徴とする、発現ベクター。
  18. 請求項１６記載の核酸または請求項１７記載の発現ベクターを有することを特徴とする、形質転換体。
  19. 請求項１から１５のいずれか一項に記載のタンパク質およびその塩、請求項１６記載の核酸、ならびに請求項１７記載の発現ベクターの少なくともいずれか一つを含むことを特徴とする、医薬。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102267413B1 (ko) 2019-11-11 2021-06-21 (주)지바이오로직스 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 류마티스 관절염 및 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
JP2023550415A (ja) * 2020-11-18 2023-12-01 ジバイオロジックス インコーポレイテッド 組換え安定化ガレクチン９タンパク質を含む、癌の予防または治療用薬学的組成物
KR20240032668A (ko) * 2022-08-31 2024-03-12 (주)지바이오로직스 재조합 안정화 갈렉틴 9 단백질을 포함하는 루푸스 예방 또는 치료용 조성물

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005093064A1 (ja) * 2004-03-29 2005-10-06 Galpharma Co., Ltd. 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005093064A1 (ja) * 2004-03-29 2005-10-06 Galpharma Co., Ltd. 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AIKO ITOH ET AL.: "Optimization of the inter- domain structure of galectin-9 for recombinant production", GLYCOBIOLOGY, vol. 23, no. 8, August 2013 (2013-08-01), pages 920 - 925 *
HIROMI YOSHIDA ET AL.: "X-ray structures of human galectin-9 C-terminal domain in complexes with a biantennary oligosaccharide and sialyllactose", J. BIOL. CHEM., vol. 285, no. 47, 19 November 2010 (2010-11-19), pages 36969 - 36976 *
MIKI SATO ET AL.: "Functional analysis of the carbohydrate recognition domains and a linker peptide of galectin-9 as to eosinophil chemoattractant activity", GLYCOBIOLOGY, vol. 12, no. 3, 2002, pages 191 - 197 *
NOZOMU NISHI ET AL.: "Development of highly stable galectins: Truncation of the linker peptide confers protease-resistance on tandem- repeat type galectins", FEBS LETTERS, vol. 579, April 2005 (2005-04-01), pages 2058 - 2064 *
OEZLEM TUERECI ET AL.: "Molecular definition of a novel human galectin which is immunogenic in patients with Hodgkin's disease", J. BIOL. CHEM., vol. 272, no. 10, 7 March 1997 (1997-03-07), pages 6416 - 6422 *
TAEKO OKUDAIRA ET AL.: "A modified version of galectin-9 suppresses cell growth and induces apoptosis of human T-cell leukemia virus type I-infected T-cell lines", INT. J. CANCER, vol. 120, 2007, pages 2251 - 2261 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022548279A (ja) * 2019-11-11 2022-11-17 ジバイオロジックス インコーポレイテッド 組換え安定化ガレクチン９タンパク質を含む関節リウマチ及び骨疾患予防または治療用薬学的組成物
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