KR20040041991A - 세포내 ｄｎａ／ｒｎａ 전달 방법, 및 이것의 기초 및임상학적 응용 - Google Patents
세포내 ｄｎａ／ｒｎａ 전달 방법, 및 이것의 기초 및임상학적 응용 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20040041991A KR20040041991A KR1020020070106A KR20020070106A KR20040041991A KR 20040041991 A KR20040041991 A KR 20040041991A KR 1020020070106 A KR1020020070106 A KR 1020020070106A KR 20020070106 A KR20020070106 A KR 20020070106A KR 20040041991 A KR20040041991 A KR 20040041991A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- dna
- binding
- rna
- gal4
- protein
- Prior art date
Links
- 238000010361 transduction Methods 0.000 title abstract description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 title abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 64
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 62
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 46
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 34
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims abstract description 20
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 18
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims abstract 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 25
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 9
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 9
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 9
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 8
- 101150019028 Antp gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101710192266 Tegument protein VP22 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 3
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 claims description 3
- 101100189913 Caenorhabditis elegans pept-1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010088535 Pep-1 peptide Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 claims 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 83
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 18
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 18
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 17
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 16
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 16
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 15
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 7
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 7
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 230000001164 bioregulatory effect Effects 0.000 description 3
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 2
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 2
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N [P].[Ca] Chemical compound [P].[Ca] ZQBZAOZWBKABNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[2-[(2-amino-3-carboxypropanoyl)amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]butanedioic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(=O)NC(CC(O)=O)C(O)=O OZRFYUJEXYKQDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 108700000788 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (47-57) Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910020700 Na3VO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- -1 arginine amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000002305 biomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
- A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 발명은 PTD (Protein Transduction Domain)와 DNA/RNA 결합인자 (binding factor)를 이용하여 생체기능을 조절하는 물질을 코딩하는 DNA/RNA를 생체내 (in vivo) 및 생체외 (in vitro)에서 진핵 또는 원핵세포 내부의 세포질 또는 핵내로 효과적으로 전달하는 방법에 관한 것으로서, 특히 생체내의 경우 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 및 흡입등을 포함한 다양한 경로를 통하여 세포내로 전달할 수 있다. 따라서 본 발명은 DNA/RNA 백신 (vaccine) 및 유전자 치료등의 의약적 응용 및 기초연구분야에서 각종세포, 세포에 DNA/RNA를 전달하여 일시적 (transient) 또는 지속적 (permanent)으로 발현시키는 기술에 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 생물학적 활성을 갖는 생체기능조절물질을 생체 내 (in vivo) 및 생체 외 (in vitro)에서 진핵 또는 원핵세포 내부의 세포질 또는 핵 내로 효과적으로 전달할 수 있는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 살아있는 세포는 단백질과 핵산과 같은 거대 분자에 대해서 불투과성이다. 일부 작은 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내부의 세포질 또는 핵으로 들어갈 수 있는 반면에, 거대분자는 세포 내부로 들어갈 수 없다는 사실은, 단백질 또는 핵산을 포함하는 거대분자를 이용한 치료, 예방 및 진단에 대한 제한 요인이 되고 있다. 한편, 대부분의 치료, 예방 및 진단의 목적으로 제조되는 물질들은, 이것의 진단, 예방 및 치료적 유효량이 세포내로 전달되어야 하므로 이들을 세포 외부나 표적 세포의 표면에서 작용시켜 세포내로 전달시키기 위한 여러 가지 방법들이 개발되었다. 이와 같이, 생체 외 (in vitro)에서 세포내로 거대 분자를 전달하는 방법에는, 전기충격 (electroporation), 리포좀을 이용한 막 융합, 표면에 DNA가 코팅된 미세 투사체를 이용한 고농도 투사법, 칼슘-인-DNA 침전체를 이용한 배양법, DEAE-덱스트란을 이용한 트렌스펙션 (transfection), 변형된 바이러스 핵산을 이용한 감염, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 전형적으로 거대 분자를 주입시키고자 하는 전체 세포 수 중의 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 영향을 주는 경향을 나타낸다. 또한, 생체 내에서 세포 내로 거대 분자를 실험적으로 이동시키는 방법으로서, 스크래프 로딩 (scrape loading), 칼슘-인 침전, 라이포좀을 이용하는 방법 등이 성공된 바 있으나, 이러한 기술들은 생체 내에서 세포내로 물질을 전달함에 있어 그 사용이 극히 제한적이라는 문제점이 있다.
따라서 생체 내부 및 외부 모두에서 세포를 손상시키지 않고 생물학적 활성을 지닌 거대 분자를 생물학적으로 효과적으로 전달하는 일반적인 방법이 필요하게 되었다 [참고문헌: L.A. Sternson,Ann. N.Y. Acad. Sci.,57, 19-21 (1987)]. 이와 같은 방법의 예로서, 지질 펩타이드의 화학적인 추가 [참고문헌: P. Hoffmann et al.Immunobiol., 177, 158-170(1988)] 또는 폴리라이신이나 폴리알지닌 같은 염기성 중합체를 사용하는 방법 [참고문헌: W-C. Chen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,USA, 75, 1872-1876(1978)]이 있으나, 이들 방법은 아직 검증되지 않았다. 수송체로서 사용되는 엽산 [참고문헌: C.P. Leamon and Low,Proc. Natl. Acd.Sci., USA, 88, 5572-5576(1991)]은 엽산-염 결합체로서 세포내로 이동된다는 사실이 보고되었으나, 세포질 안으로까지 전달되는 지는 아직 확인된 바가 없다. 또한, 슈도모나스 외독소 (Pseudomonas Exotoxin)도 수송체의 한 종류로서 사용되고 있다 [참고문헌: T. I. Prior et al.,Cell, 64, 1017-1023(1991)]. 그러나, 이들 방법에서도 생물학적으로 활성화된 '전달될' 물질의 세포내로의 이동에 관한 효과 및 이것의 일반적인 적용 가능성에 대해서는 명확하지 않다. 따라서 살아있는 세포의 세포질이나 핵 안으로 생물학적으로 활성인 물질을 보다 더 안전하고 효과적으로 전달할 수 있는 방법이 계속적으로 요구되고 있는 실정이다.
이러한 요구에 대한 연구의 결과로서 제시된 것으로 PTD (Protein Transduction Domain)가 있으며, 이중 가장 많은 연구가 진행된 것은 인간 면역 결핍 바이러스-1 (Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)의 전사인자인 Tat 단백질이다. 이 단백질은 세포막을 통과함에 있어 86개의 아미노산으로 구성된 완전한 형태일 때 보다 양전하를 갖는 아미노산들이 집중적으로 분포되어 있는 47번째부터 57번째 아미노산 (YGRKKRRQRRR)의 일부분으로 구성된 형태일 경우가 더욱 효과적임이 밝혀졌다 [참고문헌: Fawell S.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 664-668(1994)]. 이와 같이, PTD로서의 효과가 확인된 다른 예로는 HSV-1 (Herpes Simplex Virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산 [참고문헌: Elliott G.et al. Cell,88,223-233(1997)], HSV-2의 UL-56단백질의 84번째부터 92번째까지의 아미노산(GeneBank code : D1047[gi:221784]) 및 드로소필라 (Drosophila)의 ANTP (Antennapedia) 단백질의 339번째부터 355번째까지의 아미노산 [참고문헌: Schwarze S.R.et al. Trends Pharmacol Sci.21, 45-48(2000)] 등이 있으며, 전기적으로 양성인 아미노산들을 나열한 인위적인 펩타이드의 경우도 그 효과가 확인되었다 [참고문헌: Laus R.et al. Nature Biotechnol.18, 1269-1272(2000)].
본 발명자들은 PTD에 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 융합시켜 수득한 융합단백질을 이용함에 의해, 세포내로의 DNA/RNA를 포함하는 생체기능조절물질의 전달을 획기적으로 개선시킬 수 있을 뿐만아니라, 특히 특정 세포, 조직, 또는 장기에 특이적으로 또는 특정 자극에 의해 유도되는 방법으로 생체기능조절물질을 전달할 수 있다는 발견에 기초하여 본 발명은 완성하였다.
본 발명의 목적은 생체 내 (in vivo) 및 생체 외 (in vitro)에서 선택적인 DNA/RNA 결합서열 (DNA Binding Sequence, DBS)를 가진 생체기능조절단백질을 코딩하는 DNA/RNA, 및 상기 DNA/RNA의 DBS와 선택적으로 결합할 수 있는 DNA/RNA 결합인자 (binding factor) 또는 이것의 일부인 DNA/RNA 결합도메인 (DNA Binding Domain, DBD)을 지닌 동종 또는 하나 이상의 결합단백질과 PTD의 융합단백질을 상온에서 결합시킨 후, PTD에 의하여 생체외에서는 세포주, 생체내에서는 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입등의 투여경로를 통하여 각 장기에 생체기능조절 단백질을 코딩하는 DNA/RNA를 전달하여 단백질을 발현시키는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 생체기능조절단백질을 코딩하는 DNA/RNA와 함께 이것이 발현되는 세포, 장기, 조직에 선택적인 프로모터를 (promoter)를 포함하는경우, 체내 특정 부위에 선택적으로 생체기능조절단백질을 발현시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법을 이용하여 생체내 및 생체외에서 단백질, DNA/RNA, 지방, 탄수화물, 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체기능조절물질을 진핵 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵내로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법을 이용하여 DNA/RNA 백신 및 유전자 치료 방법을 제공하고, 다양한 종류의 원핵 또는 진핵세포에 원하는 DNA/RNA를 전달하여 이들을 안정적으로 또는 일시적으로 발현시키는 방법에 관한 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 본 발명의 재조합 발현벡터의 구조를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 도 1의 각 발현벡터를 제한효소로 처리한 후 아가로스겔을 나타낸다.
도 3은 발현벡터로부터 발현되고, 분리 정제된 융합단백질에 대한 코우마쉬 블루 염색결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4, 또는 R7-Gal4에 의해 주르캐트 (Jurkat) T세포 내로 전달되어 발현된, CD8-z, Lck, 인슐린 (INS) 단백질을 CD8, Lck 또는 INS에 대한 mAb를 이용한 웨스턴블롯 (westernblot)으로 검출한 것을 나타낸다.
도 5는 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4, 또는 R7-Gal4에 의해 Hela 세포 내로 전달되어 발현하는 CD8-z, Lck, INS 단백질을 CD8, LcK 또는 INS에 대한 mAb를 이용한 웨스턴블롯 (westernblot)으로 검출한 것을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6d는 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4, 또는 R7-Gal4에 의하여 pCD8-z-GBS, pLck-GBS 또는 pINS-GBS를 I.P. 방법으로 마우스에 주입한 후, 심장 (도 6a), 간 (도 6b), 신장 (도 6c), 비장 (도 6d) 등의 장기에서 발현된 CD8-z, Lck, 인슐린을 이들에 대한 mAb로 검출한 것이다.
도 7a 내지 도 7c는 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4, 또는 R7-Gal4에 의하여 pL-CD8-z-GBS, pL-Lck-GBS 또는 pL-INS-GBS를 I.P. 방법으로 마우스에 주입한 후, 각각의 단백질이 T세포에 특이적으로 발현된 것을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c는 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4, 또는 R7-Gal4에 의하여 pL-CD8-z-GBS, pL-Lck-GBS 또는 pL-INS-GBS를 I.P. 방법으로 마우스에 주입한 후, 각각의 단백질이 T세포에 특이적으로 발현된 것을 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 특이적인 DNA/RNA 결합서열과 결합할 수 있는 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인 (DBD)을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질과 PTD (Protein Transduction Domain)의 융합단백질, 및 각각 이들 결합단백질과 PTD를 코딩하는 DNA를 포함하고 발현조절서열이 작동적으로 결합된 물질전달 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인과 특이적으로 결합하는 DNA/RNA 결합서열을 3' 또는 5' 말단에 가진 생체기능조절단백질을 코딩하는 DNA/RNA, 및 상기 단백질이 발현되는 세포, 장기, 조직에 선택적인 프로모터 (promoter)가 발현조절서열로서 작동적으로 결합된 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인과 특이적으로 결합하는 DNA/RNA 결합서열에 화학적 또는 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 것으로서, 단백질, DNA/RNA, 지방, 탄수화물, 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체기능조절물질을 포함하는 DNA 구조를 제공한다.
본 발명은 또한 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질과 PTD의 융합단백질; 및 단백질, DNA/RNA, 지방, 탄수화물, 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체기능조절물질이 화학적 또는 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된, 세포질 또는 핵내로 생체기능조절물질을 전달하기 위한 결합복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질과 PTD의 융합단백질; 및 상기 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인과 특이적으로 결합하는 DNA/RNA 결합서열, 생체기능조절물질을 코딩하는 DNA, 및 발현조절서열이 작동적으로 결합된 재조합 발현벡터가 결합된, 세포질 또는 핵내로 DNA를 전달하기 위한 결합복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인 (DBD)을 가진 단백질과 PTD의 융합단백질을 이용하여, 상기 결합인자 또는 DBD과 선택적으로 결합할 수 있는 DBS를 함유한 생체기능조절단백질을 코딩하는 DNA/RNA를 생체내 또는 생체외에서 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막, 및 흡입 등을 포함하는 다양한 경로를 통하여 진핵 또는 원핵세포와 접촉시켜 진핵 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 안으로 전달하여 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 i) DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질 및 PTD를 각각 코딩하는 DNA, 및 발현조절서열이 작동적으로 결합된 물질전달 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 단계 i)의 물질전달 재조합 발현벡터를 숙주세포에서 발현시켜 융합단백질을 수득하는 단계; ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 융합단백질과 단백질, DNA/RNA, 지방, 탄수화물, 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체기능조절물질을 화학적 또는 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의해 연결시켜 결합복합체를 수득하는 단계; 및 ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 결합복합체를 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 투여 경로를 통해 생체내로 또는 생체외에서 세포의 배양물과 혼합 배양시키는 단계를 포함하여, 생체기능조절물질을 진핵세포 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵안으로 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 제공되는 다른 방법은, i) DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질 및 PTD (Protein Transduction Domain)를 코딩하는 DNA, 및 발현조절서열이 작동적으로 결합된 물질전달 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; ⅱ) 상기 단계 i)의 물질전달 재조합 발현벡터를 숙주세포에서 발현시켜 융합단백질을 수득하는 단계; ⅲ) 생체기능조절물질을 코딩하는 DNA 및 상기 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인과 특이적으로 결합하는 DNA/RNA 결합서열 둘 모두를 포함하고, 발현벡터가 작동적으로 결합된 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; ⅳ) 상기 단계 ⅱ)에서 수득한 융합단백질과 단계ⅲ)의 재조합 발현벡터를 결합시켜 결합복합체를 수득하는 단계; 및 ⅴ) 상기 단계 ⅳ)의 결합복합체를 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 투여 경로를 통해 생체내로 또는 생체외에서 세포의 배양물과 혼합 배양시키는 단계를 포함하여, 생체기능조절물질을 진핵세포 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 안으로 전달하는 것이다.
본 발명은 또한 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인 (DBD)을 가진 결합단백질과 PTD의 융합단백질을 이용하여, 상기 결합인자 또는 DBD과 선택적으로 결합하는 DBS에 화학적 또는 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의해 연결된 생체기능조절물질을 생체내 또는 생체외에서 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막, 및 흡입 등을 포함하는 다양한 경로를 통하여 진핵 또는 원핵세포와 접촉시켜 진핵 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 안으로 전달하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서, "PTD"는 이들과 화학적, 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의하여 직접 또는 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결된 특정 단백질을 진핵 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵내로 전달가능한 물질전달 펩타이드로서 예를 들어, Sim-2 [참고문헌: Chrast R.et al. Genome Res.7, 615-624 (1997)], Mph1 [참고문헌: M.J Alkema et al.,Genes Dev. 11(2), 226-240(1997)], Tat [참고문헌: Fawell S.et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 664-668(1994)], R7 (Cell Gate, U.S.A.), SM5 (Dr. Quin, Vanderbilt University), VP22 [참고문헌: Elliott G.et al. Cell,88,223-233(1997)], ANTP [참고문헌: LeRouxI, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 9120-9124 (1993)], Pep-1 및 Pep-2 [참고문헌: May C.Morris et al, Nature Biotechnology, 19, 1173-1175(2001)] 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, "DNA/RNA 결합인자" 또는 "DNA/RNA 결합도메인 (DBD)"은 특이적인 DNA/RNA 서열과 결합할 수 있는 단백질의 전체 또는 일부로서 예를 들어, 전사인자 (transcriptional factor) 또는 바이러스 단백질 (viral protein) 등을 포함한다.
본 명세서에서, "결합단백질"이란 DNA/RNA 결합인자 (binding factor) 또는 이것의 일부인 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 하나 이상의 단백질을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, "선택적인 프로모터"는 단백질을 코딩하는 유전자를 특정 조직, 세포, 장기에 발현시킬 수 있는 프로모터로서 예를 들어, T세포에 선택적으로 발현하는 Lck, CD2 프로모터, 췌장 (pancreas)에 특이적으로 발현하는 인슐린 프로모터 (insulin promoter) 등을 포함하며, 또한 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
본 발명은 또한 PTD를 코딩하는 DNA, 및 DBD을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 물질전달 재조합 발현벡터를 제공한다.
상기 물질전달 재조합 발현벡터는, 융합단백질의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 헤마글루티닌 코돈, Myc 코돈, 말토우즈 결합 단백질 코돈 등을 포함할 수 있다. 또한 융합단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 엔테로키나제, 인자 X (Factor X), 트롬빈 (Thrombin) 등특정 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현조절서열 및 세포내 전달을 확인하기 위한 마아커 (marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님은 물론이다.
하기 실시예에 제시되는 바와 같이, 본 발명의 물질전달 재조합 발현벡터 pPTD-Gal4 예컨데, pSim2-Gal4, pMph1-Gal4, pTat-Gal4 또는 pR7-Gal4는, 세포내 물질전달 펩타이드 (PTD) 예를 들어, Sim-2, Mph-1, Tat 또는 R7를 코딩하는 DNA, 숙주세포에서 발현된 단백질의 정제를 위한 6개의 연속된 히스티딘 코돈, 엔테로키나제에 의해 특이적으로 절단되는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 서열, 및 Gal4 결합서열과 특이적으로 결합할 수 있는 Gal4 DNA 결합인자를 코딩하는 DNA를 포함한다.
본 발명의 pPTD-Gal4 벡터는 pTrcHisB 벡터 (Invitrogen)를 주형으로 하여 통상의 PCR (polymerase chain reaction) 방법에 의해 간단히 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면 물질전달 재조합 발현벡터내의 Gal4 유전자 (Invitrogen)를 적합한 제한효소를 이용하여 제거하고, 특정 DNA 서열과 결합할 수 있는 DNA 결합인자의 전체 또는 일부를 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 다양한 유형의 물질전달 재조합 발현벡터를 제조할 수 있다. 본 실시예에서 DNA 결합인자 (DNA Binding Factor)로서 사용된 Gal4는, 원핵 또는 진핵세포, 바이러스 등에 존재하는 전사인자 (transcription factor)의 전부 또는 일부인 DNA 결합도메인으로서, 상기 Gal4는 특정 세포, 조직 또는 장기 등에 대한 특이적 전달을 위해 이들 세포, 조직 또는 장기 등에 특이적으로 존재하는 수용체 또는 리간드, 또는 이들과 선택적으로 결합하는 단클론항체가 화학적, 물리적 방법에 의해 연결되어 결합단백질을 형성할수 있으며, 이들 Gal4와 연결되는 물질은 단백질외에도 지방, 탄수화물 또는 이들의 복합체 일 수 있다. 본 발명에 적용 가능한 Gal4와의 융합단백질은 세포내 물질전달 펩타이드와 화학적 또는 물리적 결합에 의해 연결되는 DNA, RNA 탄수화물, 지방 또는 화합물 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 물질전달 재조합 발현벡터를 이용하여, 물질전달 펩티드와 융합된 단백질을 목적 단백질로서 수득하고자 하는 경우, 상기 물질전달 재조합 발현벡터를 사용하여 대장균 등 적절한 숙주세포를 형질전환시키고, 수득된 형질전환체를 적절한 조건 하에서 배양하여 융합단백질을 생산한 다음, 공지된 통상의 단백질 정제 방법 예를 들어, 폴리히스티딘과 Ni2+-NTA 간의 결합을 사용한 방법 등을 사용함에 의해 목적 단백질을 분리한 후, 필요에 따라 정제하여 이용할 수 있다.
또한 본 발명은, 물질전달 펩타이드 또는 이것의 유사체 또는 물질전달펩타이드와 결합단백질과의 융합단백질을 결합유도체로 활성화시키고 이것을 목적하는 생체기능조절물질과 결합반응시켜 결합복합체를 수득하는 단계, 및 상기 수득한 결합복합체를 목적 생체기능조절물질을 전달하고자 하는 세포의 배양물과 혼합배양함에 의해 세포내로 목적 생체기능조절물질을 전달하는 단계를 포함하는 물질전달 방법을 제공하며, 뉴클리어 로컬라이제이션 서열 (Nuclear localization sequence) (NLS)이 융합단백질의 물질전달 펩타이드 (PTD)와 추가로 결합될 수 있다. 상기 결합유도체에는, PTD (물질전달 펩타이드) 또는 PTD와 목적 단백질의 융합단백질을, 목적 생체기능조절물질 예컨데, DNA, RNA, 탄수화물, 지방, 단백질 또는 화학화합물과 화학적 및/또는 물리적 방법에 의해 결합시키는 결합시약 예를 들어, BMOE (Pierce Cat. No 22323), DSP (Pierce Cat. No 22585)등이 포함된다.
또한, 상기에서 생체기능조절물질을 세포내로 전달함에 있어, 이들을 물질전달 펩타이드와 결합단백질의 융합단백질과 물리적 화학적으로 결합시켜 특정한 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 결합단백질은 전달하고자 하는 특정한 세포, 조직, 장기에 특이적으로 발현하는 수용체 또는 리간드 단백질 또는, 이들 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 mAb 및 이것의 변형된 형태 일 수 있다.
한편, 생체기능조절물질은 그 자체로서 특정 종 (species), 조직, 장기 또는 세포에서 특이적으로 유전자를 발현시키는 프로모터 및/또는 인헨서 (inhancer)일 수 있다.
본 발명의 세포내 물질전달 펩타이드는 매우 작은 크기의 펩타이드 이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 재조합발현벡터의 제조
물질전달 펩타이드와 DBD를 지닌 결합단백질의 융합단백질에 대한 물질전달 재조합 발현벡터의 제조 (
pSim2-Gal4, pMph1-Gal4, pTat-Gal4, pR7-Gal4, pCD8-z-GBS)
물질전달 펩타이드로서, Sim-2 유전자 (N말단으로부터 558 번째 아미노산인 알라닌으로부터 566번째 아미노산인 아르기닌까지), Mph-1 유전자 (N말단으로부터 858 번째 아미노산인 타이로신 으로부터 868번째 아미노산인 아르기닌까지), HIV의 Tat 유전자 (N말단으로부터 47 번째 아미노산인 타이로신으로부터 57번째 아미노산인 아르기닌까지) 또는 아미노산 아르기닌을 7개가진 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 사용하였고, DBD를 지닌 결합단백질로서 Gal4 (Invitrogen사로부터 입수 가능) 사용하였다. 상기 물질전달 펩타이드 및 Gal4-결합서열 (GBS)과 결합하는 Gal4를 코딩하는 염기서열을 결합시키기 위하여, Sim-2의 N말단으로부터 558번째인 알라닌으로부터 566번째 아미노산인 아르기닌, Mph-1의 N말단으로부터 858 번째 아미노산인 타이로신 으로부터 868번째 아미노산인 아르기닌까지, Tat의 N말단으로부터 47 번째 아미노산인 타이로신으로부터 57번째 아미노산인 아르기닌까지, 또는 7개의 아르기닌 아미노산 및 클로닝을 위한 제한효소 BamH I에 해당하는, 각각 서열번호 1, 2, 3, 4의 프라이머 및 이 4개의 DNA구조를 제작하기 위하여 Gal4의 3 말단에 해당하는 서열번호 5의 프라이머를 합성하고, Gal4 단백질의 전체 유전자가 포함되어 있는 벡터 (Clontech사로부터 입수가능)를 주형으로 하여 pfu turbo DNA 폴리머라제 (Strategen)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
본 실시예 1에서, 서열번호 1은 pSim2-gal4를 제작하기 위한 5' 프라이머의 염기서열을 나타내고, 서열번호 2는 pMph1-Gal4를 제작하기 위한 5' 프라이머의 염기서열을 나타내며, 서열번호 3은 pTat-Gal4를 제작하기 위한 5' 프라이머의 염기서열을 나타내고, 서열번호 4는 pR7-Gal4를 제작하기 위한 5' 프라이머의 염기서열을 나타내며, 서열번호 5는 pSim2-Gal4, pMph1-Gal4, pR7-Gal4과 pTat-Gal4를 제작하기 위한 3' 프라이머의 염기서열을 나타낸다.
DNA 결합서열 (DBS)을 포함하고 생체기능조절물질을 코딩하는 재조합벡터의 제조 (pLck-GBS, pINS-GBS, pL-CD8-z-GBS, pL-LCK-GBS, pL-INS-GBS)
Lck 또는 인슐린을 코딩하는 유전자를 가지고 있는 발현벡터 pCDNA-Lck 또는 pCDNA-INS의 제한효소 부위에서 DNA 결합서열로서 Gal4와 특이적으로 결합하는 Gal4 결합서열 (GBS)를 5'과 3' 말단에 Stu I 제한효소를 가지고 있는 서열번호 6와 7의 프라이머를 제작하여 pGAD를 주형으로 하여 역시 같은 방법으로 PCR을 수행하였다. PCR에서 수득한 반응생성물을 PCR 정제 키트 (Qiagen)을 사용하여 정제한 후 Bgl II및 BamH I 제한효소를 사용하여 48시간동안 처리하고 1% 아가로스겔에서 분리정제 한 다음 전기영동하고 에티움 브로마이드 (ethium bromide)로 염색하였다.
또한, Lck-GBS, INS-GBS 및 CD8-z-GBS의 각각의 DNA를 pLck-GBS, pINS-GBS, pCD8-z-GBS로부터 제한효소 처리하여 분리한 후, T세포에 선택적으로 발현하는 Lck 프로모터를 가진 발현벡터인 pLck-Luc에 클로닝하였다. 상기 방법에 따라 클로닝하여 제작된 재조합발현벡터를 pSim2-Gal4(a), pMph1-Gal4(b), pTat-Gal4(c), pR7-Gal4(d), pCD8-z-GBS(e), pLck-GBS(f), pINS-GBS(g), pL-CD8-z-GBS(h), pL-Lck-GBS(i) 및 pL-INS-GBS(j)라 명명하고 그 구조를 도 1a 내지 도 1c에 나타내었다.
서열번호 6은 Gal4 결합서열 (Binding Sequence) (GBS)를 제작하기 위한 5' 프라이머의 염기서열을 나타내고, 서열번호 7은 Gal4 결합서열 (GBS)를 제작하기위한 3' 프라이머의 염기서열을 나타낸다.
실시예 2: 대장균 형질전환제의 제조, 및 융합단백질의 발현 및 정제
상기 실시예 1에서 제조된 각각의 발현벡터 pSim2-Gal4(a), pMph1-Gal4(b), pTat-Gal4(c), pR7-Gal4(d)를 사용하여 대장균 DH5 (ATCC No. 53863)를 열충격 형질전환 방법 (Heat shock transformation)으로 형질전환 시킨 다음, 형질 전환된 대장균을 100㎖의 LB 배지에 2ml의 양으로 접종하고 12시간 동안 37℃에서 교반하면서 전 배양하였다. 다음, 이를 다시 각각 1000㎖의 LB 배지에 접종하고 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 1mM 농도의 IPTG (이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드, GibcoBRL cat.# 15529-019)를 첨가하여 lac 오페론의 발현을 유도하고 8시간 동안 배양하여 융합단백질의 발현을 유도하였다.
상기 배양액을 4℃에서 6,000rpm으로 20분간 원심분리하여 펠렛만 남기고 상등액을 제거한 후, 1㎎/㎖의 리소자임 (Sigma, cat.# L-7651)이 포함된 10㎖의 완충용액 1 (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH 8.0)로 펠렛을 풀어준 다음, 얼음에서 30분간 방치한 후, 초음파 분쇄기(Heat systems, ultrasonic processor XL)를 사용하여 300W의 세기로 10초간 초음파를 주입하고 10초간 냉각하는 과정을 반복하여 누적 초음파 주입시간이 3분이 되게 하였다. 용출액을 4℃에서 12,000rpm으로 20분간 원심분리하여 대장균의 파쇄물을 제거하고 순수한 용출액만을 분리하였다.
분리된 용출액에 2.5㎖의 50% Ni2+-NTA 아가로즈 슬러리 (Qiagen, cat#30230)를 넣고 4℃에서 200rpm으로 1시간 동안 교반하여 융합단백질과 Ni2+-NTA 아가로즈를 결합시키고, 이 혼합액을 크로마토그래피용 0.8 x 4 cm 칼럼 (BioRad, cat.# 731-1550)에 넣어 흘려주었다. 4㎖의 완충용액 2 (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸, pH 8.0)를 사용하여 두 차례 세척을 한 후, 0.5㎖의 완충용액 3 (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)으로 네 차례에 나누어 융합단백질을 분획하고, SDS-PAGE를 실시한 후 코우마쉬 블루 염색법으로 확인하여 도 3에 나타내었다. 도 3에서, 제 1열은 표준분자량 단백질이고, 각각 Sim2-Gal4(a), Mph1-Gal4(b), Tat-Gal4(c), R7-Gal4(d) 이다.
실시예 3: Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-Gal4에 의한 DNA의 주르캐트 (Jurkat) T세포내 전달 및 발현 (
in vivo
)
실시예 2에서 분리정제된 융합단백질 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4, R7-Gal4를 선형화된 DNA구조인 pCD8-z-GBS, pLck-GBS, pINS-GBS와 37℃에서 결합시킨 후, 5×105의 주르캐트 세포 (ATCC No. TIB-152)를 35mm 배양접시에 1ml씩 넣고 37℃에서 30분동안 반응시켰다. 반응을 종료하고 세포를 포집하여 용출완충용액 [0.2% 트리톤 X-100, 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 400 M EDTA, 1mM Na3VO4, 10mM NaF, 1mM PMSF, 10g 아프로티닌(aprotinin), 10g 로펩틴 (leupeptin)] 100ml로 4℃에서 30분간 반응시키고 14,000rpm으로 15분간 원심분리하여 세포용출액을 수득했다.
이들 세포용출액을 SDS-PAGE 겔에서 분리한 후 CD8에 대한 mAb (OKT8), Lck에 대한 mAb, INS에 대한 mAb을 이용하여 웨스턴 블롯으로 발현된 단백질을 검출하였다. 이에 대한 결과를 도 4에 나타냈으며(INS에 대한 결과는 도시하지 않음) 제 1열은 표준분자량 단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h)이다.
실시예 4: Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-Gal4에 의한 DNA의 Hela 세포내로의 전달 및 발현 (
in vitro
)
실시예 3과 같은 방법으로 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-Gal4에 결합된 pCD8-z-GBS, pLck-GBS, pINS-GBS를 Hela 세포내로 같은 방법으로 전달하여 세포내에서 발현된 CD8-z, Lck, 인슐린(INS)을 웨스턴 블롯 방법으로 검출하였다. 그 결과를 인슐린을 제외하고 도 5에 나타내었으며, 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h)이다.
실시예 5: Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-Gal4에 의한 생체내 DNA의 전달 및 발현
상기 실시예 4에서 제조된 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-Gal4 융합단백질과 pCD8-z-GBS, pLck-GBS, pINS-GBS DNA와의 결합 복합체를, C57B6 마우스에 I.P.방법으로 0.5mg/ml을 주입하고 4시간 경과 후 심장, 간, 신장, 비장 (spleen) 등의 장기를 적출하여 이를 장기에 전달되어 발현된 CD8-z, Lck, 인슐린을 이들에 대한 mAb를 이용한 웨스턴블롯 방법으로 검출하였다. 그 결과를 인슐린을 제외하고 도 6a 내지 도 6d에 나타내었다.
i) 심장 (도 6a): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h)이다.
ⅱ) 간 (도 6b): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h)이다.
ⅲ) 신장 (도 6c): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h)이다.
ⅳ) 비장 (spleen) (도 6d): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h) 이다.
실시예 6: Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-Gal4에 의하여 생체내 (
in vivo
)에서 목적 DNA의 세포 특이적 발현
실시예 1에서 제작된 pL-CD8-z-GBS, pL-Lck-GBS, pL-INS-GBS DNA구조를 선형화시킨 후, Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-INS-Gal4 융합단백질과의 결합복합체를 37℃에서 만든 후, C57B6 마우스의 복강에 0.5mg/ml의 농도를 주사하였다. 4시간 경과 후 간, T세포, B 세포등을 척출 또는 분리한 후 이들로부터 발현된 CD8-z, Lck, 인슐린 단백질의 발현을 이들에 대한 mAb를 이용한 웨스턴블롯을 이용하여 검출하였다. 이들에 대한 결과를 인슐린을 제외하고 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다.
ⅰ) T세포 (도 7a): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); 및 R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h) 이다.
ⅱ) B세포 (도 7b): 제 1열은 표준분자량단백질이고,각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h) 이다.
ⅲ) 간세포 (도 7c): 제 1열은 표준분자량단백질이고,각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h) 이다.
상기 제조된 Sim2-Gal4, Mph1-Gal4, Tat-Gal4 또는 R7-Gal4 융합단백질과 pL-CD8-z-GBS, pL-Lck-GBS, 및 pL-INS-GBS DNA구조의 복합체를 C57B6 마우스에 0.5mg/ml을 표피를 통하여 주입하였다. 6시간 경과 후, 간, T세포, B세포등을 척출 또는 분리한 후 이들로부터 발현된 CD8-z, Lck, 인슐린 단백질의 발현을 이들에 대한 mAb를 이용한 웨스턴블롯으로 검출하였다. 그 결과를 도 8a 내지 도 8c에 나타내었다.
ⅰ) T세포 (도 8a): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim-2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h) 이다.
ⅱ) B세포 (도 8b): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h) 이다.
ⅲ) 간세포 (도 8c): 제 1열은 표준분자량단백질이고, 각각 Sim2-Gal4에 의한 전달: CD8-z(a), Lck(e); Mph1-Gal4에 의한 전달: CD8-z(b), Lck(f); Tat-Gal4에 의한 전달: CD8-z(c), Lck(g); R7-Gal4에 의한 전달: CD8-z(d), Lck(h) 이다.
본 발명은 PTD 및 특정 DNA/RNA 서열에 결합가능한 DNA/RNA 결합인자 또는 그 일부분인 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 결합단백질과의 융합단백질, 생체내로 전달하고자하는 생체기능조절물질과 상기 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인과 특이적으로 결합하는 DNA/RNA 결합서열 둘 모두를 포함하는 DNA/RNA 구조를 이용하여 생체내 및 생체외에서 진핵 또는 원핵세포내부의 세포질 또는 핵 내로 근육내 (intramuscular), 복막내 (Intraperitoneal), 정맥내 (Intravein), 경구 (Oral), 비내 (nasal), 피하 (subcutaneous), 피내 (intradermal), 점막 (mucosal) 또는 흡입 (inhale) 등을 포함한 다양한 경로를 통하여 DNA를 효과적으로 전달할 수 있는 기술로써, DNA/RNA 백신의 개발 및 유전자치료등의 임상적 응용뿐만아니라 특정유전자를 세포내에서 안정적으로 또는 일시적으로 발현시켜 이들로부터 발현된 단백질의 기능을 연구하기 위한 기초연구에 유용하게 사용할 수 있다.
Claims (10)
- DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질과 PTD의 융합단백질; 및상기 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인과 특이적으로 결합하는 DNA/RNA 결합서열, 및 생체기능조절물질을 코딩하는 DNA/RNA가 결합된, 세포질 또는 핵내로 DNA/RNA를 전달하기 위한 결합복합체.
- 제 1항에 있어서, 뉴클리어 로컬라이제이션 (Nuclear localization sequence) (NLS)이 융합단백질의 PTD와 추가로 결합됨을 특징으로 하느 결합복합체.
- 제 1항 또는 제 2항 있어서, PTD가 Mph-1, Sim-2, Tat, R7, VP22, ANTP, Pep-1 및 Pep-2로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 결합복합체.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 생체기능조절물질이 특정 종 (species), 조직, 장기, 또는 세포에서 특이적으로 유전자를 발현시키는 프로모터 또는 인헨서 임을 특징으로 하는 결합복합체.
- 제 4항에 있어서, 프로모터가 유도성 (inducible) 프로모터 또는 인헨서 임을 특징으로 하는 결합복합체.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 생체내에서 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 투여경로에 의해 세포질 또는 핵내로 전달됨을 특징으로 하는 결합복합체.
- i) DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질 및 PTD를 각각 코딩하는 DNA, 및 발현조절서열이 작동적으로 결합된 물질전달 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;ⅱ) 상기 단계 i)의 물질전달 재조합 발현벡터를 숙주세포에서 발현시켜 융합단백질을 수득하는 단계;ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 융합단백질과 단백질, DNA/RNA, 지방, 탄수화물, 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생체기능조절물질을 화학적 또는 물리적 공유 또는 비공유 결합에 의해 연결시켜 결합복합체를 수득하는 단계; 및ⅳ) 상기 단계 ⅲ)의 결합복합체를 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 투여 경로를 통해 생체내로 또는 생체외에서 세포의 배양물과 혼합 배양시키는 단계를 포함하여, 생체기능조절물질을 진핵세포 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 안으로 전달하는 방법.
- i) DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나 이상의 결합단백질 및 PTD를 코딩하는 DNA, 및 발현조절서열이 작동적으로 결합된 물질전달 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;ⅱ) 상기 단계 i)의 물질전달 재조합 발현벡터를 숙주세포에서 발현시켜 융합단백질을 수득하는 단계;ⅲ) 생체기능조절물질을 코딩하는 DNA 및 상기 DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인과 특이적으로 결합하는 DNA/RNA 결합서열 둘 모두를 포함하고, 발현조절서열이 작동적으로 결합된 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;ⅳ) 상기 단계 ⅱ)에서 수득한 융합단백질과 단계 ⅲ)의 재조합 발현벡터를 결합시켜 결합복합체를 수득하는 단계; 및ⅴ) 상기 단계 ⅳ)의 결합복합체를 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 투여 경로를 통해 생체내로 또는 생체외에서 세포의 배양물과 혼합 배양시키는 단계를 포함하여, 생체기능조절물질을 진핵세포 또는 원핵세포의 세포질 또는 핵 안으로 전달하는 방법.
- 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 단계 ii)에서 뉴클리어 로컬라이제이션 서열을 융합단백질의 PTD와 결합시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- DNA/RNA 결합인자 또는 DNA/RNA 결합도메인을 지닌 동종 또는 이종의 하나이상의 결합단백질 및 PTD를 코딩하는 DNA, 및 발현조절서열이 작동적으로 결합된 물질전달 재조합 발현벡터.
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020020070106A KR100591936B1 (ko) | 2002-11-12 | 2002-11-12 | 세포내 ｄｎａ／ｒｎａ 전달 방법, 및 이것의 기초 및임상학적 응용 |
| PCT/KR2003/002425 WO2004044008A1 (en) | 2002-11-12 | 2003-11-12 | Dna/rna transduction technology and its clinical and basic applications |
| US10/534,433 US20060099677A1 (en) | 2002-11-12 | 2003-11-12 | DNA/RNA transduction technology and its clinical and basic applications |
| AU2003277729A AU2003277729A1 (en) | 2002-11-12 | 2003-11-12 | Dna/rna transduction technology and its clinical and basic applications |
| EP03811157A EP1578802A4 (en) | 2002-11-12 | 2003-11-12 | DNA / RNA transduction technology and its clinical and general applications |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020020070106A KR100591936B1 (ko) | 2002-11-12 | 2002-11-12 | 세포내 ｄｎａ／ｒｎａ 전달 방법, 및 이것의 기초 및임상학적 응용 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20040041991A true KR20040041991A (ko) | 2004-05-20 |
| KR100591936B1 KR100591936B1 (ko) | 2006-06-22 |
Family
ID=36316809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020020070106A KR100591936B1 (ko) | 2002-11-12 | 2002-11-12 | 세포내 ｄｎａ／ｒｎａ 전달 방법, 및 이것의 기초 및임상학적 응용 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20060099677A1 (ko) |
| EP (1) | EP1578802A4 (ko) |
| KR (1) | KR100591936B1 (ko) |
| AU (1) | AU2003277729A1 (ko) |
| WO (1) | WO2004044008A1 (ko) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030062788A (ko) | 2002-01-19 | 2003-07-28 | 포휴먼텍(주) | 생체분자 전달 펩타이드 ｍｐｈ1-ｂｔｍ 및 이것을포함하는 생명공학제품 |
| KR20030062789A (ko) * | 2002-01-19 | 2003-07-28 | 포휴먼텍(주) | 생체분자 전달 펩타이드 ｓｉｍ2-ｂｔｍ 및 이것을포함하는 생명공학제품 |
| KR20080084937A (ko) | 2005-11-04 | 2008-09-22 | 포휴먼텍(주) | 융합 폴리펩타이드를 세포로 전달하는 방법 |
| EP2044108A4 (en) | 2006-07-24 | 2010-06-30 | Forhumantech Co Ltd | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT AND TREATMENT OF ISCHEMIC SUDIDS AND METHOD FOR THEIR ADMINISTRATION |
| US7981446B2 (en) * | 2007-11-26 | 2011-07-19 | Forhumantech. Co., Ltd. | Pharmaceutical compositions and methods for delivering nucleic acids into cells |
| WO2012023838A2 (ko) * | 2010-08-20 | 2012-02-23 | Lee Sang-Kyou | 전사인자의 전사활성 조절도메인 및 단백질 운반 도메인을 가지는 융합단백질 및 이를 포함하는 전사인자 기능억제제 |
| JP6022470B2 (ja) | 2010-11-24 | 2016-11-09 | タカラ バイオ ユーエスエー， インコーポレイテッド | 分散型タンパク質形質導入ドメインを含む誘導性発現系転写モジュレータおよびその使用方法 |
| JP2014506458A (ja) * | 2011-01-26 | 2014-03-17 | クロンテック・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | タンパク質形質導入の向上 |
| US9932560B2 (en) | 2011-05-13 | 2018-04-03 | Elixirgen, Llc | Use of Zscan4 and Zscan4-dependent genes for direct reprogramming of somatic cells |
| US10335456B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-07-02 | Elixirgen Therapeutics, Inc. | Methods of using ZSCAN4 for rejuvenating human cells |
| CN115976083A (zh) * | 2022-11-24 | 2023-04-18 | 重庆师范大学 | 一种基于卵巢导向肽的外源核酸投递方法及应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999010376A1 (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-04 | Washington University | Inducible regulatory system and use thereof |
| WO2000040723A2 (en) * | 1999-01-04 | 2000-07-13 | University Of Vermont And State Agricultural College | Methods and products for delivering nucleic acids |
| US6780986B1 (en) * | 1999-01-04 | 2004-08-24 | University Of Vermont And State Agricultural College | RIP60 nucleic acid and polypeptide sequences and uses therefor |
| US6903077B1 (en) * | 1999-01-04 | 2005-06-07 | University Of Vermont And State Agricultural College | Methods and products for delivering nucleic acids |
| KR100379578B1 (ko) * | 2000-07-26 | 2003-04-08 | 최수영 | 세포침투성 티에이티-씨3 트랜스페라제 융합단백질, 이융합단백질의 발현벡터 및 티에이티-씨3 트랜스페라제를이용한 로 단백질의 생리적 기능 분석방법 |
| GB0022101D0 (en) * | 2000-09-08 | 2000-10-25 | Phogen Ltd | Delivery of substances to cells |
| WO2002062823A2 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-15 | Yale University | Peptides for facilitating composite receptor expression and translocation of macromolecules |
| EP1469871A4 (en) * | 2001-12-31 | 2006-08-23 | Dana Farber Cancer Inst Inc | METHOD FOR TREATING APOPTOSIS AND COMPOSITIONS THEREFOR |
| KR20030062789A (ko) * | 2002-01-19 | 2003-07-28 | 포휴먼텍(주) | 생체분자 전달 펩타이드 ｓｉｍ2-ｂｔｍ 및 이것을포함하는 생명공학제품 |
| US6835810B2 (en) * | 2002-05-13 | 2004-12-28 | Geneshuttle Biopharma, Inc. | Fusion protein for use as vector |
-
2002
- 2002-11-12 KR KR1020020070106A patent/KR100591936B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-11-12 US US10/534,433 patent/US20060099677A1/en not_active Abandoned
- 2003-11-12 WO PCT/KR2003/002425 patent/WO2004044008A1/en not_active Application Discontinuation
- 2003-11-12 EP EP03811157A patent/EP1578802A4/en not_active Withdrawn
- 2003-11-12 AU AU2003277729A patent/AU2003277729A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1578802A1 (en) | 2005-09-28 |
| AU2003277729A1 (en) | 2004-06-03 |
| KR100591936B1 (ko) | 2006-06-22 |
| EP1578802A4 (en) | 2006-02-15 |
| US20060099677A1 (en) | 2006-05-11 |
| WO2004044008A1 (en) | 2004-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Jans et al. | Signals mediating nuclear targeting and their regulation: application in drug delivery | |
| US7700109B2 (en) | Biomolecule transduction motif Mph-1-BTM and the use thereof | |
| EP1732581A2 (en) | Polypeptide transduction and fusogenic peptides | |
| EP1012280A1 (en) | Trimerising module | |
| KR100591936B1 (ko) | 세포내 ｄｎａ／ｒｎａ 전달 방법, 및 이것의 기초 및임상학적 응용 | |
| Kim et al. | Cell-penetrating DNA-binding protein as a safe and efficient naked DNA delivery carrier in vitro and in vivo | |
| KR20030062789A (ko) | 생체분자 전달 펩타이드 ｓｉｍ2-ｂｔｍ 및 이것을포함하는 생명공학제품 | |
| CN112279921A (zh) | 用于胞内递送分子的复合物 | |
| KR20090028624A (ko) | 자가면역질환, 알러지성 질환 및 염증성 질환 치료용 약제 조성물 및 이의 전달 방법 | |
| JP4960454B2 (ja) | 細胞膜透過伝達ペプチド及びこれを含む生物製剤 | |
| CN113121702A (zh) | 用于胞内递送分子的多聚化递送系统 | |
| JPH07508400A (ja) | 受容体のインターナライゼーション・シグナル | |
| CN110038120B (zh) | 豹蛙抗瘤酶融合蛋白作为治疗肿瘤药物的应用 | |
| ES2323530T3 (es) | Sistemas de expresion de igf recombinante. | |
| KR20240077739A (ko) | 신규 세포 침투성 펩타이드 및 이의 용도 | |
| KR20240065721A (ko) | 신규한 세포 투과성 펩타이드 및 이의 용도 | |
| CN113289001A (zh) | 一种调控肿瘤细胞凋亡的Vpr蛋白N端氨基酸多肽在制备抗肿瘤药物中的用途 | |
| CN112480262A (zh) | 一种融合蛋白及其制备与应用 | |
| Nore | Construction of a novel vector for non-viral Gene Therapy | |
| WO2003004065A1 (fr) | Methode de transport de polymere physiologique au moyen d'une proteine presentant une sequence repetitive rxp |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121217 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130617 Year of fee payment: 8 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |