WO2014077167A1 - サルモネラに結合する核酸分子およびその用途 - Google Patents

サルモネラに結合する核酸分子およびその用途 Download PDF

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sal
seq
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宏貴 皆川
穣 秋冨
金子　直人
真木雄 古市
克紀 堀井
巌 和賀
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid molecule that binds to Salmonella and uses thereof, and specifically relates to a nucleic acid molecule that binds to Salmonellas of O4 group, O7 group and / or O9 group, and uses thereof.
  • Salmonella In recent years, the increase in food poisoning caused by Salmonella has become a problem.
  • Salmonella When Salmonella is classified by serotype, Salmonella belonging to the O4 group, the O7 group, and the O9 group occupies most of the causative bacteria of food poisoning. For this reason, the establishment of a method for specifically detecting Salmonella belonging to these groups is very important.
  • a method using a selective medium is known.
  • bacteria contained in a sample are grown using a growth medium, and then, Salmonella in the growing bacteria is selectively grown using the selection medium (for example, RV medium).
  • the selection medium for example, RV medium.
  • Salmonella is detected.
  • the selective medium has a problem that, in addition to Salmonella, for example, cytolobacter, which is an opportunistic bacterium, grows. For this reason, it is not realistic to detect Salmonella only by the presence or absence of growth in the selective medium, and identification by a serotype using an antibody or the like is required.
  • nucleic acid molecules that specifically bind to the target are being studied as a new tool to replace antibodies. Since aptamers are small molecules compared to antibodies, they are easy to synthesize and can be modified. Therefore, various applications using binding between aptamers and targets are considered. Aptamers that bind to Salmonella have also been reported for Salmonella detection (Non-patent Document 1).
  • an object of the present invention is to provide a new nucleic acid molecule that can be used for detection of Salmonella.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule that specifically binds to Salmonella, comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • A a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 17
  • B one or several bases deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the nucleotide sequences of (a)
  • C a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having an identity of 80% or more to any one of the nucleotide sequences of (a) and binding to Salmonella
  • C a polynucleotide comprising a complementary base sequence to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide comprising any one of the base sequences of (a) and binding to Salmonella
  • the detection method of the present invention is a method of detecting Salmonella, wherein the sample is contacted with the nucleic acid molecule of the present invention, and the Salmonella in the sample is bound to the nucleic acid molecule to detect Salmonella in the sample. Including the step of:
  • the detection reagent of the present invention is a Salmonella detection reagent and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention is a detection kit for Salmonella, and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection device of the present invention includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to Salmonella, and specifically can bind specifically to Salmonella belonging to the O4 group, O7 group and / or O9 group, which are causative bacteria of food poisoning. Therefore, according to the nucleic acid molecule of the present invention, for example, Salmonella can be detected based on the presence or absence of binding to Salmonella. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention can be said to be an extremely useful tool for detecting Salmonella in the fields of food management, public health, and the like.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability between aptamer and cytolobacter in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 4 of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 5 of the present invention.
  • FIG. 1 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the binding ability between aptamer and cytolobacter in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the binding
  • FIG. 7 is a graph showing the specificity of binding between an aptamer and Salmonella in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 7 of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 8 of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 9 of the present invention.
  • FIG. 11 is a graph showing the binding ability between an aptamer and Salmonella in Example 10 of the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is a nucleic acid molecule that binds to Salmonella, comprising at least one polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (d).
  • A a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 17
  • B one or several bases deleted, substituted, inserted and / or added in any one of the nucleotide sequences of (a)
  • C a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having an identity of 80% or more to any one of the nucleotide sequences of (a) and binding to Salmonella
  • C a polynucleotide comprising a complementary base sequence to a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide comprising any one of the base sequences of (a) and binding to Salmonella
  • binding to Salmonella means, for example, having binding ability to the Salmonella or having binding activity to the Salmonella.
  • the binding between the nucleic acid molecule of the present invention and the Salmonella can be determined by, for example, surface plasmon resonance molecular interaction (SPR) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance molecular interaction
  • ProteON trade name, BioRad
  • BioRad BioRad
  • Salmonella examples include those belonging to the O4 group, the O7 group and / or the O9 group.
  • Salmonella in the O4 group examples include Salmonella typhimurium , Salmonella paratyphi B, and Salmonella fyris .
  • Salmonella in the O7 group examples include Salmonella infantis , Salmonella singapore , and Salmonella brenderup .
  • Salmonella in the O9 group examples include Salmonella. enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella dublin, and the like.
  • the nucleic acid molecules of the present invention bind to, for example, live and / or dead Salmonella.
  • the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to Salmonella, for example, compared to bacteria other than Salmonella.
  • bacteria other than Salmonella include Listeria and Escherichia.
  • the nucleic acid molecule of the present invention exhibits an excellent binding force to Salmonella, for example, as compared with bacteria other than Salmonella.
  • the dissociation constant of the nucleic acid molecule of the present invention showing the binding force to Salmonella is, for example, 1 ⁇ M or less, and preferably 500 nM or less.
  • the structural units of the polynucleotides (a) to (d) are, for example, nucleotide residues, and examples include deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues.
  • the polynucleotide is, for example, DNA composed of deoxyribonucleotide residues, DNA containing deoxyribonucleotide residues and ribonucleotide residues, and may further contain non-nucleotide residues.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is hereinafter also referred to as a DNA aptamer, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, a molecule composed of any of the polynucleotides (a) to (d) or a molecule containing the polynucleotide.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain two or more of any of the polynucleotides (a) to (d) as described later.
  • the two or more polynucleotides may have the same sequence or different sequences.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have, for example, a linker and / or an additional sequence.
  • the polynucleotide (a) is a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 1 to 17.
  • SAL-204 (SEQ ID NO: 1) GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC SAL-236 (SEQ ID NO: 2) GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTTGGGGGTAGGCGCTGGGGTGGGTGGGAGCGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC SAL-230 (SEQ ID NO: 3) GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC SAL-203 (SEQ ID NO: 4) GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGCGGAGTTGTGGGGGGTCGGGGGGTGGCGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC SAL-219 (SEQ ID NO: 5) GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGATCGGTGCTGCGGGGGTGGGTGGAGCGGGCAAAGGTTTCGGACGG
  • “one or several” may be, for example, within a range in which the polynucleotide of (b) binds to Salmonella.
  • the “one or several” is, for example, 1 to 60, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, and more preferably 1 to 5 in any one of the base sequences of (a). Particularly preferably, one or two.
  • the numerical range of numbers such as the number of bases and the number of sequences, for example, discloses all positive integers belonging to the range. That is, for example, the description “1 to 5 bases” means all disclosures of “1, 2, 3, 4, 5 bases” (the same applies hereinafter).
  • the “identity” may be, for example, within a range in which the polynucleotide (c) binds to Salmonella.
  • the identity is, for example, 80% or more, 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, 96% or more, 97% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • the identity can be calculated with default parameters using analysis software such as BLAST and FASTA (hereinafter the same).
  • the “hybridizable polynucleotide” is, for example, a polynucleotide that is completely or partially complementary to the polynucleotide in (a).
  • the hybridization can be detected by, for example, various hybridization assays.
  • the hybridization assay is not particularly limited, for example, Zanburuku (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the “stringent conditions” may be, for example, any of low stringent conditions, moderate stringent conditions, and highly stringent conditions.
  • Low stringent conditions are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 32 ° C.
  • Medium stringent conditions are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C.
  • the degree of stringency can be set by those skilled in the art by appropriately selecting conditions such as temperature, salt concentration, probe concentration and length, ionic strength, time, and the like.
  • “Stringent conditions” are, for example, Zanburuku previously described (Sambrook) et al., Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (Molecular Cloning:. A Laboratory Manual 2 nd Ed) " [(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] and the like can also be employed.
  • the polynucleotides (b) to (d) are not particularly limited.
  • the polynucleotides (a) to (d) do not substantially bind to, for example, Escherichia coli . “Substantially does not bind” includes, for example, that it is below the detection limit when binding between the nucleic acid molecule and E. coli is detected.
  • the polynucleotides (b) to (d) are not particularly limited, and specific examples include the following sequences.
  • the following sequences are described above, SAL-204 (SEQ ID NO: 1), SAL-230 (SEQ ID NO: 3), SAL-242 (SEQ ID NO: 7), SAL-278 (SEQ ID NO: 8), SAL-262 (SEQ ID NO: 9). ), SAL-396 (SEQ ID NO: 10), SAL-445 (SEQ ID NO: 11), SAL-437 (SEQ ID NO: 12), SAL-455 (SEQ ID NO: 14), SAL-107 (SEQ ID NO: 15), SAL-431
  • SAL-204 SEQ ID NO: 1
  • SAL-230 SEQ ID NO: 3
  • SAL-242 SEQ ID NO: 7
  • SAL-278 SEQ ID NO: 8
  • SAL-262 SEQ ID NO: 9
  • SAL-396 SEQ ID NO: 10
  • SAL-445 SEQ ID NO: 11
  • SAL-204_s46 (SEQ ID NO: 21) GGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGG SAL-204_rand (SEQ ID NO: 22) GCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGG SAL-230_s48 (SEQ ID NO: 23) GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGG SAL-230_rand (SEQ ID NO: 24) GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGG SAL-242_s46 (SEQ ID NO: 25) TATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACAT SAL-242_rand (SEQ ID NO: 26) GGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGG SAL-278_s49 (SEQ ID NO: 27) TGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCG SAL-2
  • nucleic acid molecule of the present invention for example, (a) may be, for example, (a ′) a polynucleotide comprising any one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 20 to 41.
  • any base sequence of (a) can be read as any of the base sequences of (a ′).
  • the nucleic acid molecule of the present invention may include, for example, one of the polynucleotide sequences (a) to (d) or a plurality of the polynucleotide sequences. In the latter case, it is preferable that a plurality of polynucleotide sequences are linked to form a single-stranded polynucleotide.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be directly linked to each other or indirectly linked via a linker.
  • the polynucleotide sequences are preferably linked directly or indirectly at the respective ends.
  • the sequences of the plurality of polynucleotides may be the same or different, for example.
  • sequences of the plurality of polynucleotides are preferably the same, for example.
  • the number of the sequences is not particularly limited, and is, for example, 2 or more, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 10, more preferably 2 Or 3.
  • the linker is not particularly limited.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, preferably 1 to 20 bases long, more preferably 3 to 12 bases long, and further preferably 5 to 9 bases long It is long.
  • the structural unit of the linker is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the linker is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues.
  • linker examples include, for example, polydeoxythymine (poly dT), polydeoxyadenine (poly dA), poly dAdT which is a repeating sequence of A and T, and preferably poly dT and poly dAdT. is there.
  • the polynucleotide is preferably a single-stranded polynucleotide.
  • the single-stranded polynucleotide is preferably capable of forming a stem structure and a loop structure by, for example, self-annealing.
  • the polynucleotide is preferably capable of forming a stem loop structure, an internal loop structure, and / or a bulge structure, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may be, for example, double stranded.
  • one single-stranded polynucleotide includes any of the polynucleotides (a) to (d), and the other single-stranded polynucleotide is not limited.
  • the other single-stranded polynucleotide include a polynucleotide comprising a base sequence complementary to any one of the polynucleotides (a) to (d).
  • the nucleic acid molecule of the present invention is double-stranded, it is preferably dissociated into a single-stranded polynucleotide by denaturation or the like prior to use.
  • the dissociated single-stranded polynucleotide of any one of (a) to (d) preferably has, for example, a stem structure and a loop structure as described above.
  • the stem structure and the loop structure can be formed means, for example, that the stem structure and the loop structure are actually formed, and even if the stem structure and the loop structure are not formed, the stem structure depending on the conditions. And the ability to form a loop structure.
  • a stem structure and a loop structure can be formed includes, for example, both experimental confirmation and prediction by a computer simulation.
  • the structural unit of the nucleic acid molecule of the present invention is, for example, a nucleotide residue.
  • the nucleotide residue include deoxyribonucleotide residue and ribonucleotide residue.
  • Examples of the nucleic acid molecule of the present invention include DNA composed only of deoxyribonucleotide residues, DNA containing one or several ribonucleotide residues, and the like. In the latter case, “one or several” is not particularly limited.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several modified nucleotide residues.
  • the “one or several” is not particularly limited.
  • 1 to 91, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, and further preferably 1 to 7 are used.
  • modified nucleotide residue examples include a modified deoxyribonucleotide residue and a modified ribonucleotide residue.
  • modified nucleotide residue examples include those in which a sugar residue in the nucleotide residue is modified.
  • sugar residue examples include deoxyribose residue and ribose residue.
  • the modification site in the nucleotide residue is not particularly limited, and examples thereof include the 2 'position and / or the 4' position of the sugar residue. Examples of the modification include methylation, fluorination, amination, and thiolation.
  • the modified nucleotide residue is, for example, a modified nucleotide residue having a pyrimidine base (pyrimidine nucleus) as a base, or a modified nucleotide residue having a purine base (purine nucleus) as a base.
  • the former is preferred.
  • a nucleotide residue having a pyrimidine base is referred to as a pyrimidine nucleotide residue
  • a modified pyrimidine nucleotide residue is referred to as a modified pyrimidine nucleotide residue
  • a nucleotide residue having a purine base is referred to as a purine nucleotide residue.
  • the purified purine nucleotide residue is referred to as a modified purine nucleotide residue.
  • the pyrimidine nucleotide residues include uracil nucleotide residues having uracil, cytosine nucleotide residues having cytosine, thymine nucleotide residues having thymine, and the like.
  • the modified nucleotide residue when the base is a pyrimidine base, for example, the 2'-position and / or the 4'-position of the sugar residue is preferably modified.
  • modified nucleotide residue examples include, for example, a 2′-methylated-uracil nucleotide residue, a 2′-methylated-cytosine nucleotide residue, and a 2′-modified ribose residue at the 2 ′ position.
  • the base in the nucleotide residue may be, for example, a natural base (non-artificial base) of adenine (a), cytosine (c), guanine (g), thymine (t) and uracil (u), or a non-natural base ( Artificial base).
  • a natural base non-artificial base
  • cytosine c
  • guanine g
  • thymine t
  • uracil u
  • Artificial base a non-natural base
  • Examples of the artificial base include a modified base and a modified base, and preferably have the same function as the natural base (a, c, g, t, or u).
  • the artificial base having the same function is, for example, an artificial base capable of binding to cytosine (c) instead of guanine (g), an artificial base capable of binding to guanine (g) instead of cytosine (c), Instead of adenine (a), an artificial base capable of binding to thymine (t) or uracil (u), instead of thymine (t), an artificial base capable of binding to adenine (a), instead of uracil (u) And an artificial base capable of binding to adenine (a).
  • the modified base include a methylated base, a fluorinated base, an aminated base, and a thiolated base.
  • the modified base include, for example, 2′-methyluracil, 2′-methylcytosine, 2′-fluorouracil, 2′-fluorocytosine, 2′-aminouracil, 2′-aminocytosine, 2-thiouracil, 2-thiocytosine and the like.
  • the bases represented by a, g, c, t and u include the meaning of the artificial base having the same function as each of the natural bases in addition to the natural base.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may contain, for example, one or several artificial nucleic acid monomer residues.
  • the “one or several” is not particularly limited.
  • 1 to 91, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, and further preferably 1 to 7 are used.
  • the artificial nucleic acid monomer residue include PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked Nucleic Acid), ENA (2'-O, 4'-C-Ethylenebridged Nucleic Acids) and the like.
  • the nucleic acid in the monomer residue is the same as described above, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is preferably nuclease resistant, for example.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has, for example, the modified nucleotide residue and / or the artificial nucleic acid monomer residue for nuclease resistance. Since the nucleic acid molecule of the present invention is nuclease resistant, for example, tens of kDa PEG (polyethylene glycol) or deoxythymidine may be bound to the 5 'end or 3' end.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have an additional sequence, for example.
  • the additional sequence is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 3 'end.
  • the additional sequence is not particularly limited.
  • the length of the additional sequence is not particularly limited, and is, for example, 1 to 200 bases long, preferably 1 to 50 bases long, more preferably 1 to 25 bases long, and further preferably 18 to 24 bases long. It is.
  • the structural unit of the additional sequence is, for example, a nucleotide residue, and examples thereof include a deoxyribonucleotide residue and a ribonucleotide residue.
  • the additional sequence is not particularly limited, and examples thereof include polynucleotides such as DNA consisting of deoxyribonucleotide residues and DNA containing ribonucleotide residues. Specific examples of the additional sequence include poly dT and poly dA.
  • the nucleic acid molecule of the present invention may further have a labeling substance, for example.
  • the labeling substance is preferably bound to, for example, at least one of the 5 'end and the 3' end of the nucleic acid molecule, and more preferably the 5 'end.
  • the labeling substance is not particularly limited, and examples thereof include fluorescent substances, dyes, isotopes and enzymes. Examples of the fluorescent substance include pyrene, TAMRA, fluorescein, Cy3 dye, Cy5 dye, FAM dye, rhodamine dye, Texas red dye, JOE, MAX, HEX, TYE and the like, and the dye includes, for example, And Alexa dyes such as Alexa 488 and Alexa 647.
  • the labeling substance may be linked directly to the nucleic acid molecule or indirectly via a linker, for example.
  • the linker is not particularly limited, and for example, the above examples can be used.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used, for example, immobilized on a carrier.
  • a carrier for example, either the 5 'end or the 3' end is preferably immobilized, and more preferably the 3 'end.
  • the nucleic acid molecule may be immobilized directly or indirectly on the carrier. In the latter case, for example, it is preferable to immobilize via the additional sequence.
  • the method for producing the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited, and can be synthesized by, for example, a genetic engineering technique such as a nucleic acid synthesis method using chemical synthesis or a known method.
  • the nucleic acid molecule of the present invention exhibits binding property to the Salmonella.
  • the use of the nucleic acid molecule of the present invention is not particularly limited as long as it uses the binding property to Salmonella.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be used in various methods, for example, instead of the antibody against Salmonella.
  • the Salmonella can be detected, whereby the Salmonella can be detected.
  • the method for detecting Salmonella is not particularly limited, and can be performed by detecting the binding between the Salmonella and the nucleic acid molecule.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting Salmonella, wherein the sample is brought into contact with the nucleic acid molecule of the present invention, and the Salmonella in the sample is bound to the nucleic acid molecule, thereby The method includes a step of detecting Salmonella in a sample.
  • the detection method of the present invention is characterized by using the nucleic acid molecule of the present invention, and other steps and conditions are not particularly limited.
  • the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to Salmonella, for example, by detecting the binding between Salmonella and the nucleic acid molecule, Salmonella in the sample can be specifically detected. It is. Specifically, for example, since the presence or absence of Salmonella or the amount of Salmonella in a sample can be analyzed, it can be said that qualitative or quantitative determination is also possible. According to the present invention, among Salmonella, for example, Salmonella belonging to the O4 group, the O7 group and / or the O9 group can be specifically detected.
  • the sample is not particularly limited.
  • the sample include samples derived from living organisms, food and drink, and environment.
  • the living body is not particularly limited, and examples thereof include non-human mammals such as humans, cows, pigs, sheep, mice, rats, rabbits, horses, and animals such as birds and fish.
  • Examples of the biological sample include excrement, body fluid, skin, meat, mucous membrane, body hair and the like.
  • Examples of the sample derived from food and drink include beverages, foods, and food ingredients.
  • Examples of the environment-derived sample include living organisms, water, soil, air, and the like. Examples of the water sample include groundwater, river water, seawater, domestic wastewater, and the like.
  • the sample derived from the environment includes, for example, deposits in food processing plants, kitchens, and the like.
  • a sample collected may be used as it is in the detection method of the present invention, or the collected sample is used as a seed for culturing in a medium, and the obtained culture is sampled in the detection method of the present invention. May be used as As the sample, for example, since the reliability of the detection result can be improved, it is preferable to use the culture in which the amount of bacteria contained in the collected material is increased.
  • the culture method is not particularly limited, and for example, a conventionally known method can be employed.
  • the medium used for the culture is not particularly limited, and examples of the growth medium include casein peptone 17 g / L, soy peptone 3 g / L, sodium chloride 5 g / L, dipotassium phosphate 2.5 g / L, glucose 2.5 g / L. TSV medium containing L (pH 7.3) and the like, selective medium for Salmonella, for example, soy peptone 5 g / L, sodium chloride 8 g / L, potassium dihydrogen phosphate 1.6 g / L, magnesium chloride hexahydrate RV medium containing 40 g / L, malachite green 0.04 g / L (pH 5.2), etc. can be used, and these may be used in combination.
  • the growth medium include casein peptone 17 g / L, soy peptone 3 g / L, sodium chloride 5 g / L, dipotassium phosphate 2.5 g / L, glucose 2.5 g / L. TSV medium containing
  • a culture sample cultured in a growth medium can be used as it is. Since the nucleic acid molecule of the present invention specifically binds to Salmonella, for example, even the culture sample containing various bacteria can specifically bind to Salmonella and detect this binding. It is.
  • the sample may be, for example, a live cell sample in which bacteria survive, or a dead cell sample in which bacteria have been killed.
  • the former includes, for example, the case where the sample collected as described above is used as it is or the culture is used as it is.
  • the latter includes, for example, a case where a killing treatment for bacteria contained in the sample is performed before or during contact with the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the killed bacteria treatment include heat treatment. Specific examples include a form in which the sample is heat-treated at 95 ° C. to 100 ° C. for 10 minutes and then contacted with the nucleic acid molecule of the present invention. If Salmonella is present in the sample, Salmonella may diffuse. However, by performing a killing process on the sample in advance, it is possible to sufficiently prevent Salmonella from spreading during detection and maintain safety.
  • the sample may be, for example, a liquid sample or a solid sample.
  • the solid sample for example, it is preferable to use it as a liquid sample by mixing it with a liquid because it is easy to contact with the nucleic acid molecule and is easy to handle.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, buffer solution, medium, and the like.
  • the detection step includes, for example, a contact step in which the sample and the nucleic acid molecule are brought into contact with each other to bind Salmonella and the nucleic acid molecule in the sample, and a binding detection step in which binding between the Salmonella and the nucleic acid molecule is detected. Including.
  • the detection step further includes, for example, a step of analyzing the presence or amount of Salmonella in the sample based on the result of the binding detection step.
  • the method for contacting the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact between the sample and the nucleic acid molecule is preferably performed in a liquid, for example.
  • the liquid is not particularly limited, and examples thereof include water, physiological saline, and buffer solution.
  • the contact condition between the sample and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • the contact temperature is, for example, 4 to 37 ° C., preferably 18 to 25 ° C.
  • the contact time is, for example, 10 to 120 minutes, preferably 30 to 60 minutes.
  • the sample and the nucleic acid molecule are preferably contacted in the presence of, for example, potassium ions (K + ) and magnesium ions (Mg 2+ ).
  • Potassium ions can be supplied by, for example, a potassium compound.
  • the potassium compound include an ion donor that ionizes in a liquid to liberate potassium ions.
  • a potassium salt can be used, and specific examples include potassium chloride, dipotassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, potassium sulfate, potassium acetate and the like.
  • Magnesium ions can be supplied by, for example, a magnesium compound.
  • the magnesium compound examples include ion donors that ionize in a liquid to release magnesium ions.
  • a magnesium salt can be used, and specific examples include magnesium chloride, magnesium acetate, magnesium carbonate, magnesium sulfate, magnesium hydroxide and the like.
  • the amount of bacteria in the sample brought into contact with the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • bacteria 10 5 to 10 7 cells are preferably contacted per 100 pmol of the nucleic acid molecule, more preferably 10 6 to 10 7 cells.
  • the potassium ions are, for example, 100 to 1000 nmol, more preferably 500 to 1000 nmol, and even more preferably 500 nmol per 200 fmol of the nucleic acid molecule.
  • Magnesium ions are, for example, 100 to 1000 nmol, more preferably 100 to 500 nmol, and even more preferably 100 nmol.
  • the nucleic acid molecule may be, for example, an immobilized nucleic acid molecule immobilized on a carrier or an unfixed free nucleic acid molecule.
  • the sample is contacted in a container.
  • the nucleic acid molecule is preferably, for example, the immobilized nucleic acid molecule because of its excellent handleability.
  • the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a substrate, a bead, and a container. Examples of the container include a microplate and a tube.
  • the nucleic acid molecule is immobilized as described above, for example.
  • the binding detection step is a step of detecting binding between Salmonella in the sample and the nucleic acid molecule as described above.
  • the binding detection step is a step of detecting binding between Salmonella in the sample and the nucleic acid molecule as described above.
  • the presence or absence of salmonella in the sample can be analyzed (qualitative), and by detecting the degree of binding (binding amount) between the two, for example, the sample Analyzes (quantifies) the amount of salmonella in it.
  • the binding between the Salmonella and the nucleic acid molecule cannot be detected, it can be determined that there is no Salmonella in the sample, and when the binding is detected, it can be determined that Salmonella is present in the sample. .
  • a correlation between the number of Salmonella bacteria and the binding amount can be obtained in advance, and the number of Salmonella bacteria in the sample can be analyzed from the binding amount based on the correlation.
  • the method for detecting the binding between the Salmonella and the nucleic acid molecule is not particularly limited.
  • a conventionally known method for detecting the binding between substances can be adopted, and specific examples include the above-mentioned SPR, fluorescence polarization method and the like.
  • the binding may be, for example, detection of a complex of the Salmonella and the nucleic acid molecule.
  • the fluorescence polarization method is generally characterized in that when the labeling substance is irradiated with polarized excitation light, the fluorescence emitted from the labeling substance exhibits different degrees of polarization depending on the molecular weight of the molecule labeled with the labeling substance.
  • a measurement method based on In the present invention for example, by using the nucleic acid molecule (labeled nucleic acid molecule) labeled with the labeling substance, the binding between the Salmonella and the nucleic acid molecule can be detected by the fluorescence polarization method.
  • the former when the labeled nucleic acid molecule is compared with a state in which it is not bound to Salmonella and a state in which Salmonella is bound, the former has a relatively low molecular weight, and therefore has a relatively high degree of polarization, The latter has a relatively low degree of polarization because of its relatively large molecular weight. Therefore, for example, by comparing the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule before contact with the sample and the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule after contact with the sample, Salmonella and the labeling are compared. Binding to a nucleic acid molecule can be detected.
  • the polarization degree of the labeled nucleic acid molecule after contact with the sample is determined based on the polarization degree of at least one of the labeled nucleic acid molecule not bound to Salmonella and the labeled nucleic acid molecule bound to Salmonella.
  • the evaluation can also detect the binding between Salmonella and the labeled nucleic acid molecule.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can be easily used as a sensor only by labeling with the labeling substance.
  • the detection wavelength of the labeling substance varies depending on the type thereof, for example, the influence of the fluorescence derived from the sample can be reduced by selecting the labeling substance according to the type of the sample.
  • the labeled nucleic acid molecule is not particularly limited as long as the nucleic acid molecule of the present invention is labeled with the labeling substance, for example.
  • Examples of the labeled nucleic acid molecule include a form in which the labeling substance is linked to the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the labeling substance may be directly linked to the nucleic acid molecule of the present invention, or the labeling substance is indirectly linked via a linker or the like as described above. You may connect to.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 0 to 10 bases long, preferably 0 to 7 bases long, and more preferably 0 to 5 bases long.
  • the labeling substance may be linked to, for example, any part of the nucleic acid molecule of the present invention, and specific examples include 5 ′ end and 3 ′ end, and may be linked to both ends. It may be linked to any one of the ends, preferably the 5 ′ end.
  • labeled nucleic acid molecule examples include, for example, the nucleic acid molecule of the present invention and a complementary strand that is complementary to the nucleic acid molecule (hereinafter also referred to as “labeled complementary strand”). And a hybrid molecule in which the nucleic acid molecule and the labeled complementary strand are hybridized.
  • the complementary strand only needs to have a sequence complementary to a part of the nucleic acid molecule of the present invention, for example, may be composed of only the complementary sequence, or includes the complementary sequence. But you can.
  • the complementary strand may be complementary to any region of the nucleic acid molecule of the present invention, and is preferably complementary to the 5 'end region or 3' end region.
  • the nucleic acid molecule of the present invention preferably has a linker at the 5 'end or 3' end, and the complementary sequence is preferably complementary to the linker.
  • the length of the linker is not particularly limited, and is, for example, 10 to 30 bases long, preferably 15 to 25 bases long, and more preferably 18 to 24 bases long.
  • the length of the complementary strand is not particularly limited, and is, for example, 10 to 30 bases long, preferably 15 to 25 bases long, and more preferably 18 to 24 bases long.
  • the labeling substance may be linked to, for example, any part of the complementary strand, and specific examples include the 5 ′ end and the 3 ′ end. Alternatively, it may be linked to either one of the ends.
  • the labeling substance is preferably linked to the 5 ′ end of the complementary strand
  • the labeled complementary strand is When complementary to the 5 ′ end region of the nucleic acid molecule of the present invention, the labeling substance is preferably linked to the 3 ′ end of the complementary strand.
  • the labeling substance is not particularly limited, and the examples described above can be used, and among these, the fluorescent substance and the dye are preferable.
  • the detection method of the present invention includes, for example, a contact step in which the sample and the nucleic acid molecule are brought into contact with each other, and the Salmonella in the sample is bound to the labeled nucleic acid molecule;
  • the measurement step of irradiating the labeled nucleic acid molecule with polarized excitation light to measure the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule, the measurement result in the measurement step and the evaluation criteria are compared, and Salmonella and the labeled nucleic acid molecule It is preferable to include a detection step of detecting a step of detecting binding.
  • the wavelength of the polarized excitation light and the detection wavelength of the polarization degree are not particularly limited, and can be appropriately set according to, for example, the type of the labeling substance.
  • the wavelength of the polarized excitation light is, for example, 620 to 680 nm
  • the detection wavelength of the degree of polarization is, for example, 660 to 800 nm.
  • the irradiation time of the polarized excitation light is not particularly limited, and examples thereof include 1 nanosecond to 5 nanoseconds.
  • the evaluation criterion may be determined in advance or may be determined for each measurement, for example.
  • As the evaluation criteria for example, a salmonella non-bonding standard or a salmonella binding standard can be set.
  • the former criterion is, for example, the polarization degree of only the labeled nucleic acid molecule to which Salmonella is not bound
  • the latter criterion is, for example, the polarization degree of the labeled nucleic acid molecule to which Salmonella is bound.
  • the former standard for example, if the measured value in the measurement step is higher than the standard, it can be determined that salmonella is present, and if the measured value is relatively higher than the standard, a relatively large number of salmonella is determined. Can be determined to exist. On the other hand, if the measurement value in the measurement step is about the same as or lower than the reference, it can be determined that there is no Salmonella.
  • the former criterion may be, for example, the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule before the contacting step.
  • the measurement value in the measurement step is lower than the standard, it can be determined that there is no Salmonella.
  • the measurement value in the measurement step is the same or higher than the reference, it can be determined that there is a salmonella, and if it is relatively higher than the reference, it can be determined that a relatively large amount of salmonella exists.
  • the reference may be a correlation between the amount of Salmonella and the degree of polarization.
  • a correlation equation showing the correlation by contacting a plurality of known concentrations of Salmonella with a predetermined amount of the labeled nucleic acid molecule and measuring the degree of polarization of the labeled nucleic acid molecule bound to each concentration of Salmonella. Is obtained. And the amount of Salmonella in the sample can be determined from the correlation formula and the measured value in the measuring step.
  • the detection reagent of the present invention is a detection reagent for Salmonella and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection reagent of this invention should just contain the nucleic acid molecule of the said this invention, and another structure is not restrict
  • the detection kit of the present invention is a Salmonella detection kit, and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection kit of the present invention is not limited as long as it contains the nucleic acid molecule of the present invention. If the detection kit of the present invention is used, for example, the detection of Salmonella can be easily performed as described above.
  • the detection kit of the present invention may contain other components in addition to the nucleic acid molecule of the present invention, for example.
  • the component include the carrier, a medium for culturing the sample, a buffer, a magnesium compound and a potassium compound, and instructions for use.
  • the description of the nucleic acid molecule of the present invention can be used, and the nucleic acid molecule of the present invention and the detection method of the present invention can also be used for the method of use.
  • the detection device of the present invention is a Salmonella detection device, and includes the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the detection device of the present invention is not limited as long as it contains the nucleic acid molecule of the present invention. If the detection device of the present invention is used, for example, detection of the Salmonella can be performed as described above.
  • the detection device of the present invention further includes, for example, a carrier, and the nucleic acid molecule is arranged on the carrier.
  • the nucleic acid molecule is preferably immobilized on the carrier.
  • the type of the carrier and the immobilization of the nucleic acid molecule are as described above, for example.
  • the method for using the detection device of the present invention is not particularly limited, and the nucleic acid molecule of the present invention and the detection method of the present invention can be used.
  • Example 1 About each aptamer, the binding ability with respect to Salmonella was confirmed.
  • SAL-33 a known aptamer that binds to Salmonella was used (Non-patent Document 1: Molecular and Cellular Probes 23, 2009, 20-28).
  • the aptamer sequence is shown below.
  • SAL-33 (SEQ ID NO: 18) TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGATTTCTCCTACTGGGATAGGTGGATTAT
  • N40 a DNA library containing a plurality of DNAs consisting of the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 19 containing 40-base-long random sequence (N) 40 was designated as negative control N40.
  • N is a deoxyribonucleotide residue
  • the nucleic acid was adenine, guanine, cytosine and / or thymine.
  • N40 SEQ ID NO: 19
  • the aptamer was added with polydeoxyadenine (poly dA) having a length of 24 bases at the 3 'end and used as a poly dA added aptamer in SPR described later.
  • poly dA polydeoxyadenine
  • Salmonella enteritidis Salmonella enteritidis , Salmonella typhimurium , Salmonella infantis , Citrobacter freundii and Eschericia coli (DH5a) were used as bacteria. Each bacterium was killed by heat treatment at 100 ° C. for 10 minutes. The killed bacteria were washed with PBS buffer (137 mmol NaCl, 8.1 mmol Na 2 HPO 4 , 2.68 mmol KCl, 1.48 mmol KH 2 PO so that the absorbance at a wavelength of 600 nm at an optical path length of 1 cm was 0.1. 4 and pH 7.4). This diluted sample was used for the following SPR.
  • a ProteON dedicated sensor chip a chip (product name: ProteOn NLC Sensor Chip, BioRad) on which streptavidin was immobilized was set in the ProteON XPR36. 5000 nmol / L of ligand was injected into the flow cell of the sensor chip using ultrapure water (DDW), and was bound until the signal intensity (RU: Resonance Unit) was about 1000 RU.
  • RU Resonance Unit
  • biotinylated poly dT obtained by biotinylating the 5 'end of 24 base deoxythymidine was used.
  • the poly dA-added aptamer was injected into the flow cell of the chip at a flow rate of 25 ⁇ L / min for 80 seconds using an SPR buffer, and was bound until the signal intensity reached about 700 RU.
  • the composition of the SPR buffer was 50 mmol / L Tris, 100 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 , 0.05% Tween (registered trademark) 20, and the pH was 7.4.
  • RU max indicates the amount of target binding to the aptamer at the time of sample injection
  • RU constant indicates the amount of target binding to the aptamer at the time of washing.
  • RU constant / RU max means that the higher the value, the harder the bond between the aptamer and the target is separated by washing.
  • FIG. 1 and FIG. 1 and FIG. 2 are graphs showing the binding ability of each aptamer to each bacterium.
  • FIG. 1 (A) is Salmonella enteritidis
  • (B) is Salmonella typhimurium
  • (C) is Salmonella infantis
  • FIG. 2 is Citrobacter freundii . It is a graph which shows the binding ability of each aptamer.
  • the vertical axis represents RU constant / RU max .
  • the aptamer of the example shows some binding (RU max ) to Citrobacter freundii at the time of injection, but as a result of dissociation by washing, RU constant / RU max is negative (substantially) No bond).
  • the known aptamer SAL-33 of the comparative example bound to Citrobacter freundii , and the binding was maintained after washing.
  • all of the aptamers of the examples showed better binding ability to Salmonella enteritidis than the known aptamers of the comparative examples, and excellent binding ability to Salmonella typhimurium and Salmonella infantis . showed that.
  • SAL-230, SAL-262, SAL-396, SAL-431, and SAL-437 show excellent binding ability at the time of injection of the diluted sample, and the binding with Salmonella is sufficient even by washing. I was able to maintain it. From these results, it was found that the aptamers of the examples can bind specifically to each salmonella with excellent binding ability.
  • Example 2 About each aptamer, the binding ability with respect to Salmonella was confirmed.
  • Salmonella was detected by ELAA (Enzyme-linked Aptamer Assay) using an aptamer.
  • the aptamer was added with polydeoxyadenine (poly dA) having a length of 24 bases at the 3 'end, and used as a poly dA addition aptamer for ELAA described later.
  • poly dA polydeoxyadenine
  • Bacterial samples As in the previous examples, dead bacteria of Salmonella enteritidis , Salmonella typhimurium , Salmonella infantis and Eschericia coli (DH5a) were used. The bacteria were diluted with PBS buffer so that the absorbance at a wavelength of 600 nm at a light length of 1 cm was 0.1. This diluted sample was used in the following ELAA.
  • a 96-well plate (trade name: Nunc-Immuno (registered trademark) plate, Maxisorp (registered trademark), Nunc), and allowed to adsorb at 4 ° C. overnight.
  • the well was washed with 200 ⁇ L of washing solution, 200 ⁇ L of blocking solution was added, and incubated at room temperature for 1 hour. After the incubation, the well was washed 3 times with 200 ⁇ L of the washing solution to prepare a plate on which dead bacteria in the diluted sample were immobilized.
  • the poly dA aptamer was not added, and the biotinylated poly dT was added to the plate on which the dead bacteria were immobilized, and ELAA was performed in the same manner.
  • FIG. 4 is a graph showing the binding of aptamer and Salmonella.
  • the vertical axis represents the relative value of absorbance at a wavelength of 450 nm indicating the binding ability.
  • A shows the ability to bind Salmonella enteritidis
  • B shows the ability to bind Salmonella typhimurium
  • C shows the ability to bind Salmonella infantis .
  • SAL-230_s48 (SEQ ID NO: 23) GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGG
  • SAL-230_rand (SEQ ID NO: 24) GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGG SAL-278_s49 (SEQ ID NO: 27) TGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCG SAL-278_rand (SEQ ID NO: 28) GTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGG
  • FIG. 5 is a graph showing the binding ability of each aptamer to each Salmonella.
  • the vertical axis is RU constant / RU max .
  • A shows the ability to bind Salmonella enteritidis
  • B shows the ability to bind Salmonella typhimurium
  • C shows the ability to bind Salmonella infantis .
  • Salmonella was detected by ELAA using an aptamer.
  • SAL-204, SAL-242 (SEQ ID NO: 7), SAL-262 (SEQ ID NO: 9), SAL-396 (SEQ ID NO: 10), SAL-445 (SEQ ID NO: 11), SAL-437 (SEQ ID NO: 12) ), SAL-455 (SEQ ID NO: 14), SAL-107 (SEQ ID NO: 15) and SAL-431 (SEQ ID NO: 16) were synthesized in the following nucleotides, and used as aptamers in the examples.
  • the aptamer was added with poly dA having a length of 20 bases at the 3 ′ end, and used as a poly dA-added aptamer for ELAA described later.
  • SAL-204_s46 (SEQ ID NO: 21) GGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGG SAL-204_rand (SEQ ID NO: 22) GCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGG SAL-242_s46 (SEQ ID NO: 25) TATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACAT SAL-242_rand (SEQ ID NO: 26) GGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGG SAL-262_s36 (SEQ ID NO: 29) GGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGG SAL-262_rand (SEQ ID NO: 30) GCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGG SAL-396_s55 (SEQ ID NO: 22) GCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGG SAL-242_s46 (SEQ ID NO: 25) TATGT
  • FIG. 6 shows the result of calculating the relative value for each reaction with the absorbance of the blank being 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the binding of aptamer and Salmonella.
  • the vertical axis represents the relative value of absorbance at a wavelength of 450 nm indicating the binding ability.
  • any of the aptamers of the Examples exhibited binding ability superior to that of the negative control N40 (O pool) with respect to Salmonella.
  • the composition of the SPR buffer is 40 mmol / L HEPES, 125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 , 0.05% Tween (registered trademark) 20, pH
  • the binding ability was analyzed in the same manner as in Example 1 (3) except that 7.4 was used.
  • the results of RU max and RU constant are shown in FIG.
  • FIG. 7 is a graph showing aptamer binding ability.
  • (A) shows the result of RU max
  • (B) shows the result of RU constant .
  • the horizontal axis indicates the type of aptamer, in (A), the vertical axis indicates RU max , and in (B), the vertical axis indicates RU constant .
  • SAL-278_rand showed excellent binding ability to Salmonella with respect to the negative control. SAL-278_rand did not bind to Eschericia coli O157: H7, Listeria monocytogenes 4a and Listeria monocytogenes 1 / 2a, and showed excellent binding ability only to Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium .
  • Salmonella was detected by fluorescence polarization using a labeled aptamer obtained by hybridizing a labeled complementary strand and an aptamer.
  • polydeoxyadenine having a length of 24 bases is added to the 3 ′ end of the miniaturized aptamer SAL-278_rand (SEQ ID NO: 28) of Example 4 to obtain a poly dA added aptamer.
  • poly dA polydeoxyadenine
  • SAL-278_rand SEQ ID NO: 28
  • a labeled complementary strand a labeled poly dT in which the 5 ′ end of deoxythymidine having a length of 24 bases was labeled with Alexa 647 (manufactured by Invitrogen) was prepared. Then, in the SB1T buffer (40 mmol / L HEPES, 125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 , 0.05% Tween (registered trademark) 20, pH 7.4), the folding was performed.
  • the SB1T buffer 40 mmol / L HEPES, 125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 1 mmol / L MgCl 2 , 0.05% Tween (registered trademark) 20, pH 7.4
  • a poly dA-added aptamer and the labeled poly dT were incubated at room temperature for 10 minutes, and the labeled poly dT was hybridized to the poly dA portion of the poly dA-added aptamer to prepare a labeled hybrid aptamer.
  • Example 2 Bacterial sample Bacteria used Salmonella enteritidis (SE), Salmonella typhimurium (ST), Eschericia coli O157: H7 (O157), Listeria monocytogenes 4a (LM4a) and Listeria monocytogenes 1 / 2a (LM1 / 2a), A diluted sample was prepared in the same manner as in Example 1 (2) except that the SB1T buffer was used instead of the PBS buffer. Moreover, it replaced with the said diluted sample and used SB1T buffer and made this into control.
  • SE Salmonella enteritidis
  • ST Salmonella typhimurium
  • O157 Eschericia coli O157: H7
  • LM4a Listeria monocytogenes 4a
  • LM1 / 2a Listeria monocytogenes 1 / 2a
  • FIG. 8 is a graph showing the result of the degree of fluorescence polarization.
  • the horizontal axis indicates the type of aptamer, and the vertical axis indicates the degree of fluorescence polarization. Since the labeled poly dT is hybridized to the poly dA-added aptamer, when Salmonella binds to the aptamer part of the poly dA-added aptamer, the degree of fluorescence polarization increases due to an increase in molecular weight. As shown in FIG. 8, SAL-278_rand showed a higher degree of fluorescence polarization for Salmonella than the negative control. From this, it was found that SAL-278_rand was bound to Salmonella by the degree of fluorescence polarization.
  • SAL-278_rand showed a degree of fluorescence polarization equivalent to that of the negative control for Eschericia coli O157: H7, Listeria monocytogenes 4a and Listeria monocytogenes 1 / 2a. This indicates that SAL-278_rand does not bind to anything other than Salmonella due to the degree of fluorescence polarization.
  • Salmonella was detected by fluorescence polarization using an aptamer.
  • Example 4 (2) Labeled aptamer Using the miniaturized aptamer SAL-278_rand (SEQ ID NO: 28) of Example 4, three types of labeled aptamers were prepared as shown below.
  • the first labeled aptamer is a labeled hybrid aptamer hybridized with a labeled complementary strand, and the same one as in Example 7 was used.
  • the second labeled aptamer was obtained by adding 5 base poly dT to the 5 ′ end of the miniaturized aptamer and labeling the 5 ′ end of the poly dT with Alexa 647 (5 ′ end labeled aptamer). .
  • the third labeled aptamer was obtained by adding 5-base poly dT to the 3 ′ end of the miniaturized aptamer and labeling the 3 ′ end of the poly dT with Alexa 647 (3 ′ end labeled aptamer). .
  • Example 6 As a negative control, N30 of Example 6 was used, and a labeled hybrid aptamer in which 20 A of poly A was added to the 3 'end and the labeled poly dT was hybridized was used.
  • Bacterial sample A diluted sample was prepared in the same manner as in Example 1 (2) except that Salmonella typhimurium was used as the bacterium, and SB1T buffer was used instead of PBS buffer. Moreover, it replaced with the said diluted sample and used SB1T buffer and made this into control.
  • FIG. 9 is a graph showing the result of the degree of fluorescence polarization.
  • the horizontal axis indicates the type of aptamer, and the vertical axis indicates the degree of fluorescence polarization. Since each labeled aptamer is labeled with a labeling substance, when Salmonella binds to the aptamer part of each labeled aptamer, the degree of fluorescence polarization increases due to an increase in molecular weight.
  • the labeled hybrid aptamer (hybrid) the 5 ′ end labeled aptamer (5 ′ label) and the 3 ′ end labeled aptamer (3 ′ label) are more effective against Salmonella than the negative control, respectively.
  • Salmonella was detected by fluorescence polarization using an aptamer.
  • Example 2 Bacterial sample A SB1T diluted sample was prepared in the same manner as in Example 1 (2) except that Salmonella typhimurium was used as the bacterium, and the SB1T buffer was used instead of the PBS buffer. Further, a TBS diluted sample was prepared in the same manner as in Example 1 (2) except that a culture medium of tryptosome broth (TSB) was used instead of the PBS buffer.
  • TBS tryptosome broth
  • the concentration of dead bacteria in the diluted sample is a predetermined concentration (10 6 cells / mL, 10 7 cells / mL or 10 8 cells / mL).
  • the fluorescence polarization degree of the reaction solution was measured in the same manner as in Example 7 (3) except that each diluted sample was added so that The measurement results of the degree of fluorescence polarization are shown in FIG.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of the degree of fluorescence polarization.
  • (A) shows the results using the SB1T diluted sample
  • (B) shows the results using the TBS diluted sample.
  • 10A and 10B the horizontal axis represents the concentration of Salmonella, and the vertical axis represents the degree of fluorescence polarization.
  • both of the SBT1 diluted sample and the TBS diluted sample showed a high degree of fluorescence polarization with respect to the negative control, and 10 6 cells / mL. It was found that Salmonella can be detected by fluorescence polarization even at a Salmonella concentration.
  • Example 10 The dissociation constant of the aptamer for Salmonella was measured by ELAA using the aptamer.
  • the biotinylated aptamer was not added, and ELAA was performed in the same manner. Then, the dissociation constant of the biotinylated aptamer for Salmonella was calculated from the absorbance fitting curve.
  • FIG. 11 is a graph showing the binding between aptamer and Salmonella.
  • the horizontal axis indicates the aptamer concentration
  • the vertical axis indicates the absorbance at a wavelength of 450 nm indicating the binding ability
  • the black circle ( ⁇ ) in the figure indicates the result when Salmonella enteritidis is used.
  • the white circles ( ⁇ ) indicate the results when Salmonella typhimurium was used.
  • the absorbance increased depending on the concentration of the biotinylated aptamer.
  • the dissociation constant of SAL-278 for Salmonella enteritidis was 540 nM, and the dissociation constant for Salmonella typhimurium was 310 nM. From these results, it was found that SAL-278 exhibits extremely excellent binding strength to Salmonella.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can bind to Salmonella, and specifically can bind specifically to Salmonella belonging to the O4 group, O7 group and / or O9 group, which are causative bacteria of food poisoning. For this reason, according to the nucleic acid molecule of the present invention, for example, Salmonella can be detected by binding to Salmonella. Therefore, the nucleic acid molecule of the present invention is an extremely useful tool for detecting Salmonella in the fields of food management, public health, and the like.

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Abstract

　サルモネラの検出に利用可能な核酸分子を提供する。　下記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む核酸分子を、サルモネラに結合する核酸分子とする。 （ａ）配列番号１～１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド （ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド （ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド （ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド

Description

サルモネラに結合する核酸分子およびその用途
　本発明は、サルモネラに結合する核酸分子およびその用途に関し、具体的には、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群のサルモネラに結合する核酸分子、およびその用途に関する。
　近年、サルモネラによる食中毒の増加が問題となっている。サルモネラは、血清型で分類した場合、中でも、Ｏ４群、Ｏ７群およびＯ９群に属するサルモネラが、食中毒の原因菌の大半を占めている。このため、これらの群に属するサルモネラを特異的に検出する方法の確立が、非常に重要視されている。
　サルモネラの検出は、例えば、選択培地を用いる方法が知られている。この方法は、まず、増殖培地を用いて、試料に含まれる細菌の増殖を行い、つぎに、前記選択培地（例えば、ＲＶ培地）を用いて、増殖細菌中のサルモネラを選択的に生育させることで、サルモネラの検出を行う方法である。しかしながら、前記選択培地は、サルモネラの他に、例えば、日和見菌であるサイトロバクター等も生育するという問題がある。このため、前記選択培地における生育の有無のみでサルモネラを検出することは、現実的ではなく、抗体等を用いた血清型による同定等が必要とされる。
　この他に、ＰＣＲ等の遺伝子増幅法により、サルモネラに特異的な配列を増幅させ、増幅の有無によって、サルモネラを検出する方法も提案されている。しかしながら、遺伝子増幅法において、ターゲット配列を特異的に増幅させるには、類似する配列の増幅を回避するために、プライマーの配列の設計等、増幅条件の設定が複雑である。また、増幅反応に時間を要するという問題がある。
　他方、抗体にかわる新たなツールとして、ターゲットに特異的に結合する核酸分子（アプタマー）の研究が行われている。アプタマーは、抗体と比較すると低分子であることから、合成が容易であり、改変等も可能であることから、アプタマーとターゲットとの結合を利用した様々な応用が考えられている。サルモネラ検出についても、サルモネラに結合するアプタマーが報告されている（非特許文献１）。
Raghavendra　Joshiら、Molecular　and　Cellular　Probes　2009、　23、20-28
　しかしながら、報告されているアプタマーは、サルモネラ検出の実用化において、サルモネラに対する結合が十分ではないことから、さらに優れたアプタマーの提供が望まれている。
　そこで、本発明の目的は、サルモネラの検出に利用可能な新たな核酸分子を提供することにある。
　本発明の核酸分子は、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするサルモネラに特異的に結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１～１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
　本発明の検出方法は、サルモネラの検出方法であり、試料と前記本発明の核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のサルモネラを検出する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の検出試薬は、サルモネラの検出試薬であり、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明の検出キットは、サルモネラの検出キットであり、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明の検出デバイスは、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。
　本発明の核酸分子は、サルモネラに結合可能であり、中でも、食中毒の原因菌であるＯ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するサルモネラに特異的に結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、サルモネラとの結合の有無によって、サルモネラを検出できる。したがって、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるサルモネラの検出に、極めて有用なツールといえる。
図１は、本発明の実施例１において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例１において、アプタマーとサイトロバクターとの結合能を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例２において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例３において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図５は、本発明の実施例４において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例５において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例６において、アプタマーとサルモネラとの結合の特異性を示すグラフである。 図８は、本発明の実施例７において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図９は、本発明の実施例８において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施例９において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。 図１１は、本発明の実施例１０において、アプタマーとサルモネラとの結合能を示すグラフである。
　本発明の核酸分子は、前述のように、下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするサルモネラに結合する核酸分子である。
（ａ）配列番号１～１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
　本発明において、「サルモネラに結合する」とは、例えば、前記サルモネラに対する結合能を有している、または、前記サルモネラに対する結合活性を有しているともいう。本発明の核酸分子と前記サルモネラとの結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用（ＳＰＲ；Surface　Plasmon　resonance）解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ＰｒｏｔｅＯＮ（商品名　BioRad社）が使用できる。
　サルモネラの種類は、例えば、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するものがあげられる。Ｏ４群のサルモネラは、例えば、Salmonella　typhimurium、Salmonella　paratyphi　B、Salmonella　fyrisがあげられ、Ｏ７群のサルモネラは、例えば、Salmonella　infantis、Salmonella　singapore、Salmonella　brenderupがあげられ、Ｏ９群のサルモネラは、例えば、Salmonella　enteritidis、Salmonella　typhi、Salmonella　dublinがあげられる。本発明の核酸分子は、例えば、サルモネラの生菌および／または死菌に結合する。
　本発明の核酸分子は、例えば、サルモネラ以外の細菌と比較して、サルモネラに対して特異的に結合する。前記サルモネラ以外の細菌は、例えば、リステリア属、エッシェリシア属である。本発明の核酸分子は、例えば、サルモネラ以外の細菌と比較して、サルモネラに対して優れた結合力を示す。サルモネラに対する前記結合力を示す本発明の核酸分子の解離定数は、例えば、１μＭ以下であり、好ましくは、５００ｎＭ以下である。
　本発明の核酸分子において、前記（ａ）～（ｄ）のポリヌクレオチドの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。前記ポリヌクレオチドは、後述するように、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡであり、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。本発明の核酸分子は、例えば、以下、ＤＮＡアプタマーともいう。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドからなる分子でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む分子でもよい。後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、後述するように、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを２つ以上含んでもよい。前記２つ以上のポリヌクレオチドは、同じ配列でもよいし、異なる配列でもよい。また、後者の場合、本発明の核酸分子は、例えば、さらに、リンカーおよび／または付加配列等を有してもよい。
　前記（ａ）のポリヌクレオチドは、前記配列番号１～１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
ＳＡＬ－２０４（配列番号１）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２３６（配列番号２）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTTGGGGGTAGGCGCTGGGGTGGGTGGGAGCGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２３０（配列番号３）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２０３（配列番号４）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGCGGAGTTGTGGGGGGTCGGGGGGTGGCGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２１９（配列番号５）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGATCGGTGCTGCGGGGGTGGGTGGAGCGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２５６（配列番号６）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTCGGGGGTAGTGCCGGGGGTTGGGTGGGCAGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２４２（配列番号７）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２７８（配列番号８）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２６２（配列番号９）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－３９６（配列番号１０）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４４５（配列番号１１）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４３７（配列番号１２）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４０９（配列番号１３）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGGCCTGGTAGGTTGGTGGGGGTGGGGAGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４５５（配列番号１４）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGCGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－１０７（配列番号１５）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４３１（配列番号１６）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－１２３（配列番号１７）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGGGTGTGGTGGGTGGGGGAGGTGGTATGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
　前記（ｂ）において、「１もしくは数個」は、例えば、前記（ｂ）のポリヌクレオチドが、サルモネラに結合する範囲であればよい。前記「１もしくは数個」は、前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、例えば、１～６０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１または２個である。本発明において、塩基数および配列数等の個数の数値範囲は、例えば、その範囲に属する正の整数を全て開示するものである。つまり、例えば、「１～５塩基」との記載は、「１、２、３、４、５塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
　前記（ｃ）において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ）のポリヌクレオチドが、サルモネラに結合する範囲であればよい。前記同一性は、例えば、８０％以上、８５％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
　前記（ｄ）において、「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」は、例えば、前記（ａ）のポリヌクレオチドに対して、完全または部分的に相補的なポリヌクレオチドである。前記ハイブリダイズは、例えば、各種ハイブリダイゼーションアッセイにより検出できる。前記ハイブリダイゼーションアッセイは、特に制限されず、例えば、ザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載されている方法を採用することもできる。
　前記（ｄ）において、「ストリンジェントな条件」は、例えば、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件、高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。ストリンジェンシーの程度は、当業者であれば、例えば、温度、塩濃度、プローブの濃度および長さ、イオン強度、時間等の条件を適宜選択することで、設定可能である。「ストリンジェントな条件」は、例えば、前述したザンブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　Ｅｄ．）」〔（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）〕等に記載の条件を採用することもできる。
　前記（ｂ）～（ｄ）のポリヌクレオチドは、特に制限されない。前記（ａ）～（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、大腸菌Eschericia　coliに実質的に結合しない。「実質的に結合しない」とは、例えば、前記核酸分子と大腸菌との結合を検出した際に、検出限界以下であることも含む。
　前記（ｂ）～（ｄ）のポリヌクレオチドは、特に制限されず、具体例としては、以下のような配列が例示される。下記配列は、前述した、ＳＡＬ‐２０４（配列番号１）、ＳＡＬ－２３０（配列番号３）、ＳＡＬ－２４２（配列番号７）、ＳＡＬ－２７８（配列番号８）、ＳＡＬ－２６２（配列番号９）、ＳＡＬ－３９６（配列番号１０）、ＳＡＬ－４４５（配列番号１１）、ＳＡＬ－４３７（配列番号１２）、ＳＡＬ－４５５（配列番号１４）、ＳＡＬ－１０７（配列番号１５）、ＳＡＬ－４３１（配列番号１６）を小型化したポリヌクレオチドである。
ＳＡＬ－２０４＿ｓ４６　（配列番号２１）
GGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ－２０４＿ｒａｎｄ（配列番号２２）
GCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGG
ＳＡＬ－２３０＿ｓ４８　（配列番号２３）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ－２３０＿ｒａｎｄ（配列番号２４）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGG
ＳＡＬ－２４２＿ｓ４６　（配列番号２５）
TATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACAT
ＳＡＬ－２４２＿ｒａｎｄ（配列番号２６）
GGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGG
ＳＡＬ－２７８＿ｓ４９　（配列番号２７）
TGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCG
ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）
GTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGG
ＳＡＬ－２６２＿ｓ３６　（配列番号２９）
GGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ－２６２＿ｒａｎｄ（配列番号３０）
GCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGG
ＳＡＬ－３９６＿ｓ５５　（配列番号３１）
CCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－３９６＿ｒａｎｄ（配列番号３２）
TTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGG
ＳＡＬ－４４５＿ｓ４４　（配列番号３３）
GGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－４４５＿ｒａｎｄ（配列番号３４）
TCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTG
ＳＡＬ－４３７＿ｓ４１　（配列番号３５）
GGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTC
ＳＡＬ－４３７＿ｒａｎｄ（配列番号３６）
GCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGG
ＳＡＬ－４５５＿ｓ４２　（配列番号３７）
GGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－４５５＿ｒａｎｄ（配列番号３８）
CGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCG
ＳＡＬ－１０７＿ｓ４３　（配列番号３９）
GGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－１０７＿ｒａｎｄ（配列番号４０）
TTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTG
ＳＡＬ－４３１＿ｓ５６　（配列番号４１）
CTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAG
ＳＡＬ－４３１＿ｒａｎｄ（配列番号２０）
TGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGG
　本発明の核酸分子において、例えば、前記（ａ）は、例えば、（ａ’）配列番号２０～４１のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよく、この場合、前記（ｂ）～（ｄ）において、前記（ａ）のいずれかの塩基配列は、前記（ａ’）のいずれかの塩基配列に読み替えることができる。
　本発明の核酸分子は、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドの配列を１つ含んでもよいし、前記ポリヌクレオチドの配列を複数含んでもよい。後者の場合、複数のポリヌクレオチドの配列が連結して、一本鎖のポリヌクレオチドを形成していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、それぞれが直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、それぞれが間接的に連結してもよい。前記ポリヌクレオチドの配列は、それぞれの末端において、直接的または間接的に連結していることが好ましい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じでもよいし、異なってもよい。前記複数のポリヌクレオチドの配列は、例えば、同じであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドの配列を複数含む場合、前記配列の数は、特に制限されず、例えば、２以上であり、好ましくは２～２０であり、より好ましくは２～１０であり、より好ましくは、２または３である。
　前記リンカーは、特に制限されない。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長であり、好ましくは１～２０塩基長であり、より好ましくは３～１２塩基長であり、さらに好ましくは５～９塩基長である。前記リンカーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記リンカーの具体例として、例えば、例えば、ポリデオキシチミン（ポリｄＴ）、ポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）、ＡとＴの繰り返し配列であるポリｄＡｄＴ等があげられ、好ましくはポリｄＴ、ポリｄＡｄＴである。
　本発明の核酸分子において、前記ポリヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましい。前記一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、自己アニーリングによりステム構造およびループ構造を形成可能であることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、例えば、ステムループ構造、インターナルループ構造および／またはバルジ構造等を形成可能であることが好ましい。
　本発明の核酸分子は、例えば、二本鎖でもよい。二本鎖の場合、例えば、一方の一本鎖ポリヌクレオチドは、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドを含み、他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、制限されない。前記他方の一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前記（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドに相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。本発明の核酸分子が二本鎖の場合、例えば、使用に先立って、変性等により、一本鎖ポリヌクレオチドに解離させることが好ましい。また、解離した前記（ａ）～（ｄ）のいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドは、例えば、前述のように、ステム構造およびループ構造を形成していることが好ましい。
　本発明において、「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実際にステム構造およびループ構造を形成すること、ならびに、ステム構造およびループ構造が形成されていなくても、条件によってステム構造およびループ構造を形成可能なことも含む。「ステム構造およびループ構造を形成可能」とは、例えば、実験的に確認した場合、および、コンピュータ等のシミュレーションで予測した場合の双方を含む。
　本発明の核酸分子の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基である。前記ヌクレオチド残基は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基のみから構成されるＤＮＡ、１もしくは数個のリボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等があげられる。後者の場合、「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～７個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。
　本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の修飾化ヌクレオチド残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～７個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。
　前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化デオキシリボヌクレオチド残基および修飾化リボヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されたものがあげられる。前記糖残基は、例えば、デオキシリボース残基またはリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されず、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例は、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’－メチル化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－メチル化－シトシンヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－フルオロ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－アミノ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－アミノ化－シトシンヌクレオチド残基、２’－チオ化－ウラシルヌクレオチド残基、２’－チオ化－シトシンヌクレオチド残基等があげられる。
　前記ヌクレオチド残基における塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工塩基）でもよいし、非天然塩基（人工塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’－メチルウラシル、２’－メチルシトシン、２’－フルオロウラシル、２’－フルオロシトシン、２’－アミノウラシル、２’－アミノシトシン、２－チオウラシル、２－チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
　本発明の核酸分子は、例えば、１もしくは数個の人工核酸モノマー残基を含んでもよい。前記「１もしくは数個」は、特に制限されず、例えば、前記ポリヌクレオチドにおいて、例えば、１～９１個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～７個、特に好ましくは１～３個、最も好ましくは１または２個である。前記人工核酸モノマー残基は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ）等があげられる。前記モノマー残基における核酸は、例えば、前述と同様である。
　本発明の核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼ耐性であることが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、前記修飾化ヌクレオチド残基および／または前記人工核酸モノマー残基を有することが好ましい。本発明の核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性のため、例えば、５’末端または３’末端に、数１０ｋＤａのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）またはデオキシチミジン等が結合してもよい。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに付加配列を有してもよい。前記付加配列は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは３’末端である。前記付加配列は、特に制限されない。前記付加配列の長さは、特に制限されず、例えば、１～２００塩基長であり、好ましくは１～５０塩基長であり、より好ましくは１～２５塩基長、さらに好ましくは１８～２４塩基長である。前記付加配列の構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、デオキシリボヌクレオチド残基およびリボヌクレオチド残基等があげられる。前記付加配列は、特に制限されず、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基からなるＤＮＡ、リボヌクレオチド残基を含むＤＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。前記付加配列の具体例として、例えば、ポリｄＴ、ポリｄＡ等があげられる。
　本発明の核酸分子は、例えば、さらに標識物質を有してもよい。前記標識物質は、例えば、前記核酸分子の５’末端および３’末端の少なくとも一方に結合していることが好ましく、より好ましくは５’末端である。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体、酵素等があげられる。前記蛍光物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、ＦＡＭ色素、ローダミン色素、テキサスレッド色素、ＪＯＥ、ＭＡＸ、ＨＥＸ、ＴＹＥ等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ６４７等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。
　前記標識物質は、例えば、前記核酸分子に直接的に連結してもよいし、リンカーを介して、間接的に連結してもよい。前記リンカーは、特に制限されず、例えば、前述の例示を援用できる。
　本発明の核酸分子は、例えば、担体に固定化して使用できる。前記本発明の核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれかを固定化することが好ましく、より好ましくは３’末端である。本発明の核酸分子を固定化する場合、例えば、前記核酸分子は、前記担体に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。後者の場合、例えば、前記付加配列を介して固定化することが好ましい。
　本発明の核酸分子の製造方法は、特に制限されず、例えば、化学合成を利用した核酸合成方法等、遺伝子工学的手法、公知の方法により合成できる。
　本発明の核酸分子は、前述のように、前記サルモネラに結合性を示す。このため、本発明の核酸分子の用途は、前記サルモネラへの結合性を利用する用途であれば、特に制限されない。本発明の核酸分子は、例えば、前記サルモネラに対する抗体に代えて、種々の方法に使用できる。
　本発明の核酸分子によれば、例えば、前記サルモネラを検出でき、これによって、前記サルモネラを検出できる。前記サルモネラの検出方法は、特に制限されず、前記サルモネラと前記核酸分子との結合を検出することによって、行える。
＜検出方法＞
　本発明の検出方法は、前述のように、サルモネラの検出方法であって、試料と前記本発明の核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のサルモネラを検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の検出方法は、前記本発明の核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件等は、特に制限されない。
　本発明によれば、前記本発明の核酸分子が、サルモネラに特異的に結合することから、例えば、サルモネラと前記核酸分子との結合を検出することによって、試料中のサルモネラを特異的に検出可能である。具体的には、例えば、試料中のサルモネラの有無またはサルモネラの量を分析可能であることから、定性または定量も可能といえる。本発明によれば、サルモネラの中でも、例えば、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するサルモネラを、特異的に検出できる。
　本発明において、前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、生体由来、飲食品由来、環境由来等の試料があげられる。前記生体は、特に制限されず、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ等の非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物の生体があげられる。前記生体由来の試料は、例えば、排泄物、体液、皮膚、肉、粘膜、体毛等があげられる。前記飲食品由来の試料は、例えば、飲料、食品、食品原料等があげられる。前記環境由来の試料は、例えば、生物、水、土壌、大気等があげられる。前記水試料は、例えば、地下水、河川水、海水、生活排水等があげられる。また、前記環境由来の試料は、例えば、食品加工場、調理場等における付着物があげられる。
　前記試料は、例えば、採取したものを、そのまま本発明の検出方法に使用してもよいし、前記採取物を種として培地で培養を行い、得られた培養物を本発明の検出方法に試料として使用してもよい。前記試料は、例えば、検出結果の信頼性を向上できることから、前記採取物中に含まれる細菌量を増加させた前記培養物を使用することが好ましい。前記培養方法は、特に制限されず、例えば、従来公知の方法が採用できる。培養に使用する培地は、特に制限されず、増殖培地として、例えば、カゼインペプトン　１７ｇ／Ｌ、ソイペプトン　３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム　５ｇ／Ｌ、リン酸二カリウム　２．５ｇ／Ｌ、ブドウ糖　２．５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．３）等を含むＴＳＶ培地、サルモネラ用の選択培地として、例えば、大豆ペプトン　５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム　８ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム　１．６ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物　４０ｇ／Ｌ、マラカイトグリーン　０．０４ｇ／Ｌ（ｐＨ５．２）等を含むＲＶ培地等が使用でき、これらを、順次併用してもよい。本発明の検出方法によれば、例えば、増殖培地で培養した培養試料を、そのまま使用できる。前記本発明の核酸分子は、サルモネラに対して特異的に結合することから、例えば、様々な細菌が含まれる前記培養試料であっても、特異的にサルモネラに結合し、この結合を検出可能だからである。
　前記試料は、例えば、細菌が生存する生菌試料でもよいし、細菌が死滅した死菌試料でもよい。前者は、例えば、前述のように採取したものをそのまま使用したり、前記培養物をそのまま使用する場合があげられる。後者は、例えば、前記本発明の核酸分子との接触前または接触時において、前記試料に含まれる細菌に対する死滅処理を施す場合があげられる。前記死菌処理は、例えば、加熱処理があげられる。具体例としては、例えば、前記試料を９５℃～１００℃で１０分間加熱処理した後、前記本発明の核酸分子と接触させる形態があげられる。前記試料中にサルモネラが存在する場合、サルモネラが拡散する可能性がある。しかしながら、予め、前記試料に死滅処理を施すことによって、検出時におけるサルモネラの拡散を十分に防止し、安全性を維持することができる。
　前記試料は、例えば、液体試料でもよいし、固体試料でもよい。前記固体試料の場合、例えば、前記核酸分子と接触させ易く、取扱いが簡便であることから、液体と混合して、液体試料として使用することが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液、培地等があげられる。
　前記検出工程は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させて、前記試料中サルモネラと前記核酸分子とを結合させる接触工程と、前記サルモネラと前記核酸分子との結合を検出する結合検出工程とを含む。また、前記検出工程は、例えば、さらに、前記結合検出工程の結果に基づいて、前記試料中のサルモネラの有無または量を分析する工程を含む。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触方法は、特に制限されない。前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、液体中で行われることが好ましい。前記液体は、特に制限されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液等があげられる。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触条件は、特に制限されない。接触温度は、例えば、４～３７℃であり、好ましくは１８～２５℃であり、接触時間は、例えば、１０～１２０分であり、好ましくは３０～６０分である。
　前記接触工程において、前記試料と前記核酸分子との接触は、例えば、カリウムイオン（Ｋ＋）およびマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）の存在下で行うことが好ましい。カリウムイオンは、例えば、カリウム化合物により供給できる。前記カリウム化合物は、例えば、液体中で、イオン化してカリウムイオンを遊離する、イオン供与体があげられる。前記カリウム化合物は、例えば、カリウム塩が使用でき、具体例として、塩化カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム等があげられる。マグネシウムイオンは、例えば、マグネシウム化合物により供給できる。前記マグネシウム化合物は、例えば、液体中で、イオン化してマグネシウムイオンを遊離する、イオン供与体があげられる。前記マグネシウム化合物は、例えば、マグネシウム塩が使用でき、具体例として、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、水酸化マグネシウム等があげられる。
　前記接触工程において、前記核酸分子に接触させる前記試料中の細菌量は、特に制限されない。前記核酸分子１００ｐｍｏｌあたり、例えば、細菌１０５～１０７ｃｅｌｌｓを接触させることが好ましく、より好ましくは１０６～１０７ｃｅｌｌｓである。また、カリウムイオンおよびマグネシウムイオン存在下で接触工程を行う場合、前記核酸分子２００ｆｍｏｌあたり、カリウムイオンは、例えば、１００～１０００ｎｍｏｌであり、より好ましくは５００～１０００ｎｍｏｌであり、さらに好ましくは５００ｎｍｏｌであり、マグネシウムイオンは、例えば、１００～１０００ｎｍｏｌであり、より好ましくは１００～５００ｎｍｏｌであり、さらに好ましくは１００ｎｍｏｌである。
　前記接触工程において、前記核酸分子は、例えば、担体に固定化された固定化核酸分子でもよいし、未固定の遊離した核酸分子でもよい。後者の場合、例えば、容器内で、前記試料と接触させる。前記核酸分子は、例えば、取扱性に優れることから、前記固定化核酸分子が好ましい。前記担体は、特に制限されず、例えば、基板、ビーズ、容器等があげられ、前記容器は、例えば、マイクロプレート、チューブ等があげられる。前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。
　前記結合検出工程は、前述のように、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子との結合を検出する工程である。前記両者の結合の有無を検出することによって、例えば、前記試料中のサルモネラの有無を分析（定性）でき、また、前記両者の結合の程度（結合量）を検出することによって、例えば、前記試料中のサルモネラの量を分析（定量）できる。
　そして、前記サルモネラと前記核酸分子との結合が検出できなかった場合は、前記試料中にサルモネラは存在しないと判断でき、前記結合が検出された場合は、前記試料中にサルモネラが存在すると判断できる。また、予め、サルモネラの細菌数と、結合量との相関関係を求めておき、前記相関関係に基づいて、前記結合量から、前記試料中のサルモネラの細菌数を分析することもできる。
　前記サルモネラと前記核酸分子との結合の検出方法は、特に制限されない。前記方法は、例えば、物質間の結合を検出する従来公知の方法が採用でき、具体例として、前述のＳＰＲ、蛍光偏光法等があげられる。また、前記結合は、例えば、前記サルモネラと前記核酸分子との複合体の検出でもよい。
　前記蛍光偏光法は、一般に、偏光励起光を前記標識物質に照射した際、前記標識物質から発せられる蛍光が、前記標識物質で標識された分子の分子量に応じて異なった偏光度を示すという特性に基づく測定方法である。本発明においては、例えば、前記標識物質で標識化した前記核酸分子（標識化核酸分子）を使用することで、前記蛍光偏光法により前記サルモネラと前記核酸分子との結合を検出することができる。具体的には、前記標識化核酸分子は、サルモネラと未結合の状態とサルモネラと結合した状態を比較した場合、前者は、相対的に分子量が小さいため、相対的に偏光度が高く、一方、後者は、相対的に分子量が大きいため、相対的に偏光度が低い。このため、例えば、試料と接触させる前の前記標識化核酸分子の偏光度と、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の前記偏光度とを比較することで、サルモネラと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。また、サルモネラと未結合の前記標識化核酸分子およびサルモネラと結合した前記標識化核酸分子の少なくとも一方の偏光度を評価基準として、前記試料と接触させた後の前記標識化核酸分子の偏光度を評価することでも、サルモネラと前記標識化核酸分子との結合を検出できる。
　前記蛍光偏光法によれば、例えば、前記本発明の核酸分子を、前記標識物質で標識化するのみで、センサとして容易に使用できる。また、前記標識物質は、その種類によって検出波長が異なるため、例えば、試料の種類に応じて前記標識物質を選択することで、前記試料由来の蛍光の影響を低減することもできる。
　前記標識化核酸分子は、例えば、前記本発明の核酸分子が前記標識物質で標識化されていればよく、その標識方法は、特に制限されない。
　前記標識化核酸分子としては、例えば、前記本発明の核酸分子に前記標識物質が連結した形態があげられる。この形態は、例えば、前述の記載が援用でき、前記本発明の核酸分子に、前記標識物質が直接的に連結してもよいし、前述のようにリンカー等を介して前記標識物質が間接的に連結してもよい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、０～１０塩基長であり、好ましくは０～７塩基長であり、より好ましくは、０～５塩基長である。前記標識物質は、例えば、前記本発明の核酸分子のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよく、好ましくは、５’末端である。
　前記標識化核酸分子としては、この他に、例えば、前記本発明の核酸分子と、これに相補的であって且つ標識物質が連結した相補鎖（以下、「標識化相補鎖」ともいう）とを含み、前記核酸分子と前記標識化相補鎖とがハイブリダイズしたハイブリッド分子があげられる。
　前記相補鎖は、例えば、前記本発明の核酸分子の一部に相補的な配列を有していればよく、前記相補的な配列のみから構成されてもよいし、前記相補的な配列を含んでもよい。前記相補鎖は、前記本発明の核酸分子のどの領域に対して相補的でもよく、好ましくは、５’末端領域または３’末端領域に相補的である。また、例えば、前記本発明の核酸分子が、その５’末端または３’末端にリンカーを有し、前記相補的な配列は、前記リンカーに相補的であることが好ましい。前記リンカーの長さは、特に制限されず、例えば、１０～３０塩基長であり、好ましくは１５～２５塩基長であり、より好ましくは、１８～２４塩基長である。前記相補鎖の長さは、特に制限されず、例えば、１０～３０塩基長であり、好ましくは１５～２５塩基長であり、より好ましくは、１８～２４塩基長である。
　前記標識化相補鎖において、前記標識物質は、例えば、前記相補鎖のいずれの部位に連結されてもよく、具体例としては、５’末端および３’末端があげられ、両末端に連結してもよいし、いずれか一方の末端に連結してもよい。前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の３’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の５’末端に連結することが好ましく、前記標識化相補鎖が、前記本発明の核酸分子の５’末端領域に相補的な場合、前記標識物質は、前記相補鎖の３’末端に連結することが好ましい。
　前記標識物質は、特に制限されず、前述した例示を援用でき、中でも前記蛍光物質および前記色素が好ましい。
　前記蛍光偏光法を採用する場合、本発明の検出方法は、例えば、前記試料と前記核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記標識化核酸分子とを結合させる接触工程と、前記標識化核酸分子に偏光励起光を照射して、前記標識化核酸分子の偏光度を測定する測定工程と、前記測定工程における測定結果と評価基準とを比較し、サルモネラと前記標識化核酸分子との結合を検出する工程を検出する検出工程を含むことが好ましい。
　前記測定工程において、前記偏光励起光の波長および前記偏光度の検出波長は、特に制限されず、例えば、前記標識物質の種類に応じて適宜設定できる。具体例として、前記標識物質がＡｌｅｘａ６４７の場合、前記偏光励起光の波長は、例えば、６２０～６８０ｎｍであり、偏光度の検出波長は、例えば、６６０～８００ｎｍである。前記偏光励起光の照射時間は、特に制限されず、例えば、１ナノ～５ナノ秒があげられる。
　前記検出工程において、前記評価基準は、例えば、予め決定してもよいし、測定ごとに決定してもよい。前記評価基準としては、例えば、サルモネラ未結合の基準、サルモネラ結合の基準が設定できる。前者の基準は、例えば、サルモネラが結合していない前記標識化核酸分子のみの偏光度であり、後者の基準は、例えば、サルモネラが結合した前記標識化核酸分子の偏光度である。
　前者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも高ければ、サルモネラが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのサルモネラが存在すると判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または低ければ、サルモネラが存在しないと判断できる。前者の基準は、例えば、前記接触工程前の前記標識化核酸分子の偏光度でもよい。
　また、後者の基準を用いる場合は、例えば、前記測定工程における測定値が、前記基準よりも低ければ、サルモネラが存在しないと判断できる。他方、前記測定工程における測定値が、前記基準と同程度または高ければ、サルモネラが存在すると判断でき、また、前記基準よりも相対的に高ければ、相対的に多くのサルモネラが存在すると判断できる。
　また、前記基準は、サルモネラの量と偏光度との相関関係であってもよい。例えば、複数の既知濃度のサルモネラと所定量の前記標識化核酸分子とを接触させ、各濃度のサルモネラに結合した前記標識化核酸分子の偏光度を測定することにより、前記相関関係を示す相関式が得られる。そして、この相関式と、前記測定工程における測定値とから、前記試料におけるサルモネラの量を判断することができる。
＜検出試薬およびキット＞
　本発明の検出試薬は、前述のように、サルモネラの検出試薬であって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出試薬は、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出試薬を使用すれば、前述のように、例えば、前記サルモネラの検出等を行うことができる。
　本発明の検出キットは、前述のように、サルモネラの検出キットであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出キットは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出キットを使用すれば、前述のように、例えば、前記サルモネラの検出等を容易に行うことができる。
　本発明の検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の他に、その他の構成要素を含んでもよい。前記構成要素は、例えば、前記担体、前記試料を培養するための培地、緩衝液、マグネシウム化合物およびカリウム化合物、使用説明書等があげられる。
　本発明の検出試薬および検出キットは、例えば、前記本発明の核酸分子の説明を援用でき、また、その使用方法についても、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
＜検出デバイス＞
　本発明の検出デバイスは、前述のように、サルモネラの検出デバイスであって、前記本発明の核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の検出デバイスは、前記本発明の核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。本発明の検出デバイスを使用すれば、前述のように、例えば、前記サルモネラの検出等を行うことができる。
　本発明の検出デバイスは、例えば、さらに担体を有し、前記担体に前記核酸分子が配置されている。前記核酸分子は、前記担体に固定化されていることが好ましい。前記担体の種類および前記核酸分子の固定化は、例えば、前述の通りである。本発明の検出デバイスの使用方法は、特に制限されず、前記本発明の核酸分子および前記本発明の検出方法を援用できる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
［実施例１］
　各アプタマーについて、サルモネラに対する結合能を確認した。
（１）アプタマー
　下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
ＳＡＬ－１０７（配列番号１５）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ‐２０４（配列番号１）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２３０（配列番号３）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２４２（配列番号７）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２６２（配列番号９）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２７８（配列番号８）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－３９６（配列番号１０）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４３１（配列番号１６）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４３７（配列番号１２）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４４５（配列番号１１）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－４５５（配列番号１４）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGCGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
　比較例として、サルモネラに結合する公知のアプタマー（ＳＡＬ－３３）を使用した（非特許文献１：Molecular　and　Cellular　Probes　23、　2009、　20-28）。前記アプタマーの配列を以下に示す。
ＳＡＬ－３３（配列番号１８）
TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGCTATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAGATTTCTCCTACTGGGATAGGTGGATTAT
　また、４０塩基長のランダム配列（Ｎ）４０を含む配列番号１９で表わされるオリゴヌクレオチドからなるＤＮＡを複数含むＤＮＡライブラリーを、ネガティブコントロールＮ４０とした。下記配列において、「Ｎ」は、デオキシリボヌクレオチド残基であり、その核酸は、アデニン、グアニン、シトシンおよび／またはチミンとした。
Ｎ４０（配列番号１９）
　CCTGCACCCAGTGTCCC-(N)40-GACGGAGAGGAGGACGG
　前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。
（２）細菌試料
　細菌は、Salmonella　enteritidis、Salmonella　typhimurium、Salmonella　infantis、Citrobacter　freundiiおよびEschericia　coli（ＤＨ５ａ）を使用した。各細菌を、１００℃、１０分間の加熱処理によって、死滅させた。前記死滅した細菌を、光路長１ｃｍでの波長６００ｎｍの吸光度が０．１となるように、ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ　ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ　ＫＣｌ、１．４８ｍｍｏｌ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で希釈した。この希釈試料を、以下のＳＰＲに使用した。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
　結合能の解析には、ProteON　XPR36（BioRad社）を、その使用説明書にしたがって使用した。
　まず、前記ProteON専用のセンサーチップとして、ストレプトアビジンが固定化されたチップ（商品名　ProteOn　NLC　Sensor　Chip、BioRad社）を、前記ProteON　XPR36にセットした。前記センサーチップのフローセルに、超純水（ＤＤＷ）を用いて、５０００ｎｍｏｌ／Ｌのリガンドをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　Ｕｎｉｔ）が約１０００ＲＵになるまで結合させた。前記リガンドは、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端をビオチン化した、ビオチン化ポリｄＴを使用した。そして、前記チップの前記フローセルに、ＳＰＲバッファーを用いて、４００ｎｍｏｌ／Ｌの前記ポリｄＡ付加アプタマーを、流速２５μＬ／ｍｉｎで８０秒間インジェクションし、シグナル強度が約７００ＲＵになるまで結合させた。続いて、前記希釈試料（Ａｂｓ．６００＝０．１）を、ＳＰＲバッファーを用いて、流速５０μＬ／ｍｉｎで１２０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で、ＳＰＲバッファーを流して洗浄を行った。前記希釈試料のインジェクションおよび前記ＳＰＲバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。
　前記ＳＰＲバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨは、７．４とした。
　そして、前記希釈試料のインジェクション開始を０秒として、１１５秒～１２５秒におけるＲＵの最大値（ＲＵｍａｘ）と、３５５～３６５秒におけるＲＵの平均値（ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ）とを求め、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘを算出した。ＲＵｍａｘは、試料のインジェクション時におけるアプタマーへのターゲットの結合量を示し、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔは、洗浄時におけるアプタマーへのターゲットの結合量を示す。ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘは、値が高い程、アプタマーとターゲットとの結合が、洗浄によって乖離し難いことを意味する。
　ＲＵｍａｘの結果を下記表１に、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘの結果を図１および図２に示す。図１および図２は、各細菌に対する各アプタマーの結合能を示すグラフであり、図１（Ａ）がSalmonella　enteritidis、（Ｂ）がSalmonella　typhimurium、（Ｃ）がSalmonella　infantis、図２がCitrobacter　freundiiに対する各アプタマーの結合能を示すグラフである。図１および図２のグラフにおいて、縦軸は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、大腸菌には結合しなかった。また、図２に示すように、実施例のアプタマーは、Citrobacter　freundiiに対し、インジェクション時に若干の結合（ＲＵｍａｘ）を示すものの、洗浄により解離した結果、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘがマイナス（実質的に結合無し）を示した。これに対して、比較例の公知アプタマーＳＡＬ－３３は、Citrobacter　freundiiに結合し、洗浄後も結合が維持された。
　さらに、図１に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、比較例の公知アプタマーより、Salmonella　enteritidisに対して優れた結合能を示し、Salmonella　typhimuriumおよびSalmonella　infantisに対しても、優れた結合能を示した。中でも、ＳＡＬ－２３０、ＳＡＬ－２６２、ＳＡＬ－３９６、ＳＡＬ－４３１およびＳＡＬ－４３７は、前記希釈試料のインジェクション時において優れた結合能を示し、且つ、洗浄によっても、サルモネラとの結合が十分に維持できた。これらの結果から、実施例のアプタマーは、優れた結合能でかつ特異的に各サルモネラに結合できることがわかった。
［実施例２］
　各アプタマーについて、サルモネラに対する結合能を確認した。
（１）アプタマー
　下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。
ＳＡＬ－１２３（配列番号１７）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGTTGGGTGTGGTGGGTGGGGGAGGTGGTATGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
ＳＡＬ－２１９（配列番号５）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGGGATCGGTGCTGCGGGGGTGGGTGGAGCGGGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－２３６（配列番号２）
GGTATCAACGCCTCTCAGTGAATTGTTGGGGGTAGGCGCTGGGGTGGGTGGGAGCGCAAAGGTTTCGGACGGACATATC
ＳＡＬ－４０９（配列番号１３）
GGAAATCTGCCCTTGTCCCTAAAGGGCCTGGTAGGTTGGTGGGGGTGGGGAGGGCAAAGCCGTCGAGTGGGTATTC
（２）ＳＰＲによる結合能の解析
　サルモネラとして、Salmonella　enteritidisを使用し、アプタマーとして、前記（１）のアプタマーを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、結合能を解析した。ＲＵｍａｘの結果を下記表２に、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘの結果を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記表２および図３に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、大腸菌には結合せず、Salmonella　enteritidisに対して、優れた結合能を示した。
［実施例３］
　アプタマーを用いたＥＬＡＡ（Enzyme‐linked　Aptamer　Assay）により、サルモネラの検出を行った。
（１）アプタマー
　前記実施例１で使用したＳＡＬ－２３０（配列番号３）、ＳＡＬ－２６２（配列番号９）、ＳＡＬ－３９６（配列番号１０）、ＳＡＬ－４３１（配列番号１６）、ＳＡＬ－４３７（配列番号１２）、ＳＡＬ－２４２（配列番号７）、ＳＡＬ－１０７（配列番号１５）、ＳＡＬ‐２０４（配列番号１）、ＳＡＬ－２７８（配列番号８）、ＳＡＬ－４５５（配列番号１４）を使用した。
　前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＥＬＡＡに使用した。
（２）細菌試料
　前記実施例と同様に、Salmonella　enteritidis、Salmonella　typhimurium、Salmonella　infantisおよびEschericia　coli（ＤＨ５ａ）の死滅細菌を使用した。前記細菌を、光長１ｃｍでの波長６００ｎｍの吸光度が０．１となるように、ＰＢＳ緩衝液で希釈した。この希釈試料を、以下のＥＬＡＡで使用した。
（３）ＥＬＡＡ
　使用した試薬等の組成を以下に示す。
固相化液：
　ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ　ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ　ＫＣｌ、１．４８ｍｍｏｌ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）
ブロッキング液：
　Protein　Free（TBS）ブロッキングバッファー（PIERCE社）
希釈液：
　５０ｍｍｏｌ/Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍｍｏｌ/Ｌ　ＮａＣｌ、１ｍｍｏｌ/Ｌ　ＭｇＣｌ２、５ｍｍｏｌ/Ｌ　ＫＣｌ
洗浄液：
　ＰＢＳ緩衝液（１３７ｍｍｏｌ　ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ　ＫＣｌ、１．４８ｍｍｏｌ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０
基質：
　TMBE　Peroxidase　Substrate　ELISA（MOSS社）
停止液：
　０．５Ｎ（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）　Ｈ２ＳＯ４
　９６穴プレート（商品名　Nunc-Immuno（登録商標）　plate，　Maxisorp（登録商標）、Nunc社）に、前記希釈試料を、ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩吸着させた。前記ウェルを２００μＬの洗浄液で洗浄後、ブロッキング液を２００μＬ加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、前記ウェルを２００μＬの前記洗浄液で３回洗浄し、前記希釈試料中の死菌を固定化したプレートを作製した。
　そして、希釈液で、前記ポリｄＡ付加アプタマーを１μｍｏｌ／Ｌに希釈した後、前記ウェルに１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。つぎに、希釈液で１μｍｏｌ/Ｌに希釈したビオチン化ポリｄＴを、前記ウェルに１００μＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。前記ビオチン化ポリｄＴは、前記実施例１と同じものを使用した。これにより、プレートに固定化された死菌にアプタマーが結合し、さらに、前記アプタマーにおけるポリｄＡに、ビオチン化ポリｄＴが結合する。
　続いて、前記ウェルを洗浄液で洗浄した後、１０００倍希釈したストレプトアビジン－セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ－ＨＲＰ、ＧＥ社、＃ＲＰＮ１２３１Ｖ）を１００μＬ添加し、室温で３０分間反応させた。さらに、前記ウェルを洗浄液で洗浄した後、基質１００μＬを添加し、室温で１５分間、発色反応させた。その後、前記ウェルに１００μＬの停止液を加え、反応を停止した後、プレートリーダー（商品名　Microplate　Reader　Sunrise　Remote、TECAN社）で、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した（ｎ＝３）。
　また、ブランクとして、前記ポリｄＡアプタマーを未添加とし、前記死菌が固定化されたプレートに、前記ビオチン化ポリｄＴを添加して、同様にＥＬＡＡを行った。
　そして、ブランクの吸光度を１として、各反応について相対値を求めた。これらの結果を図４に示す。図４は、アプタマーとサルモネラとの結合を示すグラフである。図４において、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度の相対値である。各アプタマーについて、各アプタマーについて、（Ａ）がSalmonella　enteritidis、（Ｂ）がSalmonella　typhimurium、（Ｃ）がSalmonella　infantisに対する結合能を示す。
　図４に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、ネガティブコントロール（ｐｏｌｙｄＴ）と比較して、サルモネラに対して優れた結合能を示した。
［実施例４］
　各アプタマーについて、サルモネラに対する結合を確認した。
（１）アプタマー
　前記ＳＡＬ－２３０（配列番号３）およびＳＡＬ－２７８（配列番号８）を小型化した下記ポリヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。前記アプタマーは、さらに、その３’末端に、２０塩基長のポリｄＡを付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。
ＳＡＬ－２３０＿ｓ４８　（配列番号２３）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ－２３０＿ｒａｎｄ（配列番号２４）
GGTTGTGGTTGGTGGGGGGTGCGGAGGGTGGG
ＳＡＬ－２７８＿ｓ４９　（配列番号２７）
TGAATTGTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGGCAAAGGTTTCG
ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）
GTGGTAGGGAGATGTGGGGGTGGGTAGGAGGG
（２）ＳＰＲによる結合能の解析
　サルモネラとしてSalmonella　enteritidis、Salmonella　typhimuriumおよびSalmonella　infantisを使用し、アプタマーとして、前記（１）のアプタマーを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、結合能を解析した。
　ＲＵｍａｘの結果を下記表３に、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘの結果を図５に示す。図５は、各サルモネラに対する各アプタマーの結合能を示すグラフである。図５のグラフにおいて、縦軸は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔ／ＲＵｍａｘである。各アプタマーについて、（Ａ）がSalmonella　enteritidis、（Ｂ）がSalmonella　typhimurium、（Ｃ）がSalmonella　infantisに対する結合能を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図５に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、（Ａ）Salmonella　enteritidis、（Ｂ）Salmonella　typhimuriumおよび（Ｃ）Salmonella　infantisに対して優れた結合能を示した。この結果から、実施例のアプタマーは、優れた結合能で各サルモネラに結合できることがわかった。
［実施例５］
　アプタマーを用いたＥＬＡＡにより、サルモネラの検出を行った。
（１）アプタマー
　前記実施例４の小型化アプタマーである、ＳＡＬ－２３０＿ｓ４８（配列番号２３）、ＳＡＬ－２３０＿ｒａｎｄ（配列番号２４）、ＳＡＬ－２７８＿ｓ４９（配列番号２７）およびＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）を使用した。また、前記ＳＡＬ－２０４、ＳＡＬ－２４２（配列番号７）、ＳＡＬ－２６２（配列番号９）、ＳＡＬ－３９６（配列番号１０）、ＳＡＬ－４４５（配列番号１１）、ＳＡＬ－４３７（配列番号１２）、ＳＡＬ－４５５（配列番号１４）、ＳＡＬ－１０７（配列番号１５）およびＳＡＬ－４３１（配列番号１６）を小型化した下記ヌクレオチドを合成し、実施例のアプタマーとした。前記アプタマーは、その３’末端に、２０塩基長のポリｄＡを付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＥＬＡＡに使用した。また、ネガティブコントロールとして、前記実施例１と同様のＮ４０を使用し、その３’末端に、同様にしてポリｄＡを付加し、前記ＥＬＡＡに使用した。
ＳＡＬ－２０４＿ｓ４６　（配列番号２１）
GGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ－２０４＿ｒａｎｄ（配列番号２２）
GCGGGGGTGGATAGTACAGGGTGGGTAGGGGG
ＳＡＬ－２４２＿ｓ４６　（配列番号２５）
TATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGGCAAAGGTTTCGGACGGACAT
ＳＡＬ－２４２＿ｒａｎｄ（配列番号２６）
GGGTGCTATGTGGTTGGGGGGGGGAGGGAGGG
ＳＡＬ－２６２＿ｓ３６　（配列番号２９）
GGTGGGGGGGGTGGGCGCGGCAAAGGTTTCGGACGG
ＳＡＬ－２６２＿ｒａｎｄ（配列番号３０）
GCCGCGTGAAGAGGTGGGGGGGGTGGGCGCGG
ＳＡＬ－３９６＿ｓ５５　（配列番号３１）
CCCTAAAGTTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－３９６＿ｒａｎｄ（配列番号３２）
TTGCGGGTGTTGTGGGGGTGGGTTGGTGGG
ＳＡＬ－４４５＿ｓ４４　（配列番号３３）
GGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－４４５＿ｒａｎｄ（配列番号３４）
TCCGGGGTGGGGGGGGGAGGTGGTGGTGTG
ＳＡＬ－４３７＿ｓ４１　（配列番号３５）
GGCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGGCAAAGCCGTC
ＳＡＬ－４３７＿ｒａｎｄ（配列番号３６）
GCGGCTACGGGGTGGGTGGGAGTAACTGGG
ＳＡＬ－４５５＿ｓ４２　（配列番号３７）
GGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－４５５＿ｒａｎｄ（配列番号３８）
CGTGCGGTGGAGAGGTGGGGGGGTGGGCCG
ＳＡＬ－１０７＿ｓ４３　（配列番号３９）
GGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTGCAAAGCCGTCGAGTGGG
ＳＡＬ－１０７＿ｒａｎｄ（配列番号４０）
TTGTGGTTGGTGGGGGGTGGGTGGTGGGTG
ＳＡＬ－４３１＿ｓ５６　（配列番号４１）
CTTGTCCCTAAAGTGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGGACAAAGCCGTCGAG
ＳＡＬ－４３１＿ｒａｎｄ（配列番号２０）
TGGAGCGGGGTGGGTGTGGTGGGTGAGGG
（２）ＥＬＡＡ
　サルモネラとして、Salmonella　enteritidisを使用し、アプタマーとして、前記（１）のアプタマーを使用した以外は、前記実施例３と同様にしてサルモネラの検出を行った。ブランクの吸光度を１として、各反応について相対値を求めた結果を図６に示す。
　図６は、アプタマーとサルモネラの結合を示すグラフである。図６において、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度の相対値である。図６に示すように、実施例のいずれのアプタマーも、サルモネラに対して、前記ネガティブコントロールＮ４０（Ｏ　ｐｏｏｌ）よりも優れた結合能を示した。
［実施例６］
　各アプタマーについて、サルモネラに対する結合の特異性を確認した。
（１）アプタマー
　前記実施例４の小型化アプタマーＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）を使用した。前記アプタマーは、その３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーとして、後述するＳＰＲに使用した。また、ネガティブコントロールとして、３０塩基のランダム配列（Ｎ）３０を含む配列番号４２で表されるオリゴヌクレオチドを複数含むＤＮＡライブラリーを、ネガティブコントロールＮ３０とし、その３’末端に、同様にしてポリｄＡを付加し、後述するＳＰＲに使用した。下記配列において、「Ｎ」は、Ｎ４０と同様とした。
Ｎ３０（配列番号４２）
　CCTGCACCCAGTGTCCC-(N)30-GACGGAGAGGAGGACGG
（２）細菌試料
　細菌は、Salmonella　enteritidis（ＳＥ）、Salmonella　typhimurium（ＳＴ）、Eschericia　coli　O157:H7（０１５７）、Listeria　monocytogenes　4a（ＬＭ４ａ）およびListeria　monocytogenes　1／2a（ＬＭ１／２ａ）を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、希釈試料を調製し、以下のＳＰＲに使用した。
（３）ＳＰＲによる結合能の解析
　前記ＳＰＲバッファーの組成を、４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、ｐＨを、７．４とした以外は、前記実施例１（３）と同様にして、結合能を解析した。ＲＵｍａｘおよびＲＵｃｏｎｓｔａｎｔの結果を図７に示す。
　図７は、アプタマーの結合能を示すグラフである。図７において、（Ａ）は、ＲＵｍａｘの結果を示し、（Ｂ）は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔの結果を示す。図７において、横軸は、アプタマーの種類を示し、（Ａ）において、縦軸は、ＲＵｍａｘを示し、（Ｂ）において、縦軸は、ＲＵｃｏｎｓｔａｎｔを示す。図７に示すように、ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄは、ネガティブコントロールに対して、サルモネラに優れた結合能を示した。また、ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄは、Eschericia　coli　O157:H7、Listeria　monocytogenes　4aおよびListeria　monocytogenes　1/2aには結合せず、Salmonella　enteritidisおよびSalmonella　typhimuriumのみに対して、優れた結合能を示した。
［実施例７］
　標識化相補鎖とアプタマーとをハイブリダイズした標識化アプタマーを用いた蛍光偏光法により、サルモネラの検出を行った。
（１）標識化アプタマー
　まず、前記実施例４の小型化アプタマーＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）の３’末端に、２４塩基長のポリデオキシアデニン（ポリｄＡ）を付加し、ポリｄＡ付加アプタマーを調製した。このポリｄＡ付加アプタマー（１ｎｍｏｌ／Ｌ）を、９５℃で３分処理した後、１分間氷冷してフォールディングさせた。
　他方、標識化相補鎖として、２４塩基長のデオキシチミジンの５’末端をＡｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で標識した標識化ポリｄＴを調製した。そして、ＳＢ１Ｔ緩衝液（４０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＫＣｌ、１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）中で、前記フォールディングさせた前記ポリｄＡ付加アプタマーと前記標識化ポリｄＴとを、室温で１０分間インキュベートし、前記ポリｄＡ付加アプタマーのポリｄＡ部分に前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせ、標識化ハイブリッドアプタマーを調製した。
　また、ネガティブコントロールとして、前記小型化アプタマーに代えて前記実施例１と同様のＮ４０を使用し、その３’末端に、同様にしてポリｄＡを付加し、前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせ、標識化ハイブリッドアプタマーを調製した。
（２）細菌試料
　細菌は、Salmonella　enteritidis（ＳＥ）、Salmonella　typhimurium（ＳＴ）、Eschericia　coli　O157:H7（Ｏ１５７）、Listeria　monocytogenes　4a（ＬＭ４ａ）およびListeria　monocytogenes　1／2a（ＬＭ１／２ａ）を使用し、ＰＢＳ緩衝液に代えて、前記ＳＢ１Ｔ緩衝液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、希釈試料を調製した。また、前記希釈試料に代えて、ＳＢ１Ｔ緩衝液を使用し、これをコントロールとした。
（３）蛍光偏光法による解析
　前記（１）で調製した１ｎｍｏｌ／Ｌの前記標識化ハイブリッドアプタマー１μＬに、前記希釈試料中の死菌の濃度が１０８細胞／ｍＬとなるよう前記希釈試料を添加し、室温１５分間反応させた。これにより、前記標識化アプタマーとサルモネラとの複合体を形成させた。前記反応後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　Ｐｒｏ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、前記反応液の蛍光偏光度を測定した。偏光励起光の波長は、６３５ｎｍとし、偏光度の検出波長は、６６５ｎｍとした（以下、同様）。偏光度の測定結果を図８に示す。
　図８は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図８において、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、蛍光偏光度を示す。前記ポリｄＡ付加アプタマーには、前記標識化ポリｄＴがハイブリダイズしているため、前記ポリｄＡ付加アプタマーのアプタマー部分にサルモネラが結合すると、分子量の増大により、蛍光偏光度が増加する。図８に示すように、ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄは、ネガティブコントロールよりも、サルモネラに対して高い蛍光偏光度を示した。このことから、蛍光偏光度により、ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄがサルモネラに結合することがわかった。また、ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄは、Eschericia　coli　O157:H7、Listeria　monocytogenes　4aおよびListeria　monocytogenes　1/2aに対して、ネガティブコントロールと同等の蛍光偏光度を示した。このことから、蛍光偏光度により、ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄがサルモネラ以外に結合しないことがわかった。
［実施例８］
　アプタマーを用いた蛍光偏光法により、サルモネラの検出を行った。
（１）標識化アプタマー
　前記実施例４の小型化アプタマーＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄ（配列番号２８）を用いて、以下に示すように、３種類の標識化アプタマーを調製した。１つ目の標識化アプタマーは、標識化相補鎖とハイブリダイズさせた標識化ハイブリッドアプタマーであり、前記実施例７と同じものを使用した。２つ目の標識化アプタマーは、前記小型化アプタマーの５’末端に５塩基のポリｄＴを付加し、前記ポリｄＴの５’末端をＡｌｅｘａ６４７で標識したものを使用した（５’末端標識アプタマー）。３つ目の標識化アプタマーは、前記小型化アプタマーの３’末端に５塩基のポリｄＴを付加し、前記ポリｄＴの３’末端をＡｌｅｘａ６４７で標識したものを使用した（３’末端標識アプタマー）。
　また、ネガティブコントロールとして、前記実施例６のＮ３０を使用し、３’末端に２０塩基のポリＡを付加し、前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせた標識化ハイブリッドアプタマーを使用した。
（２）細菌試料
　細菌は、Salmonella　typhimuriumを用い、ＰＢＳ緩衝液に代えてＳＢ１Ｔ緩衝液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、希釈試料を調製した。また、前記希釈試料に代えて、ＳＢ１Ｔ緩衝液を使用し、これをコントロールとした。
（３）蛍光偏光法による解析
　前記（１）の各標識化アプタマーを使用した以外は、前記実施例７（３）と同様にして、蛍光偏光度を測定した。蛍光偏光度の測定結果を図９に示す。
　図９は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図９において、横軸は、アプタマーの種類を示し、縦軸は、蛍光偏光度を示す。前記各標識化アプタマーは、それぞれ標識物質で標識化されているため、前記各標識アプタマーのアプタマー部分にサルモネラが結合すると、分子量の増大により、蛍光偏光度が増加する。図９に示すように、標識化ハイブリッドアプタマー（ハイブリッド）、前記５’末端標識アプタマー（５’標識）および前記３’末端標識アプタマー（３’標識）は、それぞれ、ネガティブコントロールよりも、サルモネラに対して高い蛍光偏光度を示した。中でも、前記５’末端標識アプタマーおよび前記３’末端標識アプタマーは、高い蛍光偏光度を示し、特に、前記５’末端標識アプタマーが、極めて高い蛍光偏光度を示した。これらの結果から、蛍光偏光法により、ＳＡＬ－２７８＿ｒａｎｄが、サルモネラに結合することがわかった。
［実施例９］
　アプタマーを用いた蛍光偏光法により、サルモネラの検出を行った。
（１）アプタマー
　前記実施例８の５’末端標識アプタマーを使用した。また、ネガティブコントロールとして、前記実施例１のＮ４０の３’末端に２０塩基のポリｄＡを付加し、前記標識化ポリｄＴをハイブリダイズさせた標識化ハイブリッドアプタマーを使用した。
（２）細菌試料
　細菌は、Salmonella　typhimuriumを用い、ＰＢＳ緩衝液に代えてＳＢ１Ｔ緩衝液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、ＳＢ１Ｔ希釈試料を調製した。また、ＰＢＳ緩衝液に代えて、トリプトソーヤブイヨン（ＴＳＢ）培養液を使用した以外は、前記実施例１（２）と同様にして、ＴＢＳ希釈試料を調製した。
（３）蛍光偏光法による解析
　前記（１）の標識化アプタマーを使用し、前記希釈試料における死菌の濃度が、所定濃度（１０６細胞／ｍＬ、１０７細胞／ｍＬまたは１０８細胞／ｍＬ）となるように前記各希釈試料を添加した以外は、前記実施例７（３）と同様にして、前記反応液の蛍光偏光度を測定した。蛍光偏光度の測定結果を図１０に示す。
　図１０は、蛍光偏光度の結果を示すグラフである。図１０において、（Ａ）は、前記ＳＢ１Ｔ希釈試料を用いた結果であり、（Ｂ）は、前記ＴＢＳ希釈試料を用いた結果である。図１０（Ａ）および（Ｂ）において、横軸は、サルモネラの濃度を示し、縦軸は、蛍光偏光度を示す。図１０（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前記ＳＢＴ１希釈試料および前記ＴＢＳ希釈試料のいずれを使用した場合も、ネガティブコントロールに対して、高い蛍光偏光度を示し、１０６細胞／ｍＬのサルモネラ濃度であっても、蛍光偏光法により、サルモネラを検出できることがわかった。
［実施例１０］
　アプタマーを用いたＥＬＡＡにより、アプタマーのサルモネラに対する解離定数を測定した。
（１）アプタマー
　前記実施例１で使用したＳＡＬ－２７８（配列番号８）の３’末端をビオチン化したビオチン化アプタマーを使用した。
（２）細菌試料
　前記実施例３と同様に、Salmonella　enteritidisおよびSalmonella　typhimuriumの死滅細菌を使用した。前記細菌を、１×１０８細胞／ｍＬとなるように、ＰＢＳ緩衝液で希釈した。この希釈試料を、以下のＥＬＡＡで使用した。
（３）ＥＬＡＡ
　プレートとして、９６穴プレート（商品名　ＰＳ－ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ、ｇｒｅｉｎａｒ　ｂｉｏ－ｏｎｅ社）を用いた以外は、前記実施例３と同様にして、前記希釈試料中の死菌を固定化したプレートを作製した。そして、前記希釈液で、前記ポリｄＡ付加アプタマーを所定濃度（０．０６、０．１２５、０．２５、０．５、１または２μｍｏｌ／Ｌ）に希釈した後、前記ウェルに１００μＬ添加した以外は、前記実施例３と同様にして、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した（ｎ＝３）。
　また、ブランクとして、前記ビオチン化アプタマーを未添加とし、同様にＥＬＡＡを行った。そして、前記吸光度のフィッティングカーブから、前記ビオチン化アプタマーのサルモネラに対する解離定数を算出した。
　これらの結果を図１１に示す。図１１は、アプタマーとサルモネラとの結合を示すグラフである。図１１において、横軸は、アプタマーの濃度を示し、縦軸は、前記結合能を示す波長４５０ｎｍの吸光度を示し、図中の黒抜きの丸（●）は、Salmonella　enteritidisを用いた場合の結果を示し、白抜きの丸（○）は、Salmonella　typhimuriumを用いた場合の結果を示す。
　図１１に示すように、前記ビオチン化アプタマーの濃度依存的に、吸光度が上昇した。また、ＳＡＬ－２７８のSalmonella　enteritidisのに対する解離定数は、５４０ｎＭであり、Salmonella　typhimuriumに対する解離定数は３１０ｎＭであった。これらの結果から、ＳＡＬ－２７８が、サルモネラに対し極めて優れた結合力を示すことがわかった。
　以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０１２年１１月１３日に出願された日本出願特願２０１２－２４９６６５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本発明の核酸分子は、サルモネラに結合可能であり、中でも、食中毒の原因菌であるＯ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群に属するサルモネラに特異的に結合可能である。このため、本発明の核酸分子によれば、例えば、サルモネラとの結合によって、サルモネラを検出できる。このため、本発明の核酸分子は、例えば、食品管理、公衆衛生等の分野におけるサルモネラの検出に、極めて有用なツールとなる。

Claims (12)

  1. 下記（ａ）～（ｄ）からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とするサルモネラに特異的に結合する核酸分子。
    （ａ）配列番号１～１７のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
    （ｂ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
    （ｃ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
    （ｄ）前記（ａ）のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに、相補的な塩基配列からなり、サルモネラに結合するポリヌクレオチド
  2. 前記ポリヌクレオチドが、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群のサルモネラに結合するポリヌクレオチドである、請求項１記載の核酸分子。
  3. 前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１または２記載の核酸分子。
  4. 試料と請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子とを接触させ、前記試料中のサルモネラと前記核酸分子とを結合させることにより、前記試料中のサルモネラを検出する工程を含むことを特徴とする、サルモネラの検出方法。
  5. 検出対象のサルモネラが、Ｏ４群、Ｏ７群および／またはＯ９群のサルモネラである、請求項４記載の検出方法。
  6. 前記試料が、死菌試料である、請求項４または５記載の検出方法。
  7. 前記試料が、培養試料である、請求項４から６のいずれか一項に記載の検出方法。
  8. 前記検出工程において、カリウムイオンおよびマグネシウムイオンの存在下、前記試料と前記核酸分子とを接触させる、請求項４から７のいずれか一項に記載の検出方法。
  9. 請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、サルモネラの検出試薬。
  10. 請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、サルモネラの検出キット。
  11. さらに、カリウム化合物およびマグネシウム化合物を含む、請求項１０記載の検出キット。
  12. 請求項１から３のいずれか一項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、サルモネラの検出デバイス。
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