WO2014064935A1 - 撮像装置及び顕微鏡システム - Google Patents

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imaging
microscope
diffraction grating
observation
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福武　直樹
河井　斉
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    • G03H2223/00—Optical components
    • G03H2223/23—Diffractive element

Definitions

  • the present invention relates to an imaging device applied to a microscope, and a microscope system including the same.
  • phase difference observation dark field observation
  • differential interference observation can visualize the outline of the phase object existing in the transparent sample
  • the phase distribution itself of the phase object cannot be visualized.
  • the present invention provides an imaging device that can acquire phase distribution data of a transparent sample by simply connecting to an optical output port of a microscope, and a microscope system including the imaging device.
  • An example of the imaging apparatus of the present invention is an imaging apparatus connected to an optical output port of a microscope, and includes a branching unit that branches an imaging light beam from the microscope into two branched light beams, and one of the two branched light beams. Is a reference light beam, the other is an object light beam, and an interference unit that generates an interference fringe, and an imaging unit that captures the interference fringe to generate a fringe image.
  • An example of the microscope system of the present invention includes the microscope and an example of the imaging device of the present invention.
  • FIG. 1 is an overall view of a microscope system. It is a figure explaining in detail the microscope system (holographic unit 100 of a 1st embodiment) at the time of holographic observation. It is a figure explaining the procedure of a calculation process. It is a figure which shows the structure of the holography unit 100 of 2nd Embodiment. It is a figure which shows the structure of the holography unit 300 of 3rd Embodiment.
  • a microscope system will be described as a first embodiment of the present invention.
  • this system will be exemplified by a microscope system configured to enable bright field observation, dark field observation, phase difference observation, differential interference observation, fluorescence observation, and holographic observation.
  • FIG. 1 is an overall view of the microscope system.
  • the microscope system includes a microscope main body 1, a transmission illumination unit 2, an epi-illumination unit 3, an imaging unit 8, a holography unit 100, and a laser unit 200.
  • the transmitted illumination unit 2, the epi-illumination unit 3, the imaging unit 8, the holography unit 100, and the laser unit 200 are connected to the microscope main body 1 via ports 2A, 3A, 8A, 100A, and 200A of the microscope system.
  • the ports 8A and 200A are optical output ports, and in particular, the port 200A is a side port located on the side surface of the microscope main body 1.
  • a filter / prism set 30, a fluorescent filter block 43, and a filter / prism set 60 can be attached to each part of the microscope body 1.
  • movable mirrors 28, 48, and 57 for switching the optical path are mounted on each part of the microscope body 1.
  • the filter / prism set 30 is inserted into the pupil conjugate plane of the transmitted illumination optical path during differential interference observation.
  • the filter / prism set 30 is a combination of a polarizer and a differential interference prism.
  • the filter / prism set 60 is inserted into the pupil conjugate plane of the observation optical path during differential interference observation.
  • the filter / prism set 60 is a combination of a differential interference prism and an analyzer.
  • the fluorescent filter block 43 is inserted at a branching point between the epi-illumination optical path and the observation optical path during fluorescence observation.
  • the fluorescent filter block 43 is a combination of an excitation filter 44 and a barrier filter 46 combined with a dichroic mirror 45.
  • the movable mirror 28 switches between the laser unit 200 and the transmission illumination unit 2.
  • the transmission illumination unit 2 is activated
  • the laser unit 200 is activated.
  • the movable mirror 48 switches between the holography unit 100 and the imaging unit 8.
  • the posture of the reflecting surface of the movable mirror 48 is set to the posture shown by a solid line in FIG. 1 (holography mode)
  • the holography unit 100 becomes effective
  • the imaging unit 8 becomes effective.
  • the movable mirror 57 enables the binocular unit 7 as necessary.
  • the imaging unit 8 is effective when the movable mirror 57 is inserted in the optical path. However, when the movable mirror 57 is detached from the optical path, the imaging unit 8 becomes invalid, and the binocular unit 7 can perform naked-eye observation.
  • condenser lenses 32-1, 32-2, and 32-3 are attached to the microscope body 1, and one of these condenser lenses is inserted into the optical path of the microscope body 1.
  • the condenser lens 32-1 is a condenser lens that can be used for bright field observation, differential interference observation, and holographic observation (described later)
  • the condenser lens 32-2 is a condenser lens for dark field observation (dark field condenser).
  • the condenser lens 32-3 is assumed to be a phase difference observation condenser lens (phase difference condenser lens).
  • a specimen 33 is arranged on a stage (not shown) of the microscope body 1.
  • the specimen 33 is a transparent sample, for example, a preparation in which a culture solution containing biological cells is dropped. Since the specimen 33 is almost transparent to visible light, dark field observation, phase difference observation, differential interference observation, fluorescence observation, and holographic observation are effective. In addition, when performing fluorescence observation, the specific site
  • the objective lens 34-1 is an objective lens that can be used for bright field observation, dark field observation, differential interference observation, fluorescence observation, and holographic observation
  • the objective lens 34-2 is an objective lens for phase difference observation. It is assumed that (a phase difference objective lens).
  • the transmission illumination unit 2 is used for bright field observation, dark field observation, phase difference observation, and differential interference observation.
  • the transmitted illumination unit 2 includes a light source 21 such as a halogen lamp or a mercury lamp, a collector lens 22, a shutter 23, a relay lens 24, a filter 25, a relay lens 26, and a field stop 27.
  • the filter 25 is an ND filter that limits the amount of light, an NCB filter that controls the color temperature, an interference filter that limits the wavelength, or the like. Each of these filters is inserted into and removed from the optical path as necessary.
  • the epi-illumination unit 3 is used for fluorescence observation.
  • the epi-illumination unit 3 includes a light source 35 such as a mercury lamp, a collector lens 36, a shutter 37, a relay lens 38, an aperture stop 39, a relay lens 40, a field stop 41 and 42, and a field lens 42. And are provided.
  • the laser unit 200 is used for holographic observation.
  • the laser unit 200 includes a laser light source.
  • the number of laser light sources in the laser unit 200 is 1, but the laser wavelength may be variable by setting it to 2 or more.
  • the laser unit 200 and the microscope main body 1 may be directly connected as shown in FIG. 1 or may be connected via an optical fiber or a relay lens.
  • the holography unit 100 is used for holographic observation.
  • the holography unit 100 includes a diffraction grating 101, a relay lens 102, a spatial filter 103, a relay lens 104, and an imaging device 105 configured by a CCD, a CMOS, or the like. Details of the holography unit 100 will be described later.
  • the movable mirror 28 is inserted into the optical path. Further, since the holography unit 100 is not used during bright field observation, the posture of the movable mirror 48 is set to the normal mode (dotted line). During bright field observation, a condenser lens 32-1 and an objective lens 34-1 that can be used for bright field observation are inserted into the optical path. Further, a halogen lamp is set as the light source 21 of the transmissive illumination unit 2, and the filter 25 is set so that the light emitted from the transmissive illumination unit 2 becomes white light.
  • the light emitted from the light source 21 of the transmitted illumination unit 2 enters the microscope main body 1 through the collector lens 22, the shutter 23, the relay lens 24, the filter 25, the relay lens 26, and the field stop 27.
  • the light incident on the microscope body 1 reflects the movable mirror 28 and illuminates the specimen 33 through the field lens 29, the aperture stop 31, and the condenser lens 32-1.
  • the light transmitted through the specimen 33 passes through the objective lens 34-1, the second objective lens 47, the movable mirror 48, the relay lens 49, the optical path bending mirror 50, the relay lens 51, the movable mirror 57, and the second imaging lens 58.
  • a bright field image of the specimen 33 is formed on the imaging element 59 of the imaging unit 8.
  • the image sensor 59 is connected to a monitor (not shown), and images (bright field images) acquired by the image sensor 59 are displayed on the monitor in the order of acquisition.
  • the dark field observation is the same as the bright field observation except that the dark field condenser lens 32-2 is used as the condenser lens.
  • the image sensor 59 acquires a dark field image.
  • phase difference observation is the same as the bright field observation except that the phase difference condenser lens 32-3 is used as the condenser lens and the phase difference objective lens 43-2 is used as the objective lens.
  • a mercury lamp is set as the light source 21 of the transmissive illumination unit 2
  • the filter 25 is set so that the light emitted from the transmissive illumination unit 2 becomes monochromatic light.
  • the image sensor 59 acquires a phase difference image.
  • the differential interference observation is the same as the bright field observation except that the filter / prism sets 30 and 60 are inserted into the optical path.
  • a mercury lamp is set as the light source 21 of the transmission illumination unit 2, and the type of light emitted from the transmission illumination unit 2 is set to monochromatic light.
  • the image pickup element 59 acquires an image by differential interference.
  • the fluorescence filter block 43 is inserted into the optical path. Further, since the holography unit 100 is not used during fluorescence observation, the posture of the movable mirror 48 is set to the normal mode (dotted line). In addition, during fluorescence observation, the objective lens 34-1 is inserted into the optical path. During fluorescence observation, the laser unit 200 and the transmitted illumination unit 2 are turned off (the light emitted from the laser unit 200 or the transmitted illumination unit 2 does not enter the microscope main body 1).
  • the light emitted from the light source 35 of the epi-illumination unit 3 enters the microscope main body 1 through the collector lens 36, the shutter 37, the relay lens 38, the aperture stop 39, the relay lens 40, the field stop 41, and the field lens 42.
  • the light incident on the microscope main body 1 is incident on the dichroic mirror 45 of the fluorescent filter block 43 via the excitation filter 44 of the fluorescent filter block 43, the light is reflected on the dichroic mirror 45 and is reflected on the sample 33 via the objective lens 34-1. Irradiate.
  • the fluorescence generated in the specimen 33 by this irradiation enters the dichroic mirror 45 of the fluorescent filter block 43 through the objective lens 34-1, passes through the dichroic mirror 45, and passes through the barrier filter 46 of the fluorescent filter block 43.
  • the light enters the objective lens 47.
  • the fluorescence that has entered the second objective lens 47 passes through the movable mirror 48, the relay lens 49, the optical path bending mirror 50, the relay lens 51, the movable mirror 57, and the second imaging lens 58. Then, a fluorescent image of the specimen 33 is formed.
  • the image sensor 59 is connected to a monitor (not shown), and images (fluorescence images) acquired by the image sensor 59 are displayed on the monitor in the order of acquisition.
  • the movable mirror 28 is detached from the optical path. Further, since the holography unit 100 is used during holographic observation, the attitude of the movable mirror 48 is set to the holography mode (solid line). During holographic observation, the condenser lens 32-1 and the objective lens 34-1 are inserted into the optical path.
  • FIG. 2 is a diagram for explaining in detail the microscope system (holographic unit 100 of the first embodiment) during holographic observation.
  • the laser light emitted from the laser light source of the laser unit 200 enters the microscope main body 1, it receives the condensing action of the field lens 29 of the microscope main body 1, and the aperture stop 31. After being condensed at the center of the light, it enters the condenser lens 32-1 as a divergent light beam.
  • the laser light incident on the condenser lens 32-1 becomes a parallel light beam having a large diameter when exiting the condenser lens 32-1, and illuminates the observation area of the sample 33 with uniform illuminance from the front.
  • the laser light that has passed through the specimen 33 enters the objective lens 34-1, it is condensed at the center of the pupil of the objective lens 34-1, and then enters the second objective lens 47 as a divergent light beam.
  • the laser light incident on the second objective lens 47 becomes a parallel light beam when exiting the second objective lens 47.
  • the laser light that has become a parallel light beam is reflected by the movable mirror 48 and enters the holography unit 100.
  • the laser light incident on the holography unit 100 enters the diffraction grating 101 of the holography unit 100 from the front.
  • the diffraction grating 101 is a transmission type and phase type diffraction grating.
  • the diffraction grating 101 is a unidirectional diffraction grating having a periodic structure in a predetermined direction (vertical direction in FIG. 2) perpendicular to the optical axis, and the type of the periodic structure is a blaze type (FIG. 2B ).
  • the diffraction grating 101 generates a transmitted 1st-order diffracted light beam and a transmitted 0th-order diffracted light beam according to the incident laser beam (parallel light beam).
  • a light beam emitted from the diffraction grating 101 at an angle of zero is a transmitted zero-order diffracted light beam
  • a light beam emitted from the diffraction grating 101 at a predetermined angle is a transmitted first-order diffracted light beam.
  • the diffraction efficiency of the diffraction grating 101 is such that the intensity of the diffracted light beam other than the transmitted 1st order diffracted light beam and the transmitted 0th order diffracted light beam is substantially zero, and the intensity of the transmitted 1st order diffracted light beam is higher than the intensity of the transmitted 0th order diffracted light beam. Is set to be higher.
  • the transmitted first-order diffracted light beam and transmitted zero-order diffracted light beam emitted from the diffraction grating 101 are incident on the relay lens 102, they are subjected to the condensing action of the relay lens 102, and the pupil conjugate plane A Condensed at different positions.
  • the condensing point of the transmitted zero-order diffracted light beam is on the optical axis, and the condensing point of the transmitted first-order diffracted light beam is a position away from the optical axis.
  • the spatial filter 103 is arranged on the pupil conjugate plane A.
  • the spatial filter 103 is a mask having a predetermined opening pattern, and the opening pattern includes, as shown in FIG. 2C, a pinhole 103A located near the condensing point of the transmitted first-order diffracted light beam, and a transmission It consists of a circular aperture 103B located near the condensing point of the 0th-order diffracted light beam.
  • the pinhole 103A has a function of diffracting the transmitted first-order diffracted light beam and converting the wavefront of the light beam into an ideal spherical surface. Therefore, the size of the pinhole 103A is set to a sufficiently small size.
  • the circular aperture 103B has a function of allowing the transmitted 0th-order diffracted light beam to pass through without being diffracted and cutting an extra diffracted light beam (a small amount of transmitted-first-order diffracted light beam and higher-order diffracted light beam generated by the diffraction grating 101). Is granted.
  • the size of the circular opening 103B is set to be equal to or slightly larger than the cross-sectional size of the transmitted zero-order diffracted light beam.
  • a light beam converted into an ideal spherical wave is emitted from the pinhole 103A of the spatial filter 103, and a light beam having a wavefront shape corresponding to the phase distribution of the sample 33 is emitted from the circular aperture 103B of the spatial filter 103. .
  • the holography unit 100 of this embodiment uses the light beam emitted from the pinhole 103A as the reference light beam LR, and uses the light beam emitted from the circular opening 103B as the object light beam LO.
  • Each of the reference light beam LR and the object light beam LO emitted from the spatial filter 103 is converted into a parallel light beam by the condensing action of the relay lens 104 and is incident on the sample conjugate plane B at different angles.
  • the incident angle of the object light beam LO with respect to the sample conjugate plane B is zero, while the incident angle of the reference light beam LR is a predetermined value other than zero.
  • the incident angle of the reference light beam LR with respect to the sample conjugate plane B is determined by the structural period (grating pitch P) of the diffraction grating 101, the wavelength ⁇ of the laser light, the focal lengths of the relay lenses 102 and 104, and the like.
  • the imaging surface 105A of the imaging element 105 is located on the specimen conjugate plane B.
  • a plurality of pixels are arranged in a predetermined direction (X direction) perpendicular to the optical axis (Z direction), and a plurality of pixels are arranged in a predetermined direction (Y direction) perpendicular to both the Z direction and the X direction. Pixels are arranged.
  • the reference light beam LR and the object light beam LO are incident on the imaging surface 105A at different angles, the reference light beam LR and the object light beam LO overlap each other on the imaging surface 105A in a stripe-shaped interference. Stripes occur (see FIG. 2D).
  • the rotational position of the imaging surface 105A around the optical axis is set so that the X direction and the Y direction of the imaging surface 105A form an angle of 45 ° with respect to the fringe direction of the interference fringes, as shown in FIG. Has been.
  • the image sensor 105 repeatedly captures interference fringes with a frame period of 1/30 seconds, for example, and sequentially transfers the fringe images generated by the imaging to a computing device (not shown).
  • the arithmetic device When the fringe image is transferred from the image sensor 105, the arithmetic device (not shown) creates a holographic image (described later) of the specimen 33 by performing predetermined arithmetic processing (described later) on the fringe image. A holographic image is displayed on a monitor (not shown).
  • a computing device may be externally attached to the microscope system, may be incorporated in the microscope system, or may be incorporated in the holography unit 100.
  • a general-purpose computer may be operated as the arithmetic device.
  • a program for executing a calculation process (described later) is installed in the computer.
  • the program is installed on the computer via a communication network such as the Internet or a storage medium such as a CD-ROM.
  • the relationship between the fringe pitch of the interference fringes and the pixel pitch of the imaging surface 105A needs to be appropriate. Specifically, it is desirable to detect the fringes for one period with approximately four pixels.
  • the lattice pitch P of the diffraction grating 101, the focal length of the relay lens 102 and f 1, the focal length of the relay lens 104 and f 2, XY direction of the pixel pitch p and the following equation on the imaging plane 105A (1) must be satisfied.
  • the wavelength ⁇ of the laser beam is set to 488 nm
  • the numerical aperture NA of the objective lens 34-1 is set to 0.45
  • the magnification ⁇ of the objective lens 34-1 is set to 20.
  • the grating pitch P of the diffraction grating 101 is set to 3.37 ⁇ m
  • the focal length f 1 of the relay lens 102 is set to 50 mm
  • the focal length f 2 of the relay lens 104 is set to 70 mm
  • the height of the pinhole 103A set h to 7.32Mm, it sets the diameter phi 3 of the circular opening 103B to 2.25 mm, and sets the pixel pitch p to 1.67 .mu.m.
  • the diameter of the pinhole 103A phi 2 was set in the range of 20 ⁇ m to 30 ⁇ m, and the effective diameter ⁇ 4 of the imaging surface 105A was set to 8 mm.
  • the diameter phi 2 of the pinhole 103A even smaller than 20 [mu] m, the intensity of the reference light beam LR is ensured to some extent here, moreover, the space as the manufacture of the filter 103 it does not become difficult, and the range of 30 ⁇ m to phi 2 from 20 [mu] m.
  • FIG. 3 is a diagram for explaining the procedure of the arithmetic processing by the arithmetic device. Hereinafter, each step of the arithmetic processing will be described in order.
  • Step S1 The arithmetic unit Fourier-transforms the fringe image (FIG. 3A) by FFT to obtain a spectrum image (FIG. 3B) represented in the wave number space.
  • a zero-order spectrum appears in the vicinity of the origin on the wave number space, and a ⁇ first order spectrum appears at a position outside the origin on the wave number space.
  • the zero-order spectrum is a DC component of the fringe image, and is an unnecessary component that does not include the wavefront information of the object light beam LO.
  • each ⁇ 1st order spectrum is a necessary component including wavefront information of the object light beam LO.
  • the shift amount from the origin of the ⁇ 1st order spectrum in the wave number space is equal to the spatial frequency K of the interference fringes, and the values of K are the grating pitch P of the diffraction grating 101, the wavelength ⁇ of the laser light, the relay lens. Since it is uniquely determined by the focal lengths f 1 and f 2 of 102 and 104, it can be calculated in advance. Therefore, it is assumed that the arithmetic device of this embodiment stores the value of K in advance.
  • Step S2 The computing device cuts out one of the ⁇ first order spectra (the first order spectrum) in the wave number space, and shifts the spectrum by K in the wave number space, thereby placing it at the origin in the wave number space. As a result, a spectrum image (FIG. 3C) including only the wavefront information of the object light beam LO is obtained.
  • Step S3 The computing device obtains the wavefront shape of the object light beam LO on the imaging surface 105A and the amplitude distribution of the object light beam LO on the imaging surface 105A by performing inverse Fourier transform on the spectrum image acquired in step S2 by inverse FFT. . Further, the arithmetic device converts the obtained wavefront shape into a holographic image (FIG. 3D) composed of a gradation image, and displays the holographic image on the monitor (step S3).
  • a holographic image FIG. 3D
  • the gradation distribution of this holographic image represents the phase distribution of the specimen 33. That is, the holographic image reflects not only the outline of the cells present in the specimen 33 but also the phase distribution of the cells.
  • step S1 to step S3 the time required for the processing from step S1 to step S3 is shorter than the frame period of the image sensor 105. Therefore, every time the fringe image is transferred from the image sensor 105, the arithmetic device according to the present embodiment executes the processing from step S1 to step S3 to update the holographic image on the monitor.
  • the user can observe the phase distribution of cells existing in the specimen 33 in real time.
  • the microscope system of the present embodiment can perform not only the above-described holographic observation but also dark field observation, phase difference observation, differential interference observation, fluorescence observation, and the like.
  • the user roughly observes the specimen 33 by other observation methods such as dark field observation, phase difference observation, differential interference observation, and fluorescence observation, and when the user feels that detailed observation is necessary, the holography unit 100 is used. It is also possible to perform flexible observation such that the phase distribution of the specimen 33 is observed by setting it effectively.
  • the imaging device (100) of the present embodiment is an imaging device connected to the optical output port (100A) of the microscope (1), and the imaging light beam from the microscope (1) is divided into two branched light beams.
  • the fringe image can be acquired by effectively using the optical output port (100A) of the microscope (1).
  • the fringe image reflects the wavefront shape of the object luminous flux (LO) (and eventually the phase distribution of the object (33) set in the microscope (1)).
  • the imaging apparatus (100) of the present embodiment further includes a shaping unit (103A) that shapes the wavefront shape of the reference light beam (LR) toward the imaging unit (105) into a predetermined shape.
  • a shaping unit (103A) that shapes the wavefront shape of the reference light beam (LR) toward the imaging unit (105) into a predetermined shape.
  • the wavefront shape of the reference light beam (LR) is shaped in this way, the wavefront shape of the object light beam (LO) (and thus the phase distribution of the object (33)) can be easily calculated from the fringe image. Can do.
  • the branching means (101) is a blazed phase diffraction grating, and one of the ⁇ first-order diffracted light beams generated by the diffraction grating (101) is used as the reference light beam (LR), and is generated by the diffraction grating.
  • the 0th-order diffracted light beam is used as the object light beam (LO).
  • the intensity balance between the reference light beam (LR) and the object light beam (LO) contributing to the interference fringes can be reliably controlled.
  • a spatial filter (103) for cutting off an extra diffracted light beam generated by the diffraction grating (101) is disposed between the diffraction grating (101) and the imaging means (105).
  • the function of the shaping means (103A) is mounted on the spatial filter (103).
  • the number of optical elements to be mounted on the image pickup apparatus (100) can be suppressed (in the example of FIG. 2, the number of optical elements is limited to five points). ing.).
  • the diffraction efficiency of the diffraction grating (101) is such that the intensity of the reference light beam (LR) emitted from the diffraction grating (101) is higher than the intensity of the object light beam (LO) emitted from the diffraction grating (101). It is set to be high.
  • the intensity balance of the reference light beam (LR) and the object light beam (LO) contributing to the interference fringes can be made appropriate.
  • the difference between the incident angle of the reference beam (LR) and the incident beam of the object beam (LO) with respect to the imaging surface (105A) of the imaging unit (105) is set to a predetermined value other than zero.
  • the image pickup surface (105A) of the image pickup means (105) is disposed on a surface (B) optically conjugate with the image surface of the microscope (1).
  • phase distribution of the object (33) can be easily calculated from the fringe image.
  • the imaging apparatus (100) further includes a calculation unit that calculates a phase distribution of the object (33) set on the microscope based on the fringe image, and the calculation unit displays the phase distribution on a monitor. .
  • the user can confirm the phase distribution of the object (33) on the monitor.
  • the imaging means (105) and the calculation means operate repeatedly.
  • phase distribution on the monitor is updated sequentially. Therefore, the user can observe the time change of the phase distribution of the object (33) in real time.
  • the microscope system of the present embodiment includes the microscope (1) and the imaging device (100), and the microscope (1) is equipped with a laser light source (200).
  • the imaging device (100) can effectively use the laser light source (200) for acquiring the fringe image.
  • the coherence between the reference light beam (LR) and the object light beam (LO) increases, so that the quality of the fringe image also increases.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a configuration of the holography unit 100 according to the second embodiment.
  • the holography unit 100 of the present embodiment is the same as the holography unit of the first embodiment, but includes a diffraction grating 101 ′ instead of the diffraction grating 101.
  • the diffraction grating 101 ′ is a non-blazed type of the diffraction grating 101. That is, the diffraction grating 101 'is formed by periodically forming grooves on a transparent substrate. In this case, since the intensity of the transmitted ⁇ 1st order diffracted light beam becomes as strong as the intensity of the transmitted + 1st order diffracted light beam, the use efficiency of the laser light is reduced, but there is an advantage that an inexpensive diffraction grating can be used.
  • the wavelength ⁇ of the laser beam is set to 488 nm
  • the numerical aperture NA of the objective lens 34-1 is set to 0.45
  • the magnification ⁇ of the objective lens 34-1 is set to 20.
  • the grating pitch P of the diffraction grating 101 ′ is set to 4.72 ⁇ m
  • the focal length f 1 of the relay lens 102 is set to 50 mm
  • the focal length f 2 of the relay lens 104 is set to 50 mm
  • the height of the pinhole 103A is set. is set to h in 5.166Mm
  • set the diameter phi 3 of the circular opening 103B to 2.25 mm
  • sets the pixel pitch p to 1.67 .mu.m.
  • the diameter (field diameter) ⁇ 1 of the observation area in the specimen 33 is set to 300 ⁇ m
  • the focal length f 0 of the second objective lens 47 is set to 200 mm
  • the diameter ⁇ 2 of the pinhole 103A is set. the set from 20 ⁇ m in the range of 30 [mu] m, and set the effective diameter phi 4 of the imaging surface 105A to 8 mm, and the groove depth of the diffraction grating 101 'and 500 nm.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating a configuration of the holography unit 300 according to the third embodiment.
  • the holography unit 300 of this embodiment includes a relay lens 301, a beam splitter 302, a pinhole mask 303, optical path bending mirrors 304 and 305, a beam splitter 306, a relay lens 307, and an image sensor. 308.
  • laser light (parallel light flux) incident on the holography unit 300 is incident on the relay lens 301 of the holography unit 300, receives the condensing action of the relay lens 301, and converges the beam.
  • the light enters the splitter 302.
  • the laser light incident on the beam splitter 302 is split into a transmitted light beam that passes through the beam splitter 302 and a reflected light beam that reflects from the beam splitter 302.
  • the transmission / reflectance of the beam splitter 302 is set so that the intensity of the transmitted light beam is higher than the intensity of the reflected light beam (because the reference light beam LR of the present embodiment is generated based on the transmitted light beam). )
  • the transmitted light beam emitted from the beam splitter 302 is condensed toward the center (optical axis) of the pupil conjugate plane A.
  • a pinhole mask 303 is arranged on the pupil conjugate plane A, and the pinhole 303A of the pinhole mask 303 is located in the vicinity of the condensing point.
  • the pinhole 303A has a function of diffracting the transmitted light beam and converting the wavefront of the light beam into an ideal spherical surface. Therefore, the size of the pinhole 303A is set to a sufficiently small size.
  • the holography unit 300 of this embodiment uses this light beam as the reference light beam LR.
  • the reference light beam LR is deflected by the optical path bending mirror 304 and is incident on the beam splitter 306 to be reflected by the beam splitter 306.
  • the reflected light beam emitted from the beam splitter 302 is condensed toward the center (optical axis) of the pupil conjugate plane A ′, it travels again as a divergent light beam and is deflected by the optical path bending mirror 305, and then the beam.
  • the light enters the splitter 306 and passes through the beam splitter 306.
  • the holography unit 300 of this embodiment uses this light beam as the object light beam LO.
  • Each of the reference light beam LR reflected by the beam splitter 306 and the object light beam LO transmitted through the beam splitter 306 is converted into a parallel light beam by the condensing action of the relay lens 307 and enters the sample conjugate plane B.
  • the optical path bending mirror 305 disposed in the single optical path of the object light beam LO is disposed at an angle of 45 ° with respect to the incident optical path, whereas the optical bending mirror disposed in the single optical path of the reference light beam LR.
  • the mirror 305 is disposed at an angle deviated from 45 ° by a predetermined value with respect to the incident optical path.
  • the incident angle of the object light beam LO with respect to the sample conjugate surface B is zero, whereas the incident angle of the reference light beam LR with respect to the sample conjugate surface B is a predetermined value other than zero.
  • the imaging surface 308A of the imaging device 308 is located on the specimen conjugate surface B.
  • a plurality of pixels are arranged in a predetermined direction (X direction) perpendicular to the optical axis (Z direction), and a plurality of pixels are arranged in a predetermined direction (Y direction) perpendicular to both the Z direction and the X direction. Pixels are arranged.
  • the reference light beam LR and the object light beam LO are incident on the imaging surface 105A at different angles, the reference light beam LR and the object light beam LO are incident on the image pickup surface 308A in an overlapping manner. Stripes occur.
  • the rotational position of the imaging surface 308A around the optical axis is set so that the X direction and the Y direction of the imaging surface 308A form an angle of 45 ° with respect to the fringe direction of the interference fringes.
  • the image sensor 308 repeatedly captures interference fringes with a frame period of 1/30 seconds, for example, and sequentially transfers the fringe images generated by the image capturing to an arithmetic device (not shown).
  • the arithmetic device When the fringe image is transferred from the image sensor 308, the arithmetic device (not shown) performs a predetermined arithmetic process on the fringe image to create a holographic image (described later) of the specimen 33, and the holographic image Display on a monitor (not shown).
  • the wavelength ⁇ of the laser beam is set to 488 nm
  • the numerical aperture NA of the objective lens 34-1 is set to 0.45
  • the magnification ⁇ of the objective lens 34-1 is set to 20.
  • the focal length f 1 of the relay lens 301 was set to 50 mm
  • the focal length f 2 of the relay lens 306 was set to 50 mm
  • the pixel pitch p was set to 4.4 ⁇ m.
  • the observation area diameter (field diameter) ⁇ 1 of the specimen 33 is set to 300 ⁇ m, and the focal length f 0 of the second objective lens 47 is set to 200 mm.
  • the holography unit is connected to the side port 100A of the microscope body 1, but the microscope body 1 includes, for example, a left port, a right port, a bottom port, and a back port as optical output ports.
  • the connection destination of the holography unit may be any of the left port, the right port, the bottom port, and the back port.
  • a movable mirror is used and an effective optical output port is switched between a plurality of optical output ports.
  • a plurality of optical output ports may be used simultaneously.
  • a non-movable beam splitter may be used instead of the movable mirror.
  • the observation target of the holography unit is a transparent object, and the phase distribution of the transparent object is acquired as a holographic image.
  • the observation target of the holography unit is an opaque object, and the surface shape of the opaque object is a holographic image. You may get it.
  • an illumination method when observing an opaque object with a holography unit it is necessary to adopt epi-illumination instead of transmitted illumination. Also in this case, it is desirable to use a light source (laser light source) with high coherence as the light source.
  • the arrangement destination of the image sensor mounted on the imaging unit coincides with the sample conjugate plane, but it may be shifted from the sample conjugate plane.
  • the process of converting the phase distribution of the imaging plane to the phase distribution of the sample conjugate plane is performed. It is necessary to add to the above-described arithmetic processing.
  • 1 microscope main body
  • 2 transmission illumination unit
  • 3 epi-illumination unit
  • 8 imaging unit
  • 100 holography unit
  • 200 laser unit
  • 2 transmission illumination unit
  • 3 epi-illumination unit
  • 8 imaging unit
  • 100A Port
  • 101 Diffraction grating
  • 102 Relay lens
  • 103 Spatial filter
  • 104 Relay lens
  • 105 Image sensor

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Abstract

　顕微鏡の光学出力ポートに連結するだけで透明試料の位相分布データを取得できる撮像装置を提供するために、本発明の撮像装置の一例は、顕微鏡の光学出力ポートに連結される撮像装置であって、前記顕微鏡からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段と、前記２つの分岐光束の一方を参照光束とし、他方を物体光束として干渉縞を生成する干渉手段と、前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段とを備える。

Description

撮像装置及び顕微鏡システム
　本発明は、顕微鏡に適用される撮像装置、及びそれを備えた顕微鏡システムに関する。
　生体細胞を顕微鏡（特許文献１など）で観察するには、透明な物体を観察できる位相差観察、暗視野観察、微分干渉観察、蛍光観察が有効である。
　しかしながら、位相差観察、暗視野観察、微分干渉観察は、透明試料中に存在する位相物体の輪郭を可視化できるものの、位相物体の位相分布自体を可視化できる訳ではない。
　また、蛍光観察は、透明試料の特定部位を予め染色しておく必要があり、また、蛍光観察で可視化できるのは、特定部位の蛍光強度分布であって、特定部位の位相分布ではない。　
特開２００２?１７４７７２号公報
　そこで本発明は、顕微鏡の光学出力ポートに連結するだけで透明試料の位相分布データを取得できる撮像装置及びそれを備えた顕微鏡システムを提供する。
　なお、顕微鏡の光学出力ポートとは、撮像ユニット等への連結口であって、顕微鏡で生成された結像光束（＝試料の光学像を表す光束）が射出するポートのことである。
　本発明の撮像装置の一例は、顕微鏡の光学出力ポートに連結される撮像装置であって、前記顕微鏡からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段と、前記２つの分岐光束の一方を参照光束とし、他方を物体光束として干渉縞を生成する干渉手段と、前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段とを備える。
　本発明の顕微鏡システムの一例は、前記顕微鏡と、本発明の撮像装置の一例とを備える。
顕微鏡システムの全体図である。 ホログラフィ観察時の顕微鏡システム（第１実施形態のホログラフィユニット１００）を詳しく説明する図である。 演算処理の手順を説明する図である。 第２実施形態のホログラフィユニット１００の構成を示す図である。 第３実施形態のホログラフィユニット３００の構成を示す図である。
　［第１実施形態］
　以下、本発明の第１実施形態として顕微鏡システムを説明する。ここでは、このシステムは、明視野観察、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察、ホログラフィ観察が可能に構成された顕微鏡システムを例に挙げる。
　図１は、顕微鏡システムの全体図である。図１に示すとおり顕微鏡システムは、顕微鏡本体１と、透過照明ユニット２と、落射照明ユニット３と、撮像ユニット８と、ホログラフィユニット１００と、レーザユニット２００とを備える。透過照明ユニット２、落射照明ユニット３、撮像ユニット８、ホログラフィユニット１００、レーザユニット２００は、顕微鏡システムのポート２Ａ、３Ａ、８Ａ、１００Ａ、２００Ａを介して顕微鏡本体１に連結される。
　このうち、ポート８Ａ、２００Ａは、光学出力ポートであって、特に、ポート２００Ａは、顕微鏡本体１の側面に位置するサイドポートである。
　また、顕微鏡本体１の各部には、フィルタ・プリズムセット３０、蛍光フィルタブロック４３、フィルタ・プリズムセット６０が装着可能である。また、顕微鏡本体１の各部には、光路切り換え用の可動ミラー２８、４８、５７が搭載されている。
　フィルタ・プリズムセット３０は、微分干渉観察時に透過照明光路の瞳共役面に挿入される。フィルタ・プリズムセット３０は、偏光子と微分干渉プリズムとを組み合わせたものである。
　フィルタ・プリズムセット６０は、微分干渉観察時に観察光路の瞳共役面に挿入される。フィルタ・プリズムセット６０は、微分干渉プリズムと検光子とを組み合わせたものである。
　蛍光フィルタブロック４３は、蛍光観察時に落射照明光路と観察光路との分岐箇所へ挿入される。蛍光フィルタブロック４３は、ダイクロイックミラー４５に励起フィルタ４４とバリアフィルタ４６とを組み合わせたものである。
　可動ミラー２８は、レーザユニット２００と透過照明ユニット２との間の切り換えを行う。可動ミラー２８が光路へ挿入されると、透過照明ユニット２が有効となり、可動ミラー２８が離脱すると、レーザユニット２００が有効となる。
　可動ミラー４８は、ホログラフィユニット１００と撮像ユニット８との間の切り換えを行う。可動ミラー４８の反射面の姿勢が図１に実線で示す姿勢（ホログラフィモード）に設定されると、ホログラフィユニット１００が有効となり、図１に点線で示す姿勢（通常モード）に設定されると、撮像ユニット８が有効となる。
　可動ミラー５７は、必要に応じて双眼部７を有効にする。可動ミラー５７が光路へ挿入された状態では撮像ユニット８が有効であるが、可動ミラー５７が光路から離脱されると撮像ユニット８が無効となり、双眼部７による肉眼観察が可能となる。
　また、顕微鏡本体１には、複数種類のコンデンサレンズ３２－１、３２－２、３２－３が装着されており、このうち１つのコンデンサレンズが顕微鏡本体１の光路へ挿入される。ここでは、コンデンサレンズ３２－１は、明視野観察、微分干渉観察、ホログラフィ観察（後述）に使用可能なコンデンサレンズであり、コンデンサレンズ３２－２は、暗視野観察用のコンデンサレンズ（暗視野コンデンサレンズ）であり、コンデンサレンズ３２－３は、位相差観察用のコンデンサレンズ（位相差コンデンサレンズ）であると仮定する。
　また、顕微鏡本体１の不図示のステージには、標本３３が配置されている。標本３３は、透明試料であって、例えば、生体細胞を含む培養液が滴下されたプレパラートである。このような標本３３は、可視光に対してほぼ透明であるので、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察、ホログラフィ観察が有効である。なお、蛍光観察を行う場合は、生体細胞の特定部位が蛍光色素で予め染色されている必要がある。
　また、顕微鏡本体１には、複数種類の対物レンズ３４－１、３４－２、３４－３が装着されており、このうち１つの対物レンズが顕微鏡本体１の光路へ挿入される。ここでは、対物レンズ３４－１は、明視野観察、暗視野観察、微分干渉観察、蛍光観察、ホログラフィ観察に使用可能な対物レンズであり、対物レンズ３４－２は、位相差観察用の対物レンズ（位相差対物レンズ）であると仮定する。
　透過照明ユニット２は、明視野観察、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察に使用される。透過照明ユニット２には、ハロゲンランプや水銀ランプなどの光源２１と、コレクタレンズ２２と、シャッタ２３と、リレーレンズ２４と、フィルタ２５と、リレーレンズ２６と、視野絞り２７とを備える。フィルタ２５は、光量を制限するＮＤフィルタ、色温度を制御するＮＣＢフィルタ、波長を制限する干渉フィルタなどである。これらのフィルタの各々は、必要に応じて光路に対して挿脱される。
　落射照明ユニット３は、蛍光観察に使用される。落射照明ユニット３には、水銀ランプなどの光源３５と、コレクタレンズ３６と、シャッタ３７と、リレーレンズ３８と、開口絞り３９と、リレーレンズ４０と、視野絞り４１と、４２と、フィールドレンズ４２とが備えられる。
　レーザユニット２００は、ホログラフィ観察に使用される。レーザユニット２００には、レーザ光源が備えられる。なお、図１では、レーザユニット２００におけるレーザ光源の数を１としたが、２以上として、レーザ波長を可変としてもよい。また、レーザユニット２００と顕微鏡本体１とは図１のとおり直接連結されてもよいし、光ファイバやリレーレンズなどを介して連結されてもよい。
　ホログラフィユニット１００は、ホログラフィ観察に使用される。ホログラフィユニット１００には、回折格子１０１、リレーレンズ１０２、空間フィルタ１０３、リレーレンズ１０４、ＣＣＤやＣＭＯＳなどで構成された撮像素子１０５が備えられる。ホログラフィユニット１００の詳細は、後述する。
　＜明視野観察＞
　以下、明視野観察時の顕微鏡システムを説明する。
　明視野観察時は、透過照明ユニット２が使用されるので、可動ミラー２８が光路へ挿入される。また、明視野観察時は、ホログラフィユニット１００は使用されないので、可動ミラー４８の姿勢は通常モード（点線）に設定される。また、明視野観察時は、明視野観察に使用可能なコンデンサレンズ３２－１、対物レンズ３４－１が光路に挿入される。また、透過照明ユニット２の光源２１としてはハロゲンランプがセットされ、透過照明ユニット２からの射出光が白色光となるようにフィルタ２５がセットされる。
　透過照明ユニット２の光源２１から射出した光は、コレクタレンズ２２、シャッタ２３、リレーレンズ２４、フィルタ２５、リレーレンズ２６、視野絞り２７を介して顕微鏡本体１へ入射する。顕微鏡本体１へ入射した光は、可動ミラー２８を反射し、フィールドレンズ２９、開口絞り３１、コンデンサレンズ３２－１を介して標本３３を照明する。標本３３を透過した光は、対物レンズ３４－１、第２対物レンズ４７、可動ミラー４８、リレーレンズ４９、光路折り曲げミラー５０、リレーレンズ５１、可動ミラー５７、第２の結像レンズ５８を介して、撮像ユニット８の撮像素子５９に標本３３の明視野像を形成する。撮像素子５９は不図示のモニタに接続されており、撮像素子５９が取得する画像（明視野画像）は、取得順にモニタへ表示される。
　＜暗視野観察＞
　以下、暗視野観察時の顕微鏡システムを説明する。
　暗視野観察時は、コンデンサレンズとして暗視野コンデンサレンズ３２－２が使用される点以外は、明視野観察時と同じである。この状態で撮像素子５９は暗視野画像を取得する。
　＜位相差観察＞
　以下、位相差観察時の顕微鏡システムを説明する。
　位相差観察時は、コンデンサレンズとして位相差コンデンサレンズ３２－３が使用され、対物レンズとして位相差対物レンズ４３－２が使用される点以外は、明視野観察時と同じである。但し、透過照明ユニット２の光源２１としては水銀ランプがセットされ、透過照明ユニット２からの射出光が単色光となるようにフィルタ２５がセットされる。この状態で撮像素子５９は位相差画像を取得する。
　＜微分干渉観察＞
　以下、微分干渉観察時の顕微鏡システムを説明する。
　微分干渉観察時は、フィルタ・プリズムセット３０、６０が光路へ挿入される点以外は、明視野観察時と同じである。但し、透過照明ユニット２の光源２１としては水銀ランプがセットされ、透過照明ユニット２から射出する光の種類は単色光に設定される。この状態で撮像素子５９は微分干渉が像を取得する。
　＜蛍光観察＞
　以下、蛍光観察時の顕微鏡システムを説明する。
　蛍光観察時は、蛍光フィルタブロック４３が光路へ挿入される。また、蛍光観察時は、ホログラフィユニット１００は使用されないので、可動ミラー４８の姿勢は通常モード（点線）に設定される。また、蛍光観察時は、対物レンズ３４－１が光路に挿入される。また、蛍光観察時は、レーザユニット２００及び透過照明ユニット２はオフされる（レーザユニット２００又は透過照明ユニット２からの射出光は顕微鏡本体１へ入射しない。）。
　落射照明ユニット３の光源３５から射出した光は、コレクタレンズ３６、シャッタ３７、リレーレンズ３８、開口絞り３９、リレーレンズ４０、視野絞り４１、フィールドレンズ４２を介して顕微鏡本体１へ入射する。顕微鏡本体１へ入射した光は、蛍光用フィルタブロック４３の励起フィルタ４４を介して蛍光フィルタブロック４３のダイクロイックミラー４５へ入射すると、ダイクロイックミラー４５を反射し、対物レンズ３４－１を介して標本３３を照射する。この照射により標本３３で発生した蛍光は、対物レンズ３４－１を介して蛍光フィルタブロック４３のダイクロイックミラー４５へ入射すると、ダイクロイックミラー４５を透過し、蛍光フィルタブロック４３のバリアフィルタ４６を介して第２対物レンズ４７へ入射する。第２対物レンズ４７へ入射した蛍光は、可動ミラー４８、リレーレンズ４９、光路折り曲げミラー５０、リレーレンズ５１、可動ミラー５７、第２の結像レンズ５８を介して、撮像ユニット８の撮像素子５９に標本３３の蛍光像を形成する。撮像素子５９は不図示のモニタに接続されており、撮像素子５９が取得する画像（蛍光画像）は、取得順にモニタへ表示される。
　＜ホログラフィ観察＞
　以下、ホログラフィ観察時の顕微鏡システムを説明する。
　ホログラフィ観察時は、レーザユニット２００が使用されるので、可動ミラー２８が光路から離脱される。また、ホログラフィ観察時は、ホログラフィユニット１００が使用されるので、可動ミラー４８の姿勢はホログラフィモード（実線）に設定される。また、ホログラフィ観察時は、コンデンサレンズ３２－１、対物レンズ３４－１が光路に挿入される。
　図２は、ホログラフィ観察時の顕微鏡システム（第１実施形態のホログラフィユニット１００）を詳しく説明する図である。
　図２（Ａ）に示すとおり、ホログラフィ観察時、レーザユニット２００のレーザ光源から射出したレーザ光は、顕微鏡本体１へ入射すると、顕微鏡本体１のフィールドレンズ２９の集光作用を受け、開口絞り３１の中心に集光した後、発散光束となってコンデンサレンズ３２－１へ入射する。コンデンサレンズ３２－１へ入射したレーザ光は、コンデンサレンズ３２－１を射出する際に径の太い平行光束となり、標本３３の観察エリアを正面から均一な照度で照明する。
　標本３３を通過したレーザ光は、対物レンズ３４－１へ入射すると、対物レンズ３４－１の瞳中心に集光した後、発散光束となって第２対物レンズ４７へ入射する。第２対物レンズ４７へ入射したレーザ光は、第２対物レンズ４７を射出する際に平行光束となる。平行光束となったレーザ光は、可動ミラー４８にて反射し、ホログラフィユニット１００へ入射する。
　ホログラフィユニット１００へ入射したレーザ光は、ホログラフィユニット１００の回折格子１０１へ正面から入射する。
　ここで、回折格子１０１は、透過型かつ位相型の回折格子である。この回折格子１０１は、光軸に垂直な所定方向（図２の紙面上下方向）にかけて周期構造を有した一方向回折格子であって、その周期構造のタイプはブレーズ型である（図２（Ｂ）を参照。）。
　この回折格子１０１は、入射したレーザ光（平行光束）に応じて透過１次回折光束と透過０次回折光束とを発生させる。図２において、回折格子１０１から角度ゼロで射出する光束が透過０次回折光束であり、回折格子１０１から所定角度で射出する光束が透過１次回折光束である。
　なお、回折格子１０１の回折効率は、透過１次回折光束及び透過０次回折光束以外の回折光束の強度がほぼゼロとなり、かつ、透過０次回折光束の強度よりも透過１次回折光束の強度の方が高くなるように設定されている。
　図２（Ａ）に示すとおり、回折格子１０１から射出した透過１次回折光束及び透過０次回折光束は、リレーレンズ１０２へ入射すると、リレーレンズ１０２の集光作用を受け、瞳共役面Ａの互いに異なる位置に集光する。透過０次回折光束の集光点は光軸上であり、透過１次回折光束の集光点は光軸から離れた位置である。
　ここで、瞳共役面Ａには、空間フィルタ１０３が配置されている。空間フィルタ１０３は、所定の開口パターンを有したマスクであって、その開口パターンは、図２（Ｃ）に示すとおり、透過１次回折光束の集光点近傍に位置するピンホール１０３Ａと、透過０次回折光束の集光点近傍に位置する円形開口１０３Ｂとからなる。
　ピンホール１０３Ａには、透過１次回折光束を回折し、その光束の波面を理想球面に変換する機能が付与されている。そのために、ピンホール１０３Ａのサイズは十分に小さなサイズに設定されている。
　円形開口１０３Ｂには、透過０次回折光束を回折せずに通過させ、かつ、余分な回折光束（回折格子１０１で発生した僅かな透過－１次回折光束及び高次回折光束）をカットする機能が付与されている。そのために、円形開口１０３Ｂのサイズは、透過０次回折光束の断面サイズと同等又は若干大きい程度に設定されている。
　したがって、空間フィルタ１０３のピンホール１０３Ａからは、理想球面波に変換された光束が射出し、空間フィルタ１０３の円形開口１０３Ｂからは、標本３３の位相分布に応じた波面形状を有する光束が射出する。
　そこで本実施形態のホログラフィユニット１００は、ピンホール１０３Ａから射出した光束を参照光束ＬＲとして使用し、円形開口１０３Ｂから射出した光束を物体光束ＬＯとして使用する。
　空間フィルタ１０３から射出した参照光束ＬＲ及び物体光束ＬＯの各々は、リレーレンズ１０４の集光作用を受けて平行光束となり、標本共役面Ｂに対して互いに異なる角度で入射する。標本共役面Ｂに対する物体光束ＬＯの入射角度はゼロであるのに対して、参照光束ＬＲの入射角度は、ゼロ以外の所定値である。なお、標本共役面Ｂに対する参照光束ＬＲの入射角度は、回折格子１０１の構造周期（格子ピッチＰ）、レーザ光の波長λ、リレーレンズ１０２、１０４の焦点距離などによって決まる。
　ここで、標本共役面Ｂには、撮像素子１０５の撮像面１０５Ａが位置している。撮像面１０５Ａには、光軸（Ｚ方向）に垂直な所定方向（Ｘ方向）にかけて複数の画素が配列されており、Ｚ方向及びＸ方向の双方に垂直な所定方向（Ｙ方向）にかけても複数の画素が配列されている。
　この撮像面１０５Ａには、参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが互いに異なる角度で入射するので、撮像面１０５Ａにおいて参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが重複して入射する領域には、ストライプ状の干渉縞が生起する（図２（Ｄ）を参照。）。
　なお、撮像面１０５Ａの光軸周りの回転位置は、図２（Ｄ）に示すとおり、撮像面１０５ＡのＸ方向及びＹ方向が干渉縞の縞方向に対して４５°の角度を成すように設定されている。
　撮像素子１０５は、例えば１／３０秒のフレーム周期で干渉縞を繰り返し撮像すると共に、その撮像で生成した縞画像を逐次に演算装置（不図示）へ転送する。
　不図示の演算装置は、撮像素子１０５から縞画像が転送されると、その縞画像に対して所定の演算処理（後述）を施すことにより、標本３３のホログラフィ画像（後述）を作成し、そのホログラフィ画像をモニタ（不図示）へ表示する。
　なお、不図示の演算装置は、顕微鏡システムに外付けされてもよいし、顕微鏡システムに内蔵されてもよいし、ホログラフィユニット１００に内蔵されてもよい。
　また、不図示の演算装置を顕微鏡システムに外付けする場合は、汎用のコンピュータを演算装置として動作させてもよい。その場合は、演算処理（後述）を実行するためのプログラムがコンピュータにインストールされる。なお、コンピュータに対するプログラムのインストールは、インターネットなどの通信網、又は、ＣＤ－ＲＯＭなどの記憶媒体などを介して行われる。
　＜数値例＞
　以下、第１実施形態の数値例を説明する。
　ホログラフィユニット１００が適正な縞画像を生成するためには、干渉縞の縞ピッチと、撮像面１０５Ａの画素ピッチとの関係が適正である必要がある。具体的には、１周期分の縞をおおよそ４画素で検出することが望まれる。
　そのためには、回折格子１０１の格子ピッチＰと、リレーレンズ１０２の焦点距離をｆ１と、リレーレンズ１０４の焦点距離をｆ２と、撮像面１０５ＡにおけるＸＹ方向の画素ピッチｐとが以下の式（１）を満たす必要がある。
　Ｐ＝（ｆ１／ｆ２）×４ｐ／（√２）　…（１）
　また、空間フィルタ１０３のピンホール１０３Ａが良質な参照光束ＬＲを生成するためには、レーザ光の波長λと、回折格子１０１の格子ピッチＰと、リレーレンズ１０２の焦点距離をｆ１と、光軸からピンホール１０３Ａまでの高さｈとは、以下の式（２）を満たす必要がある。
　ｈ＝（√２）・λｆ１／（４Ｐ）　…（２）
　また、空間フィルタ１０３の円形開口１０３Ｂが良質な物体光束ＬＯを生成するためには、物レンズ３４－１の倍率βと、対物レンズ３４－１の開口数ＮＡと、円形開口１０３の径φ３とは、以下の式（３）を満たす必要がある。
　φ３＝２ＮＡ・ｆ１／β　…（３）
　そこで、例えば、本数値例では、レーザ光の波長λを４８８ｎｍに設定し、対物レンズ３４－１の開口数ＮＡを０．４５に設定し、対物レンズ３４－１の倍率βを２０に設定し、回折格子１０１の格子ピッチＰを３．３７μｍに設定し、リレーレンズ１０２の焦点距離ｆ１を５０ｍｍに設定し、リレーレンズ１０４の焦点距離ｆ２を７０ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの高さｈを７．３２ｍｍに設定し、円形開口１０３Ｂの径φ３を２．２５ｍｍに設定し、画素ピッチｐを１．６７μｍに設定した。
　因みに、本実施形態では、標本３３における観察エリアの径（視野の径）φ１を３００μｍに設定し、第２対物レンズ４７の焦点距離ｆ０を２００ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの径φ２を２０μmから３０μmの範囲に設定し、撮像面１０５Ａの有効径φ４を８ｍｍに設定した。
　なお、参照光束ＬＲの波面を良質にするためには、ピンホール１０３Ａの径φ２を２０μmよりさらに小さくすることが望ましいが、ここでは参照光束ＬＲの強度が或る程度確保され、しかも、空間フィルタ１０３の製造が困難とならないように、φ２を２０μmから３０μmの範囲とした。
　＜演算処理＞
　以下、演算装置による演算処理を説明する。
　図３は、演算装置による演算処理の手順を説明する図である。以下、演算処理の各ステップを順に説明する。
　ステップＳ１：演算装置は、縞画像（図３（Ａ））をＦＦＴによりフーリエ変換し、波数空間で表されたスペクトル画像（図３（Ｂ））を取得する。このスペクトル画像では、波数空間上の原点近傍に０次スペクトルが現れており、波数空間上の原点から外れた位置に±１次スペクトルが現れている。このうち、０次スペクトルは、縞画像のＤＣ成分であって、物体光束ＬＯの波面情報を含まない不要成分である。一方、±１次スペクトルの各々は、物体光束ＬＯの波面情報を含んだ必要成分である。
　ここで、波数空間における±１次スペクトルの原点からのシフト量は、干渉縞の空間周波数Ｋに等しく、また、Ｋの値は、回折格子１０１の格子ピッチＰ、レーザ光の波長λ、リレーレンズ１０２、１０４の焦点距離ｆ１、ｆ２などによって一義的に決まるので、予め計算しておくことが可能である。そこで、本実施形態の演算装置は、Ｋの値を予め記憶しているものとする。
　ステップＳ２：演算装置は、波数空間における±１次スペクトルの一方（１次スペクトル）を切り出すと共に、そのスペクトルを波数空間上でＫだけシフトさせることにより、波数空間上の原点に配置する。これによって、物体光束ＬＯの波面情報のみを含んだスペクトル画像（図３（Ｃ））が得られる。
　ステップＳ３：演算装置は、ステップＳ２で取得したスペクトル画像を逆ＦＦＴにより逆フーリエ変換することにより、撮像面１０５Ａにおける物体光束ＬＯの波面形状と、撮像面１０５Ａにおける物体光束ＬＯの振幅分布とを求める。さらに演算装置は、求めた波面形状を、階調画像からなるホログラフィ画像（図３（Ｄ））に変換し、そのホログラフィ画像をモニタへ表示する（以上、ステップＳ３）。
　このホログラフィ画像の階調分布は、標本３３の位相分布を表す。つまり、ホログラフィ画像には、標本３３中に存在する細胞の輪郭だけでなく、細胞の位相分布までもが反映されている。
　なお、以上のステップＳ１からステップＳ３までの処理に要する時間は、撮像素子１０５のフレーム周期よりも短い。よって、本実施形態の演算装置は、撮像素子１０５から縞画像が転送される度にステップＳ１からステップＳ３までの処理を実行してモニタ上のホログラフィ画像を更新する。
　したがって、ユーザは、標本３３中に存在する細胞の位相分布をリアルタイムで観察することができる。
　なお、本実施形態の顕微鏡システムは、以上のホログラフィ観察だけでなく、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察なども可能である。
　したがって、ユーザは、暗視野観察、位相差観察、微分干渉観察、蛍光観察などの他の観察方法で標本３３を大まかに観察し、詳細な観察が必要と感じた場合には、ホログラフィユニット１００を有効にセットして、標本３３の位相分布を観察する、といった柔軟な観察を行うことも可能である。
　［第１実施形態の作用効果］
　以上、本実施形態の撮像装置（１００）は、顕微鏡（１）の光学出力ポート（１００Ａ）に連結される撮像装置であって、前記顕微鏡（１）からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段（１０１）と、前記２つの分岐光束の一方を参照光束（ＬＲ）とし、他方を物体光束（ＬＯ）として干渉縞を生成する干渉手段（１０２、１０４）と、前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段（１０５）とを備える。
　したがって、本実施形態の撮像装置（１００）によれば、前記顕微鏡（１）の光学出力ポート（１００Ａ）を有効に利用して前記縞画像を取得することができる。この縞画像には、前記物体光束（ＬＯ）の波面形状（ひいては前記顕微鏡（１）にセットされた物体（３３）の位相分布）が反映されている。
　また、本実施形態の撮像装置（１００）は、前記撮像手段（１０５）に向かう前記参照光束（ＬＲ）の波面形状を予め決められた形状に整形する整形手段（１０３Ａ）を更に備える。
　このように前記参照光束（ＬＲ）の波面形状を整形しておけば、前記物体光束（ＬＯ）の波面形状（ひいては前記物体（３３）の位相分布）を、前記縞画像から簡単に算出することができる。
　また、前記分岐手段（１０１）は、ブレーズ型位相回折格子であり、前記回折格子（１０１）で発生した±１次回折光束の一方が前記参照光束（ＬＲ）として使用され、前記回折格子で発生した０次回折光束が前記物体光束（ＬＯ）として使用される。
　したがって、前記干渉縞に寄与する前記参照光束（ＬＲ）と前記物体光束（ＬＯ）との強度バランスを確実に制御できる。
　また、前記回折格子（１０１）と前記撮像手段（１０５）との間には、前記回折格子（１０１）で発生した余分な回折光束をカットする空間フィルタ（１０３）が配置される。
　この空間フィルタ（１０３）によれば、前記縞画像に対するノイズの重畳を抑えることができる。
　また、前記空間フィルタ（１０３）には、前記整形手段（１０３Ａ）の機能が搭載されている。
　このような空間フィルタ（１０３）を利用すれば、前記撮像装置（１００）に搭載すべき光学素子の点数が抑えられる（因みに、図２の例は、光学素子の点数は、５点に抑えられている。）。
　また、前記回折格子（１０１）の回折効率は、前記回折格子（１０１）から射出する前記参照光束（ＬＲ）の強度が前記回折格子（１０１）から射出する前記物体光束（ＬＯ）の強度よりも高くなるように設定されている。
　したがって、波面整形時に発生する前記参照光束（ＬＲ）の光量ロスを、補償することができる。また、前記干渉縞に寄与する前記参照光束（ＬＲ）及び前記物体光束（ＬＯ）の強度バランスを適正にすることもできる。
　また、前記撮像手段（１０５）の撮像面（１０５Ａ）に対する前記参照光束（ＬＲ）の入射角度と前記物体光束（ＬＯ）の入射角度との差は、ゼロ以外の所定値に設定されており、前記撮像手段（１０５）の撮像面（１０５Ａ）の配置先は、前記顕微鏡（１）の像面と光学的に共役な面（Ｂ）である。
　したがって、前記物体（３３）の位相分布を前記縞画像から簡単に算出することができる。
　また、前記撮像装置（１００）は、前記縞画像に基づき前記顕微鏡にセットされた物体（３３）の位相分布を算出する演算手段を更に備え、前記演算手段は、前記位相分布をモニタへ表示する。
　したがって、ユーザは、前記物体（３３）の位相分布を前記モニタ上で確認できる。
　また、前記撮像手段（１０５）及び前記演算手段は、繰り返し動作する。
　したがって、前記モニタ上の前記位相分布は、逐次に更新される。よって、ユーザは、前記物体（３３）の位相分布の時間変化をリアルタイム観察することができる。
　また、本実施形態の顕微鏡システムは、前記顕微鏡（１）と、前記撮像装置（１００）とを備え、前記顕微鏡（１）には、レーザ光源（２００）が搭載されている。
　したがって、前記撮像装置（１００）は、前記縞画像の取得に前記レーザ光源（２００）を有効利用することができる。
　因みに、前記レーザ光源（２００）を利用すれば、前記参照光束（ＬＲ）と前記物体光束（ＬＯ）との可干渉性が高まるので、前記縞画像の品質も高まる。
　［第２実施形態］
　以下、本発明の第２実施形態として第１実施形態の変形例を説明する。第１実施形態との相違点は、ホログラフィユニット１００の一部にある。
　図４は、第２実施形態のホログラフィユニット１００の構成を示す図である。
　図４に示すとおり本実施形態のホログラフィユニット１００は、第１実施形態のホログラフィユニットにおいて、回折格子１０１の代わりに回折格子１０１’を備えたものである。
　回折格子１０１’は、回折格子１０１を非ブレーズ型で構成したものである。つまり、回折格子１０１’は、透明基板に溝を周期的に形成したものである。この場合、透過－１次回折光束の強度が透過＋１次回折光束の強度と同様に強くなってしまうので、レーザ光の利用効率が低下するが、安価な回折格子を利用できるという利点がある。
　なお、例えば、本実施形態では、レーザ光の波長λを４８８ｎｍに設定し、対物レンズ３４－１の開口数ＮＡを０．４５に設定し、対物レンズ３４－１の倍率βを２０に設定し、回折格子１０１’の格子ピッチＰを４．７２μｍに設定し、リレーレンズ１０２の焦点距離ｆ１を５０ｍｍに設定し、リレーレンズ１０４の焦点距離ｆ２を５０ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの高さｈを５．１６６ｍｍに設定し、円形開口１０３Ｂの径φ３を２．２５ｍｍに設定し、画素ピッチｐを１．６７μｍに設定した。
　また、本実施形態では、標本３３における観察エリアの径（視野の径）φ１を３００μｍに設定し、第２対物レンズ４７の焦点距離ｆ０を２００ｍｍに設定し、ピンホール１０３Ａの径φ２を２０μmから３０μmの範囲に設定し、撮像面１０５Ａの有効径φ４を８ｍｍに設定し、回折格子１０１’の溝深さを５００ｎｍとした。
　［第３実施形態］
　以下、本発明の第２実施形態として第１実施形態の変形例を説明する。第１実施形態との相違点は、ホログラフィユニットに適用される干渉計の種類にある。具体的に、第１実施形態のホログラフィユニットでは、シアリング干渉計を利用したが、本実施形態のホログラフィユニットでは、マッハツェンダー干渉計を利用する。
　図５は、第３実施形態のホログラフィユニット３００の構成を示す図である。
　図５に示すとおり本実施形態のホログラフィユニット３００は、リレーレンズ３０１と、ビームスプリッタ３０２と、ピンホールマスク３０３と、光路折り曲げミラー３０４、３０５と、ビームスプリッタ３０６と、リレーレンズ３０７と、撮像素子３０８とが備えられる。
　図５に示すとおり、ホログラフィ観察時、ホログラフィユニット３００へ入射したレーザ光（平行光束）は、ホログラフィユニット３００のリレーレンズ３０１へ入射すると、リレーレンズ３０１の集光作用を受け、集光しながらビームスプリッタ３０２へ入射する。
　ビームスプリッタ３０２へ入射したレーザ光は、ビームスプリッタ３０２を透過する透過光束と、ビームスプリッタ３０２を反射する反射光束とに分岐される。
　なお、ビームスプリッタ３０２の透過／反射率は、透過光束の強度の方が反射光束の強度より高くなるように設定されている（なぜなら、本実施形態の参照光束ＬＲは、透過光束に基づき生成される。）。
　先ず、ビームスプリッタ３０２から射出した透過光束は、瞳共役面Ａの中心（光軸）に向かって集光する。
　ここで、瞳共役面Ａには、ピンホールマスク３０３が配置されており、ピンホールマスク３０３のピンホール３０３Ａは、その集光点の近傍に位置している。
　ピンホール３０３Ａには、透過光束を回折し、その光束の波面を理想球面に変換する機能が付与されている。そのために、ピンホール３０３Ａのサイズは十分に小さなサイズに設定されている。
　したがって、ピンホールマスク３０３のピンホール３０３Ａからは、理想球面波に変換された光束が射出する。本実施形態のホログラフィユニット３００は、この光束を参照光束ＬＲとして使用する。この参照光束ＬＲは、光路折り曲げミラー３０４によって偏向され、ビームスプリッタ３０６へ入射すると、ビームスプリッタ３０６を反射する。
　一方、ビームスプリッタ３０２から射出した反射光束は、瞳共役面Ａ’の中心（光軸）に向かって集光すると、再び発散光束となって進行し、光路折り曲げミラー３０５によって偏向された後、ビームスプリッタ３０６へ入射し、ビームスプリッタ３０６を透過する。本実施形態のホログラフィユニット３００は、この光束を物体光束ＬＯとして使用する。
　ビームスプリッタ３０６で反射した参照光束ＬＲと、ビームスプリッタ３０６を透過した物体光束ＬＯとの各々は、リレーレンズ３０７の集光作用を受けて平行光束となり、標本共役面Ｂへ入射する。
　ここで、物体光束ＬＯの単独光路に配置された光路折り曲げミラー３０５は、入射光路に対して４５°の角度で配置されているのに対して、参照光束ＬＲの単独光路に配置された光折り曲げミラー３０５は、入射光路に対して４５°から所定値だけずれた角度で配置されている。
　よって、標本共役面Ｂに対する物体光束ＬＯの入射角度はゼロとなるのに対して、標本共役面Ｂに対する参照光束ＬＲの入射角度は、ゼロ以外の所定値となる。
　ここで、標本共役面Ｂには、撮像素子３０８の撮像面３０８Ａが位置している。撮像面１０５Ａには、光軸（Ｚ方向）に垂直な所定方向（Ｘ方向）にかけて複数の画素が配列されており、Ｚ方向及びＸ方向の双方に垂直な所定方向（Ｙ方向）にかけても複数の画素が配列されている。
　この撮像面１０５Ａには、参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが互いに異なる角度で入射するので、撮像面３０８Ａにおいて参照光束ＬＲと物体光束ＬＯとが重複して入射する領域には、ストライプ状の干渉縞が生起する。
　なお、撮像面３０８Ａの光軸周りの回転位置は、撮像面３０８ＡのＸ方向及びＹ方向が干渉縞の縞方向に対して４５°の角度を成すように設定されている。
　撮像素子３０８は、例えば１／３０秒のフレーム周期で干渉縞を繰り返し撮像すると共に、その撮像で生成した縞画像を逐次に演算装置（不図示）へ転送する。
　不図示の演算装置は、撮像素子３０８から縞画像が転送されると、その縞画像に対して所定の演算処理を施すことにより、標本３３のホログラフィ画像（後述）を作成し、そのホログラフィ画像をモニタ（不図示）へ表示する。
　なお、不図示の演算装置、不図示のモニタは、第１実施形態におけるそれらと同様である。
　また、例えば、本実施形態では、レーザ光の波長λを４８８ｎｍに設定し、対物レンズ３４－１の開口数ＮＡを０．４５に設定し、対物レンズ３４－１の倍率βを２０に設定し、リレーレンズ３０１の焦点距離ｆ１を５０ｍｍに設定し、リレーレンズ３０６の焦点距離ｆ２を５０ｍｍに設定し、画素ピッチｐを４．４μｍに設定した。
　また、本実施形態では、標本３３における観察エリアの径（視野の径）φ１を３００μｍに設定し、第２対物レンズ４７の焦点距離ｆ０を２００ｍｍに設定した。
　［実施形態の補足］
　なお、上述した実施形態では、ホログラフィユニットの連結先を顕微鏡本体１のサイドポート１００Ａとしたが、顕微鏡本体１が光学出力ポートとして、例えば、左ポート、右ポート、ボトムポート、バックポートを備えていた場合には、ホログラフィユニットの連結先を、左ポート、右ポート、ボトムポート、バックポートの何れとしてもよいことは言うまでもない。
　また、上述した実施形態では、可動ミラーを使用し、複数の光学出力ポートの間で有効な光学出力ポートを切り換えたが、複数の光学出力ポートを同時に使用可能としてもよい。複数の光学出力ポートを同時に使用するためには、可動ミラーの代わりに非可動のビームスプリッタを使用すればよい。
　また、上述した実施形態では、ホログラフィユニットの観察対象を透明物体とし、透明物体の位相分布をホログラフィ画像として取得したが、ホログラフィユニットの観察対象を不透明物体とし、不透明物体の表面形状をホログラフィ画像として取得してもよい。但し、不透明物体をホログラフィユニットで観察する際の照明方法としては、透過照明ではなく落射照明を採用する必要がある。また、その場合も、光源は可干渉性の高い光源（レーザ光源）が使用されることが望ましい。
　また、上述した実施形態では、撮像ユニットに搭載される撮像素子の配置先が、標本共役面に一致していたが、標本共役面からずれていても構わない。但し、上述した演算処理によって算出できるのは、撮像面の位相分布であるので、標本共役面の位相分布を知るためには、撮像面の位相分布を標本共役面の位相分布へ換算する処理を、上述した演算処理に加える必要がある。
　１：顕微鏡本体、２：透過照明ユニット、３：落射照明ユニット、８：撮像ユニット、１００：ホログラフィユニット、２００：レーザユニット、２：透過照明ユニット、３：落射照明ユニット、８：撮像ユニット、１００Ａ：ポート、１０１：回折格子、１０２：リレーレンズ、１０３：空間フィルタ、１０４：リレーレンズ、１０５：撮像素子

Claims (14)

  1. 　顕微鏡の光学出力ポートに連結される撮像装置であって、
    　前記顕微鏡からの結像光束を２つの分岐光束に分岐する分岐手段と、
    　前記２つの分岐光束の一方を参照光束とし、他方を物体光束として干渉縞を生成する干渉手段と、
    　前記干渉縞を撮像して縞画像を生成する撮像手段と、
    　を備えることを特徴とする撮像装置。
  2. 　請求項１に記載の撮像装置において、
    　前記撮像手段に向かう前記参照光束の波面形状を、予め決められた形状に整形する整形手段を更に備える
    　ことを特徴とする撮像装置。
  3. 　請求項２に記載の撮像装置において、
    　前記分岐手段は、ブレーズ型位相回折格子である
    　ことを特徴とする撮像装置。
  4. 　請求項３に記載の撮像装置において、
    　前記回折格子で発生した±１次回折光束の一方が前記参照光束として使用され、前記回折格子で発生した０次回折光束が前記物体光束として使用される
    　ことを特徴とする撮像装置。
  5. 　請求項４に記載の撮像装置において、
    　前記回折格子と前記撮像手段との間には、前記回折格子で発生した余分な回折光束をカットする空間フィルタが配置される
    　ことを特徴とする撮像装置。
  6. 　請求項５に記載の撮像装置において、
    　前記空間フィルタには、前記整形手段の機能が搭載されている
    　ことを特徴とする撮像装置。
  7. 　請求項４～請求項６の何れか一項に記載の撮像装置において、
    　前記回折格子の回折効率は、前記回折格子から射出する前記参照光束の強度が前記回折格子から射出する前記物体光束の強度よりも高くなるように設定されている
    　ことを特徴とする撮像装置。
  8. 　請求項１～請求項７の何れか一項に記載の撮像装置において、
    　前記撮像手段の撮像面に対する前記参照光束の入射角度と前記物体光束の入射角度との差は、ゼロ以外の所定値に設定されている
    　ことを特徴とする撮像装置。
  9. 　請求項１～請求項８の何れか一項に記載の撮像装置において、
    　前記撮像手段の撮像面の配置先は、前記顕微鏡の像面と光学的に共役な面である
    　ことを特徴とする撮像装置。
  10. 　請求項１～請求項９の何れか一項に記載の撮像装置において、
    　前記縞画像に基づき前記顕微鏡にセットされた物体の位相分布を算出する演算手段を更に備える
    　ことを特徴とする撮像装置。
  11. 　請求項１０に記載の撮像装置において、
    　前記演算手段は、
    　前記位相分布をモニタへ表示する
    　ことを特徴とする撮像装置。
  12. 　請求項１１に記載の撮像装置において、
    　前記撮像手段及び前記演算手段は、繰り返し動作する
    　ことを特徴とする撮像装置。
  13. 　請求項１～請求項１２の何れか一項に記載の撮像装置と、
    　前記顕微鏡と、
    　を備えることを特徴とする顕微鏡システム。
  14. 　請求項１３に記載の顕微鏡システムにおいて、
    　前記顕微鏡には、
    　レーザ光源が搭載されている
    　ことを特徴とする顕微鏡システム。
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