WO2014048168A1 - 外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 - Google Patents

外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a tissue filler for surgical shaping cross-linking sodium hyaluronate gel and a preparation method thereof.
  • Hyaluronic acid also known as hyaluronic acid, hereinafter referred to as HA
  • HA hyaluronic acid
  • sodium salt is a natural high molecular mucopolysaccharide, which is widely distributed in mammalian connective tissue, cockscomb and streptococcus. Because it does not have species and organ specificity, hyaluronic acid gel prepared from hyaluronic acid as a filler is transplanted or injected into the body to show good body compatibility, and it can resist wrinkles, breast milk, padding, etc. It has no side effects on the human body and is therefore widely used in medical and cosmetic applications. Skin fillers made from HA or its sodium salt are most popular in cosmetic surgery.
  • tissue fillers for injection are similar to collagen, which last longer and have a lower risk of allergic reactions.
  • HA or its sodium salt is easily degraded by the action of enzymes such as hyaluronan hydrolase and free radicals in the living body, and thus the residence time in the living body is short.
  • enzymes such as hyaluronan hydrolase and free radicals in the living body
  • HA or its sodium salt In order to increase the residence time of HA or its sodium salt in the body, it is usually cross-linked with HA or its sodium salt to form a chemical bond between the hydroxyl group in the HA or its sodium salt polymer chain and the crosslinking agent to form a cross-linking.
  • HA or its sodium salt gel In order not to affect the biocompatibility of the gel, the concentration of the crosslinking agent should not be too high.
  • the gel derivative obtained has a low ability to undergo enzymatic hydrolysis in the antibody, and the residence time in the body is relatively short, and the residence time is about 1 to 6 months. If the amount of the crosslinking agent is too large, the residence time in the body is prolonged accordingly, but the viscosity is high, the gel hardness is increased, and it is not easy to pass the 30G or even 27G needle, and the injectability is lowered. In addition, the high amount of cross-linking agent causes excess cross-linking agent to remain in the product and is difficult to purify and clean. Thus, the cytotoxicity of the crosslinked HA or its sodium salt gel is large, and it is easy to cause side effects to the human body.
  • the cross-linking reaction of the existing HA or the sodium salt thereof is to cross-link the HA or the sodium salt thereof by adding only the crosslinking agent in the homogeneous alkaline aqueous solution, and the anti-linking degree is improved by the method of increasing the degree of crosslinking.
  • Biodegradability prolonging the residence time of skin fillers in the body.
  • a first object of the present invention is to provide a surgical filler for cross-linking transparent tissue which can effectively improve the resistance to enzymatic hydrolysis while maintaining the excellent biocompatibility of sodium hyaluronate itself.
  • Sodium gel
  • a technical solution for achieving the first object of the present invention is: a surgical dressing tissue filler cross-linking sodium hyaluronate gel, characterized in that it is an alkaline solution of sodium hyaluronate and an epoxy group-containing Long-chain alkane and epoxy-containing cross-linking agent, 35 ° C ⁇ 50 ° C reaction 2 ⁇ 5 hours to form cross-linked sodium hyaluronate, and then washed, gelatinized, sterilized, wherein, sodium hyaluronate: epoxy-containing crosslinker: The epoxy group-containing long-chain alkane has a molar ratio of 10:4 to 1:1 to 4 ; the epoxy group-containing long-chain alkane has 6 to 18 carbon atoms;
  • the epoxy group-containing crosslinking agent is 1,4-butanediol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether having a molecular weight of 500 to 6000, 1,2,7,8-diepoxyoctane One of alkane, 1,2,3,4-dibutylene oxide;
  • the sodium hyaluronate alkaline solution is formed by dissolving dry powder of sodium hyaluronate in a mixed solution composed of a 0.2-0.5 M aqueous sodium hydroxide solution and dimethyl sulfoxide, wherein the concentration of sodium hyaluronate is 4wt% ⁇ 8wt%; 0.2-0.5M sodium hydroxide aqueous solution and dimethyl sulfoxide volume ratio is 10: 7 ⁇ 1.
  • the chemical structure of the crosslinked sodium hyaluronate gel contains a chemically bonded hydrophobic group having a self-adhesive self-aggregation function, and the number of carbon atoms of the hydrophobic group is 6 to 18.
  • a second object of the present invention is to provide a surgical filler for cross-linking which is capable of effectively improving the resistance to enzymatic hydrolysis while maintaining the excellent biocompatibility of sodium hyaluronate itself.
  • a method of sodium sulfate gel which is easy to handle and the quality of the obtained product is stable.
  • a technical solution for achieving the second object of the present invention is: a method for preparing a cross-linked sodium hyaluronate gel for the above-mentioned surgical orthopedic tissue filler, characterized in that the specific preparation steps are as follows:
  • sodium hyaluronate epoxy group-containing crosslinker: molar ratio of long-chain alkane containing epoxy group is 10: 4 ⁇ 1: 1 ⁇ 4 ; number of carbon atoms of long-chain alkane containing epoxy group 6 ⁇ 18; 0.2 ⁇ 0.5M sodium hydroxide aqueous solution and dimethyl sulfoxide volume ratio is 10: 7 ⁇ 1 ; sodium hyaluronate alkaline solution, sodium hyaluronate concentration is 4wt% ⁇ 8wt %; the volume ratio of the aqueous sodium hydroxide solution to the added acetone is 1: 4 to 2: 3; the average molecular weight of sodium hyaluronate is 500,000 to 2,000,000; the epoxy group-containing crosslinking agent is 1, 4-butanediol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether having a molecular weight of 500 to 6000, 1,2,7,8-diepoxyoctane, 1,2,3,
  • step 2 in the cross-linked sodium hyaluronate powder obtained in step 1, adding water for injection to form a cross-linked sodium hyaluronate gel, adding the water for injection to the collected gel particles, and stirring and washing at 15 ° C to 35 ° C After 2 ⁇ 5 hours, filter the water for injection, The gel particles are collected and washed with water for injection, and after repeated washing for 4 to 5 times according to the above process, the collected gel particles are cross-linked sodium hyaluronate gel;
  • step 4 The gel particles collected in step 3 are filled in a pre-sterilized disposable syringe, and sterilized in steam at 121 ° C to 125 ° C for 15 to 25 minutes to obtain a cross-linking transparent for surgical plastic tissue filler.
  • Sodium carbonate gel a pre-sterilized disposable syringe
  • the chemical structure of the prepared crosslinked sodium hyaluronate gel comprises a chemically bonded hydrophobic group having a self-adhesive self-aggregating function, the hydrophobic group The number of carbon atoms in the group is 6 to 18.
  • the technical effect of the present invention is:
  • the technical solution of the present invention uses an epoxy group-containing crosslinking agent, for example, 1,4-butanediol diglycidyl ether to crosslink sodium hyaluronate, and at the same time introduces an appropriate amount of An epoxy-based long-chain alkane (the number of carbon atoms of a long-chain alkane is 6 to 18). Since the long-chain alkane is a hydrophobic group, it becomes a part of the crosslinked sodium hyaluronate gel network structure, and is adjusted.
  • an epoxy group-containing crosslinking agent for example, 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • the hydrophilicity of the cross-linked sodium hyaluronate gel prevents the entry of the enzyme and leads to the degradation of the cross-linked sodium hyaluronate, prolonging its retention time in the body, that is, the filler can maintain the effect of filling the tissue volume for a longer period of time.
  • the introduced long-chain alkane produces a self-adhesive self-aggregation function through strong hydrophobic association, and many physical clusters are formed in the cross-linked sodium hyaluronate gel, so that the anti-enzymatic effect can be increased without affecting
  • the biocompatibility and other physical properties of the gel achieve the same anti-enzymatic stability and even higher stability in the case of high cross-linking degree; compared with the gel of the same cross-linking degree, due to the transparency of the present invention
  • the sodium gel has the above self-adhesive self-aggregation function, so that the anti-enzymatic ability of the sodium hyaluronate gel of the invention can be increased by 2 to 3 times in vitro, and the residence time in the body is greatly prolonged, and therefore, the gel length is long.
  • the present invention also finds that since the degree of swelling of the gel of the present invention is not lowered by the introduction of the hydrophobic chain, the flexibility of the gel can be maintained, and the injection needle of 30G can be passed without additional lubricant addition (see table). 2).
  • FIG. 1 is a schematic view showing the chemical structure of a crosslinked sodium hyaluronate gel according to the present invention
  • Figure 2 shows the FT-IR spectrum.
  • 1 is an FT-IR spectrum of sodium hyaluronate used as a raw material of the present invention
  • 2 is an FT-IR spectrum of the crosslinked sodium hyaluronate gel of the present invention
  • Figure 3 is a standard 1H-NMR chart of sodium hyaluronate used as a raw material of the present invention
  • Figure 4 is a ⁇ -NMR spectrum of the sodium hyaluronate treated by the method of the present invention alone with an epoxy group-containing long-chain alkane
  • Figure 5 is a method of the present invention cross-linking with 1,4-butanediol diglycidyl ether alone 1H-NMR spectrum of the latter sodium hyaluronate
  • Figure 6 is an iH-NMR chart of a crosslinked sodium hyaluronate gel obtained by treating a long-chain alkane containing an epoxy group and a crosslinking agent 1,4-butanediol diglycidyl ether according to the method of the present invention.
  • sodium hyaluronate 1,4-butanediol diglycidyl ether: 1,2-epoxydodecane molar ratio of 10: 2: 1; number of carbon atoms of long-chain alkane containing epoxy groups 12; 0.2 ⁇ 0.5M sodium hydroxide aqueous solution and dimethyl sulfoxide volume ratio is 4: 1, sodium hyaluronate alkaline solution, sodium hyaluronate concentration is 4.0wt% ; sodium hydroxide aqueous solution The volume ratio to the added acetone is 1:4;
  • step 3 adding 500 ml of isotonic physiological saline to the gel particles collected in step 2, and washing and washing at 25 ° C for 2 hours, filtering out isotonic physiological saline, collecting gel particles, and washing with isotonic saline, as described above After repeated washing for 4 times, the gel particles having an average particle diameter of 250 ⁇ m were collected by sieve screening;
  • step 3 The gel particles collected in step 3 were filled in a pre-sterilized disposable syringe and sterilized in steam at 121 ° C for 25 minutes to obtain a surgical plastic tissue-crosslinking cross-linking sodium hyaluronate gel.
  • Example 2 to Example 7 Preparation of Surgical Plastic Tissue Filler Crosslinked Sodium Hyaluronate Gel
  • step 1 of Example 1 sodium hyaluronate: 1,4-butanediol diglycidyl ether: 1,2-epoxydodecane
  • step 1 of Example 1 sodium hyaluronate: 1,4-butanediol diglycidyl ether: 1,2-epoxydodecane
  • the amount and the molar ratio of the three were added as shown in Table 1, respectively, to obtain a crosslinking agent of 1,4-butanediol diglycidyl ether and 1,2-epoxydodecane in a different amount of crosslinked sodium hyaluronate. gum.
  • the specific detection method is as follows:
  • control group was added with RPMI1640 medium; the experimental group was added with RPMI1640 medium containing 50% of the above extract; the control group and the experimental group were separately placed in a 37 °C carbon dioxide incubator for further culture, and taken out after 2 days, the culture plate was The well was added with MTT solution (5 mg/ml) 20 L, and the culture was continued at 37 ° C for 4 hours to terminate the culture;
  • RCR (%) (average absorbance value of the experimental group / average absorbance value of the control group) X 100%;
  • C is not less than 100%, and the cytotoxicity is graded to 0; C is 75 ⁇ 99%, and the cytotoxicity is grade 1;
  • C is 50 ⁇ 74%, and the cytotoxicity is grade 2;
  • C is 25 to 49%, and the cytotoxicity is graded to 3;
  • C is 1 ⁇ 24%, and the cytotoxicity is grade 4;
  • RC is 0% and cytotoxicity is grade 5;
  • the biocompatibility of the crosslinked sodium hyaluronate gel was judged by the relative increase rate of the cells measured by the above method. The higher the C, the better the biocompatibility of the crosslinked sodium hyaluronate gel to be tested;
  • the specific detection methods are as follows:
  • the anti-enzymatic properties of the cross-linked sodium hyaluronate gel were judged by the degradation rate of the enzyme measured by the above method.
  • the lower the enzymatic degradation rate the better the anti-enzymatic properties of the cross-linked sodium hyaluronate gel to be tested.
  • the specific detection methods are as follows:
  • the injectability of the crosslinked sodium hyaluronate gel can be indirectly judged by the degree of swelling measured as described above. The higher the degree of swelling, the better the hydrophilicity of the crosslinked sodium hyaluronate gel to be tested, and the softer the gel, the better the injectability.
  • Table 2 Note 4 gel particle size
  • the specific test method is to detect the particle size D [4, 3] using a Mastersizer 2000 particle size analyzer from Malvern, UK.
  • the specific detection methods are as follows:
  • the method for preparing the crosslinked sodium hyaluronate gel of this embodiment is basically the same as that of Example 1, except that the molecular weight of sodium hyaluronate is 1.5 million, sodium hyaluronate: BDDE: 1,2-epoxy ten The molar ratio of dioxane is 10:3:1 and 10:3:2, respectively.
  • the enzymatic degradation rates of the gels prepared in Examples 8 to 9 were 30.20% and 32.5%, respectively, according to the above method, indicating that the molecular weight of sodium hyaluronate was 1.5 million, sodium hyaluronate: BDDE: 1,2- The molar ratio of epoxy dodecane is 10:3:
  • cross-linking modification of sodium hyaluronate of the present invention did not change the basic chemical structure of sodium hyaluronate, thus ensuring that the biocompatibility of the cross-linked sodium hyaluronate gel was not affected.
  • Cross-linking sodium hyaluronate gel ensures that the epoxy-containing crosslinker 1,4-butanediol diglycidyl ether (BDDE) is crosslinked with sodium hyaluronate and ensures a 1,2-ring Oxydodecane is chemically bonded to sodium hyaluronate.
  • BDDE 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • Polyethylene glycol diglycidyl ether, 1,2,7,8-diepoxyoctane or 1,2,3,4-dibutylene oxide having a molecular weight of 500 to 6000 is used as the epoxy group.
  • the cross-linking agent of the group is combined with a long-chain alkane having an epoxy group (the carbon number of the long-chain alkane is 6 to 18), and a cross-linked sodium hyaluronate gel having the same performance can be obtained, and thus will not be described again.

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Abstract

本发明涉及一种外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶及其制备方法。该凝胶是透明质酸钠碱性溶液与含环氧基的长链烷烃及含环氧基的交联剂，于35°C〜50°C反应2〜5小时形成交联透明质酸钠，再经洗涤、凝胶化、灭菌制得的，其中，透明质酸钠：含环氧基的交联剂：含环氧基的长链烷烃的摩尔比为10：4〜1：1〜4；所述含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为6〜18个。本发明的凝胶一方面可以有效提高抗酶解的能力，更加稳定，同时也能维持透明质酸钠本身优异的生物相容性，不影响可注射性。

Description

外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶及其制备方法 技术领域
[0001] 本发明涉及一种外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶及其制备方法。
背景技术
[0002] 透明质酸（又名玻璃酸， 以下简称 HA)或者其钠盐是一种天然高分子粘多糖类物质， 广泛分布于哺乳动物的结缔组织、鸡冠和链球菌的夹膜等处，由于不具有种属及脏器特异性， 由透明质酸制得的透明质酸凝胶作为填充物移植或注入肌体都显示良好的肌体相容性，起到 抗皱、 丰乳、 充垫等作用， 而且对人体无副作用， 因此， 广泛用于医疗、 美容。 以 HA或者 其钠盐为原料制造的皮肤填充剂在美容外科整形中最受欢迎。这些用于注射的组织填充剂与 胶原蛋白相似， 其疗效更长久， 过敏反应风险更低。 但是， HA或者其钠盐在生物体内易因 酶如透明质酸水解酶和自由基的作用而发生降解， 因此在生物体内的滞留时间短。 为了提高 HA或者其钠盐在体内的滞留时间， 通常采用对 HA或者其钠盐进行交联， 使 HA或者其钠 盐高分子链中的羟基基团与交联剂形成化学键合制得交联 HA或者其钠盐凝胶。为了不影响 凝胶的生物相容性， 交联剂的使用浓度不宜过高。 但当交联剂用量少时， 所得凝胶衍生物抵 抗体内酶解的能力低， 在体内停留的时间就比较短， 停留时间大约在 1〜6个月左右。 如果 交联剂用量过大时， 在体内的停留时间相应延长了， 但粘度较高， 凝胶硬度增加， 不容易通 过 30G乃至 27G的针头， 可注射性下降。 此外， 交联剂用量高， 会使过量交联剂残留于产 物中， 且很难纯化清洗。 这样， 使得交联 HA或者其钠盐凝胶的细胞毒性较大， 容易对人体 产生副作用。而现有 HA或者其钠盐的交联反应均是在均相的碱性水溶液中只加入交联剂对 HA或者其钠盐进行交联， 而且均是通过提高交联度的方法来提高抗生物降解能力， 延长皮 肤填充剂在体内停留时间。 这样， 一方面会破坏交联 HA或者其钠盐凝胶的生物相容性， 另 一方面又会使凝胶产品的粘弹性下降， 硬度增加， 可注射性下降。
发明内容
[0003] 本发明的第一个目的是：提供一种可以有效提高抗酶解的能力， 同时也能维持透明质 酸钠本身优异的生物相容性的外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶。
[0004] 实现本发明第一个目的的技术方案是：一种外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝 胶， 其特征在于， 它是透明质酸钠碱性溶液与含环氧基的长链烷烃及含环氧基的交联剂， 于 35 °C〜50°C反应 2〜5小时形成交联透明质酸钠， 再经洗涤、 凝胶化、 灭菌制得的， 其中， 透明质酸钠 ： 含环氧基的交联剂： 含环氧基的长链烷烃的摩尔比为 10 ： 4〜1： 1〜4; 所述含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 6〜18个；
所述含环氧基的交联剂为 1,4-丁二醇二缩水甘油醚、 分子量为 500〜6000的聚乙二醇二 缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷、 1,2,3,4-二环氧丁烷中的一种；
所述透明质酸钠碱性溶液是由透明质酸钠干粉溶解于由 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液和 二甲亚砜组成的混合溶液后形成的， 其中， 透明质酸钠的浓度为 4wt%〜8wt%; 0.2-0.5M 的氢氧化钠水溶液与二甲亚砜的体积比为 10 ： 7〜1。
[0005] 上述交联透明质酸钠凝胶的化学结构中包含化学键合的具有自黏附自聚集功能的疏 水基团， 该疏水基团的碳原子数目为 6〜18个。
[0006] 本发明的第二个目的是：提供一种制备可以有效提高抗酶解的能力， 同时也能维持透 明质酸钠本身优异的生物相容性的外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶的方法，该方 法便于操作， 所得产品质量稳定。
[0007] 实现本发明第二个目的的技术方案是：一种上述外科整形用组织填充剂交联透明质酸 钠凝胶的制备方法， 其特征在于， 具体制备步骤如下：
①将透明质酸钠干粉溶解于由 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液和二甲亚砜组成的混合溶液 后获得透明质酸钠碱性溶液，然后向透明质酸钠碱性溶液中加入含环氧基的长链烷烃及含环 氧基的交联剂， 搅拌状态下加热至 35 °C〜50°C并保温 2〜5小时后， 冷却至室温， 在搅拌下 滴加丙酮生成白色粉末形成固一液混合物料， 加入盐酸将固一液混合物料的 pH 值调节至 6.5〜7.4， 滤除液体后， 所得固体物料用异丙醇和丙酮分别洗涤 3〜5次， 再真空干燥至挥发 物质含量低于 2ppm， 所得白色干粉即为交联透明质酸钠粉末；
其中， 透明质酸钠： 含环氧基的交联剂： 含环氧基的长链烷烃的摩尔比为 10 ： 4〜1 ： 1〜4; 含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 6〜18个； 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液与二甲 亚砜的体积比为 10 ： 7〜1 ; 透明质酸钠碱性溶液中， 透明质酸钠的浓度为 4wt%〜8wt%; 氢氧化钠水溶液与滴加的丙酮的体积比为 1 : 4〜2： 3； 透明质酸钠的平均分子量为 50万〜 200万； 所述含环氧基的交联剂为 1,4-丁二醇二缩水甘油醚、 分子量为 500〜6000的聚乙二 醇二缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷、 1,2,3,4-二环氧丁烷中的一种；
②在步骤①得到的交联透明质酸钠粉末中，加入注射用水溶胀形成交联透明质酸钠凝胶， 收集的凝胶颗粒中加入注射用水， 在 15 °C〜35 °C下搅拌洗涤 2〜5小时后， 滤除注射用水， 收集凝胶颗粒， 再用注射用水洗涤， 按上述过程反复洗涤共 4〜5次后， 收集的凝胶颗粒即 为交联透明质酸钠凝胶；
③向步骤②收集的凝胶颗粒中加入等渗生理盐水， 在 15 °C〜35 °C下搅拌洗涤 2〜5小时 后，滤除等渗生理盐水，收集凝胶颗粒，再用等渗生理盐水洗涤，按上述过程反复洗涤共 4〜 5次后， 经筛网分筛收集平均粒径为 150 μ m〜350 μ m的凝胶；
④将步骤③收集的凝胶颗粒灌装于事先灭菌的一次性注射器中，在 121 °C〜125 °C蒸汽中 灭菌 15〜25分钟， 即可得到外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶。
[0008] 上述交联透明质酸钠凝胶的制备方法中，制得的交联透明质酸钠凝胶的化学结构中包 含化学键合的具有自黏附自聚集功能的疏水基团， 该疏水基团的碳原子数目为 6〜18个。
[0009] 本发明的技术效果是： 本发明技术方案采用含环氧基的交联剂， 例如 1,4-丁二醇二缩 水甘油醚对透明质酸钠进行交联时， 同时引入适量含环氧基的长链烷烃（长链烷烃的碳原子 数目在 6〜18)， 由于该长链烷烃为疏水基，它成为交联透明质酸钠凝胶网状分子结构中的一 部分， 调整了交联透明质酸钠凝胶的亲水性， 避免酶的进入而导致交联透明质酸钠降解， 延 长了其在体内留存时间， 也即填充剂能维持组织容积填充更长时间的效果， 另外， 引入的长 链烷烃通过强大的疏水缔合产生自黏附自聚集功能，在交联透明质酸钠凝胶中会形成很多物 理团簇， 因而可以达到增加抗酶解的效果， 并且不影响凝胶的生物相容性和其他物理性能， 达到了高交联度情况下相同的抗酶解稳定性， 甚至稳定性更高； 与相同交联度的凝胶相比， 由于本发明透明质酸钠凝胶具有上述自黏附自聚集功能，使得本发明透明质酸钠凝胶在体外 抗酶解的能力可以增加 2〜3倍， 在体内的停留时间会大大延长， 因此， 凝胶的长效稳定性 提高。 本发明同时发现， 由于本发明凝胶的溶胀度不会由于疏水链的引入而降低， 因此， 能 保持凝胶的柔软性， 不需要额外添加润滑剂， 就可以通过 30G的注射针头 (见表 2)。
附图说明
[0010] 图 1为本发明交联透明质酸钠凝胶的化学结构示意图；
图 2为 FT-IR图谱
其中： 1为用作本发明原料的透明质酸钠的 FT-IR图谱； 2为本发明交联透明质酸钠凝胶 的 FT-IR图谱；
图 3为用作本发明原料的透明质酸钠的标准 1H-NMR图谱；
图 4为本发明方法单独用含环氧基的长链烷烃处理后的透明质酸钠的 ^-NMR图谱； 图 5为本发明方法单独用 1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联后的透明质酸钠的 1H-NMR图谱； 图 6为本发明方法用含环氧基的长链烷烃及交联剂 1,4-丁二醇二缩水甘油醚处理后得到 的交联透明质酸钠凝胶的 iH-NMR图谱。
具体实施方式
[0011] 以下结合实施例及附图对本发明做进一步描述， 但不局限于此。
[0012] 实施例所用原材料除另有说明外均为市售医药级用品， 可通过商业渠道购得。
[0013] 实施例 1制备外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶
具体步骤如下：
①将 10g透明质酸钠干粉（平均分子量为 200万）溶解于由 200ml 0.5M的氢氧化钠水溶 液和 50ml二甲亚砜组成的混合溶液后获得透明质酸钠碱性溶液， 然后向透明质酸钠碱性溶 液中加入 0.5ml含环氧基的长链烷烃 1,2-环氧十二烷 （分子量 184.32， 纯度 98%， Sigma公 司产品）及 1ml含环氧基的交联剂 1,4-丁二醇二缩水甘油醚（分子量 202.25，纯度 98%， Sigma 公司产品）， 搅拌状态下加热至 40°C并保温 5小时后， 冷却至室温（15°C〜30°C )， 在搅拌下 滴加丙酮直至出现白色粉末， 形成固一液混合物料（丙酮的滴加量为 800ml)， 加入 5M盐酸 调节固一液混合物料的 pH值至 7， 滤除液体后， 所得固体粉末用异丙醇洗涤 3次， 然后丙 酮洗涤 5次 （异丙醇和丙酮每次用量均为 100ml)， 再真空干燥至挥发物质含量低于 2ppm， 所得白色干粉即为交联透明质酸钠粉末， 其化学结构式见附图 1 ;
其中， 透明质酸钠 ： 1,4-丁二醇二缩水甘油醚 ： 1,2-环氧十二烷的摩尔比为 10 ： 2 ： 1； 含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 12个； 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液与二甲亚砜的体积 比为 4 ： 1， 透明质酸钠碱性溶液中， 透明质酸钠的浓度为 4.0wt%; 氢氧化钠水溶液与滴加 的丙酮的体积比为 1 ： 4;
②在步骤①得到的交联透明质酸钠粉末中加入 1L注射用水， 25°C溶胀 8小时形成交联 透明质酸钠凝胶， 收集的凝胶颗粒中加入注射用水 1L， 在 25°C下搅拌洗涤 2小时后， 滤除 注射用水， 收集凝胶颗粒， 再用注射用水洗涤， 按上述过程反复洗涤共 4次后， 收集的凝胶 颗粒即为交联透明质酸钠凝胶；
③向步骤②收集的凝胶颗粒中加入 500ml等渗生理盐水， 在 25°C下搅拌洗涤 2小时后， 滤除等渗生理盐水，收集凝胶颗粒，再用等渗生理盐水洗涤，按上述过程反复洗涤共 4次后， 经筛网分筛收集平均粒径为 250 μ m的凝胶颗粒；
④将步骤③收集的凝胶颗粒灌装于事先灭菌的一次性注射器中， 在 121 °C蒸汽中灭菌 25 分钟， 即可得到外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶。 [0014] 实施例 2〜实施例 7制备外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶
具体步骤与实施例 1基本相同，不同之处在于：实施例 1的步骤①中，透明质酸钠 ： 1,4- 丁二醇二缩水甘油醚 ： 1,2-环氧十二烷的投料量及三者的摩尔比分别按表 1所示添加， 获得 交联剂 1,4-丁二醇二缩水甘油醚和 1,2-环氧十二烷用量不同的交联透明质酸钠凝胶。
[0015] 表 1
Figure imgf000007_0001
检测实施例 1至实施例 7制得的凝胶的颗粒大小、 可注射性、 细胞毒性、 酶降解率及溶 胀度， 同时， 检测单独用 BDDE交联的透明质酸钠凝胶商业化产品， 检测结果见表 2。
[0016] 表 2
用 BDDE 实施例 实施例 实施例 实施例 实施例 实施例 实施例 交联的 凝胶
1 2 3 4 5 6 7 商业化
-iz:口 广口口 颗粒大小 团状凝
250 300 280 300 180 200 350 (微米） 胶
可注射性
容易（含
( 30G 针 容易 容易 容易 容易 容易 容易 困难
润滑剂） 头）
细 胞 毒 1级 1级 1级 1级 1级 1级 2级 1级 性， 级 ( 90. 0 ) ( 83. 84 ( 95. 0 ) ( 82. 2 ) (85. 4) (76. 2) (65. 0) ( 85. 2 )
( RCR %) )
酶降解率
20. 0 53. 0 80. 0 40. 3 15. 0 10. 0 35. 0 86. 0 (%)
溶胀度
3500 2500 7450 2100 2600 2400 1500 2200 (%) 由表 2可以看出， 通过单独增加 BDDE交联剂的用量（如实施例 2、 4、 7)， 溶胀度会降 低， 抗酶解性也会提高， 但在一定的比例下（实施例 7)， 凝胶硬度增加， 可注射性下降， 必 须通过利用润滑剂提高其可注射性， 另外细胞毒性也增加。而本发明通过引进含环氧基长链 烷烃（如实施例 1、 5和 6)不会影响原来透明质酸的亲水能力， 凝胶的溶胀度没有下降， 但 抗酶解性却得到提高， 同时细胞毒性能通过生物相容性的检验标准。
[0017] 表 2注 1 ： 体外细胞毒性测试 根据 EN ISO 10993-5: 2009《医疗器械的生物学评价
--第 5部分： 体外细胞毒性试验》 标准， 检测细胞增值率， 交联透明质酸钠作为三类医疗器 械进行体外细胞毒性测试。
[0018] 具体检测方法如下：
①先将待测交联透明质酸钠凝胶与 RPMI1640培养液按 0.2g/ml混合， 置于 37°C， 5%二 氧化碳孵箱中浸提 72小时， 用 0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌， 得到浸提液；
②将 l X 105 /mL的 L929细胞悬浮液接种于 96孔细胞培养板， 置于 37°C二氧化碳培 养箱中培养 24小时， 待细胞贴壁生长后， 去除上清液， 分成对照组和实验组两组；
③对照组加入 RPMI1640培养液； 实验组加入含 50%上述浸提液的 RPMI1640培养液； 将对照组和实验组分别置于 37°C二氧化碳培养箱中继续培养，于 2天后取出，培养板每孔加 入 MTT溶液 （5mg/ml) 20 L, 于 37 °C继续培养 4小时， 终止培养；
④小心吸弃孔内培养上清液， 每孔加入 200 L DMSO， 振荡 10分钟混勾后， 用酶联免 疫检测仪在 630nm下分别测定其吸光度值；
⑤根据下面的公式计算细胞相对增值率 （RCR)， RCR ( %) = (实验组平均吸光度值 / 对照组平均吸光度值） X 100%;
⑥细胞相对增值率 RCR与细胞毒性分级关系如下：
C 不小于 100%， 细胞毒性分级为 0级； C 为 75〜99%， 细胞毒性分级为 1级；
C 为 50〜74%, 细胞毒性分级为 2级；
C 为 25〜49%， 细胞毒性分级为 3级；
C 为 1〜24%， 细胞毒性分级为 4级；
RC 为 0%， 细胞毒性分级为 5级；
用按上述上方法测得的细胞相对增值率判断交联透明质酸钠凝胶的生物相容性。 C 越 高， 表明待测交联透明质酸钠凝胶的生物相容性越好；
表 2注 2酶降解率
具体检测方法如下：
①取待测交联透明质酸钠凝胶样品，用 PBS稀释至样品的交联透明质酸钠浓度为 4mg/ml 作为供试品；
② 取 l .Og供试品， 力 B 50U lml透明质酸酶液震荡 lmin， 于 37°C水浴中 24小时， 然 后在 100°C煮沸 lOmin灭活；
③滤液经 0.45 μ m微孔滤膜抽滤， 然后用 PBS定容至 10ml;
④采用改良咔脞显色法 （参考文献： Bitter .T， Muir H.M, (1962) A modified uronic acid carbarbazole reation .Anal.Biochem.4,330-333. ) 测定糖醛酸含量， 乘以 2.07后折算为加入酶 液的样品中交联透明质酸钠的含量 C1 ; 未加酶液样品中的交联透明质酸钠含量为 C2， 计算 酶降解率 = d/ C2 X 100% ；
用按上述方法测得的酶降解率判断交联透明质酸钠凝胶的抗酶解性。 酶降解率越低， 表 明待测交联透明质酸钠凝胶的抗酶解性越好， 交联透明质酸钠凝胶在体内的停留时间越长， 凝胶的长效稳定性好。
[0019] 表 2注 3溶胀度
具体检测方法如下：
将凝胶成膜后真空烘干得凝胶膜， 将所得干凝胶膜精确称量， 其重量为 Wd， 然后加到 PBS中， 常温下放置 24小时， 把充分膨胀的凝胶膜取出， 用吸水纸去除凝胶膜表面的游离 水后， 称量凝胶膜重量为 Wg, 计算溶胀度 （％) =(Wg/Wd ) X 100%;
用按上述方法测得的溶胀度可以间接判断交联透明质酸钠凝胶的可注射性。 溶胀度越高 表明待测交联透明质酸钠凝胶亲水性越好， 凝胶越柔软， 可注射性提高。
[0020] 表 2注 4凝胶颗粒大小 具体检测方法是利用英国 Malvern 公司的 Mastersizer 2000 型粒度测定仪检测颗粒大小 D[4,3]。
[0021] 表 2注 5可注射性
具体检测方法如下：
在一次性使用的 lml无菌注射针管内， 先装入已经消毒灭菌的凝胶， 再装上 30G注射针 头， 然后按照正常注射挤压的办法挤出凝胶， 用手感判断可注射难易程度。
[0022] 实施例 8〜9
本实施例的制备交联透明质酸钠凝胶的方法与实施例 1基本相同， 不同之处在于透明质 酸钠的分子量为 150万， 透明质酸钠 ： BDDE ： 1,2-环氧十二烷的摩尔比分别是 10 ： 3： 1 和 10 ： 3 ： 2。
[0023] 按照上述方法检测实施例 8〜9制备的凝胶的酶降解率分别为 30.20% 和 32.5%， 表 明透明质酸钠的分子量为 150万，透明质酸钠 ： BDDE ： 1,2-环氧十二烷的摩尔比在 10: 3：
1 就可以满足耐酶解性的要求。
[0024] 对本发明交联透明质酸钠凝胶进行红外光谱检测
①采用传统 FT-IR傅立叶变换红外光谱仪
②检测方法如下：
采用传统方法将用作原料的透明质酸钠和实施例 1制得的交联透明质酸钠凝胶冷冻干燥 样品和溴化钾压片在 FT-IR上扫描检测红外结构， 得到的图谱见附图 2， 其中： 1为用作本 发明原料的透明质酸钠的 FT-IR图谱； 2为本发明交联透明质酸钠凝胶的 FT-IR图谱；
分析附图 2 中的图谱 1 和 2 可以看出二者的红外结构谱图一致， 均存在以下波 峰： 3395cm—1【 v (NH) , ν (OH) OH禾 Π NHCO], 2916cm—1【 v (CH) C— CH2— C】， 1615cm—1【 δ (NH)酰胺 （ I I ) 和羧酸基团】， 1411cm—1 【 v (CN) 和 δ (ΝΗ)酰胺 I I I】， 1377cm—1 【 v (C=0) -C00H], 1044cm—1【 v (C- 0) C- 0- C】， 945cm—1【 δ (0- H) 和 v (C- C) C_0- C (环) 和 0H】， 612cm— 1【ω (N-H)酰胺 I】。 证明本发明对透明质酸钠进行交联改性并未改变透明质 酸钠的基本化学结构， 这样就确保交联透明质酸钠凝胶的生物相容性不受影响。
[0025] 对本发明交联透明质酸钠凝胶进行 ^-NMR分析
检测检测方法
①用 NMR仪器 （300HZ， Bruker, Switzerland )； ②检测方法如下：
1 ) 原料透明质酸钠溶解在 D20中， 进行 NMR检测， 其检测图谱见附图 3 ; 2) 本发明交联透明质酸钠凝胶 （实施例 1制得） 用 NaOH调整到 pH=8， 高压 121 °C灭 菌 30分钟， 形成液体， 然后冷冻干燥得粉末， 溶解于 D20/DMSO中进行 NMR检测， 其检 测图谱见附图 6;
3 ) 采用本发明方法分别制得单独用含环氧基的长链烷烃处理后的透明质酸钠及单独用 1,4-丁二醇二缩水甘油醚交联后的透明质酸钠用 NaOH调整到 pH=8， 高压 121 °C灭菌 30分 钟， 形成液体， 然后冷冻干燥得粉末， 溶解于 D20/DMSO中进行 NMR检测， 其检测图谱见 附图 4和 5;
在附图 3的 1H-NMR图谱中， 透明质酸钠的乙酰胺基团 N-Acetyl (NHCOCH3) 的位置 在 1.9〜2.2ppm, 葡萄糖醛酸 （10H) 的位置在 3.0〜4.0ppm, 葡萄糖单元异头碳氢 （2H) 的 位置在 4.35〜4.45ppm;
在附图 4的1 H-NMR图谱中， 除附图 3的上述峰值外， 还在位置 1.2〜1.4ppm和 0.65〜 0.85ppm出现了峰， 它们分别代表亚甲基 CH2峰和长链碳端基 C¾， 证明用本发明方法可以 将含环氧基的长链烷烃与透明质酸钠化学键合；
在附图 5的 iH-NMR图谱中， 除附图 3的上述峰值外， 还在位置 1.5〜1.7ppm出现了 0- CH2CH2的峰， 它代表交联剂 BDDE与透明质酸钠的交联键， 证明用本发明方法含环氧基的 交联剂 BDDE可以将透明质酸钠交联；
在附图 6的 1H-NMR图谱中， 除附图 3的上述峰值外， 还同时出现三个峰， 即： 位置在 0.65〜0.85ppm 出现的代表含环氧基的长链烷烃的长链碳端基 CH3， 1.2〜1.4ppm代表环氧 烷烃的亚甲基 CH2 以及 1.5〜1.7ppm 代表交联剂 BDDE 与透明质酸钠的的交联键 0- CH2CH2， 证明制备本发明交联透明质酸钠凝胶的方法可以确保含环氧基的交联剂 1,4-丁二 醇二缩水甘油醚 （BDDE) 与透明质酸钠进行交联而且可以确保 1,2-环氧十二烷与透明质酸 钠化学键合。
[0026] 采用分子量为 500〜6000 的聚乙二醇二缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷或 1,2,3,4- 二环氧丁烷作为含环氧基的交联剂与含环氧基的长链烷烃 （长链烷烃的碳原子数 6〜18个） 配合， 可以获得性能相同的交联透明质酸钠凝胶， 故不再赘述。

Claims

权利要求书
1. 一种外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶， 其特征在于， 它是透明质酸钠 碱性溶液与含环氧基的长链烷烃及含环氧基的交联剂， 于 35 °C〜50°C反应 2〜5小时 形成交联透明质酸钠， 再经洗涤、 凝胶化、 灭菌制得的， 其中， 透明质酸钠 ： 含环 氧基的交联剂 ： 含环氧基的长链烷烃的摩尔比为 10 ： 4〜1 ： 1〜4;
所述含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 6〜18个；
所述含环氧基的交联剂为 1,4-丁二醇二缩水甘油醚、 分子量 500〜6000的聚乙二 醇二缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷、 1,2,3,4-二环氧丁烷中的一种；
所述透明质酸钠碱性溶液是由透明质酸钠干粉溶解于由 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液 和二甲亚砜组成的混合溶液后形成的，其中，透明质酸钠的浓度为 4wt%〜8wt%; 0.2〜 0.5M的氢氧化钠水溶液与二甲亚砜的体积比为 10 ： 7〜1。
2. 根据权利要求 1 所述的交联透明质酸钠凝胶， 其特征在于， 交联透明质酸钠凝胶 的化学结构中包含化学键合的具有自黏附自聚集功能的疏水基团，该疏水基团的碳原 子数目为 6〜18个。
3. —种权利要求 1 所述的外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶的制备方法， 其特征在于， 具体制备步骤如下：
①将透明质酸钠干粉溶解于由 0.2〜0.5M的氢氧化钠水溶液和二甲亚砜组成的混 合溶液后获得透明质酸钠碱性溶液，然后向透明质酸钠碱性溶液中加入含环氧基的长 链烷烃及含环氧基的交联剂，搅拌状态下加热至 35 °C〜50°C并保温 2〜5小时后， 冷 却至室温， 在搅拌下滴加丙酮生成白色粉末形成固一液混合物料， 加入盐酸将固一液 混合物料的 pH值调节至 6.5〜7.4， 滤除液体后， 所得固体物料用异丙醇和丙酮分别 洗涤 3〜5次， 再真空干燥至挥发物质含量低于 2ppm， 所得白色干粉即为交联透明质 酸钠粉末；
其中， 透明质酸钠 ： 含环氧基的交联剂 ： 含环氧基的长链烷烃的摩尔比为 10 ： 4〜1 ： 1〜4; 含环氧基的长链烷烃的碳原子数目为 6〜18个； 0.2〜0.5M的氢氧化钠 水溶液与二甲亚砜的体积比为 10 ： 7〜1 ; 透明质酸钠碱性溶液中， 透明质酸钠的浓 度为 4wt%〜8wt%; 氢氧化钠水溶液与滴加的丙酮的体积比为 1 : 4〜2： 3； 透明质酸 钠的平均分子量为 50万〜 200万;所述含环氧基的交联剂为 1,4-丁二醇二缩水甘油醚、 分子量为 500〜6000的聚乙二醇二缩水甘油醚、 1,2,7,8-二环氧辛烷、 1,2,3,4-二环氧 丁烷中的一种；
②在步骤①得到的交联透明质酸钠粉末中， 加入注射用水溶胀形成交联透明质酸 钠凝胶， 收集的凝胶颗粒中加入注射用水， 在 15 °C〜35 °C下搅拌洗涤 2〜5小时后， 滤除注射用水， 收集凝胶颗粒， 再用注射用水洗涤， 按上述过程反复洗涤共 4〜5次 后， 收集的凝胶颗粒即为交联透明质酸钠凝胶；
③向步骤②收集的凝胶颗粒中加入等渗生理盐水，在 15 °C〜35 °C下搅拌洗涤 2〜5 小时后， 滤除等渗生理盐水， 收集凝胶颗粒， 再用等渗生理盐水洗涤， 按上述过程反 复洗涤共 4〜5次后， 经筛网分筛收集平均粒径为 150 m〜350 m的凝胶；
④将步骤③收集的凝胶颗粒灌装于事先灭菌的一次性注射器中，在 121 °C〜125 °C 蒸汽中灭菌 15〜25分钟， 即可得到外科整形用组织填充剂交联透明质酸钠凝胶。
4. 根据权利要求 3 所述的交联透明质酸钠凝胶的制备方法， 其特征在于， 制得的交 联透明质酸钠凝胶的化学结构中包含化学键合的具有自黏附自聚集功能的疏水基团， 该疏水基团的碳原子数目为 6〜18个。
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