WO2014000313A1

WO2014000313A1 - 一种治疗艾滋病的药物组合物及其制备方法和用途

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Publication number: WO2014000313A1
Application number: PCT/CN2012/078065
Authority: WO
Inventors: 胡英杰; 邱声祥; 符林春; 郑永唐
Original assignee: 广州中医药大学; 中国科学院华南植物园; 中国科学院昆明动物研究所
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-07-02
Publication date: 2014-01-03
Also published as: CN102727850B; CN102727850A

Abstract

一种治疗艾滋病的药物组合物及其制备方法和用途。组合物的原料药由熟附子、淫羊藿、干姜、甘草、人参、丹参、虎杖、茯苓、黄柏、黄芩及Euphorbiasteroid组成。所述药物组合物对猴艾滋病病毒感染恒河猴所致艾滋病模型具有显著的治疗效果，具有治疗人类艾滋病的用途。给予HIV感染者或艾滋病患者所述药物组合物，能够缓解病症，包括稳定或者提升HI病毒感染者和艾滋病病人的CD4+T淋巴细胞计数、改善CD4+/CD8比值水平，缓解临床症状体征、改善生存质量。

Description

说明书一种治疗艾滋病的药物组合物及其制备方法和用途技术领域本发明涉及一种药物组合物，特别涉及一种用于治疗治疗艾滋病的药物组合物。本发明还涉及该组合物的质量控制方法和用途。

背景技术艾滋病是 HIV感染引起的获得性免疫缺陷综合征， HIV感染进程和发病的不同阶段临床表现复杂多样，包括在后期发生的致命性恶性肿瘤和各类机会性感染。

人感染 HIV-1 后一般经 7-12年进入发病期。照现行的诊疗标准，对于无症状且 CD+T细胞数尚未大幅度降低（例如，仍处于 300个每微升以上）的 HIV病毒携带者，不建议给予抗病毒疗法，否则会使病人和社会承担诱发严重抗药性的巨大风险。根据近十年的临床实践，对于进入发病期特别是发病早、中期的艾滋病患者，在实施 HAART 主流疗法的同时，同时加服中药进行辅助治疗，已见到在改善乏力、腹泻、恶寒等并发症状、减少西药引起的毒副作用、提高患者治疗依从性、提高患者生存质量等方面的效果。中药应该能够成为艾滋病治疗的选项。

天然有机化合物 Euphorbiasteroid是本发明人发现具有抗 HIV作用的一种续随子垸型二萜化合物，单独使用显示具有一定的抗 HIV作用。经美国国家肿瘤研究所 (NCI) 测定，在体外对艾滋病病毒（HIV-1 ) 的复制具有较强的抑制作用，治疗指数（半数细胞毒浓度 /半数病毒复制抑制浓度）为 600。

本发明人在 CN 201210119628.4公开了一种药物组合物，该药物组合物具有一定的抗 HIV活性，但是有待进一步提高其活性。

发明内容本发明的一个目的在于提供一种治疗艾滋病的药物组合物。

本发明的另一个目的在于提供上述药物组合物的质量控制方法。

本发明的再一个目的在于提供上述药物组合物的在治疗艾滋病中的应用。本发明所采取的技术方案是：

一种药物组合物，其原料药由以下质量份的：

熟附子： 20〜30份；

淫羊藿、干姜、甘草：各 10〜15份；

人参、丹参、虎杖、茯苓：各 6〜12份；

黄柏： 2〜5份；

黄芩： 2〜4份；

Euphorbiasteroid 0.1〜 0.2份组成。

特别的，原料药由以下质量份的：

熟附子： 25份；

淫羊藿、干姜、甘草：各 12.5份；

红参 7.82 份、茯苓 7.81 份、虎杖 7.81 份、丹参 7.81 份；

黄柏： 3.75份;

黄芩： 2.5份；

Euphorbiasteroid 0.18份组成。

优选的，除 Euphorbiasteroid外，原料药的有效成分经水提，之后醇提得到。上述药物组合物的制备方法，包括如下步骤： 1)取原料药，用水煎煮，过滤，取滤液；

2)将滤液离心，取上清液，浓缩，得水提浓液；

3)在水提浓液中加入乙醇，搅拌，静置，之后离心，取上清液，去除乙醇，得到醇提物；

4)将醇提物、 Euphorbiasteroid与其他可接受的药用辅料，制备得到药物制剂。制备步骤包括如下操作：

1)取原料药，加水煎煮 3次，每次加入 20倍量的水，煎煮 2h，放冷，滤过，合并滤液；

2)将滤液离心，取上清液并浓缩至原料药重，得水提浓液；

3)在水提浓液加入两倍体积浓度为 95% (v/v) 的乙醇，搅拌均匀，静置 6至 10 小时，之后离心，取上清液，去除乙醇，浓缩干燥，得到醇提物。上述药物组合物的质量控制方法，包括定性鉴定和指标化合物的定量测定，包括如下步骤：

1)按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中的乌头碱限量，不得多于规定限度；

2)按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中应至少检测出存在有淫羊藿、甘草、虎杖、干姜、人参、黄芩和 Euphorbiasteroid;

3)按照中国药典一部高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中的双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的总量不得超过规定限度；

4)按照中国药典一部高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中的淫羊藿苷、甘草酸、虎杖苷、黄芩苷和 Euphorbiasteroid的含量不低于规定限度。组合物为口服制剂，优选为胶囊剂、片剂、颗粒剂、冲剂、口服液、水滴丸或蜜丸。本发明的有益效果是：

通过国际学术界公认的实验评价艾滋病药物体内作用的最佳艾滋病猴模型技术，证实了本发明特定的药物组合物对猴艾滋病病毒感染恒河猴所致艾滋病模型猴具有治疗作用。使用本发明的药物组合物口服治疗艾滋病猴模型，与病毒对照组比较，可提高 CD4+T细胞比率达 73%，提高 CD4+T/CD8+T比值达 80%。可见，本发明药物组合物拥有延长生存期、提高生存质量、改善和恢复 T₃、 Cor水平、改善 CD4+T细胞比率、改善 CD4+/CD8+比值、抑制病毒的综合疗效指标中的全部或部分疗效指标，其效果好于 CN 201210119628.4公开的组合物和 Euphorbiasteroid。

基于对艾滋病猴模型这种适宜艾滋病动物模型的疗效，可以预见本发明药物组合物制剂具有治疗人类艾滋病的用途，给予 HIV感染者和艾滋病患者本发明药物组合物制剂，能够缓解病症，包括稳定或者提升 HIV病毒感染者和艾滋病病人的 CD4+T淋巴细胞计数水平，缓解临床症状体征、改善生存质量。

具体实施方式发明人观察研究了猴艾滋病病毒 (SIV)感染的艾滋病猴模型的中医证型分布与演变规律，总结归纳出疾病的证型分布和演变规律：由感染初期阶段出现的烦躁等 "实证"演变为中期阶段的摄食量减少、腹泻、活动减少，毛发脱落，体重增长缓慢等"脾虚证"，再发展成为晚期的肌肉萎缩、蜷缩、畏寒、精神萎靡不振、机体消瘦、体重急速下降、肢体蜷缩颤抖，甚至眼睑、脸部水肿等中医"脾肾阳虚证"表现。

对于艾滋病模型患猴，特别是能够反映和评价中医证特点的病症复合猴艾滋病模型患猴的实验治疗结果，辨证治疗优于非辨证治疗；温补肾阳法的疗效明显优于清热解毒法的疗效。温补肾阳法采用的中药应立 "温补肾阳"原则为君（首要治则）， "补益元气、补益脾阳"原则为臣（次要治则），以是否能够延长生存期，提高生存质量为目的，以能否改善和恢复 T₃、 Cor水平、改善 CD4+T细胞比率、改善 CD4+/CD8+比值作为疗效指标。

一种药物组合物，其原料药由以下质量份的：

熟附子： 20〜30份；

淫羊藿、干姜、甘草：各 10〜15份；

人参、丹参、虎杖、茯苓：各 6〜12份；

黄柏： 2〜5份；

黄芩： 2〜4份；

Euphorbiasteroid 0.1〜 0.2份组成。

特别的，原料药由以下质量份的：

熟附子： 25份；

淫羊藿、干姜、甘草：各 12.5份；

红参 7.82 份、茯苓 7.81 份、虎杖 7.81 份、丹参 7.81 份；

黄柏： 3.75份;

黄芩： 2.5份；

Euphorbiasteroid 0.18份组成。

优选的，除 Euphorbiasteroid夕卜，原料药的有效成分经水提，之后醇提得到。上述药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)取原料药，用水煎煮，过滤，取滤液；

2)将滤液离心，取上清液，浓缩，得水提浓液；

2)将滤液离心，取上清液并浓缩至原料药重，得水提浓液；

3)在水提浓液加入两倍体积浓度为 95% ( v/v ) 的乙醇，搅拌均匀，静置 6至 10 小时，之后离心，取上清液，去除乙醇，浓缩干燥，得到醇提物。

上述药物组合物的质量控制方法，包括定性鉴定和指标化合物的定量测定，包括如下步骤：

4)按照中国药典一部高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中的淫羊藿苷、甘草酸、虎杖苷、黄芩苷和 Euphorbiasteroid的含量不低于规定限度。组合物为口服制剂，优选为胶囊剂、片剂、颗粒剂、冲剂、口服液、水滴丸或蜜丸。

本发明药物组合物使用的药材如下，均应符合中国药典对药材的质量要求。

附子是毛茛科植物乌头 Acom m carmichaeli Debx.的子根的加工品。包括黑顺片和白附片。

淫羊藿是小檗科植物淫羊藿 Epimedium brevicornum Maxim.、箭叶淫羊藿

Epimedium sagittatum(Sieb. et.Zucc. ) Maxim. 、柔毛淫羊着 Epimedium pubescens Maxim. 、巫山淫羊着 Epimedium wushanense T. S. Ying 或朝食羊淫羊着 Epimedium koreanum Nakai 的地上咅分。

干姜是姜科植物姜 Zingiber officinale Rose. 的干燥根茎。

甘草是豆禾斗植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 、胀果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat. 或光果甘草 Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根及根茎。

人参是五加科植物人参 Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根及根茎。包括生晒参和红参，优选红参。

丹参是唇形科植物丹参 Salvia miotiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。

虎杖是蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根及根茎。

茯苓是多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos (Schw.) Wolf.的干燥菌核。

黄柏是芸香科植物黄柏 Phellodendron chinensis Schneid.的干燥树皮。

黄芩是唇形科植物黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

下面结合实施例，进一步说明本发明。

以下实施例中，如无特别说明，份数均指质量份，乙醇的浓度以体积浓度计。实施例 1硬胶嚢的制备

原料药组成：

熟附子 25 份、淫羊藿 12.5 份、干姜 12.5 份、甘草 12.5 份、红参 7.82 份、茯苓 7.81 份、虎杖 7.81 份、丹参 7.81 份、黄柏 3.75 份、黄芩 2.5 份、 Euphorbiasteroid 0.18份。

实施例 2

熟附子 20份、淫羊藿 12 份、干姜 12 份、甘草 10 份、红参 10 份、茯苓 10份、虎杖 8 份、丹参 10份、黄柏 5 份、黄芩 3 份、 Euphorbiasteroid 0.15份。

实施例 3 原料药组成：

熟附子 30份、淫羊藿 10 份、干姜 12 份、甘草 12 份、红参 8 份、茯苓 8份、虎杖 7 份、丹参 8份、黄柏 2 份、黄芩 3 份、 Euphorbiasteroid 0.20份。

实施例 4

原料药组成：

熟附子 27 份、淫羊藿 10 份、干姜 12 份、甘草 12 份、红参 6 份、茯苓 9 份、虎杖 12 份、丹参 6 份、黄柏 4 份、黄芩 2 份、 Euphorbiasteroid 0.12份。

实施例 5

原料药组成：

熟附子 20 份、淫羊藿 15 份、干姜 10 份、甘草 15 份、红参 12 份、茯苓 6 份、虎杖 6份、丹参 12 份、黄柏 4 份、黄芩 2 份、 Euphorbiasteroid O.10份。

实施例 6

原料药组成：

熟附子 27 份、淫羊藿 10 份、干姜 12 份、甘草 12 份、红参 6 份、茯苓 9 份、虎杖 12 份、丹参 6 份、黄柏 4 份、黄芩 2 份、 Euphorbiasteroid 0.16份。

原料药中药材有效成分的提取：

1)照处方比例称取原料药中的各种中药材，加纯水煎煮 3次，每次加入 20倍量的纯水，煎煮 2h，放冷，滤过，合并滤液；

2)将滤液以 15000 rpm的转速离心 10分钟，取上清液，将上清液浓缩至药液体积以升计等于药材总质量以千克计（约与原中药材等量）；

3)加入两倍药液体积的含体积分数为 95%的药用乙醇，搅拌均匀，静置 6至 10 小时，以 15000 rpm的转速离心，取上清液，减压下回收乙醇并减压下浓缩成稠膏，喷雾干燥，或在 80°C以下直空干燥、粉碎，即得中药材有效成分的提取物。

药物制剂的制备：

硬胶嚢：按上述方法，使用实施例 1的原料药配比，提取得到原料药中药材的有效成分，记为药物组合物 GZY提取物，提取物的得率为 13.2%。将 GZY提取物、 Euphorbiasteroid与辅料混合均匀，过 80 目筛，制粒，加入硬脂酸镁混合均匀，装填得到硬胶囊，规格： 0.5 g提取物 /粒。制得的硬胶囊记为 GZE硬胶囊。

经检验，测得本品含淫羊藿苷 2.0 mg/g、含乌头碱为 0、 Euphorbiasteroid (C₃₂H₄。O₈)

片剂：按上述方法，使用实施例 1的原料药配比，提取得到原料药的有效成分，将提取物粉碎，过 100目筛，与 Euphorbiasteroid和辅料混合均匀，过 80目筛，制粒，加硬脂酸镁，经 60目筛整粒，压片，即得。

颗粒剂：按上述方法，使用实施例 1的原料药配比，提取得到原料药的有效成分，加入 Euphorbiasteroid、适量糖粉、苯甲酸钠和其他辅料，加纯水，加热至沸，搅拌下于 80°C保温 2h，冷却至室温，过滤，取滤液分装，即得。

控制:

取实施例 1的方法制得的药物组合物胶囊内容物进行检验。

( 1 )按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，本发明所说的中药制剂中熟附子的指标化合物的乌头碱限量，不得多于规定限度。具体方法如下：取胶囊内容物 10.0 g，加氨试液 10 mL，拌匀，放置 2小时，加乙醚 lOO mL, 分两次提取，每次振摇 0.5小时，放置分层，取乙醚层蒸干，残渣用无水乙醇溶解使成 l mL，作为供试品溶液。取乌头碱对照品适量，加无水乙醇制成每 l mL含 1.0 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液 10 μί、对照品 5 μί，分别点于用 0.1% 氢氧化钠溶液处理过的干燥硅胶 G板上，以环己烷：乙酸乙酯：甲醇（6.4:3.6: 1 ) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上出现的斑点应小于对照品斑点，或不出现斑点。表示按照此方法，每 10 g内容物中的乌头碱可以不被检出；如果被检出，其中的乌头碱限度不得多于 0.5 mg。

(2)按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，本发明所说的中药制剂中至少应该检查出如下药材的存在：淫羊藿、甘草、虎杖、干姜、人参、黄芩。本实施例以淫羊藿和甘草为例说明如下。其他药材参照药典质量检查标准，按照本领域专业人员能够理解的方法进行检测。其中，淫羊藿的检测方法为：取胶囊内容物 5 g，加水 20 mL，加热使溶解，放冷，加二氯甲垸脱脂，振摇 2次，每次 20mL_; 水层加正丁醇振摇提取 3次，每次 20 mL，合并正丁醇液，减压蒸干，残渣加甲醇 5 mL使溶解，作为供试品溶液。取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每 l mL含 l mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典一部附录 VI B )试验，吸取供试品溶液及对照品溶液各 5 μί, 分别点于同一块硅胶 G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-稀氨水（8.5 : 1.5 : 1.5) 的上层为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%香草醛高氯酸乙醇溶液，在 105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。其中，甘草的检测方法为：取胶囊内容物 5 g，加水 20 mL加热使溶解，放冷，加入氨水调 pH9〜10，放置，滤过，滤液加稀盐酸调 pH 2~3，放置，滤过，留取固体不溶物，加正丁醇 20 mL溶解，用正丁醇饱和水溶液萃取 3次，每次 20 mL，合并正丁醇液，蒸干，加甲醇 2 mL溶解，作为供试品溶液。另取甘草酸单铵盐对照品，加甲醇制成每 l mL含 2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典一部附录）试验，吸取上述溶液各 5 μί，分别点于同一块硅胶 G薄层板上，以正丁醇一 95%乙醇一氨水（5:1:2) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇，在 105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(3 )按照中国药典高效液相色谱法项下规定的方法，本发明所说的中药制剂中熟附子中的双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱总量，不得超过规定限度。

以乌头碱为例，其测定方法如下：

色谱条件与系统适用性试验：以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂；以甲醇 -0.04 mol/L醋酸铵（53:47 ) 为流动相，检测波长为 235 nm。理论板数按乌头碱峰计算应不低于 3000。

对照品溶液的制备：取乌头碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶液制成每 1 mL 含 20 μ_§的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品粉末，研细粉，取约 5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨液 4 mL，混匀，加入乙醚 30 mL，密塞，超声处理 15分钟，放置过夜，搅拌，分取乙醚液，残渣加入乙醚提取 3次（每次 10 mL) ，合并乙醚液，减压蒸干，残渣加甲醇溶液溶解，定容至 10 mL，摇匀，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10 μί, 注入液相色谱仪，测定，即得。

( 4 ) 按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，制剂中应该检查出 Euphorbiasteroid的存在。具体方法如下：取胶囊内容物 0.2 g，加二氯甲垸 20 mL，分两次提取，每次超声处理 10分钟，滤过，取滤液浓缩至 1 mL，作为供试品溶液。取本发明 Euphorbiasteroid对照品适量，加二氯甲垸制成每 1 mL含 1.0 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液 10 μί、对照品 10 μί，分别点于用硅胶 G板上，以石油醚（沸程 60-90°C ) ：丙酮（7:3 ) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇试液，热风吹干， 105°C烘烤至显色。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上出现颜色相同的斑点。

( 2 ) 按照中国药典一部高效液相色谱法项下规定的方法分析，制剂中

Euphorbiasteroid的含量不得少于规定限度。具体方法如下：色谱条件与系统适用性试验：以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂；以甲醇-水 (8: 2) 为流动相；检测波长为 270 nm，流速 1 mL'min— ¹，柱温 25 °C。理论板数按 Euphorbiasteroid 峰计算应不低于 3000。

对照品液的制备：取 Euphorbiasteroid对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL 含 l mg的溶液，即得。

供试品液的制备：取本品，研细，取约 1 g，精密称定，置 50 mL量瓶中，加甲醇 40 mL，超声处理（功率 250W, 频率 25 kHz) 30分钟，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定：分别精密吸取对照品液与供试品液各 10 μί，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品含 Euphorbiasteroid (C₃₂H₄。O₈) 的量，不得少于 10 mg/g。

(5 )按照中国药典高效液相色谱法项下规定的方法，本发明所说的中药制剂中其他一些中药材的指标化合物，不得少于规定限度，特别地，淫羊藿以淫羊藿苷计、甘草以甘草酸计、虎杖以虎杖苷计、黄芩以黄芩苷计，分别不得少于规定限度。

以淫羊藿为例，其测定方法如下：

色谱条件与系统适用性试验：以十八垸基硅垸键合硅胶为填充剂；以乙腈-水 (27:73) 为流动相；检测波长为 270 nm。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不低于 4000。

对照品溶液的制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每 1 mL含 0.1 mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品，研细，取约 0.5 g，精密称定，置 50 mL量瓶中，加稀乙醇 45 mL，超声处理（功率 250W, 频率 25 kHz) 30分钟，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10 μί, 注入液相色谱仪，测定，即得。

其他药材参照药典质量检查标准，按照本领域专业人员能够理解的方法进行检测。本发明药物组合物的质量标准主要要求如下：

按照高效液相色谱法（中国药典一部附录）试验，本品含 Euphorbiasteroid (C₃₂H_4QO₈ ) 的量，不得少于 10 mg/g; 含附子双酯型生物碱以乌头碱（C₃₄H₄₇NO_U )、新乌头碱（C H^NOU 次乌头碱（C₃₃H₄₅NO₁₍₎ )等的总量计，不得过 0.10 mg/g; 含淫羊藿以淫羊藿苷（C₃₃H_4QO₁₅ ) 计，不得少于 1.5 mg/g。

在猴艾滋病病毒 (SIV)感染的艾滋病型上的疗效试验结果

1、实验材料

1.1实验动物、场地及其等相关方面

实验动物选择：恒河猴，排除 TB感染（PPD试验阴性和胸片 X光片正常）、沙门氏菌、志贺氏菌和体内外寄生虫、血清 SRV、血清 STLV-I、血清 SIV等项目检测阴性，外观健康，经体检无浅表淋巴结肿大的 3-6岁龄，体重 4〜7Kg健康恒河猴 35只。

实验场地：生物安全 2级实验室。

动物的饲养和管理：动物单笼饲养在不锈钢笼具中，摄食专用的饲料及自由饮水。室温 20-25°C，相对湿度 50-70%。按照有关规定给予动物福利。

1.2 猴艾滋病病毒感染

1.2.1 猴艾滋病病毒株： SIVmac239

1.2.2 感染剂量及感染途径：接种剂量 1:3000，使用 1640稀释液进行稀释，静脉注射感染，注射量 1 mL。

1.3 实验动物分组与给药量：

雄性恒河猴随机分组。 ①组：健康空白对照组 5只； ②组：病毒感染模型对照组

4只；③ -④组： GZY提取物的低、高剂量鉬各 4只，高剂量 2.0 g/kg.d,低剂量 1.0 g/kg.d; ⑤组： Euphorbiasteroid组 4只，剂量 15 mg/kg.d; ⑥组： GZE硬胶囊内容物组 4只，剂量 1.0 g/kg.d。

2、观察及检测指标

2.1 SIV病毒感染相关检测指标：病毒载量、血常规、淋巴细胞亚群（CD3+、 CD4+、 CD8+、 CD4+/CD8+)。

2.2 病理检测： 1、无菌手术取淋巴结，固定于 10%中性甲醛液，石蜡包埋， H.E染色后光镜观察病理形态学。 2、部分组织器官免疫组化检查。

2.3 死亡动物处理：试验期间死亡动物做尸检。

3、实验方案

( 1 ) 实验动物检疫合格后移入实验室适应环境，期间进行观察，测量基本数据，确定感染前各恒河猴临床基线特征。分组。

(2) 分组完成后用 SIVmac 239株静脉注射进行 SIV病毒感染，于感染后 14天左右抽血测病毒载量判定感染情况，确认感染病毒。待感染后血浆病毒载量降至调定点（setpoint), 即平台期时实施给药治疗 8周。期间定期检测 SIV病毒载量和其他指标。

4、实验结果

( 1 ) 一般情况，见表 1。表 1结果说明本发明药物组合物有助于治疗，在治疗期间不治疗的 SIV病毒模型组有 1只患猴死亡（死亡率为 1/4)，健康对照组和给药治疗组均无患猴死亡。表 1 治疗期间一般情况组别动物数死亡数死亡比率

5 0 0/5

健康对照组 4 1 1/4

SIV病毒感染模型对照组

4 0 0/4

GZY提取物小剂量组

4 0 0/4

GZY提取物大剂量组

4 0 0/4

Euphorbiasteroid组

4 0 0/4

GZE硬胶囊内容物组

(2)对 CD4+比率变化的影响，见表 2。艾滋病发展进程中，无论人类还是其他灵长类动物的 CD4+T淋巴细胞计数或比率都是呈现出渐进性下降，至患者死亡时可降低为 0。提升、稳定、甚至延缓 CD4+T淋巴细胞计数的降低，都反映出积极和有效的治疗效果。表 2结果说明，与健康动物相比， SIV病毒模型对照组明显降低，符合艾滋病模型特征。与 SIV病毒感染模型对照组相比，治疗 4周或 8周， Euphorbiasteroid 药以及中药 GZY提取物的小剂量、大剂量组能够促使 CD4+比率保持稳定或略有提升；本发明 GZE 硬胶囊内容物组的 CD4+比率，则由治疗前的 26.36±9.85 分别提升到 31.51±16.03和 38.51±15.93，分别提高了 19.5%和 46.1%; 与同期 SIV病毒感染模型对照组相比，分别提高了 62.6%和 73.2%，治疗 8周时出现了显著改善（P<0.05)。其中治疗 8周时的 CD4+T细胞比率接近健康空白组（42.83±8.74)。说明本发明药物组合物具有明显改善 CD4+T细胞比率、改善艾滋病猴细胞免疫的作用。治疗期间各组动物 CD4+比率变化（％ ) 组另 IJ 治疗前治疗 4周治疗 8周健康对照组 36.26±7.51 40.03±6.39 42.83±8.74

SIV病毒感染模型对照组 23.11±5.95 19.38±4.35♦ 22.23±6.96

GZY提取物小剂量组 21.21±2.30 23.15±4.13 25.59±5.51

GZY提取物大剂量组 20.70±10.54 18.12±8.54 23.56±7.98 24.23±4.91 24.54±9.79 28.89±5.71

Euphorbiasteroid组

GZE硬胶囊内容物组 26.36±9.85 31.51±16.03 38.51±15.93 附注： ♦ SIV病毒模型对照组在治疗 4周时死亡 1头，最后检测数据为 31.89。

* 同组治疗前后比较 P<0.05。 (3 ) 对 CD4+/CD8+比率变化的影响，见表 3。结果说明，与健康动物相比， SIV 病毒模型对照组明显降低，符合艾滋病模型特征，治疗 4周或 8周，本发明药物组合物 GZY各剂量组对 CD4/CD8比率未见明显改善，而 Euphorbiasteroid组由治疗前的 1.00±0.39，分别提升到 1.43±0.75和 1.54±0.29，出现了明显改善（P=0.087); 本发明 GZE硬胶囊内容物组由治疗前的 1.07±0.46，分别提升到 1.33±0.74和 1.62±0.83，分别提升了 24.3%和 51.4%;与同期 SIV病毒感染模型对照组相比，分别提高了 40%和 80%，表明在治疗 8周时出现了明显改善（P=0.06)。说明本发明药物组合物具有明显改善艾滋病猴 CD4+/CD8+比值、改善细胞免疫的作用。表 3 治疗期间各组动物 CD4/CD8比率变化组另 IJ 治疗前治疗 4周治疗 8周

1.72±0.22

健康对照组 1.42±0.25 1.48±0.23

0.90±0.21

SIV病毒感染模型对照组 0.98±0.21 0.95±0.29 *

0.81±0.16

GZY提取物小剂量组 0.74±0.09 0.82±0.18

0.87±0.27

GZY提取物大剂量组 1.10±0.57 0.96±0.28

1.00±0.39 1.43±0.75 1.54±0.29

Euphorbiasteroid组

1.62±0.83

GZE硬胶囊内容物组 1.07±0.46 1.33±0.74 附注： ♦ SIV病毒模型对照组在治疗 4周时死亡 1头，最后检测数据为 0.75。 *同组治疗前后比较 P<0.05。 GZ硬胶囊内容物组尸 =0.06， Euphorbiasteroid组：尸 =0.087。

Claims

权利要求书

1. 一种药物组合物，其原料药由以下质量份的：

熟附子： 20〜30份；

淫羊藿、干姜、甘草：各 10〜15份；

人参、丹参、虎杖、茯苓：各 6〜12份；

黄柏： 2〜5份；

黄芩： 2〜4份；

Euphorbiasteroid 0.1—0.2份组成。

2. 根据权利要求 1所述的一种药物组合物，其原料药由以下质量份的：

熟附子： 25份；

淫羊藿、干姜、甘草：各 12.5份；

红参 7.82 份、茯苓 7.81 份、虎杖 7.81 份、丹参 7.81 份；

黄柏： 3.75份；

黄芩： 2.5份；

Euphorbiasteroid 0.18份组成。

3. 根据权利要求 1或 2所述的一种药物组合物，其特征在于：除 Euphorbiasteroid 夕卜，原料药的有效成分经水提，之后醇提得到。

4. 权利要求 1或 2所述药物组合物的制备方法，包括如下歩骤：

1) 取原料药，用水煎煮，过滤，取滤液；

2) 将滤液离心，取上清液，浓缩，得水提浓液；

3) 在水提浓液中加入乙醇，搅拌，静置，之后离心，取上清液，去除乙醇，得到醇提物； 4) 将醇提物、 Euphorbiasteroid 与其他可接受的药用辅料，制备得到药物制剂。

5. 根据权利要求 4所述的制备方法，其特征在于：所述制备歩骤包括如下操作:

1) 取原料药，加水煎煮 3次，每次加入 20倍量的水，煎煮 2h，放冷，滤过，合并滤液；

2) 将滤液离心，取上清液并浓缩至原料药重，得水提浓液；

3) 在水提浓液加入两倍体积浓度为 95% (v/v) 的乙醇，搅拌均匀，静置 6 至 10小时，之后离心，取上清液，去除乙醇，浓缩干燥，得到醇提物。

6. 权利要求 1或 2所述药物组合物的质量控制方法，包括定性鉴定和指标化合物的定量测定，包括如下歩骤：

1) 按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中的乌头碱限量，不得多于规定限度；

2) 按照中国药典薄层色谱法项下规定的方法，组合物中应至少检测出存在有淫羊藿、甘草、虎杖、干姜、人参、黄芩和 Euphorbiasteroid;

3) 按照中国药典一部高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中的双酯型生物碱乌头碱、新乌头碱和次乌头碱的总量不得超过规定限度；

4) 按照中国药典一部高效液相色谱法项下规定的方法，组合物中的淫羊藿苷、甘草酸、虎杖苷、黄芩苷和 Euphorbiasteroid的含量不低于规定限度。

7. 权利要求 1或 2所述药物组合物在制备治疗艾滋病药物中的应用。

8. 根据权利要求 1或 2所述药物组合物，其特征在于：所述组合物为口服制剂。

9. 根据权利要求 8所述药物组合物，其特征在于：口服制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、冲剂、口服液、水滴丸或蜜丸。