WO2013153117A1 - Compositions à base de probiotiques et d'un complexe beepollen/argile, leur préparation et leurs utilisations en nutrition et thérapeutique - Google Patents

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Definitions

  • compositions based on probiotics and a beepollen / clay complex their preparation and their uses in nutrition and therapy
  • the present invention relates to the administration of probiotic microorganisms (bacteria or yeasts) by means of a support based on beepollen and clay, as well as compositions comprising said microorganisms and said beepollen / clay complex.
  • microorganism refers to microorganisms (bacteria or yeasts) for probiotic purposes.
  • Probiotics are microorganisms such as bacteria or yeasts, non-pathogenic and nontoxic which, delivered alive in sufficient quantity in the intestine, contribute to the maintenance of the equilibrium of the flora and the strengthening of the intestinal mucosa. They are currently highly sought after for the beneficial effects they would bring in terms of nutrition and health.
  • probiotics living microorganisms which, when administered in sufficient quantity, confer a benefit on the health of those who consume them. And reported that probiotics can play an important role in immunological, digestive and respiratory functions and could have a significant effect in treating infectious diseases, especially in children.
  • probiotic microorganisms are generally lyophilized and packaged in different forms (capsules, sachets, etc.). Nevertheless, industrialization, gastric acidity and contact with bile and pancreatic juices may be responsible for the loss of a large majority of these microorganisms, which must also be reactivated if they have been lyophilized.
  • several studies have been devoted to the viability of probiotics in acidic medium. Thus, the deleterious effects of acidity on the survival of certain probiotic strains (Bifidobacterium and Lactobacillus) have been reported by Sun et al. International Journal of Food Microbiology, 61, 17-25 (2000), Sultana et al.
  • probiotic a strain of microorganisms must arrive alive in sufficient quantity at the intestinal level and establish itself in the intestinal microflora.
  • compositions that guarantee the probiotic effect of microorganisms added to beepollen, ensuring their bioavailability and biological activity.
  • the present invention thus relates to a composition
  • a composition comprising:
  • the present invention also relates to the use of a beepollen / clay-based complex as a support for the administration of probiotic microorganisms especially freeze-dried, in particular to improve the bioburden and the bioavailability of said microorganisms .
  • the beepollen / clay complex constitutes an ideal protection and nutrition medium for microorganisms with the aim of probiotic able to ensure their protection during gastric passage, contact with the bile and pancreatic juices to provide the necessary food for their development and, prior to their reactivation in the case of freeze-dried microorganisms.
  • the complex makes it possible to keep microorganisms alive up to the intestine and to preserve their biological characteristics, and consequently their physiological benefits on the balance of the intestinal flora of the host.
  • the beepollen / clay complex provides a favorable environment for the intra-corporeal birth of living microorganisms with a probiotic aim of great vitality, adapted to the digestive environment.
  • the survival of probiotic microorganisms becomes problematic below a pH of 3
  • the beepollen / clay support of the compositions according to the invention makes it possible to protect the microorganisms from gastric acidity, by maintaining the pH at a level compatible with the cellular life by buffer effect which thus isolates the microorganisms of the stomach pH and which allows the intra corpus birth of microorganisms at the end of the gastric passage. It has also been shown that this protection is prolonged during passage in the intestine.
  • Intra-corpus birth is the ability of microorganisms to multiply in the beepollen / clay complex and to adapt to the physiological environment (including the conditions of the digestive system) of the host to which they are administered.
  • beepollen / clay complex means any stable or “anhydrous” material resulting from the binding of beepollen from any plant species to a silicate lamellar structure.
  • International Application PCT / EP201 1/072756 discloses combinations of beepollen and clay, and its contents are incorporated herein by reference.
  • "beepollen” is understood to mean the pollen taken by bees. It is the fecundating plant element drawn by the bee from the male organ of the flower, agglomerated with flower in bloom and transported to the hive. It can be taken by any means, including just before entering the hive (thanks to a pollen trap), according to the usual methods.
  • beepollen applies to pollen harvested by bees regardless of its method of sampling and / or conservation.
  • beepollen refers to beepollen in any form allowing the maintenance of the characteristics of fresh pollen. It therefore includes fresh beepollen and beepollen previously frozen.
  • beepollen may originate from various plant species and is not limited to a particular flower. We can thus mention the beepollen of rye, corn, sunflower, rockrose, chestnut, kiwi, willow, poppy, lavender, heather, etc.
  • Beepollen in particular frozen beepollen, may be commercially available for example from Pollenergy.
  • Beepollen can also be of varying composition, depending on the nature of the original plants as well as the period of harvest, harvesting mode or the geographical area (countries, regions ).
  • the fresh beepollen suitable for the invention generally contains from 5% to 36% of water and from 64% to 95% of dry matter, among these:
  • clay is meant a material comprising clay minerals such as hydrated silicates, especially aluminum or magnesium silicates. Particularly preferred phyllosilicates having a laminated structure consisting of one or more layers.
  • Fibrous minerals The thickness of the leaflet varies and is called chlorites or fibrous minerals (sepiolite, attapulgite, etc.).
  • clay according to the invention therefore refers to these four types of clay.
  • clay minerals there may be mentioned illite, chlorite, glauconite, kaolinite, attapulgite, sepiolite and montmorillonite. It is particularly preferred, as clay, kaolin, illite, montmorillonite, attapulgite, and more particularly montmorillonite.
  • microorganism means a microscopic organism including, in particular, bacteria and yeasts, in particular non-pathogenic and non-toxic yeasts.
  • probiotic microorganism means microorganisms characterized and cultured prior to their formulation, which, when delivered live in sufficient quantity to the intestine, would confer a benefit for the health and / or the nutrition of the host.
  • characterized refers to a microorganism of which the strain or strains that constitute it have been identified, in particular so as to know the nature of the strain (s) and possibly their concentration (s) ( s).
  • the microorganisms characterized according to the invention are added to beepollen.
  • the microorganisms added to beepollen are distinct, in particular by their nature, number, structure, microorganisms naturally present in the beepollen.
  • freeze-dried microorganisms are added.
  • yeast mention may be made of Saccharomyces cerivisiae.
  • bacteria lactic acid bacteria can be mentioned, such as lactobacilli, bifidobacteria or other lactic acid bacteria. According to the invention:
  • lactobacilli there may be mentioned Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovirus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobius, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus John Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus lactis.
  • Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium bifidum
  • Bifidobacterium breva Bifidobacterium infantis
  • Bifidobacterium lactis reclassified Bifidobacterium animalis
  • Bifidobacterium laterosporus Bifidobacterium longum
  • Bifidobacterium thermophilum Bifidobacterium thermophilum.
  • lactic acid bacteria include Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus intermedius, Streptococcus thermophilus.
  • non-lactic bacteria mention may be made of Bacillus spp, Escherichia coli (nissle strain) and Propionibacterium freudenreichii.
  • lactobacilli and bifidobacteria such as the species Bifidobacterium bifidum (Bifidus), Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breva, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus.
  • probiotic microorganisms are generally commercially available.
  • Said microorganisms suitable for the invention are generally isolated, lyophilized, characterized and / or cultured before being added and included in the beepollen / clay complex.
  • this definition does not cover the microorganisms naturally present in the beepollen / clay complex, and which would not have been isolated, characterized, cultured and / or freeze-dried prior to their inclusion in the complex. .
  • Freeze drying or cold drying, is a sublimation-based process that removes the water contained in a material, food or product to make it stable at room temperature and thus facilitate its preservation.
  • Lyophilization has many advantages over other drying or preservation processes. • Lyophilization retains much of the quality of foods as they remain below freezing during sublimation. The use of lyophilization is particularly important in the case of lactic acid bacteria since they are very sensitive to heat.
  • Lyophilization results in a significant decrease in weight, which greatly facilitates the transport of freeze-dried foods. For example, many foods contain up to 90% water. They will therefore be ten times lighter after lyophilization.
  • the lyophilized microorganisms are placed in a dormant state by desiccation. They must therefore be reactivated to arrive alive in the intestine and exert an action beneficial to the health of the host, according to the invention.
  • beepollen / clay complex represents a support allowing the reactivation of these freeze-dried bacteria.
  • This support therefore represents a favorable environment and ideal for nutrition, protection, development and lyophilized microorganisms reactivation of microorganisms, including during oral administration.
  • compositions of claim 1 comprise:
  • the beepollen / clay complexes generally include:
  • the complexes according to the invention comprise:
  • the complexes according to the invention advantageously have a particle size of less than 500 ⁇ , a moisture content of less than 15% and / or a water activity (aw) of less than 0.75.
  • compositions according to the invention are in the form of a powder and exhibit in particular the following characteristics:
  • compositions according to the invention can be formulated in gastro-resistant form, in particular in the form of gastro-resistant capsules.
  • a gastro-resistant formulation of probiotic microorganisms and the beepollen / clay complex has allowed the increase of the biocharge with the intraportal birth of ferments whereas microorganisms formulated as gastro-resistant capsules, without the beepollen / clay complex, have a viability level considerably affected.
  • the passage in the stomach is a favorable factor for proliferation.
  • the gastro-resistant capsule becomes permeable, the water penetrates and provides the moisture that microorganisms need to begin the proliferation phase.
  • composition - nourish and maintain viable probiotic microorganisms included in the composition
  • microorganisms in the intestinal environment while promoting their adhesion and interaction with the intestinal mucosa.
  • Microorganisms must attach to the intestine to help strengthen the intestinal barrier and exert their beneficial effect on the health of the host.
  • bifidobacteria have adhesion capabilities to the intestinal mucosa where they recognize different receptors of the intestinal epithelium.
  • Lactic bacteria on the other hand, occupy potential sites of colonization by pathogens by preventing the entry of harmful antigens and thus avoiding the proliferation of pathogenic germs. They consume available nutrients limiting the source of nutrients for pathogens and compete with pathogens for access to host receptors.
  • antimicrobial molecules such as bacteriocins at the epithelial surface and also act on the medium (eg, acidification).
  • the beepollen / clay complex promotes the beneficial interaction of these microorganisms with the intestinal mucosa.
  • the intestinal microbiota has many physiological functions that are necessary and beneficial for maintaining the health of the host. Maintaining the balance of the intestinal flora and strengthening the intestinal barrier are of major interest. Probiotic microorganisms are good candidates to achieve this goal.
  • the beepollen / clay complex makes it possible to simultaneously overcome all industrial, biological and / or physiological obstacles to the action of probiotics by providing the following elements:
  • the invention also relates to a method for preparing a composition according to the invention. Said method comprises:
  • Said probiotic microorganisms may be freeze-dried, presented in powder form in particular.
  • the resulting mixture can be sieved to obtain the desired particle size.
  • a mesh screen 500 ⁇ is used.
  • the invention also relates to the use of a beepollen and clay-based complex for transporting probiotic microorganisms to the intestine, to fix them, to improve their bioavailability and / or their biological probiotic activity at the intestinal level. .
  • the complex thus constitutes a biovector for the administration of probiotic microorganisms.
  • biological activity means the nutritional (including dietary) and / or physiological effect, such as probiotic and therapeutic, exerted by said microorganisms in the subjects who consumed them.
  • the present invention therefore particularly relates to a food, cosmetic, pharmaceutical and / or galenic composition and / or a medical device comprising a composition according to the invention.
  • compositions / devices according to the invention are therefore useful as a preventive and / or curative, therapeutic and / or nutritional (including dietary), for human and / or animal.
  • the excipients necessary for the industrial shaping of the product can be chosen from all the acceptable materials according to the regulation (food, dietary supplement, functional food, cosmetic, medical device, pharmaceutical) which governs this product.
  • compositions also comprise a source of sugar, such as glucose allowing the bacteria to grow.
  • a source of sugar such as glucose
  • compositions according to the invention may be presented in forms intended for oral, sublingual, topical, local, intratracheal, intranasal or rectal administration, in particular oral administration.
  • solutes or multi-dose vials can therefore be present especially in the form of solutes or multi-dose vials, or in the form of naked or coated tablets, coated tablets, capsules, soft or hard capsules, granules, pills, cachets, powders, suppositories or rectal capsules, solutions or suspensions, or creams, gels, ointments, pastes, patch, food products such as yogurts, etc.
  • the present invention relates more particularly to gastroresistant formulations such as pasta or capsules, in particular gastroresistant capsules comprising a composition according to the invention.
  • said composition contains an effective amount of the composition according to the invention.
  • the dose and / or dosage may vary within the important limits (0.5 mg to 1000 mg) and may depend on the route of administration, as well as the age and weight of the subject.
  • the appropriate dosage for each subject is determined according to the mode of administration, the weight and the response of said subject, as well as the concentration of microorganisms in said composition.
  • the food compositions according to the invention can be in particular a food, a functional food (or food) or a food supplement.
  • Functional foods or nutraceuticals are generally defined as a conventional food, or one that appears to be part of the normal diet, and has the characteristic of providing beneficial physiological effects beyond its normal nutritional functions or reducing the risk of chronic diseases.
  • the invention therefore also relates to functional foods such as yogurts comprising a composition according to the invention.
  • Said composition may also constitute a food supplement within the meaning of the European Directive 2002/46 / EC.
  • Said dietary supplement is advantageously formulated in the form of a dose, namely in a form of presentation defined by the European Directive 2002/46 / EC, such as "capsules, lozenges, tablets, pills and other similar forms, as well as sachets of powder, ampoules of liquid, vials with dropper and other similar forms of liquid or powder preparations intended to be taken in small quantities'.
  • composition may also constitute a pharmaceutical specialty within the meaning of European Directive 2001/83 / EC.
  • the composition may be useful in the prevention and / or treatment of disorders in which probiotics are generally considered beneficial. Osteoporosis, cardiovascular diseases, cancers, disorders of the liver and metabolism, fatigue, circulatory disorders, joint disorders, menopausal symptoms, disorders of the nervous system, disorders of the gastrointestinal system, ocular disorders, urinary disorders of the prostate such as benign prostatic hypertrophy, prostatitis chronic, prostatodynia and prostate cancer, nutritional, dermatological and cosmetodermatological disorders, asthenia and fatigability, convalescence and post-surgery, hydro-electrolytic imbalances, improvements in physical conditions, etc.
  • compositions according to the invention may also comprise one or more active ingredients.
  • the present invention also relates to medical devices comprising a composition according to the invention.
  • Said composition may therefore constitute a medical device within the meaning of European Directive 93/42 EEC.
  • Figure 1 represents the development of lyophilized bacteria (Bifidobacterium longum) in an ideal medium and within the beepollen / clay complex.
  • FIG. 2 represents the percentages of gain and loss of enzymes after passage through the stomach for four compositions formulated in the form of gastro-resistant capsules:
  • Figure 3 shows the survival of freeze-dried bacteria in gastroresistant capsules after passage through the stomach.
  • FIG. 4 represents the reactivation of lyophilized bacteria associated with the beepollen / clay complex, in gastro-resistant capsules, after passage through the stomach.
  • Figure 5 illustrates the gains and losses of enzymes after passage through the stomach and action of the bile and pancreas, with and without complex.
  • Figure 6 illustrates the synergistic effect of beepollen and clay on the gains of enzymes in the stomach, chyme, mucosa and intestinal fluid.
  • the parts of the agitator are preferably dry to prevent hydration of the complex
  • the desired particle size is obtained by sieving using a mesh screen 500 ⁇ .
  • compositions based on beepollen / clay and probiotic microorganisms are prepared as follows for 166.67 g of final product with 10% of microorganisms:
  • the parts of the agitator are preferably dry to avoid hydration of the complex
  • Example 1 Demonstration of the capacity of the beepollen / arqile complex to provide a nutrition medium and reactivation of freeze-dried bacteria
  • Agar (polysaccharides) 16 Between 13 and 55%
  • the bacteria were seeded in an ideal culture medium and others were inoculated with the beepollen / clay complex in an equivalent amount.
  • Example 2 Demonstration of the resistance to acidity of the beepollen / clay complex with respect to commercial products
  • Bion transit is intended for people with sensitive intestines who are prone to frequent intestinal disorders: discomfort, discomfort, heaviness, bloating, irregular transit, etc.
  • Lactibiane Reference The probiotic strains of Lactibiane Reference are GRAS (Generally Regarded As Safe) certified and deposited in the National Collection of Microorganism Cultures of the Pasteur Institute. These are the following four strains:
  • Lactibiane reference 2,5G contributes to the maintenance of intestinal flora, improves digestive comfort and regulates the transit from the first week. It can help in case of digestive disorders (bloating, etc.) and in winter prevention.
  • Arkoprobiotics Defenses + contains a selection of freeze-dried probiotics from several strains:
  • Arkoprobiotics + defense helps strengthen the body's natural defenses, especially during winter and seasonal changes, as well as rebalancing the intestinal flora. It helps balance the vitality of the body.
  • Gastro-resistant capsules containing the beepollen / clay complex or bacterial strains of commercial products were manufactured using the kit for the preparation of gastro-resistant capsules ApproPharm (254 chemin de la Farllift - 83500 La Seyne sur Mer).
  • Tests have been conducted to ensure the resistance of the capsules in an acidic medium. They showed excellent resistance to the acid environment since the envelopes were not broken after a time of 4 hours.
  • the gastro-resistant capsules thus prepared were subjected to the following experimental conditions.
  • the capsules remained intact (no rupture of the capsule causing a dispersion of its contents), but became slightly permeable.
  • the contents of the capsules were isolated and analyzed to perform the enumeration of the lactic ferments.
  • the enumeration of the lactic ferments present in the beepollen / clay complex within the gastro-resistant capsules and before digestion indicates 60 000 CFU per gram. After digestion, the beepollen / clay complex has a lactic acid bacteria load of 80,000 CFU per gram.
  • Arkoprobiotics defenses + 40,000 CFU / g The variations in digestion of the ferments in the beepollen / clay complex and the three commercial products are illustrated in Figure 2.
  • the commercial products formulated in gastro-resistant capsules show that less than 1% of ferments are reactivated.
  • the beepollen / clay medium in the form of gastro-resistant capsules increases the enzyme load by 33% during digestion.
  • Example 3 Impact of the beepollen / clay complex on the reactivation of freeze-dried bacteria
  • Freeze-dried bacteria included in the beepollen / clay complex were prepared as follows:
  • the volume of freeze-dried bacteria corresponding to a quantity of 1,000,000
  • the enumeration of the lactic ferments was carried out before and after experimentation by an independent microbiological laboratory accredited by the COFRAC (French Accreditation Committee) for the program 59 - Microbiological Analyzes of Food Products - within the framework of the convention accreditation n 0 1344.
  • Lactobacillus acidophilus 160,000 CFU / g
  • Lyophilized bacteria associated with the complex before putting in capsule, before passage in the stomach (steps 2 and 3 of the protocol not carried out):
  • Freeze-dried bacteria associated with the complex before passage in the stomach :
  • Lactobacillus acidophilus 1,800,000 CFU / g
  • Lactobacillus acidophilus 2,600,000 CFU / g
  • the beepollen / clay complex formulated in gastro-resistant capsules allows an increase in the ferments of freeze-dried probiotics during digestion.
  • Freeze-dried probiotics formulated as gastro-resistant capsules lose at least 95% of their ferments during digestion.
  • beepollen / clay complex is a medium of choice for the reactivation of freeze-dried probiotics
  • the beepollen / clay complex serves as a support for proliferation, implantation and thus administration of probiotics.
  • probiotics when probiotics arrive at the level of the intestine, to exert their actions on the health, they must resist the rise of the pH between the stomach and the duodenum, to resist the impact of the bile salts and the enzymes pancreatic, finally attach to the intestinal wall to be able to interact with the support depending on the specificities of bacteria.
  • a control (physiological saline) will be carried out in parallel, at the same time as these samples.
  • Examples 1 -3 having shown that the placing in gastro-resistant capsules commercial probiotics as Bifidobacterium longum was not of interest in their survival compared to the use of conventional capsules, only the samples comprising the complex beepollen / clay and the beepollen / clay complex associated with probiotics were packaged in gastro-resistant capsules according to the protocol below.
  • the set of samples is subjected to the protocol of Example 2.
  • the stomach fluid has also been analyzed from a microbiological point of view;
  • Pork has been chosen as an animal model, this animal having the digestive physiology closest to that of humans: its gastrointestinal tract is structurally similar to it (Heinz et al., 1987, J. Gen. Virol 68, 2495-2499). 4.2. Recovery of pork intestine
  • the intestines recovered after slaughter of animals for food are placed in a physiological solution.
  • the contents of the gastric chyme adjusted to the correct pH are placed in one of the 700mL stainless steel containers.
  • the contents are continuously stirred to simulate gastric and intestinal movements using a propeller (20 rpm).
  • the intestine is then positioned on the plate.
  • the carpet is activated and the flow of intestinal fluid is started for a period of two hours, under the following conditions:
  • the hygrometry is controlled (80%) so as not to dry the pig's intestine.
  • the internal air of the chamber consists of 95% nitrogen (N2) and 5% air.
  • the fluid passed on the intestine and collected in the bins is analyzed from a microbiological point of view.
  • the fluid before passage on the intestine is also analyzed from a microbiological point of view. On the samples, a microbiological analysis of the lactic flora (NF ISO 15214) is carried out.
  • CFU Colony Forming Units per gram
  • the objective of this study is to evaluate the probiotic's resistance to gastric acidity, then to the increase of the pH during the transit, to the contact with the bile salts and the pancreatic enzymes, their survival to the different intestinal fluids and their adhesion to the intestinal wall.
  • Examples 1-3 show that digestion does not allow bacteria to survive if they are not associated with the beepollen / clay complex.
  • the beepollen / clay complex promotes an increase in the amount of probiotics ingested.
  • the bioburden increases in the presence of the complex, while, at the same time, the probiotics (Bifidobacterium longum) without the protection of the complex are almost all killed.
  • the passage in the stomach is a factor favorable to the proliferation of bacteria if they are protected by the complex.
  • the gastro-resistant capsule becomes permeable, the water penetrates and brings the moisture which the bacteria need to be reactivated and to start the phase proliferation, provided that the bacteria have, as is the case with the complex, sufficient nutrient reserve.
  • This crucial stage of reactivation and proliferation within the complex constitutes a central and preponderant axis in the probiotic activity of the complex.
  • Gastric acidity and bilio-pancreatic secretions are the main endogenous mechanisms of inactivation of the probiotic bacteria ingested.
  • the complex promotes the intra-corpus development of new bacteria from the stomach phase, further improved when placed in contact with the bile and enzymatic juices.
  • the counts of the flora contained in the intestinal fluid before passage on the intestine can determine the contribution of the complex in the survival of probiotics in contact with bile and pancreatic juices. Better than surviving, probiotics continue and accentuate their proliferation.
  • the complex has 23, 424 and 636 fold more bacteria than commercial products (Bion, Lactibiane and Arkoprobiotics respectively).
  • Another crucial point of the study concerns the adhesion of the complex and bacteria to the intestinal mucosa. To have a beneficial action on the mucosa, probiotics must adhere to it.
  • Snapshots were taken before and after the intestinal phase of the study, that is before and after the flow of intestinal fluid that contains the complex with Bifidobacterium longum. There is a very significant difference between the mucosa before and after discharge. Indeed, an orange carpet is visible on the entire surface of the intestine that has been in contact with the intestinal fluid. The photos unambiguously show a characteristic yellow presence of pollen, this time released from its "mantle" of clay.
  • microbiological data are analyzed with the average counts of the 3 segments reported on the surface of the intestine studied.
  • the bioburden contained in the intestinal mucus removed by scraping the mucosa is 582 650 CFU / g with freeze-dried bacteria (Bifidobacterium longum) against 5,160,000 since these are included in the complex.
  • freeze-dried bacteria Bacillus subtilis
  • the complex makes it possible to have respectively 69, 301 and 818 times more bacteria in the intestinal mucosa than the commercial products (Lactibiane, Bion and Arkoprobiotics respectively).
  • the ratio between the bacteria present in the complex and the bacteria without complex was more than 22 times. This difference between these two ratios is explained by the fact that the very important biocharge of the intestinal liquid during the use of the complex as a support for probiotics saturated the intestinal mucosa in microferments.
  • the lactic flora shows better adhesion when associated with the complex. There is also a peripheral action on the total flora. In addition to the interest of the complex for the lactic flora, it seems to act on the control of the total flora, the latter being significantly less important in the presence of the complex. The development of the total flora is totally different on the imprints of the intestine segments with or without complex.
  • the Bifidobacterium longum alone generate footprints with a development of the total flora very important (uncountable on the footprint).
  • the complex associated with Bifidobacterium longum very few colonies (between 10 and 20) develop. In contrast, there is an important development of lactic flora.
  • the pollen can gradually come off the complex to release the bacteria
  • the complex makes it possible to increase the number of lactic acid bacteria of 92 683% in the chyme, 489% in the intestinal mucosa and 2271% in the intestinal liquid, compared to the estimated values.
  • the beepollen / clay complex allows the ferments associated with it to be reactivated. It is a medium of choice for the reactivation and proliferation of "new" lactic acid bacteria.
  • the complex is first brought into contact with the bile and pancreatic juices without affecting the cell viability since on the contrary, the proliferation capacity remains and grows.
  • the major and differentiating interest of the complex consists in the synergistic action of certain intrinsic characteristics of the components, such as the adsorbent effect of the clay.
  • the nutrient supply of pollen is thus complemented by its ability to oppose the irreversible adsorption of bacteria in the clay. This increase of probiotics on the surface of the intestinal mucosa also plays a role in the total flora and reduces its development.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un complexe beepollen/argile à titre de support pour l'administration de probiotiques, ainsi que les compositions comprenant un ou plusieurs probiotiques et ledit complexe beepollen/argile.

Description

Compositions à base de probiotiques et d'un complexe beepollen/argile, leur préparation et leurs utilisations en nutrition et thérapeutique
La présente invention concerne l'administration de microorganismes (bactéries ou levures) à visée probiotique au moyen d'un support à base de beepollen et d'argile, ainsi que les compositions comprenant lesdits microorganismes et ledit complexe beepollen/argile.
Selon la présente invention, le terme microorganisme désigne des microorganismes (bactéries ou levures) à visée probiotique.
Les probiotiques sont des microorganismes tels que les bactéries ou les levures, non pathogènes et non toxiques qui, délivrés vivants en quantité suffisante dans l'intestin, contribuent au maintien de l'équilibre de la flore et au renforcement de la muqueuse intestinale. Ils sont actuellement très recherchés pour les effets bénéfiques qu'ils apporteraient en terme de nutrition et de santé.
Ainsi, la consultation d'experts d'octobre 2001 de Food and Agricultural
Organization (FAO)/OMS sur l'évaluation de la santé et des propriétés nutritionnelles des probiotiques a défini les probiotiques comme des « microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantité suffisante, confèrent un bénéfice pour la santé de celui qui les consomme » et a rapporté que les probiotiques peuvent jouer un rôle important dans les fonctions immunologiques, digestives et respiratoires et pourraient avoir un effet significatif pour traiter les maladies infectieuses, notamment chez les enfants.
Les microorganismes à visée probiotique commercialement disponibles sont généralement lyophilisés et conditionnés sous différentes formes (gélules, sachets, etc.). Néanmoins, l'industrialisation, l'acidité gastrique et la mise en contact avec les sucs biliaires et pancréatiques peuvent être responsables de la perte d'une grande majorité de ces microorganismes, lesquels doivent par ailleurs être réactivés s'ils ont été lyophilisés. Dans la littérature, plusieurs études ont été consacrées à la viabilité des probiotiques en milieu acide. Ainsi, les effets délétères de l'acidité sur la survie de certaines souches probiotiques (Bifidobacterium et Lactobacillus) ont été rapportés par Sun et al. International Journal of Food Microbiology, 61 ,17-25 (2000), Sultana et al. International Journal of Food Microbiology, 62, 47-55 (2000), Favaro-Trindade et al. Journal of Microencapsulation, 19(4), 485-494 (2002) et Hansen et al. Food Microbiology, 19, 35-45 (2002) notamment.
Même parmi les lactobacilles utilisés par l'industrie laitière pour la fabrication de lait fermenté et de yaourts, un grand nombre ne survit pas à l'environnement acide de l'estomac et ne peut donc prétendre à la définition des probiotiques. En effet, pour être qualifié de « probiotique », une souche de microorganismes doit arriver vivante en quantité suffisante au niveau intestinal et s'établir dans la microflore intestinale.
Compte tenu de l'intérêt des probiotiques, il est donc désirable de mettre à disposition des formulations permettant aux microorganismes d'arriver vivants et en quantité suffisante dans l'intestin de l'hôte.
Ainsi, il est essentiel de fournir des compositions qui garantissent l'effet probiotique des microorganismes ajoutés au beepollen, en assurant leur biodisponibilité et leur activité biologique.
La demande internationale PCT/EP201 1/072756 décrit des combinaisons de beepollen et d'argile, nommées ici complexe beepollen/argile, permettant la stabilisation, la formulation sous forme de doses et l'administration de beepollen frais, mais n'envisage aucunement son utilisation à titre de support pour l'administration des microorganismes à visée probiotique caractérisés et préalablement mis sous culture, notamment lyophilisés.
Il a maintenant été découvert, et c'est l'un des objets de la présente invention, que lesdites combinaisons d'argile et de beepollen constituent un système d'administration idéal des microorganismes à visée probiotique, en leur donnant la protection nécessaire contre l'acidité stomacale, les sucs biliaires et pancréatiques ; en fournissant l'alimentation indispensable à leur développement et, préalablement à leur réactivation dans le cas de microorganismes lyophilisés, en leur permettant de donner naissance intra corpus à des microorganismes d'une grande vitalité, naturellement adaptés à l'environnement digestif ; en les délivrant vivants à l'intestin , en les y fixant et en les y libérant. Selon un premier objet, la présente invention concerne donc une composition comprenant :
- un ou plusieurs microorganismes à visée probiotique, et
- un complexe à base de beepollen et d'argile. Selon un autre objet, la présente invention concerne également l'utilisation d'un complexe à base de beepollen/argile à titre de support pour l'administration de microorganismes à visée probiotique notamment lyophilisés, en particulier pour améliorer la biocharge et la biodisponibilité desdits microorganismes.
Ainsi, selon l'invention, il a été démontré que le complexe beepollen/argile constitue un milieu de protection et de nutrition idéal pour les microorganismes à visée probiotique capable d'assurer leur protection lors du passage gastrique, de la mise en contact avec les sucs biliaires et pancréatiques de fournir l'alimentation nécessaire à leur développement et, préalablement à leur réactivation dans le cas de microorganismes lyophilisés.
Le complexe permet de maintenir les microorganismes vivants jusqu'à l'intestin et de conserver leurs caractéristiques biologiques, et par conséquent leurs bienfaits physiologiques sur l'équilibre de la flore intestinale de l'hôte.
En particulier, le complexe beepollen/argile offre un environnement favorable à la naissance intra corpus de microorganismes vivants à visée probiotique d'une grande vitalité, adaptés à l'environnement digestif. De plus, alors que la survie des microorganismes à visée probiotique devient problématique en dessous d'un pH de 3, il a été démontré que le support beepollen/argile des compositions selon l'invention permet de protéger les microorganismes de l'acidité gastrique, en maintenant le pH à un niveau compatible à la vie cellulaire par effet tampon qui isole ainsi les microorganismes du pH stomacal et qui permet la naissance intra corpus de microorganismes à l'issue du passage gastrique. Il a également été démontré que cette protection se prolonge lors du passage dans l'intestin.
On entend par naissance intra corpus la capacité des microorganismes à se multiplier dans le complexe beepollen/argile et à s'adapter à l'environnement physiologique (notamment les conditions du système digestif) de l'hôte à qui ils sont administrés.
On entend par « complexe beepollen/argile » toute matière stable ou « anhydre » résultant de la fixation de beepollen provenant de quelque espèce végétale que ce soit sur une structure lamellaire silicatée. La demande internationale PCT/EP201 1/072756 décrit des combinaisons de beepollen et d'argile, et son contenu est incorporé ici par référence. Au sens de l'invention, on entend par « beepollen » le pollen prélevé par les abeilles. Il s'agit de l'élément fécondant végétal tiré par l'abeille de l'organe mâle de la fleur, aggloméré de fleur en fleur et transporté jusqu'à la ruche. Il peut être prélevé par tout moyen, et notamment juste avant son entrée dans la ruche (grâce à une trappe à pollen), selon les méthodes habituelles.
Au sens de l'invention, ce terme « beepollen » s'applique au pollen récolté par les abeilles quelque soit son mode de prélèvement et/ou conservation. Au sens de l'invention, le terme « beepollen » désigne le beepollen sous toute forme permettant le maintien des caractéristiques du pollen frais. Il comprend donc notamment le beepollen frais ainsi que le beepollen préalablement congelé.
Dans le cadre de la présente invention, le beepollen peut être originaire de diverses espèces végétales et n'est pas limité à une fleur particulière. On peut ainsi citer le beepollen de seigle, de maïs, de tournesol, de ciste, de châtaigner, de kiwi, de saule, de coquelicot, de lavande, de bruyère, etc.
Le beepollen, notamment le beepollen congelé, peut être disponible commercialement par exemple chez Pollenergie.
Le beepollen peut également être de composition variable, notamment en fonction de la nature des plantes d'origine ainsi que de la période de la récolte, du mode de récolte ou encore de la zone géographique (pays, régions...).
Ainsi, le beepollen frais convenant à l'invention contient généralement de 5% à 36% d'eau et de 64% à 95% de matières sèches, parmi celles-ci :
- 2,5% à 3,8% de sels minéraux ;
- 4,2% à 19,8% de lipides ;
- 8% à 30% d'albumine ;
- 5% à 7% d'amidon ;
- des vitamines ;
- des facteurs de croissance ;
- de l'acide folique ;
- des polyphénols ;
- des phytostérols;
des ferments et levures.
On entend par « argile » un matériau comprenant des minéraux argileux tels que les silicates hydratés, notamment des silicates d'aluminium ou de magnésium. On préfère notamment les phyllosilicates présentant une structure feuilletée constituée d'un ou plusieurs feuillets.
Selon la classification de Jozja, basée sur l'épaisseur et la structure du feuillet, on distingue quatre groupes d'argiles :
i) Minéraux à 7 À : Son épaisseur est d'environ 7 À, c'est la catégorie des kaolinites (kaolin, halloysite ...)
ii) Minéraux à 10 À : Son épaisseur est d'environ 10 À, c'est la catégorie des illites (illite, glauconite, ..) iii) Minéraux à 14 À : Son épaisseur est d'environ 14 A, c'est la catégorie des smectites (montmorillonite, bentonite, ghassoul ...)
iv) Minéraux fibreux : L'épaisseur du feuillet est variable on les appelle chlorites ou minéraux fibreux (sepiolite, attapulgite ...).
Le terme « argile » selon l'invention fait donc référence à ces quatre types d'argile.
A titre de minéraux argileux, on peut notamment citer l'illite, la chlorite, la glauconite, la kaolinite, l'attapulgite, la sépiolite et la montmorillonite. On préfère notamment, à titre d'argile, le kaolin, l'illite, la montmorillonite, l'attapulgite, et plus particulièrement la montmorillonite.
Au sens de l'invention, on entend par microorganisme, un organisme microscopique incluant notamment les bactéries et les levures, notamment non pathogènes et non toxiques.
Au sens de l'invention, on entend par microorganisme à visée probiotique, des microorganismes caractérisés et mis sous culture avant leur formulation, qui, lorsqu'ils sont délivrés vivants en quantité suffisante à l'intestin, conféreraient un bénéfice pour la santé et/ou la nutrition de l'hôte.
Le terme « caractérisé » utilisé ici fait référence à un microorganisme dont la ou les souches qui le constituent ont été identifiée(s), notamment de façon à connaître la nature de la ou les souche(s) et éventuellement leur(s) concentration(s).
Selon un mode de réalisation, les microorganismes caractérisés selon l'invention sont ajoutés au beepollen. Selon un mode de réalisation, les microorganismes ajoutés au beepollen sont distincts, notamment de par leur nature, nombre, structure, des microorganismes naturellement présents dans le beepollen. Selon un mode de réalisation, des microorganismes lyophilisés sont ajoutés.
A titre de levure, on peut citer Saccharomyces cerivisiae. A titre de bactéries, on peut citer essentiellement les bactéries lactiques, telles que les lactobacilles, les bifidobactéries ou autres bactéries lactiques. Selon l'invention :
- à titre de lactobacilles, on peut notamment citer Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovirus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobius, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus lactis. - à titre de bifidobactéries, on peut citer Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium brève, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis (reclassé Bifidobacterium animalis), Bifidobacterium laterosporus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum.
- d'autres bactéries lactiques incluent notamment Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus intermedius, Streptococcus thermophilus.
- à titre de bactéries non lactiques, on peut citer Bacillus spp, Escherichia coli (souche nissle), Propionibacterium freudenreichii.
On préfère notamment les lactobacilles et bifidobactéries telles que les espèces Bifidobacterium bifidum (bifidus), Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium brève, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus.
Ces microorganismes à visée probiotique sont généralement disponibles commercialement.
Lesdits microorganismes convenant à l'invention sont généralement isolés, lyophilisés, caractérisés et/ou mis sous culture avant d'être ajoutés et inclus dans le complexe beepollen/argile.
De fait, selon un mode de réalisation préféré cette définition ne couvre pas les microorganismes naturellement présents dans le complexe beepollen/argile, et qui n'auraient pas été isolés, caractérisés, mis sous culture et/ou lyophilisés préalablement à leur inclusion dans le complexe.
Les microorganismes lyophilisés à visée probiotique rentrent dans le champ de la présente invention.
Les microorganismes à visée probiotique sont majoritairement commercialisés sous forme lyophilisée. La lyophilisation, ou séchage à froid, est un procédé basé sur la sublimation qui permet de retirer l'eau contenue dans une matière, un aliment ou un produit afin de le rendre stable à la température ambiante et ainsi faciliter sa conservation.
La lyophilisation comporte de nombreux avantages par rapport aux autres procédés de séchage ou de conservation. • La lyophilisation permet de conserver une grande partie des qualités des aliments étant donné que ceux-ci demeurent à une température sous le point de congélation durant la sublimation. L'utilisation de la lyophilisation est particulièrement importante dans le cas des bactéries lactiques puisqu'elles sont très sensibles à la chaleur.
• Les aliments lyophilisés en général ne nécessitent pas de réfrigération pour se conserver. Les coûts d'entreposage et de transport peuvent être ainsi réduits de façon appréciable.
• La lyophilisation entraîne une diminution importante du poids, ce qui facilite grandement le transport des aliments lyophilisés. Par exemple, plusieurs aliments contiennent jusqu'à 90% d'eau. Ils seront donc dix fois plus légers après lyophilisation.
• La plupart des aliments lyophilisés se réhydratent très rapidement grâce à leur texture poreuse. En effet, la lyophilisation n'entraîne pas de diminution de volume appréciable. L'eau peut donc reprendre sa place facilement dans la structure moléculaire de l'aliment.
Les microorganismes lyophilisés sont mis en état dormant par dessication. Ils doivent donc être réactivés pour arriver vivants dans l'intestin et y exercer une action bénéfique pour la santé de l'hôte, conformément à l'invention.
Selon l'invention, il a été démontré que le complexe beepollen/argile représente un support permettant la réactivation de ces bactéries lyophilisées.
Ce support représente donc un environnement favorable et idéal à la nutrition, la protection, au développement et pour les microorganismes lyophilisés la réactivation des microorganismes, y compris lors de l'administration par voie orale.
Généralement, les compositions selon la revendication comprennent :
- de 0,1 % à 70% de probiotiques lyophilisés ; et
- de 30% à 99,9% dudit complexe,
les pourcentages s'entendant en poids ;
et plus particulièrement :
- de 3% à 30% de probiotiques lyophilisés ; et
- de 70% à 97% dudit complexe,
les pourcentages s'entendant en poids.
Les complexes beepollen/argile comprennent généralement :
- de 4% à 90% de beepollen, et
- de 10% à 96% d'argile.
Les pourcentages s'entendant en poids. Plus préférentiellement, les complexes selon l'invention comprennent :
- de 20% à 40% de beepollen et
- de 60% à 80% d'argile,
et plus particulièrement :
- de 30% à 35% de beepollen et
- de 65% à 70% d'argile.
Les complexes selon l'invention présentent avantageusement une granulométrie inférieure à 500 μηι, un taux d'humidité inférieur à 15% et/ou une activité d'eau (aw) inférieure à 0,75.
Généralement, les compositions selon l'invention se présentent sous forme de poudre et présentent notamment les caractéristiques suivantes :
Figure imgf000009_0001
Avantageusement, les compositions selon l'invention peuvent être formulées sous forme gastro-résistante, notamment sous forme de gélules gastro-résistantes.
Selon l'invention, il a également été démontré, de façon inattendue, qu'une formulation gastro-résistante de microorganismes à visée probiotique et du complexe beepollen/argile a permis l'augmentation de la biocharge avec la naissance intra corpus de ferments alors que les microorganismes formulés sous forme de gélules gastro- résistantes, sans le complexe beepollen/argile, ont un niveau de viabilité considérablement affecté.
Avantageusement, lorsque le complexe beepollen/argile chargé en probiotiques lyophilisés est formulé en gélules gastro-résistantes, le passage au niveau de l'estomac s'inscrit comme un facteur favorable à la prolifération. Au contact du flux gastrique contenu dans l'estomac, la gélule gastro-résistante devient perméable, l'eau pénètre et apporte l'humidité dont les microorganismes ont besoin pour entamer la phase de prolifération.
Selon l'invention, l'utilisation d'un complexe beepollen/argile comme support pour l'administration orale de microorganismes à visée probiotique permet de
- protéger les microorganismes à visée probiotique des effets délétères du conditionnement ;
- réactiver les microorganismes à visée probiotique lyophilisés inclus dans la composition ;
- nourrir et maintenir viables les microorganismes à visée probiotique inclus dans la composition ;
- protéger les microorganismes à visée probiotique de l'acidité gastrique
- protéger les microorganismes à visée probiotique des sucs biliaires et pancréatiques ;
- donner naissance intra corpus à des microorganismes à visée probiotique adaptés à l'environnement digestif ;
libérer les microorganismes dans le milieu intestinal tout en favorisant leur adhésion et interaction avec la muqueuse intestinale. Les microorganismes doivent se fixer à l'intestin pour contribuer au renforcement de la barrière intestinale et exercer leur action bénéfique sur la santé de l'hôte. Ainsi, par exemple, les bifidobactéries possèdent des capacités d'adhésion à la muqueuse intestinale où elles reconnaissent différents récepteurs de l'épithélium intestinal. Les bactéries lactiques, quant à elles, occupent des sites potentiels de colonisation par les pathogènes en empêchant la pénétration d'antigènes nuisibles et en évitant ainsi la prolifération de germes pathogènes. Elles consomment les nutriments disponibles limitant la source de nutriments pour les pathogènes et entrent en compétition avec les pathogènes pour l'accès aux récepteurs de l'hôte. De plus, elles sécrètent des molécules antimicrobiennes telles les bactériocines au niveau de la surface épithéliale et agissent aussi sur le milieu (p. ex. acidification).
En augmentant la rétention des microorganismes à visée probiotique dans l'intestin, le complexe beepollen/argile favorise l'interaction bénéfique de ces microorganismes avec la muqueuse intestinale. Le microbiote intestinal exerce de nombreuses fonctions physiologiques nécessaires et bénéfiques pour le maintien de la santé de l'hôte. Le maintien de l'équilibre de la flore intestinale et le renforcement de la barrière intestinale présentent un intérêt majeur. Les microorganismes à visée probiotique sont de bons candidats pour atteindre cet objectif. Cependant, des difficultés majeures empêchent généralement les microorganismes d'exercer une activité probiotique : la nécessité d'alimenter correctement les microorganismes pour les maintenir en vie ; la nécessité de réactiver les microorganismes lyophilisés ; la faible résistance des microorganismes aux chocs de l'industrialisation ; la faible résistance des microorganismes à l'acidité gastrique, aux sucs biliaires et pancréatiques ; le manque d'adaptation des microorganismes à l'environnement digestif et le caractère planctonique des microorganismes qui est un frein à leur adhésion à la muqueuse et à leur interaction avec elle. Des stratégies de contournement de ces difficultés existent, mais aucune ne permet de contourner l'ensemble des difficultés. Par exemple, des souches bactériennes bénéfiques isolées et mises sous culture pour leur résistance à l'acidité gastrique ne sont pas réactivées, et le pourcentage infime qui va atteindre l'intestin ne pourra ni s'y fixer ni interagir efficacement au niveau intestinal. Aujourd'hui, aucun support ne permet de résoudre en simultané les différents freins biologiques et/ou physiologiques en garantissant une action sur le site cible. La présente invention permet de s'affranchir dans une large mesure de ces difficultés et fournit aux microorganismes l'environnement nécessaire à leur action probiotique au niveau intestinal.
Le complexe beepollen/argile permet de s'affranchir simultanément de l'ensemble des obstacles industriels, biologiques et/ou physiologiques à l'action des probiotiques en apportant les éléments suivants :
Environnement nutritif nécessaire à la subsistance des bactéries
Environnement nutritif nécessaire à la réactivation des bactéries lyophilisées
Résistance à l'acidité gastrique
· Résistance aux sucs biliaires et pancréatiques
Adaptation à l'environnement digestif
Fixation à la paroi intestinale et délivrance.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition selon l'invention. Ledit procédé comprend :
- le mélange de beepollen et d'argile ; et
- l'ajout et le mélange de microorganismes à visée probiotique.
Lesdits microorganismes à visée probiotique peuvent être lyophilisés, présentés sous forme de poudre notamment.
De préférence, le mélange obtenu peut être tamisé pour obtenir la granulométrie désirée. Avantageusement, un tamis de maillage 500μηι est utilisé. L'invention concerne également l'utilisation d'un complexe à base de beepollen et d'argile pour véhiculer les microorganismes à visée probiotique jusqu'à l'intestin, les fixer, améliorer leur biodisponibilité et/ou leur activité biologique probiotique au niveau intestinal. Ledit complexe constitue donc un biovecteur pour l'administration de microorganismes à visée probiotique.
On entend ici par « activité biologique » l'effet nutritionnel (notamment diététique) et/ou physiologique, tel que probiotique et thérapeutique, exercé par lesdits microorganismes chez les sujets qui les ont consommés.
La présente invention concerne donc notamment une composition alimentaire, cosmétique, pharmaceutique et/ou galénique et/ou un dispositif médical comprenant une composition selon l'invention.
Lesdites compositions/dispositifs selon l'invention sont donc utiles à titre préventif et/ou curatif, thérapeutique et/ou nutritionnel (notamment diététique), pour usage humain et/ou animal. Les excipients nécessaires à la mise en forme industrielle du produit peuvent être choisis parmi toutes les matières acceptables selon la réglementation (aliment, complément alimentaire, aliment fonctionnel, cosmétique, dispositif médical, pharmaceutique) qui régit ce produit.
On peut ainsi notamment citer comme excipients les dérivés de la cellulose ou de la cellulose microcristalline, les carbonates alcalino-terreux, le phosphate de magnésium, les amidons, les amidons modifiés, le lactose pour les formes solides, l'eau, les solutés aqueux, le sérum physiologique, les solutés isotoniques, etc.
Selon un mode de réalisation, les compositions comprennent également une source de sucre, tel que le glucose permettant aux bactéries de se développer.
Les compositions selon l'invention peuvent être présentées sous des formes destinées à l'administration par voie orale, sublinguale, topique, locale, intratrachéale, intranasale ou rectale, notamment orale.
Elles peuvent donc être notamment présentes sous forme de solutés ou flacons multi-doses, ou sous forme de comprimés nus ou enrobés, de dragées, de capsules, de gélules molles ou dures, de granules, pilules, de cachets, de poudres, de suppositoires ou de capsules rectales, de solutions ou de suspensions, ou encore de crèmes, gels, pommades, pâtes, patch, produits alimentaires tels que yaourts, etc.
La présente invention vise plus particulièrement les formulations gastrorésistantes telles que les pâtes ou les gélules, notamment les gélules gastrorésistantes comprenant une composition selon l'invention. De préférence, ladite composition contient une quantité efficace de la composition selon l'invention.
La dose et/ou posologie peut varier dans les limites importantes (0,5 mg à 1000 mg) et peut dépendre de la voie d'administration, ainsi que de l'âge et du poids du sujet.
II peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés ; de tels dosages ne sortent pas du cadre de l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque sujet est déterminé selon le mode d'administration, le poids et la réponse dudit sujet, ainsi que la concentration des microorganismes dans ladite composition.
Les compositions alimentaires selon l'invention peuvent être notamment un aliment, un aliment fonctionnel (ou alicament) ou un complément alimentaire.
Les aliments fonctionnels ou alicaments sont généralement définis comme un aliment conventionnel, ou qui en a l'apparence, qui fait partie de l'alimentation normale, et qui a pour caractéristique de procurer des effets physiologiques bénéfiques dépassant ses fonctions nutritionnelles habituelles ou de réduire le risque de maladies chroniques.
L'invention vise donc également les aliments fonctionnels tels que les yaourts comprenant une composition selon l'invention.
Ladite composition peut aussi constituer un complément alimentaire au sens de la Directive Européenne 2002/46/CE.
Ledit complément alimentaire est avantageusement formulé sous forme de dose, à savoir dans une forme de présentation définie par la Directive Européenne 2002/46/CE, telle que « les gélules, les pastilles, les comprimés, les pilules et autres formes similaires, ainsi que les sachets de poudre, les ampoules de liquide, les flacons munis d'un compte- goutte et les autres formes analogues de préparations liquides ou en poudre destinées à être prises en unités de faible quantité ».
Ladite composition peut aussi constituer notamment une spécialité pharmaceutique au sens de la Directive Européenne 2001 /83/CE.
Ladite composition peut être utile dans la prévention et/ou le traitement de désordres dans lesquels les probiotiques sont généralement considérés bénéfiques. On peut ainsi citer notamment l'ostéoporose, des maladies cardio-vasculaires, des cancers, des désordres du foie et du métabolisme, la fatigue, des troubles circulatoires, des troubles articulaires, les symptômes ménopausiques, des désordres du système nerveux, des désordres du système gastro-intestinal, des désordres oculaires, urinaires, des désordres de la prostate tel que l'hypertrophie bénigne de la prostate, la prostatite chronique, la prostatodynie et le cancer de la prostate, les troubles nutritionnels, dermatologiques et cosmétodermatologiques, l'asthénie et la fatigabilité, la convalescence et la post-chirurgie, les déséquilibres hydro-électrolytiques, les améliorations des conditions physiques, etc.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également comprendre un ou plusieurs ingrédients actifs.
La présente invention concerne également les dispositifs médicaux comprenant une composition selon l'invention. Ladite composition peut donc constituer un dispositif médical au sens de la Directive Européenne 93/42 CEE.
FIGURES
La figure 1 représente le développement de bactéries lyophilisées (Bifidobacterium longum) dans un milieu idéal et au sein du complexe beepollen/argile.
La figure 2 représente les pourcentages de gain et de perte de ferments après passage dans l'estomac pour quatre compositions formulées sous forme de gélules gastro-résistantes :
i) sur support beepollen/argile ;
ii) produit Bion Transit,
iii) produit Lactibiane réf. 2,5G,
iv) Arkoprobiotics défense +.
La figure 3 représente la survie des bactéries lyophilisées en gélules gastrorésistantes après passage dans l'estomac.
La figure 4 représente la réactivation des bactéries lyophilisées associées au complexe beepollen/argile, en gélules gastro-résistantes, après passage dans l'estomac.
La Figure 5 illustre les gains et pertes des ferments après passage dans l'estomac et action de la bile et du pancréas, avec et sans complexe.
La Figure 6 illustre l'effet synergique du beepollen et de l'argile sur les gains de ferments dans l'estomac, chyme, muqueuse et liquide intestinal.
Les exemples suivants illustrent l'invention, sans toutefois la limiter. Les produits de départs utilisés sont des produits connus ou préparés selon des modes opératoires connus.
Les pourcentages sont exprimés en poids, sauf mention contraire. EXEMPLES
- Matériel:
Balance électronique de précision- Mettler Toledo PG803
Etuve WTB binder
Agitateur - IKA Labotechnik Eurostar
pH mètre HANNA instruments
Bêcher en verre 250m L - Bomex
Spatules courbées, forme cuillère, acier inox 18/8 - Labo-moderne
- Fournisseurs de matières premières:
Pollen de Tournesol congelé sous gaz azote
Pollenergie
La Grabère - 47450 St Hilaire de Lusignan
Tél. 05 53 68 1 1 1 1 - Fax. 05 53 68 1 1 12
Argile Montmorillonite
Argiletz
14 route d'Echampeau - 77 440 Lizy sur Ourcq
Tél. 01 60 61 20 88 - Fax. 01 60 61 27 39. Le complexe a été préparé de la façon suivante.
Pour la préparation de 150 g de complexe beepollen/argile : les proportions de chacun des composants est de 66,66 % d'argile pour 33,33% de beepollen.
Peser 100 g d'argile dans un bêcher de 250 mL ;
Peser 50 g de beepollen congelé dans un bêcher de 250 mL ;
- Les pièces de l'agitateur sont de préférence sèches pour éviter l'hydratation du complexe ;
- Mélanger l'argile ;
- Ajouter le beepollen et laisser mélanger pendant 30 secondes.
La granulométrie désirée est obtenue par tamisage au moyen d'un tamis de maillage 500 μηι.
Les compositions à base de beepollen/argile et de microorganismes à visée probiotique sont préparées de la façon suivante pour 166.67g de produit final avec 10% de microorganismes :
- Peser 100g d'argile dans un bêcher de 250 mL;
- Peser 50g de beepollen dans un bêcher de 250 mL; - Peser 16.67g de microorganismes dans un bêcher de 100 ml_;
- Les pièces de l'agitateur sont de préférences sèches pour éviter l'hydratation du complexe;
- Mélanger l'argile;
- Ajouter le beepollen et laisser mélanger pendant 30 secondes;
- Ajouter les microorganismes et laisser mélanger pendant 30 secondes;
La granulométrie désirée est obtenue par un tamisage au moyen d'un tamis de maillage 500 μπι. Exemple 1 : Mise en évidence de la capacité du complexe beepollen/arqile à fournir un milieu de nutrition et réactivation des bactéries lyophilisées
Il a été rapporté, dans la littérature, les besoins en ingrédients indispensables à la réactivation des bactéries lyophilisées.
Ces ingrédients (sucres, protéines, sodium, etc.) et les proportions optimales (besoins en %) pour la réactivation des bactéries lyophilisées sont représentés dans les deux premières colonnes du tableau ci-dessous. La troisième colonne de ce tableau indique le pourcentage de ces différents ingrédients contenu dans le complexe beepollen/argile.
Ingrédients Besoins en Dans le support
% beepollen/argile %
Peptone (hydrolyse de protéine) 16
35
Protéine 13
Levure 6.6 Entre 6 et 13
La plus grande source de vitamine B1
(12mg/100g) nécessaire au métabolisme des
glucides et des lipides
Glucose 32 De 20 à 40%
Acétate de sodium trihydraté 8 Sodium apporté par l'argile
Citrate d'ammonium 3.2 Apporté par l'argile
Tween (solubilisant nécessaire à 1 .6 non applicable
l'assemblage des substances non miscibles
entre elles)
Hydrogénophosphate de potassium 3.2 De 20 à 45% des cendres
Sulfate de magnésium heptahydraté 0.3 De 1 à 12% des cendres Sulfate de manganèse tétrahydraté 0.1 1 .4% des cendres*
Agar (polysacharides) 16 Entre 13 et 55%
pH 6.2 Pollen pH6.0 maintenu acide par l'argile
De nombreuses vitamines, des acides aminés et des substances de croissance
On retrouve donc une parfaite concordance entre les éléments indispensables à la réactivation des bactéries lyophilisées rapportés dans la littérature et les éléments contenus dans le support de beepollen/argile.
Le développement de bactéries Bifidobacterium longum au sein d'un milieu nutritif idéal et au sein du complexe beepollen/argile a été mis en évidence de la façon suivante.
1 - Les bactéries ont été ensemencées dans un milieu de culture idéal et d'autres ont été ensemencées avec le complexe beepollen/argile en quantité équivalente.
2- Des dénombrements ont été réalisés pour ces deux échantillons.
Les résultats illustrés à la Figure 1 démontrent que le complexe beepollen/argile permet la réactivation et la prolifération des bactéries.
Exemple 2 : Mise en évidence de la résistance à l'acidité du complexe beepollen/argile par rapport à des produits commerciaux
Les trois produits commerciaux suivants ont été utilisés.
Bion transit
Bion transit apporte une souche probiotique spécifique : Lactobacillus plantarum
299v.
Bion transit est destiné aux personnes dont l'intestin est sensible et qui sont sujettes à des troubles intestinaux fréquents : inconfort, gêne, pesanteur, ballonnements, transit irrégulier, etc.
Il est revendiqué sur le produit un apport de 10 000 000 000 (10 milliards) de probiotiques par gélule. Lactibiane référence 2,5G
Les souches probiotiques de Lactibiane Référence sont certifiées GRAS (Generally Regarded As safe) et déposées à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'institut Pasteur. Il s'agit des quatre souches suivantes :
- Bifidobacterium longum LA 101
- Lactobacillus acidophilus LA 102
- Lactococcus Lactis LA 103
- Streptococcus thermophilus LA 104
Lactibiane référence 2,5G contribue au maintien de la flore intestinale, améliore le confort digestif et régule le transit dès la première semaine. Il peut aider en cas de troubles digestifs (ballonnements, etc.) et en prévention hivernale.
Il est revendiqué sur le produit un apport de 10 000 000 000 (10 milliards) de probiotiques par gélule. Arkoprobiotics défenses +
Arkoprobiotics défenses + contient une sélection de probiotiques lyophilisés provenant de plusieurs souches :
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus plantarum
- Lactobacillus rhamnosus
Lactobacilus acidophilus
Arkoprobiotics défense+ aide à renforcer les défenses naturelles de l'organisme, notamment pendant l'hiver et les changements de saison, ainsi qu'à rééquilibrer la flore intestinale. Il contribue à l'équilibre de la vitalité de l'organisme.
Il est revendiqué sur le produit un apport de 50 000 000 000 (50 milliards) de probiotiques par gélule.
Mode opératoire :
Des gélules gastro-résistantes contenant le complexe beepollen/argile ou des souches bactériennes de produits commerciaux ont été fabriquées, au moyen du kit de préparation des gélules gastro-résistantes ApproPharm (254 chemin de la Farlède - 83500 La Seyne sur Mer).
Le mode opératoire pour l'enrobage est le suivant • Tremper les gélules pleines de complexe beepollen/argile ou de produits commerciaux pendant 10 secondes dans le liquide.
• Laisser sécher sur un tamis, en remuant fréquemment pour éviter tout collage.
• Attendre 10 minutes et puis ajouter une 2e couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment.
• Attendre 10 minutes et puis ajouter une 3e couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment.
• Attendre 10 minutes et puis ajouter une 4e couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment.
· Attendre 10 minutes et puis ajouter une 5e couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment.
Des essais ont été conduits pour s'assurer de la résistance des gélules dans un milieu acide. Ils ont montré une excellente résistance au milieu acide puisque les enveloppes n'étaient pas rompues après un temps de 4 heures.
Conditions expérimentales
Les gélules gastro-résistantes ainsi préparées ont été soumises aux conditions expérimentales suivantes.
Ainsi, les gélules
- ont été placées dans 500 mL (volume de l'estomac en préprandial)
- d'une solution acide de pH 2 (acidité du contenu stomacal)
- maintenues dans une étuve à la température de 37 °C (température corporelle)
- pendant une durée totale de 4h (durée de transit au niveau stomacal)
- sous agitation mécanique (contraction de l'estomac).
A la fin de l'expérimentation, les gélules sont restées intègres (pas de rupture de la gélule entraînant une dispersion de son contenu), mais sont devenues légèrement perméables. Le contenu des gélules a été isolé et analysé pour réaliser le dénombrement des ferments lactiques.
Dénombrement des ferments lactiques
Le dénombrement des ferments lactiques par QSA - Qualité Sécurité Alimentation - Site d'Agropole - BP 125 - 47931 Agen Cedex 9.
Le dénombrement des ferments lactiques présents dans le complexe beepollen/argile au sein des gélules gastro-résistantes et avant digestion indique 60 000 UFC par gramme. Après digestion, le complexe beepollen/argile présente une charge en bactéries lactiques de 80 000 UFC par gramme.
Pour les produits commerciaux avec mise en gélule gastro-résistante sans complexe, le dénombrement des ferments lactiques après digestion est le suivant :
Bion Transit 40 UFC/g
Lactibiane référence 2,5G 190 000 UFC/g
Arkoprobiotics défenses + 40 000 UFC/g Les variations lors de la digestion des ferments dans le complexe beepollen/argile et les trois produits commerciaux sont illustrées à la Figure 2. Les produits commerciaux formulés en gélules gastro-résistantes montrent que moins de 1 % des ferments sont réactivés. Le support beepollen/argile sous forme de gélules gastro-résistantes permet d'augmenter la charge en ferments de 33% lors de la digestion.
Exemple 3 : Impact du complexe beepollen/argile sur la réactivation des bactéries lyophilisées
1 ) préparation des lots
- des bactéries lyophilisées seules (souches commerciales pures)
versus
- les mêmes bactéries lyophilisées incluses dans le complexe beepollen/argile. Une quantité similaire de microorganismes a été incluse dans chaque lot, indépendamment de la quantité et/ou de la forme galénique du produit de référence (entre
1 000 000 et 2 000 000).
Les bactéries lyophilisées incluses dans le complexe beepollen/argile ont été préparées de la façon suivante :
Le volume de bactéries lyophilisées correspondant à une quantité de 1 000 000-
2 000 000 a été ajouté au complexe. Le mélange a été homogénéisé à l'aide d'un agitateur pendant 30 secondes.
2) Les gélules gastro-résistantes ont été préparées selon la procédure de l'exemple 2.
3) Les gélules ont étés soumises aux conditions expérimentales suivantes. Ainsi, les gélules :
- ont été placées dans 500 mL (volume de l'estomac en préprandial) - d'une solution acide de pH2 (acidité du contenu stomacal)
- maintenues dans une étuve à la température de 37°C (température corporelle)
- pendant une durée totale de 4h (durée de transit au niveau stomacal)
- sous agitation mécanique (contraction de l'estomac).
Le dénombrement des ferments lactiques a été réalisé avant et après expérimentation par un laboratoire d'analyse microbiologique indépendant accrédité par le COFRAC (Comité Français d'Accréditation) pour le programme 59 - Analyses microbiologiques des produits agro-alimentaires - dans le cadre de la convention d'accréditation n 01344.
Les résultats obtenus sont les suivants :
1. Echantillons sans le complexe Beeopollen/ argile
Bactéries commerciales lyophilisées, avant mise en gélule, avant passage dans l'estomac (étapes 2 et 3 du protocole non réalisées) :
Bactéries lyophilisées avant passage dans l'estomac :
Bifidobacterium longum 800 UFC/g
Lactobacillus acidophilus 41 000 000 UFC/g
Bifidobacterium bifidum 75 000 000 UFC/g
Bactéries commerciales lyophilisées, mises en gélules gastro-résistantes après passage dans l'estomac (étapes 1, 2 et 3 du protocole) :
Bifidobacterium longum 40 UFC/g
Lactobacillus acidophilus 160 000 UFC/g
Bifidobacterium bifidum 32 000 UFC/g
Les pourcentages de gain ou de perte des ferments lactiques après passage dans l'estomac ont été calculés. Ils sont représentés pour chaque bactérie, à la Figure 3. 2. Echantillons associés au complexe beepollen/ argile
Bactéries lyophilisées associées au complexe avant mise en gélule, avant passage dans l'estomac (étapes 2 et 3 du protocole non réalisées):
Bactéries lyophilisées associées au complexe avant passage dans l'estomac :
Bifidobacterium longum 1 900 000 UFC/g
Lactobacillus acidophilus 1 800 000 UFC/g
Bifidobacterium bifidum 1 100 000 UFC/g Bactéries lyophilisées associées au complexe, mises en gélules gastro-résistantes après passage dans l'estomac :
Bifidobacterium longum 7 400 000 UFC/g
Lactobacillus acidophilus 2 600 000 UFC/g
Bifidobacterium bifidum 2 600 000 UFC/g
Les pourcentages de gain ou de perte des ferments lactiques après passage dans l'estomac ont été calculés. Ils sont représentés pour chaque bactérie, seule ou associée au complexe beepollen/argile, à la Figure 4.
Le complexe beepollen/argile formulé en gélules gastro-résistantes permet une augmentation des ferments des probiotiques lyophilisés lors de la digestion.
Les probiotiques lyophilisés formulés sous forme de gélules gastro-résistantes perdent au moins 95% de leurs ferments lors de la digestion.
Ces résultats montrent que :
les effets de prolifération des ferments induits par le complexe beepollen/argile sur les bactéries incluses naturellement dans le beepollen frais peuvent être étendus aux bactéries lyophilisées.
le complexe beepollen/argile est un support de choix pour la réactivation de probiotiques lyophilisés
le complexe beepollen/argile sert de support de prolifération, d'implantation et donc d'administration de probiotiques.
Exemple 4 : Etude intestinale
La démonstration que les bactéries qui arrivent au niveau intestinal ne sont pas dégradées par les différents sucs sécrétés et qu'elles adhèrent à la muqueuse intestinale est un enjeu de taille et constitue un potentiel scientifique et industriel.
En effet, lorsque les probiotiques arrivent au niveau de l'intestin, pour exercer leurs actions sur la santé, ils doivent résister à l'élévation du pH entre l'estomac et le duodénum, résister à l'impact des sels biliaires et des enzymes pancréatiques, enfin se fixer à la paroi intestinale pour pouvoir interagir avec le support en fonction des spécificités des bactéries.
La présente étude a pour but d'évaluer :
- la résistance des probiotiques aux variations de pH (gastrique et intestinal) et aux différents fluides (sels biliaires et enzymes pancréatiques)
- l'adhérence des probiotiques à la paroi intestinale. Elle comporte donc deux expérimentations :
- une étude sur milieu artificiel permettant de mesurer la résistance des probiotiques aux variations physiologiques de pH et aux atteintes enzymatiques, de l'estomac au duodénum : ceci vient en quelque sorte compléter par le niveau intestinal les études précédentes qui étudiaient la résistance des probiotiques au milieu gastrique (et dont les résultats ont été rappelés précédemment) ;
- une étude ex-vivo sur explants d'intestin pour mesurer à la fois la survie des probiotiques dans la lumière intestinale et leur adhésion à la muqueuse intestinale.
PROTOCOLE
1. Echantillons à tester
Les échantillons qui devront être testés lors de cette étude sont :
-Argile seule
-Pollen seul
-Probiotique seul (Bifidobacterium longum)
-Complexe beepollen/argile
-Complexe beepollen/argile + probiotiques
- Produits Bion, Lactibiane, Arkoprobiotics
Un témoin (sérum physiologique) sera réalisé en parallèle, en même temps que ces échantillons.
Pour des raisons d'homogénéité, tous les échantillons ont été mis en gélules de taille 1 , conservées à 4°C.
Les exemples 1 -3 ayant montré que la mise en gélules gastro-résistantes des probiotiques commerciaux comme de Bifidobacterium longum ne présentait pas d'intérêt quant à leur survie par rapport à l'utilisation de gélules classiques, seuls les échantillons comportant le complexe beepollen/argile et le complexe beepollen/argile associés aux probiotiques ont été conditionnés en gélules gastro-résistantes selon le protocole ci- après.
• Tremper les gélules pleines de complexe Beepollen/argile avec ou sans probiotiques pendant 10 secondes dans le liquide.
• Laisser sécher sur un tamis, en remuant fréquemment pour éviter tout collage.
• Attendre 10 minutes et puis ajouter une 2ème couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment. • Attendre 10 minutes et puis ajouter une 3ème couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment.
• Attendre 10 minutes et puis ajouter une 4ème couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment.
• Attendre 10 minutes et puis ajouter une 5ème couche : Tremper les gélules 5 secondes dans la solution, puis laisser sécher comme précédemment.
2. Simulation in vitro de la phase stomacale
L'ensemble des échantillons est soumis au protocole de l'exemple 2.
Au niveau de l'estomac, les échantillons sont soumis à de nombreux paramètres physiologiques qui ont étés reproduits de la manière suivante:
- ils ont été dilués dans 500ml_ (volume de l'estomac en pré-prandial)
- d'une solution acide de pH2 (acidité du contenu stomacal)
- maintenus dans une étuve à la température de 37 °C (température corporelle)
- pendant une durée totale de 4h (durée de transit au niveau stomacal)
- sous agitation (contraction de l'estomac).
Après incubation :
- dans le cas du complexe beepollen/argile associé aux Bifidobacterium longum, le contenu de ces gélules a été analysé d'un point de vue microbiologique ;
- dans le cas des gélules non gastro-résistantes, le liquide stomacal a également été analysé d'un point de vue microbiologique ;
- 62,5 ml_ de l'extrait de sucs biliaire et de suc pancréatique ont été ajoutés au liquide stomacal. Un échantillon de ce liquide (chyme intestinal) a été analysé d'un point de vue microbiologique.
3. Passage du pH gastrique au pH intestinal
A la fin des 4 heures d'incubation, 62,5 ml d'une solution constituée d'une solution de bicarbonate de sodium à 0.2M et d'extrait de bile à 1 ,2% et de suc pancréatique à 0.2% sont ajoutés au liquide gastrique.
4. Etude sur explants : étude préparatoire
4.1 . Choix du modèle animal.
Le porc a été choisi comme modèle animal, cet animal ayant la physiologie digestive la plus proche de celle de l'Homme : son tractus gastro-intestinal lui est similaire du point de vue structural (Heinz et al., 1987, J. Gen. Virol. 68, 2495-2499). 4.2. Récupération de l'intestin de porc
Les intestins récupérés après abattage des animaux à destination alimentaire (dénués de toute pathologie) sont placés dans une solution physiologique. La solution est composée d'eau distillée et de chlorure de sodium (NaCI) dilué à 9 pour 1000 (= solution à 0,9 % de poids/volume de NaCI, soit 9 g/l). Elle contient 154 mEq/l de Na+ et de Cl- avant utilisation, puis l'intestin est lavé dans une solution de Ringer.
Des segments longitudinaux de 6 cm par 27 cm sont préparés dans le duodéno- jéjunum et conservés dans la solution de Ringer. 5. Simulation de la phase intestinale
Pour visualiser l'adhésion des microbactéries à la muqueuse intestinale, un appareil permettant de simuler la digestion sur des explants d'intestins de porc a été développé avec les paramètres suivants:
Le contenu du chyme gastrique ajusté au bon pH est placé dans un des réceptacles en acier inoxydable de 700mL. Le contenu est brassé en continu de manière à simuler les mouvements gastriques et intestinaux à l'aide d'une hélice (20 tours par minute).
Les intestins de porcs sont placés sur les plaques présentant les caractéristiques suivantes:
- des plaques inclinées (1 1 °) en acier inoxydable de 6.8 cm sur 22 cm qui sont recouvertes d'une membrane souple et crantée permettant de modéliser le péristaltisme. Ce mouvement sera réalisé à l'aide d'un tapis roulant à la vitesse de 0,5cm/minute.
L'intestin est alors positionné sur la plaque. Lorsque l'intestin est correctement positionné sur la plaque, le tapis est activé et l'écoulement du liquide intestinal est lancé pour une durée de deux heures, dans les conditions suivantes :
- Maintien de l'intestin de porc à une température constante de 37°C.
- L'hygrométrie est contrôlée (80%) de manière à ne pas assécher l'intestin de porc.
- L'air interne de la chambre est constitué de 95% d'azote (N2) et 5% d'air.
- Maintien de l'intestin de porc à l'obscurité durant la phase expérimentale.
6. Mesures
Au bout des 2 heures, les intestins sont
- enlevés de leurs supports ;
- découpés en sections transversales ; -observées au microscope et raclées pour réaliser un dénombrement microbiologique :
Le liquide passé sur l'intestin et recueilli dans les bacs de récupération est analysé d'un point de vue microbiologique.
Le liquide avant passage sur l'intestin est également analysé d'un point de vue microbiologique. Sur les échantillons, on réalise une analyse microbiologique de la flore lactique (NF ISO 15214).
Les résultats relatifs aux comptages microbiologiques avant, pendant et après passage sur l'intestin sont transmis en Unité Formant des Colonies par gramme (UFC - Units Forming Colony per gram). Cela permet de comparer les différents niveaux et d'évaluer les éventuelles proliférations. Les ratios: surfaces d'intestins analysés par rapport à la surface totale de l'intestin sont pris en considération.
Les morphologies cellulaires ont été évaluées. L'intégrité du grain de pollen est également évaluée.
RESULTATS ET DISCUSSIONS
L'objectif de cette étude est d'évaluer la résistance des probiotiques à l'acidité gastrique, puis à l'élévation du pH au cours du transit, à la mise en contact avec les sels biliaires et les enzymes pancréatiques, leur survie aux différents fluides intestinaux et leur adhérence à la paroi intestinale.
1. Evaluation de la survie de ferments à la phase stomacale.
Les exemples 1 -3 montrent que la digestion ne permet pas aux bactéries de survivre s'ils ne sont pas associés au complexe beepollen/argile.
Dans ce même contexte physiologique, le complexe beepollen/argile favorise une augmentation de la quantité de probiotiques ingérés. La biocharge augmente en présence du complexe, alors que, dans le même temps, les probiotiques (Bifidobacterium longum) sans la protection du complexe sont quasiment tous tués.
Ainsi, le passage au niveau de l'estomac s'inscrit comme un facteur favorable à la prolifération des bactéries si elles sont protégées par le complexe. Au contact de l'eau contenue dans l'estomac, la gélule gastro-résistante devient perméable, l'eau pénètre et apporte l'humidité dont les bactéries ont besoin pour être réactivées et entamer la phase de prolifération, sous réserve que les bactéries aient, comme c'est le cas avec le complexe, la réserve nutritive suffisante.
Cette étape cruciale de réactivation et prolifération au sein du complexe constitue un axe central et prépondérant dans l'activité probiotique du complexe.
2. Evaluation de la survie de ferments aux sels biliaires et aux sucs pancréatiques
L'acidité gastrique et les sécrétions bilio-pancréatiques constituent les principaux mécanismes endogènes d'inactivation des bactéries probiotiques ingérées.
Le complexe favorise le développement intra-corpus de nouvelles bactéries dès la phase stomacale, amélioré encore lors de la mise en contact avec les sucs biliaires et enzymatiques. Les dénombrements de la flore contenue dans le liquide intestinal avant passage sur l'intestin permet de déterminer l'apport du complexe dans la survie des probiotiques au contact de la bile et de sucs pancréatiques. Mieux que survivre, les probiotiques continuent et accentuent leur prolifération.
Les résultats obtenus montrent que sans complexe, il persiste 78 750 probiotiques Bifidobacterium longum au niveau du liquide intestinal. Avec le complexe contenant ces bactéries, on en dénombre 101 250 000. Ceci représente un facteur de respectivement 46, >100 000 000, 600 par rapport aux produits commerciaux testés sans le complexe (respectivement Bion, Lactibiane, Arkoprobiotics). Au-delà de les maintenir en vie, le complexe beepollen/argile permet aux bactéries lactiques de se développer dans le liquide intestinal.
Mieux encore : alors que la survie et la prolifération en milieu stomacal constitue une caractéristique essentielle et déterminante, le phénomène de résistance et de prolifération intra-corpus s'accentue lors du contact avec la bile. On constate ainsi une augmentation d'un facteur 7,79 entre la fin de la phase stomacale et le début de la phase intestinale.
Ces résultats indiquent que non seulement, les bactéries sont protégées par le complexe, mais ce dernier assure en outre leur développement.
Comme illustré à la Figure 5, il ne reste en effet que 0,05% des probiotiques initiaux après le passage gastrique et l'impact de la bile et des enzymes pancréatiques s'ils ne sont pas protégés. Au contraire, soumis aux mêmes conditions, les mêmes probiotiques présentent un gain de 1 165,63 % s'ils sont inclus dans le complexe.
Ces résultats montrent que le complexe beepollen/argile protège les bactéries lors de la digestion que ce soit vis-à-vis de l'acidité gastrique ou des sucs pancréatiques et biliaires et favorise leur développement.
3. Evaluation des probiotiques présents dans le liquide intestinal recueilli en fin d'écoulement
Il est également important d'observer la charge contenue dans le liquide intestinal qui va poursuivre son trajet le long de l'intestin et du colon.
Les résultats obtenus montrent que la biocharge contenue dans le liquide intestinal recueilli à la fin de l'écoulement est de 77 millions de ferments avec le complexe. Sans le complexe, il ne reste que 3,4 millions de bactéries dans le liquide intestinal, soit 22,65 fois moins.
Le complexe permet d'avoir respectivement 23, 424 et 636 fois plus de bactéries que les produits commerciaux (Bion, Lactibiane et Arkoprobiotics respectivement).
4. Evaluation de l'adhésion du complexe sur la muqueuse intestinale.
Un autre point déterminant de l'étude concerne l'adhésion du complexe et des bactéries sur la muqueuse intestinale. Pour avoir une action bénéfique sur la muqueuse, les probiotiques doivent y adhérer.
4. 1. Evaluation macroscopique
Des clichés ont été pris avant et après la phase intestinale de l'étude, c'est-à-dire avant et après l'écoulement du liquide intestinal qui contient le complexe avec les Bifidobactérium longum. On remarque une différence très significative entre la muqueuse avant et après écoulement. En effet, un tapis orangé est visible sur toute la surface de l'intestin ayant été en contact avec le liquide intestinal. Les photos montrent sans ambiguïté une présence jaune caractéristique de pollen, cette fois libéré de son "manteau" d'argile.
Ce constat visuel semble confirmer:
- la présence du complexe sur la paroi intestinale malgré l'écoulement et l'effort mécanique associé,
- la capacité du complexe à se séparer in situ. L'observation au microscope de l'intestin permet de visualiser avec précision la présence isolée d'argile et de pollen (entouré ou non de son « manteau » d'argile).
Un plus fort grossissement permet de visualiser dans le mucus des grains de pollen avec leur "manteau" d'argile, mais aussi et surtout des grains de pollen débarrassés de cette structure argileuse, faisant la démonstration de la capacité des grains de pollen à se libérer de leur gangue argileuse. Les grains non encore libérés à ce stade vont pouvoir le faire tout le long du parcours intestinal.
Ces observations indiquent que les attaches entre le pollen et l'argile peuvent se rompre au niveau intestinal et libérer les ferments et le contenu du pollen. Comme certains grains de pollen sont encore recouverts d'argile, ils peuvent continuer leur trajet dans l'intestin et se dissocier progressivement le long du tube digestif.
4.2. Evaluation microbiologique
En raison de l'hétérogénéité d'un intestin de porc, les données microbiologiques sont analysées avec la moyenne des dénombrements des 3 segments rapportés à la surface de l'intestin étudié.
A la fin de l'écoulement du liquide intestinal sur l'intestin (fin de la digestion), la biocharge contenue dans le mucus intestinal prélevé par raclage de la muqueuse est de 582 650 UFC/g avec les bactéries lyophilisées (Bifidobacterium longum) contre 5 160 000 dès lors que ces dernières sont incluses dans le complexe. On retrouve donc 9 fois plus de bactéries au niveau de la muqueuse intestinale lorsque le complexe beepollen/argile est utilisé comme vecteur. Le complexe permet d'avoir respectivement 69, 301 et 818 fois plus de bactéries au niveau de la muqueuse intestinale que les produits commerciaux (Lactibiane, Bion et Arkoprobiotics respectivement).
Dans le liquide récolté après passage sur l'intestin, le rapport entre les bactéries présentes dans le complexe et les bactéries sans complexe était de plus de 22 fois. Cette différence entre ces deux rapports s'explique par le fait que la très importante biocharge du liquide intestinal lors de l'utilisation du complexe comme support des probiotiques a saturé en microferments la muqueuse intestinale.
En outre, ceci permet aux bactéries contenues dans le liquide intestinal (et qui vont continuer à se multiplier par la suite du trajet intestinal) de coloniser les parties suivantes du tube digestif. Le complexe beepollen/argile constitue donc un bon facteur favorisant l'adhésion des probiotiques à la muqueuse intestinale.
4.3. Evaluation des empreintes
La flore lactique présente une meilleure adhérence lorsqu'elle est associée au complexe. On observe également une action périphérique sur la flore totale. Outre l'intérêt du complexe pour la flore lactique, il semble agir sur la maîtrise de la flore totale, cette dernière étant significativement moins importante en présence du complexe. Le développement de la flore totale est totalement différent sur les empreintes des segments d'intestins avec ou sans complexe. Les Bifidobacterium longum seuls génèrent des empreintes avec un développement de la flore totale très important (indénombrable sur l'empreinte). En revanche, avec le complexe associé avec les Bifidobacterium longum, très peu de colonies (entre 10 et 20) se développent. A l'opposé, on observe un important développement de la flore lactique. Ceci signifie que la flore que l'on souhaite implanter (les probiotiques) vient bien en compétition avec la flore totale au niveau de la muqueuse digestive où elle s'implante au détriment de cette dernière : c'est précisément ce qui est souhaité lors d'utilisation de probiotiques. Les conclusions globales des résultats mentionnés aux paragraphes 2 à 4 de cette partie sont donc les suivantes :
- le complexe permet une survie des probiotiques aux attaques des sucs biliaires et pancréatiques ;
- mieux, il permet une très importante multiplication de ces probiotiques, ceux-ci étant adaptés à ce milieu ;
- le complexe permet une adhésion de ces probiotiques à la muqueuse intestinale ;
- le pollen peut progressivement se détacher du complexe pour libérer les bactéries ;
- la très grande quantité de la flore apportée et sa grande viabilité lui permettent de s'implanter dans la flore locale.
5. Evaluation de la synergie des ingrédients du complexe beepollen/argile
Parmi les échantillons utilisés dans cette étude, l'un comportait l'argile seule et un autre le pollen seul. Il est donc possible de juger de l'intérêt du complexe en comparant l'effet attendu en calculant avec une pondération l'effet des constituants pris isolément et les résultats obtenus par l'étude : on constate l'effet synergique du complexe. ESTOMAC CHYME MUQUEUSE LIQUIDE INTESTINAL
% UFC/g % UFC/g % UFC/g % UFC/g
Bifidobacterium
0,00 % 0 0,08 % 78 750 1 1 ,29 % 582 650 4,00 % 3 080 000 longum (BL)
Argile 0,00 % 0 0,03 % 30 375 3,38 % 174 580 0,14 % 108 900
Pollen 0,00 % 0 0,00 % 0 2,29 % 1 18 250 0,08 % 57 750
Complexe +BL
0,00 % 0 0,11 % 109 125 16,97 % 875 480 4,22 % 3 246 650 (total estimé)
Complexe +BL
100 % 13 000 000 100 % 101 250 000 100 % 5 160 000 100 % 77 000 000 (résultats)
Effet synergique 92 600 % x 927,8 + 489 % x 5,9 + 2 271 % x 23,7
On peut donc visualiser ainsi l'effet synergique à tous les stades du complexe :
L'effet synergique du beepollen et de l'argile sur les gains de ferments dans l'estomac, chyme, muqueuse et liquide intestinal est illustré à la Figure 6.
Le complexe permet d'augmenter le nombre de bactéries lactiques de 92 683 % dans le chyme, de 489 % au niveau de la muqueuse intestinale et de 2271 % dans le liquide intestinal, par rapport aux valeurs estimées.
Ces résultats ex-vivo obtenus sur des intestins de porc ont permis d'évaluer la résistance des probiotiques à l'acidité gastrique, puis à l'élévation du pH au cours du transit, à la mise en contact des sels biliaires et des sucs pancréatiques et leur survie aux différents fluides intestinaux ainsi que leur adhérence à la paroi intestinale.
L'apport bénéfique du complexe beepollen/argile a été démontré sur toutes les phases de la digestion. CONCLUSIONS :
Lors de la phase stomacale, lorsqu'il est conditionné en gélules gastro-résistantes, le complexe beepollen/argile permet aux ferments qui y sont associés d'être réactivés. C'est un support de choix à la réactivation et à la prolifération de "nouvelles" bactéries lactiques.
Lors de la phase intestinale, le complexe est dans un premier temps mis en contact avec la bile et les sucs pancréatiques sans que cela n'affecte la viabilité cellulaire puisqu'au contraire, la capacité de prolifération demeure et croît.
Lors du transit intestinal, le complexe adhère facilement à la muqueuse. Les observations microscopiques montrent que les grains de pollen sont libérés de leur manteau d'argile, libérant in situ leur cytoplasme. Le dénombrement des ferments sur la muqueuse intestinale permet d'affirmer que le complexe libère bien sa biocharge au niveau intestinal tant sur la paroi intestinale que dans le flux de la lumière intestinale. L'intérêt majeur et différenciant du complexe consiste en l'action synergique de certaines caractéristiques intrinsèques des composants comme l'effet adsorbant de l'argile. L'apport nutritif du pollen est ainsi complété par sa capacité à s'opposer à l'adsorption irréversible des bactéries au niveau de l'argile. Cette augmentation de probiotiques sur la surface de la muqueuse intestinale joue également un rôle sur la flore totale dont elle réduit le développement.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Composition comprenant :
- un ou plusieurs microorganismes à visée probiotique,
ajoutés à
- un complexe à base de beepollen et d'argile.
2. Composition selon la revendication 1 telle que lesdits microorganismes sont lyophilisés.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2 telle que lesdits microorganismes sont choisis parmi les bactéries lactiques.
4. Composition selon la revendication 1 , 2 ou 3 telle que lesdits microorganismes sont choisis parmi les bactéries des genres Bifidobacterium spp et Lactobacillus spp.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant :
- de 0,1 % à 70% de microorganismes lyophilisés ; et
- de 30% à 99,9% dudit complexe,
les pourcentages s'entendant en poids.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes comprenant :
- de 3% à 30% de microorganismes lyophilisés ; et
- de 70% à 97% dudit complexe
les pourcentages s'entendant en poids.
7. Composition selon l'une quelconque des revendication précédentes telle que le dit complexe comprend :
- de 20 % à 40 % de beepollen et
- de 60 % à 80 % d'argile.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes telle qu'elle se présente sous forme d'une poudre.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes en formulation gastrorésistante.
10. Composition selon la revendication 9 formulée en gélules gastrorésistantes.
1 1 . Procédé de préparation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 comprenant :
- le mélange de beepollen et d'argile ; et
- l'ajout et le mélange de microorganismes.
12. Composition alimentaire, cosmétique, et/ou galénique comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
13. Composition alimentaire selon la revendication 12 telle qu'il s'agit d'un aliment, un aliment fonctionnel, ou un complément alimentaire.
14. Composition pharmaceutique comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
15. Utilisation d'un complexe à base de beepollen et d'argile pour améliorer la biodisponibilité et/ou l'activité de microorganismes à visée probiotique.
16. Composition pharmaceutique selon la revendication 14 pour son utilisation pour améliorer la biodisponibilité et/ou l'activité de microorganismes à visée probiotique.
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