WO2013129469A1 - 溶液の攪拌方法 - Google Patents

溶液の攪拌方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013129469A1
WO2013129469A1 PCT/JP2013/055117 JP2013055117W WO2013129469A1 WO 2013129469 A1 WO2013129469 A1 WO 2013129469A1 JP 2013055117 W JP2013055117 W JP 2013055117W WO 2013129469 A1 WO2013129469 A1 WO 2013129469A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
test substance
solution
analysis chip
recess
stirring
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/055117
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
黒田　俊彦
信正　均
Original Assignee
東レ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東レ株式会社 filed Critical 東レ株式会社
Priority to EP13755655.1A priority Critical patent/EP2821794B1/en
Priority to KR1020147018545A priority patent/KR102039369B1/ko
Priority to JP2013513887A priority patent/JP6187259B2/ja
Priority to ES13755655.1T priority patent/ES2623098T3/es
Priority to BR112014017624A priority patent/BR112014017624B8/pt
Priority to DK13755655.1T priority patent/DK2821794T3/en
Priority to CN201380011640.6A priority patent/CN104169722B/zh
Priority to US14/381,715 priority patent/US9944976B2/en
Priority to CA2861288A priority patent/CA2861288C/en
Publication of WO2013129469A1 publication Critical patent/WO2013129469A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F29/00—Mixers with rotating receptacles
    • B01F29/15—Use of centrifuges for mixing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00158—Elements containing microarrays, i.e. "biochip"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00465—Separating and mixing arrangements
    • G01N2035/00495—Centrifuges

Definitions

  • the present invention is a method for stirring a solution containing a test substance, and is applied to a substance that selectively binds to a test substance immobilized on a substrate (referred to herein as a “selective binding substance”).
  • the present invention relates to a method of stirring a solution when a solution containing a test substance is brought into contact with the reaction.
  • the analysis chip has a substrate on which a selective binding substance (nucleic acid, protein, lipid, sugar, etc.) that is a substance that selectively binds to a test substance is immobilized, and the selective binding substance on the substrate It is used for subjecting a test substance to a hybridization reaction in a normal solution and analyzing the presence / absence, state or amount of the substance contained in the test substance from the reaction result.
  • a selective binding substance nucleic acid, protein, lipid, sugar, etc.
  • microarray In which molecules such as DNA, proteins, and sugar chains are arranged at high density on a substrate for the purpose of simultaneously measuring many tens to tens of thousands of gene expressions. There is something.
  • Chain detection and quantification are possible, and for example, systematic and comprehensive gene expression analysis in animal models of various diseases and cell biology phenomena can be performed.
  • a DNA microarray (DNA chip) is used for detection / quantification of nucleic acids based on a nucleic acid / nucleic acid hybridization reaction.
  • a DNA chip for example, a DNA chip on which a large number of DNA fragments are aligned and fixed at high density is used.
  • a DNA chip hybridizes on a flat substrate a sample labeled with a gene expressed in a cell to be studied with a fluorescent dye, and binds complementary nucleic acids (DNA or RNA) to each other.
  • DNA chips are highly expected not only in gene expression analysis by detection and quantification of expressed genes but also in application fields such as detection of single nucleotide substitutions (SNPs) of genes.
  • the analysis chip is used not only for nucleic acids such as DNA but also for testing and analyzing proteins and saccharides.
  • proteins such as antibodies, antigens, and enzyme substrates are immobilized on the substrate.
  • Patent Document 1 describes a method in which an analysis chip having a concavo-convex structure is rotated, and a solution containing a test substance is stirred by moving fine particles or bubbles in the analysis chip, and the selective binding substance is fixed.
  • a method is disclosed in which a strong fluorescent signal can be obtained with a good S / N ratio even with a small amount of a test substance by moving the fine particles or bubbles so that the fine particles or bubbles do not contact the formed surface.
  • Patent Document 2 an analysis chip having a concavo-convex structure is rotated in a substantially horizontal direction, and a test substance solution is stirred using fine particles in performing a selective reaction between a test substance and a selective binding substance.
  • Patent Document 3 discloses a hybridization method and apparatus for stirring a sample solution in a container by rotating the container containing the sample solution and the fine particles and dropping the fine particles in the direction of gravity.
  • Patent Document 4 the position of the space of the solution in the chamber is changed by injecting the hybridization solution into a dedicated hybridization chamber in which the microarray is arranged, leaving a part of the space, and rotating the chamber.
  • a hybridization method in which the solution is stirred is disclosed.
  • Patent Document 5 discloses a self-revolving hybridization apparatus that stirs a sample solution by rotating itself while revolving a microarray installed on a turntable.
  • the analysis chip is rotated at a relatively low rotational speed of 3 rpm. In this case, 10 hours are required for the hybridization reaction. It was not a suitable method for rapid detection. Further, in the stirring method of the test substance solution described in Patent Document 2, since the hybridization reaction takes 16 hours, as in the method of Patent Document 1, rapid detection of the test substance can be performed. It was not an applicable method. In addition, although the method disclosed in Patent Document 3 has an effect of shortening the hybridization time, it actually requires 6 hours for the hybridization reaction, and for the analysis that requires a quick diagnosis. It was difficult to apply.
  • Patent Document 5 is a device that enables agitation of a microarray with a small amount of sample solution. However, it does not mention the time required for hybridization or shortening the time, and is it applicable to rapid diagnosis? It was unclear.
  • the present invention solves the above-described problems, and promotes the progress of a selective binding reaction (hybridization reaction) between a selective binding substance immobilized on an analysis chip and a test substance, particularly in a short time.
  • An object of the present invention is to provide means capable of analyzing the test substance.
  • the present inventors have analyzed a test substance using an analysis chip in a solution containing a test substance that can promote the reaction between the test substance and the immobilized selective binding substance.
  • a solution containing a test substance is injected into the concave portion of the analysis chip leaving a part of the concave space, and the solution is stirred by rotating and turning at a centrifugal acceleration of 1 ⁇ g or more.
  • the inventors have found that a stable selective binding reaction can be realized in a short time, and have reached the present invention.
  • the present invention includes the following (1) to (7).
  • (1) A method for stirring a solution containing a test substance injected into an analysis chip, the analysis chip having a recess into which a solution containing the test substance is injected, and having a bottom surface of the recess A selective binding substance that selectively binds to the test substance is immobilized on all or a part thereof, and the solution containing the test substance is injected while leaving a part of the space in the space of the recess of the analysis chip.
  • a method of stirring the solution, wherein the analysis chip into which the solution containing the test substance is injected is rotated by applying a centrifugal acceleration of 1 ⁇ g or more.
  • the stirring method of the test substance solution of the present invention the selective reaction between the test substance and the selective binding substance immobilized on the analysis chip is effectively promoted, and the selective binding substance and the test substance are accelerated.
  • the opportunity for material access can be significantly increased. Therefore, it becomes possible to detect or quantify the test substance contained in the test substance solution in a short time using the analysis chip.
  • the method for stirring a test substance solution of the present invention even in the case of using an analysis chip having a plurality of recesses into which a solution containing a test substance is injected, the solution in each recess is subjected to the same conditions. Since stirring can be performed, the reaction between the selective binding substance and the test substance in each recess can be performed under the same conditions, and the occurrence of variation in reaction between the recesses can be suppressed.
  • tip for analysis of this invention (A) An example of the chip
  • tip for analysis which shows the one aspect
  • the analysis chip is a solution containing a test substance (hereinafter sometimes referred to as a “test substance solution”) injected into the chip to determine whether the test substance exists or not, and the test substance.
  • a test substance solution a solution containing a test substance (hereinafter sometimes referred to as a “test substance solution”) injected into the chip to determine whether the test substance exists or not, and the test substance.
  • This refers to a chip used for measuring the amount of the substance, the property of the test substance, and the like.
  • a biochip that measures the amount and presence of a test substance by a reaction between the test substance and a selective binding substance immobilized on the surface of the carrier can be mentioned.
  • a DNA chip having a nucleic acid immobilized on the carrier surface a protein chip having a protein typified by an antibody immobilized on the carrier surface, a sugar chain chip having a sugar chain immobilized on the carrier surface, and a cell carrier Examples thereof include a cell chip immobilized on the surface.
  • a recess into which a solution containing a test substance is injected is formed.
  • the recess forms a space composed of a wall surface and a bottom surface, and the selective binding substance is immobilized on all or part of the surface of the bottom surface of the recess.
  • FIG. 1 illustrates an analysis chip including a flat substrate 1 (for example, a slide glass) and a plate material 2 having a through hole.
  • plate material 2 which has a through-hole are joined, and the recessed part 6 (or space of a recessed part) comprised by the wall surface 3 of a recessed part and the wall surface 4 of a recessed part is formed.
  • (A) is an example when there is one recess 6,
  • (b) is an example when there are a plurality of recesses 6, and (c) shows a cross section of each recess.
  • the selective binding substance is fixed to a part of the surface (upper surface) of the substrate 1.
  • the fixed surface is bonded to the bottom surface 3 of the recess 6 by bonding the substrate 1 and the plate material 2. It becomes the immobilization surface 5 of the selective binding substance in the part.
  • the material of the flat plate substrate and the plate material is there is no particular limitation, and for example, inorganic materials such as glass, ceramic, and silicon, and polymer materials such as polyethylene terephthalate, cellulose acetate, polycarbonate, polystyrene, polymethyl methacrylate, and silicone rubber can be suitably used.
  • the joining method of the flat substrate and the plate material is not particularly limited, and may be bonded in a state where it can be substantially not attached or detached using an adhesive, or in a state where it can be attached or detached via an adhesive layer such as a double-sided tape or a resin composition. It may be glued.
  • the number of recesses per analysis chip can be set according to the purpose of analysis, and may be one or more.
  • FIG. 2 and 3 illustrate an analysis chip in which the recess 6 is formed in the substrate 1 by, for example, injection molding without using the plate having the through hole illustrated in FIG.
  • the recess 6 formed in the substrate 1 has a space constituted by a bottom surface 3 and a wall surface 4, and a part of the bottom surface 3 of the recess serves as an immobilizing surface 5 for a selective binding substance.
  • (A) is an example when there is one recess
  • (b) is an example when there are a plurality of recesses
  • (c) shows an example of a cross section of the recess.
  • the number of recesses per one analysis chip can be selected arbitrarily according to the purpose of analysis.
  • the material of the substrate may be the same as the substrate in the analysis chip illustrated in FIG.
  • the depth of the concave portion of the analysis chip used in the solution stirring method of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 10 mm, and more preferably 0.5 to 5 mm.
  • FIG. 2 shows an example of an analysis chip in which the depth of the recess 6 is shallow
  • FIG. 3 shows an example of an analysis chip in which the depth of the recess 6 is deep.
  • the analysis chip illustrated in FIG. 4 is an example of an analysis chip in which a cover 7 that covers the entire recess 6 is attached to the analysis chip and the test substance solution is sealed in the recess 6.
  • a flat cover 7 is attached to the analysis chip shown in FIG. (A) is an example when there is one recess, (b) is an example when there are a plurality of recesses, and (c) shows a cross section of the recess.
  • the cover 7 is provided with an injection hole 8 for injecting a test substance solution into the recess.
  • a sealing material such as a flat plate made of resin, rubber, glass, or an adhesive tape can be used.
  • the cover By providing the cover with an injection hole for injecting the test substance solution into the recess, the cover can be mounted after the test substance solution is injected into the recess. In this case, it is preferable that there are a plurality of injection holes, for example, 2 to 4 injection holes can be provided per recess.
  • the cover when the cover is attached after the injection of the test substance solution, the cover may or may not be provided with an injection hole.
  • the opening portion is sealed with an adhesive tape and the shape of the opening portion is adjusted.
  • a method of closely sealing a plate material to which an O-ring is fixed, a method of sealing an open portion with a clay-like substance, and the like can be suitably used.
  • the recess of the analysis chip When it is necessary to prevent evaporation of the test substance solution or keep the reaction temperature strictly constant during the hybridization reaction, it is preferable to seal the recess of the analysis chip. It is preferable to use the chip with a cover.
  • the shape of the bottom surface of the recess of the analysis chip used in the solution stirring method of the present invention is the space (or bubbles) left in the recess that is not filled with the test substance solution when the analysis chip is rotated. It is preferable that the shape is easy to move.
  • the shape of the bottom surface of the concave portion is a polygon, the corner is rounded (for example, (b) in FIG. 5) is also the space (or bubbles) left in the concave portion not filled with the test solution. ) Is preferable because it is easy to move.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view of the vicinity of the analysis chip recess, showing one mode when a solution containing a test substance is injected into the analysis chip equipped with a cover.
  • a state in which a solution containing a test substance is injected into the space 6 of the recess of the analysis chip to form a space (or bubble) 9 not filled with the solution, and the cover 7 is attached is shown.
  • the test substance solution can be agitated and the hybridization reaction can be performed.
  • the selective binding substance in the present invention means various substances that can selectively bind to a test substance directly or indirectly.
  • Representative examples of the selective binding substance that can bind to the surface of the carrier include nucleic acids, proteins, peptides, saccharides, and lipids.
  • nucleic acid examples include DNA and RNA, and may be PNA or LNA.
  • DNA examples include, but are not limited to, chromosomal DNA, viral DNA, bacteria and mold DNA, cDNA obtained by reverse transcription of RNA, and fragments that are a part of them. Further, as RNA, messenger RNA, ribosomal RNA, small RNA, micro RNA, a fragment that is a part thereof, and the like can be used, but are not limited thereto. Also included are chemically synthesized DNA or RNA.
  • a single-stranded nucleic acid having a specific base sequence selectively hybridizes and binds to a single-stranded nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence or a part thereof. Applicable to substances.
  • the nucleic acid may be derived from natural products such as living cells, or may be synthesized by a nucleic acid synthesizer.
  • Preparation of DNA or RNA from living cells can be carried out by known methods, for example, DNA extraction by the method of Blin et al. (Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)), etc. About extraction, it can carry out by the method of Favaroro et al. (Favaroro et al., Methods Enzymol. 65: 718 (1980)).
  • nucleic acid to be immobilized examples include linear or circular plasmid DNA or chromosomal DNA, DNA fragments obtained by cutting or chemically cutting them with restriction enzymes, DNA synthesized by enzymes in a test tube, or chemically synthesized oligonucleotides Etc. can also be used.
  • Examples of the protein include antibody and antigen-binding fragments of antibodies such as Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments, and various antigens. Since an antibody or an antigen-binding fragment thereof selectively binds with a corresponding antigen, and the antigen selectively binds with a corresponding antibody, it corresponds to a “selective binding substance”.
  • sugars include sugar chains such as various monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides.
  • the lipid may be a simple lipid or a complex lipid.
  • antigenic substances other than the nucleic acids, proteins, saccharides, and lipids can be immobilized. Moreover, you may fix a cell on the surface of a support
  • DNA, RNA, protein, peptide, sugar, sugar chain, and lipid are particularly preferable.
  • test substance used in the present invention examples include nucleic acids to be measured (target nucleic acids), for example, genes such as pathogenic bacteria and viruses, causative genes of genetic diseases, and parts thereof, various biological components having antigenicity, pathogenic bacteria, Examples include antibodies against viruses and the like, but are not limited thereto.
  • target nucleic acids for example, genes such as pathogenic bacteria and viruses, causative genes of genetic diseases, and parts thereof, various biological components having antigenicity, pathogenic bacteria, Examples include antibodies against viruses and the like, but are not limited thereto.
  • the viscosity of the solution containing the test substance is particularly limited as long as the space in the recess of the analysis chip not filled with the test substance solution can be moved when the analysis chip is rotated by applying centrifugal acceleration. Not.
  • the nucleic acid used as the test substance may be labeled with nucleic acid extracted from blood or cells by a conventional method, or may be amplified by a nucleic acid amplification method such as PCR using the nucleic acid as a template. In the latter case, the measurement sensitivity after performing the stirring method of the present invention can be greatly improved.
  • a nucleic acid amplification product is used as a test substance, the amplified nucleic acid can be labeled by performing amplification in the presence of a nucleoside triphosphate labeled with a fluorescent substance or the like.
  • test substance antigen or antibody When the test substance is an antigen or antibody, the test substance antigen or antibody may be directly labeled by a conventional method, or the test substance antigen or antibody may be bound to a selective binding substance. Thereafter, the carrier is washed, and a labeled antibody or antigen that reacts with the antigen or antibody with an antigen-antibody is reacted, and the label bound to the carrier can be measured.
  • test substance labeled with a fluorescent substance by removing the phosphate group at the 5 ′ end of the nucleic acid by alkaline phosphatase is reacted with a selective binding substance
  • a method of measuring the bound label, or a method of measuring the label of the detection probe by capturing a test substance with a selective binding substance (capture probe) and then binding a detection probe labeled with a fluorescent substance to the test substance. (Sandwich hybridization method) is preferably used.
  • test substance solution a solution containing the test substance (test substance solution).
  • the test substance solution is injected into the recess space of the analysis chip so as to leave a part of the recess space, and the recess is filled with the test substance solution. No space is formed.
  • the space moves in the recess by the swivel rotation of the analysis chip, and the test substance solution is Can be stirred.
  • the space formed in the recess may exist as a single space in the recess, or may be divided into a plurality of spaces, that is, as a plurality of bubbles. Also good.
  • the ratio of the space that is not filled with the test substance solution in the space of the recess is preferably 10% or more, more preferably 20% or more, and the upper limit is preferably 90% or less, more preferably 80% or less. More preferably, it is 70% or less.
  • the range of the ratio of the space not filled with the test substance solution is preferably 10% or more and 90% or less, and more preferably 15% or more and 80% or less. More preferably, it is 20% or more and 70% or less. If the proportion of this space is less than 5%, the test substance solution may not move sufficiently in the space of the recess during the swiveling rotation of the analysis chip, and the test substance solution may not be substantially stirred.
  • the proportion of the space not filled with the test substance solution is preferably 30% or more and 90% or less, for example. 40% or more and 80% or less is more preferable.
  • the solution is agitated by rotating the analysis chip into which the solution containing the test substance is injected.
  • the turning rotation means that the analysis chip itself rotates around the rotation axis by circular motion or elliptic motion.
  • the swivel rotation of the present invention refers to a mode of rotation that is performed so that circular motion of the same radius having each unique center of rotation is made at any point on the analysis chip.
  • FIG. 7 shows an example of the turning rotation of the present invention. For arbitrary points A and B on the analysis chip 10, the point A rotates on a circular orbit having a radius r centered on OA at a predetermined rotational speed, and the point B similarly has a radius r centered on OB.
  • a straight line AB connecting arbitrary points A and B on the analysis chip 10 is always parallel in an arbitrary orbit of circular motion.
  • the straight lines AB are parallel.
  • the distance (r a , r b ) is different. That is, the rotation mode including revolution is a rotation mode in which the rotation radius of the circular motion varies depending on the position on the analysis chip.
  • the analysis chip When rotating the analysis chip, the analysis chip is preferably installed so that the surface on which the selective binding substance is immobilized is parallel or substantially parallel to the rotation surface.
  • the solution in each recess can be stirred under the same conditions by swiveling and rotating. It is preferable because the reaction with the substance can be performed under the same conditions and the reaction variation between the recesses can be reduced.
  • the agitation is performed by the revolution method in which the analysis chip is revolved while rotating, or the revolution method in which the rotation center is outside the analysis chip, the plurality of recesses are agitated under different conditions. In addition, there may be a variation in reaction between the recesses.
  • the direction of the rotation surface when the analysis chip is rotated is not particularly limited.
  • the direction of the horizontal or substantially horizontal direction the direction inclined by 15 degrees from the horizontal direction, the direction inclined by 30 degrees from the horizontal direction, or inclined by 45 degrees from the horizontal direction.
  • a direction inclined by 60 degrees from the horizontal direction, a direction inclined by 75 degrees from the horizontal direction, a vertical or substantially vertical direction, and the like can be used.
  • a preferable direction of the rotation surface is horizontal or substantially horizontal.
  • the substantially horizontal direction means a direction close to horizontal toward the surface on which the selective binding substance of the analysis chip is immobilized, for example, a direction inclined in a range of 0 to 3 degrees with respect to the horizontal plane. Is preferred.
  • substantially vertical direction means a direction that is nearly perpendicular to the surface on which the selective binding substance of the analysis chip is immobilized, for example, a direction tilted in the range of 0 to 3 degrees with respect to the vertical surface. Is preferred.
  • the swivel rotation of the analysis chip may be performed intermittently, for example, by stopping the rotation for a certain period of time during rotation while maintaining the rotation speed constant or changing the rotation speed.
  • the direction of rotation is not particularly limited, and may be clockwise, counterclockwise, or a combination thereof.
  • the time for rotating during the reaction is not particularly limited, and can be appropriately determined within a range sufficient for the selective binding substance and the test substance to react.
  • the test substance when it is a nucleic acid, it can be set according to the time required for the hybridization reaction with the probe nucleic acid that is a selective binding substance.
  • the solution agitation method of the present invention by applying a centrifugal acceleration of 1 ⁇ g or more during swiveling rotation, the selective reaction between the test substance and the selective binding substance is effectively promoted, and the test substance is kept in a short time. It has a feature that can be detected or quantified.
  • the rotation time is short.
  • the reaction time is preferably 3 hours or more and 4 hours or less, more preferably 2 hours or less, further preferably 1 hour or less, and 0.5 hours or less. It is particularly preferred.
  • centrifugal acceleration is the amount of centrifugal force applied to an object in the form of rotational motion, expressed in the form of acceleration, and is the absolute value of the distance from the center of rotation and the square of the angular velocity of rotational motion.
  • centrifugal acceleration in the present invention refers to centrifugal force, that is, relative centrifugal acceleration (RCF), and is calculated by the following formula 1.
  • RCF 1118 ⁇ R ⁇ N 2 ⁇ 10 ⁇ 8 (Formula 1)
  • RCF Relative centrifugal acceleration ( ⁇ g)
  • R radius of rotation (cm)
  • N Number of rotations (rpm).
  • a centrifugal acceleration of 1 ⁇ g or more is given when the analysis chip is rotated.
  • the lower limit of the centrifugal acceleration is preferably 5 ⁇ g or more, more preferably 10 ⁇ g or more.
  • the upper limit of the centrifugal acceleration is not particularly limited, but is preferably 50 ⁇ g or less, more preferably 40 ⁇ g or less, and further preferably 30 ⁇ g or less.
  • the range of centrifugal acceleration is preferably 1 ⁇ g to 50 ⁇ g, more preferably 5 ⁇ g to 40 ⁇ g, and still more preferably 10 ⁇ g to 30 ⁇ g.
  • the target centrifugal acceleration can be given by appropriately setting the number of rotations and the rotation radius when the analysis chip is rotated. Therefore, the number of rotations and the radius of rotation can be selected according to the specifications of the stirring device for stirring the analysis chip. For example, when the rotation radius is small, a large centrifugal acceleration can be applied by increasing the rotation speed.
  • Rotational radius can be selected as appropriate to obtain a desired centrifugal acceleration in combination with the rotational speed.
  • the lower limit of the rotation radius is preferably 0.1 mm or more, more preferably 0.2 mm or more, and further preferably 0.3 mm or more.
  • the upper limit of the radius of rotation is preferably 20 mm or less, more preferably 10 mm or less, and even more preferably 5 mm or less.
  • the range of the radius of rotation is preferably 0.1 to 20 mm, more preferably 0.2 to 10 mm, and still more preferably 0.3 to 5 mm.
  • the rotational speed of the turning rotation can be appropriately selected as a value capable of obtaining a desired centrifugal acceleration in combination with the rotation radius, but is preferably 500 rpm or more and 10,000 rpm or less, more preferably 750 rpm or more and 8000 rpm or less.
  • a smaller radius of rotation is preferable because the reaction apparatus and the stirring apparatus can be miniaturized and the apparatus embodying the solution stirring method of the present invention can be made compact.
  • a stirrer having a small rotation radius is preferably used in order to prevent the injected test substance solution from spilling.
  • the rotation radius is preferably 0.1 mm or more and 5 mm or less, more preferably 0.2 mm or more and 4 mm or less, and further preferably 0.3 mm or more and 3 mm or less.
  • the stirrer for stirring the analysis chip used in the present invention is not particularly limited as long as it can give a centrifugal acceleration of 1 ⁇ g or more by a combination of the rotational speed of rotation and the rotation radius.
  • a plate shaker can be suitably used.
  • the device is preferably a device that can control the rotational speed, driving time, and the like of the swivel rotation from the outside.
  • a stirring bar may be added to the space inside the recess.
  • the stirrer include fine particles (beads) and microrods, and fine particles are particularly preferable.
  • the shape of the microparticles and the microrod is not particularly limited as long as it can move in the recess of the analysis chip and can stir the solution containing the test substance.
  • a polygonal shape may be used in addition to a spherical shape, and in the case of a microrod, the shape may be any shape such as a cylindrical shape or a prismatic shape, but a spherical shape is preferable.
  • the size of the fine particles is not particularly limited.
  • the diameter can be in the range of 0.1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, and the range of 50 ⁇ m to 500 ⁇ m in diameter is more preferable in view of stirring efficiency.
  • the length is preferably 50 ⁇ m or more and 5000 ⁇ m or less, and the bottom diameter can be 10 ⁇ m or more and 300 ⁇ m or less.
  • One kind of fine particles and microrods can be selected and used in view of stirring efficiency, and two or more kinds can be used in combination.
  • the material of the fine particles and the microrod is not particularly limited, and glass, ceramic (for example, yttrium partially stabilized zirconia), metal (for example, gold, platinum, stainless steel), plastic (for example, nylon or polystyrene) and the like can be used.
  • ceramic for example, yttrium partially stabilized zirconia
  • metal for example, gold, platinum, stainless steel
  • plastic for example, nylon or polystyrene
  • the analysis chip used in the present invention may have a convex portion for immobilizing the selective binding substance on the upper surface of the concave portion.
  • the detection noise can be greatly increased by focusing the scanner on the top of the convex part on which the selective binding substance is immobilized.
  • the S / N ratio can be increased.
  • the analysis chip used in the present invention is preferably manufactured from a material that can reduce autofluorescence. For example, at least a part of the convex part on which the selective binding substance is immobilized is black. preferable.
  • an S / N ratio (signal-to-noise ratio) can be used as an index indicating the sensitivity of signal detection.
  • it is preferable to determine the sensitivity using S / N 2 as a detection limit.
  • the concentration or amount of a test substance with an S / N ratio of 2 to 3 is adopted as the detection limit. If the S / N is 2 or more, the detection is more reliable than the detection limit. Judgment can be made.
  • the solution stirring method of the present invention can accelerate the progress of the selective reaction between the selective binding substance immobilized on the analysis chip and the test substance, so that the test substance can be detected in a short time. Or it can be quantified.
  • the reaction time which conventionally required a reaction time of 6 to 20 hours can be greatly shortened. Therefore, for example, when analysis is performed using an analysis chip in a test / diagnosis region where a rapid analysis of a large number of samples is required, it is preferable to apply the solution stirring method of the present invention.
  • the present invention is preferably applied from the viewpoint of cost reduction.
  • Reference example 1 Production of analysis chip substrate Polymethylmethacrylate having a shape as described later is produced by injection molding using a known method of LIGA (Lithographie Galvanforming Abform) process. A substrate made of (PMMA) was obtained. The average molecular weight of PMMA used was 50,000, and carbon black (# 3050B manufactured by Mitsubishi Chemical) was contained in PMMA at a ratio of 1% by weight to make the substrate black.
  • LIGA Lithographie Galvanforming Abform
  • the spectral reflectance was 5% or less at any wavelength in the visible light region (wavelength 400 nm to 800 nm), and in the same range of wavelengths, The transmittance was 0.5% or less.
  • Neither spectral reflectance nor spectral transmittance had a specific spectral pattern (such as a peak) in the visible light region, and the spectrum was uniformly flat.
  • the spectral reflectance is the spectral reflectance when specularly reflected light from the substrate is captured using an apparatus (manufactured by Minolta Camera, CM-2002) equipped with an illumination / light receiving optical system that conforms to condition C of JIS Z 8722. The reflectance was measured.
  • the outer shape is 76 mm in length, 26 mm in width, and 1 mm in thickness.
  • the substrate is provided with a recess having a length of 6.48 mm, a width of 6.90 mm, and a depth of 0.12 mm.
  • a substrate (hereinafter referred to as “substrate A”) provided with 576 convex portions having a height of 0.12 mm was used.
  • the difference in height between the upper surface of the convex portion and the upper surface of the flat portion was 3 ⁇ m or less.
  • the variation in the height of the upper surface of the convex portion was 3 ⁇ m or less.
  • the pitch of the convex portions was set to 0.18 mm.
  • the substrate A was immersed in a 10N aqueous sodium hydroxide solution at 70 ° C. for 12 hours. This was washed in the order of pure water, 0.1N HCl aqueous solution, and pure water to generate carboxyl groups on the substrate surface.
  • Oligonucleotides were immobilized on the substrate A as selective binding substances (probe DNAs) under the following conditions.
  • oligonucleotides corresponding to the four types of genes a to d oligonucleotides represented by the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 4 (Operon DNA microarray oligonucleotide set “Homosapiens (Human) AROS V4.0 (60 bases each) ) ") was used. Each oligonucleotide was dissolved in pure water to a concentration of 0.3 nmol / ⁇ L to obtain a stock solution.
  • PBS 8 g NaCl, 2.9 g Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.2 g KCl, and 0.2 g KH 2 PO 4 was added.
  • it is dissolved in pure water, diluted to 1 L, adjusted to pH 5.5 by adding hydrochloric acid, and diluted 10-fold to make the final concentration of probe DNA 0.03 nmol / ⁇ L, and PMMA 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) was added to condense the carboxyl group generated on the substrate surface and the terminal amino group of the probe DNA, and the final concentration was 50 mg / mL. did.
  • the cover member was affixed to the analysis chip 1 and the analysis chip 2 on which the selective binding substance was immobilized as follows.
  • the cover member was produced by cutting a PMMA flat plate.
  • the produced cover member was provided with a through hole and a liquid level holding chamber.
  • a double-sided tape was used as an adhesive member, and the cover member was laminated with a thickness of 50 ⁇ m and attached, and then the cover member was attached to the analysis chip 1 and the analysis chip 2.
  • test substance was prepared using aRNA (antisense RNA), which is a common microarray test substance.
  • CyRNA GE Healthcare
  • CyRNA was prepared using 5 ⁇ g of commercially available human RNA-derived total RNA (“Human Reference RNA” manufactured by CLONTECH) using an aRNA preparation kit “MessageAmp II aRNA Amplification Kit” manufactured by Ambion. Cy5-labeled aRNA was obtained by fluorescent labeling.
  • Reaction solution for hybridization of selective binding substance and test substance Unless otherwise specified in the following Examples and Comparative Examples, the labeled aRNA prepared above was 1% by weight BSA, 5 ⁇ SSC. , 0.01 wt% salmon sperm DNA, 0.1 wt% SDS diluted with a hybridization solution (each concentration is the final concentration) was used.
  • Example 1 A test substance solution was prepared by mixing the hybridization solution with a solution containing 100 ng of Cy5-labeled aRNA described in Reference Example 1 to 25 ⁇ L. 10 ⁇ L of the test substance solution was injected into the analysis chip 1. The volume of the space not filled with the test substance solution in the recess was about 3 ⁇ L, and the proportion of the space not filled with the test substance solution in the recess was about 23%.
  • Six sets of the above analysis chips 1 were prepared.
  • the stirrer “BioShake 5000” Q Instruments; maximum rotation speed 5000 rpm, rotation radius 0.6 mm
  • each chip for analysis was stirred and reacted at 5000 rpm for 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, and 16 h, respectively.
  • the centrifugal acceleration applied to each analysis chip was about 17.7 ⁇ g.
  • the signal intensity (fluorescence intensity) of the hybridized labeled aRNA was measured using a high-resolution fluorescence detection apparatus (Toray Industries, Inc .; “3D-Gene (registered trademark) Scanner”). The results are shown in FIGS. 9 and 10 and Table 1. A signal exceeding the threshold (average of blank spots + 2SD) was detected at 0.5 h after the start of the reaction, indicating that the reaction proceeded quickly.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the test substance solution was injected into the analysis chip 1 (6 sets). It set to the stirring apparatus "BioShake 5000" installed in the oven temperature-controlled at 37 degreeC, and it stirred for 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, and 16 h at 3000 rpm, respectively, and was made to react. At this time, the centrifugal acceleration given to each analysis chip was about 6.04 ⁇ g. For each analysis chip, the signal intensity (fluorescence intensity) of the hybridized labeled aRNA was measured using a high-resolution fluorescence detector. The results are shown in FIGS. 9 and 10 and Table 1. A signal above the threshold was detected 0.5 h after the start of the reaction, indicating that the reaction proceeded quickly.
  • Example 3 In the same manner as in Example 1, the test substance solution was injected into the analysis chip 1 (6 sets). Set in a stirrer “MS3 Digital” (IKA; maximum rotation speed 3000 rpm, rotation radius 2.25 mm) installed in an oven temperature-controlled at 37 ° C., and set at 3000 rpm for 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, and 8 h, respectively. , Stirred for 16 h to react. At this time, the centrifugal acceleration given to each analysis chip was about 22.6 ⁇ g. For each analysis chip, the signal intensity (fluorescence intensity) of the hybridized labeled aRNA was measured using a high-resolution fluorescence detector. The results are shown in FIGS. 9 and 10 and Table 1. A signal above the threshold was detected 0.5 h after the start of the reaction, indicating that the reaction proceeded quickly.
  • MS3 Digital IKA; maximum rotation speed 3000 rpm, rotation radius 2.25 mm
  • Example 4 In the same manner as in Example 1, the test substance solution was injected into the analysis chip 1 (6 sets). It set to the stirring apparatus "MS3 digital" installed in the oven temperature-controlled at 37 degreeC, and it stirred for 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, and 16 h at 1000 rpm, respectively, and was made to react. At this time, the centrifugal acceleration applied to each analysis chip was about 2.52 ⁇ g. For each analysis chip, the signal intensity (fluorescence intensity) of the hybridized labeled aRNA was measured using a high-resolution fluorescence detector. The results are shown in FIGS. 9 and 10 and Table 1. A signal above the threshold was detected 0.5 h after the start of the reaction, indicating that the reaction proceeded quickly.
  • Example 1 In the same manner as in Example 1, the test substance solution was injected into the analysis chip 1 (6 sets). It set in the stirring apparatus "BioShake 5000" installed in the oven temperature-controlled at 37 degreeC, and it was made to react by stirring at 1000 rpm for 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, and 16 h, respectively. At this time, the centrifugal acceleration applied to the analysis chip was about 0.671 ⁇ g. For each analysis chip, the signal intensity (fluorescence intensity) of the hybridized labeled aRNA was measured using a high-resolution fluorescence detector. The results are shown in FIGS. 9 and 10 and Table 1. No signal above the threshold was detected 0.5 h after the start of the reaction. A signal that was equal to or greater than the threshold was detected after 1 h from the start of the reaction.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the test substance solution was injected into the analysis chip 1 (6 sets). It set in the stirring apparatus "BioShake 5000" installed in the oven temperature-controlled at 37 degreeC, and it was made to react by stirring 0.5h, 1h, 2h, 4h, 8h, and 16h at 250 rpm, respectively. At this time, the centrifugal acceleration given to each analysis chip was about 0.042 ⁇ g. For each analysis chip, the signal intensity (fluorescence intensity) of the hybridized labeled aRNA was measured using a high-resolution fluorescence detector. The results are shown in FIGS. 9 and 10 and Table 1. No signal above the threshold was detected 0.5 h after the start of the reaction. A signal that was equal to or greater than the threshold was detected after 1 h from the start of the reaction.
  • Example 3 In the same manner as in Example 1, the test substance solution was injected into the analysis chip 1 (6 sets). It set in the stirring apparatus "MS3 digital" installed in the oven temperature-controlled at 37 degreeC, and it was made to react by stirring 0.5h, 1h, 2h, 4h, 8h, and 16h at 250 rpm, respectively. At this time, the centrifugal acceleration applied to the analysis chip was about 0.157 ⁇ g. For each analysis chip, the signal intensity (fluorescence intensity) of the hybridized labeled aRNA was measured using a high-resolution fluorescence detector. The results are shown in FIGS. 9 and 10 and Table 1. No signal above the threshold was detected 0.5 h after the start of the reaction. A signal that was equal to or greater than the threshold was detected after 1 h from the start of the reaction.
  • Example 5 The hybridization solution was mixed with the solution containing 60 ng of Cy5-labeled aRNA described in Reference Example 1 to make 10 ⁇ L, and 6.7 ⁇ L was injected into the analysis chip 2 (2 sets).
  • the amount of Cy5-labeled aRNA injected was 40 ng, which was the same as in Examples 1 to 4.
  • the volume of the space not filled with the test substance solution in the recess was about 6.3 ⁇ L, and the proportion of the space not filled with the test substance solution in the entire recess was about 48%.
  • the signal intensity (fluorescence intensity) of the labeled aRNA hybridized to the three genes b to d was measured using a high-resolution fluorescence detection apparatus. The results are shown in Table 2. In the reaction time of 1 hour, the signal intensity of all the genes exceeded the threshold value and was effective.
  • Example 6 The hybridization solution was mixed with the solution containing 60 ng of Cy5-labeled aRNA described in Reference Example 1 to make 15 ⁇ L, and 10 ⁇ L was injected into the analysis chip 2 (2 sets).
  • the amount of Cy5-labeled aRNA injected was 40 ng, which was the same as in Examples 1 to 4.
  • the volume of the space not filled with the test substance solution in the recess was about 6.3 ⁇ L, and the proportion of the space not filled with the test substance solution in the entire recess was about 23%.
  • the signal intensity (fluorescence intensity) of the labeled aRNA hybridized to the three genes b to d was measured using a high-resolution fluorescence detection apparatus. The results are shown in Table 2. In the reaction time of 1 hour, the signal intensity of all the genes exceeded the threshold value and was effective.
  • Comparative Example 4 The hybridization solution was mixed with the solution containing 60 ng of Cy5-labeled aRNA described in Reference Example 1 to make 20 ⁇ L, and 13 ⁇ L was injected into the analysis chip 2 (2 sets) to fill the recess (with the test substance solution occupying the entire recess). The percentage of unfilled space is 0%). In the same manner as in Example 1, it was set in a stirring device “BioShake 5000” and reacted at 5000 rpm for 1 hour. For each analysis chip, the signal intensity of the labeled aRNA hybridized to the three genes b to d was measured using a high-resolution fluorescence detection apparatus. The results are shown in Table 2. Although the signal intensity of gene b exceeded the threshold value and was effective at a reaction time of 1 hour, the signal intensity was weaker than in Examples 5 and 6. Moreover, the signal intensity of the genes c and d was lower than the threshold value and was invalid.
  • Reference example 2 (1) Production of Analysis Chip Substrate A substrate of the same material as in Reference Example 1 having an outer shape of 76 mm in length, 26 mm in width, and 2.5 mm in thickness was produced by injection molding.
  • the substrate is provided with four oval concave portions having a long side of 4.8 mm, a short side of 2.40 mm, and a depth of 1.5 mm, and a convex portion having a diameter of 0.1 mm and a height of 0.12 mm is provided in each concave portion.
  • a substrate provided with 98 locations hereinafter referred to as “substrate B”) was used. In the substrate B, the volume of the recess was about 13.5 ⁇ L.
  • the difference in height between the upper surface of the convex portion and the upper surface of the flat portion and the variation in the height of the upper surface of the convex portion were both 3 ⁇ m or less. Further, the pitch of the convex portions was set to 0.18 mm.
  • test substance As a test substance, a recombinant plasmid (pHPV16 (16,600 base pairs in total length)) cloned from human papillomavirus genomic DNA purchased from the Human Science Research Resource Bank is fragmented by ultrasound. Processed. In 1 ⁇ hybridization solution (1 wt% bovine serum albumin (BSA), 5 ⁇ SSC, 1 wt% sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 ng / mL salmon sperm DNA solution, 5 wt% sodium dextran sulfate, 30% formamide) The sample was diluted to a nucleic acid concentration of 0.1 amol / ⁇ L to obtain a sample DNA solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • SDS 1 wt% sodium dodecyl sulfate
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the sample was diluted to a nucleic acid concentration of 0.1 amol / ⁇ L to obtain
  • MY11 SEQ ID NO: 6; 5 ′ end side 50 based on the base position of the 5 ′ end when the test substance is bound to the capture probe
  • GP5 SEQ ID NO: 7; similar to MY11, complementary sequence to the 10th to 34th nucleotide sequence on the 5 ′ end side
  • GP6 SEQ ID NO: 8; test
  • the complementary sequence to the 60th to 82nd base sequence on the 3 ′ end side, and MY09 SEQ ID NO: 9; similar to GP6, 3
  • the 3′-end and 5′-end biotin-labeled ones were synthesized. These were diluted with sterilized water to a concentration
  • Example 7 To 1 ⁇ L of the sample DNA solution described in Reference Example 2, 1 ⁇ L of the detection probe solution described in Reference Example 2 was added and mixed, and heated with a thermal cycler at 95 ° C. for 5 minutes. After leaving it to return to room temperature, 8 ⁇ L of the 1 ⁇ hybridization solution described in Reference Example 2 was added and mixed to obtain a hybridization solution containing a test substance. The entire amount was injected into one portion of the concave portion of the analysis chip 3, and the opening was sealed with a PET film coated with an acrylic adhesive. At this time, the volume of the space not filled with the solution in the recess was about 3.5 ⁇ L, and the proportion of the space not filled with the solution in the recess was about 26%. The test substance was detected by sandwich hybridization.
  • the sample was set in a stirrer “BioShake 5000” (Q Instruments) installed in an oven adjusted to 32 ° C., and stirred at 3000 rpm for 2 h to cause a hybridization reaction between the capture probe and the test substance.
  • the centrifugal acceleration given to each analysis chip was about 6.04 ⁇ g.
  • the seal covering the opening was peeled off, and the plate was washed with a washing solution A (0.5 ⁇ SSC, 1 wt% SDS) heated to 30 ° C. for 5 minutes.
  • streptavidin phycoerythrin solution prepared by mixing a staining reagent (streptavidin phycoerythrin) with a diluent (100 mM MES, 1 M NaCl, 0.05 wt% Tween 20, 2 mg / mL BSA) was dropped into the recess and incubated at 35 ° C. for 5 minutes in the dark. Washing was performed for 5 minutes with washing liquid B (6 ⁇ SSPE, 0.01 wt% Tween 20) heated to 30 ° C., and dried.
  • staining reagent streptavidin phycoerythrin
  • a diluent 100 mM MES, 1 M NaCl, 0.05 wt% Tween 20, 2 mg / mL BSA
  • the signal intensity was measured using a high-resolution fluorescence detection apparatus (Toray Industries, Inc .; “3D-Gene (registered trademark) Scanner”).
  • Table 3 shows the result of calculating the signal / noise ratio (S / N ratio) by reading the numerical values of the convex portion (signal) on which the selective binding substance is immobilized and the convex portion (noise) on which the selective binding substance is not immobilized.
  • Example 9 The same operation as in Example 7 was performed, except that “Mix-EVR” (Tytec Corp .; maximum rotation speed 2500 rpm, rotation radius 1 mm) was used as the stirring apparatus, and the rotation speed of the stirring apparatus during the hybridization reaction was 2000 rpm. It was. At this time, the centrifugal acceleration was 4.47 ⁇ g.
  • Example 10 The same operation as in Example 9 was performed except that the number of rotations of the stirring device during the hybridization reaction was 2500 rpm. At this time, the centrifugal acceleration was 6.99 ⁇ g.
  • Example 11 The same operation as in Example 7 was performed except that “MS3 Digital” (IKA Co., Ltd.) was used as the stirrer, and the rotation speed of the stirrer during the hybridization reaction was 2000 rpm. At this time, the centrifugal acceleration was 10.06 ⁇ g.
  • Example 12 The same operation as in Example 10 was performed except that the number of revolutions of the stirring device during the hybridization reaction was changed to 3000 rpm. At this time, the centrifugal acceleration was 22.64 ⁇ g.
  • Example 13 The same operation as in Example 7 was performed except that the produced stirring device (maximum rotational speed 1000 rpm, rotational radius 5 mm) was used and the rotational speed of the stirring device during the hybridization reaction was 1000 rpm. At this time, the centrifugal acceleration was 5.59 ⁇ g.
  • Comparative Example 10 The same operation as in Example 7 was performed except that the produced stirring device (maximum rotational speed 1000 rpm, rotational radius 24 mm) was used and the rotational speed of the stirring device during the hybridization reaction was 100 rpm. At this time, the centrifugal acceleration was 0.27 ⁇ g.
  • Comparative Example 11 The same operation as in Example 7 was performed except that the produced stirring device (maximum rotational speed 1000 rpm, rotational radius 72 mm) was used and the rotational speed of the stirring device during the hybridization reaction was 100 rpm. At this time, the centrifugal acceleration was 0.80 ⁇ g.
  • Example 14 To 4 ⁇ L of the sample DNA solution described in Reference Example 2, 4 ⁇ L of the detection probe solution described in Reference Example 2 was added and mixed, and heated with a thermal cycler at 95 ° C. for 5 minutes. After leaving it to return to room temperature, 32 ⁇ L of 1 ⁇ hybridization solution described in Reference Example 2 was added and mixed to obtain a hybridization solution containing a test substance. 10 ⁇ L of each was injected into four recesses (recesses No. # 1 to # 4) of the analysis chip 3, and the openings were sealed with a PET film coated with an acrylic adhesive.
  • the volume of the space not filled with the solution in the recess was about 3.5 ⁇ L, and the proportion of the space not filled with the solution in the recess was about 26%.
  • the test substance was detected by the sandwich hybrid method.
  • the sample was set in a stirring device “MS3 Digital” (IKA Co.) installed in an oven controlled at 32 ° C. and stirred at 2000 rpm for 2 h to cause a hybridization reaction between the capture probe and the test substance.
  • the centrifugal acceleration applied to each analysis chip was about 10.1 ⁇ g.
  • the seal covering the opening was peeled off, and the plate was washed with a washing solution A (0.5 ⁇ SSC, 1 wt% SDS) heated to 30 ° C.
  • streptavidin phycoerythrin solution prepared by mixing a staining reagent (streptavidin phycoerythrin) with a diluent (100 mM MES, 1 M NaCl, 0.05 wt% Tween 20, 2 mg / mL BSA) was dropped into the recess and incubated at 35 ° C. for 5 minutes in the dark. Washing was performed for 5 minutes with washing liquid B (6 ⁇ SSPE, 0.01 wt% Tween 20) heated to 30 ° C., and dried.
  • staining reagent streptavidin phycoerythrin
  • a diluent 100 mM MES, 1 M NaCl, 0.05 wt% Tween 20, 2 mg / mL BSA
  • the CV values of the signals of the 22 convex spots in each concave portion were all low values less than 10%, and the variation in the signals in the concave portions was small. Furthermore, it was shown that the CV value of the signals (88) of the whole four concave portions was as low as 7.5%, and the variation between the concave portions was small.
  • the CV values of the signals of the 22 convex spots in each concave portion vary around 10%, and the CV values of the signals (88 pieces) of the entire four concave portions are as high as 15.3%, It was shown that the variation between the recesses was large.
  • the solution stirring method of the present invention can significantly reduce the time required for detection or quantification of a test substance using an analysis chip such as a DNA chip. Therefore, the present invention is useful because it enables rapid diagnosis / diagnosis of a disease in a clinical site or an examination center.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　本発明は、分析用チップに固定化された選択結合性物質と被検物質との選択的な結合反応を促進させ、特に短時間での被検物質の分析が可能となる手段を提供するものである。　本発明は、分析用チップの凹部に被検物質を含む溶液を注入する際に、凹部の空間に該空間の一部を残して注入し、１×ｇ以上の遠心加速度を与えて分析用チップを旋回回転させて、被検物質溶液を攪拌する方法である。

Description

溶液の攪拌方法
　本発明は、被検物質を含む溶液の攪拌方法であって、基板上に固定化された被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）に被検物質を含む溶液を接触させて反応させる際の溶液を攪拌する方法に関する。
　分析用チップは、被検物質と選択的に結合する物質である選択結合性物質（核酸、タンパク質、脂質、糖など）が固定化された基板を有し、この基板上の選択結合性物質と被検物質を通常溶液中でハイブリダイゼーション反応させて、その反応結果から被検物質に含まれる物質の存在有無、状態又は量などを分析するために用いられる。この基板としては、一般にガラス製、金属製、樹脂製のものが用いられる。
　分析用チップの一態様として、例えば数十～数万という多数の遺伝子発現を同時に測定することを目的として、基板上にＤＮＡ、蛋白質、糖鎖などの分子を高密度に配置した、マイクロアレイと呼ばれるものがある。マイクロアレイを使用することによって、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸の検出・定量や、蛋白質／蛋白質間、糖鎖／糖鎖間又は糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖の検出・定量が可能となり、例えば各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能、すなわち遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になる。
　分析用チップのうち、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップ）は、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸の検出・定量等に用いられる。ＤＮＡチップとして、例えば、ガラス製の平面基板上に、多数のＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられている。ＤＮＡチップは、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基板上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所の蛍光を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法により、サンプル中の各遺伝子を検出し又はその量を測定するために用いられる。また、ＤＮＡチップは、発現遺伝子の検出や定量による遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）の検出等の応用分野においても大きく期待されている。
　また、分析用チップは、ＤＮＡ等の核酸だけでなく、タンパク質や糖類などの検査、解析手段としても利用されている。とりわけ、プロテイン分析用チップでは、抗体、抗原、酵素基質などのタンパク質が基板上に固定化される。
　特許文献１には、凹凸構造を有する分析用チップを回転させ、分析用チップ中の微粒子又は気泡を動かして被検物質を含む溶液を攪拌する方法が記載されており、選択結合性物質が固定化された面に微粒子又は気泡が接触しないように微粒子又は気泡を移動させることで、微量の被検物質でも良好なＳ／Ｎ比で強い蛍光シグナルが得られ方法が開示されている。
　特許文献２には、凹凸構造を有する分析用チップを略水平方向に回転させ、被検物質と選択結合性物質との選択的な反応を行うにあたり、微粒子を用いて被検物質溶液を撹拌することにより簡便かつ安定して行うことができる方法が開示されている。
　特許文献３には、試料溶液と微粒子が入った容器を回転させて、微粒子を重力方向に落下させることで容器内の試料溶液を攪拌するハイブリダイゼーション方法及び装置が開示されている。
　特許文献４には、マイクロアレイを配置した専用のハイブリダイゼーション用チャンバーに、空間の一部を残してハイブリダイゼーション溶液を注入し、チャンバーを回転させることで、チャンバー内溶液の空間の位置が変化し、溶液を攪拌するハイブリダイゼーション方法が開示されている。
　特許文献５には、ターンテーブルに設置したマイクロアレイを公転させながら自身も回転させることで試料溶液を撹拌する、自公転方式のハイブリダイゼーション装置が開示されている。
国際公開第２００５／０９０９９７号 特開２００７－２８５８２８号公報 特開２００３－３３９３７５号公報 特許第４４７３００７号公報 米国特許第６３０９８７５号
　特許文献１に記載される溶液の攪拌方法においては、例えば３ｒｐｍといった比較的低い回転数で分析用チップを回転させているが、この場合ハイブリダイゼーション反応に１０時間を要しており、被検物質の迅速な検出に適する方法ではなかった。また、特許文献２に記載される被検物質溶液の撹拌方法においても、ハイブリダイゼーション反応に１６時間を要していることから、特許文献１の方法と同様、被検物質の迅速な検出への適用できる方法ではなかった。また、特許文献３に開示される方法は、ハイブリダイゼーションの時間短縮を効果として謳っているものの、実際にはハイブリダイゼーション反応に６時間を要しており、迅速な診断が要求される分析には適用が困難であった。さらに、特許文献４に開示されるハイブリダイゼーション方法は、チャンバーを回転させることにより、静置で反応させる場合と比べてＣＶ値は良化しているものの、シグナル強度はほとんど変化しておらず、反応の進行を加速させるものではなかった。特許文献５に記載される装置は、少量の検体溶液でマイクロアレイの撹拌を可能とする装置であるが、ハイブリダイゼーションに要する時間やその時間短縮について言及しておらず、迅速診断に適応できるものかどうか不明であった。
　これら特許文献１～５に記載の溶液の攪拌方法は、いずれもハイブリダイゼーション反応の効率を高めて検出感度を向上させることを目的としているが、実際にはハイブリダイゼーション反応に６時間から２０時間を要しており、分析用チップを用いた被検物質の検出又は定量のスピードを格段に高めるための技術とはいえない。したがって、分析用チップを用いて行う被検物質の分析において、数分からせいぜい２時間以内といった短時間での検出又は定量が求められる分析、例えばインフルエンザ等の感染症や敗血症等の検査・診断用途において、その要求を満たすようなスピードでの分析を可能とするための被検物質溶液の攪拌方法はこれまで存在しなかった。
　本発明は、前記課題を解決するもので、分析用チップに固定化された選択結合性物質と被検物質との選択的な結合反応（ハイブリダイゼーション反応）の進行を促進させ、特に短時間での被検物質の分析が可能となる手段を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らは、分析用チップを用いる被検物質の分析において、被検物質と固定化された選択結合性物質との反応を促進できる被検物質を含む溶液の攪拌方法について鋭意検討した結果、分析用チップの凹部に被検物質を含む溶液を凹部空間の一部を残して注入し、１×ｇ以上の遠心加速度を与えて旋回回転させて溶液を攪拌することで、短時間で安定した選択的結合反応が実現できることを見出し、本発明に到達した。
　すなわち、本発明は次の（１）～（７）で構成される。
（１）分析用チップに注入された被検物質を含む溶液の攪拌方法であって、該分析用チップは該被検物質を含む溶液が注入される凹部を有し、該凹部の底面表面の全て又は一部に該被検物質と選択的に結合する選択結合性物質が固定化され、該被検物質を含む溶液は、分析用チップの凹部の空間に該空間の一部を残して注入され、該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを１×ｇ以上の遠心加速度を与えて旋回回転させる、溶液の攪拌方法。
（２）該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを０．１ｍｍ以上２０ｍｍ以下の回転半径で旋回回転する、（１）に記載の溶液の撹拌方法。
（３）前記被検物質を含む溶液が、前記凹部に１０％以上７０％以下の空間を残して注入される、（１）又は（２）に記載の溶液の攪拌方法。
（４）前記分析用チップが、互いに壁面で区切られた被検物質を含む溶液が注入される複数の凹部を有する、（１）～（３）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
（５）前記分析用チップに前記凹部の全体を覆うカバーが装着されて、前記被検物質を含む溶液が該凹部に密閉される、（１）～（４）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
（６）前記被検物質を含む溶液が注入された分析用チップが、前記凹部の底面が水平又は略水平となるよう設置されて水平又は略水平の方向に旋回回転させる、（１）～（５）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
（７）（１）～（６）のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法により分析用チップに固定化された選択結合性物質に被検物質を結合させ、選択結合性物質に結合した該被検物質を検出する、被検物質の分析方法。
　本発明の被検物質溶液の攪拌方法によれば、被検物質と分析用チップに固定化された選択結合性物質との選択的な反応を効果的に促進し、選択結合性物質と被検物質が接近する機会を著しく増大させることができる。そのため、分析用チップを用いて被検物質溶液に含まれる被検物質を短時間で検出又は定量することが可能となる。
　また、本発明の被検物質溶液の撹拌方法によれば、被検物質を含む溶液が注入される凹部を複数有する分析用チップを用いる場合であっても、各凹部内の溶液を同じ条件で撹拌することができるため、各凹部における選択結合性物質と被検物質との反応を同条件で行うことができ、凹部間における反応ばらつきの発生を抑えることができる。
本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。 本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。 本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。 カバーを装着した本発明の分析用チップの一例を示した図。（ａ）凹部が１個である分析用チップの一例、（ｂ）凹部を複数有する分析用チップの一例、（ｃ）凹部の断面図。 本発明の分析用チップの凹部の底面の好ましい形状の一例を示す上面図。（ａ）六角形、（ｂ）角がＲ加工された四角形、（ｃ）楕円形。 本発明の分析用チップに被検物質を含む溶液を注入した際の一態様を示す、分析用チップの断面図。 本発明の旋回回転を例示する図。 公転を含む回転様式を例示する図。 実施例１～４、比較例１～３における、反応時間とシグナル強度の関係を示すグラフ。 図９のグラフのうち、反応時間が１時間までの部分を拡大したグラフ。
　本発明において、分析用チップとは、被検物質が含まれる溶液（以下「被検物質溶液」ということもある。）を当該チップに注入し、被検物質の存在の有無や、被検物質の量、被検物質の性状等を測定するために用いるチップを指す。具体的には、担体表面に固定化された選択結合性物質と被検物質との反応により、被検物質の量や有無を測定する、バイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を担体表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を担体表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を担体表面に固定化した糖鎖チップ、及び細胞を担体表面に固定化した細胞チップ等が挙げられる。
　本発明で用いられる分析用チップには、被検物質を含む溶液が注入される凹部が形成されている。凹部は、壁面及び底面から構成される空間を形成しており、凹部の底面の表面の全て又は一部に選択結合性物質が固定化される。
　以下に、本発明で用いられる分析用チップの例を、図１～６を用いて説明する。
　図１には、平板の基板１（例えば、スライドガラス）、貫通孔を有する板材２から構成される分析用チップが例示されている。基板１と貫通孔を有する板材２とが接合されて、凹部の壁面３及び凹部の壁面４とで構成される凹部６（又は凹部の空間）が形成されている。（ａ）は凹部６が１個の場合、（ｂ）は凹部６を複数個有する場合の一例であり、（ｃ）は各凹部の断面を示している。選択結合性物質は、基板１の表面（上面）の一部に固定化されているが、その固定化表面は、基板１と板材２とが接合されることにより、凹部６の底面３の一部において選択結合性物質の固定化表面５となる。
　図１に例示するような選択結合性物質が固定化される平板の基板と、凹部を形成するための貫通孔を有する板材とから構成される分析用チップにおいて、当該平板基板及び板材の材質は特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等の高分子材料を好適に用いることができる。平板基板と板材との接合方法は特に限定されず、接着剤を用いて実質上着脱できない状態で接着されてもよいし、両面テープや樹脂組成物等の接着層を介して着脱可能な状態で接着されてもよい。また、分析用チップ１枚あたりの凹部の数は分析の目的に合わせて設定することができ、１個でも複数個でもよい。
　図２及び図３には、図１に例示する貫通孔を有する板材を用いず、例えば射出成形により、基板１に凹部６を形成した分析用チップを例示している。基板１に形成された凹部６は底面３及び壁面４とで構成される空間を有しており、凹部の底面３の一部が選択結合性物質の固定化表面５となっている。（ａ）は凹部が１個の場合、（ｂ）は凹部を複数個有する場合の一例であり、（ｃ）は凹部の断面の一例を示している。分析用チップ１枚あたりの凹部の数は、分析目的に合わせて任意の数を選択することができる。
　図２及び図３に例示する分析用チップにおいて、基板の材質は、上記図１に例示する分析用チップにおける基板と同様のものを用いることができる。
　本発明の溶液の攪拌方法において用いられる分析用チップの凹部の深さは特に限定されないが、０．１～１０ｍｍが好ましく、０．５～５ｍｍがより好ましい。図２は凹部６の深さが浅いタイプ、図３は凹部６の深さが深いタイプの分析用チップの例である。
　被検物質溶液が注入された分析用チップを旋回回転させる際、図３のような凹部が深い分析用チップを用いる場合は、分析用チップにカバーをせずにそのまま旋回回転させることも可能である。一方、図２のような凹部が浅い分析用チップを用いる場合は、凹部の全体を覆うカバーが装着されて被検物質溶液が凹部に密閉されることが好ましい。分析用チップを旋回回転させる条件（遠心加速度、回転数、回転半径）にあわせて、例えば、凹部の深さが５ｍｍ以下の場合は、カバーを装着することが好ましい。
　図４に例示する分析用チップは、凹部６の全体を覆うカバー７が分析用チップに装着されて被検物質溶液が凹部６に密閉される分析用チップの例である。具体的には、図２又は図３に示す分析用チップに平板状のカバー７が装着されたものである。（ａ）は凹部が１個の場合、（ｂ）は凹部を複数個有する場合の一例であり、（ｃ）は凹部の断面を示している。この例では、カバー７には、被検物質溶液を凹部に注入するための注入孔８が備えられている。
　カバーとしては、樹脂製、ゴム製、ガラス製等の平板や粘着性テープ等のシール材料を用いることができる。カバーに被検物質溶液を凹部に注入するための注入孔を設けることにより、被検物質溶液を凹部に注入した後でカバーを装着することができる。この場合、注入孔は複数個あることが好ましく、例えば凹部当たり２～４個設けることができる。一方、被検物質溶液の注入後にカバーを装着する場合は、カバーに注入孔を設けても設けなくてもよく、例えば粘着性テープで開放部を塞いで密閉する方法、開放部の形状に合わせたＯリングを固定した板材を密着させて密閉する方法、粘土様の物質で開放部に蓋をして密閉する方法などを好適に用いることができる。
　ハイブリダイゼーション反応の際、被検物質溶液の蒸発を防いだり、反応温度を厳密に一定に保ったりする必要がある場合、分析用チップの凹部の空間を密閉することが好ましく、その場合は分析用チップにカバーを装着して用いることが好ましい。
　本発明の溶液の攪拌方法において用いられる分析用チップの凹部の底面の形状は、分析用チップを旋回回転させるときに、被検物質溶液で満たされていない凹部に残された空間（又は気泡）が移動しやすい形状であることが好ましい。例えば、図５に示すように、凹部の底面の形状が六角形（ａ）、四角形（ｂ）、楕円形（ｃ）である分析用チップを用いることが、凹部に残された空間（又は気泡）９が移動しやすくなるため好ましい。また、凹部の底面の形状が多角形の場合に角がＲ加工されていること（例えば、図５の（ｂ））も、被検溶液で満たされていない凹部に残された空間（又は気泡）が移動しやすくなるため好ましい。
　図６は、カバーを装着した分析用チップに被検物質を含む溶液を注入した際の一態様を示す、分析用チップ凹部付近の断面図である。分析用チップの凹部の空間６に被検物質を含む溶液を注入し、溶液で満たされていない空間（又は気泡）９を形成させ、カバー７を装着した状態を示す。図６の状態で分析用チップを旋回回転することで被検物質溶液を攪拌し、ハイブリダイゼーション反応を行うことができる。
　本発明における選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。担体の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
　核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡが挙げられ、ＰＮＡ、ＬＮＡでも良い。ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌、カビ等のＤＮＡ、ＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡ、それらの一部である断片などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｓｍａｌｌ　ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡやそれらの一部である断片などを用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、化学的に合成されたＤＮＡ又はＲＮＡ等も含まれる。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう選択結合性物質に該当する。核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Ｂｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．３：２３０３（１９７６））等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Ｆａｖａｌｏｒｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：７１８（１９８０））等により行うことができる。固定化される核酸としては、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
　蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ´）２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。
　糖類としては、各種単糖、オリゴ糖、多糖などの糖鎖を挙げることができる。
　脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。
　更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、担体の表面に細胞を固定化してもよい。
　これらの選択結合性物質のうち特に好ましいものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖、脂質を挙げることができる。
　本発明で用いられる被検物質としては、測定すべき核酸（標的核酸）、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の溶液の攪拌方法では、これらの被検物質を含む溶液として、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。ここで、被検物質を含む溶液の粘度は、遠心加速度を与えて分析チップを旋回回転させるときに、被検物質溶液で満たされていない分析チップの凹部の空間が移動可能であれば特に限定されない。
　被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型とし、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、本発明の攪拌方法を行った後の測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、担体を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、担体に結合した標識を測定することもできる。また、増幅されていない核酸を被検物質とする場合は、例えばアルカリホスファターゼにより核酸の５’末端のリン酸基を除去して蛍光物質を標識した被検物質を選択結合性物質と反応させ、結合した標識を測定する方法や、選択結合性物質（捕捉プローブ）により被検物質を捕捉した後、被検物質に蛍光物質等で標識した検出プローブを結合させ、検出プローブの標識を測定する方法（サンドイッチハイブリダイゼーション法）が好適に用いられる。
　本発明の溶液の攪拌方法においては、上述のような標識、増幅等を施した被検物質を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させて被検物質を含む溶液（被検物質溶液）とする。
　本発明の溶液の攪拌方法では、分析用チップの凹部の空間への被検物質溶液の注入は、凹部の空間の一部を残すように行われ、凹部には被検物質溶液で満たされていない空間が形成される。被検物質溶液で凹部の空間を完全に満たさずに被検物質溶液で満たされていない空間を形成することで、分析用チップの旋回回転によって凹部内で空間が移動し、被検物質溶液を攪拌することができる。分析用チップが旋回回転されるとき、凹部に形成された空間は、凹部内で単一の空間として存在してもよいし、複数の空間に分かれて、すなわち複数の気泡となって存在してもよい。
　凹部の空間に占める、被検物質溶液で満たされていない空間の割合は、下限が好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、上限が好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下である。被検物質溶液で満たされていない空間の割合の範囲は、１０％以上９０％以下が好ましく、１５％以上８０％以下がより好ましい。さらに好ましくは、２０％以上７０％以下である。この空間の割合が５％より少ないと、分析用チップの旋回回転の際、凹部の空間における被検物質溶液の移動が不十分となり、実質上被検物質溶液が攪拌されないおそれがあり、また９０％より多いと、選択結合性物質が固定化された領域に被検物質を含む溶液が接触する機会が減少して反応の進行低下につながる。また、図３のような凹部が深い分析用チップを、カバーを装着せずに旋回回転させる場合は、被検物質溶液で満たされていない空間の割合は、例えば３０％以上９０％以下が好ましく、４０％以上８０％以下がより好ましい。
　本発明の溶液の攪拌方法では、被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを旋回回転させることで溶液の撹拌を行う。ここで、旋回回転とは、分析用チップ自体が円運動又は楕円運動により回転軸の周囲を回転することを意味する。詳細には、本発明の旋回回転は、分析用チップ上の任意のいずれの点においても、各固有の回転中心を有する同じ半径の円運動がなされるように行う回転様式のことを指す。図７に、本発明の旋回回転の一例を示す。分析用チップ１０上の任意の点Ａ、Ｂについて、点Ａは、ＯＡを中心とした半径ｒの円軌道上を所定回転数で回転し、点Ｂも同様に、ＯＢを中心とした半径ｒの円軌道上を所定回転数で回転する。このとき、分析用チップ１０上の任意の点Ａ、Ｂを結ぶ直線ＡＢは、円運動の任意の軌道において常に平行となる。例えば、図７において、分析用チップ１０が位置Ｐ１、位置Ｐ２、位置Ｐ３、位置Ｐ４のいずれに位置する場合でも、直線ＡＢは平行となる。一方、公転回転や自公転回転といった、公転を含む回転様式の場合は、図８に示すとおり、公転の中心Ｏから分析用チップ１０上の任意の点Ａ、点Ｂまでの距離（ｒａ、ｒｂ）がそれぞれ異なる。すなわち、公転を含む回転様式は、分析用チップ上の位置によって円運動の回転半径が異なる回転様式である。
　分析用チップを旋回回転させる際、分析用チップは、その選択結合性物質が固定化された面が回転面に平行又は略平行になるように設置されることが好ましい。
　被検物質を含む溶液が注入される凹部を複数有する分析用チップを用いる場合、旋回回転させることにより、各凹部内の溶液を同じ条件で撹拌できることから、各凹部における選択結合性物質と被検物質との反応を同条件で行うことができ、凹部間の反応ばらつきを低減できるため好ましい。一方、分析用チップを公転させながら自身を回転させる自公転方式や、回転中心が分析用チップの外側にある公転方式によって攪拌する場合は、複数の凹部がそれぞれ異なる条件で撹拌されることになり、凹部間の反応ばらつきが発生するおそれがある。
　分析用チップを旋回回転させる際の回転面の方向は特に限定されず、例えば水平又は略水平方向、水平方向から１５度傾いた方向、水平方向から３０度傾いた方向、水平方向から４５度傾いた方向、水平方向から６０度傾いた方向、水平方向から７５度傾いた方向、鉛直又は略垂直方向などを用いることができる。好ましい回転面の方向は、水平又は略水平方向である。ここで、略水平方向とは、分析用チップの選択的結合物質が固定化された面に向かって水平に近い方向を意味し、例えば水平面を基準として０度から３度の範囲で傾いた方向が好ましい。また、略垂直方向とは、分析用チップの選択結合性物質が固定化された面に向かって垂直に近い方向を意味し、例えば垂直面を基準として０度から３度の範囲で傾いた方向が好ましい。
　本発明において、分析用チップの旋回回転は、回転数を一定としても、回転数を変化させてもよく、また旋回回転中に一定時間停止させるなど間歇的に行ってもよい。また、回転方向は特に限定されず、時計回りでも反時計回りでもよく、その組み合わせでもよい。
　反応時に旋回回転させる時間は、特に限定されず、選択結合性物質と被検物質とが反応するのに十分な範囲で適宜決定することができる。例えば、被検物質が核酸である場合は、選択結合性物質であるプローブ核酸とのハイブリダイゼーション反応に要する時間にあわせて設定することができる。本発明の溶液の攪拌方法では、旋回回転時に１×ｇ以上の遠心加速度を与えることで、被検物質と選択結合性物質との選択的反応を効果的に促進し、被検物質を短時間で検出又は定量することが可能となる特徴を有する。この特徴を活かして、特に検査・診断用途で分析用チップを用いる場合等、迅速な検出又は定量を求められる場合には、旋回回転させる時間は短時間であることが好ましい。例えば、核酸のハイブリダイゼーションの場合、反応時間が３時間以上４時間以内あることが好ましく、２時間以内であることがより好ましく、１時間以内であることがさらに好ましく、０．５時間以内であることが特に好ましい。
　一般に、遠心加速度とは、回転運動をする系において、物体に加わる遠心力の大きさを加速度の形で表したものであり、回転の中心からの距離の絶対値及び回転運動の角速度の二乗に比例する。本発明における遠心加速度は、遠心力、すなわち相対遠心加速度（Ｒａｌａｔｉｖｅ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　Ｆｏｒｃｅ；ＲＣＦ）を指し、以下の式１で算出される。
　ＲＣＦ＝１１１８×Ｒ×Ｎ２×１０－８　　・・・（式１）
　　ＲＣＦ：相対遠心加速度（×ｇ）
　　Ｒ：回転半径（ｃｍ）
　　Ｎ：回転数（ｒｐｍ）。
　本発明の溶液の攪拌方法では、分析用チップを旋回回転させるときに１×ｇ以上の遠心加速度を与える。遠心加速度の下限は、好ましくは５×ｇ以上、より好ましくは１０×ｇ以上である。遠心加速度の上限は特に限定されないが、好ましくは５０×ｇ以下、より好ましくは４０×ｇ以下であり、さらに好ましくは３０×ｇ以下である。遠心加速度の範囲は、好ましくは１×ｇ以上５０×ｇ以下であり、より好ましくは５×ｇ以上４０×ｇ以下であり、さらに好ましくは１０×ｇ以上３０×ｇ以下である。
　本発明の溶液の攪拌方法では、分析用チップを旋回回転させる際の回転数と回転半径を適宜設定することで、目的とする遠心加速度を与えることができる。従って、分析用チップを攪拌させる撹拌装置の仕様にあわせて回転数と回転半径を選択して行うことができる。例えば、回転半径が小さい場合は、回転速度を大きくすることで、大きな遠心加速度を付与できる。
　回転半径は、回転数との組合せで所望の遠心加速度が得られる値を適宜選択することができる。回転半径の下限は、好ましくは０．１ｍｍ以上、より好ましくは０．２ｍｍ以上、さらに好ましくは０．３ｍｍ以上である。また、回転半径の上限は、好ましくは２０ｍｍ以下、より好ましくは１０ｍｍ以下、さらに好ましくは５ｍｍ以下である。回転半径の範囲としては、好ましくは０．１～２０ｍｍ、より好ましくは０．２～１０ｍｍ、さらに好ましくは０．３～５ｍｍである。回転半径が２０ｍｍより大きくなると、遠心力が支配的になり、被検物質溶液で満たされていない空間が凹部の外周に押し付けられる傾向があり、撹拌効率の低下や、凹部内での攪拌ムラが生じることがある。一方、回転半径が０．１ｍｍより小さいと、回転方向に働く力が支配的になり、被検物質溶液で満たされていない空間が凹部の中心部に留まる傾向があり、撹拌効率の低下や、攪拌ムラが生じることがある。
　また、旋回回転の回転数は、回転半径との組合せで所望の遠心加速度が得られる値を適宜選択することができるが、好ましくは５００ｒｐｍ以上１００００ｒｐｍ以下、より好ましくは７５０ｒｐｍ以上８０００ｒｐｍ以下である。回転半径が小さい方が、反応装置や攪拌装置を小型化でき、本発明の溶液の攪拌方法を具現化する装置をコンパクトに作製できることから、好ましい。
　また、分析用チップにカバーを装着せずに旋回回転させる場合は、注入された被検物質溶液がこぼれないようにするため、回転半径の小さい攪拌装置が好適に使用される。例えば、回転半径が０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましく、０．２ｍｍ以上４ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以上３ｍｍ以下であることが一層好ましい。
　本発明において使用する分析用チップを攪拌させる撹拌装置は、旋回回転の回転数と回転半径との組合せで１×ｇ以上の遠心加速度を与えることができるものであれば特に限定されない。市販品では、プレートシェーカーを好適に用いることができ、例えば「ＢｉｏＳｈａｋｅ５０００　ｅｌｍ」、「ＢｉｏＳｈａｋｅ　３０００－Ｔ　ｅｌｍ」、「ＢｉｏＳｈａｋｅ　３０００　ｅｌｍ」（以上、Ｑ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）、「モノシェーク」、「テレシェーク」、「テレシェーク１５３６」（以上、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）、「ＭＳ３　ベーシック」、「ＭＳ３　デジタル」、「ＶＸＲ　ｂａｓｉｃ　Ｖｉｂｒａｘ」（登録商標）、「ＶＯＲＴＥＸ　３」（以上、ＩＫＡ社製）、「マイクロプレートシェーカーＮ－７０４」（日伸理化製）、「プレートシェーカーＫＭ－Ｍ０１」（カジックス製）、「プレートミキサーＰ－１０」（十慈フィールド製）等が挙げられる。自動化装置に組み入れる場合、外部から旋回回転の回転数や駆動時間などを制御できる装置であることが好ましい。
　本発明において、凹部内側の空間に撹拌子を添加してもよい。撹拌子としては、微粒子（ビーズ）、マイクロロッド等が挙げられ、特に微粒子が好ましい。微粒子やマイクロロッドの形状は、分析用チップの凹部内で移動可能であって被検物質を含む溶液を攪拌することが可能であれば特に限定されない。微粒子の場合、球状以外に、多角形でも良く、またマイクロロッドの場合、円筒形、角柱形など任意の形状とすることができるが、球状のものが好ましい。また、微粒子のサイズも特に限定されないが、例えば球状の微粒子の場合、直径０．１μｍ以上１０００μｍ以下の範囲とすることができ、撹拌効率を鑑みると、直径５０μｍ以上５００μｍ以下の範囲がより好ましい。マイクロロッドの場合、好ましくは長さ５０μｍ以上５０００μｍ以下、底面直径１０μｍ以上３００μｍ以下の範囲とすることができる。微粒子やマイクロロッドは、撹拌効率などの面から、１種類を選択して用いることもできる他、２種類以上を組み合わせて用いることができる。
　前記微粒子やマイクロロッドの材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えばナイロンやポリスチレン）等を用いることができる。
　本発明で用いる分析用チップは、凹部に、その上部表面に選択結合性物質を固定化するための凸部を有していてもよい。このような構造を有する分析用チップを被検物質の分析に用いることにより、シグナル検出の際、選択結合性物質が固定化された凸部上面にスキャナーの焦点を合わせることで、検出ノイズを大幅に低減でき、Ｓ／Ｎ比を高めることができる。また、本発明で用いる分析用チップは、自家蛍光を低減できる材料により製造されていることが好ましく、例えば選択結合性物質が固定化される凸部には少なくともその一部が黒色であることが好ましい。
　本発明において、シグナルの検出の感度を示す指標としてＳ／Ｎ比（シグナル対ノイズ比）を用いることができる。この場合、Ｓ／Ｎ＝２を検出限界として感度を判断することが好ましい。一般に、Ｓ／Ｎ比が２～３となる被検物質濃度又は量が検出限界として採用されており、Ｓ／Ｎが２以上であれば検出限界以上の信頼性のある検出がされたものと判断することができる。（例えば、丹羽誠著、「これならわかる　化学のための統計手法－正しいデータの扱い方－」、２００８年、化学同人編、１０１頁）
　本発明の溶液の攪拌方法は、分析用チップに固定化された選択結合性物質と被検物質との選択的反応の進行を従来より促進させることができるため、被検物質を短時間で検出又は定量することを可能とする。例えば、核酸のハイブリダイゼーションにおいて、従来６～２０時間の反応時間を要していた反応時間を、大幅に短縮することができる。従って、例えば、数多くの検体を迅速に分析することが求められる検査・診断領域において分析用チップを用いて分析を行う場合、本発明の溶液の攪拌方法を適用することが好ましい。例えば、インフルエンザ等の感染症や、敗血症の検査・診断に好ましく用いることができる。また、検査センターにおいて莫大な数の検体を処理する場合も、迅速に分析を行うことができるので、コストを削減の点から本発明の適用が好ましい。
　本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
参考例１
　（１）分析用チップの基板の作製
　公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ　Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ　Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成形法により、後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製　＃３０５０Ｂ）を含有させて、基板を黒色にした。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ　Ｚ　８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ－２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
　基板としては、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚さ１ｍｍであり、基板に縦６．４８ｍｍ、横６．９０ｍｍ、深さ０．１２ｍｍの凹部を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１２ｍｍの凸部を５７６箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする。）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部上面と平坦部上面との高さの差は、３μｍ以下であった。また、凸部上面の高さのばらつきは、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチを０．１８ｍｍとした。
　上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
　（２）選択結合性物質の固定化
　基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。４種の遺伝子ａ～ｄに対応するオリゴヌクレオチドとして、配列番号１～４の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド（オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット「Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ（Ｈｕｍａｎ）　ＡＲＯＳ　Ｖ４．０（各６０塩基）」）を用いた。この各オリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調整したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；「Ｇｅｎｅ　Ｓｔａｍｐ－ＩＩ」）を用いて、基板Ａの凸部上面に遺伝子ａに対応する配列番号１の塩基配列で示されるプローブをＮ＝４でスポットしたもの（以下、「分析用チップ１」とする。）、遺伝子ｂ～ｄに対応する配列番号２～４の塩基配列で示されるプローブをそれぞれＮ＝２でスポットしたもの（以下、「分析用チップ２」とする。）を用意した。次いで、スポットした各基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。
　（３）分析用チップ基板へのカバー部材の貼付
　選択結合性物質を固定化した上記分析用チップ１、分析用チップ２に対し、次のようにカバー部材を貼付した。カバー部材は、ＰＭＭＡ平板を切削加工により作製した。作製した該カバー部材には、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを設けた。そして接着部材として両面テープを用い、カバー部材を縁取るように、かつ厚さ５０μｍで積層させて貼り付けたのち、当該カバー部材を分析用チップ１、分析用チップ２に貼付した。
　（４）被検物質の調製
　被検物質は、マイクロアレイの被検物質として一般的である、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ＲＮＡ）を用いて調製した。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製「Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＲＮＡ」）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キット「ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ　ＩＩ　ａＲＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」を使用して調製したａＲＮＡを、Ｃｙ５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で蛍光標識して、Ｃｙ５標識ａＲＮＡを得た。
　（５）選択結合性物質と被検物質とのハイブリダイゼーションのための反応液
　以下の実施例、比較例で特に断りのない限り、上記で調製した標識ａＲＮＡを、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション溶液（各濃度はいずれも終濃度）で希釈したものを用いた。
　実施例１
　参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ１００ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して２５μＬとして、被検物質溶液を調製した。被検物質溶液を分析用チップ１に１０μＬ注入した。凹部内の被検物質溶液で満たされていない空間の容積は約３μＬであり、凹部内に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は約２３％であった。以上の分析用チップ１を６セット用意した。各分析チップの注入口をシールして凹部を密閉した状態にして、３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」（Ｑ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社；最大回転数５０００ｒｐｍ、回転半径０．６ｍｍ）にセットし、各分析用チップについて５０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌して反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約１７．７×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置（東レ株式会社；「３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）　Ｓｃａｎｎｅｒ」）を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値（ブランクスポットの平均＋２ＳＤ）以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。
　実施例２
　実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」にセットし、３０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約６．０４×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。
　実施例３
　実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＭＳ３デジタル」（ＩＫＡ社；最大回転数３０００ｒｐｍ、回転半径２．２５ｍｍ）にセットし、３０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約２２．６×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。
　実施例４
　実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＭＳ３デジタル」にセットし、１０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約２．５２×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈで閾値以上のシグナルが検出され、反応が早く進行したことが示された。
　比較例１
　実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブン内に設置した、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」にセットし、１０００ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、分析用チップに与えられた遠心加速度は、約０．６７１×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈでは、閾値以上のシグナルが検出されなかった。閾値以上のシグナルが検出されたのは、反応開始後１ｈ以降であった。
　比較例２
　実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブン内に設置した、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」にセットし、２５０ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約０．０４２×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈでは、閾値以上のシグナルが検出されなかった。閾値以上のシグナルが検出されたのは、反応開始後１ｈ以降であった。
　比較例３
　実施例１と同様にして被検物質溶液を分析用チップ１（６セット）に注入した。３７℃に温調されたオーブン内に設置した、攪拌装置「ＭＳ３デジタル」にセットし、２５０ｒｐｍでそれぞれ０．５ｈ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、１６ｈ攪拌し、反応させた。このとき、分析用チップに与えられた遠心加速度は、約０．１５７×ｇであった。各分析用チップについて、ハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を図９、図１０、表１に示す。反応開始後０．５ｈでは、閾値以上のシグナルが検出されなかった。閾値以上のシグナルが検出されたのは、反応開始後１ｈ以降であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例５
　参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ６０ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して１０μＬとして、分析用チップ２（２セット）に６．７μＬ注入した。注入されたＣｙ５標識ａＲＮＡの量は４０ｎｇであり、実施例１～４と同量であった。凹部内の被検物質溶液で満たされていない空間の容量は約６．３μＬであり、凹部全体に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は約４８％であった。実施例１と同様にして、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」にセットし、それぞれ５０００ｒｐｍで１時間反応させた。各分析用チップについて、３種類の遺伝子ｂ～ｄに対してハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を表２に示す。１時間の反応時間で、全ての遺伝子のシグナル強度が閾値以上となり有効であった。
　実施例６
　参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ６０ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して１５μＬとして、分析用チップ２（２セット）に１０μＬ注入した。注入されたＣｙ５標識ａＲＮＡの量は４０ｎｇであり、実施例１～４と同量であった。凹部内の被検物質溶液で満たされていない空間の容量は約６．３μＬであり、凹部全体に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は約２３％であった。実施例１と同様にして、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」にセットし、それぞれ５０００ｒｐｍで１時間反応させた。各分析用チップについて、３種類の遺伝子ｂ～ｄに対してハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を表２に示す。１時間の反応時間で、全ての遺伝子のシグナル強度が閾値以上となり有効であった。
　比較例４
　参考例１に記載のＣｙ５標識ａＲＮＡ６０ｎｇを含む溶液にハイブリダイゼーション溶液を混合して２０μＬとし、分析用チップ２（２セット）に１３μＬ注入して凹部を満たした（凹部全体に占める被検物質溶液で満たされていない空間の割合は０％）。実施例１と同様にして、攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」にセットし、それぞれ５０００ｒｐｍで１時間反応させた。各分析用チップについて、３種類の遺伝子ｂ～ｄに対してハイブリダイズした標識ａＲＮＡのシグナル強度を高解像度蛍光検出装置を用いて測定した。その結果を表２に示す。１時間の反応時間で、遺伝子ｂのシグナル強度は閾値以上となり有効であったものの、実施例５、６よりシグナル強度が弱かった。また、遺伝子ｃ、ｄのシグナル強度は閾値より低く、無効であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　参考例２
　（１）分析用チップの基板の作製
　参考例１と同様の材質で、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚さ２．５ｍｍの基板を射出成形で作製した。基板には長辺４．８ｍｍ、短辺２．４０ｍｍ、深さ１．５ｍｍの楕円形の凹部を４箇所設け、各凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１２ｍｍの凸部を９８箇所設けた基板（以下「基板Ｂ」とする。）を用いた。基板Ｂにおいて、凹部の容積は約１３．５μＬであった。また、凸部上面と平坦部上面との高さの差、凸部上面の高さのばらつきはともに３μｍ以下であった。また、凸部のピッチを０．１８ｍｍとした。
　（２）選択結合性物質（捕捉プローブ）の固定化
　参考例１と同様の作製方法により、選択結合性物質（捕捉プローブ）として、ヒトパピローマウイルスの型判別の研究で報告された文献（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９５．ｐ．９０１－９０５）に記載された、配列番号５の塩基配列（被検物質となる１６型ヒトパピローマウイルスのＬ１遺伝子領域の配列の一部と相補的な配列）で示されるオリゴヌクレオチドの５’末端にアミノ基を修飾したものを合成し、基板Ｂの９８箇所の凸部のうちの２２箇所にスポットして固定化することで、分析用チップを得た（以下、「分析用チップ３」とする。）。
　（３）被検物質の調製
　被検物質として、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより購入したヒトパピローマウイルスのゲノムＤＮＡがクローニングされた組み換えプラスミド（ｐＨＰＶ１６（全長１６，６００塩基対））を、超音波により断片化処理した。１×ハイブリダイゼーション溶液（１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５×ＳＳＣ、１重量％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０ｎｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ溶液、５重量％デキストラン硫酸ナトリウム、３０％ホルムアミド）で核酸濃度が０．１ａｍｏｌ／μＬとなるように希釈し、検体ＤＮＡ溶液とした。
　（４）検出プローブ溶液の調製
　サンドイッチハイブリダイゼーションに使用する検出プローブとして、ＭＹ１１（配列番号６；被検物質が捕捉プローブと結合した場合の５´末端の塩基位置を基準として、５´末端側５０～６９番目の塩基配列に対する相補的な配列）、ＧＰ５（配列番号７；ＭＹ１１と同様に、５´末端側１０～３４番目の塩基配列に対する相補的な配列）、ＧＰ６（配列番号８；被検物質が捕捉プローブと結合した場合の３´末端の塩基位置を基準として、３´末端側６０～８２番目の塩基配列に対する相補的な配列）、及びＭＹ０９（配列番号９；ＧＰ６と同様に、３´末端側３４０～３５９番目の塩基配列に対する相補的な配列）の、３’末端及び５’末端にビオチン標識したものをそれぞれ合成した。これらを濃度が１００ｆｍｏｌとなるよう滅菌水で希釈し、各検出プローブ溶液を得た。
　実施例７
　参考例２に記載の検体ＤＮＡ溶液１μＬに、参考例２に記載の検出プローブ溶液１μＬを加えて混和し、サーマルサイクラーで９５℃、５分間加熱した。室温に戻るまで静置後、参考例２に記載の１×ハイブリダイゼーション溶液を８μＬ加えて混和し、被検物質を含むハイブリダイゼーション溶液とした。全量を分析用チップ３の凹部の１箇所に注入し、開口部をアクリル系粘着剤が塗布されたＰＥＴ製フィルムでシールした。このとき、凹部内の溶液で満たされていない空間の容積は約３．５μＬであり、凹部内に占める溶液で満たされていない空間の割合は約２６％であった。サンドイッチハイブリダイゼーション法により、被検物質の検出を行った。３２℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＢｉｏＳｈａｋｅ　５０００」（Ｑ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）にセットし、３０００ｒｐｍで２ｈ攪拌し、捕捉プローブと被検物質をハイブリダイゼーション反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約６．０４×ｇであった。反応後、開口部を塞いだシールを剥がし、３０℃に加温した洗浄液Ａ（０．５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ）で５分間洗浄した。乾燥後、染色試薬（ストレプトアビジンフィコエリスリン）を希釈液（１００ｍＭ　ＭＥＳ、１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）と混合して調製した、５０ｎｇ／μＬストレプトアビジンフィコエリスリン溶液を、凹部に１０μＬ滴下し、３５℃で５分間遮光下でインキュベートした。３０℃に加温した洗浄液Ｂ（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄し、乾燥させた。シグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置（東レ株式会社；「３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）　Ｓｃａｎｎｅｒ」）を用いて測定した。選択結合性物質が固定化された凸部（シグナル）及び固定化されていない凸部（ノイズ）の数値をそれぞれ読み取り、シグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．８０であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。
　実施例８
　ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を５０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は１６．７７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．５３であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。
　比較例５
　ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．６７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．５６であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。
　実施例９
　撹拌装置として「Ｍｉｘ－ＥＶＲ」（タイテック社；最大回転数２５００ｒｐｍ、回転半径１ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は４．４７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．２４であり、検出限界するＳ／Ｎ＝２を超えていた。
　実施例１０
　ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２５００ｒｐｍとした以外は、実施例９と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は６．９９×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．７６であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。
　比較例６
　ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を５００ｒｐｍとした以外は、実施例９と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．２８×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．４８であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。
　実施例１１
　撹拌装置に「ＭＳ３デジタル」（ＩＫＡ社）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は１０．０６×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝３．２５であり、一検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。
　実施例１２
　ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を３０００ｒｐｍとした以外は、実施例１０と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は２２．６４×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．７２であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。
　比較例７
　ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を５００ｒｐｍとした以外は、実施例１１と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．６３×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．６１であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。
　実施例１３
　製作した撹拌装置（最大回転数１０００ｒｐｍ、回転半径５ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１０００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は５．５９×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝２．３９であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。
　比較例８
　ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２５０ｒｐｍとした以外は、実施例１３と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．３５×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．４９であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。
　比較例９
　撹拌装置に「マルチシェーカーＭＭＳ－２１０」（東京理化器械社；最大回転数２５０ｒｐｍ、回転半径１２．５ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を２５０ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．８７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．５６であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。
　比較例１０
　製作した撹拌装置（最大回転数１０００ｒｐｍ、回転半径２４ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．２７×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．３９であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。
　比較例１１
　製作した撹拌装置（最大回転数１０００ｒｐｍ、回転半径７２ｍｍ）を用い、ハイブリダイゼーション反応時の撹拌装置の回転数を１００ｒｐｍとした以外は、実施例７と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は０．８０×ｇであった。Ｓ／Ｎ比を算出した結果を表３に示す。Ｓ／Ｎ＝１．５７であり、検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例１４
　参考例２に記載の検体ＤＮＡ溶液４μＬに、参考例２に記載の検出プローブ溶液４μＬを加えて混和し、サーマルサイクラーで９５℃、５分間加熱した。室温に戻るまで静置後、参考例２に記載の１×ハイブリダイゼーション溶液を３２μＬ加えて混和し、被検物質を含むハイブリダイゼーション溶液とした。分析用チップ３の凹部４箇所（凹部Ｎｏ．＃１～＃４）に、それぞれ１０μＬ注入し、開口部をアクリル系粘着剤が塗布されたＰＥＴ製フィルムでシールした。このとき、凹部内の溶液で満たされていない空間の容積は約３．５μＬであり、凹部内に占める溶液で満たされていない空間の割合は約２６％であった。サンドイッチハイブリ法により、被検物質の検出を行った。３２℃に温調されたオーブンに設置した攪拌装置「ＭＳ３デジタル」（ＩＫＡ社）にセットし、２０００ｒｐｍで２ｈ攪拌し、捕捉プローブと被検物質をハイブリダイゼーション反応させた。このとき、各分析用チップに与えられた遠心加速度は、約１０．１×ｇであった。反応後、開口部を塞いだシールを剥がし、３０℃に加温した洗浄液Ａ（０．５×ＳＳＣ、１重量％ＳＤＳ）で５分間洗浄した。乾燥後、染色試薬（ストレプトアビジンフィコエリスリン）を希釈液（１００ｍＭ　ＭＥＳ、１Ｍ　ＮａＣｌ、０．０５重量％Ｔｗｅｅｎ２０、２ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ）と混合して調製した、５０ｎｇ／μＬストレプトアビジンフィコエリスリン溶液を、凹部に１０μＬ滴下し、３５℃で５分間遮光下でインキュベートした。３０℃に加温した洗浄液Ｂ（６×ＳＳＰＥ、０．０１重量％Ｔｗｅｅｎ２０）で５分間洗浄し、乾燥させた。シグナル強度（蛍光強度）を高解像度蛍光検出装置（東レ株式会社；「３Ｄ－Ｇｅｎｅ（登録商標）　Ｓｃａｎｎｅｒ」）を用いて測定した。選択結合性物質が固定化された凸部（シグナル）及び固定化されていない凸部（ノイズ）の数値をそれぞれ読み取り、４箇所の凹部（凹部Ｎｏ．＃１～＃４）のシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を算出した結果を表４に示す。それぞれＳ／Ｎ＝２．９、２．７、２．８．２．８であり、すべての凹部で検出限界とするＳ／Ｎ＝２を超えていた。また、各凹部内における２２個の凸部スポットのシグナルのＣＶ値がすべて１０％を切る低い値であり、凹部内のシグナルのばらつきも小さかった。さらに、４箇所の凹部全体のシグナル（８８個）のＣＶ値も７．５％と低く、凹部間のばらつきも小さいことが示された。
　比較例１２
　製作した自公転方式の撹拌装置（公転半径７２ｍｍ）を用い、公転回転数を３５０ｒｐｍとした以外は、実施例１４と同様の操作を行った。このとき、遠心加速度は９．９×ｇであった。４箇所の凹部（凹部Ｎｏ．＃１～＃４）のＳ／Ｎ比を算出した結果を表４に示す。それぞれＳ／Ｎ＝１．８、１．９、１．７、１．５であり、すべての凹部で検出限界とするＳ／Ｎ＝２に満たなかった。また、各凹部内における２２個の凸部スポットのシグナルのＣＶ値は１０％前後でばらつきがあり、さらに、４箇所の凹部全体のシグナル（８８個）のＣＶ値が１５．３％と高く、凹部間のばらつきが大きいことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の溶液の攪拌方法は、ＤＮＡチップ等の分析用チップを用いる被検物質の検出又は定量に要する時間を従来より大幅に短縮することができる。従って、本発明は、臨床現場や検査センターにおける迅速な疾患の診断・診察等を可能とすることから有用である。
１　基板
２　貫通孔を有する板材
３　凹部の底面
４　凹部の壁面
５　選択結合性物質の固定化表面
６　凹部（又は凹部の空間）
７　カバー
８　注入孔
９　溶液で満たされていない空間（又は気泡）
１０　分析用チップ

Claims (7)

  1. 　分析用チップに注入された被検物質を含む溶液の攪拌方法であって、
    該分析用チップは該被検物質を含む溶液が注入される凹部を有し、該凹部の底面表面の全て又は一部に該被検物質と選択的に結合する選択結合性物質が固定化され、
    該被検物質を含む溶液は、分析用チップの凹部の空間に該空間の一部を残して注入され、
    該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを１×ｇ以上の遠心加速度を与えて旋回回転させる、溶液の攪拌方法。
  2. 　該被検物質を含む溶液が注入された分析用チップを０．１ｍｍ以上２０ｍｍ以下の回転半径で旋回回転する、請求項１に記載の溶液の撹拌方法。
  3. 　前記被検物質を含む溶液が、前記凹部に１０％以上７０％以下の空間を残して注入される、請求項１又は２に記載の溶液の攪拌方法。
  4. 　前記分析用チップが、互いに壁面で区切られた被検物質を含む溶液が注入される複数の凹部を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
  5. 　前記分析用チップに前記凹部の全体を覆うカバーが装着されて、前記被検物質を含む溶液が該凹部に密閉される、請求項１～４のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
  6. 　前記被検物質を含む溶液が注入された分析用チップが、前記凹部の底面が水平又は略水平となるよう設置されて水平又は略水平の方向に旋回回転させる、請求項１～５のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の溶液の攪拌方法により分析用チップに固定化された選択結合性物質に被検物質を結合させ、選択結合性物質に結合した該被検物質を検出する、被検物質の分析方法。
PCT/JP2013/055117 2012-02-29 2013-02-27 溶液の攪拌方法 WO2013129469A1 (ja)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13755655.1A EP2821794B1 (en) 2012-02-29 2013-02-27 Method for stirring solution
KR1020147018545A KR102039369B1 (ko) 2012-02-29 2013-02-27 용액의 교반 방법
JP2013513887A JP6187259B2 (ja) 2012-02-29 2013-02-27 溶液の攪拌方法
ES13755655.1T ES2623098T3 (es) 2012-02-29 2013-02-27 Procedimiento para remover una solución
BR112014017624A BR112014017624B8 (pt) 2012-02-29 2013-02-27 método para agitar uma solução contendo uma substância teste e método para analisar uma substância teste
DK13755655.1T DK2821794T3 (en) 2012-02-29 2013-02-27 Process for stirring a solution
CN201380011640.6A CN104169722B (zh) 2012-02-29 2013-02-27 溶液的搅拌方法
US14/381,715 US9944976B2 (en) 2012-02-29 2013-02-27 Method for stirring solution
CA2861288A CA2861288C (en) 2012-02-29 2013-02-27 Method for stirring solution

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012043704 2012-02-29
JP2012-043704 2012-02-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013129469A1 true WO2013129469A1 (ja) 2013-09-06

Family

ID=49082663

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/055117 WO2013129469A1 (ja) 2012-02-29 2013-02-27 溶液の攪拌方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9944976B2 (ja)
EP (1) EP2821794B1 (ja)
JP (1) JP6187259B2 (ja)
KR (1) KR102039369B1 (ja)
CN (1) CN104169722B (ja)
BR (1) BR112014017624B8 (ja)
CA (1) CA2861288C (ja)
DK (1) DK2821794T3 (ja)
ES (1) ES2623098T3 (ja)
PL (1) PL2821794T3 (ja)
WO (1) WO2013129469A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018101781A (ja) * 2016-12-21 2018-06-28 キヤノン株式会社 リセッションを含むインプリントリソグラフィのためのテンプレート、そのテンプレートを使用する装置及び方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309875B1 (en) 2000-02-29 2001-10-30 Agilent Technologies, Inc. Apparatus for biomolecular array hybridization facilitated by agitation during centrifuging
JP2003339375A (ja) 2002-05-24 2003-12-02 Hitachi Ltd ハイブリダイゼーション方法および装置
WO2005090997A1 (ja) 2004-03-23 2005-09-29 Toray Industries, Inc. 溶液を攪拌する方法
JP2007285828A (ja) 2006-04-14 2007-11-01 Toray Ind Inc 検体溶液の撹拌方法
JP4473007B2 (ja) 2004-02-20 2010-06-02 三菱レイヨン株式会社 ハイブリダイゼーション方法
JP2010519536A (ja) * 2007-02-20 2010-06-03 ギロス パテント アーべー マイクロチャネル構造中でアリコートを混合する方法
WO2010106989A1 (ja) * 2009-03-16 2010-09-23 東レ株式会社 分析チップ、分析方法及び溶液の攪拌方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1302244A1 (en) * 2001-10-15 2003-04-16 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Chemical analysis using array hybridization
ES2384745T3 (es) * 2007-01-24 2012-07-11 Toray Industries, Inc. Chip de análisis y método de análisis
EP2309266A1 (en) * 2009-09-21 2011-04-13 F. Hoffmann-La Roche AG Method for carrying out reactions in an analytical device

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6309875B1 (en) 2000-02-29 2001-10-30 Agilent Technologies, Inc. Apparatus for biomolecular array hybridization facilitated by agitation during centrifuging
JP2003339375A (ja) 2002-05-24 2003-12-02 Hitachi Ltd ハイブリダイゼーション方法および装置
JP4473007B2 (ja) 2004-02-20 2010-06-02 三菱レイヨン株式会社 ハイブリダイゼーション方法
WO2005090997A1 (ja) 2004-03-23 2005-09-29 Toray Industries, Inc. 溶液を攪拌する方法
JP2007285828A (ja) 2006-04-14 2007-11-01 Toray Ind Inc 検体溶液の撹拌方法
JP2010519536A (ja) * 2007-02-20 2010-06-03 ギロス パテント アーべー マイクロチャネル構造中でアリコートを混合する方法
WO2010106989A1 (ja) * 2009-03-16 2010-09-23 東レ株式会社 分析チップ、分析方法及び溶液の攪拌方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLIN ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 3, 1976, pages 2303
FAVALORO ET AL., METHODS ENZYMOL., vol. 65, 1980, pages 718
J. CLIN. MICROBIOL., 1995, pages 901 - 905
MAKOTO NIWA: "Korenara Wakaru Kagakuno Tameno Toukei Shuhou - Tadashii Data no Atsukaikata-", 2008, pages: 10 1
See also references of EP2821794A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018101781A (ja) * 2016-12-21 2018-06-28 キヤノン株式会社 リセッションを含むインプリントリソグラフィのためのテンプレート、そのテンプレートを使用する装置及び方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2861288C (en) 2019-10-01
EP2821794A1 (en) 2015-01-07
DK2821794T3 (en) 2017-06-06
EP2821794B1 (en) 2017-04-05
CA2861288A1 (en) 2013-09-06
JP6187259B2 (ja) 2017-08-30
KR102039369B1 (ko) 2019-11-01
CN104169722A (zh) 2014-11-26
US20150045250A1 (en) 2015-02-12
JPWO2013129469A1 (ja) 2015-07-30
BR112014017624A2 (pt) 2017-06-27
KR20140138112A (ko) 2014-12-03
CN104169722B (zh) 2017-03-08
ES2623098T3 (es) 2017-07-10
US9944976B2 (en) 2018-04-17
PL2821794T3 (pl) 2017-08-31
BR112014017624B1 (pt) 2020-04-14
EP2821794A4 (en) 2015-12-02
BR112014017624B8 (pt) 2020-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5396857B2 (ja) 分析用チップ及び分析方法
EP2410341A1 (en) Analysis chip, analysis method and method for stirring solution
JP5504587B2 (ja) 分析用チップ
JP4857882B2 (ja) 検体溶液の撹拌方法
EP3279671B1 (en) Analysis chip
WO2015147004A1 (ja) 分析用チップ
JP5092405B2 (ja) 選択結合性物質固定化担体
JP6187259B2 (ja) 溶液の攪拌方法
JP2007304094A (ja) 分析チップ
JP2007171030A (ja) 選択的結合性物質固定化基材
JP2011106897A (ja) 分析チップおよび溶液の攪拌方法
JP2015045579A (ja) 溶液の攪拌方法
JP2007114191A (ja) 分析チップ、分析方法及び分析キット
JP2007285927A (ja) 選択結合性物質固定化基材

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013513887

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13755655

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2861288

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20147018545

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14381715

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2013755655

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013755655

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112014017624

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112014017624

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20140717