JP4473007B2

JP4473007B2 - ハイブリダイゼーション方法

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Publication number: JP4473007B2
Application number: JP2004044766A
Authority: JP
Inventors: 千秋長浜; 敏則隅; 陽子大槻
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp; Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2004-02-20
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2024-02-20
Also published as: JP2005229934A

Description

本発明は、ハイブリダイゼーション方法およびそれに用いるハイブリダイゼーション用チャンバに関するものである。

現在、ヒトゲノムの解読が進み、様々な疾病や体質と特定の遺伝子配列との因果関係が明らかにされつつある。それにより、遺伝子配列を基に、例えば、発病の予測、薬剤に対する副作用の予測等を行うことが可能になると考えられている。

古くから使用されている遺伝子の分析手段としては、ゲルを媒体とした電気泳動法が知られている。さらに、近年、より微量の生物試料を短い時間で分離分析するために、キャピラリーゲル電気泳動法が開発され、利用されている。このキャピラリーゲル電気泳動では、ガラス製キャピラリーが使用され、このキャピラリーの中にアクリルアミド等のハイドロゲルを充填したものが使用されている。

また、多数の遺伝子の変異及び発現量を一括して検出できる有用なツールとして、キャプチャープローブであるＤＮＡが平面基板片上に複数保持されたマイクロアレイ又はチップが利用されている。このマイクロアレイを利用した遺伝子の分析方法においては、平面基板片上に多数のＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられる。この方法では、平面基板片上に固定化された個々のＤＮＡ断片に対して、遺伝子等の検体を作用させ、核酸と核酸との間のハイブリダイゼーション反応を利用して核酸を検出し、定量化を行っている。具体的には、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識して、このサンプルを含有した検体溶液を準備しておき、この検体溶液をマイクロアレイである平面基板片上に作用させる。検体溶液をマイクロアレイに作用させると、平面基板片上に固定化されたＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片と互いに相補的な検体溶液に含まれている核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）が、ハイブリダイゼーション反応により結合する。研究対象細胞の発現遺伝子は蛍光色素等で標識されているので、平面基板片上に固定化されたＤＮＡ断片と検体溶液に含まれている核酸が結合すると、平面基板片上の核酸が結合した箇所に蛍光が表れる。この蛍光を高解像度解析装置で高速に読みとることにより、検体溶液中の核酸が、平面基板片上に固定化されたどのＤＮＡ断片とハイブリダイゼーション反応を起こしたかを特定することができる。

特開２０００−２７０８７７号公報（特許文献１）、特開２０００−２７０８７８号公報（特許文献２）、特開２０００−２７０８７９号公報（特許文献３）には、上記のように使用されるマイクロアレイが記載されている。これらのマイクロアレイは、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲルを保持した中空繊維配列体を作製し、該配列体の繊維軸と交差する方向に切断することにより形成されている。

また、マイクロアレイに固定されたＤＮＡ断片と、検体溶液中の核酸をハイブリダイゼーションさせる操作は、グラスアレイにおいては、従来は実験者が手作業でマイクロアレイに検体溶液を添加し、その上にカバーガラスをかぶせることで行われている。

一方、特開２００３−１９４８２２号公報（特許文献４）、特開２００３−７９３９８号公報（特許文献５）、及び特開２００３−８３９６４号公報（特許文献６）には、検体溶液をマイクロアレイに均一に作用させる方法及び装置が記載されている。特許文献４には、マイクロアレイを機械的に振動させることができるハイブリダイゼーション装置が記載されている。また、特許文献５には、マイクロアレイに気泡が付着するのを防止するために、プラスチックバッグ内のハイブリダイゼーション溶液をローラーによって強制的に撹拌する方法が記載されている。さらに、特許文献６には、超音波を用いてハイブリダイゼーション溶液を撹拌する方法が記載されている。

特開２０００−２７０８７７号公報特開２０００−２７０８７８号公報特開２０００−２７０８７９号公報特開２００３−１９４８２２号公報特開２００３−７９３９８号公報特開２００３−８３９６４号公報

しかしながら、実験者が手作業でマイクロアレイに検体溶液を添加し、その上にカバーガラスをかぶせる操作は、カバーガラスに気泡が残る、ハイブリダイゼーション中にカバーガラスに塩が析出する等の問題がある。特に、カバーガラスに塩が析出した場合には、蛍光を解析するための画像のバックグランドノイズが上昇する等の問題を引起こす。さらに、実験者が手作業で行う操作は、実験者の熟練度に影響される点が多く、多数のスポット領域に均一にハイブリダイゼーションを起こさせることが困難であり、その結果、核酸検出の十分な感度、データの再現性を得るのが難しいという問題がある。

また、特許文献４乃至６に記載のハイブリダイゼーション装置、方法を使用することによって、気泡の付着を防止し、検体溶液をマイクロアレイに均一に作用させることは可能になるが、マイクロアレイを揺動させる装置、マイクロアレイに超音波を作用させる装置等、特殊な装置を用意しなければならないという問題がある。

また、特許文献４乃至６に記載のハイブリダイゼーション装置、方法においては、検体溶液をマイクロアレイに均一に作用させるためには、マイクロアレイ全体を検体溶液中に浸漬する必要がある。このため、マイクロアレイ上に配置されたＤＮＡ断片を固定したスポット数が増加すると、検体溶液を薄めるための多くのハイブリバッファーが必要になり、これにより検体溶液中の検体であるＤＮＡ、ＲＮＡの濃度が低下する。検体濃度が低下すると、マイクロアレイ上に配置されたＤＮＡ断片と結合する検体の数が低下するので、ハイブリダイゼーション反応によって発生するシグナル強度が低下し、解析の感度が低下するという問題がある。

したがって、本発明は、感度および再現性に優れた遺伝子解析を行うことができるハイブリダイゼーション方法およびハイブリダイゼーション用チャンバを提供することを目的としている。

この目的を達成するために、本発明のハイブリダイゼーション方法は、マイクロアレイ及びハイブリダイゼーション用チャンバを準備する工程と、ハイブリダイゼーション用チャンバの中にマイクロアレイを配置する工程と、マイクロアレイが配置されたハイブリダイゼーション用チャンバ内の空間の一部を残して、ハイブリダイゼーション溶液をハイブリダイゼーション用チャンバ内に注入する工程と、ハイブリダイゼーション用チャンバ内のハイブリダイゼーション溶液によって満たされていない空間の位置が変化するように、ハイブリダイゼーション用チャンバを回転させる工程と、を有することを特徴としている。

このように構成された本発明においては、内部にマイクロアレイを配置したハイブリダイゼーション用チャンバに、ハイブリダイゼーション溶液が注入される。この際、ハイブリダイゼーション用チャンバ内の空間にハイブリダイゼーション溶液を完全に充填せずに、空間の一部を残してハイブリダイゼーション溶液を注入する。次に、ハイブリダイゼーション用チャンバを回転させながら、ハイブリダイゼーション反応を生起させる。ハイブリダイゼーション用チャンバが回転すると、チャンバ内のハイブリダイゼーション溶液によって満たされていない空間の位置が変化するので、チャンバ内のハイブリダイゼーション溶液が効果的に攪拌される。
このように構成された本発明によれば、感度および再現性に優れたハイブリダイゼーション反応を生起させることができる。

本発明において、好ましくは、ハイブリダイゼーション溶液をハイブリダイゼーション用チャンバ内に充填する工程において、マイクロアレイが配置されたハイブリダイゼーション用チャンバ内の空間の３０乃至９０％にハイブリダイゼーション溶液が充填される。
このように構成された本発明によれば、ハイブリダイゼーション用チャンバ内のハイブリダイゼーション溶液を、効率良く攪拌することができる。

本発明において、好ましくは、ハイブリダイゼーション用チャンバを回転させる工程において、０．１乃至１００ｒｐｍの回転速度でハイブリダイゼーション用チャンバが回転される。
このように構成された本発明によれば、ハイブリダイゼーション用チャンバ内のハイブリダイゼーション溶液を、効率良く攪拌することができる。

本発明において、好ましくは、マイクロアレイが、その複数の貫通孔に生体関連物質を固定化させたものである。
このように構成された本発明によれば、マイクロアレイの基板の両面からハイブリダイゼーション反応が生起するので、ハイブリダイゼーション反応を効率的に生起させることができる。

本発明のハイブリダイゼーション方法およびハイブリダイゼーション用チャンバによれば、感度および再現性に優れた遺伝子解析を行うことが可能になる。

次に、図１乃至５を参照して、本発明の実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバを説明する。図１は、本実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバをチャンバ本体部とチャンバ蓋部に分解して示した斜視図である。また、図２は、ハイブリダイゼーション用チャンバ内に収容されるマイクロアレイホルダをホルダ本体部とホルダ蓋部に分解して示した斜視図である。図３は、マイクロアレイホルダに支持されるマイクロアレイ及びマイクロアレイを支持したマイクロアレイホルダの斜視図である。

図１に示すように、ハイブリダイゼーション用チャンバ１は、マイクロアレイを内部に収容するチャンバ本体部２と、この本体部に蓋をするチャンバ蓋部４とを有する。チャンバ本体部２は、その中央に、マイクロアレイホルダを受け入れるための長方形の凹部２ａが形成され、この凹部２ａの底面には、パッキンを受け入れるための環状長方形の溝２ｂが形成されている。さらに、チャンバ本体部２の凹部２ａの周囲には、チャンバ蓋部４を取付けるためのボルトを螺合させる４つの雌ネジ穴２ｃが形成されている。また、凹部２ａの底面中央に、ガラス又は透明樹脂製の本体部窓６が取付けられており、外からチャンバの内部を見ることができるようになっている。

チャンバ蓋部４は、長方形板状の形状を有し、中央部にはパッキンを受け入れるための環状長方形の溝４ａが形成されている。この溝４ａの環の内側には、検体溶液を注入するための注入孔４ｂが形成されている。また、溝４ａの周囲には、チャンバ蓋部４をチャンバ本体部２に取付けるためのボルトを通す４つの穴４ｃが、雌ネジ穴２ｃに対応した位置に形成されている。さらに、チャンバ蓋部４の中央には、ガラス又は透明樹脂製の窓８が設けられており、外からチャンバの内部を見ることができるようになっている。

図２に示すように、マイクロアレイホルダ１０は、ホルダ本体部１２と、ホルダ蓋部１４とを有する。これらのホルダ本体部１２及びホルダ蓋部１４は、チャンバ本体部２の凹部２ａの中に隙間なく受け入れられる寸法、形状に構成されている。ホルダ本体部１２は、その中央にホルダ蓋部１４を受け入れるための長方形の第１凹部１２ａを有し、この第１凹部１２ａの底面中央には、マイクロアレイを受け入れるための長方形の第２凹部１２ｂが形成されている。この第２凹部１２ｂは、保持すべきマイクロアレイを隙間なく受け入れる寸法、形状に構成されている。さらに、第２凹部１２ｂの中央には、マイクロアレイを保持したとき、マイクロアレイに形成されたスポットを露出させるための長方形のホルダ本体開口部１２ｃが形成されている。また、チャンバ内で検体溶液が流れるように、長方形のホルダ本体切欠部１２ｄが、ホルダ本体開口部１２ｃの対向する２つの辺から両側に夫々延びている。さらに、各ホルダ本体切欠部１２ｄの両側には、ホルダ蓋部１４に設けられたピンを受け入れるためのピン孔１２ｅが夫々形成されている。

ホルダ蓋部１４は長方形板状の形状を有し、ホルダ本体部１２の第１凹部１２ａに隙間なく受け入れられる寸法及び形状に構成されている。ホルダ蓋部１４の中央には、ホルダ本体開口部１２ｃと同一の大きさのホルダ蓋開口部１４ａが形成されている。また、このホルダ蓋開口部１４ａの対向する２つの辺から、長方形のホルダ蓋切欠部１４ｂが両側に夫々延びている。さらに、ホルダ蓋切欠部１４ｂの両側には、ホルダ本体部１２のピン孔１２ｅに受け入れられる４本のピン１４ｃが、ピン孔１２ｅに対応した位置に夫々設けられている。

図３（ａ）に示すように、本発明の実施形態によるハイブリダイゼーション方法に使用されるマイクロアレイ１６は、正方形の板状であり、その中央付近には、複数のスポット１８が、整列して形成されている。なお、図３（ａ）では、マイクロアレイ１６には９つのスポット１８しか図示されていないが、実際には、マイクロアレイ上には多数のスポットが形成されている。また、図３（ａ）では、マイクロアレイ１６は正方形の板状であるが、その形状に制限はなく、任意形状のマイクロアレイ１６を使用することができる。本実施形態においては、マイクロアレイ１６は、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲルを保持した中空繊維配列体を作成し、この配列体を、その繊維の軸線方向と交差する方向に切断することによって作成されており、各スポット１８がゲルを保持した中空繊維によって構成され、マイクロアレイ１６の両面に露出した貫通孔タイプである（ＷＯ０１／９８７８１号公報参照）。

図３（ｂ）に示すように、マイクロアレイ１６を使用するときは、マイクロアレイ１６をホルダ本体部１２の第２凹部１２ｂの中に配置し、次いで、ホルダ蓋部１４のピン１４ｃがホルダ本体部１２のピン孔１２ｅに受け入れられるように、ホルダ蓋部１４をホルダ本体部１２の第１凹部１２ａの中に配置する。これにより、マイクロアレイ１６は第２凹部１２ｂの中に、ホルダ蓋部１４は第１凹部１２ａの中に、夫々ガタなく受け入れられる。また、ホルダ本体部１２にはホルダ本体開口部１２ｃが、ホルダ蓋部１４にはホルダ蓋開口部１４ａが形成されているので、マイクロアレイ１６上に配置されている各スポット１８は、マイクロアレイホルダ１０によって覆われることなく、露出している。なお、本実施形態において、マイクロアレイホルダ１０及び凹部２ａは、マイクロアレイの支持機構を構成する。

次に、図４及び５を参照して、本発明の実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバ１の使用方法を説明する。図４は本実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバ１の中に、マイクロアレイ１６を収容したマイクロアレイホルダ１０を配置した様子を示す断面図であり、図５はマイクロアレイホルダ１０を収容したハイブリダイゼーション用チャンバ１の中に、検体溶液を注入した様子を示す断面図である。

図４に示すように、ハイブリダイゼーション用チャンバ１の中にマイクロアレイホルダ１０を配置する場合には、チャンバ本体部２に形成された溝２ｂの中にパッキン２０を嵌め込み、その上にマイクロアレイホルダ１０を配置する。次に、溝４ａにパッキン２２を嵌め込んだチャンバ蓋部４を、チャンバ本体部２の上に被せ、チャンバ蓋部４に形成された穴４ｃにボルト２４を通してボルト２４を雌ネジ穴２ｃに螺合させる。これにより、マイクロアレイホルダ１０はパッキン２０及び２２と密着し、チャンバ本体部２とチャンバ蓋部４が密着する。この構造により、検体溶剤は、マイクロアレイホルダ１０とチャンバ本体部２の間のパッキン２０及びマイクロアレイホルダ１０とチャンバ蓋部４の間のパッキン２２によって、ハイブリダイゼーション用チャンバ１の中に密封される。また、チャンバは、ホルダ本体開口部１２ｃ及びホルダ蓋開口部１４ａによって形成される空間、及びこれらの空間を連通させるホルダ本体切欠部１２ｄ及びホルダ蓋切欠部１４ｂによって形成される空間によって構成される。さらに、図４に示すように、本体部窓６及び窓８は、チャンバ本体部２及びチャンバ蓋部４と夫々同一面を形成するように取付けられている。従って、マイクロアレイ１６の基板表面から向い合うチャンバ壁面までの距離は、ホルダ本体開口部１２ｃが形成されている部分の厚さ（ホルダ本体１２の全厚さから第１凹部１２ａ及び第２凹部１２ｂの深さを減じた厚さ）及びホルダ蓋部１４の厚さによって夫々規定される。本実施形態においては、この距離は５００μｍである。好ましくは、この距離は５０乃至１０００μｍとする。さらに好ましくは、この距離は、１００乃至５００μｍとする。この距離が５０μｍよりも小さいと、検体溶液の表面張力により、検体溶液がチャンバ内で移動し難くなり、検体溶液を十分に攪拌することができない。また、この距離が１０００μｍよりも大きくなると、チャンバ内の空間が大きくなるので、多くの検体溶液が必要になり、検体溶液の濃度を低下させる必要が生じてしまう。

図５に示すように、マイクロアレイ１６を収容したハイブリダイゼーション用チャンバ１の中に、注入孔４ｂを介して検体溶液Ｓを注入した後、注入孔４ｂにキャップ２７を挿入して、チャンバを密閉する。このとき、チャンバの内容積の３０乃至９０％の体積の検体溶液Ｓを注入するのが良い。これは、一般的なグラスアレイにおいては、スポット領域全面がハイブリダイゼーション溶液に浸漬していなければならないが、本実施形態によるハイブリダイゼーション方法においては、スポット領域全面がハイブリダイゼーション溶液に浸漬していなくても良いためである。さらに好ましくは、チャンバの内容積の５０乃至８０％の体積の検体溶液Ｓを注入するのが良い。この注入する検体溶液Ｓの体積が３０％よりも少ないと、検体溶液Ｓの量が不足して、検体溶液Ｓがマイクロアレイ１６全体に行き渡らなくなるので、ハイブリダイゼーションによって得られたデータの再現性が低下する。また、検体溶液Ｓの体積が９０％よりも多いと、チャンバ内の検体溶液Ｓで満たされていない空気相の空間が少なくなり、検体溶液Ｓの攪拌効果が低下してしまう。

次に、図５に示すように、検体溶液Ｓを注入したハイブリダイゼーション用チャンバ１を、少なくとも１本の回転軸線を中心に回転させ、検体溶液Ｓを攪拌しながらハイブリダイゼーション反応させる。ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させると、マイクロアレイ１６とチャンバ本体部２の間にある検体溶液は、マイクロアレイ１６の両側にあるホルダ本体切欠部１２ｄ及びホルダ蓋切欠部１４ｂを通ってマイクロアレイ１６とチャンバ蓋部４の間の空間へ流れ、またその逆に流れる等、チャンバ内を自由に流れる。本実施形態において、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる回転速度は、０．１乃至１００ｒｐｍにするのが良い。さらに好ましくは、１乃至１０ｒｐｍでハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる。これは、回転速度が０．１ｒｐｍよりも小さいと、空気相の移動が少なく十分な攪拌効果が得られないためであり、また、回転速度が１００ｒｐｍよりも大きいと、検体溶液Ｓに働く遠心力が大きくなり過ぎて、かえって空気相の移動が少なくなり攪拌効果が低下するためである。

図６及び７は、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる回転装置の一例を示す。図６は回転装置の斜視図であり、図７（ａ）は回転装置の全断面図、図７（ｂ）は側面図である。図６及び７に示すように、回転装置３０は、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を収容する回転本体３２と、回転本体３２を回転させる回転軸３４と、回転本体３２に収容されたハイブリダイゼーション用チャンバ１を押さえる押えプレート３６とを有する。更に、回転装置３０は、押えプレート３６を固定するロックプレート３８と、回転本体３２を回転軸３４上に固定するセットカラー４０、４２と、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転本体３２内部で位置決めするスペーサリング４４と、を有する。回転本体３２は、その中心に回転軸３４を通すための穴３２ａが形成され、この穴３２ａから放射状に等間隔に延びる６つの収容凹部３２ｂが設けられている。

回転装置３０によってハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる際には、スペーサリング４４を回転本体３２の内部にセットし、各収容凹部３２ｂの中にハイブリダイゼーション用チャンバ１を配置する。図７（ａ）は、６つの収容凹部３２ｂのうちの３つにハイブリダイゼーション用チャンバ１を配置した様子を示している。各収容凹部３２ｂにハイブリダイゼーション用チャンバ１を配置した後、押えプレート３６を回転本体３２に載せ、ロックプレート３８を取付けて、ハイブリダイゼーション用チャンバ１が収容凹部３２ｂから脱落しないように押さえる。次いで、回転軸３４を回転本体３２の穴３２ａに通し、回転本体３２をセットカラー４０、４２で両側から挟んで、回転軸３４上に固定する。ハイブリダイゼーション用チャンバ１のセットが完了した後、回転軸３４を水平方向に配向した状態で、モータ（図示せず）により回転軸３４を回転駆動することにより、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる。

ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転装置３０で回転させることにより、ハイブリダイゼーション用チャンバ１は、図５において、紙面と平行な水平方向の軸線であるＸ軸の周囲を公転するので、チャンバ内の検体溶液Ｓで満たされていない空間の位置が移動する。また、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる軸線は、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を横切るＸ軸と平行な軸線であっても良く、或いは、図５において、紙面と直角な水平方向の軸線であるＹ軸であっても良い。

このように、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる回転軸線は、その回転軸線を中心としたハイブリダイゼーション用チャンバ１の回転により、チャンバ内の空気相が移動するような回転軸線であれば任意に選択することができる。さらに、回転軸線の数は２以上でも良い。例えば、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を、その重心を通る第１の回転軸線を中心に自転させながら、チャンバの外部を通る第２の回転軸線を中心に公転させるようにしてもよい。また、市販されているハイブリダイゼーション用オーブン、例えば、Hybaid社製のシェイク＆スタックHB-MOVCST等の回転架台を使用してハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させても良い。ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させる装置として任意の装置を用いることができる。

次に、図８乃至１１を参照して、本実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバを使用して実際にハイブリダイゼーションを行った実験例を説明する。
（１）実施例１
まず、外径１３ｍｍ、内径９ｍｍのポリカーボネートパイプを用いて、プリフォーム延伸法により、外径０．３０ｍｍ、内径０．１８ｍｍ、長さ１５０ｍｍのポリカーボネート製中空繊維を製造した。
次に図８に示すように、配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図中のｘ、ｙ、ｚは直交の３次元軸であり、ｘ軸は繊維の長手方向と一致している。
まず、縦横各１０列で合計１００個の孔５２を設けた厚さ０．１ｍｍの多孔板５０を２枚準備した。なお、孔５２の直径は０．３２ｍｍであり、孔５２の中心間距離は０．４２ｍｍである。これらの多孔板５０を重ね合わせ、そのすべての孔５２に、上記のように延伸法によって得られた中空繊維５４を１本づつ、通過させた。

各中空繊維５４のｘ軸方向に０．１Ｎの張力をかけた状態で２枚の多孔板５０の位置を移動させ、多孔板５０を中空繊維５４の一方の端部から２０ｍｍの位置と１００ｍｍの位置の２ヶ所に固定した。即ち、２枚の多孔板５０の間隔を８０ｍｍとした。
次いで、多孔板５０の間の空間の両側面及び底面を３枚の板状物５６（底面の板状物５６は図示せず。）で囲い、上部のみ開口した容器を形成した。次に、この容器の上部開口部から容器内に樹脂原料を流し込んだ。樹脂としては、ポリウレタン樹脂接着剤（日本ポリウレタン工業（株）ニッポラン4276、コロネート4403）の総重量に対し、２．５質量％のカーボンブラックを添加したものを使用した。２５゜Ｃで１週間静置して樹脂を硬化させた。次いで、図９に示すように、多孔板５０と３枚の板状物５６を取り除くことにより、中空繊維束５８を得た。
得られた中空繊維束５８をデシケーター中に入れ内部を窒素置換した後、１６時間静置することで、ポリウレタン樹脂接着剤中の酸素濃度を低下させた。次に合成機DNA/RNA synthesizer (model394)（ＰＥバイオシステムズ社製）を用いて、オリゴヌクレオチドＡ（配列番号１）を合成した。これらは、一般的手法によって脱保護及び精製して使用した。
配列番号１：cggtcaacga tcgcggagag agaatcttgg atttggtgcc aagtcatatc catgacaaat cttct

得られたオリゴヌクレオチドＡ（５００ｎｍｏｌ／ｍｌ）５０μｌ、グリシジルメタクリレート５μｌ及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５μｌを混合し、７０゜Ｃで２時間反応させ、水１９０μｌを加えて、１００ｎｍｏｌ／ｍｌのメタクリレート基を有するオリゴヌクレオチドＡ（MA-OligoA）を得た。
次に、表１に示す質量比で混合した単量体及び開始剤を含むゲル前駆体重合性溶液を調製した。

この溶液に対して、MA-OligoAを５ｎｍｏｌ／ｍＬとなるように添加した。次に、キャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を前述のデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束５８の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部にキャプチャープローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、デシケーターの容器内を７０゜Ｃとし、３時間かけて重合反応を行った。このようにしてキャプチャープローブがゲル状物を介して中空繊維の中空部に保持された中空繊維束５８を得た。得られた中空繊維束５８を、ミクロトームを用いて繊維の長手方向と直交する方向でスライスし、厚さ０．５ｍｍの中空繊維配列体薄片を５０枚得た。
また、図１０は、中空繊維配列体薄片のアレイデザインを示し、図中の「１」で示したスポットはオリゴヌクレオチドＡを搭載したスポットであり、「Ｂ」で示したスポットはオリゴヌクレオチドＡを搭載していないスポットである。

このようにして得られた中空繊維配列体薄片であるマイクロアレイ１６をマイクロアレイホルダ１０に装着し、このマイクロアレイホルダ１０をハイブリダイゼーション用チャンバ１の内部に収容した。マイクロアレイホルダ１０を収容した状態で、ハイブリダイゼーション用チャンバ１内の空き空間は１２０μＬ（マイクロリットル）になった。この実施例では、検体溶液であるハイブリダイゼーション溶液として、ハイブリダイゼーションバッファーである６×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）に、オリゴヌクレオチドＡに相補的な配列で５'末端がｃｙ３で標識されたオリゴヌクレオチドＢを８０ｆｍｏｌ（フェムトモル）溶解したものを、ハイブリダイゼーション用チャンバ１の中に８０μＬ添加した。従って、ハイブリダイゼーション用チャンバ１内の空き空間の２／３（６６．６７％）にハイブリダイゼーション溶液が注入されたことになる。

次に、ハイブリダイゼーション溶液を注入したハイブリダイゼーション用チャンバ１を、ハイブリダイゼーションオーブンの回転架台にセットし、５ｒｐｍで回転させながら３７゜Ｃで２０時間ハイブリダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション完了後、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を開けてマイクロアレイを取り出し、１０ｍＬ（ミリリットル）の２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳによって４５゜Ｃで２０分間の洗浄を２回行った。さらに、洗浄後のマイクロアレイを２×ＳＳＣ溶液中で保存した。

次に、洗浄の完了したマイクロアレイの各スポットの蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定には、三菱レイヨン社製ＤＮＡチップ検出器を使用した。蛍光強度の測定に際しては、まず、マイクロアレイをスライドガラス上に置き、滅菌水をマイクロアレイに滴下し、気泡が入らないようにカバーグラスを被せ、このスライドガラスを検出器にセットした。次に、５００ｍｓｅｃの間光を照射し、マイクロアレイ上の全てのスポットの蛍光強度を測定した。

図１０に示したように、本実施例においては、１００個のスポットのうち、５０個にオリゴヌクレオチドＡが搭載されており、残りの５０個のスポットには、オリゴヌクレオチドＡは搭載されていない。オリゴヌクレオチドＡが搭載されたスポットには、蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチドＢがハイブリダイゼーションによって結合する。従って、オリゴヌクレオチドＡが搭載されている５０個のスポットの蛍光強度の平均値から、オリゴヌクレオチドＡが搭載されていない５０個のスポットの蛍光強度の平均値を減じた値が、ハイブリダイゼーションに由来する蛍光量であり、これがハイブリダイゼーションの度合いを表すシグナル強度と考えられる。オリゴヌクレオチドＡが搭載されている５０個のスポットのシグナル強度の平均値は２９８２、標準偏差は４４１、標準偏差をシグナル強度で除したＣＶ値は１５％となった。また、データの再現性を調べるために同一の条件でもう一度ハイブリダイゼーションを行った結果、平均値は３０８９、標準偏差は３６０、ＣＶ値は１２％となった。

（２）実施例２
実施例１と同様の方法で、縦１９列、横１２列の合計２２８スポットのマイクロアレイである中空配列体薄片を作成した。このマイクロアレイのアレイデザインを図１１に示す。図中の「１」で示したスポットはオリゴヌクレオチドＡを搭載したスポットであり、「Ｂ」で示したスポットはオリゴヌクレオチドＡを搭載していないスポットである。このマイクロアレイをマイクロアレイホルダ１０にセットし、このマイクロアレイホルダをハイブリダイゼーション用チャンバ１に収容すると、チャンバ内の空間の容積は、１２０μＬになった。また、ハイブリダイゼーションバッファー６０μＬに６０ｆｍｏｌのオリゴヌクレオチドＢを加えた６０μＬのハイブリダイゼーション溶液をチャンバ内に注入した。従って、チャンバ内の空間の５０％の容積のハイブリダイゼーション溶液をハイブリダイゼーション用チャンバ１に注入したことになる。他の条件であるハイブリダイゼーションバッファー、ハイブリダイゼーションの温度、時間、回転数、ハイブリダイゼーション後の洗浄は、実施例１と同一の条件で行った。ハイブリダイゼーションの結果を表２に示す。

（３）比較例１
比較例１として、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を回転させない点以外は実施例１と同一の条件で、実験を行った。即ち、比較例１では、ハイブリダイゼーション用チャンバ１を図５に示す状態に静置してハイブリダイゼーションを行っている。ハイブリダイゼーションの結果を表２に示す。

（４）比較例２
比較例２として、実施例２と同一のマイクロアレイを使用し、ハイブリダイゼーションバッファー１２０μＬに１２０ｆｍｏｌのオリゴヌクレオチドＢを加えた１２０μＬのハイブリダイゼーション溶液をチャンバ内に注入した。従って、ハイブリダイゼーション用チャンバ１内の空間の１００％の容積、即ち、チャンバ内の空間すべてにハイブリダイゼーション溶液を充填したことになる。比較例２においては、ハイブリダイゼーション用チャンバは回転させておらず、ハイブリダイゼーションバッファー、ハイブリダイゼーションの温度、時間、ハイブリダイゼーション後の洗浄等の他の条件は、実施例１と同一の条件で行った。このように、ハイブリダイゼーション用チャンバを静置して行った比較例２のハイブリダイゼーションの結果を表２に示す。

表２に示すように、実施例１と比較例１を比較すると、これらは同等のシグナル強度が得られていることがわかる。また、ＣＶ値は、実施例１の方が比較例１よりも値が小さいので、本発明の実施形態によるハイブリダイゼーション方法の方が従来の方法よりもマイクロアレイ内の再現性が格段に高いことがわかる。また、実施例２と比較例２を比較すると、実施例２ではオリゴヌクレオチドＢの添加量が６０ｆｍｏｌであり、比較例２では１２０ｆｍｏｌであるにもかかわらず、実施例２の方が高いシグナル強度が得られていることがわかる。このことは、本発明の実施形態によるハイブリダイゼーション方法の方が従来の方法よりも感度が格段に高いことを示している。また、実施例２と比較例２のＣＶ値を比較すると、実施例２の方が比較例２よりも値が小さいので、本発明の実施形態によるハイブリダイゼーション方法の方が従来の方法よりもマイクロアレイ内の再現性が高いことがわかる。

さらに、本発明の実施形態によるハイブリダイゼーション方法では、特別な装置を使用することなく、単にハイブリダイゼーション用オーブンの回転架台等を利用するだけで容易に実施することができる。

以上、本発明の好ましい実施形態を説明したが、上述した実施形態に種々の変更を加えることができる。特に、上述した実施形態において、ハイブリダイゼーション用チャンバの特定の形態を説明したが、ハイブリダイゼーション用チャンバは、密閉された構造であり、内部にマイクロアレイを支持することができる構造であれば、任意の構造のものを使用することができる。例えば、上述したハイブリダイゼーション用チャンバでは、チャンバ本体部とチャンバ蓋部をボルトで密着させていたが、チャンバ本体部とチャンバ蓋部をクランプ等で密着させるように構成することもできる。

本発明の実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバをチャンバ本体部とチャンバ蓋部に分解して示した斜視図である。図１に示したハイブリダイゼーション用チャンバ内に収容されるマイクロアレイホルダをホルダ本体部とホルダ蓋部に分解して示した斜視図である。マイクロアレイホルダに支持されるマイクロアレイ及びマイクロアレイを支持したマイクロアレイホルダの斜視図である。本発明の実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバの中に、マイクロアレイを収容したマイクロアレイホルダを配置した様子を示す断面図である。マイクロアレイホルダを収容したハイブリダイゼーション用チャンバの中に、検体溶液を注入した様子を示す断面図である。ハイブリダイゼーション用チャンバを回転させる回転装置の斜視図である。ハイブリダイゼーション用チャンバを回転させる回転装置の（ａ）全断面図及び（ｂ）側面図である。中空繊維配列体の製造方法を示す斜視図である。製造された中空繊維配列体を示す斜視図である。中空繊維配列体薄片のアレイデザインの一例を示す。中空繊維配列体薄片のアレイデザインの他の一例を示す。

符号の説明

１本発明の実施形態のハイブリダイゼーション用チャンバ
２チャンバ本体部
４チャンバ蓋部
６本体部窓
８窓
１０マイクロアレイホルダ
１２ホルダ本体部
１４ホルダ蓋部
１６マイクロアレイ
１８スポット
２０パッキン
２２パッキン
２４ボルト
３０回転装置
３２回転本体
３４回転軸
３６押えプレート
３８ロックプレート
４０セットカラー
４２セットカラー
４４スペーサリング
５０多孔板
５２孔
５４中空繊維
５６板状物
５８中空繊維束

配列番号１：合成ＤＮＡ

Claims

マイクロアレイ及びハイブリダイゼーション用チャンバを準備する工程と、
上記ハイブリダイゼーション用チャンバの中に上記マイクロアレイを配置する工程と、
上記マイクロアレイが配置された上記ハイブリダイゼーション用チャンバ内の空間の一部を残して、ハイブリダイゼーション溶液を上記ハイブリダイゼーション用チャンバ内に注入する工程と、
上記ハイブリダイゼーション用チャンバ内の上記ハイブリダイゼーション溶液によって満たされていない空間の位置が変化するように、上記ハイブリダイゼーション用チャンバを回転させる工程と、
を有することを特徴とするハイブリダイゼーション方法。
上記ハイブリダイゼーション溶液を上記ハイブリダイゼーション用チャンバ内に充填する工程において、上記マイクロアレイが配置された上記ハイブリダイゼーション用チャンバ内の空間の３０乃至９０％に上記ハイブリダイゼーション溶液が充填される請求項１記載のハイブリダイゼーション方法。
上記ハイブリダイゼーション用チャンバを回転させる工程において、０．１乃至１００ｒｐｍの回転速度で上記ハイブリダイゼーション用チャンバが回転される請求項１又は２記載のハイブリダイゼーション方法。
上記マイクロアレイが、その複数の貫通孔に生体関連物質を固定化させたものである請求項１乃至３の何れか１項に記載のハイブリダイゼーション方法。