JP4390184B2 - キャピラリーアレイシートを用いた分析法に用いる用具及びその方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡマイクロアレイ等を用いた遺伝子発現解析等を実行するに際し、ハイ
ブリダイゼーション等の反応処理、洗浄処理、分析処理時におけるキャピラリーアレイシ
ートの損傷を防止し、マイクロアレイの取り扱いを向上させるための部品や処理、測定方
法に関するものである。

多数遺伝子の一括発現解析を行う方法としてＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法
）と呼ばれる分析法がある。この方法は、マイクロアレイと呼ばれる平面基板片上に、多
数のＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものを用い、個々の固定化されたＤＮＡ断片
において、核酸：核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出及び定量を行う方
法である。

マイクロアレイ法の使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素
等で標識したサンプルを含有した検体溶液をマイクロアレイに供し、ハイブリダイゼーシ
ョンを行い、互いに相補的な核酸同士を結合させ、ハイブリットを形成した区画を高解像
度解析装置で高速に読みとることにより、核酸検出及び定量を行う方法が挙げられる。

マイクロアレイは上述の平面基盤片のもの以外に、例えば、生体関連物質を検出しうる
物質が高分子ゲルに固定されており、該ゲルを保持した貫通孔部を複数含むキャピラリー
アレイシートが知られている。その製造方法は、例えば特許文献１に開示されている。

特許文献１には、複数本の中空糸を準備し、それら中空糸を束状とし、その束を樹脂等
で固定した中空糸配列体を作成し、その配列体の片端部から、キャプチャープローブを含
むアクリルアミド等の重合性モノマー溶液を各中空糸の中空部に導入し、中空部内で重合
した後、中空糸配列体の樹脂固定化部を中空糸の長手方向と交差する方向で切断を繰り返
すことによりキャピラリーアレイシートを製造する方法が開示されている。

キャピラリーアレイシートは、シート表面にキャプチャープローブが固定化された高分
子ゲルが露出しており、その反応処理、洗浄処理、分析処理において、表面に露出した繊
細なゲル部を損傷しないように十分注意して取り扱う必要がある。よって、適当な容器で
キャピラリーアレイシートを保護しなければならない。

マイクロアレイの収納容器としては、多種類の検出体がメンブレン上に配置固定された
マクロアレイの周縁を、支持具によって支持することでマクロアレイの取り扱い性を向上
させ、その支持具で保持されたマクロアレイを２対の容器ではさみ、マクロアレイと容器
で構成された空間の一方から検体溶液を注入し、マクロアレイの高い透水性を利用して検
体溶液を貫通流動させながらハイブリダイゼーション処理や洗浄処理を行う方法、それに
用いられる器具が開示されている。

しかし、特許文献２に開示されている方法及び器具を用いた方法では、反応処理、洗浄
処理において、検体溶液を、キャピラリーアレイシートを貫通流動させる手法を採用する
ことができない。

よって、キャプチャープローブが固定化された高分子ゲルが、表裏を貫通する複数の孔
部に充填された構造のキャピラリーアレイシートのハイブリダイゼーション処理、洗浄処
理に適した用具、手法の開発が望まれていた。
特開2001-133453号公報 特開2001-83158号公報

従って本発明の目的は、生体関連物質を検出しうる物質が高分子ゲルに固定されており
、該ゲルを保持した貫通孔部を複数含むキャピラリーアレイシートを用いた分析を実行す
るに際し、反応処理、洗浄処理、測定操作時におけるキャピラリーアレイシートの損傷を
防止し、それらの処理におけるキャピラリーアレイシートの取り扱いを向上させるための
部品や処理、測定方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意検討を行った結果、キャピラリーアレイシートを
、該キャピラリーアレイシートに含まれる高分子ゲルが露出可能な開口部を有し、開口部
と連結する切欠部を有する構造を含む、キャピラリーアレイシートホルダにより収納する
ことにより上記問題点が解決できることを見出した。

すなわち、本発明は、生体関連物質を検出しうる物質が高分子ゲルに固定されており、
該ゲルを保持した貫通孔部を複数含むキャピラリーアレイシートを１枚以上収納可能なホ
ルダであって、該ホルダは、収納された該キャピラリーアレイシートに含まれる高分子ゲ
ルが露出可能な開口部を有し、開口部と連結する切欠部を有する構造を含む、キャピラリ
ーアレイシートホルダ、である。

また、上記ホルダを反応処理に利用する際、キャピラリーアレイシートホルダの開口部
に液体を注入可能な注入口を有する収納容器に収納することにより、上記問題点を解決す
るに到った。即ち、本発明は、キャピラリーアレイシートホルダを収納する収納容器であ
って、収納容器には収納したキャピラリーアレイシートホルダの開口部に液体を注入可能
な注入口を有する、キャピラリーアレイシートホルダ収納容器、である。

さらに、上記の収納容器は、注入口が設けられ、注入口から検体溶液の添加が可能な構
造体となっている。すなわち、本発明は、生体関連物質を検出しうる物質が高分子ゲルに
固定されており、該ゲルを保持した貫通孔部を複数含むキャピラリーアレイシートを、請
求項１又は２記載のキャピラリーアレイシートホルダに収納し、該キャピラリーアレイシ
ートホルダを請求項３又は４記載のキャピラリーアレイシートホルダ収納容器に収納し、
検体溶液をキャピラリーアレイシートホルダ収納容器の注入口より注入し、検体との反応
を実施することを含むキャピラリーアレイシートの処理方法、である。

本発明のキャピラリーアレイシートホルダ、キャピラリーアレイシートホルダ収納容器
、洗浄用フレーム、検出ケースを用い、キャピラリーアレイシートの反応処理、洗浄処理
及び分析処理を行うことにより、キャピラリーアレイシートを操作する際に誤って繊細な
ゲル充填部を損傷したりする恐れがなく、取り扱い性も向上し、熟練した作業者でなくと
も簡単にキャピラリーアレイシートを用いた多数遺伝子の一括発現解析などを実施するこ
とができる。

以下、図面を使用して本発明を詳細に説明する。

図１は、本実施形態のキャピラリーアレイシートホルダ（以下、単にアレイホルダと称
する）の構成部品を示した斜視図である。アレイホルダ（１０）は、本体部（１１）と蓋
部（１２）から構成される。

本体部は、蓋部がはまり込む蓋収納溝（１１ａ）、蓋部と本体部を固定するためのピン
孔（１１ｂ）、キャピラリーアレイシートを収納するシート収納溝（１１ｃ）、キャピラ
リーアレイシートの高分子ゲルが露出可能な開口部（１１ｄ）が形成されている。

蓋部には、本体部のピン孔にはまるピン（１２ａ）、開口部（１２ｂ）が形成されてい
る。また本体部と蓋部には、本体部にキャピラリーアレイシートを収納し蓋をしたときに
貫通流路となる本体部切欠部（１１ｅ）、蓋部切欠部（１２ｃ）が形成されている。

図２は、キャピラリーアレイシート（以下、単にアレイと称する）及びアレイが収納さ
れた状態のホルダ（１１）を示す斜視図である。

アレイは、複数の貫通孔を有するシート状物により構成されている。各貫通孔の内部に
はゲルが保持されており、ゲルにはキャプチャープローブが固定されている。詳細な製造
方法の一例は、特開2001-133453号公報に記載されている。

アレイの収納は、本体部（１１）のシート収納溝（１１ｃ）にアレイ（２１）を挿入し
、蓋部（１２）を本体にはめ込むことにより実施される。収納された状態は、アレイのゲ
ル露出面（２１ａ）が表裏の開口部から露出しており、表裏の開口部を結ぶ貫通流路がキ
ャピラリーアレイシートを挟んで相対する２箇所に溝が形成される構造となっている。

ホルダを構成する材料としては、例えば、ハイブリダイゼーション反応、抗原抗体反応
等の検出反応を阻害する物質を含むものでなければ特に限定はない。たとえばポリプロピ
レン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネイトなどの熱可塑性の樹
脂材料を用い、射出成形などで安価に大量に製造することができる。

ここで、検出の際、蛍光検出を用いる場合、アレイホルダの自家蛍光が強いとＳ／Ｎ比
が低下し、検出精度が低下する。よって、自家蛍光が小さな素材を選択する必要がある。

自家蛍光が大きい素材でも、蛍光を吸収する添加剤、例えばカーボンブラック等を添加す
ると自家蛍光を大きく低減することができるため、そのような添加剤を添加したさまざま
な素材を用いることもできる。

図３は、キャピラリーアレイシートとキャピラリーアレイシートホルダのマーカー部の
模式図である。これは、図２のより好ましい形態である。即ち、ホルダにアレイを収納す
る際に、収納方向の間違わないために、アレイ（２１）に予め半円形の切り欠き部（２１
ｂ）を設けておき、アレイを収納するシート収納溝（１１ｃ）には、切り欠き部と互いに
ぴったりと嵌り合う半円形の突起部（１１ｆ）を設けている。

切り欠き部の形状は、例えば円形、多角形の切り欠きと、それと一致する突起の組み合
わせや、円形、多角形の穴と、それと一致する突起の組み合わせでも良い。このようなマ
ーカー部を予め定められた方向、定められた面でしか嵌り合わない位置に設けておくこと
で、シート収納溝へアレイを収納する際、向きや表裏を間違って挿入することを防ぐこと
ができる。

図４は、複数枚のアレイを収納するアレイホルダの模式図である。このアレイホルダは
、複数のシート収納溝（４１ａ）を有する本体部（４１）及び、それにはまる蓋部（４２
）から構成されている。ここで、本体部と蓋部には、図１で示した場合と同様、アレイの
ゲルを露出させるための開口部と、隣接した開口部をつなぐ流路を兼ねた、本体開口流路
（４１ｂ）、蓋開口流路（４２ａ）が設けられ、それらの開口流路両端部には、本体と蓋
の開口流路をつなぐ貫通流路となる本体部の切欠部（４１ｃ）、蓋部の切欠部（４２ｂ）
が設けられる。

次に、本発明においてアレイホルダを収納するための、キャピラリーアレイシートホル
ダ収納容器（以下、単にホルダ収納容器と称する）について図５及び図６を用いて説明す
る。

図５は、ホルダ収納容器（５０）を示した模式図である。ホルダ収納容器（５０）は、
容器部（５１）及び蓋部（５２）より構成され、容器部にはアレイホルダを収納するホル
ダ収納溝（５１ａ）、パッキンを挿入するためパッキン溝（５１ｂ）、ボルトをねじ込む
ためのネジ孔（５１ｃ）がある。蓋部には検体溶液を注入するための表裏を貫通する注入
口（５２ａ）、パッキンを収納するためのパッキン溝（５２ｂ）、ボルトを貫通させるボ
ルト貫通穴（５２ｃ）有している。

図６は、アレイホルダが収納されたホルダ収納容器のＸ−Ｙ方向の断面図である。ボル
ト（６１）をボルト貫通穴（５２ｃ）を貫通させ、予めホルダ収納容器に設けられたネジ
穴（５１ｂ）にねじ込むことで、本体と蓋に設けられたパッキン溝に挿入されているパッ
キン（６２）が、キャピラリーアレイシートホルダ上下面と密着し、開口部に検体溶液を
溜める空間を形成することになる。キャピラリーアレイシートホルダとキャピラリーアレ
イシートホルダ収納容器を密着させる方法として、図示したように蓋と容器を直接ボルト
で締結する以外に、例えばクランプの様な物で挟み込んで圧着しても良い（図７参照）。

また、アレイホルダとホルダ収納容器の接触面をシールするパッキンの配置は、注入し
た検体溶液が外部に漏れない位置、例えばホルダ収納容器の、容器と蓋の接触する面に配
置したり、パッキンがキャピラリーアレイシートホルダ外周をぐるりと取り囲み、パッキ
ンの上下面が容器と蓋に密着する位置が挙げられる。

好ましい配置としては、アレイホルダ本体に蓋がはめ込まれている表面は、パッキンが
本体と蓋の嵌め合わせの継ぎ目のすぐ側を取り囲むように、本体の裏面はパッキンが開口
部と蓋切り欠き部のすぐ側を取り囲むように配置する。

このような配置とすると、アレイホルダの蓋がホルダ収納容器とアレイホルダの本体と
パッキンで形成される空間に包み込まれ、毛細管現象でアレイホルダとホルダ収納容器の
微小な隙間に検体溶液が吸い上げられる部分を減少させることができる。

さらに、容器部と蓋部のアレイホルダの開口部が接触する部分に、ガラスや透明樹脂製
の窓（６３）を設けることで、ホルダ収納容器にアレイホルダを収納したまま、内部のア
レイホルダの開口部を観察することができる。また、ホルダ収納容器の本体部と蓋部の双
方に透明性の高いガラス、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリメチルメ
タクリレート、ポリカーボネイト、ポリスルホン等を用いると構造が単純化でき好ましい
。

つぎに図６のアレイが収納されたホルダ収納容器を使用した検体との反応処理を図７に
沿って説明する。

図７は、キャピラリーアレイシートホルダ収納容器を使用した反応手順を示した模式図
である。まずアレイが収納されたホルダ収納容器（７０）に、ホルダ収納容器を直立させ
たときに、アレイの高分子ゲル部が浸漬するのに必要な最少量の検体を、ピペッター等の
分注器具（７２）により、蓋部の注入口（５２ｂ）よりアレイホルダの開口部に検体溶液
を注入する。注入口に栓（７３）で注入口を封止し、アレイホルダと収納容器で形成され
た空間を密閉する。

次に、ホルダ収納容器（７０）の注入口を上側とし、直立させ、該容器内部のアレイホ
ルダの開口部から露出している高分子ゲル部に気泡などが付着していないかどうか観察を
行う。もし気泡などの付着があれば、収納容器自体を振動させる、又は注入口を中心方向
にして遠心力を作用させる等により気泡を除去する。その後、ホルダ収納容器の注入口を
上にして直立させたままの状態で検体溶液との反応を実施する。

反応条件は、使用するキャプチャープローブの種類、検体の種類等により適宜選択され
る。例えば、一定温度で反応を進行される場合、ホルダ収納容器を恒温槽内に静置するこ
とも可能である。

反応終了後、容器内のアレイを洗浄する必要がある。図９〜図１１に従って、その洗浄
に使用する容器及び洗浄方法を説明する。

図８は、洗浄の際に使用する洗浄フレームを示す模式図である。検体との反応が終了し
たアレイ（２１）を収納したアレイホルダ（１０）を、洗浄用フレーム（９１）の側面開
口部（９１ａ）から、アレイホルダ（１０）を装着する。その際、アレイホルダ（２０）
がフレーム（９１）から脱落しないように、開口部（９１ａ）には、ホルダガイド（９１
ｂ）が設けられている。

また、図９では、アレイホルダ（１０）を、洗浄用フレーム（１０１）の底面開口部（
１０１ａ）から、アレイホルダを挿入する場合を例示している。その際も、図９で説明し
た場合と同様にアレイホルダの脱落を防止するため、ホルダガイド（１０１ｂ）が設けら
れている。

脱落を防止するためのガイドとしては、例えば、アレイホルダを洗浄用フレームに挿入
した際に、互いに軽く嵌まり合うよう、該フレームの一部に突起を、キャピラリーアレイ
ホルダの一部に部くぼみを予め設けておき、キャピラリーアレイホルダが洗浄用フレーム
の所定に位置まで挿入されると、くぼみと突起互いに嵌まり合うようにしておく方法等が
挙げられる。

図１０には、図８及び図９で示した洗浄ホルダを使用した洗浄方法を示す図である。図
９では、アレイホルダを装着した洗浄用フレーム（９１）を円筒状の円筒洗浄容器（１１
１）に挿入する。このとき、洗浄フレームの幅を円筒容器の直径とほぼ等しい幅にするこ
とで、洗浄用フレームが洗浄容器のほぼ中央部で保持された状態となり、アレイホルダの
表裏が洗浄容器の内壁からほぼ等しい位置に保持することができる。洗浄容器は特に円筒
状である必要はなく、図１０に示すように、直方体洗浄容器（１１２）であってもよい。

その際、内壁に洗浄用フレームを差し込むためのフレームガイド（１１２ａ）などを有す
る矩形断面の容器であってもよい。そして洗浄用フレームが挿入された洗浄容器に洗浄液
を注入し、所定の処方で洗浄処理を行う。

次に、洗浄処理を終えたアレイの分析方法の一例を示す。ここでは、キャプチャープロ
ーブとして、核酸を使用したアレイを使用し、検体溶液として蛍光標識されたmRNA、c
DNA等を含む溶液を使用し、ハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリットを形成
した孔部から放射されるエネルギーを測定する手順について、図１１を用い説明する。

まず、洗浄処理を終えたアレイホルダを、アレイホルダをぴったり収納するくぼみを持
った検出用ケース（１２１）に収納する。次に、アレイホルダの開口部（１０ａ）に蒸留
水を注入する。注入する蒸留水の量は、アレイシートホルダ表面が完全に浸漬し、さらに
多少蒸留水が盛り上がる程度注入する。そして、アレイホルダより多少大きなの透明カバ
ー（１２２）を、内部に気泡を咬み込まないように乗せ、次いで余分な蒸留水を除去し、
検出用ケースに嵌まり込んだアレイホルダの上部が透明なカバーで覆われた状態とする。

この検出用ケースを標識物質から放射されるエネルギを測定する装置に装着し測定を行う
。透明カバーの材質は、アレイホルダ内の水分の蒸発を防ぐために水蒸気透過率の低い材
料を用い、標識物質として蛍光物質を用いた場合は蛍光物質が放射する蛍光を吸収しない
材質を選定する。例えば無蛍光ガラス製のカバーグラスなどを用いると良い。

分析処理は、使用するキャプチャープローブや検体の種類により相違する。

キャピラリーアレイシートホルダの構成部品を示した斜視図である。 キャピラリーアレイシート及びアレイが収納された状態のキャピラリーアレイシートホルダを示す斜視図である。 キャピラリーアレイシートとキャピラリーアレイシートホルダのマーカー部の模式図である。 複数枚のキャピラリーアレイシートを収納するキャピラリーアレイシートホルダの模式図である。 キャピラリーアレイシートホルダ収納容器を示す模式図である。 キャピラリーアレイシートを収納したキャピラリーアレイシートホルダを、キャピラリーアレイシートホルダ収納容器に収納した状態の断面図である。 キャピラリーアレイシートホルダ収納容器を使用した反応手順を示した模式図である。 洗浄の際に使用する洗浄フレームを示す模式図である 底面装着型の洗浄用フレームへのキャピラリーアレイシートホルダの装着状態を示した模式図である。 キャピラリーアレイシートホルダを装着した洗浄用フレームを洗浄容器に挿入する模式図である。 キャピラリーアレイシートホルダを検出用フレームに装着、上部を透明カバーで覆う操作を示した模式図である。

符号の説明

１０・・・・・キャピラリーアレイシートホルダ
１１・・・・・本体部
１１ａ・・・・蓋収納溝
１１ｂ・・・・ピン孔
１１ｃ・・・・シート収納溝
１１ｄ・・・・開口部
１１ｅ・・・・本体切り欠き
１１ｆ・・・・ホルダマーカー部
１２・・・・・蓋部
１２ａ・・・・ピン
１２ｂ・・・・開口部
１２ｃ・・・・蓋部切欠部
２１・・・・・キヤピラリーアレイシート
２１ａ・・・・ゲル保持部
２１ｂ・・・・シートマーカー部
４１・・・・・本体部
４１ａ・・・・シート収納溝
４１ｂ・・・・本体開口流路
４１ｃ・・・・切欠部
４２・・・・・蓋部
４２ａ・・・・蓋開口流路
４２ｂ・・・・切欠部
５０・・・・・キャピラリーアレイボルダ収納容器
５１・・・・・容器部
５１ａ・・・・ホルダ収納溝
５１ｂ・・・・パッキン溝
５１ｃ・・・・ネジ孔
５２・・・・・蓋部
５２ａ・・・・注入口
５２ｂ・・・・パッキン溝
５２ｃ・・・・貫通穴
６１・・・・・ボルト
６２・・・・・パッキン
６３・・・・・窓蓋
７０・・・・・フォルダ収納容器
７１・・・・・検体溶液
７２・・・・・分注器具
７３・・・・・栓
９１・・・・・洗浄用フレーム
９１ａ・・・・側面開口部
９１ｂ・・・・ホルダガイド
１０１・・・・洗浄用フレーム
１０１ａ・・・底面開口部
１０１ｂ・・・ホルダガイド
１１１・・・・円筒洗浄容器
１１２・・・・直方体洗浄容器
１１２ａ・・・フレームガイド
１２１・・・・検出用ケース
１２２・・・・透明カバー

Claims (8)

1. 高分子ゲルを保持した貫通孔部を複数含むキャピラリーアレイシートを1枚以上収納可能なホルダであって、該シートの高分子ゲルが露出可能な表側および裏側の開口部と、その表側および裏側の開口部と連結する切欠部を有する、キャピラリーアレイシートホルダ。
2. シートにマーカー部を有する、請求項１記載のホルダ。
3. 請求項１又は請求項２に記載のホルダを収納する収納容器であって、収納容器には収納したホルダの開口部に液体を注入可能な注入口を有する、ホルダ収納容器。
4. 開口部が外部から観察可能な窓部を有する、請求項３記載の容器。
5. 請求項３又は４記載の容器の注入口から検体溶液を注入し、検体との反応を行うことを含む、検体分析方法。
6. 容器の注入口が上になるように直立させて反応を行うことを含む、請求項５記載の方法。
7. 反応後、容器からホルダを脱着し、該ホルダを洗浄用フレームに装着し、該フレームを洗浄容器に挿入し、シートの洗浄を行うことを含む、請求項５又は６記載の方法。
8. 洗浄後のホルダを検出用ケースに装着し、該ホルダを液体で浸漬し、ホルダの開口部の上部を透明なカバーで覆い検出することを含む、請求項７記載の方法。

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