JPH1033173A - Ｄｎａ試料調整装置及びこれを用いる電気泳動分析装置 - Google Patents
Ｄｎａ試料調整装置及びこれを用いる電気泳動分析装置Info
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- JPH1033173A JPH1033173A JP8194341A JP19434196A JPH1033173A JP H1033173 A JPH1033173 A JP H1033173A JP 8194341 A JP8194341 A JP 8194341A JP 19434196 A JP19434196 A JP 19434196A JP H1033173 A JPH1033173 A JP H1033173A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 大容量配列解析可能なキャピラリー電気泳動
のためのＤＮＡ試料調整装置を提供する。 【解決手段】 基板２４に反応液を入れる反応液槽２
５、アビジンが固定される細溝反応部２６、キャピラリ
ー結合部２７が形成される。キャピラリー結合部２７に
試料注入シリンジ２８によりＤＮＡを滴下し細溝２６内
に入れる。ビオチン標識された鋳型ＤＮＡを細溝２６内
に固定化後、余剰ＤＮＡを含む液を除去し、反応液槽２
５にＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、反応基質である
ｄＮＴＰ等が含まれる反応液を加え細溝反応部２６の溝
へ注入し、鋳型ＤＮＡと反応させる。反応液を除去、洗
浄しホルムアミド溶液を注入すると共に基板を昇温し、
反応液槽２５に電極を入れ、２７にキャピラリー分析部
２９の試料注入端を接触させ電界を加えて試料を電界注
入する。試料は電気泳動により分離され検出される。 【効果】 μｌオーダーのハンドリングで多数試料の反
応を実行できる。
のためのＤＮＡ試料調整装置を提供する。 【解決手段】 基板２４に反応液を入れる反応液槽２
５、アビジンが固定される細溝反応部２６、キャピラリ
ー結合部２７が形成される。キャピラリー結合部２７に
試料注入シリンジ２８によりＤＮＡを滴下し細溝２６内
に入れる。ビオチン標識された鋳型ＤＮＡを細溝２６内
に固定化後、余剰ＤＮＡを含む液を除去し、反応液槽２
５にＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、反応基質である
ｄＮＴＰ等が含まれる反応液を加え細溝反応部２６の溝
へ注入し、鋳型ＤＮＡと反応させる。反応液を除去、洗
浄しホルムアミド溶液を注入すると共に基板を昇温し、
反応液槽２５に電極を入れ、２７にキャピラリー分析部
２９の試料注入端を接触させ電界を加えて試料を電界注
入する。試料は電気泳動により分離され検出される。 【効果】 μｌオーダーのハンドリングで多数試料の反
応を実行できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はキャピラリーアレー
電気泳動を用いたＤＮＡ等の分析法及び装置に関する。
電気泳動を用いたＤＮＡ等の分析法及び装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】キャピラリーゲル電気泳動は高速・高感
度な分析法として普及してきている。特にＤＮＡ塩基配
列決定（ＤＮＡシーケンシング）を含むＤＮＡ分析に有
望な方法として注目を集めている。また、多くの試料を
同時に分析し、スループットを上げるために、キャピラ
リー分析管を並べたキャピラリーアレー装置が開発され
ている。これら装置では、試料はタイタープレート又は
試料ボトル中に保持されており、その中に電極及びキャ
ピラリー末端が浸され、電極とキャピラリー端の間に電
界を加えることにより、試料は電気的にキャピラリー中
に注入される。
度な分析法として普及してきている。特にＤＮＡ塩基配
列決定（ＤＮＡシーケンシング）を含むＤＮＡ分析に有
望な方法として注目を集めている。また、多くの試料を
同時に分析し、スループットを上げるために、キャピラ
リー分析管を並べたキャピラリーアレー装置が開発され
ている。これら装置では、試料はタイタープレート又は
試料ボトル中に保持されており、その中に電極及びキャ
ピラリー末端が浸され、電極とキャピラリー端の間に電
界を加えることにより、試料は電気的にキャピラリー中
に注入される。
【０００３】一方、ＤＮＡシーケンシングなどＤＮＡ分
析のニーズはゲノム解析計画の進展と共に増大しつつあ
り、高効率な方法の開発が望まれており、キャピラリー
アレーを用いたＤＮＡシーケンサーもその有力候補であ
る。これら解析装置に加えて、試料調整作業の効率向上
も必要であり、種々のピペッティング装置が市販されだ
している。通常ＤＮＡシーケンシングなどの試料調整で
は、０．５ｍｌ（ミリリットル）容量のチューブや、９
６穴タイタープレートが用いられている。特に多数の試
料を扱うにはタイタープレートが良く、広く用いられて
いる。反応に用いる試薬の全体積は反応効率を考え、反
応容積が１０μｌ（マイクロリットル）程度であり、容
積が１００〜２００μｌ（マイクロリットル）前後のタ
イタープレートが広く用いられている。タイタープレー
トを使用して得られた反応生成物は、市販されているス
ラブゲルを用いるＤＮＡシーケンサーではほとんど全量
を計測に用いるが、キャピラリーを用いたＤＮＡシーケ
ンサーでは使用する試料の量は、スラブゲルで計測に使
用する試料の量の１／１００以下である。
析のニーズはゲノム解析計画の進展と共に増大しつつあ
り、高効率な方法の開発が望まれており、キャピラリー
アレーを用いたＤＮＡシーケンサーもその有力候補であ
る。これら解析装置に加えて、試料調整作業の効率向上
も必要であり、種々のピペッティング装置が市販されだ
している。通常ＤＮＡシーケンシングなどの試料調整で
は、０．５ｍｌ（ミリリットル）容量のチューブや、９
６穴タイタープレートが用いられている。特に多数の試
料を扱うにはタイタープレートが良く、広く用いられて
いる。反応に用いる試薬の全体積は反応効率を考え、反
応容積が１０μｌ（マイクロリットル）程度であり、容
積が１００〜２００μｌ（マイクロリットル）前後のタ
イタープレートが広く用いられている。タイタープレー
トを使用して得られた反応生成物は、市販されているス
ラブゲルを用いるＤＮＡシーケンサーではほとんど全量
を計測に用いるが、キャピラリーを用いたＤＮＡシーケ
ンサーでは使用する試料の量は、スラブゲルで計測に使
用する試料の量の１／１００以下である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来、上述したように
ＤＮＡ解析作業の効率向上が計られているが、十分では
ない。本発明の目的は、使用する試薬量を削減しコスト
低減して、さらに手間を小さくするため反応回数の削減
を可能とし、大容量の配列解析を行なうキャピラリーア
レー電気泳動を用いたＤＮＡ等の分析法及び装置を提供
することにある。
ＤＮＡ解析作業の効率向上が計られているが、十分では
ない。本発明の目的は、使用する試薬量を削減しコスト
低減して、さらに手間を小さくするため反応回数の削減
を可能とし、大容量の配列解析を行なうキャピラリーア
レー電気泳動を用いたＤＮＡ等の分析法及び装置を提供
することにある。
【０００５】
【発明を解決するための手段】本発明は、試料消費量の
少ないキャピラリーアレー型電気泳動装置に合った試料
調整装置を提供する。即ち、１つの容器内に複数の分離
された試料調整反応領域を持つ容器を用い、１つの溶液
中で複数の異なる一連の反応をそれぞれ異なる場所で行
ない、生成物をその近傍に保持する手段を用いる。各区
分で生成した試料は、それぞれ異なるキャピラリーに注
入されるが、注入部キャピラリーのピッチと各区分のピ
ッチを揃えておくと都合が良い。例えば、細溝の底面
を、水、バッファー液等を透過するフィルター状膜（例
えば、濾紙フィルター、ガラスフィルター等）で構成
し、表面に一定間隔でアビジンを固定しておき、これに
ビオチン付加した鋳型ＤＮＡを含む液をフィルターに通
過させ、鋳型ＤＮＡをフィルターを固定する。シーケン
シングプライマー、及び反応溶液を細溝に満たし、シー
ケンシング反応を行なう。多数の試料を同時に調製す
る。生成物はフィルターに固定されたＤＮＡにハイブリ
ダイズしており、この近傍にキャピラリー端を近付け、
生成物を昇温等により固定されたＤＮＡから遊離し、電
界によりキャピラリー中に引き込み、分析する。
少ないキャピラリーアレー型電気泳動装置に合った試料
調整装置を提供する。即ち、１つの容器内に複数の分離
された試料調整反応領域を持つ容器を用い、１つの溶液
中で複数の異なる一連の反応をそれぞれ異なる場所で行
ない、生成物をその近傍に保持する手段を用いる。各区
分で生成した試料は、それぞれ異なるキャピラリーに注
入されるが、注入部キャピラリーのピッチと各区分のピ
ッチを揃えておくと都合が良い。例えば、細溝の底面
を、水、バッファー液等を透過するフィルター状膜（例
えば、濾紙フィルター、ガラスフィルター等）で構成
し、表面に一定間隔でアビジンを固定しておき、これに
ビオチン付加した鋳型ＤＮＡを含む液をフィルターに通
過させ、鋳型ＤＮＡをフィルターを固定する。シーケン
シングプライマー、及び反応溶液を細溝に満たし、シー
ケンシング反応を行なう。多数の試料を同時に調製す
る。生成物はフィルターに固定されたＤＮＡにハイブリ
ダイズしており、この近傍にキャピラリー端を近付け、
生成物を昇温等により固定されたＤＮＡから遊離し、電
界によりキャピラリー中に引き込み、分析する。
【０００６】細溝の底に並ぶＤＮＡ固定部は、０．５ｍ
ｍ〜１ｍｍピッチで並べることで１ｃｍ当たり１０〜２
０のサンプルを固定でき、５ｃｍ幅内に５０〜１００サ
ンプルを保持し、一度に反応できる。溝の幅をキャピラ
リー外径と同程度の０．３ｍｍとすることで、使用する
反応溶液の体積は５０ｍｍ×０．３ｍｍ×１ｍｍ＝１５
μｌ（マイクロリットル）であり、通常の１サンプルに
要する量で５０〜１００サンプルの反応を１回の操作で
行なうことができる。ＤＮＡ保持部のピッチをキャピラ
リーアレーのキャピラリーのピッチと揃えることで、サ
ンプルを同時にキャピラリー中に注入でき、大変便利で
ある。さらに、詳細に本発明の構成を説明すると以下の
通りである。
ｍ〜１ｍｍピッチで並べることで１ｃｍ当たり１０〜２
０のサンプルを固定でき、５ｃｍ幅内に５０〜１００サ
ンプルを保持し、一度に反応できる。溝の幅をキャピラ
リー外径と同程度の０．３ｍｍとすることで、使用する
反応溶液の体積は５０ｍｍ×０．３ｍｍ×１ｍｍ＝１５
μｌ（マイクロリットル）であり、通常の１サンプルに
要する量で５０〜１００サンプルの反応を１回の操作で
行なうことができる。ＤＮＡ保持部のピッチをキャピラ
リーアレーのキャピラリーのピッチと揃えることで、サ
ンプルを同時にキャピラリー中に注入でき、大変便利で
ある。さらに、詳細に本発明の構成を説明すると以下の
通りである。
【０００７】構成１：複数種類のＤＮＡ試料又はプライ
マーをそれぞれ異なる区画に固定する第１の部材と、開
口部を有する第２の部材とを有し、第１の部材と開口部
とにより形成される空間で、ＤＮＡ相補鎖合成を含む反
応を各区画で独立して同時に行なうＤＮＡ試料調整装置
に特徴があり、第１の部材がフィルター膜から構成され
ること、第１の部材の各区画にビオチン付ＤＮＡ又はプ
ライマー、あるいは抗原付ＤＮＡ又はプライマーを固定
して、ビオチンーアビジン結合又は抗体抗原反応を利用
して、ＤＮＡ試料又はプライマーを第１の部材に固定す
ることに特徴がある。
マーをそれぞれ異なる区画に固定する第１の部材と、開
口部を有する第２の部材とを有し、第１の部材と開口部
とにより形成される空間で、ＤＮＡ相補鎖合成を含む反
応を各区画で独立して同時に行なうＤＮＡ試料調整装置
に特徴があり、第１の部材がフィルター膜から構成され
ること、第１の部材の各区画にビオチン付ＤＮＡ又はプ
ライマー、あるいは抗原付ＤＮＡ又はプライマーを固定
して、ビオチンーアビジン結合又は抗体抗原反応を利用
して、ＤＮＡ試料又はプライマーを第１の部材に固定す
ることに特徴がある。
【０００８】構成２：構成１のＤＮＡ試料調整装置の各
区画において生成した反応成物をキャピラリーに注入し
て、電気泳動して分析する電気泳動分析装置に特徴があ
り、キャピラリーにはゲル又はゾルが充填されているこ
と、各区画の配列とキャピラリーの末端の試料注入部の
配列がほぼ一致していること、反応生成物をキャピラリ
ーの末端の試料注入部に注入する手段を具備することに
特徴がある。
区画において生成した反応成物をキャピラリーに注入し
て、電気泳動して分析する電気泳動分析装置に特徴があ
り、キャピラリーにはゲル又はゾルが充填されているこ
と、各区画の配列とキャピラリーの末端の試料注入部の
配列がほぼ一致していること、反応生成物をキャピラリ
ーの末端の試料注入部に注入する手段を具備することに
特徴がある。
【０００９】（２）構成３：シート状部材に所定の間隔
で形成された複数の細孔を反応槽とするＤＮＡ試料調整
装置に特徴があり、細孔の内面にＤＮＡ試料又はプライ
マーを固定し、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうこと、
細孔が多孔質材料で形成されること、細孔にビオチン付
ＤＮＡ又はプライマー、あるいは抗原付ＤＮＡ又はプラ
イマーを固定して、ビオチンーアビジン結合又は抗体抗
原反応を利用して、ＤＮＡ試料又はプライマーを細孔に
固定すること、シート状部材と開口部を有する部材とに
より形成される空間に反応試薬を注入して、細孔へ反応
試薬の供給を行なうことに特徴がある。
で形成された複数の細孔を反応槽とするＤＮＡ試料調整
装置に特徴があり、細孔の内面にＤＮＡ試料又はプライ
マーを固定し、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうこと、
細孔が多孔質材料で形成されること、細孔にビオチン付
ＤＮＡ又はプライマー、あるいは抗原付ＤＮＡ又はプラ
イマーを固定して、ビオチンーアビジン結合又は抗体抗
原反応を利用して、ＤＮＡ試料又はプライマーを細孔に
固定すること、シート状部材と開口部を有する部材とに
より形成される空間に反応試薬を注入して、細孔へ反応
試薬の供給を行なうことに特徴がある。
【００１０】構成４：構成３のＤＮＡ試料調整装置の各
細孔において生成した反応成物をキャピラリーに注入し
て、電気泳動して分析する電気泳動分析装置に特徴があ
り、キャピラリーにはゲル又はゾルが充填されているこ
と、各細孔の配列とキャピラリーの末端の試料注入部の
配列がほぼ一致していること、反応生成物をキャピラリ
ーの末端の試料注入部に注入する手段を具備することに
特徴がある。
細孔において生成した反応成物をキャピラリーに注入し
て、電気泳動して分析する電気泳動分析装置に特徴があ
り、キャピラリーにはゲル又はゾルが充填されているこ
と、各細孔の配列とキャピラリーの末端の試料注入部の
配列がほぼ一致していること、反応生成物をキャピラリ
ーの末端の試料注入部に注入する手段を具備することに
特徴がある。
【００１１】構成５：ＤＮＡ試料又はプライマーが内面
に固定されたキャピラリーと、反応液をキャピラリーに
供給する供給手段とを有し、キャピラリー内部でそれぞ
れ独立してＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうＤＮＡ試料
調整装置に特徴があり、キャピラリーは複数であり、異
なるキャピラリー内に異なる試料ＤＮＡが固定され、供
給手段はキャピラリーにほぼ同時に反応液を供給するこ
と、キャピラリーにビオチン付ＤＮＡ又はプライマー、
あるいは抗原付ＤＮＡ又はプライマーを固定して、ビオ
チンーアビジン結合又は抗体抗原反応を利用して、ＤＮ
Ａ試料又はプライマーをキャピラリーに固定すること、 構成６：構成５の各キャピラリーにおいて生成した反応
成物を分析用キャピラリーに注入して、電気泳動して分
析する電気泳動分析装置に特徴が有り、分析用キャピラ
リーにゲル又はゾルが充填されていること、各キャピラ
リーの配列と分析用キャピラリーの末端の試料注入部の
配列をほぼ一致させて、反応成物を分析用キャピラリー
に注入して、電気泳動して分析すること、反応生成物を
キャピラリーの末端の試料注入部に注入する手段を具備
することに特徴がある。
に固定されたキャピラリーと、反応液をキャピラリーに
供給する供給手段とを有し、キャピラリー内部でそれぞ
れ独立してＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうＤＮＡ試料
調整装置に特徴があり、キャピラリーは複数であり、異
なるキャピラリー内に異なる試料ＤＮＡが固定され、供
給手段はキャピラリーにほぼ同時に反応液を供給するこ
と、キャピラリーにビオチン付ＤＮＡ又はプライマー、
あるいは抗原付ＤＮＡ又はプライマーを固定して、ビオ
チンーアビジン結合又は抗体抗原反応を利用して、ＤＮ
Ａ試料又はプライマーをキャピラリーに固定すること、 構成６：構成５の各キャピラリーにおいて生成した反応
成物を分析用キャピラリーに注入して、電気泳動して分
析する電気泳動分析装置に特徴が有り、分析用キャピラ
リーにゲル又はゾルが充填されていること、各キャピラ
リーの配列と分析用キャピラリーの末端の試料注入部の
配列をほぼ一致させて、反応成物を分析用キャピラリー
に注入して、電気泳動して分析すること、反応生成物を
キャピラリーの末端の試料注入部に注入する手段を具備
することに特徴がある。
【００１２】構成７：基板に、複数種類のＤＮＡ試料又
はプライマーが種類毎に内面に固定される複数の第１の
細溝と、反応溶液が満たされ第１の細溝と連結する第２
の細溝とが形成され、第１の細溝に前記反応溶液を流入
させて、反応溶液と複数種のＤＮＡ試料又はプライマー
を独立して同時に反応させるＤＮＡ試料調整装置に特徴
がある。
はプライマーが種類毎に内面に固定される複数の第１の
細溝と、反応溶液が満たされ第１の細溝と連結する第２
の細溝とが形成され、第１の細溝に前記反応溶液を流入
させて、反応溶液と複数種のＤＮＡ試料又はプライマー
を独立して同時に反応させるＤＮＡ試料調整装置に特徴
がある。
【００１３】構成８：構成７の第１の細溝において生成
した反応成物を分析用キャピラリーに注入して、電気泳
動して分析する電気泳動分析装置に特徴があり、分析用
キャピラリーにゲル又はゾルが充填されていること、第
１の細溝の末端に分析用キャピラリーを挿入可能な部位
が形成され、この部位から分析用キャピラリーの末端の
試料注入部に、反応生成物が注入されることに特徴があ
る。
した反応成物を分析用キャピラリーに注入して、電気泳
動して分析する電気泳動分析装置に特徴があり、分析用
キャピラリーにゲル又はゾルが充填されていること、第
１の細溝の末端に分析用キャピラリーを挿入可能な部位
が形成され、この部位から分析用キャピラリーの末端の
試料注入部に、反応生成物が注入されることに特徴があ
る。
【００１４】構成９：反応液を収納する反応液槽と、反
応液槽から供給された反応液と複数の試料のそれぞれと
独立して反応が実行される複数の反応部とを有するＤＮ
Ａ試料調整装置に特徴がある。
応液槽から供給された反応液と複数の試料のそれぞれと
独立して反応が実行される複数の反応部とを有するＤＮ
Ａ試料調整装置に特徴がある。
【００１５】構成１０：構成９の反応部において生成し
た反応成物を分析用キャピラリーに注入して、電気泳動
して分析する電気泳動分析装置に特徴があり、分析用キ
ャピラリーにゲル又はゾルが充填されていることに特徴
がある。
た反応成物を分析用キャピラリーに注入して、電気泳動
して分析する電気泳動分析装置に特徴があり、分析用キ
ャピラリーにゲル又はゾルが充填されていることに特徴
がある。
【００１６】
【発明の実施形態】本発明を実施例を図面を参照して詳
細に説明する。
細に説明する。
【００１７】（第１の実施例）第１の実施例は鋳型ＤＮ
Ａをフィルター等に固定し、複数種類のサンプルを同時
に調製した例であり、以下図１、図２、図３を参照して
説明する。図１は、フィルターを用いた第１の実施例に
おける細溝型反応槽（以下、単に反応槽ともいう）をも
つＤＮＡ試料調整装置の、（ａ）断面を含む斜視図、及
び（ｂ）平面図、図２は、キャピラリーアレー分析部と
ＤＮＡ試料調整装置との結合の断面図、及び電界注入部
を示す部分拡大断面図、図３は、電界注入部の変形例を
示す部分拡大断面図を示す。まず、ＤＮＡ試料調整装置
の構成の概要を説明する。ＤＮＡ試料調整装置は、上部
開口部４−１と下部開口部４−２を持つ上部フィルター
ホルダー４と、上部に直線状に配列する複数の細孔３
（３−１、３−２、〜、３−Ｎ）を、下部に開口部をそ
れぞれ持つ下部フィルターホルダー５と、上部フィルタ
ーホルダー４と下部フィルターホルダー５との間に配置
されるフィルタ膜ー１と、下部フィルターホルダー５の
下部の開口部をふさぐ下部の蓋８とから構成される。下
部開口部４−２の面積は上部開口部４−１の面積より十
分小さく、上部開口部４−１と下部開口部４−２とフィ
ルタ膜ー１とにより、フィルター膜ー１を底部に持つ細
溝型反応槽が形成される。
Ａをフィルター等に固定し、複数種類のサンプルを同時
に調製した例であり、以下図１、図２、図３を参照して
説明する。図１は、フィルターを用いた第１の実施例に
おける細溝型反応槽（以下、単に反応槽ともいう）をも
つＤＮＡ試料調整装置の、（ａ）断面を含む斜視図、及
び（ｂ）平面図、図２は、キャピラリーアレー分析部と
ＤＮＡ試料調整装置との結合の断面図、及び電界注入部
を示す部分拡大断面図、図３は、電界注入部の変形例を
示す部分拡大断面図を示す。まず、ＤＮＡ試料調整装置
の構成の概要を説明する。ＤＮＡ試料調整装置は、上部
開口部４−１と下部開口部４−２を持つ上部フィルター
ホルダー４と、上部に直線状に配列する複数の細孔３
（３−１、３−２、〜、３−Ｎ）を、下部に開口部をそ
れぞれ持つ下部フィルターホルダー５と、上部フィルタ
ーホルダー４と下部フィルターホルダー５との間に配置
されるフィルタ膜ー１と、下部フィルターホルダー５の
下部の開口部をふさぐ下部の蓋８とから構成される。下
部開口部４−２の面積は上部開口部４−１の面積より十
分小さく、上部開口部４−１と下部開口部４−２とフィ
ルタ膜ー１とにより、フィルター膜ー１を底部に持つ細
溝型反応槽が形成される。
【００１８】反応槽の下部（下部開口部４−２の領域
内）には、細孔３のそれぞれに対応する位置にアビジン
をスポット状に直線状に並べた試料保持用アビジンスポ
ット２が作成される。図２に示すように各細孔３とアビ
ジンスポット２に対応する位置で、反応槽の下部領域に
キャピラリー電気泳動管９の一方の端部が配置され、キ
ャピラリー電気泳動管９の他端部には電極（図２では、
＋電極）が配置される（または、各他端部が＋電極が配
置される電解液槽内に配置される。
内）には、細孔３のそれぞれに対応する位置にアビジン
をスポット状に直線状に並べた試料保持用アビジンスポ
ット２が作成される。図２に示すように各細孔３とアビ
ジンスポット２に対応する位置で、反応槽の下部領域に
キャピラリー電気泳動管９の一方の端部が配置され、キ
ャピラリー電気泳動管９の他端部には電極（図２では、
＋電極）が配置される（または、各他端部が＋電極が配
置される電解液槽内に配置される。
【００１９】なお、下部フィルターホルダー５に設けら
れた複数の細孔３に沿ってヒーター６が配置され、細溝
型反応槽の温度が、図示しない温度制御回路で所定の条
件の保持されるように制御される。下部フィルターホル
ダー５の下部の開口部とこれをふさぐ下部の蓋８とから
構成され空間に、下部の蓋８のバッファー液入口１０か
らバッファー液が流入され、バッファー液出口１１から
排泄され、バッファー液中に直線状に電極７（図２では
−電極）が配置される。
れた複数の細孔３に沿ってヒーター６が配置され、細溝
型反応槽の温度が、図示しない温度制御回路で所定の条
件の保持されるように制御される。下部フィルターホル
ダー５の下部の開口部とこれをふさぐ下部の蓋８とから
構成され空間に、下部の蓋８のバッファー液入口１０か
らバッファー液が流入され、バッファー液出口１１から
排泄され、バッファー液中に直線状に電極７（図２では
−電極）が配置される。
【００２０】細溝型の反応槽で底部にフィルター１を持
ち、そのフィルター上にアビジンをスポット状に直線状
に並べたものを用意する。スポット２のピッチは０．５
ｍｍである。スポットサイズは０．３ｍｍである。試料
ＤＮＡはＰＣＲ増幅したものを用いるが、この時、片方
のプライマーをビオチン標識にしておく。フィルターを
穴あきパネル（下部フィルターホルダー５）上に乗せ、
穴あきパネルの下部からフィルターを吸引する。この吸
引は、バッファー液入口１０からバッファー液を流入し
バッファー液出口１１から排泄して行なう。細穴３はア
ビジンスポット２の位置に合わせる。フィルター上部の
溶液（反応槽中の溶液）はアビジンスポット２を通って
排出される。反応槽中の溶液中にビオチン標識物がある
とアビジンスポット２に捕獲される。
ち、そのフィルター上にアビジンをスポット状に直線状
に並べたものを用意する。スポット２のピッチは０．５
ｍｍである。スポットサイズは０．３ｍｍである。試料
ＤＮＡはＰＣＲ増幅したものを用いるが、この時、片方
のプライマーをビオチン標識にしておく。フィルターを
穴あきパネル（下部フィルターホルダー５）上に乗せ、
穴あきパネルの下部からフィルターを吸引する。この吸
引は、バッファー液入口１０からバッファー液を流入し
バッファー液出口１１から排泄して行なう。細穴３はア
ビジンスポット２の位置に合わせる。フィルター上部の
溶液（反応槽中の溶液）はアビジンスポット２を通って
排出される。反応槽中の溶液中にビオチン標識物がある
とアビジンスポット２に捕獲される。
【００２１】即ち、ビオチンプライマーを用いてＤＮＡ
をＰＣＲ増幅し、ビオチン標識ＤＮＡ鋳型を作製する。
生成物を内径０．２ｍｍ〜０．３ｍｍのキャピラリー管
に保持し、キャピラリーの端部をアビジンスポットに接
触させ、生成物をフィルターを通して下部パネルの孔か
ら吸引してアビジンを捕獲させる。この操作は、多くの
キャピラリーにそれぞれ試料を保持し、同時に各スポッ
トにそれぞれの試料を同時に捕獲させても良い。この場
合、サンプルを保持したキャピラリーアレーの配置はア
ビジンスポットの配置と同じにしておく。フィルター上
部にはバッファー液を加えておき、試料と一緒にバッフ
ァー液も吸引されるようにし、同じ種類の試料が複数の
スポットに捕獲されないように工夫する。このようにし
て、鋳型となるＤＮＡを０．５ｍｍおきに細溝下部のフ
ィルター上に固定して直線状に並べることができる。図
１に示した例では、フィルターを底部に持つ細溝型反応
槽の長さは５０ｍｍ、細溝の幅は０．３ｍｍであり、ス
ポットの数は９６である。
をＰＣＲ増幅し、ビオチン標識ＤＮＡ鋳型を作製する。
生成物を内径０．２ｍｍ〜０．３ｍｍのキャピラリー管
に保持し、キャピラリーの端部をアビジンスポットに接
触させ、生成物をフィルターを通して下部パネルの孔か
ら吸引してアビジンを捕獲させる。この操作は、多くの
キャピラリーにそれぞれ試料を保持し、同時に各スポッ
トにそれぞれの試料を同時に捕獲させても良い。この場
合、サンプルを保持したキャピラリーアレーの配置はア
ビジンスポットの配置と同じにしておく。フィルター上
部にはバッファー液を加えておき、試料と一緒にバッフ
ァー液も吸引されるようにし、同じ種類の試料が複数の
スポットに捕獲されないように工夫する。このようにし
て、鋳型となるＤＮＡを０．５ｍｍおきに細溝下部のフ
ィルター上に固定して直線状に並べることができる。図
１に示した例では、フィルターを底部に持つ細溝型反応
槽の長さは５０ｍｍ、細溝の幅は０．３ｍｍであり、ス
ポットの数は９６である。
【００２２】細溝型反応槽に、蛍光標識プライマー、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、相補鎖合成基質などを含む約１０μ
ｌ（マイクロリットル）の反応液を加えて反応させる。
シーケンシングの場合にはこの反応を４つの塩基種に対
応して、４種のターミネーター毎にシーケンシング反応
を行なう。即ち、４つの細溝型反応槽を用い、Ａ、Ｃ、
Ｇ及びＴ反応を行なう。一方、蛍光標識ダイデオキシヌ
クレオチドを用いる、いわゆるターミネーター法では反
応槽は１つで良い。異なる蛍光体で標識された４種のタ
ーミネーター（ｄｉｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ）を混合して加え、１回の反応でシーケンシング用試
料を作れるからである。
ＮＡポリメラーゼ、相補鎖合成基質などを含む約１０μ
ｌ（マイクロリットル）の反応液を加えて反応させる。
シーケンシングの場合にはこの反応を４つの塩基種に対
応して、４種のターミネーター毎にシーケンシング反応
を行なう。即ち、４つの細溝型反応槽を用い、Ａ、Ｃ、
Ｇ及びＴ反応を行なう。一方、蛍光標識ダイデオキシヌ
クレオチドを用いる、いわゆるターミネーター法では反
応槽は１つで良い。異なる蛍光体で標識された４種のタ
ーミネーター（ｄｉｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅ）を混合して加え、１回の反応でシーケンシング用試
料を作れるからである。
【００２３】図２に示したように生成物はフィルターに
固定された鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしている。図２
での部分拡大図は細孔３−２近傍の部分拡大図を示し、
１２は、反応で生成したＤＮＡとフィルターに固定され
たＤＮＡを示す。バッファー液で反応槽を洗浄し、反応
液、即ちプライマー及び反応基質（ｄＮＴＰ；ｄｅｏｘ
ｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
及びｄｄ−ＮＴＰ；ｄｉｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などを除去する。分
析用キャピラリーアレー９の各キャピラリーの試料注入
端を試料が保持されたスポット２の近傍に置き、イオン
交換水にフォルムアミドを溶かした液を加えて、温度制
御回路で制御されるヒーター６により、試料保持部を７
０℃以上に昇温すると共に、＋電極−電極に電界を印加
し、ＤＮＡ試料をキャピラリー泳動部９へ注入する。そ
れに続く電気泳動により各成分を分離して蛍光検出す
る。ターミネーター標識の場合には１回の注入で良い
が、プライマー標識の場合には約５秒毎の注入を各末端
塩基毎に４回繰り返す。
固定された鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしている。図２
での部分拡大図は細孔３−２近傍の部分拡大図を示し、
１２は、反応で生成したＤＮＡとフィルターに固定され
たＤＮＡを示す。バッファー液で反応槽を洗浄し、反応
液、即ちプライマー及び反応基質（ｄＮＴＰ；ｄｅｏｘ
ｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
及びｄｄ−ＮＴＰ；ｄｉｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）などを除去する。分
析用キャピラリーアレー９の各キャピラリーの試料注入
端を試料が保持されたスポット２の近傍に置き、イオン
交換水にフォルムアミドを溶かした液を加えて、温度制
御回路で制御されるヒーター６により、試料保持部を７
０℃以上に昇温すると共に、＋電極−電極に電界を印加
し、ＤＮＡ試料をキャピラリー泳動部９へ注入する。そ
れに続く電気泳動により各成分を分離して蛍光検出す
る。ターミネーター標識の場合には１回の注入で良い
が、プライマー標識の場合には約５秒毎の注入を各末端
塩基毎に４回繰り返す。
【００２４】通常、ＤＮＡを保持したフィルター面の反
対側、即ち吸引孔側に設けた電極とキャピラリーの計測
部側の端の間に電圧をかけて電界を作り、分析用キャピ
ラリーに試料を注入するが、分析用キャピラリーの外側
に図３に示したような環状電極１３を設け、これをスラ
イドさせてフィルター面に接触させて、この環状電極１
３とキャピラリー９の間に電界を作っても良い。もちろ
ん、キャピラリーが通る孔を設けた金属板をフィルター
に密着させ、試料保持部が孔と一致するようにした上で
キャピラリーを孔に挿入し、両者の間に電界をかけて試
料注入しても良い。以上の説明では、細孔３は直線状に
配列したが、２次元に配列しても良いことは言うまでも
ない。
対側、即ち吸引孔側に設けた電極とキャピラリーの計測
部側の端の間に電圧をかけて電界を作り、分析用キャピ
ラリーに試料を注入するが、分析用キャピラリーの外側
に図３に示したような環状電極１３を設け、これをスラ
イドさせてフィルター面に接触させて、この環状電極１
３とキャピラリー９の間に電界を作っても良い。もちろ
ん、キャピラリーが通る孔を設けた金属板をフィルター
に密着させ、試料保持部が孔と一致するようにした上で
キャピラリーを孔に挿入し、両者の間に電界をかけて試
料注入しても良い。以上の説明では、細孔３は直線状に
配列したが、２次元に配列しても良いことは言うまでも
ない。
【００２５】（第２の実施例）第２の実施例は直線状に
配列した細孔内で反応を行なう例である。図４は、プラ
スチックシートに細孔をあけ反応槽として用いた第２の
実施例を示す、（ａ）ＤＮＡ保持細孔を持つ細孔付シー
トの平面図、（ｂ）細孔付シートの一部拡大断面図、及
び（ｃ）反応液供給具との結合を示す断面を含む斜視図
を示す。図４に示したように、厚さ０．５ｍｍ〜１ｍｍ
のプラスチックシートに０．２ｍｍの細孔（ＤＮＡ保持
細孔１５）が並んだ細孔付シート１４を用意する。細孔
１５の内部にストレプトアビジンを固定化する。この細
孔１５は多孔質材料で形成し、ストレプトアビジンを固
定化しても良い。細孔１５は１ｍｍ間隔で直線状に１０
０ケ並んでいる。もちろん、細孔を２次元的に並べても
良いが、ここでは直線的に並んだ例で説明する。４色の
蛍光標識プライマーを用いる時にはこのプラスチックシ
ートが４枚重ねになっているものを用いる。
配列した細孔内で反応を行なう例である。図４は、プラ
スチックシートに細孔をあけ反応槽として用いた第２の
実施例を示す、（ａ）ＤＮＡ保持細孔を持つ細孔付シー
トの平面図、（ｂ）細孔付シートの一部拡大断面図、及
び（ｃ）反応液供給具との結合を示す断面を含む斜視図
を示す。図４に示したように、厚さ０．５ｍｍ〜１ｍｍ
のプラスチックシートに０．２ｍｍの細孔（ＤＮＡ保持
細孔１５）が並んだ細孔付シート１４を用意する。細孔
１５の内部にストレプトアビジンを固定化する。この細
孔１５は多孔質材料で形成し、ストレプトアビジンを固
定化しても良い。細孔１５は１ｍｍ間隔で直線状に１０
０ケ並んでいる。もちろん、細孔を２次元的に並べても
良いが、ここでは直線的に並んだ例で説明する。４色の
蛍光標識プライマーを用いる時にはこのプラスチックシ
ートが４枚重ねになっているものを用いる。
【００２６】第１の実施例の場合と同様、各細孔１５に
ビオチン標識したＤＮＡ試料を注入し、細孔の壁に固定
されたアビジンで捕獲する。溶媒を除去した後、４枚の
シトをばらばらにし、各シートを図４のようにそれぞれ
テーパーを有する開口部４’−１、５’−１を持つ上部
シートホルダー４’と下部シートホルダー５’との間に
サンドイッチする。即ち、上部シートホルダー４’、下
部シートホルダー５’の対応する細長い開口する部分の
間で、各シートは露出することになる。上部シートホル
ダー４’のテーパーがつけられた開口部４’−１は、プ
ライマー、酵素を含む反応液１６が注入される反応液槽
となる。反応液槽はテーパーがつけてあるため、反応液
が下部に集まる。上記の細長い開口する部分の幅は０．
２ｍｍであり、長さは１００ｍｍである。
ビオチン標識したＤＮＡ試料を注入し、細孔の壁に固定
されたアビジンで捕獲する。溶媒を除去した後、４枚の
シトをばらばらにし、各シートを図４のようにそれぞれ
テーパーを有する開口部４’−１、５’−１を持つ上部
シートホルダー４’と下部シートホルダー５’との間に
サンドイッチする。即ち、上部シートホルダー４’、下
部シートホルダー５’の対応する細長い開口する部分の
間で、各シートは露出することになる。上部シートホル
ダー４’のテーパーがつけられた開口部４’−１は、プ
ライマー、酵素を含む反応液１６が注入される反応液槽
となる。反応液槽はテーパーがつけてあるため、反応液
が下部に集まる。上記の細長い開口する部分の幅は０．
２ｍｍであり、長さは１００ｍｍである。
【００２７】反応液は細孔１５に侵入し、シーケンス反
応が進行する。反応終了後、溶媒を除去し、洗浄する。
細孔位置を合わせて４枚のシートを重ね合わせ、ホルム
アミドの入った液を加える。キャピラリー端をシートの
細孔に合わせて置き、シートホルダー４’、５’を、図
示されないヒーターを第１の実施例と同様にして温度制
御回路で制御して、加熱しながら遊離した試料をキャピ
ラリー中に電界注入する。もちろん、キャピラリー中ヘ
の試料の電界注入は、図３に示した方法を使用しても良
い。ここではシートに孔をあけて用いたが、キャピラリ
ーを１次元、又は２次元に所定のピッチで並べて配置
し、各キャピラリーを、熱可塑性プラスチック、又はガ
ラスで一体化して、キャピラリー軸に交叉する方向でス
ライスして、これを細孔として使用しても良い。
応が進行する。反応終了後、溶媒を除去し、洗浄する。
細孔位置を合わせて４枚のシートを重ね合わせ、ホルム
アミドの入った液を加える。キャピラリー端をシートの
細孔に合わせて置き、シートホルダー４’、５’を、図
示されないヒーターを第１の実施例と同様にして温度制
御回路で制御して、加熱しながら遊離した試料をキャピ
ラリー中に電界注入する。もちろん、キャピラリー中ヘ
の試料の電界注入は、図３に示した方法を使用しても良
い。ここではシートに孔をあけて用いたが、キャピラリ
ーを１次元、又は２次元に所定のピッチで並べて配置
し、各キャピラリーを、熱可塑性プラスチック、又はガ
ラスで一体化して、キャピラリー軸に交叉する方向でス
ライスして、これを細孔として使用しても良い。
【００２８】（第３の実施例）第３の実施例はキャピラ
リー管を反応槽を用いる例である。図５は、キャピラリ
ー管を反応槽に利用した第３の実施例を示す、（ａ）試
料ＤＮＡ注入を説明する図、（ｂ）反応液の注入を説明
する図、及び（ｃ）分析用キャピラリーアレーへ試料を
移動する操作を説明する図である。キャピラリー反応管
１８には市販の石英管を用いたが、プラスチック管等で
も良い。反応表面積を大きくするためにここでは内径
０．０５ｍｍの管を５０ｍｍの長さと長くして用い、キ
ャピラリー内面にストレプトアビジンを固定化した。図
５に示したように。１００本のキャピラリー反応管（束
キャピラリー）１８の一端を束ねてマイクロシリンジ１
７の先端に取付けられるようにする。キャピラリー反応
管１８の反対側の先端をそれぞれ、鋳型ＤＮＡが含まれ
る容器（試料溜）１９に入れ吸引し、鋳型ＤＮＡをキャ
ピラリー反応管１８内に導入し、ビオチンーアビジン結
合を用いて鋳型ＤＮＡをキャピラリー反応管１８の壁に
固定する。鋳型注入の他の方法はキャピラリー短管に各
鋳型を吸入し、溝に並べて前記の束キャピラリーで吸引
により注入する方法である。
リー管を反応槽を用いる例である。図５は、キャピラリ
ー管を反応槽に利用した第３の実施例を示す、（ａ）試
料ＤＮＡ注入を説明する図、（ｂ）反応液の注入を説明
する図、及び（ｃ）分析用キャピラリーアレーへ試料を
移動する操作を説明する図である。キャピラリー反応管
１８には市販の石英管を用いたが、プラスチック管等で
も良い。反応表面積を大きくするためにここでは内径
０．０５ｍｍの管を５０ｍｍの長さと長くして用い、キ
ャピラリー内面にストレプトアビジンを固定化した。図
５に示したように。１００本のキャピラリー反応管（束
キャピラリー）１８の一端を束ねてマイクロシリンジ１
７の先端に取付けられるようにする。キャピラリー反応
管１８の反対側の先端をそれぞれ、鋳型ＤＮＡが含まれ
る容器（試料溜）１９に入れ吸引し、鋳型ＤＮＡをキャ
ピラリー反応管１８内に導入し、ビオチンーアビジン結
合を用いて鋳型ＤＮＡをキャピラリー反応管１８の壁に
固定する。鋳型注入の他の方法はキャピラリー短管に各
鋳型を吸入し、溝に並べて前記の束キャピラリーで吸引
により注入する方法である。
【００２９】溶媒を除去した後、反応液をシリンジ１７
に入れるか、容器２０（反応液溜又は反応液槽）から吸
入することにより、各キャピラリーに入れ反応を行な
う。反応終了後、溶液を除去し、ホルムアミドを含む液
でキャピラリー１８の内部を満たす。反応生成物２３を
内面に保持したキャピラリー１８の先端を分析用キャピ
ラリー管２１（＋電極）の試料注入端に接触させ、試料
保持キャピラリー１８を昇温すると共にシリンジシャフ
トを片方の電極（−電極）にして試料を電界注入する。
これをスムーズにするために、試料保持（反応に用い
た）キャピラリー１８と分析用キャピラリー１９は同じ
ピッチ（本実施例では０．４ｍｍピッチ）で、お互いの
端部を対応させて配列させて固定する溝付支持基板２２
を用いた。分析用キャピラリー１９に注入された試料は
前記の第１、第２の実施例と同様に分離され検出され
る。
に入れるか、容器２０（反応液溜又は反応液槽）から吸
入することにより、各キャピラリーに入れ反応を行な
う。反応終了後、溶液を除去し、ホルムアミドを含む液
でキャピラリー１８の内部を満たす。反応生成物２３を
内面に保持したキャピラリー１８の先端を分析用キャピ
ラリー管２１（＋電極）の試料注入端に接触させ、試料
保持キャピラリー１８を昇温すると共にシリンジシャフ
トを片方の電極（−電極）にして試料を電界注入する。
これをスムーズにするために、試料保持（反応に用い
た）キャピラリー１８と分析用キャピラリー１９は同じ
ピッチ（本実施例では０．４ｍｍピッチ）で、お互いの
端部を対応させて配列させて固定する溝付支持基板２２
を用いた。分析用キャピラリー１９に注入された試料は
前記の第１、第２の実施例と同様に分離され検出され
る。
【００３０】（第４の実施例）第４の実施例はマイクロ
加工を用いた反応容器兼試料注入部の例である。図６
は、マイクロファブリケーションを用いて作製する第４
の実施例の、（ａ）反応液槽、細溝反応部、キャピラリ
ー結合部を持つ基板を示す斜視図、（ｂ）前記基板とキ
ャピラリーアレー電気泳動装置との結合を説明する斜視
図を示す。キャピラリー用の反応容器としては小さなサ
イズで必要なだけ試料を反応させ、反応生成物をできる
だけ全て分析部へ導くのが良い。しかし、反応試薬のハ
ンドリングはインクジェットなどを用いる場合を除い
て、μｌ（マイクロリットル）オーダーの量以下は扱え
ない。そこで、μｌ（マイクロリットル）オーダーの試
薬を１ケ所に注入し、それが微細な反応槽へ分割されて
運搬され使用されるようにすると都合が良い。反応生成
物は空間的に離れた各キャピラリー分析部又は平板型ゲ
ル電気泳動用ウェル部に注入されるので生成物を取り出
す部分は空間的に離れた方が取り扱いの点で都合が良
い。第３の実施例ではキャピラリー管を用いてこれを実
現したものであるが、第４の実施例では、マイクロ加工
を用いて作った細溝を用いた例である。
加工を用いた反応容器兼試料注入部の例である。図６
は、マイクロファブリケーションを用いて作製する第４
の実施例の、（ａ）反応液槽、細溝反応部、キャピラリ
ー結合部を持つ基板を示す斜視図、（ｂ）前記基板とキ
ャピラリーアレー電気泳動装置との結合を説明する斜視
図を示す。キャピラリー用の反応容器としては小さなサ
イズで必要なだけ試料を反応させ、反応生成物をできる
だけ全て分析部へ導くのが良い。しかし、反応試薬のハ
ンドリングはインクジェットなどを用いる場合を除い
て、μｌ（マイクロリットル）オーダーの量以下は扱え
ない。そこで、μｌ（マイクロリットル）オーダーの試
薬を１ケ所に注入し、それが微細な反応槽へ分割されて
運搬され使用されるようにすると都合が良い。反応生成
物は空間的に離れた各キャピラリー分析部又は平板型ゲ
ル電気泳動用ウェル部に注入されるので生成物を取り出
す部分は空間的に離れた方が取り扱いの点で都合が良
い。第３の実施例ではキャピラリー管を用いてこれを実
現したものであるが、第４の実施例では、マイクロ加工
を用いて作った細溝を用いた例である。
【００３１】図６は本実施例の模式図を示したものであ
る。基板２４（例えば、シリコン基板、ガラス基板等）
には、マイクロファブリケーションにより、反応液槽２
５、細溝反応部２６、キャピラリー結合部２７が形成さ
れる。複数の細溝反応部２６のそれぞれの一端は反応液
槽２５に連なり、他端にはそれぞれキャピラリー結合部
２７が形成される。図６に示す例では、反応液槽２５の
一方の側にのみ細溝反応部２６が配置されているが、反
応液槽２５の両側に細溝反応部２６を配置しても良いこ
とは言うまでもない。反応液槽２５は反応液を入れると
ころであり、細溝反応部２６は反応部である。例えば、
スライドグラス等のガラス板に図６のような溝を掘り、
プラスチックフィルム等で蓋をする。細溝反応部２６の
溝部分にアビジンを固定する処理をする。
る。基板２４（例えば、シリコン基板、ガラス基板等）
には、マイクロファブリケーションにより、反応液槽２
５、細溝反応部２６、キャピラリー結合部２７が形成さ
れる。複数の細溝反応部２６のそれぞれの一端は反応液
槽２５に連なり、他端にはそれぞれキャピラリー結合部
２７が形成される。図６に示す例では、反応液槽２５の
一方の側にのみ細溝反応部２６が配置されているが、反
応液槽２５の両側に細溝反応部２６を配置しても良いこ
とは言うまでもない。反応液槽２５は反応液を入れると
ころであり、細溝反応部２６は反応部である。例えば、
スライドグラス等のガラス板に図６のような溝を掘り、
プラスチックフィルム等で蓋をする。細溝反応部２６の
溝部分にアビジンを固定する処理をする。
【００３２】細溝反応部２６の溝の端に形成された孔
（凹部）２７に、細管をつないだ試料注入シリンジ２８
によりＤＮＡを滴下し、毛管現象により細溝２６内に入
れる。鋳型ＤＮＡは予めビオチンで標識してあり、細溝
２６内に固定化してある。余剰ＤＮＡを含む液を除去
後、反応液槽２５の溝に反応液を１０μｌ（マイクロリ
ットル）加え、圧力をかけて細溝反応部２６の溝へ注入
する（例えば、圧力はプラスチックフィルム等の上記蓋
に力をかけ変形させて得る）。反応液中にはＤＮＡポリ
メラーゼ、プライマー、反応基質であるｄＮＴＰ等が含
まれており、細溝２６の壁に固定された鋳型ＤＮＡと反
応し、生成物を作る。反応後、反応液を除去、洗浄して
も生成物は鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたまま溝２６
内に残る。そこでホルムアミド溶液を注入すると共に基
板を昇温し、反応液槽２５の溝内に電極（−電極）を入
れ、細溝反応部２６の溝の端に形成される孔にキャピラ
リー分析管（キャピラリー分析部（一端が光照射部３０
に接続されている））２９の試料注入端を接触させて電
界を加えて試料を電界注入する。キャピラリー分析部２
９に注入された試料は前記の第１、第２、第３の実施例
と同様に分離され検出される。図６において、３１は蛍
光検出器、３２はデータ処理部である。
（凹部）２７に、細管をつないだ試料注入シリンジ２８
によりＤＮＡを滴下し、毛管現象により細溝２６内に入
れる。鋳型ＤＮＡは予めビオチンで標識してあり、細溝
２６内に固定化してある。余剰ＤＮＡを含む液を除去
後、反応液槽２５の溝に反応液を１０μｌ（マイクロリ
ットル）加え、圧力をかけて細溝反応部２６の溝へ注入
する（例えば、圧力はプラスチックフィルム等の上記蓋
に力をかけ変形させて得る）。反応液中にはＤＮＡポリ
メラーゼ、プライマー、反応基質であるｄＮＴＰ等が含
まれており、細溝２６の壁に固定された鋳型ＤＮＡと反
応し、生成物を作る。反応後、反応液を除去、洗浄して
も生成物は鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたまま溝２６
内に残る。そこでホルムアミド溶液を注入すると共に基
板を昇温し、反応液槽２５の溝内に電極（−電極）を入
れ、細溝反応部２６の溝の端に形成される孔にキャピラ
リー分析管（キャピラリー分析部（一端が光照射部３０
に接続されている））２９の試料注入端を接触させて電
界を加えて試料を電界注入する。キャピラリー分析部２
９に注入された試料は前記の第１、第２、第３の実施例
と同様に分離され検出される。図６において、３１は蛍
光検出器、３２はデータ処理部である。
【００３３】
【発明の効果】以上述べたように本発明によれば、通常
２〜３つの試料の反応に用いる試薬を用いて、１００も
の試料のシーケンス反応又はフラグメント分析反応を行
なうことができ、しかも、ハンドリングは従来と同じμ
ｌ（マイクロリットル）オーダーのハンドリングで済む
ので、試薬の節約ができるばかりでなく取り扱いが楽で
ある。
２〜３つの試料の反応に用いる試薬を用いて、１００も
の試料のシーケンス反応又はフラグメント分析反応を行
なうことができ、しかも、ハンドリングは従来と同じμ
ｌ（マイクロリットル）オーダーのハンドリングで済む
ので、試薬の節約ができるばかりでなく取り扱いが楽で
ある。
【図１】本発明のフィルターを用いた第１の実施例にお
ける細溝型反応槽（以下、単に反応槽ともいう）をもつ
ＤＮＡ試料調整装置の、（ａ）断面を含む斜視図、及び
（ｂ）平面図。
ける細溝型反応槽（以下、単に反応槽ともいう）をもつ
ＤＮＡ試料調整装置の、（ａ）断面を含む斜視図、及び
（ｂ）平面図。
【図２】本発明の第１の実施例のキャピラリーアレー分
析部とＤＮＡ試料調整装置との結合の断面図、及び電界
注入部を示す部分拡大断面図。
析部とＤＮＡ試料調整装置との結合の断面図、及び電界
注入部を示す部分拡大断面図。
【図３】本発明の第１の実施例の電界注入部の変形例を
示す部分拡大断面図。
示す部分拡大断面図。
【図４】プラスチックシートに細孔をあけ反応槽として
用いた本発明の第２の実施例を示す、（ａ）ＤＮＡ保持
細孔を持つ細孔付シートの平面図、（ｂ）細孔付シート
の一部拡大断面図、及び（ｃ）反応液供給具との結合を
示す断面を含む斜視図。
用いた本発明の第２の実施例を示す、（ａ）ＤＮＡ保持
細孔を持つ細孔付シートの平面図、（ｂ）細孔付シート
の一部拡大断面図、及び（ｃ）反応液供給具との結合を
示す断面を含む斜視図。
【図５】キャピラリー管を反応槽に利用した本発明の第
３の実施例を示す、（ａ）試料ＤＮＡ注入を説明する
図、（ｂ）反応液の注入を説明する図、及び（ｃ）分析
用キャピラリーアレーへ試料を移動する操作を説明する
図。
３の実施例を示す、（ａ）試料ＤＮＡ注入を説明する
図、（ｂ）反応液の注入を説明する図、及び（ｃ）分析
用キャピラリーアレーへ試料を移動する操作を説明する
図。
【図６】マイクロファブリケーションを用いて作製する
本発明の第４の実施例の、（ａ）反応液槽、細溝反応
部、キャピラリー結合部を持つ基板を示す斜視図、
（ｂ）前記基板とキャピラリーアレー電気泳動装置との
結合を説明する斜視図。
本発明の第４の実施例の、（ａ）反応液槽、細溝反応
部、キャピラリー結合部を持つ基板を示す斜視図、
（ｂ）前記基板とキャピラリーアレー電気泳動装置との
結合を説明する斜視図。
１…フィルター膜、２…試料保持用アビジンスポット、
３、３−１、３−２、〜、３−Ｎ…細孔、４…上部フィ
ルターホルダー、４’…上部シートホルダー、４−１…
上部開口部、４’−１…上部シートホルダーの開口部、
４−２…下部開口部、５…下部フィルターホルダー、
５’…下部シートホルダー、５’−１…下部シートホル
ダーの開口部、６…ヒーター、７…電極、８…下部の
蓋、９…キャピラリー電気泳動管、１０…バッファー液
入口、１１…バッファー液出口、１２…反応で生成した
ＤＮＡとフィルターに固定されたＤＮＡ、１３…環状電
極、１４…細孔付シート、１５…ＤＮＡ保持細孔、１６
…反応液、１７…マイクロシリンジ、１８…キャピラリ
ー反応管、１９…試料溜、２０…反応液槽、２１…分析
用キャピラリー管、２２…溝付支持基板、２３…反応生
成物、２４…基板、２５…反応液槽、２６…細溝反応
部、２７…キャピラリー結合部、２８…試料注入シリン
ジ、２９…キャピラリー分析部、３０…光照射部、３１
…蛍光検出器、３２…データ処理部。
３、３−１、３−２、〜、３−Ｎ…細孔、４…上部フィ
ルターホルダー、４’…上部シートホルダー、４−１…
上部開口部、４’−１…上部シートホルダーの開口部、
４−２…下部開口部、５…下部フィルターホルダー、
５’…下部シートホルダー、５’−１…下部シートホル
ダーの開口部、６…ヒーター、７…電極、８…下部の
蓋、９…キャピラリー電気泳動管、１０…バッファー液
入口、１１…バッファー液出口、１２…反応で生成した
ＤＮＡとフィルターに固定されたＤＮＡ、１３…環状電
極、１４…細孔付シート、１５…ＤＮＡ保持細孔、１６
…反応液、１７…マイクロシリンジ、１８…キャピラリ
ー反応管、１９…試料溜、２０…反応液槽、２１…分析
用キャピラリー管、２２…溝付支持基板、２３…反応生
成物、２４…基板、２５…反応液槽、２６…細溝反応
部、２７…キャピラリー結合部、２８…試料注入シリン
ジ、２９…キャピラリー分析部、３０…光照射部、３１
…蛍光検出器、３２…データ処理部。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 1/28 Ｊ // Ｃ０７Ｈ 21/04 27/26 ３１５Ｋ
Claims (29)
- 【請求項１】複数種類のＤＮＡ試料又はプライマーをそ
れぞれ異なる区画に固定する第１の部材と、開口部を有
する第２の部材とを有し、前記第１の部材と前記開口部
とにより形成される空間で、ＤＮＡ相補鎖合成を含む反
応を前記各区画で独立して同時に行なうことを特徴とす
るＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項２】請求項１に記載のＤＮＡ試料調整装置にお
いて、前記第１の部材がフィルター膜であることを特徴
とするＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項３】請求項１に記載のＤＮＡ試料調整装置にお
いて、前記第１の部材の前記各区画にビオチン付ＤＮＡ
又はプライマー、あるいは抗原付ＤＮＡ又はプライマー
を固定して、ビオチンーアビジン結合又は抗体抗原反応
を利用して、前記ＤＮＡ試料又はプライマーを前記第１
の部材に固定することを特徴とするＤＮＡ試料調整装
置。 - 【請求項４】請求項１から請求項３に記載のＤＮＡ試料
調整装置の前記各区画において生成した反応成物をキャ
ピラリーに注入して、電気泳動して分析することを特徴
とする電気泳動分析装置。 - 【請求項５】請求項１から請求項３に記載のＤＮＡ試料
調整装置の前記各区画において生成した反応成物をゲル
又はゾルが充填されたキャピラリーに注入して、電気泳
動して分析することを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項６】請求項４又は請求項５に記載の何れかの電
気泳動分析装置において、前記各区画の配列と前記キャ
ピラリーの末端の試料注入部の配列がほぼ一致している
ことを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項７】請求項４又は請求項５に記載の何れかの電
気泳動分析装置において、前記反応生成物を前記キャピ
ラリーの末端の試料注入部に注入する手段を具備するこ
とを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項８】シート状部材に所定の間隔で形成された複
数の細孔を反応槽とすることを特徴とするＤＮＡ試料調
整装置。 - 【請求項９】請求項８に記載のＤＮＡ試料調整装置にお
いて、前記細孔の内面にＤＮＡ試料又はプライマーを固
定し、ＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうこと特徴とする
ＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項１０】請求項８に記載のＤＮＡ試料調整装置に
おいて、前記細孔が多孔質材料で形成されること特徴と
するＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項１１】請求項８に記載のＤＮＡ試料調整装置に
おいて、前記細孔にビオチン付ＤＮＡ又はプライマー、
あるいは抗原付ＤＮＡ又はプライマーを固定して、ビオ
チンーアビジン結合又は抗体抗原反応を利用して、前記
ＤＮＡ試料又はプライマーを前記細孔に固定することを
特徴とするＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項１２】請求項８に記載のＤＮＡ試料調整装置に
おいて、前記シート状部材と開口部を有する部材とによ
り形成される空間に反応試薬を注入して、前記細孔へ前
記反応試薬の供給を行なうことを特徴とするＤＮＡ試料
調整装置。 - 【請求項１３】請求項８から請求項１２に記載のＤＮＡ
試料調整装置の前記各細孔において生成した反応成物を
キャピラリーに注入して、電気泳動して分析することを
特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項１４】請求項８から請求項１２に記載のＤＮＡ
試料調整装置の前記各細孔において生成した反応成物を
ゲル又はゾルが充填されたキャピラリーに注入して、電
気泳動して分析することを特徴とする電気泳動分析装
置。 - 【請求項１５】請求項１３又は請求項１４に記載の何れ
かの電気泳動分析装置において、前記各細孔の配列と前
記キャピラリーの末端の試料注入部の配列がほぼ一致し
ていることを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項１６】請求項１３又は請求項１４に記載の何れ
かの電気泳動分析装置において、前記反応生成物を前記
キャピラリーの末端の試料注入部に注入する手段を具備
することを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項１７】ＤＮＡ試料又はプライマーが内面に固定
されたキャピラリーと、反応液を前記キャピラリーに供
給する供給手段とを有し、前記キャピラリー内部でそれ
ぞれ独立してＤＮＡポリメラーゼ反応を行なうことを特
徴とするＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項１８】請求項１７に記載のＤＮＡ試料調整装置
において、前記キャピラリーは複数であり、異なる前記
キャピラリー内に異なる試料ＤＮＡが固定され、前記供
給手段は前記キャピラリーにほぼ同時に前記反応液を供
給することを特徴とするＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項１９】請求項１７に記載のＤＮＡ試料調整装置
において、前記キャピラリーにビオチン付ＤＮＡ又はプ
ライマー、あるいは抗原付ＤＮＡ又はプライマーを固定
して、ビオチンーアビジン結合又は抗体抗原反応を利用
して、前記ＤＮＡ試料又はプライマーを前記キャピラリ
ーに固定することを特徴とするＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項２０】請求項１７から請求項１９に記載のＤＮ
Ａ試料調整装置の前記各キャピラリーにおいて生成した
反応成物を分析用キャピラリーに注入して、電気泳動し
て分析することを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項２１】請求項１７から請求項１９に記載のＤＮ
Ａ試料調整装置の前記各キャピラリーにおいて生成した
反応成物をゲル又はゾルが充填された分析用キャピラリ
ーに注入して、電気泳動して分析することを特徴とする
電気泳動分析装置。 - 【請求項２２】請求項２０又は請求項２１に記載の何れ
かの電気泳動分析装置において、前記各キャピラリーの
配列と分析用キャピラリーの末端の試料注入部の配列を
ほぼ一致させて、前記反応成物を分析用キャピラリーに
注入して、電気泳動して分析することを特徴とする電気
泳動分析装置。 - 【請求項２３】請求項２０又は請求項２１に記載の何れ
かの電気泳動分析装置において、前記反応生成物を前記
キャピラリーの末端の試料注入部に注入する手段を具備
することを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項２４】基板に、複数種類のＤＮＡ試料又はプラ
イマーが前記種類毎に内面に固定される複数の第１の細
溝と、反応溶液が満たされ前記第１の細溝と連結する第
２の細溝とが形成され、前記第１の細溝に前記反応溶液
を流入させて、前記反応溶液と前記複数種のＤＮＡ試料
又はプライマーを独立して同時に反応させることを特徴
とするＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項２５】請求項２４に記載のＤＮＡ試料調整装置
の前記第１の細溝において生成した反応成物を分析用キ
ャピラリーに注入して、電気泳動して分析することを特
徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項２６】請求項２４に記載のＤＮＡ試料調整装置
の前記第１の細溝において生成した反応成物をゲル又は
ゾルが充填された分析用キャピラリーに注入して、電気
泳動して分析することを特徴とする電気泳動分析装置。 - 【請求項２７】請求項２５又は請求項２６に記載の何れ
かの電気泳動分析装置において、前記第１の細溝の末端
に前記分析用キャピラリーを挿入可能な部位が形成さ
れ、前記部位から前記分析用キャピラリーの末端の試料
注入部に、前記反応生成物が注入されることを特徴とす
る電気泳動分析装置。 - 【請求項２８】反応液を収納する反応液槽と、前記反応
液槽から供給された反応液と複数の試料のそれぞれと独
立して反応が実行される複数の反応部とを有することを
特徴とするＤＮＡ試料調整装置。 - 【請求項２９】請求項２８に記載のＤＮＡ試料調整装置
の前記反応部において生成した反応成物を分析用キャピ
ラリーに注入して、電気泳動して分析することを特徴と
する電気泳動分析装置。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19434196A JP4000605B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | Ｄｎａ試料調整装置及びこれを用いる電気泳動分析装置 |
| US08/897,833 US6054035A (en) | 1996-07-24 | 1997-07-21 | DNA sample preparation and electrophoresis analysis apparatus |
| US09/435,786 US6267859B1 (en) | 1996-07-24 | 1999-11-08 | DNA sample preparation and electrophoresis analysis apparatus |
| US09/666,047 US6527933B1 (en) | 1996-07-24 | 2000-09-20 | DNA sample preparation and electrophoresis analysis apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19434196A JP4000605B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | Ｄｎａ試料調整装置及びこれを用いる電気泳動分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1033173A true JPH1033173A (ja) | 1998-02-10 |
| JP4000605B2 JP4000605B2 (ja) | 2007-10-31 |
Family
ID=16322983
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19434196A Expired - Lifetime JP4000605B2 (ja) | 1996-07-24 | 1996-07-24 | Ｄｎａ試料調整装置及びこれを用いる電気泳動分析装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6054035A (ja) |
| JP (1) | JP4000605B2 (ja) |
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