JP5675592B2 - タイタープレートおよび分析対象の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、分析対象を検出するためのタイタープレート、ならびにタイタープレート用の読取装置に関する。更に、本発明は、分析対象の検出方法に関する。更に、本発明は、タイタープレートと読取装置とを含む分析装置に関する。

分子診断分析により、例えば、ＨＩウィルス、Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎ウィルスによるウィルス感染が診断される。今日では、中央検査室において、この種の分析がしばしばピペットロボット装置上で行なわれる。反応容器として、マイクロタイタープレート、特に、例えば１２個ずつの８列のウェルを有するいわゆる９６ウェルプレートが使用される。これらのウェルは互いに約０．９ｃｍの標準化された間隔で配置されている。試料物質及び試薬が、ピペットロボットから自由にプログラム可能に、プラスチック製のピペットチップ又は洗浄・再使用可能なチップにより、タイタープレートの予め定められたウェルつまりｗｅｌｌに移送される。更に、ピペットロボット装置においては、特定温度での培養、混合プロセス又は、例えば磁気的な分離プロセスのような幾つかの作業ステップが実行される。

分子診断法のほぼ不可欠のプロセスは、例えばいわゆるポリメラーゼ連鎖反応（略してＰＣＲ）のような熱サイクル反応によるいわゆる標的（分析対象）の増幅である。その際に、分析対象分子の非常に僅かな直接的には検出できない量が指数関数的に検出可能な量に増やされる。

増幅されるべき試料もしくは増幅された試料の操作は極めて厄介である。場合によっては単一の分子のみによる、例えばエアロゾル発生を介する極めて僅かな汚染が、誤った陽性結果又は高められた定量結果をともなう試料を生じるであろう。従って、分子診断においては、隔離された空間内で試料前処理及び増幅を行なうのが通常である。しかし、これは非常に高価であり、実験所員による試料の処理を必要とする。

１つの解決手段は、ＰＣＲ実施前における被覆フィルムによるタイタープレートの密封封印にある（例えば、特許文献１参照）。引続いて、もはやタイタープレートはその同じ空間内で開放してはならない。隔離された空間でのこの措置は、分析プロセスを統合して自動化する動向と矛盾する。

生成されたＰＣＲ生成物を増幅された分析対象とともに分析するために、例えば、いわゆるリアルタイムＰＣＲに基づく光学的な方法が考慮される。しかし、分子診断においては電気的に検出するための測定方法が存在し、これらの方法ではハイブリダイゼーション反応が行なわれる。この種の方法は公知である（例えば、特許文献２参照）。そのために、生成されたＰＣＲ生成物が反応容器からハイブリダイゼーション用の他の容器に移送される。汚染のない移送のための解決策は、ＰＣＲ及びハイブリダイゼーション用の容器を、例えばいわゆるクイックラボ・ポイント・オブ・ケア−カセット（quicklab（登録商標） point of Care-Kassette）のような１つの閉じられたカセット内に密封統合することにある。しかし、この解決策は、多様なルーチン的用途にとって、しばしば高価すぎ、しかも比較的僅かな処理能力しか可能にしない。

効率的な検出のためには、増幅された分析対象とのハイブリダイゼーション反応の生成物が電気的に検出されるとよい。模範的に言及したクイックラボ（quicklab（登録商標））は刊行物により公知である（例えば、特許文献３参照）。バイオチップのための他の装置も公知である（例えば、特許文献４参照）。分析対象とのハイブリダイゼーションによって電気的に検出可能な特性を変化させるバイオチップも公知である（例えば、特許文献５参照）。

独国特許出願公開第１０２００５０５９５３５号明細書 国際特許出願公開第９９／０７８７９号明細書 独国特許出願公開第１０２３３２１２号明細書 独国特許出願公開第１００５８３９７号明細書 独国特許出願公開第１０１２６３４１号明細書

本発明の課題は、増幅された試料の改善された自動取扱いを可能にするタイタープレートおよび分析対象の検出方法を提供することにある。

タイタープレートに関する課題は、請求項１による技術的に簡単な手段を用いて解決される。
すなわち、この課題は、本発明によれば、複数の互いに隔てられて分離されたウェルと、分析対象を検出すべく設計され検出時に電気信号を送出する少なくとも１つのバイオチップとを備え、分析対象を検出するためのタイタープレートにおいて、
複数のウェルは、それぞれ、試薬、溶剤、又は分析対象について検査する試料を収容するように定められ、タイタープレートに組み込まれたバイオチップはウェルから離されてウェルに隣接して配置され、
それぞれウェルの複数と１つのバイオチップとが、多枝の長穴として形成された１つの切欠きの底部に配置され、該切欠きが１つの壁によって取り囲まれ、
少なくとも１つの切欠きはタイタープレートの第１の面に向いて開き、第１の面に対向する面がバイオチップのための収容部を備えているか又はバイオチップがタイタープレートの底部に嵌め込まれている
ことによって解決される（請求項１）。

本発明は、特に請求項１によるタイタープレートの実施態様を含む。
本発明によるタイタープレートの実施態様は次の通りである。
・バイオチップがウェルに隣接して配置され、壁によって少なくとも１つの切欠きが画成され、それぞれウェルの複数個と１つのバイオチップとが切欠きの底部に配置されている。
・タイタープレートが複数の切欠きを有する（請求項２）。
・少なくとも１つの切欠きがタイタープレートの第１面に向かって開き、第１面に対向する面がバイオチップのための収容部とウェルの膨らみとを備えている。
・少なくとも１つの切欠きが長穴として形成され、この長穴が壁によって取り囲まれた全てのウェル及びバイオチップの上に延びている。
・第１面に対向する第２の面がウェルの膨らみを備えている（請求項３）。
・少なくとも１つのバイオチップの上にエラストマ密封部材が設けられ、このエラストマ密封部材が注入口を有する（請求項４）。
・バイオチップのエラストマ密封部材の上に、ピペットチップのための少なくとも１つの置場が設けられている（請求項５）。
・バイオチップの感応面に液体を接触させるバイオチップ室が存在する（請求項６）。
・バイオチップ室が、バイオチップ室からの液体を受け入れるためのオーバーフロータンクに接続可能である（請求項７）。
・オーバーフロータンク内に、バイオチップ室からの液体を吸い取るための芯材が配置されている（請求項８）。
・１つの切欠き内に、タイタープレートを貫通する１つの孔が存在する（請求項９）。
・バイオチップが、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡを検出すべく設計されている（請求項１０）。
・定量分析、ＩＤＴ、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）又は発現分析に使用される。

本発明によるタイタープレートは、好ましくは、標準マイクロタイタープレートの場合の間隔に相当する間隔で配置された複数のウェルを有し、従って本発明によるタイタープレートはピペットロボットにより操作可能である。この標準間隔は例えば９ｍｍである。更に、タイタープレートは好ましくは標準タイタープレートの長さ及び幅を有し、１２×８個のウェルを有する標準タイタープレートサイズに相当すると好ましい。本発明によるタイタープレートの厚さは、以下になおも詳しく説明するように、それぞれ１つのバイオチップと複数のウェルとを取り囲む壁に場所を提供するために比較的大きいと好ましい。

本発明によるタイタープレートは、清潔な複数のピペットチップのストックを持つピペットロボットによって操作可能であると好ましい。ピペットチップをピペットロボットがつかみ、標準タイタープレート上の例えば１２×８＝９６個のウェル位置のうちの任意の１つの位置に移動させ、そこでピペットチップを降下させ当該ウェルから液体を吸い取り又は注入する。更に、ピペットロボットは、使用済みのピペットチップを廃棄物容器の中に下ろし、新しい清潔なピペットチップをつかみ取って、このピペットチップを用いて作業を更に続行する。

分析対象の検出のために、本発明によれば、少なくとも１つのバイオチップがタイタープレート上に配置されている。「バイオチップ」とは、分析対象、例えば特定のＤＮＡを検出するのに適し、特に分析対象の存在時に電気信号を発生するチップである。典型的には、バイオチップは、それぞれ特異的に分析対象に結合する捕捉分子を持つ１つ又は複数の感応面を有する。１つのバイオチップには異なる捕捉分子を持つ複数の感応面を配置することができ、例えば８〜４００個、特に好ましくは６４又は１２８個の感応面もしくはスポットを配置することができる。バイオチップは、例えばユニバーサルジップコード捕捉体を有するＣＭＯＳチップである。複数個、特に６〜２４個、好ましくは１２個のバイオチップがタイタープレート上に存在すると好ましく、それによって例えば１２ランダムアクセス多重アッセイ法（Random Access Multiplex Assay）を実施することができる。

分析対象分子が捕捉分子に結合し、例えば捕捉分子とハイブリダイズする際に、例えば、感応面においてキャパシタンスの変化が生じ、この変化が電気的に読取られる。これは次のようにして行なわれるとよい。分析対象もしくは標的がビオチン化されている。分析対象分子が捕捉分子に結合した後に、例えばストレプタビジン又はＡＧホスファターゼのような標識酵素が添加される。この酵素は標的のビオチンに結合する。その後に基質が添加されると反応生成物が生成し、この反応性生物がバイオチップによって読取可能な電気信号を発生する。特に好ましくは、バイオチップが、適切な捕捉分子とのハイブリダイゼーションによりＤＮＡを検出するように設計されているとよい。

バイオチップの１つ又は複数の感応面がバイオチップの一方の面、特に上面に配置され、バイオチップの前記一方の面に対向する面に電気信号の読取りを可能にする接触部が配置されているとよい。とりわけ、５〜１００個、特に８〜１２個の感応面と、同じ個数の接触部とを１つのバイオチップに配置することによって、同時に複数の異なる分析対象を検査することができる。

バイオチップがタイタープレートの中に嵌め込まれているとよい。例えば、バイオチップがプラスチックリングの中に嵌め込まれ、このプラスチックリングが再びタイタープレートの適切なウェルの中へ嵌め込まれていることによって、試料物質又は反応物質が、バイオチップの好ましくは上方に向いた感応面と接触することができる。好ましくは、バイオチップが、例えば上方に向いた感応面側に、汚染物質が突き抜けて捕捉分子に到達するのを防ぐ密封部材を備えているとよい。密封部材は、例えばエラストマ材料及び／又は熱可塑性材料からなるカバーである。

バイオチップは、標準タイタープレートの場合には例えば２、４、６又は８個のような固定個数のウェルが配置されている範囲に広がっているとよい。ウェルの標準位置でピペットロボットが停止し、物質を吸込み又は放出する。それによってバイオチップは、ピペットロボットによって、試料物質、反応物質又は標識酵素及び基質で満たされる。

各ＤＮＡチップの隣にそれぞれ複数のウェルもしくは穴が配置され、これらの中において、例えば標的の増幅を、例えばＰＣＲ反応により実施することができ、あるいはその他の試薬を供給することができる。それゆえ、１つのバイオチップとウェルの複数個とがそれぞれ１つの単位を構成し、この単位内で定められた分析が行なわれる。この単位は壁によって周りを囲われている。この単位内において検出のために必要な全てのステップを実行することができる。これらの単位の空間的分離によって、個々の試料を汚染の危険にさらすことなく、非常に小さい面の上に多数の単位を収容することができる。非常に多数の試料の大規模な並列検査が高速かつ低コストにて可能である。

壁によって取り囲まれた１つの単位には、例えば２、４、６、８又は１０個のウェルと、１、２又は３個のバイオチップとが所属する。特に好ましくは、４個のウェルと１個のバイオチップとが１つの単位を構成し、しかもバイオチップが、標準タイタープレートにおいて４個のウェルによって占められる面積と同じ面積を占めるとよい。従って、好ましい１つの単位は、ピペットロボットがピペットチップを操作することができる８個のウェルに相当し、従って８つの位置を有する。従って、標準で１２×８のサイズの１つのタイタープレートはそれぞれ壁によって互いに分離された１２個の単位を有する。

本発明によるタイタープレートは、例えば約２０〜７０ｍｍ、とりわけ４５±１０ｍｍの高さのブロックであり、個々の単位間の壁は、各単位がブロック内の一種の切欠きの中に配置されていることによって形成される。ウェル及びバイオチップは切欠きの底部に配置されている。ピペットロボットは、切欠き内において、ピペットチップを１つのウェルから隣のウェルもしくはバイオチップに移動させることができる。バイオチップと複数のウェルとを取り囲む壁は切欠きの壁であり、タイタープレートの高さとほぼ同じ高さ、即ち好ましくは約２０〜７０ｍｍ、とりわけ４５±１０ｍｍの高さを持つとよい。それによって、ピペット操作時に個々の滴が１つの単位からその隣に位置する１つの単位に達することが有効に防止される。従って、タイタープレートは、それぞれ複数のウェルと１つのバイオチップとからなる単位と同じ個数の切欠きを有すると好ましい。

この種の切欠きは、単にタイタープレートの第１面、特に上面に向かって開いているだけでよい。各単位内に１つのピペットが切欠きを介して入れられ、試料を例えば１つのウェルからバイオチップへ移送する最中、当該単位の、周りを囲われた空間内にとどまる。タイタープレートの第１面に対向する面、特に下面は、バイオチップの収容部を提供し、かつそれぞれ１つのウェルに対応する膨らみを備えている。

特に好ましくは、切欠きがそれぞれ長穴として形成され、単位ごとに例えばほぼＥ字の形を有するとよい。切欠きはピペットロボットの移動経過に合わせられている。長穴は、全部で４つのウェルとバイオチップ上の少なくとも１つの位置とにわたって延びている。長穴は、いわば、ウェルとバイオチップとの間における唯一の接続線を成している。これは、個々の単位間のみならず部分的に１つの単位内の個々のウェル間にも壁が配置されているという利点を有する。ピペットチップが一度試料物質に接触すると、そのチップはこの単位内に置きっぱなしにすることができる。公知のタイタープレートの場合と違って、非常に細かい滴ですら他の分析単位の中に落ち込むことは起こり得ない。なぜならば、使用されたピペットチップは他のウェルもしくはチップの上を跨いで外に出されることがないからである。発展形態によれば、切欠きは１つ又は複数のピペットチップを切欠き内にとどめ置くことができるように設計されている。

タイタープレートはプラスチックから作られていると好ましい。タイタープレートは一方の面に向かって開いた切欠きを備えているので、このタイタープレート（バイオチップなし）を射出成形法により製作することができる。壁もしくは切欠きとウェルとを一体のプラスチック射出成形部品として製作し、後でこの射出成形部品の中にバイオチップを嵌め込むとよい。代替として、タイタープレートがウェルとバイオチップ用の収容部とを有する１つの平らな板として形成され、この板上の個々の単位の間に壁部材を載置してもよい。しかし、この場合には壁部材と板との間の密封を配慮しなければならないので、この実施形態は好ましくはない。

バイオチップは、バイオチップの各コーナが標準サイズのマイクロタイタープレート上の１つのウェルの対応位置にあるように、タイタープレートの中に嵌め込まれていると好ましい。これらの位置の少なくとも１つには、バイオチップのエラストマカバー又は密封部材における注入口が存在する。エラストマ密封部材はバイオチップの感応面を汚染から守るために用いられている。密封部材は、例えば２成分射出成形法にて、タイタープレートの製作時にタイタープレートの中に組み込まれるとよい。代替として、バイオチップが嵌め込まれているプラスチックリングによって、密封部材もしくはカバーを固定してもよい。特に好ましくは、エラストマ密封部材をバイオチップ感応面から僅かに隔てることによって、その隙間に、バイオチップの感応面に液体を接触させるバイオチップ室を形成するとよい。

好ましくは注入口を介して液体がバイオチップ室内に注入され、その後に液体が捕捉分子に接触し、それによりバイオチップによって分析される。バイオチップの注入口は、いわばタイタープレートの複数のウェルの標準位置の１つに一直線に揃えられているので、ピペットはピペットロボットにより自動的に試料をバイオチップへ移送することができる。

特に好ましくは、バイオチップのエラストマ密封部材の上側に、ピペットチップのための少なくとも１つの、好ましくは２つの置場が設けられているとよい。しかも、当該置場が、標準タイタープレート上の１つのウェルにそれぞれに対応し、従ってピペットロボットによって到達可能である例えば４つの位置のうちの１つ又は好ましくは２つの位置に設けられているとよい。試料物質と接触させられるピペットはこの場所に下ろされ、従ってその単位内にとどめ置かれ、このことは場合によっては清潔なピペットチップがその単位内において使用される場合も当てはまる。更に、他の４つのピペットチップが４つのウェルの位置にとどめ置かれる。

更に、余剰の液体を受け入れるために、各単位用に１つのオーバーフロータンクを設けると好ましい。好ましい実施形態においては、オーバーフロータンクがバイオチップ室と直接に接続されているかもしくは接続可能である。それにより、バイオチップ室内に注入された液体は直接に更にオーバーフロータンクへ流入する。バイオチップがタイタープレートの底部に嵌め込まれているので、オーバーフロータンクはバイオチップ室の上側にあるとよい。従って、オーバーフロータンクは、そのチップ室から液体を吸い取る芯材又は他の吸収力のある材料を備えていると好ましい。このようにしてチップ室によって押圧された液体の全てがオーバーフロータンクによって受け入れられる。オーバーフロータンクは、好ましくは０．５ｍｌ〜５ｍｌ、特に好ましくは１〜２ｍｌの容積を有するとよい。更に、オーバーフロータンクが、バイオチップ室内への液体の逆流を防止するオーバーフロー壁を備えているとよい。代替として、オーバーフロータンクへの流入が、例えば、標準タイタープレート上の複数のウェルに対応する複数の標準位置の１つにおける入口を通して行なわれてもよい。

代替実施形態によれば、本発明は、少なくとも１つのバイオチップを備え分析対象を検出するためのタイタープレートを含み、その少なくとも１つのバイオチップが分析対象を検出すべく設計されかつ壁によって取り囲まれ、密封部材、好ましくはエラストマ密封部材が少なくとも１つのバイオチップ上に配置され、その密封部材がバイオチップと一緒にバイオチップ室を形成し、かつオーバーフロータンクと共に直接にそのバイオチップ室に接続されているかもしくは接続可能である。従って、バイオチップ室内に注入された液体は直接に更にオーバーフロータンクに流入する。バイオチップが好ましくはタイタープレートの底部に嵌め込まれるので、オーバーフロータンクはバイオチップ室の上側にあると好ましい。従って、オーバーフロータンクが、チップ室から液体を吸い取る芯材又は他の吸収力のある材料を備えているとよい。このようにして、チップ室によって押圧される液体の全てがオーバーフロータンクによって受け入れられる。この代替実施形態によれば、タイタープレートに他のウェルが必要でないので、タイタープレートの底面全体が完全にバイオチップによって占有可能である。

請求項１による本発明の第１の実施形態に関連して言及されている他の好ましい本発明の特徴の全ては、本発明によるタイタープレートの代替実施形態においても備えることができる。

任意選択的に、本発明によるタイタープレートは少なくとも１つの孔によって貫通されていてよい。この孔はタイタープレートの支持材料に対して直角方向に延び、好ましくはウェルとバイオチップとの間に開口している。更に、起こり得るタイタープレート上の空間からの汚染滴を吸い取るために、負圧にされるとよい。各単位もしくは各切欠きが１つの専用の孔を備えているとよい。

更に、本発明は、試料の自動取扱いの更なる改善を保証すべく設計されているタイタープレート用の読取装置に関する。この読取装置は、バイオチップ用の少なくとも１つの電気接触面つまり読取面を提供する。読取面は加熱可能であると好ましい。なぜならば、バイオチップの読取結果は一般に適切な熱処理後にはじめて読取可能であるからである。
本発明によるタイタープレート用の読取装置は、タイタープレート用の読取装置であって、読取装置が、１つのバイオチップのための少なくとも１つの電気接触面と、タイタープレートのウェルを収容するための槽とを有することを特徴とする。
本発明によるタイタープレート用の読取装置の実施態様は次の通りである。
・タイタープレートのウェルのための槽が選択的に加熱可能である。
・タイタープレートのウェルのための複数の槽がそれぞれ１つのサーモブロックにまとめられ、読取装置が互いに独立に動作可能な複数のサーモブロックを含む。

更に読取装置はウェルのための槽を含み、これらの槽は加熱可能な収容部（サーモブロック）として設計されているとよい。読取装置上へのタイタープレートの載置時に、それぞれ１つのウェルが１つの槽の中に収容され、良好な熱伝達を保証するために、ウェルができるだけ密接に槽によって包囲されていると好ましい。１つの単位内に形成されているウェルと同数の槽が、それぞれ１つの独立の熱サイクル単位（以下において、サーモブロックと呼ぶ）を構成するとよい。槽の適切な加熱によって、ウェル内で例えばＰＣＲを実行することができる。

読取装置は、それぞれ４つの槽と１つの接触面とで構成される互いに独立な単位を有するとよい。

本発明の他の課題は、バイオチップにより分析対象を検出するための改善された方法を提供することにある。本発明によるタイタープレートの使用によって、ピペットロボットによるいわゆる「液体の取扱い」が行なわれる。
しかして、本発明による分析対象の検出方法は、本発明によるタイタープレートに組み込まれているバイオチップにより分析対象を検出するために、基質、特に液体を複数のウェルのうちの１つからバイオチップに移送するステップを有する分析対象の検出方法において、
基質が、ピペットチップを有するピペットロボットによりバイオチップに移送され、ピペットチップが切欠き内にとどめ置かれることを特徴とする（請求項１１）。
本発明による分析対象の検出方法の実施態様は次の通りである。
・本発明によるタイタープレートに組み込まれているバイオチップにより分析対象を検出するために、
ａ）複数のウェルのうちの１つに試料を注入するステップ、
ｂ）複数のウェルのうちの少なくとも１つに試薬を注入するステップ、
ｃ）試薬に混合された試料を用いた増幅反応を実行するステップ、
ｄ）生成された反応混合物をバイオチップ上へ移送するステップ、
ｅ）分析対象とのハイブリダイゼーションによって少なくとも１つの電気的に検出可能な特性を変化させるバイオチップの読取りステップ、
を有し、
反応混合物及び／又は試料が、ピペットチップを有するピペットロボットにより注入されもしくはバイオチップ上へ移送され、かつピペットチップが切欠き内にとどめ置かれる（請求項１２）。
・ステップｄ）の後に、液体、特に標識液体がピペットチップによりバイオチップ上に移送される（請求項１３）。
・複数のピペットチップが切欠き内にとどめ置かれる（請求項１４）。
・ピペットチップが、ピペット操作後に、特に複数のウェルのうちの１つからバイオチップ）上へ生成した反応混合物の移送後に、液体が移送されたそれぞれのウェルに置かれる（請求項１５）。
・ピペットチップが、ピペット操作後に、特にバイオチップ上への標識液体の移送後に、切欠き内の１つの置場に置かれ、その置場が、ピペットチップから液体が漏れないようにピペットチップの下側を封鎖する（請求項１６）。
・ステップａ）〜ｅ）が更に別の試料に関して実行される。

この方法は、タイタープレートの複数のウェルのうちの１つへの試料の注入のほかに分析対象の増幅を含み、かつ１つの共通の空間内でのバイオチップのハイブリダイゼーション領域の空間的統合という利点を提供する。ピペットチップがこの空間内にとどめ置かれるので、他の試料物質による汚染が有効に回避される。

方法の有利な実施形態によれば、単位ごとに複数のピペットチップがピペットロボットによって使用され得るが、これらのピペットチップは使用後それぞれ当該単位内にとどめ置かれる。これは、ピペットチップが隣接する単位の上を跨いで運び去られる際に隣接する単位が増幅された物質により汚染されるということがないという利点を有する。特に好ましくは、使用されたピペットチップはバイオチップのカバー又は密封部材の上の置場に下ろされる。

例えば、例えば同一患者の異なる組織からの１つのみならず複数の試料が、１つの単位の異なるウェルに入れられる。ＰＣＲ後に相次いで反応混合物が異なるウェルから異なるピペットチップによりバイオチップ室に移送され、バイオチップが読み取られる。ピペットチップはバイオチップ室上で完全に空にされ、余剰の液体がオーバーフロータンクに流入する。その後にピペットチップはＰＣＲ反応混合物が移送されたのと同一のウェルの上に下ろされる。更なる操作のためには清潔なピペットチップが使用され、そのピペットチップも当該単位もしくは切欠き内にとどめ置かれる。

ＰＣＲ反応生成物の移送後に他の液体、特に標識液体がピペットチップによりバイオチップ上もしくはバイオチップ室内に移送されるとよい。この標識は、例えば、ビオチン化された分析対象に結合するストレプタビジン又はＡＧホスファターゼである。標識を移送したピペットチップは、場合によっては他の試料のためにもう一度使用されるので、まだ空にされず、従って置場位置又は待機位置の１つで待機させられる。

更に、他のピペットチップにより基質がバイオチップ室の中に注入される。これはバイオチップにおいて電気信号を作動させる反応生成物を発生させる。基質を移送したピペットチップは、場合によっては他の試料のためにもう一度使用されるので、まだ空にされず、従って第２の置場位置又は待機位置で待機させられる。

それゆえ、好ましい方法の特徴は、複数のピペットチップが、切欠き内における例えば異なる置場又はウェル内にとどめ置かれることにある。

分析対象の増幅のために熱サイクル反応が使用されるとよい。その際に、本発明による方法の発展形態によれば、ポリメラーゼ連鎖反応（略してＰＣＲ）、アレル特異性プライマ発現（略してＡＳＰＥ）及び／又はいわゆる増幅不応性突然変異系（略してＡＲＭＳ）が考慮される。

この場合に、分析対象の温度制御される増幅のほかに、温度制御されるハイブリダイゼーションも用いられる。

更に、分析対象の改善された検出は、温度制御される電気的な、特に電気化学的な検出によって達成される。

更に、試料の自動取扱いの改善のために、分析装置が、読取装置とタイタープレートとの組合せから提供される。この組合せは市販のピペットロボットに適合している。

本発明の他の特徴は本発明によるタイタープレートの使用方法に関する。１つの単位における複数のウェルは、４つの異なる比較濃度を用いて定量分析用に使用できる。これは統合化ＤＮＡ技術における発現実験又はいわゆる単一ヌクレオチド多型（略してＳＮＰ）における複合多重化のために考えられ得る。

添付図面を参照して本発明の好ましい実施例を説明する。

図１は本発明によるタイタープレートの実施例の斜視図である。 図２は本発明によるタイタープレート用の読取装置の実施例の斜視図である。 図３は図１によるタイタープレートと図２による読取装置との組合せの斜視図である。 図４は本発明によるタイタープレートの上面の一部の平面図である。 図５は第２の実施形態によるタイタープレート及び読取装置の一部の縦断面図である。 図６は本発明による方法のフローチャートである。

以下において図面を参照して本発明の実施例を説明する。

図１は、分析対象を検出するためのタイタープレート１０を下面２２から見た図で示す。タイタープレート１０は列に配置された複数のウェル１２を有し、これらのウェル１２は下面２２からは膨らみ１２’として見える。ウェル１２は、ピペットロボットがピペットチップにより必要な試薬、溶剤、及び／又は分析対象について検査する試料を入れることができるように、互いに隔てられて整列させられている。

２列のウェル１２ごとに隣に１列のバイオチップ１４が配置されている。バイオチップ１４は、同様にウェル１２に対して、ロボットがピペットチップをそこへ自動的にプログラム制御により移動することができるように配置されている。これらのバイオチップ１４は、例えばＤＮＡをハイブリダイゼーションにより検出すべく設計されており、バイオチップ１４の少なくとも１つの電気特性が変化する。この種のバイオチップ１４は、必要に応じてチップカード実験室も含み得る。

タイタープレート１０はモジュールに構成され、このタイタープレート１０は、ウェル１２つまり膨らみ１２’が形成されているプラスチック製ブロック、例えば射出成形部品と、バイオチップ１４とを含む。バイオチップ１４はこのブロックの収容部１４’に収容されている。バイオチップ１４の下に熱可塑性エラストマからなる密封部材が配置されていると好ましく、この密封部材は収容部１４’をタイタープレートの上面（図１では下方にある）に向かって密封する。密封部材には、入口、出口及び場合によっては置場を成す漏斗状の開口が配置されているとよい。更に、バイオチップ１４がそれぞれ１つのプラスチックリングの中に嵌め込まれ、そのプラスチックリングが収容部１４’に、例えば接着又は溶接により取り付けられているとよい。

タイタープレート１０上で複数の試料を検査できるように、それぞれ複数のウェル、ここでは４つのウェル１２が、それぞれ１つのバイオチップ１４と共に、１つの単位２１にまとめられ、図１ではこの単位２１が鎖線によって囲まれている。４つのウェル１２と１つのバイオチップ１４とを囲って汚染から保護する壁１６が、少なくともこの鎖線２１に沿って延びている。このために射出成形部品は、約５０ｍｍ〜約６０ｍｍの厚さｄ、即ち壁高さを有する。タイタープレート１０は１２個のこの種の単位２１を有する。

図２は、タイタープレート１０用の読取装置２６の実施例を示す。読取装置２６上には、一方では、タイタープレートのウェル１２のための加熱可能な収容部として用いられる槽１３の列が配置されている。特に、図１に示されている膨らみ１２’は、槽１３の中にぴったりはまる。１つの単位２１の４つの槽１３は、それぞれ１つのサーモブロック１１にまとめられ、互いに関係なく加熱可能であり、かつ特に他のサーモブロック１１に関係なく加熱可能である。従って、図示の読取装置２６は、１つの単位の４つの槽からなる独立のサーモブロック１１を１２個含んでいる。１つのサーモブロック１１を用いて、ウェル１２内の分析対象を増幅反応により良好に検出できる量まで増やすことができる。

更に、読取装置２６は、バイオチップ１４のための幾つかの電気的な読取面つまり接触面１５を提供する。それぞれ１つのバイオチップ１４が１つの読取面１５上に載っていることによって、バイオチップ１４の接触部が接触して読み取られる。読取面１５の温度が制御されるとよい。１つの読取面１５上には、例えば８個の電気接触部が配置されている。

接触面１５及び槽１３は縁枠部１７によって取り囲まれ、縁枠部１７は図１に示されているタイタープレート１０を読取装置２６上に位置合わせして保持することができる。

読取装置２６の底面積及び高さは、公知のスターレット（ＳＴＡＲｌｅｔ(登録商標)）システムと互換性があると好ましく、従ってそのサイズは１５０×１１０×１１０ｍｍ³であり、７トラックの支持体にぴったり適合する。読取装置２６は、任意にプログラム可能なＰＣＲを実行することができる１つの単位の４つの槽からなる１２個の独立のサーモブロックもしくはサーモサイクラ１１と、１２個の独立の温度制御される電気バイオチップ読取ブロックとを含むと好ましい。電子集積回路が、通信インターフェースと、２４個の独立の温度制御ユニットと、１２個の独立のバイオチップ読取用のディジタルインターフェースとを有するとよい。

図３には、図１のタイタープレート１０が図２による読取装置２６の上にどのように装着されるかを上面側から見た図で示されている。タイタープレート１０は縁枠部１７によって支持されている。タイタープレート１０の上面２０においては、ほぼＥ字形の長穴として形成された切欠き１８を認識することができる。切欠き１８は、ブロック内に切り込んだようにタイタープレート１０の底部にまで達している。従って、各切欠き１８は、タイタープレート１０内のウェル１２にまで達する比較的厚い壁１６によって区切られている。壁１６は、複数のウェル１２と１つのバイオチップ１４とからなる個々の単位の囲いを提供する。これらのウェル１２は、切欠き１８の底部１９に配置され、ピペットロボットにより到達可能である。ピペットロボットは、増幅された試料混合物を長穴１８に沿ってウェル１２からバイオチップ１４へ移送すべく、ピペットチップ４０を移動する。

図４には、タイタープレート１０の１つのバイオチップと４つのウェルと含む１つの単独の単位２１が上面２０から見た平面図で概略的に示されている。このタイタープレート１０において、１つの切欠き１８が形成されている。切欠き１８は長穴として形成され、壁１６によって取り囲まれている。切欠き１８は上面２０に向かって開いている。

切欠き１８を通してタイタープレート１０の底部１９を見ると、その底部１９内には右側に示す４つのウェル１２が到達することができる。左側にはバイオチップ１４が破線の下に位置している。バイオチップ１４は例えば密封部材３０によって覆われている。密封部材３０においては、３２のところで注入口に到達することができ、注入口を通してピペットチップにより試料をバイオチップ１４と接触させることができる。位置３３，３５において、バイオチップ１４上の密封部材３０は透過できないが、ピペットチップのための小さな収容部を備えている。この収容部は、例えば、密封部材３０内における小さな窪みであってよく、この窪みの中にピペットチップを収容することができる。しかし、この種の窪みは必ずしも必要ではない。いずれにせよ位置３３，３５にピペットチップを下ろすことができる。それゆえ、これらの位置３３，３５は長穴１８とつながっている。ピペットチップの開口は密封部材３０のエラストマ材料によって密封されるので、ピペットチップは、これらの置場位置の１つ３３又は３５に待機させられる際に、例えば基質又は標識酵素をなおも満たされていてよい。位置３４にはオーバーフロータンクの開口が配置されている。この位置は長穴１８とつながっていない。なぜならば、この位置にはピペットチップを移動する必要でないからである。

ウェル１２内での試料の取扱いのために、切欠き１８は、とりわけ４つのウェルをいわば「上から」接近可能にする多枝の長穴として設計されている。即ち、ピペットチップ４０はピペットロボットにより長穴１８を介して挿入し移動することができる。挿入されたピペットチップは、その切欠き１８から出て行かなくても、全てのウェル１２にも、バイオチップ１４にも到達する。標的を含んでいる増幅された試料は、ピペットによってウェル１２の１つから受け取られ、注入口３２を介してバイオチップ１４内へ移送される。注入口３２は、保護のためにバイオチップ１４上に設けられたエラストマ密封部材又は被覆３０を貫通する。

注入口３２を介して液状試料がピペットチップ４０からバイオチップ室３６の中へ流入する。バイオチップ室３６はバイオチップ１４の感応面に接するように配置され、特にバイオチップ１４と密封部材３０との間に延びている。バイオチップ室３６からオーバーフロータンク２４が分岐し、このオーバーフロータンク２４は上に向かって開いている。オーバーフロータンク２４内には芯材３１が配置されている。この場合に芯材３１は、例えば発泡材又は脱脂綿のような吸収性材料からなる円筒状部材である。従って、バイオチップ室３４から更に、ピペットチップ４０からの液状試料２４がオーバーフロータンク２４へ流入する。

ピペットチップは、使用後に、切欠き１８の内部において６つの異なる位置にとどめ置かれてもよい。ピペットチップが、例えば標識又は基質、特に後にもう一度必要される液体でなおも満たされている場合には、そのピペットチップは両置場位置３３，３５のうちの１つに待機させられるとよい。そこでは、それらの置場の開口が密封部材３０によって封鎖されている。空の使用済みのピペットチップ、例えばＰＣＲ生成物をウェル１２の１つから注入口３２を介してバイオチップ室３６の中へ移した後のピペットチップは、その都度のウェル１２内に下ろされるとよい。ＰＣＲ生成物をバイオチップ室３６へ移した後に、ピペットチップを完全に空にするとよい。なぜならば、バイオチップ室３６がオーバーフロータンク２４に直接的につながっていて、オーバーフロータンク２４の中へ全ての余剰の液体が吸い取られるからである。

図５はタイタープレート１０と読取装置２６との組合せを示し、ここでも１つの単位２１だけが示されている。タイタープレート１０は複数のウェル１２を含み、これらのウェルの膨らみ１２’がサーモブロック１１の壁１３の中に挿入されている。注入された試料物質がＰＣＲの如き熱サイクル反応により繰り返し複製される。他のウェル１２からの試料物質の汚染を避けるために、封鎖媒体２８（ここでは鉱油膜）がウェル１２の１つに設けられている。ウェル１２には、第１面２０に向かって開いた壁１６が隣接している。それゆえ、ピペットチップ４０がピペットロボットによって持ち込まれてウェル１２に到達することができる。両ウェル１２の間ならびに左側のウェル１２とバイオチップ１４との間において、壁１６は切断されているのではなくて、上から見て認識することができる。

バイオチップ１４はプラスチックリング４１によって縁取りされている。このプラスチックリング４１は、好ましくは密封縁部を有し、バイオチップ１４をタイタープレート１０もしくは密封部材３０に対して密封する。バイオチップ１４は、上側に、汚染防止手段として、例えばポリプロピレンからなる密封部材３０を有する。密封部材３０と、バイオチップ１４上の分析対象のための捕捉分子を有する面との間には、試料を受け入れ得るバイオチップ室３６が構成されている。増幅された試料は、ピペットチップ４０により注入口３２を介してバイオチップ室３６の中に移されるが、その際に周りを囲まれた切欠き１８から外に出ることはない。

ウェル１２と注入口３２との間には孔３８が配置されている。この孔３８はタイタープレート１０全体を貫通する。負圧又は真空の適用によって、試料物質による汚染の確率を更に低減する連続的な空気流を発生させることができる。この場合に空気流は第１面２０を介してタイタープレート１０の中に入る。その後、エアロゾル、滴などが空気流と一緒に孔３８を介して排出される。従って、本発明によるタイタープレート１０のためのいわゆる抽出システムが使用できる。更に孔３８がフィルタ材料３９で覆われているとよい。

試料は注入口３２を介してバイオチップ１４上のチップ室３６の中に流入する。過剰の液体がバイオチップ室３６の中に注入された場合、これは、密封部材３０における出口３４を介してオーバーフロータンク２４の中に流入する。オーバーフロータンク２４内にある液体がもう一度元に戻ることができないようにするために、図５に示されているように、中間壁３７がオーバーフロー防止手段として設けられている。中間壁３７と壁１６との間の間隙には、例えば吸収性の芯材が存在し、この芯材は、余剰の試料液体を受け入れ、これを毛細管力により、約１．３ｍｌの液体を収容できるオーバーフロータンク２４の中に導く。

図示されていない他の実施形態によれば、オーバーフロータンク２４は出口３４の直上に配置されているが、しかしバイオチップ室３６からは間隙を介して離されている。オーバーフロータンク２４は、図４に示されているように、ほぼ完全に芯材で占められ、この芯材は１〜２ｍｌの液体を保持することができる。出口３４に現れる液体は芯材によって吸収される。間隙が存在するために、液体がもはや補給されないときには、液体流が直ぐに途切れる。このようにして毛細管力によらなくても逆流は生じない。

タイタープレート１０を用いて、バイオチップ１４による分析対象を検出するための本発明による方法を実施することができる。バイオチップ１４は、前述のようにタイタープレート１０の中に組み込まれている。この方法は次のステップを含む。試料がタイタープレート１０のウェル１２の１つに注入され、そのウェル１２に試薬が注入される。次に、試薬と混合された試料を用いて増幅反応が行なわれ、その際にＰＣＲ反応、ＡＳＰＥ反応及び／又はＡＲＭＳ反応が考慮される。その後、生成された反応混合物がバイオチップ１４上に移送され、分析対象とのハイブリダイゼーションによって少なくとも１つの電気的に検出可能な特性を変化させるバイオチップ１４が読み取られる。本発明による方法は、液体がピペットチップ４０を有するピペットロボットにより移送され、周りを囲われた空間１８内にピペットチップ４０がとどめ置かれることを特徴とする。このためにピペットチップ４０がウェル１２の１つ又は置場位置３３，３５の１つに下ろされる。

ピペットロボットの使用によって分析プロセスが著しく加速され、誤りを生じることが少なくなり、しかもコスト的に有利である。特に、定量分析、統合ＤＮＡ技術（integrated DNA technology；略してＩＤＴ）又はＳＮＰの際の複合多重化のための使用が可能になる。

バイオチップ１４により分析対象を検出するための本発明による方法が図６にフローチャートとして示されている。本発明による方法は、先ず、タイタープレート１０の１つ又は複数のウェル１２内への１つ又は複数の被検査試料の注入１０２を含む。このタイタープレート１０は、既に述べたような本発明によるタイタープレート１０であると好ましい。試料に接触したピペットチップ４０は、その後、ピペットロボットによって通常のように廃棄物処理されてよい。

更なる方法ステップ１０４において、分析対象の増幅反応に必要な試薬がウェル１２内に入れられる。このために他のピペットチップ４０がピペットロボットによって切欠き１８内に入れられ、その後通常のように切欠きの外へ廃棄物処理されてよい。任意選択的に試料が増幅反応前に鉱油により表面膜を形成されるとよい。試薬と試料とが一緒にされた後に、ＰＣＲ反応を進行させるために温度プログラム１０６が実行される。引続いて、反応混合物は検出改善のために大量に複製された形の分析対象を含んでいる。

それゆえ、ステップ１０８において、ピペットロボットが新しい清潔なピペットチップ４０を受け入れる。このピペットチップにより、ステップ１１０において、増幅された試料を有する反応混合物が第１のウェル１２からバイオチップ１４へ移送される。反応混合物がバイオチップ室３６の中へ注入される。場合によっては過剰に受け入れられた反応混合物は出口３４を通してオーバーフロータンク２４の中に流入する。ステップ１１４において、使用されたピペットチップが完全に空にされた後に第１のウェル１２に下ろされる。即ち、そのピペットチップは切欠き１８内にとどめ置かれる。

それゆえ、ステップ１１６において、ピペットロボットが先ず他の新しい清潔なピペットチップ４０を受け入れる。このピペットチップにより、ステップ１１８において、標識酵素が、切欠き１８の外側にある貯蔵タンクから受け入れられ、バイオチップ１４の中に移送される。ピペットチップ４０は、その後でもまだ空になっていなく、従ってステップ１２０において第１の置場位置３３に下ろされる。即ち、そのピペットチップ４０は切欠き１８内にとどめ置かれる。

その後、ステップ１２２において、ピペットロボットが他の新しい清潔なピペットチップ４０を受け入れる。このピペットチップ４０により、ステップ１２４において、基質が切欠き１８の外側にある貯蔵タンクから受け入れられ、バイオチップ１４へ移される。ピペットチップ４０はその後でもまだ空になっていなく、従ってステップ１２６において第２の置場位置３５に下ろされる。即ち、そのピペットチップ４０は切欠き１８内にとどめ置かれる。

その後、ステップ１２８において、バイオチップ１４が読み取られる。

ステップ１１０〜１２８は、なおも多数回繰り返され、しかも他のウェル１２からの他の反応混合物に関して繰り返される。ウェル１２から反応混合物を吸い取るために使用されたピペットチップは、それぞれのウェル１２へ戻されてそこにとどめ置かれ、やがてそのピペットチップはタイタープレート１０と一緒に廃棄物処理される。標識酵素及び基質を移送するのに用いたピペットチップは再使用され、その後再び置場位置３３,３５で待機させられる。

従って、本発明は、使用されたピペットチップを他の試料が検査される他の切欠き１８の上を跨いで廃棄物処理する必要がないことを可能にし、それにより汚染の危険が減少する。

１０ タイタープレート
１１ サーモブロック（サーモサイクラ）
１２ ウェル
１２’ 膨らみ
１３ 槽
１４ バイオチップ
１４’ 収容部
１５ 読取面（接触面）
１６ 壁
１７ 縁枠部
１８ 切欠き（長穴）
１９ 底部
２０ 上面
２１ 単位
２２ 下面
２４ オーバーフロータンク
２６ 読取装置
２８ 封鎖媒体
３０ 密封部材（被覆）
３１ 芯材
３２ 注入口
３３ 置場位置、置場
３４ 位置
３５ 置場位置、置場
３６ バイオチップ室
３７ 中間壁
３８ 孔
３９ フィルタ材料
４０ ピペットチップ
１０２〜１２８ ステップ

Claims (16)

1. 複数の互いに隔てられて分離されたウェル（１２）と、分析対象を検出すべく設計され検出時に電気信号を送出する少なくとも１つのバイオチップ（１４）とを備え、分析対象を検出するためのタイタープレート（１０）において、
   複数のウェル（１２）は、それぞれ、試薬、溶剤、又は分析対象について検査する試料を収容するように定められ、タイタープレート（１０）に組み込まれたバイオチップ（１４）はウェル（１２）から離されてウェル（１２）に隣接して配置され、
   それぞれウェル（１２）の複数個と１つのバイオチップ（１４）とが、多枝の長穴として形成された１つの切欠き（１８）の底部（１９）に配置され、該切欠き（１８）が１つの壁（１６）によって取り囲まれ、
   少なくとも１つの切欠きはタイタープレート（１０）の第１の面（２０）に向いて開き、第１の面（２０）に対向する面（２２）がバイオチップ（１４）のための収容部（１４'）を備えているか又はバイオチップ（１４）がタイタープレートの底部に嵌め込まれている
   ことを特徴とするタイタープレート。
2. タイタープレート（１０）が複数の切欠き（１８）を有することを特徴とする請求項１記載のタイタープレート。
3. 第１の面（２０）に対向する面（２２）がウェル（１２）の膨らみ（１２'）を備えていることを特徴とする請求項１又は２に記載のタイタープレート。
4. 少なくとも１つのバイオチップ（１４）の上にエラストマ密封部材（３０）が設けられ、このエラストマ密封部材が注入口（３２）を有することを特徴とする請求項１乃至３の１つに記載のタイタープレート。
5. バイオチップ（１４）のエラストマ密封部材（３０）の上に、ピペットチップ（４０）のための少なくとも１つの置場が形成されていることを特徴とする請求項４記載のタイタープレート。
6. バイオチップ（１４）の感応面に液体を接触させるバイオチップ室（３６）が存在することを特徴とする請求項１乃至５の１つに記載のタイタープレート。
7. バイオチップ室（３６）が、バイオチップ室（３６）からの液体を受け入れるためのオーバーフロータンク（２４）に接続可能であることを特徴とする請求項６記載のタイタープレート。
8. オーバーフロータンク（２４）内に、バイオチップ室（３６）からの液体を吸い取るための芯材（３１）が配置されていることを特徴とする請求項７記載のタイタープレート。
9. 切欠き（１８）内に、タイタープレート（１０）を貫通する１つの孔（３８）が存在することを特徴とする請求項１乃至８の１つに記載のタイタープレート。
10. バイオチップ（１４）が、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡを検出すべく設計されていることを特徴とする請求項１乃至９の１つに記載のタイタープレート。
11. 請求項１乃至１０の１つに記載のタイタープレート（１０）に組み込まれているバイオチップ（１４）により分析対象を検出するために、基質を複数のウェルのうちの１つからバイオチップに移送する分析対象の検出方法において、
    基質が、ピペットチップ（４０）を有するピペットロボットによりバイオチップ（１４）に移送され、ピペットチップ（４０）が切欠き（１８）内にとどめ置かれることを特徴とする分析対象の検出方法。
12. ａ）複数のウェル（１２）のうちの１つに試料を注入するステップ（１０２）、
    ｂ）複数のウェル（１２）のうちの少なくとも１つに試薬を注入するステップ、
    ｃ）試薬に混合された試料を用いた増幅反応を実行するステップ、
    ｄ）生成された反応混合物をバイオチップ（１４）上へ移送するステップ（１１０）、
    ｅ）分析対象とのハイブリダイゼーションによって少なくとも１つの電気的に検出可能な特性を変化させるバイオチップ（１４）の読取りステップ、
    を有することを特徴とする請求項１１記載の方法。
13. ステップｄ）の後に、標識液体がピペットチップ（４０）によりバイオチップ（１４）上に移送されることを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. 複数のピペットチップ（４０）が切欠き（１８）内にとどめ置かれることを特徴とする請求項１１乃至１３の１つに記載の方法。
15. ピペットチップ（４０）が、複数のウェル（１２）のうちの１つからバイオチップ（１４）上へ生成した反応混合物の移送（１１０）後に、標識液体が移送されたそれぞれのウェル（１２）に置かれることを特徴とする請求項１１乃至１４の１つに記載の方法。
16. ピペットチップ（４０）が、バイオチップ（１４）上への標識液体の移送後に、切欠き（１８）内の１つの置場（３３，３５）に置かれ、その置場が、ピペットチップ（４０）から標識液体が漏れないようにピペットチップ（４０）の下側を封鎖することを特徴とする請求項１１乃至１５の１つに記載の方法。

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