WO2009144173A2 - Titerplatte, leseeinrichtung hierfür und verfahren zur detektion eines analyten, sowie deren verwendung - Google Patents

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WO2009144173A2
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recesses
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Definitions

  • Titer plate reading device therefor and method for the detection of an analyte, and their use
  • the present invention relates to a titer plate for detecting an analyte and a reading device therefor. Furthermore, the invention relates to a method for detecting an analyte. Furthermore, the present invention involves the use of such methods, titer plates and a combination titer plate reader.
  • An almost indispensable method of molecular diagnostics is an amplification of a so-called target - the analyte - by a thermocycling reaction, such as, e.g. a so-called polymerase chain reaction - short PCR.
  • a thermocycling reaction such as, e.g. a so-called polymerase chain reaction - short PCR.
  • the smallest, not directly detectable amounts of analyte molecules are multiplied exponentially to detectable levels.
  • Manipulating samples to be amplified or amplified is extremely critical. Smallest contaminations, for example play on an aerosol, with possibly even only single molecules would lead to sample material with false positive or increased quantitative results. Therefore, it is common in molecular diagnostics to perform sample preparation and amplification in separate rooms. However, this is very expensive and requires the processing of the samples by laboratory staff.
  • a product of the hybridization reaction with the amplified analyte can be detected electrically.
  • the exemplary named quicklab® is disclosed, for example, in DE 102 33 212 A1.
  • Another arrangement for a biochip is known from DE 100 58 397 A1.
  • DE 101 26 341 A1 teaches a biochip which changes an electrically detectable property by hybridization with an analyte. It is an object of the present invention to provide a titer plate which allows for improved automated handling of the amplified samples.
  • the invention particularly comprises a first embodiment of a titer plate according to claim 1.
  • the well plate according to the invention preferably has recesses which are arranged at intervals corresponding to the Abstän ⁇ at a standard microtiter plate, so that the titer plate of the invention can be operated by a pipetting robot.
  • This standard distance is eg 9mm.
  • the titer plate preferably has the length and width of a standard titer plate, eg, it preferably conforms to the standard 12x8 well titer plate format.
  • the thickness of the titre plate according to the invention is preferably larger in order to accommodate the wall, each of which surrounds a biochip and a plurality of recesses, as wei ⁇ ter be described in more detail below.
  • Biochip is understood to mean a chip which is suitable for the detection of an analyte, for example a specific DNA, and is particularly suitable for application of an analyte. senity of the analyte generates an electrical signal.
  • the biochip to one or more sensitive FLAE ⁇ chen with capture molecules, each specifically binding to an analyte.
  • Several sensitive surfaces with different capture molecules can be arranged on a biochip, eg 8 to 400, particularly preferably 64 or 128 sensitive surfaces or "spots.”
  • the biochip is, for example, a CMOS chip with universal zip-code catchers.
  • a plurality of biochips, in particular 6 to 24, preferably 12 biochips are present on a titer plate, so that, for example, 12 random access multiplex assays can be performed.
  • the analyte molecules bind to the capture molecules, for example, hybridize with them, for example, is effected a change in the capacitance of the sensitive surface, the electrically who can read ⁇ .
  • the analyte or the target is biotinylated.
  • a label enzyme such as streptavidin or AG phosphatase is added. This enzyme binds to the biotin of the target.
  • a substrate is subsequently added, a reaction product is produced which generates an electrical signal that can be read by the biochip.
  • the biochip is designed for the detection of DNA by means of hybridization to suitable capture molecules.
  • the sensitive surface (s) of the biochip on one side are ordered at ⁇ while the contacts, where the electrical Sig- can be read nal, on a duly opposite ⁇ the side of the biochip disposed are.
  • 5 to 100 advertising tested in particular 8 to 12 sensitive areas and entspre ⁇ accordingly arranged many contacts to a biochip so that simultaneously a plurality of different analytes the can.
  • the biochip is preferably embedded in the titer plate, for example, the biochip is embedded in a plastic ring, which in turn is inserted into a suitable recess of the titer plate, so that sample or reaction material can be brought into contact with the preferably upwardly facing sensitive surfaces of the biochip ,
  • the biochip on the side of the sensitive surfaces - for example, upwards - provided with a seal which prevents impurities can penetrate the catcher molecules.
  • the seal is for example a cover of an elastomeric and / or thermoplastic material.
  • the biochip preferably extends over a region on which, in the case of a standard titer plate, a fixed number, such as e.g. 2, 4, 6 or 8 wells are arranged.
  • a pipetting robot can stop and aspirate or dispense material. This allows the biochip of pipetting robots to be filled with sample material, reaction material or with label enzymes and substrate.
  • a plurality of depressions or holes are respectively arranged in which, for example, an amplification of the target can be carried out, for example by means of a PCR reaction, or other reagents can be provided.
  • an amplification of the target can be carried out, for example by means of a PCR reaction, or other reagents can be provided.
  • one biochip and several of the wells each form a unit within which a particular analysis is performed. This unit is surrounded by a wall. In a ⁇ standardize all necessary steps for the detection can be carried leads.
  • the spatial separation of the units allows many units to be accommodated in a very small area without risking contamination of the individual samples. A massively parallel examination of very many samples is possible quickly and inexpensively.
  • a unit surrounded by a wall includes 2, 4, 6, 8, or 10 wells and one, two, or three biochips.
  • 4 wells and 1 biochip form one Unit, where the biochip occupies an area that is also taken up by 4 wells in a standard titer plate.
  • a preferred unit thus corresponds to 8 wells and thus has 8 positions in which a pipetting robot can handle a pipette tip.
  • a titer plate in standard 12x8 format thus has 12 units which are each separated by a wall from each ⁇ .
  • the titer plate according to the invention is, for example, a block of about 20-70 mm, preferably of 45 ⁇ 10 mm height, wherein the wall between the individual units is formed by each unit being arranged in a kind of recess in the block.
  • the depressions and the biochip are arranged at the bottom of the recess.
  • the pipetting robot may be a pipette tip from one well to the next well or to the biochip various ⁇ ben within the recess.
  • the wall surrounding the biochip and a plurality of depressions is the wall of the recess and is preferably about as high as the height of the titer plate, ie preferably about 20-70 mm, preferably 45 ⁇ 10 mm high. This effectively prevents can get from a one ⁇ ness in an adjacent unit during pipetting individual droplets.
  • the titer plate preferably has as many recesses as units from a plurality of wells and a biochip.
  • Such a recess is preferably only open to a first side, in particular the upper side of the titer plate.
  • a pipette can be introduced through the recess and remains during the transfer of
  • the first side opposite ⁇ opposite side, preferably the bottom, of the titer plate provides a housing for the biochip prepared and provided with training bulges which in each case one recess entspre ⁇ chen.
  • the recesses are formed respectively in the form ei ⁇ nes elongated hole and have for each unit, for example, in about a "E" shape.
  • the Ausneh ⁇ rules are fit reasonable course of movement of a pipetting robot.
  • the oblong hole extends over all four recesses and at least one position above the biochip, which forms a single connecting line between the recesses and the biochip, which has the advantage that walls are arranged not only between the individual units, but also in part between the individual recesses within a unit
  • the titer plate is preferably made of plastic. Since it is preferably equipped with recesses which are open to one side, it is possible to produce the titer plate (without biochips) by injection molding. Preferably, the walls or recesses and the recesses are made as a one-piece plastic injection-molded part, in which later the biochips are embedded. Alternatively, the titer plate can also be formed as a flat plate with recesses and receptacles for the biochips, are placed on the wall elements between the individual units. Since in this case, a seal between wall elements and plate must be taken care of, this embodiment is not preferred.
  • the biochip is preferably such in the titer plateLet ⁇ tet that each corner of the biochip is located at the corresponding Posi tion ⁇ a recess on the microtiter plate in a standard format. At least one of these positions is a Einyogllport in an elastomeric cover or seal the biochip present.
  • the elastomeric seal serves to protect the sensitive surfaces of the biochip from contamination. You can, for example, moved into a two-component injection molding used in the preparation of the titer plate in this integ ⁇ riert.
  • the seal or cover is clamped by a plastic ring, in which the biochip is embedded.
  • the elastomeric seal is slightly spaced from the sensitive surface of the biochip, whereby a biochip chamber is formed therebetween, which is in fluid communication with the sensitive surfaces of the biochip.
  • liquid can preferably be injected into the biochip chamber, which then comes into contact with the catcher molecules and is thus analyzed by the biochip. Since the filling port of the biochip is, as it were, "aligned" with one of the standard positions of the wells of a titer plate, a pipette can automatically transfer a sample to the biochip by means of the pipetting robot.
  • At least one and preferably two storage positions for a pipette tip are provided above the elastomeric seal of the biochip, namely at one or preferably two of the eg 4 positions, each corresponding to a depression on a standard titer plate and so ⁇ with by a Pipetting robot can be reached.
  • a pipette that has come into contact with the sample material can be deposited at this point and thus remain within the unit, even if fresh pipette tips are possibly present in the unit
  • an overflow reservoir is preferably provided for each unit to receive excess fluid.
  • the overflow reservoir is connected directly to the biochip chamber or can be connected. Consequently If liquid that is filled into the biochip chamber runs directly into the overflow reservoir. Since the biochip is preferably embedded in the bottom of the titer plate, the overflow reservoir is preferably located above the biochip chamber. Therefore, the overflow reservoir is preferably provided with a wick or other absorbent material which draws the liquid from the chip chamber. In this way, all the fluid that is pressed through the chip chamber is received by the overflow reservoir.
  • the overflow reservoir preferably holds 0.5 ml to 5 ml, more preferably 1-2 ml.
  • the overflow reservoir is preferably provided with egg ⁇ ner overflow wall that prevents back flow of liquid in the biochip chamber.
  • the overflow reservoir also be filled, for example through an inlet at one of the standard positions Alternatively, corresponding to the wells of a titer plate stardard.
  • the invention comprises a titer plate for the detection of an analyte, with at least one biochip, wherein the at least one biochip for
  • Detection of an analyte is designed and is from a wall ⁇ give, with a seal, preferably an elastomeric seal on which at least one biochip (14) is applied, which defines a biochip chamber together with the biochip and with an overflow reservoir directly with the biochip chamber is connected or connectable.
  • a seal preferably an elastomeric seal on which at least one biochip (14) is applied, which defines a biochip chamber together with the biochip and with an overflow reservoir directly with the biochip chamber is connected or connectable.
  • the overflow reservoir is preferably located above the biochip chamber. Therefore, the overflow reservoir is preferably provided with a wick or other absorbent material which draws the liquid from the chip chamber. In this way, all the fluid that is pressed through the chip chamber is received by the overflow reservoir.
  • the titer plate according to the invention may be penetrated by at least one bore.
  • This bore extends transversely to the carrier material of the titer plate and preferably opens between the depressions and the biochip.
  • a negative pressure can be applied by means of this, in order to suck off possible droplet impurities from the space above the titer plate.
  • each unit or recess is equipped with its own bore.
  • the invention is indicated on a reading device for a titer plate which is adapted to ensure a white ⁇ tere improve the automatic handling of samples.
  • the reading device provides at least one electrical contact or read-out area for the biochip.
  • the read-out surface can be heated, since the readout result of the biochip can usually only be read out after suitable heat treatment.
  • the reading device also includes trays for the recesses, preferably as heated seats (thermoblocks) konzi ⁇ are piert.
  • thermoblocks heated seats
  • a recess in a pan is taken in each case, preferably the recess is concluded as closely as possible environmentally from the pan to ensure a good heat transfer.
  • the recess is concluded as closely as possible environmentally from the pan to ensure a good heat transfer.
  • an independent thermo-cycle unit hereinafter also called thermoblock.
  • a reading device has mutually independent units each having four trays and a contact surface. It is a further object of the present invention to provide an improved method for detecting an analyte by means of a biochip.
  • a titer plate according to the invention By using a titer plate according to the invention, a so-called “liquid handling” can take place by means of a pipetting robot.
  • the method preferably comprises an amplification of the analyte and offers the advantage of a spatial integration of a hybridization region of the biochip in a common space. Contamination of other sample materials is effectively avoided because the pipette tip remains in the ⁇ sem space.
  • a plurality of pipette tips may be used by the pipetting robot for each unit, which remain within each unit after use. This has the advantage that adjacent units can not be contaminated with amplified material as the pipette tip is transported away across them. Used pipette tips are particularly preferably stored on the storage positions on an ex ⁇ cover or seal of the biochip.
  • the reaction mixtures from the different wells with different pipette tips can successively be transferred into the biochip chamber and the biochip read out.
  • the pipette tip is thereby completely emptied over the biochip chamber, wherein excess liquid flows into the overflow reservoir.
  • the pipette tip is preferably deposited on the same well from which the PCR reaction mixture was transferred.
  • a fresh pipette tip is used, which in turn remains in the unit or recess.
  • another liquid in particular a label liquid
  • a pipette tip onto the biochip or into the biochip chamber.
  • the label is, for example, streptavidin or AG phosphatase, which binds to the biotinylated analyte.
  • the pipette tip used to transfer the label has not yet been emptied, as it may be reused for further samples, and is therefore parked in one of the storage or parking locations.
  • a substrate is preferably pipetted into the biochip chamber with another pipette tip.
  • This forms a reaction product which triggers an electrical signal on the biochip.
  • the pipette tip, with which the substrate was transferred has not yet been emptied, as it is used for any additional samples again, and since ⁇ her parked on a second filing or park positions.
  • the preferred method is that multiple pipette tips, e.g. remain on different storage positions or in the recesses within the recess.
  • thermocyclization reaction For amplification of the analyte, a thermocyclization reaction is preferably used. According to a further development of the method according to the invention, a polymerase chain reaction - in short PCR -, an allele-specific primer expression - ASPE for short - and / or a so-called Amplification Refractory Mutation System - ARMS for short.
  • a temperature-controlled hybridization by means of the biochip is also provided here.
  • An improved detection of the analyte is also achieved by a temperature-controlled electrical, in particular electrochemical, detection. Furthermore, to improve the automatic handling of samples, an analysis device of a combination of Leseein ⁇ direction and titer plate is specified. This combination is adapted to standard pipetting robots.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the titer plate according to the invention.
  • the wells of one unit can be used with four different reference concentrations for quantitative determinations. This is conceivable for expression experiments in the integrated DNA technique or multiple multiplexing in so-called single nucleotide polymorphism (SNP for short).
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • Fig. 1 is a perspective view of an embodiment of a titer plate according to the invention.
  • FIG. 2 shows a perspective view of an embodiment of a reading device for a titer plate according to the invention
  • FIG. 3 is a perspective view of a combination of a titer plate according to Figure 1 with a Leseein ⁇ direction in FIG. 3;
  • FIG. 4 is a plan view of a section of the Obersei ⁇ te the titer plate according to the invention.
  • FIG. 5 shows a longitudinal section through a section of a titer plate and a reading device according to a second embodiment
  • FIG. 6 shows a flowchart of a method according to the invention rens.
  • FIG. 1 shows a titer plate 10 for detecting an analytical th 22 from the bottom of the titer plate 10 includes a plurality of recesses arranged in rows 12 which are visible as bulges 12 'from the lower side ⁇ 22nd
  • the recesses 12 are spaced from each other such and being rich ⁇ tet that a pipetting robot with a pipette tip can contribute to the analyte sample to be tested into the recesses 12 required reagents, solvents, and / or a.
  • biochips 14 In addition to two rows of wells 12 a number of biochips 14 is arranged.
  • the biochip 14 are also positioned in Be ⁇ train to the recesses 12 such that the Ro ⁇ boter the pipette tip can get moved automatically program-ert.
  • These biochips 14 are designed, for example, to detect a DNA by means of hybridization, wherein at least one electrical property of the biochip 14 changes.
  • Such biochips 14 may possibly also include a chip card laboratory.
  • the titer plate 10 is modular, it comprises a block, for example an injection molded part, made of plastic, in which the depressions 12 or bulges 12 'are formed, and the biochips 14. These are accommodated in receptacles 14' in the block.
  • a seal made of a thermoplastic elastomer is preferably arranged, the 'to the upper surface of the titer plate (un ⁇ th in Fig. 1 lying) towards seals the receptacle 14.
  • the seal preferably funnel-shaped openings are arranged, which form an inlet port, an outlet and possibly storage positions.
  • the biochips 14 may each be held in a plastic ring, which is fixed in the receptacle 14 ', eg glued or welded.
  • a plurality of - in this case four - wells 12 each having a biochip 14 are combined to form a unit 21, which is surrounded in FIG. 1 by a dot-dash line.
  • At least along this line 21 extends a wall 16 which encloses four recesses 12 and a biochip 14 and protects against contamination.
  • the injection-molded part has a thickness d - ie a wall height - of about 50mm to about 60mm.
  • the titer plate 10 has 16 such units 21.
  • FIG. 2 shows an exemplary embodiment of a reading device 26 for a titer plate 10.
  • a number of troughs 13 are arranged, which serve as heatable receptacles for the depressions 12 of the titer plate.
  • the bulges 12 'shown in FIG. 1 fit into the tubs 13.
  • the four tubs 13 of a unit 21 are each combined to form a thermoblock 11 and can preferably be heated independently of one another and in particular by the other thermoblocks 11.
  • the illustrated reading device 26 thus comprises 12 independent 4 thermoblocks 11. With a thermoblock 11, an analyte in the wells 12 can be amplified by means of an amplification reaction to a good amount to be detected.
  • the reading device 26 further provides some electrical readout or contact surfaces 15 for the biochips 14.
  • a biochip 14 rests on a readout surface 15, so that the corresponding contacts on the biochip 14 are contacted and read out.
  • the temperature of the readout surfaces 15 can be controlled.
  • 8 electrical contacts are arranged on a Ausleseflä ⁇ che 15, for example.
  • the contact surfaces 15 and trays 13 are surrounded by a border 17 which can align and hold a titer plate 10 shown in FIG. 1 on the reading device 26.
  • the base area and height of the reading device 26 is preferably compatible with the known STARlet® system, ie the dimensions are, for example, 150 ⁇ 110 ⁇ 110 mm 3 and fit into a 7- track carrier.
  • the reading device 26 preferably comprises 12 independent thermo blocks or thermal cycler 11, with which an arbitrarily programmable PCR can be performed, and 12 independent temperature-controlled electrical Bio ⁇ chip read-out blocks.
  • the integrated electronics have preferably ⁇ , a communication interface, turkontrollmaschineen 24 independent temperature and 12 independent digital interfaces for the biochip reading on.
  • titer plate 10 of FIG. 1 is shown from the top, as it is placed on a reading device 26 of FIG. In this case, the titer plate 10 is supported by the border 17.
  • recesses 18 can be seen, each having the shape of an approximately E-shaped elongated hole.
  • the recesses 18 penetrate as far as the bottom of the titer plate 10, ie they are "milled in” as a block, and each recess 18 is therefore bounded by relatively thick walls 16 which extend to the recesses 12 in the titer plate 10.
  • the walls 16 provide a fenestration of the individual units of wells 12 and the biochip 14. These are located at the bottom 19 of the recess 18 and can be reached by a pipetting robot The pipetting robot moves a pipette tip 40 to transfer an amplified sample mixture from the well 12 in the biochip 14 along the slot 18.
  • FIG. 4 schematically shows a plan view of a single unit 21 comprising a biochip and four depressions of a titer plate 10 from the upper side 20.
  • a recess 18 is introduced in the titer plate 10.
  • the recess 18 is formed as a slot and enclosed by the walls 16.
  • To the top 20 towards the recess 18 is open.
  • Through the recess 18 can be seen on the bottom 19 of the titer plate 10, in which four depressions 12 shown on the right are embedded.
  • On the left side of the biochip 14 is below the dashed line.
  • the biochip 14 is covered, for example, by a seal 30, in which a filling port is inserted at 32, by means of which a sample can be brought into contact with the biochip 14 by means of a pipette tip.
  • the seal 30 on the biochip 14 is not permeable, but provided with a small receptacle for a pipette tip.
  • This receptacle may be, for example, a small depression in the seal 30 in which a pipette tip can be received. However, such depressions are not absolutely necessary.
  • a pipette tip can be deposited at positions 33 and 35. Therefore, these positions 33, 35 are connected to the slot 18.
  • the opening of the pipette tip is sealed by the elastomeric material of the seal 30, so that the pipette tip can still be filled with eg substrate or label enzyme when it is parked at one of these storage positions 33 or 35.
  • an opening of an overflow reservoir is arranged. This position is not connected to the slot 18, since it is not necessary to move to this position a pipette tip.
  • Recess 18 designed in the form of a multi-membered elongated hole, which makes, inter alia, the four wells "accessible from above.” That means that pipette tips 40 can be introduced and moved by means of a pipetting robot via the slot 18. The inserted pipette tip reached be made without departing from the recess 18 to Müs ⁇ sen both all the wells 12 and the biochip 14. a target containing the amplified sample can be taken up by the pipette from one of the pits 12 transferred via the injection port 32 in the biochip fourteenth the
  • Fill port 32 penetrates the elastomeric seal or coating 30 that is applied to the biochip 14 for protection. Via the filling port 32, the liquid sample passes from a pipette tip 40 into a biochip chamber 36, which is arranged adjacent to the sensitive surfaces of the biochip 14 and in particular runs between the biochip 14 and the seal 30. From the biochip chamber 36 goes from an overflow reservoir 24, which is open to the top. In the overflow reservoir 24, a wick element 31 is arranged, in this case a zy ⁇ linderförmiges piece of absorbent material, such as foam or cotton wool. From the biochip chamber 34, the liquid sample from a pipette tip 40 thus continues to run into the overflow reservoir 24.
  • a pipette tip may remain in 6 different positions within the recess 18 after use: if the pipette spit is still filled, e.g. With label or substrate, in particular with a liquid that will be needed again later, it can be parked on one of the two storage positions 33, 35, where its opening is closed by the seal 30.
  • An empty, used pipette tip e.g. after pipetting PCR product from one of the depressions 12 via the filling port 32 into the biochip chamber 36, it is possible to deposit in the respective depression 12. After the transfer of PCR product into the biochip chamber 36, the pipette tip can be completely emptied, since the biochip chamber 36 is connected directly to the overflow reservoir 24, into which all excess liquid is sucked off.
  • FIG. 5 shows a combination of a titer plate 10 with a reading device 26 in longitudinal section, again showing only one unit 21.
  • the titer plate 10 comprises a plurality of depressions 12, the bulges 12 'of which are introduced into troughs 13 of a thermoblock 11.
  • the introduced sample material is copied several times by means of a thermocyclization reaction, such as a PCR.
  • a barrier medium 28 - here a mineral oil film - is provided in one of the wells 12.
  • To the wells 12 close to walls 16, which are open to the first side 20.
  • pipette tips 40 introduced by a pipetting robot can reach the recesses 12.
  • the wall 14 is not cut, but recognizable in plan view.
  • the biochip 14 is surrounded by a plastic ring 41, which preferably has a sealing lip and seals the biochip 14 against the titer plate 10 or the seal 30.
  • the biochip 14 has as a contamination protection a seal 30, e.g. made of polypropylene.
  • a biochip chamber 36 is formed, into which a sample can be taken.
  • the amplified sample can be transferred with the pipette tip 40 via a filling port 32 into the biochip chamber 36, wherein the bounded recess 18 is not left.
  • a bore 38 is arranged between the recesses 12 and the filling port 32.
  • This bore 38 penetrates the entire titer plate 10.
  • a vacuum or vacuum By applying a vacuum or vacuum, a steady stream of air can be generated which further reduces the likelihood of contamination with sample material.
  • the air flow enters the titer plate 10 via the first side 20.
  • An aerosol, droplets or the like is then removed with the air flow through the bore 38.
  • the bore 38 may also be covered with a filter material 39.
  • an intermediate wall 37 is provided as an overflow reservoir. provided as shown in Figure 5.
  • a Saugdocht which can absorb excess sample liquid and conducts it by means of capillary forces in the overflow reservoir 24, which can accommodate about 1.3ml liquid.
  • the overflow reservoir 24 is arranged directly above the outlet 34, but separated from the biochip chamber 36 by a gap.
  • the overflow reservoir 24 is almost completely filled with a wicking element, as shown in Fig. 4, which can hold about 1 to 2 ml of liquid. Liquid occurring at the outlet 34 is absorbed by the wick. Due to the gap, the liquid flow breaks off immediately, if no liquid is replenished. In this way, no return flow, not even by capillary forces.
  • the method according to the invention for the detection of an analyte by means of a biochip 14 can be performed ⁇ .
  • the biochip 14 is integrated in a titer plate 10 in ⁇ as described above.
  • the method comprises the following steps: introduction of a sample into one of the depressions 12 of the titer plate 10 and introduction of reagents into the depressions 12
  • the inventive method is characterized in that the liquids are transferred by means of a pipetting robot with the pipette tip 40 and the pipette tip 40 remains within the enclosed space 18. For this purpose, it is stored in one of the recesses 12 or on one of the storage positions 33, 35.
  • the use of pipetting robots considerably speeds up the analysis process, is less error-prone and more cost-effective.
  • FIG. 6 An inventive method for detecting an analyte by means of biochips 14 is shown in FIG. 6 as a flow chart. It first comprises the introduction 102 of one or more sample (s) to be examined into one or more of the wells 12 of a titer plate 10.
  • This titer plate 10 is preferably a titer plate 10 according to the invention as described above.
  • the pipette tip 40 brought into contact with the sample can then be disposed of in the usual way by a pipetting robot.
  • reagents required for an amplification reaction of the analyte are introduced into the recesses 12.
  • a further Pi ⁇ pettenspitze introduced by pipetting robot 40 into the recess 18 and preferably thereafter disposed of in the usual way except ⁇ half the recess.
  • the sample may be overcoated with mineral oil prior to the amplification reaction.
  • Temperature program 106 performed to run off a PCR reaction ⁇ run.
  • the reaction mixture then contains the analyte in bulk copied form for better detection.
  • the pipetting robot picks up a new, clean Pi ⁇ pettenspitze 40, step 108.
  • this pipette tip is transferred in step 110, the reaction mixture having the amplifizier- th sample from a first of the recesses 12 in the biochip fourteenth
  • the reaction mixture is introduced into the Biochipkam ⁇ mer 36th Possibly too much captured running ⁇ reaction mixture through the outlet 34 into the overflow reservoir 24.
  • the used pipette tip is after the complete unloading emptied at the first recess 12, step 114, ie it remains within the recess 18th
  • the pipetting robot initially picks up another new, clean pipette tip 40, step 116.
  • this pipette tip is made in step 118 a label enzyme from a befindlichem outside the recess 18 reservoir on ⁇ and transferred to the biochip fourteenth
  • the pipette tip 40 is then not yet empty, and is therefore stored at the first storage position 33, step 120, that is, it remains ⁇ ver within the recess 18th
  • the liquid-handling robot picks up a further new clean pipette tip 40, step 122.
  • this pipette tip is received in step 124, a substrate made of a befindlichem outside the recess 18 from ⁇ reservoir and transferred into the biochip fourteenth
  • the pipette tip 40 is then not empty and is therefore deposited at the second storage position 35, step 126, ie it remains within the recess 18th
  • biochip 14 may be read out, step 128.
  • Steps 110 to 128 may be repeated several more times with the other reaction mixtures from the other wells 12.
  • the pipette tip used to pipette the reaction mixture from the well 12 is returned to the respective well 12 and remains there until it is disposed of together with the titer plate 10.
  • Substrate were transferred are used again and there ⁇ parked again at the storage positions 33, 35.
  • the invention thus allows, used pipette tips do not have other recesses 18 in which are ⁇ tersucht other samples un having to dispose of time and thus reduces the risk of contamination.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Titerplatte (10) und Verfahren zur Detektion eines Analyten sowie deren Verwendung. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, mehrere Vertiefungen (12) und einen daneben angeordneten Biochip (14) der Titerplatte (10) mit einer Wand (16) zu umgeben, um bei hoher räumlicher Integration eine Probenkontamination wirksam zu vermeiden.

Description

Beschreibung
Titerplatte, Leseeinrichtung hierfür und Verfahren zur Detek- tion eines Analyten, sowie deren Verwendung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Titerplatte zur Detektion eines Analyten sowie eine Leseeinrichtung hierfür. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Detektion eines Analyten. Des Weiteren bezieht die vorlie- gende Erfindung die Verwendung derartiger Verfahren, Titerplatten und eine Kombination von Titerplatte-Leseeinrichtung ein.
Mittels molekulardiagnostischer Analysen werden z.B. virale Belastungen von HI Viren, Hepatitis C und Hepatitis B Viren bestimmt. In einem Zentral-Labor werden heute derartige Analysen häufig auf Pipettier-Roboter-Anlagen durchgeführt. Als Reaktionsgefäße werden Mikrotiterplatten, insbesondere sogenannte 96er Platten mit beispielsweise 8 Reihen zu je 12 Vertiefungen, eingesetzt. Diese Vertiefungen sind in standardisierten Abständen von etwa 0,9 cm voneinander angeordnet. Probenmateri¬ al und Reagenzien werden vom Pipettier-Roboter frei programmierbar mittels Pipettenspitzen aus Plastik oder waschbaren, wieder verwendbaren Spitzen in vorbestimmte Vertiefungen bzw. Wells der Titerplatten pipettiert. Außerdem werden in der Pi- pettier-Roboter-Anlage einige Arbeitsschritte wie Inkubation bei bestimmter Temperatur, Misch-Vorgänge oder zum Beispiel magnetische Trennvorgänge durchgeführt.
Ein nahezu unverzichtbares Verfahren der Molekulardiagnostik ist eine Amplifikation eines sogenannten Targets - des Analyten - durch eine Thermozyklisierungsreaktion wie z.B. einer sogenannten Polymerase-Chain-Reaktion - kurz PCR. Dabei werden kleinste, nicht direkt nachweisbare Mengen an Analyt-Molekülen exponentiell auf nachweisbare Mengen vervielfältigt.
Ein Manipulieren von zu amplifizierenden bzw. amplifizierten Proben ist äußerst kritisch. Kleinste Kontaminationen, zum Bei- spiel über eine Aerosolbildung, mit ggf. sogar nur einzelnen Molekülen würden zu Probenmaterial mit falsch positiven oder erhöhten quantitativen Ergebnissen führen. Deshalb ist es in der Molekulardiagnostik üblich, Probenvorbereitung und Amplifi- kation in getrennten Räumen durchzuführen. Dies ist jedoch sehr aufwendig und benötigt die Bearbeitung der Proben durch Labormitarbeiter.
Ein Lösungsweg besteht in einem hermetischen Versiegeln der Ti- terplatte mit Laminierfolie vor Durchführung der PCR wie in der DE 10 2005 059 535 Al beschrieben. Die Titerplatte darf anschließend im gleichen Raum nicht mehr geöffnet werden. Diese Maßnahme der getrennten Räume steht dem Trend entgegen, Analysenprozesse zu integrieren und zu automatisieren.
Um das entstandene PCR-Produkt mitsamt dem amplifizierten Ana- lyten zu analysieren, kommen beispielsweise optische Verfahren auf Basis von sogenannten Real-Time-PCR in Frage. Es gibt jedoch Messverfahren in der Molekulardiagnostik zur elektrischen Detektion, bei welchen Hybridisierungsreaktionen durchgeführt werden. Ein gattungsgemäßes Verfahren ist aus der WO 99/07879 Al bekannt. Dazu wird das entstandene PCR-Produkt aus dem Reak¬ tionsgefäß in ein weiteres Gefäß für die Hybridisierung überführt. Eine Lösung für einen kontaminationsfreien Transfer liegt in einer hermetischen Integration der Gefäße für die PCR und die Hybridisierung in einer geschlossenen Kassette, wie z.B. in einer sogenannten quicklab® Point of Care-Kassette . Diese Lösung ist jedoch für eine routinemäßige, vielfältige An¬ wendung oft zu teuer und erlaubt nur vergleichsweise geringe Durchsätze.
Für eine effiziente Detektion kann ein Produkt der Hybridisie- rungsreaktion mit dem amplifizierten Analyten elektrisch er- fasst werden. Das exemplarisch genannte quicklab® ist zum Bei- spiel in der DE 102 33 212 Al offenbart. Eine weitere Anordnung für einen Biochip ist aus der DE 100 58 397 Al bekannt. Die DE 101 26 341 Al lehrt einen Biochip, der durch Hybridisierung mit einem Analyten eine elektrisch erfassbare Eigenschaft ändert. Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Titerplatte anzugeben, die eine verbesserte automatisierte Handhabung der amplifizierten Proben ermöglicht.
Diese Aufgabe wird mit technisch einfachen Mitteln gemäß Anspruch 1 gelöst.
Die Erfindung umfasst insbesondere eine erste Ausführungsform einer Titerplatte gemäß Anspruch 1.
Die erfindungsgemäße Titerplatte weist vorzugsweise Vertiefungen auf, die in Abständen angeordnet sind, die den Abstän¬ den bei einer Standard-Mikrotiterplatte entsprechen, damit die erfindungsgemäße Titerplatte von einem Pipettier-Roboter bedient werden kann. Dieser Standard-Abstand beträgt z.B. 9mm. Darüber hinaus weist die Titerplatte vorzugsweise die Länge und die Breite einer Standard-Titerplatte auf, z.B. entspricht sie bevorzugt dem Standard-Titerplattenformat mit 12x8 Vertiefungen. Die Dicke der erfindungsgemäßen Titerplatte ist bevorzugt größer, um die Wand zu beherbergen, die jeweils einen Biochip und mehrere Vertiefungen umgibt, wie wei¬ ter unten noch genauer beschrieben.
Die erfindungsgemäße Titerplatte kann bevorzugt durch einen Pipettier-Roboter bedient werden, der über einen Vorrat an frischen Pipettenspitzen verfügt. Diese kann er greifen, an eine beliebige der z.B. 12x8=96 Positionen der Vertiefungen auf einer Standard-Titerplatte verfahren, sie dort absenken und aus der Vertiefung Flüssigkeit absaugen oder einspritzen. Darüber hinaus kann er eine gebrauchte Pipettenspitze in ei¬ nem Abfallbehälter ablegen, eine neue, saubere Pipettenspitze greifen und mit dieser weiterarbeiten.
Zur Detektion des Analyten ist erfindungsgemäß zumindest ein Biochip auf der Titerplatte angeordnet. Unter „Biochip" wird ein Chip verstanden, der zur Detektion eines Analyten, z.B. einer bestimmten DNA, geeignet ist und insbesondere bei Anwe- senheit des Analyten ein elektrisches Signal erzeugt. Typischerweise weist der Biochip eine oder mehrere sensitive Flä¬ chen mit Fängermolekülen auf, die jeweils spezifisch an einen Analyten binden. Es können an einem Biochip mehrere sensitive Flächen mit verschiedenen Fängermolekülen angeordnet sein, z.B. 8 bis 400, besonders bevorzugt 64 oder 128 sensitive Flächen bzw. „Spots". Bei dem Biochip handelt es sich z.B. um einen CMOS Chip mit universellen Zip-Code Fängern. Bevorzugt sind mehrere Biochips, insbesondere 6 bis 24, vorzugsweise 12 Biochips auf einer Titerplatte vorhanden, so dass z.B. 12 Random Access Multiplex Assays durchgeführt werden können.
Wenn Analytmoleküle an die Fängermoleküle anbinden, z.B. mit ihnen hybridisieren, wird z.B. eine Änderung der Kapazität an der sensitiven Fläche bewirkt, die elektrisch ausgelesen wer¬ den kann. Dies geschieht vorzugsweise wie folgt: Die Analyt bzw. das Target ist biotinyliert . Nachdem Analytmoleküle an die Fängermoleküle gebunden haben, wird ein Label-Enzym wie z.B. Streptavidin oder AG Phosphatase beigefügt. Dieses Enzym bindet an das Biotin des Targets. Wenn daraufhin ein Substrat beigefügt wird, entsteht ein Reaktionsprodukt, welches ein elektrisches Signal erzeugt, das vom Biochip ausgelesen werden kann. Besonders bevorzugt ist der Biochip zur Detektion von DNA mittels Hybridisierung an geeignete Fängermoleküle ausgelegt.
Vorzugsweise ist/sind die sensitiven Fläche (n) des Biochips auf einer Seite, insbesondere der Oberseite des Biochips an¬ geordnet, während die Kontakte, an denen das elektrische Sig- nal ausgelesen werden kann, auf einer hierzu gegenüberliegen¬ den Seite des Biochips angeordnet sind. Vorzugsweise sind 5 bis 100, insbesondere 8 bis 12 sensitive Flächen und entspre¬ chend viele Kontakte an einem Biochip angeordnet, so dass gleichzeitig auf mehrere verschiedene Analyten getestet wer- den kann. Der Biochip ist vorzugsweise in die Titerplatte eingebettet, z.B. ist der Biochip in einen Kunststoffring eingelassen, der wiederum in eine geeignete Vertiefung der Titerplatte eingesetzt ist, so dass Proben- oder Reaktionsmaterial in Kontakt mit den bevorzugt nach oben weisenden sensitiven Flächen des Biochips gebracht werden kann. Bevorzugt ist der Biochip auf der Seite der sensitiven Flächen - z.B. nach oben hin - mit einer Dichtung versehen, welche verhindert, dass Verunreinigungen an die Fängermoleküle dringen können. Die Dichtung ist z.B. eine Abdeckung aus einem elastomeren und/oder thermoplastischen Material.
Der Biochip erstreckt sich dabei vorzugsweise über einen Bereich, auf dem bei einer Standard-Titerplatte eine feste An- zahl wie z.B. 2, 4, 6 oder 8 Vertiefungen angeordnet sind. An der Standard-Position einer Vertiefung kann ein Pipettier- Roboter anhalten und Material ansaugen oder abgeben. Dadurch kann der Biochip von Pipettier-Robotern mit Probenmaterial, Reaktionsmaterial oder mit Label-Enzymen und Substrat befüllt werden.
Neben jedem DNA-Chip sind jeweils mehrere Vertiefungen bzw. Löcher angeordnet, in denen z.B. eine Amplifikation des Targets z.B. mittels einer PCR Reaktion durchgeführt werden kann oder andere Reagenzien bereitgestellt werden. Somit bilden ein Biochip und mehrere der Vertiefungen jeweils eine Einheit, innerhalb derer eine bestimmte Analyse durchgeführt wird. Diese Einheit ist von einer Wand umfriedet. In der Ein¬ heit können alle notwendigen Schritte zur Detektion durchge- führt werden. Durch die räumliche Abtrennung der Einheiten können viele Einheiten auf sehr kleiner Fläche untergebracht werden, ohne das Kontaminieren der einzelnen Proben zu riskieren. Eine massiv parallele Untersuchung von sehr vielen Proben ist schnell und kostengünstig möglich.
Zu einer von einer Wand umgebenen Einheit gehören z.B. 2, 4, 6, 8, oder 10 Vertiefungen und ein, zwei oder drei Biochips. Besonders bevorzugt bilden 4 Vertiefungen und 1 Biochip eine Einheit, wobei der Biochip eine Fläche belegt, die bei einer Standard-Titerplatte ebenfalls von 4 Vertiefungen eingenommen wird. Eine bevorzugte Einheit entspricht somit 8 Vertiefungen und weist somit 8 Positionen auf, in denen ein Pipettier- Roboter eine Pipettenspitze handhaben kann. Eine Titerplatte im Standard 12x8 Format weist somit 12 Einheiten auf, die je¬ weils durch eine Wandung voneinander abgetrennt sind.
Die erfindungsgemäße Titerplatte ist beispielsweise ein Block von ca. 20-70mm, vorzugsweise von 45±10mm Höhe, wobei die Wandung zwischen den einzelnen Einheiten dadurch gebildet wird, dass jede Einheit in einer Art Ausnehmung in dem Block angeordnet ist. Die Vertiefungen und der Biochip sind am Grund der Ausnehmung angeordnet. Der Pipettier-Roboter kann innerhalb der Ausnehmung eine Pipettenspitze von einer Vertiefung zur nächsten Vertiefung bzw. zu dem Biochip verschie¬ ben. Die Wand, die den Biochip und mehrere Vertiefungen umgibt, ist die Wand der Ausnehmung und ist bevorzugt etwa so hoch wie die Höhe der Titerplatte also bevorzugt ca. 20-70mm, vorzugsweise 45±10mm hoch. Dadurch wird wirkungsvoll verhindert, dass beim Pipettieren einzelne Tröpfchen von einer Ein¬ heit in eine daneben liegende Einheit gelangen können. Somit weist die Titerplatte vorzugsweise so viele Ausnehmungen auf wie Einheiten aus jeweils mehreren Vertiefungen und einem Biochip.
Eine derartige Ausnehmung ist bevorzugt lediglich zu einer ersten Seite, insbesondere der Oberseite der Titerplatte, hin offen. In jede Einheit kann eine Pipette über die Ausnehmung eingebracht werden und verbleibt während des Transfers der
Probe z.B. von einer Vertiefung zum Biochip innerhalb des um¬ friedeten Raumes der Einheit. Die der ersten Seite gegenüber¬ liegende Seite, vorzugsweise die Unterseite, der Titerplatte stellt eine Aufnahme für den Biochip bereit und ist mit Aus- Wölbungen versehen, welche jeweils einer Vertiefung entspre¬ chen . Besonders bevorzugt sind die Ausnehmungen jeweils in Form ei¬ nes Langlochs ausgebildet und weisen für jede Einheit beispielsweise in etwa eine „E" Form auf. Dabei sind die Ausneh¬ mungen dem Bewegungsablauf eines Pipettier-Roboters ange- passt. Das Langloch erstreckt sich über alle vier Vertiefungen und zumindest eine Position über dem Biochip. Es bildet quasi eine einzige Verbindungslinie zwischen den Vertiefungen und dem Biochip. Dies hat den Vorteil, dass nicht nur zwischen den einzelnen Einheiten, sonders teilweise auch zwi- sehen den einzelnen Vertiefungen innerhalb einer Einheit Wandungen angeordnet sind. Kommt eine Pipettenspitze einmal mit Probenmaterial in Kontakt, kann die Spitze innerhalb dieser Einheit belassen werden. Anders als bei bekannten Titerplatten können kleinste Tröpfchen nicht in andere Analyseeinhei- ten geraten und diese kontaminieren, da eine benutzte Pipettenspitze nicht über andere Vertiefungen, bzw. Chips herausgeführt wird. Die Ausnehmung ist nach einer Weiterbildung so ausgebildet, dass eine oder mehrere Pipettenspitzen hierin verbleiben können.
Die Titerplatte ist bevorzugt aus Kunststoff hergestellt. Da sie bevorzugt mit Ausnehmungen ausgestattet ist, die zu einer Seite hin offen sind, ist es möglich, die Titerplatte (ohne Biochips) im Spritzguss-Verfahren herzustellen. Vorzugsweise sind die Wände bzw. Ausnehmungen und die Vertiefungen als ein einstückiges Kunststoff-Spritzgussteil gefertigt, in dass später die Biochips eingebettet werden. Alternativ kann die Titerplatte auch als eine flache Platte mit Vertiefungen und Aufnahmen für die Biochips ausgebildet werden, auf die Wand- elemente zwischen den einzelnen Einheiten aufgesetzt werden. Da in diesem Fall für eine Dichtung zwischen Wandelemente und platte gesorgt werden muss, ist diese Ausführungsform jedoch nicht bevorzugt.
Der Biochip ist bevorzugt derart in die Titerplatte eingebet¬ tet, dass jede Ecke des Biochips an der entsprechenden Posi¬ tion einer Vertiefung auf der Mikrotiterplatte im Standardformat liegt. An zumindest einer dieser Positionen ist ein Einfüllport in einer elastomeren Abdeckung oder Dichtung des Biochips vorhanden. Die elastomere Dichtung dient dazu, die sensitiven Flächen des Biochips vor Kontamination zu schützen. Sie kann z.B. in einem Zweikomponenten-Spritzguss- verfahren bei der Herstellung der Titerplatte in diese integ¬ riert werden. Alternativ ist die Dichtung bzw. Abdeckung durch einen Kunststoffring aufgespannt, in den der Biochip eingelassen ist. Besonders bevorzugt ist die elastomere Dich¬ tung leicht von der sensitiven Fläche des Biochips beabstan- det, wodurch dazwischen eine Biochipkammer gebildet wird, welche in einer Flüssigkeitsverbindung mit den sensitiven Flächen des Biochips steht.
Über den Einfüllport kann bevorzugt Flüssigkeit in die Bio- chipkammer eingespritzt werden, die dann in Kontakt mit den Fängermolekülen gelangt und somit vom Biochip analysiert wird. Da der Einfüllport des Biochips quasi mit einer der Standard-Positionen der Vertiefungen einer Titerplatte „fluchtet", kann eine Pipette mittels des Pipettier-Roboters automatisch eine Probe auf den Biochip transferieren.
Besonders bevorzugt sind oberhalb der elastomeren Dichtung des Biochips zumindest eine und bevorzugt zwei Ablagepositio- nen für eine Pipettenspitze vorgesehen, und zwar an einer oder bevorzugt zwei der z.B. 4 Positionen, die jeweils einer Vertiefung auf einer Standard-Titerplatte entsprechen und so¬ mit durch einen Pipettier-Roboter erreichbar sind. Eine mit Probenmaterial in Kontakt gekommene Pipette kann an dieser Stelle abgelegt werden und somit innerhalb der Einheit verbleiben, auch wenn ggf. frische Pipettenspitzen in der
Einheit verwendet werden. Darüber hinaus können weitere 4 Pi¬ pettenspitzen an den Positionen der 4 Vertiefungen verbleiben .
Ferner ist bevorzugt ein Überlaufreservoir für jede Einheit vorgesehen, um überschüssige Flüssigkeit aufzunehmen. In ei¬ ner bevorzugten Ausführungsform ist das Überlaufreservoir direkt mit der Biochipkammer verbunden bzw. verbindbar. Somit läuft Flüssigkeit, die in die Biochipkammer eingefüllt wird, direkt weiter in das Überlaufreservoir . Da der Biochip bevorzugt in den Boden der Titerplatte eingelassen ist, befindet sich das Überlaufreservoir bevorzugt oberhalb der Biochipkam- mer. Daher ist das Überlaufreservoir vorzugsweise mit einem Docht oder einem anderen saugfähigen Material ausgestattet, das die Flüssigkeit aus der Chipkammer zieht. Auf diese Weise wird sämtliche Flüssigkeit, die durch die Chipkammer gedrückt wird, von dem Überlaufreservoir aufgenommen. Das Überlaufre- servoir fasst bevorzugt 0,5 ml bis 5 ml, besonders bevorzugt 1-2 ml. Ferner ist das Überlaufreservoir vorzugsweise mit ei¬ ner Überlaufwand ausgestattet, die ein Zurückfließen von Flüssigkeit in die Biochipkammer verhindert. Alternativ könn¬ te das Überlaufreservoir auch z.B. durch einen Einlass an ei- ner der Standard-Positionen befüllt werden, die den Vertiefungen auf einer Stardard-Titerplatte entsprechen.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform umfasst die Erfindung eine Titerplatte zur Detektion eines Analyten, mit zu- mindest einem Biochip, wobei der zumindest eine Biochip zur
Detektion eines Analyten ausgelegt ist und von einer Wand um¬ geben ist, wobei eine Dichtung, bevorzugt eine elastomere Dichtung, auf dem zumindest einen Biochip (14) aufgebracht ist, welche gemeinsam mit dem Biochip eine Biochipkammer de- finiert und mit einem Überlaufreservoir direkt mit der Biochipkammer verbunden bzw. verbindbar ist. Somit läuft Flüssigkeit, die in die Biochipkammer eingefüllt wird, direkt weiter in das Überlaufreservoir . Da der Biochip bevorzugt in den Boden der Titerplatte eingelassen ist, befindet sich das Überlaufreservoir bevorzugt oberhalb der Biochipkammer. Daher ist das Überlaufreservoir vorzugsweise mit einem Docht oder einem anderen saugfähigen Material ausgestattet, das die Flüssigkeit aus der Chipkammer zieht. Auf diese Weise wird sämtliche Flüssigkeit, die durch die Chipkammer gedrückt wird, von dem Überlaufreservoir aufgenommen. Gemäß dieser Alternativen Ausführungsform sind keine weiteren Vertiefungen in der Titerplatte notwendig, so dass die gesamte Grundfläche der Titerplatte komplett mit Biochips belegt werden kann. Sämtliche weitere bevorzugten Erfindungsmerkmale, die in Zusammenhang mit der ersten Ausführungsform der Erfindung gemäß Anspruch 1 genannt sind, können auch bei der alternativen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Titerplatte vorgesehen werden.
Optional kann die erfindungsgemäße Titerplatte von zumindest einer Bohrung durchdrungen sein. Diese Bohrung verläuft quer zum Trägermaterial der Titerplatte und mündet vorzugsweise zwischen den Vertiefungen und dem Biochip. Darüber kann ein Unterdruck angelegt werden, um eventuelle Tröpfchenverunreinigungen aus dem Raum über der Titerplatte abzusaugen. Vorzugsweise ist jede Einheit bzw. Ausnehmung mit einer eigenen Bohrung ausgestattet.
Des Weiteren ist die Erfindung auf eine Leseeinrichtung für eine Titerplatte angegeben, die dazu ausgelegt ist, eine wei¬ tere Verbesserung der automatischen Handhabung der Proben zu gewährleisten. Die Leseeinrichtung stellt mindestens eine elektrische Kontakt- bzw. Auslesefläche für den Biochip bereit. Bevorzugt ist die Auslesefläche beheizbar, da das Ausleseergeb¬ nis des Biochips in der Regel erst nach geeigneter Wärmebehandlung auslesbar ist.
Die Leseeinrichtung umfasst zudem Wannen für die Vertiefungen, die vorzugsweise als beheizbare Aufnahmen (Thermoblöcke) konzi¬ piert sind. Beim Aufsetzen der Titerplatte auf die Leseeinrich¬ tung wird jeweils eine Vertiefung in einer Wanne aufgenommen, vorzugsweise ist die Vertiefung möglichst eng von der Wanne um- schlössen, um einen guten Wärmetransfer zu gewährleisten. Vorzugsweise bilden jeweils so viele Wannen, wie Vertiefungen in einer Einheit ausgebildet sind, eine unabhängige Thermozyklus- Einheit, im Folgenden auch Thermoblock genannt. Durch geeignetes Beheizen der Wannen kann in den Vertiefungen z.B. eine PCR durchgeführt werden.
Bevorzugt weist eine Leseeinrichtung voneinander unabhängigen Einheiten zu je vier Wannen und einer Kontaktfläche auf. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Detektion eines Analyten mittels eines Biochips anzugeben. Durch den Einsatz einer erfindungs- gemäßen Titerplatte kann ein sogenanntes „Liquid Handling" mittels Pipettier-Roboter erfolgen.
Das Verfahren umfasst neben einem Einbringen der Probe in eine der Vertiefungen der Titerplatte bevorzugt eine Amplifika- tion des Analyten und bietet den Vorteil einer räumlichen Integration eines Hybridisierungsbereichs des Biochips in einem gemeinsamen Raum. Eine Kontamination von anderen Probenmaterialien wird wirksam vermieden, da die Pipettenspitze in die¬ sem Raum verbleibt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens können für jede Einheit mehrere Pipettenspitzen durch den Pipettier- Roboter verwendet werden, die nach der Verwendung jeweils innerhalb der Einheit verbleiben. Dies hat den Vorteil, dass benachbarte Einheiten nicht mit amplifiziertem Material kontaminiert werden können, wenn die Pipettenspitze über sie hinweg abtransportiert wird. Besonders bevorzugt werden gebrauchte Pipettenspitzen auf den Ablagepositionen auf der Ab¬ deckung oder Dichtung des Biochips abgelegt.
Beispielsweise werden nicht nur eine, sonders mehrere Proben, z.B. von verschiedenen Geweben des gleichen Patienten, in die verschiedenen Vertiefungen einer Einheit eingebracht. Nach einer PCR können nacheinander die Reaktionsgemische aus den verschiedenen Vertiefungen mit verschiedenen Pipettenspitzen in die Biochipkammer transferiert und der Biochip ausgelesen werden. Die Pipettenspitze wird dabei über der Biochipkammer vollständig entleert, wobei überschüssige Flüssigkeit in das Überlaufreservoir fließt. Danach wird die Pipettenspitze vor- zugsweise auf derselben Vertiefung abgelegt, von der das PCR- Reaktionsgemisch transferiert wurde. Für weitere Manipulationen wird eine frische Pipettenspitze verwendet, die wiederum in der Einheit bzw. Ausnehmung verbleibt. Vorzugsweise wird nach dem Transferieren das PCR-Reaktions- produktes eine weitere Flüssigkeit insbesondere eine Label- Flüssigkeit, mit eine Pipettenspitze auf den Biochip bzw. in die Biochipkammer transferiert. Der Label ist z.B. Streptavi- din oder AG Phosphatase, welche an den biotinlylierten Analy- ten bindet. Die Pipettenspitze, mit der der Label transferiert wurde, ist noch nicht entleert, da sie ggf. für weitere Proben nochmals verwendet wird, und wird daher auf einer der Ablage- oder Parkpositionen geparkt.
Daraufhin wird mit einer weiteren Pipettenspitze bevorzugt ein Substrat in die Biochipkammer pipettiert. Dieses bildet ein Reaktionsprodukt, welches auf dem Biochip ein elektri- sches Signal auslöst. Die Pipettenspitze, mit der das Substrat transferiert wurde, ist noch nicht entleert, da sie ggf. für weitere Proben nochmals verwendet wird, und wird da¬ her auf einer zweiten Ablage- oder Parkpositionen geparkt.
Somit zeichnet sich das bevorzugte Verfahren darin aus, dass mehrere Pipettenspitzen z.B. auf verschiedenen Ablagepositionen oder in den Vertiefungen innerhalb der Ausnehmung verbleiben .
Zur Amplifikation des Analyten wird vorzugsweise eine Thermo- zyklisierungsreaktion eingesetzt. Dabei kommen nach einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Polymera- se-Kettenreaktion - kurz PCR -, eine allelspezifische Primer Expression - kurz ASPE - und/oder ein sogenanntes Amplificati- on Refractory Mutation System - kurz ARMS in Betracht.
Neben einer temperaturgesteuerten Amplifizierung des Analyten ist hierbei auch eine temperaturgesteuerte Hybridisierung mittels des Biochips vorgesehen.
Eine verbesserte Detektion des Analyten wird zudem durch eine temperaturgesteuerte elektrische, insbesondere elektrochemische, Detektion erreicht. Des Weiteren wird zur Verbesserung der automatischen Handhabung der Proben eine Analysegerät aus einer Kombination aus Leseein¬ richtung und Titerplatte angegeben. Diese Kombination ist an handelsübliche Pipettier-Roboter angepasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Titerplatte. Die Vertiefungen einer Einheit können mit vier verschiedenen Vergleichskonzen- trationen für quantitative Bestimmungen eingesetzt werden. Dies ist für Expressionsexperimente in der integrierten DNA Technik oder multiples Multiplexing bei sogenannten Single Nukleotide Polymorphism - kurz SNP - denkbar.
Mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen werden nunmehr be¬ vorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung beschrieben.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 eine perspektivische Ansicht eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Titerplatte;
Fig.2 eine perspektivische Ansicht eines Ausführungsbeispiels einer erfindungsgemäßen Leseeinrichtung für eine Titerplatte;
Fig. 3 eine perspektivische Ansicht einer Kombination einer Titerplatte gemäß Fig. 1 mit einer Leseein¬ richtung gemäß Fig. 3;
Fig.4 eine Draufsicht auf einen Ausschnitt der Obersei¬ te der erfindungsgemäßen Titerplatte;
Fig.5 einen Längsschnitt durch einen Ausschnitt einer Titerplatte und eines Lesegeräts gemäß einer zweiten Ausführungsform;
Fig.6 einen Ablaufplan eines erfindungsgemäßen Verfah- rens .
Im Folgenden werden die Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
Figur 1 zeigt eine Titerplatte 10 zur Detektion eines Analy- ten von der Unterseite 22. Die Titerplatte 10 weist mehrere in Reihen angeordnete Vertiefungen 12 auf, die von der Unter¬ seite 22 als Auswölbungen 12' sichtbar sind. Dabei sind die Vertiefungen 12 derart voneinander beabstandet und ausgerich¬ tet, dass ein Pipettier-Roboter mit einer Pipettenspitze erforderliche Reagenzien, Lösungsmittel und/oder eine auf den Analyten zu prüfende Probe in die Vertiefungen 12 einbringen kann .
Neben je zwei Reihen von Vertiefungen 12 ist eine Reihe von Biochips 14 angeordnet. Die Biochips 14 sind ebenfalls in Be¬ zug auf die Vertiefungen 12 derart positioniert, dass der Ro¬ boter die Pipettenspitze dorthin automatisch programmgesteu- ert verfahren kann. Diese Biochips 14 sind dazu ausgelegt, z.B. eine DNA mittels Hybridisierung zu detektieren, wobei sich mindestens eine elektrische Eigenschaft des Biochips 14 verändert. Derartige Biochips 14 können ggf. auch ein Chipkartenlabor beinhalten.
Die Titerplatte 10 ist modular aufgebaut, sie umfasst einen Block, z.B. ein Spritzgussteil, aus Kunststoff, in den die Vertiefungen 12 bzw. Auswölbungen 12' ausgeformt sind, und die Biochips 14. Diese sind in Aufnahmen 14' in dem Block aufgenommen. Unter den Biochips 14 ist bevorzugt eine Dichtung aus einem thermoplastischen Elastomer angeordnet, die die Aufnahme 14' zur Oberseite der Titerplatte (in Fig. 1 un¬ ten liegend) hin abdichtet. In der Dichtung sind vorzugsweise trichterförmige Öffnungen angeordnet, die einen Einlassport, einen Auslass und ggf. Ablagepositionen bilden. Ferner können die Biochips 14 jeweils in einen Kunststoffring gefasst sein, der in der Aufnahme 14' befestigt ist, z.B. aufgeklebt oder geschweißt . Um mehrere Proben auf einer Titerplatte 10 untersuchen zu können, sind jeweils mehrere - hier vier - Vertiefungen 12 mit je einem Biochip 14 zu einer Einheit 21 zusammengefasst, die in Fig. 1 durch eine strichpunktierte Linie umrandet ist. Zumindest entlang dieser Linie 21 verläuft eine Wand 16, die vier Vertiefungen 12 und einen Biochip 14 umfriedet und vor Kontaminationen schützt. Hierzu weist das Spitzgussteil eine Dicke d - also eine Wandhöhe - von etwa 50mm bis etwa 60mm auf. Die Titerplatte 10 weist 16 derartige Einheiten 21 auf.
Figur 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Leseeinrichtung 26 für eine Titerplatte 10. Auf der Leseeinrichtung 26 sind zum einen eine Reihe von Wannen 13 angeordnet, die als be- heizbare Aufnahmen für die Vertiefungen 12 der Titerplatte dienen. Insbesondere passen die in Figur 1 gezeigten Auswölbungen 12' in die Wannen 13. Die vier Wannen 13 einer Einheit 21 sind jeweils zu einem Thermoblock 11 zusammengefasst und bevorzugt unabhängig von einander und insbesondere von den anderen Thermoblöcken 11 beheizbar. Die dargestellte Leseeinrichtung 26 umfasst somit 12 unabhängige 4er Thermoblöcke 11. Mit einem Thermoblock 11 kann ein Analyt in den Vertiefungen 12 mittels einer Amplifizierungsreaktion auf eine gut zu de- tektierende Menge vervielfältigt werden.
Die Leseeinrichtung 26 stellt weiterhin einige elektrische Auslese- bzw. Kontaktflächen 15 für die Biochips 14 bereit. Jeweils ein Biochip 14 liegt auf einer Auslesefläche 15 auf, so dass die entsprechenden Kontakte am Biochip 14 kontaktiert und ausgelesen werden. Vorzugsweise kann die Temperatur der Ausleseflächen 15 kontrolliert werden. Auf einer Ausleseflä¬ che 15 sind z.B. 8 elektrische Kontakte angeordnet.
Die Kontaktflächen 15 und Wannen 13 sind von einer Umrandung 17 umgeben, die eine in Figur 1 gezeigte Titerplatte 10 auf der Leseeinrichtung 26 ausrichten und halten kann. Die Grundfläche und Höhe der Leseeinrichtung 26 ist vorzugsweise kompatibel mit dem bekannten STARlet® System, die Maße betragen also z.B. 150x110x110 mm3 und passen in einen 7- track Träger. Die Leseeinrichtung 26 umfasst bevorzugt 12 un- abhängige 4er Thermoblöcke bzw. Thermocycler 11, mit denen eine beliebig programmierbare PCR durchgeführt werden kann, sowie 12 unabhängige Temperaturkontrollierte elektrische Bio¬ chip-Ausleseblöcke. Die integrierte Elektronik weist vorzugs¬ weise ein Kommunikations-Interface, 24 unabhängige Tempera- turkontrolleinheiten sowie 12 unabhängige digitale Schnittstellen für die Biochip-Auslesung auf.
In Fig. 3 ist die Titerplatte 10 der Fig. 1 von der Oberseite gezeigt, wie sie auf eine Leseeinrichtung 26 gemäß Fig. 2 aufgesetzt ist. Dabei ist die Titerplatte 10 von der Umrandung 17 abgestützt. In der Oberseite 20 der Titerplatte 10 sind 16 Ausnehmungen 18 erkennbar, die jeweils die Form eines etwa E-förmigen Langlochs aufweisen. Die Ausnehmungen 18 gehen bis auf den Boden der Titerplatte 10 durch, sind also wie in einen Block „eingefräst". Jede Ausnehmung 18 ist daher von relativ dicken Wänden 16 begrenzt, die bis zu den Vertiefungen 12 in der Titerplatte 10 reichen. Die Wände 16 stellen eine Umfriedung der einzelnen Einheiten aus Vertiefungen 12 und dem Biochip 14 bereit. Diese sind am Grund 19 der Ausneh- mung 18 angeordnet und sind mittels Pipettier-Roboter erreichbar. Der Pipettier-Roboter bewegt eine Pipettenspitze 40 zum Umfüllen einer amplifizierten Probenmischung von der Vertiefung 12 in den Biochip 14 entlang des Langlochs 18.
In Figur 4 ist schematisch eine Draufsicht auf eine einzelne Einheit 21 - umfassend einen Biochip und vier Vertiefungen - einer Titerplatte 10 von der Oberseite 20 dargestellt. In die Titerplatte 10 ist eine Ausnehmung 18 eingebracht. Die Ausnehmung 18 ist als Langloch ausgebildet und von den Wänden 16 umschlossen. Zur Oberseite 20 hin ist die Ausnehmung 18 offen . Durch die Ausnehmung 18 sieht man auf den Grund 19 der Titerplatte 10, in dem vier rechts gezeigte Vertiefungen 12 eingelassen sind. Auf der linken Seite liegt der Biochip 14 unterhalb der gestrichelten Linie. Der Biochip 14 ist z.B. von einer Dichtung 30 bedeckt, in der bei 32 ein Einfüllport eingelassen ist, durch den mittels einer Pipettenspitze eine Probe in Kontakt mit dem Biochip 14 gebracht werden kann. An den Positionen 33 und 35 ist die Dichtung 30 auf dem Biochip 14 nicht durchlässig, jedoch mit einer kleinen Aufnahme für eine Pipettenspitze versehen. Diese Aufnahme kann z.B. eine kleine Vertiefung in der Dichtung 30 sein, in der eine Pipettenspitze aufgenommen werden kann. Derartige Vertiefungen sind jedoch nicht unbedingt notwendig. Jedenfalls kann an den Positionen 33 und 35 eine Pipettenspitze abgelegt werden. Deshalb sind auch diese Positionen 33, 35 mit dem Langloch 18 verbunden. Dabei wird die Öffnung der Pipettenspitze durch das elastomere Material der Dichtung 30 abgedichtet, so dass die Pipettenspitze noch mit z.B. Substrat oder Label-Enzym gefüllt sein kann, wenn sie an einer dieser Ablagepositionen 33 oder 35 geparkt wird. An der Position 34 ist eine Öffnung eines Überlaufreservoirs angeordnet. Diese Position ist nicht mit dem Langloch 18 verbunden, da es nicht notwendig ist, an diese Position eine Pipettenspitze zu verfahren.
Zur Handhabung einer Probe in den Vertiefungen 12 ist die
Ausnehmung 18 in Form eines mehrgliedrigen Langlochs ausgelegt, das unter anderem die vier Vertiefungen quasi „von oben" zugänglich macht. Das heißt, dass Pipettenspitzen 40 mittels eines Pipettier-Roboters über das Langloch 18 einge- bracht und verschoben werden können. Die eingeführte Pipettenspitze erreicht, ohne die Ausnehmung 18 verlassen zu müs¬ sen sowohl alle Vertiefungen 12 als auch den Biochip 14. Eine das Target enthaltende amplifizierte Probe kann von der Pipette aus einer der Vertiefungen 12 aufgenommen und über den Einfüllport 32 in den Biochip 14 transferiert werden. Der
Einfüllport 32 durchdringt die elastomere Dichtung oder Be- schichtung 30, die zum Schutz auf dem Biochip 14 aufgebracht ist . Über den Einfüllport 32 läuft die flüssige Probe aus einer Pipettenspitze 40 in eine Biochipkammer 36, die angrenzend an die sensitiven Flächen des Biochips 14 angeordnet ist und insbesondere zwischen Biochip 14 und Dichtung 30 verläuft. Von der Biochipkammer 36 geht ein Überlaufreservoir 24 ab, welches zur Oberseite hin offen ist. In dem Überlaufreservoir 24 ist ein Dochtelement 31 angeordnet, in diesem Fall ein zy¬ linderförmiges Stück aus absorbierenden Material, z.B. Schaumstoff oder Watte. Aus der Biochipkammer 34 läuft die flüssige Probe aus einer Pipettenspitze 40 somit weiter in das Überlaufreservoir 24.
Eine Pipettenspitze kann nach Benutzung innerhalb der Ausneh- mung 18 an 6 verschiedenen Positionen verbleiben: Ist die Pi- pettenspite noch gefüllt, z.B. mit Label oder Substrat, insbesondere mit einer Flüssigkeit, die später nochmals benötigt werden wird, kann sie auf einer der beiden Ablagepositionen 33, 35 geparkt werden, wo ihre Öffnung durch die Dichtung 30 verschlossen wird. Eine leere, gebrauchte Pipettenspitze, z.B. nach dem Pipettieren von PCR-Produkt von einer der Vertiefungen 12 über den Einfüllport 32 in die Biochipkammer 36, kann in der jeweiligen Vertiefung 12 abgelegt werden. Nach dem Transfer von PCR-Product in die Biochipkammer 36 kann die Pipettenspitze völlig entleert werden, da die Biochipkammer 36 direkt mit dem Überlaufreservoir 24 verbundne ist, in das alle überschüssige Flüssigkeit abgesogen wird.
Die Figur 5 zeigt eine Kombination von einer Titerplatte 10 mit einer Leseeinrichtung 26 im Längsschnitt, wobei wiederum nur eine Einheit 21 dargestellt ist. Die Titerplatte 10 um- fasst mehrere Vertiefungen 12, deren Auswölbungen 12' in Wannen 13 eines Thermoblocks 11 eingebracht sind. Das eingebrachte Probenmaterial wird mittels einer Thermozykli- sierungsreaktion wie einer PCR mehrfach kopiert. Um eine Kontamination von Probenmaterial aus anderen Vertiefungen 12 zu vermeiden, ist ein Sperrmedium 28 - hier ein Mineralölfilm - in einer der Vertiefungen 12 vorgesehen. An die Vertiefungen 12 schließen sich Wände 16 an, die zur ersten Seite 20 offen sind. Somit können Pipettenspitzen 40 von einem Pipettier- Roboter eingebracht die Vertiefungen 12 erreichen. Jeweils zwischen den beiden Vertiefungen 12 und der linken Vertiefung 12 und der Biochip 14 ist die Wand 14 nicht geschnitten, sondern in Draufsicht erkennbar.
Der Biochip 14 ist von einem Kunststoffring 41 umrandet, der vorzugsweise eine Dichtlippe aufweist und den Biochip 14 ge- gen die Titerplatte 10 bzw. die Dichtung 30 abdichtet. Nach oben weist der Biochip 14 als Kontaminationsschutz eine Dichtung 30 z.B. aus Polypropylen auf. Zwischen der Dichtung 30 und der Fläche mit Fängermolekülen für den Analyten auf dem Biochip 14 ist eine Biochipkammer 36 gebildet, in die eine Probe aufgenommen werden kann. Die amplifizierte Probe kann mit der Pipettenspitze 40 über einen Einfüllport 32 in die Biochipkammer 36 übertragen werden, wobei die umgrenzte Ausnehmung 18 nicht verlassen wird.
Zwischen den Vertiefungen 12 und dem Einfüllport 32 ist eine Bohrung 38 angeordnet. Diese Bohrung 38 durchdringt die gesamte Titerplatte 10. Durch Applizieren eines Unterdrucks oder Vakuums kann ein stetiger Luftstrom erzeugt werden, der die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination mit Probenmaterial weiter verringert. Der Luftstrom tritt hierbei über die erste Seite 20 in die Titerplatte 10 ein. Ein Aerosol, Tröpfchen oder dergleichen wird sodann mit dem Luftstrom über die Bohrung 38 abgeführt. Es steht somit ein sogenanntes Extraktionssystem für die erfindungsgemäße Titerplatte 10 zur Verfü- gung. Die Bohrung 38 kann zudem mit einem Filtermaterial 39 belegt sein.
Die Probe tritt über den Einfüllport 32 in die Chipkammer 36 über den Biochip 14 ein. Falls zuviel Flüssigkeit in die Bio- chipkammer 36 eingefüllt wird, läuft dieses über den Auslass 34 in der Dichtung 30 in ein Überlaufreservoir 24. Damit einmal in dem Überlaufreservoir 24 befindliche Flüssigkeit nicht zurücklaufen kann, ist eine Zwischenwand 37 als Überlauf- schütz vorgesehen wie in Figur 5 gezeigt. Im Zwischenraum zwischen der Zwischenwand 37 und der Wandung 16 befindet sich beispielsweise ein Saugdocht, der überschüssige Probenflüssigkeit aufnehmen kann und diese mittels Kapillarkräften in das Überlaufreservoir 24 leitet, welches ca. 1,3ml Flüssigkeit aufnehmen kann.
Gemäß einer anderen, nicht dargestellten Ausführungsform ist das Überlaufreservoir 24 direkt oberhalb des Auslasses 34 an- geordnet, jedoch über einen Spalt von der Biochipkammer 36 getrennt. Das Überlaufreservoir 24 ist fast vollständig mit einem Dochtelement ausgefüllt, wie in Fig. 4 dargestellt, der etwa l-2ml Flüssigkeit halten kann. Am Auslass 34 auftretende Flüssigkeit wird vom Docht aufgenommen. Aufgrund des Spaltes reißt der Flüssigkeitsstrom sofort ab, wenn keine Flüssigkeit mehr nachgeliefert wird. Auf diese Weise entsteht kein Rücklaufstrom, auch nicht durch Kapillarkräfte.
Mit der Titerplatte 10 kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion eines Analyten mittels eines Biochips 14 durch¬ geführt werden. Der Biochip 14 ist in eine Titerplatte 10 in¬ tegriert wie vorstehend beschrieben. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Ein Einbringen einer Probe in eine der Vertiefungen 12 der Titerplatte 10 und ein Einbringen von Re- agenzien in die Vertiefungen 12. Anschließend erfolgt ein
Durchführen einer Amplifizierungsreaktion mit der mit Reagenzien versetzten Probe, wobei eine PCR-Reaktion, eine ASPE- und/oder eine ARMS-Reaktion in Betracht kommen. Danach erfolgt das Transferieren des entstandenen Reaktionsgemisches auf den Biochip 14, und Auslesen des Biochips 14, der durch Hybridisierung mit dem Analyten mindestens eine elektrisch erfassbare Eigenschaft verändert. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass das Flüssigkeiten mittels eines Pipettier-Roboters mit der Pipettenspitze 40 transferiert werden und die Pipettenspitze 40 innerhalb des umfriedeten Raums 18 verbleibt. Hierzu wird sie in einer der Vertiefungen 12 oder auf einer der Ablagepositionen 33, 35 abgelegt . Durch den Einsatz von Pipettier-Robotern wird das Analyseverfahren erheblich beschleunigt, ist weniger fehlerbehaftet und zudem kostengünstiger. Insbesondere wird die Verwendung für quantitative Bestimmungen, eine integrierte DNA Technik - kurz IDT oder ein multiples Multiplexing im Rahmen von SNP möglich.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Detektion eines Analyten mittels Biochips 14 ist in Figur 6 als Ablaufplan darge- stellt. Es umfasst zunächst das Einbringen 102 einer oder mehrerer zu untersuchenden Probe (n) in eine oder mehrere der Vertiefungen 12 einer Titerplatte 10. Diese Titerplatte 10 ist vorzugsweise eine erfindungsgemäße Titerplatte 10 wie vorstehend beschrieben. Die mit der Probe in Kontakt gebrach- te Pipettenspitze 40 kann danach von einem Pipettier-Roboter auf gewöhnliche Art entsorgt werden.
In einem weiteren Verfahrensschritt 104 werden die für eine Amplifizierungsreaktion des Analyten benötigten Reagenzien in die Vertiefungen 12 eingebracht. Hierzu wird eine weitere Pi¬ pettenspitze 40 vom Pipettier-Roboter in die Ausnehmung 18 eingebracht und bevorzugt danach auf die übliche Weise außer¬ halb der Ausnehmung entsorgt. Optional kann die Probe vor der Amplifizierungsreaktion mit Mineralöl überschichtet werden. Nach Zusammenführen der Reagenzien und der Probe wird ein
Temperaturprogramm 106 durchgeführt, um eine PCR Reaktion ab¬ laufen zu lassen. Das Reaktionsgemisch enthält anschließend den Analyten in massenweise kopierter Form zur besseren Detektion .
Der Pipettier-Roboter nimmt daraufhin eine neue, saubere Pi¬ pettenspitze 40 auf, Schritt 108. Mit dieser Pipettenspitze wird in Schritt 110 das Reaktionsgemisch mit der amplifizier- ten Probe von einer ersten der Vertiefungen 12 in den Biochip 14 transferiert. Das Reaktionsgemisch wird in die Biochipkam¬ mer 36 eingelassen. Eventuell zuviel aufgenommenes Reaktions¬ gemisch läuft durch den Auslass 34 in das Überlaufreservoir 24. Die benutzte Pipettenspitze wird nach vollständiger Ent- leerung an der ersten Vertiefung 12 abgelegt, Schritt 114, d.h. sie verbleibt innerhalb der Ausnehmung 18.
Daraufhin nimmt der Pipettier-Roboter zunächst eine weitere neue, saubere Pipettenspitze 40 auf, Schritt 116. Mit dieser Pipettenspitze wird in Schritt 118 ein Label-Enzym aus einem außerhalb der Ausnehmung 18 befindlichem Vorratsbehälter auf¬ genommen und in den Biochip 14 transferiert. Die Pipettenspitze 40 ist danach noch nicht leer und wird daher an der ersten Ablageposition 33 abgelegt, Schritt 120, d.h. sie ver¬ bleibt innerhalb der Ausnehmung 18.
Danach nimmt der Pipettier-Roboter eine weitere neue, saubere Pipettenspitze 40 auf, Schritt 122. Mit dieser Pipettenspitze wird in Schritt 124 ein Substrat aus einem außerhalb der Aus¬ nehmung 18 befindlichem Vorratsbehälter aufgenommen und in den Biochip 14 transferiert. Die Pipettenspitze 40 ist danach noch nicht leer und wird daher an der zweiten Ablageposition 35 abgelegt, Schritt 126, d.h. sie verbleibt innerhalb der Ausnehmung 18.
Danach kann der Biochip 14 ausgelesen werden, Schritt 128.
Die Schritte 110 bis 128 können noch mehrmals wiederholt wer- den, und zwar mit den anderen Reaktionsgemischen aus den anderen Vertiefungen 12. Die Pipettenspitze, die zum Pipettieren des Reaktionsgemisches aus der Vertiefung 12 benutzt wird, wird in die jeweilige Vertiefung 12 zurückgestellt und verbleibt dort, bis sie gemeinsam mit der Titerplatte 10 ent- sorgt wird. Die Pipettenspitzen, mit denen Label-Enzym und
Substrat transferiert wurden, werden wieder verwendet und da¬ nach wieder an den Ablagepositionen 33, 35 geparkt.
Die Erfindung erlaubt es somit, benutzte Pipettenspitzen nicht über andere Ausnehmungen 18, in denen andere Proben un¬ tersucht werden, hinweg entsorgen zu müssen und vermindert damit das Kontaminationsrisiko.

Claims

Patentansprüche
1. Titerplatte (10) zur Detektion eines Analyten, mit mehreren Vertiefungen (12) und mit zumindest einem Biochip (14) , d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s der zumindest eine Biochip (14) zur Detektion eines Analyten ausgelegt ist und dass zumindest ein Biochip (14) gemeinsam mit mehreren der Vertiefungen (12) von einer Wand (16) umgeben ist.
2. Titerplatte (10) nach Anspruch 1, d a d u r c h g e ¬ k e n n z e i c h n e t , d a s s der Biochip (14) neben den Vertiefungen (12) angeordnet ist und dass zumindest eine Aus¬ nehmung (18) von einer Wand (16) begrenzt ist und je mehrere der Vertiefungen (12) und ein Biochip (14) an deren Grund (19) angeordnet sind.
3. Titerplatte (10) nach Anspruch 2, d a d u r c h g e ¬ k e n n z e i c h n e t , d a s s sie mehrere Ausnehmungen (18) aufweist.
4. Titerplatte (10) nach einem der Ansprüche 2 bis 4, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die zumin¬ dest eine Ausnehmung (18) zu einer ersten Seite (20) der Ti- terplatte (10) hin offen ist, wobei die gegenüberliegende
Seite (22) mit einer Aufnahme (14 λ) für den Biochip (14) und mit einer Auswölbung (12 λ) der Vertiefung (12) versehen ist.
5. Titerplatte (10) nach einem der Ansprüche 2 bis 5, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die zumin¬ dest eine Ausnehmung (18) als ein Langloch (24) ausgebildet ist, das sich über alle Vertiefungen (12) und den Biochip (14) erstreckt, die von der Wand (16) umgeben sind.
6. Titerplatte (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine elastomere Dichtung (30) auf dem zumindest einen Biochip (14) aufgebracht ist, welche einen Einfüllport (32) aufweist.
7. Titerplatte (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s auf der elastomeren Dichtung (30) des Biochips (14) zumindest eine Ablageposition für eine Pipettenspitze (40) vorgesehen ist.
8. Titerplatte (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine Biochipkammer (36) in Flüssigkeitsverbindung mit einer sensitiven Fläche des Biochips (14) steht.
9. Titerplatte (10) nach Anspruch 8, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Biochipkammer (36) mit einem Überlaufreservoir (24) verbindbar ist, um eine Flüssigkeit aus der Biochipkammer (36) aufzunehmen.
10. Titerplatte (10) nach Anspruch 9, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s in dem Überlauf reservoir (24) ein Dochtelement (31) zum Aufsaugen von Flüssigkeit aus der Biochipkammer (36) angeordnet ist.
11. Titerplatte (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s inner- halb einer Vertiefung (18) eine die Titerplatte (10) durchdringende Bohrung (38) vorhanden ist.
12. Titerplatte (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 11, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s der Biochip (14) zur Detektion von DNA mittels Hybridisierung ausgelegt ist.
13. Leseeinrichtung (26) für eine Titerplatte (10), insbesondere für eine Titerplatte (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s sie zumindest eine elektrische Kontaktfläche (15) für einen Biochip (14) und Wannen (13) zur Aufnahme von Vertiefungen (12) der Titerplatte (10) aufweist.
14. Leseeinrichtung (26) nach Anspruch 13, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Wannen (13) für Vertiefungen (12) der Titerplatte (10) selektiv beheizbar sind.
15. Leseeinrichtung (26) nach Anspruch 13 oder 14, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s jeweils meh¬ rere Wannen (13) für Vertiefungen (12) der Titerplatte (10) zu einem Thermoblock (11) zusammengefasst sind, wobei die Le¬ seeinrichtung (26) mehrere Thermoblöcke (11) umfasst, die un¬ abhängig voneinander betreibbar sind.
16. Analysegerät, umfassend zumindest eine Titerplatte (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und eine Leseeinrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15.
17. Verfahren zur Detektion eines Analyten mittels eines Biochips (14), der in eine Titerplatte (10) nach einem der An- sprüche 1 bis 12 integriert ist mit folgenden Schritten:
Transferieren (110) eine Substanz, insbesondere einer Flüssigkeit, aus einer der Vertiefungen (12) auf den Biochip (14), d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Substanz mittels eines Pipettier-Roboters mit einer Pipettenspitze (40) auf den Biochip (14) transferiert wird und die Pipettenspitze (40) innerhalb der Ausnehmung (18) verbleibt.
18. Verfahren nach Anspruch 17 zur Detektion eines Analyten mittels eines Biochips (14), der in eine Titerplatte (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 12 integriert ist, mit folgen¬ den Schritten: a) Einbringen (102) einer Probe in eine der Vertiefungen (12); b) Einbringen von Reagenzien in zumindest eine der Vertiefungen (12) ; z
c) Durchführen einer Amplifizierungsreaktion mit der mit Reagenzien versetzten Probe; d) Transferieren (110) des entstandenen Reaktionsgemisches auf den Biochip (14), und e) Auslesen des Biochips (14), der durch Hybridisierung mit dem Analyten mindestens eine elektrisch erfassbare Eigenschaft verändert; d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s das Reaktionsgemisch und/oder die Probe mittels eines Pipet- tier-Roboters mit einer Pipettenspitze (40) eingebracht bzw. auf den Biochip (14) transferiert wird und dass die Pipetten¬ spitze (40) innerhalb der Ausnehmung (18) verbleibt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, d a d u r c h g e k e n n - z e i c h n e t , d a s s nach Schritt d) eine Flüssigkeit, insbesondere eine Label-Flüssigkeit, mit eine Pipettenspitze (40) auf den Biochip (14) transferiert wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, d a - d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s mehrere Pipettenspitzen (40) innerhalb der Ausnehmung (18) verbleiben.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine Pipet- tenspitze (40) nach dem Pipettieren, insbesondere nach dem Transferieren (110) des entstandenen Reaktionsgemisches von einer der Vertiefungen (12) auf den Biochip (14), in der jeweiligen Vertiefung (12) abgestellt wird, von der Flüssigkeit transferiert wurde.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s eine Pipettenspitze (40) nach dem Pipettieren, insbesondere nach dem Transferieren von Label-Flüssigkeit auf den Biochip (14), auf einer Ablageposition (33, 35) innerhalb der Ausnehmung (18) abgestellt wird, welche die Pipettenspitze (40) nach unten abdichtet, so das keine Flüssigkeit aus der Pipettenspitze (40) austreten kann.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 22, d a ¬ d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , d a s s die Schrit¬ te a) bis e) mit einer weiteren Probe durchgeführt werden.
24. Verwendung einer Titerplatte (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 12 für eine quantitative Bestimmung, eine IDT, ein SNP (Single Nukleotide Polymorphism) oder eine Expressionsanalyse .
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