JP2010506583A - 核酸の増幅及び検出装置 - Google Patents

Abstract

核酸の増幅及び検出において使用するのに適した装置が提供されている。当該装置は、区画（３）を含んだ試料管を含み、前記区画（３）は、前記管がさかさまに回転された場合にその内容物が流れ出るように上が開口されているのが好ましい。前記管は、増幅された試料ＤＮＡがハイブリッド形成することができる核酸のマイクロアレイを含むキャップ（２）をさらに含む。

Description

本発明は、特にハイブリダイゼーションによって、核酸断片を増幅及び検出するための装置並びに方法に関する。

ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）は、特定の核酸断片を増幅するための方法である。多くの感染症を含めた種々の疾患の研究において及びその診断のために使用される場合が多い。増幅されたＰＣＲ産物の検出は、固定化された相補的な核酸配列に対するハイブリダイゼーションにより行うことができる。特異的な相補的配列（いわゆる捕獲プローブ）を規定されたパターンで固定化することにより、多数のヌクレオチド配列を同時に検出することができる。そのようなパターン形成された捕獲プローブのアレイは、マイクロアレイと呼ばれることが多い。マイクロアレイとハイブリッド形成した核酸配列は、例えば蛍光による等、光学手段により検出することができる。

国際公開ＷＯ−Ａ−０１／４５８４３号は、流動装置を収容するためのカートリッジを含む、ハイブリダイゼーションアッセイを行うためのシステムを開示している。前記流動装置は、マイクロチャンネル通路のアレイを有している。前記カートリッジは観察窓を含むことができる。このシステムは特定化された実験環境において機能的であり得るけれども、ポイントオブケアで操作することができる単純に操作される装置の必要性を満たしていない。

国際公開ＷＯ０３／０２２４２１号は、生物学的及び化学的分析を行うための装置並びに方法を開示しており、前記装置は、支持プレートから突出した三次元微小カラムのアレイを含む。多数の異なる生物学的材料のアレイを、前記カラムの表面に取り付けることができる。前記装置は、既存のマイクロタイターウェルプレートと組み合わせて使用することができる。

米国特許第２００４／０１６６５０８号は、多数の試料を分析するための、そこに含有され、特異的結合反応における結合パートナーとして生物学的関連性のある分析物に対する分析用プラットフォーム、及び、それを用いて行われる方法を開示している。前記方法は、分散型の測定領域内で分析されることになる試料を、固体支持体としてのエバネッセント場センサプラットフォーム上に堆積させるステップ、１又は複数のトレーサー化合物を試料と接触させるステップ、試料に含有された分析物に対するトレーサー化合物の結合から生じた光電子信号の変化を測定するステップ、並びに、対応する測定領域からの前記光電子信号の変化の相対量から質的及び／又は量的に特異的に検出されることになる分析物の存在を決定するステップを含む。

国際公開ＷＯ−Ａ−００／１２６７５号及び米国特許第６，６４９，３７８号は、容易に操作されると記載され、汚染のない自給式装置を開示している。記載されたアイデアは、自給式装置を使用した、増幅された核酸の迅速で正確な検出を提供している。前記装置は、核酸抽出、特異的な標的の増幅及び検出を１つの装置に統合し、迅速で正確な核酸配列の検出を可能にしている。前記自給式装置は、端の一つが閉じた第１の中空円筒、及び、その中の複数のチャンバ、相対的回転が可能な第１の円筒の内部に接触して置かれた第２の中空縦長円筒を含む。試料が、抽出のために前記第１の円筒内に導入される。抽出された核酸は固体相に結合され、従って、洗浄バッファーの添加により固体相から溶離されない。増幅及びラベリングが同じ円筒内で起こる。最後に、ラベルされ増幅された産物を、標的配列の検出のためにレポーター特異的リガンドと結合した微粒子と反応させる。

核酸を増幅及び検出するための別の簡単なシステムを提供することが、本発明の目的である。

本発明は、従って、核酸の増幅及び検出のための装置に関し、当該装置は、反応組成物を含んだ少なくとも１つの区画（３）を含む管（１）を含み、該管はキャップ（２）を含み、該キャップはその内側に核酸のマイクロアレイを含む。

本発明は、さらに、捕獲プローブに対する核酸のリアルタイムのハイブリダイゼーションを検出する方法に関し、当該方法は、
（ａ）本発明による装置の底の区画にＰＣＲマスターミックス、適切なＰＣＲプライマー、及び鋳型ＤＮＡを含んだ試料を投与するステップ、
（ｂ）区画（３）にハイブリダイゼーションバッファーを投与するステップ、
（ｃ）内側に核酸（捕獲プローブ）のマイクロアレイを含んだ前記キャップで当該装置を閉じるステップ、
（ｄ）鋳型ＤＮＡの増幅のためにＰＣＲ反応を実行するステップ、
（ｅ）区画（３）の内容物が前記区画から流れ出るように、当該装置の向きを変えるステップ、
（ｆ）任意選択で、区画（３）の内容物の当該装置の内容物との混合を確実にするために、繰り返し当該装置の向きを変えるステップ、
（ｇ）前記増幅された鋳型ＤＮＡを前記捕獲プローブとハイブリッド形成させるステップ、
（ｈ）前記ハイブリッド形成した増幅された鋳型ＤＮＡを検出するステップ、
を含む。

さらなる例において、本発明は、核酸の増幅及び検出のためのシステムに関し、当該システムは、少なくとも１つ、好ましくは多数の上記の装置を含む。

本発明による装置を示している。 本発明によるシステムを示している。 本発明による方法を例示している。

〔定義〕
鋳型ＤＮＡは、試料内に存在し、その存在が検出されることになるＤＮＡである。

ＰＣＲマスターミックスは、濃縮されたＰＣＲ反応要素の混合である。一般的に、そのような混合は、ポリメラーゼ酵素、バッファー、ヌクレオチド、又はその組合せを含めた群から選択された組成物を含む。

マイクロアレイは、ヌクレオチド断片、好ましくはＤＮＡ断片を検査するために使用される、一組の縮小化された化学反応領域として定義される。

前記管は区画（３）を含み、反応における特定の段階、好ましくは、管（１）の底にある試料に存在するいかなる標的配列の増幅後に管（１）の底の区画に存在する要素と混合することができる試薬を区画（３）は含む。

少なくとも１つの区画（３）は、ＰＣＲ反応が実行された場合に最も好ましいハイブリダイゼーションバッファーである反応組成物で満たされることが好ましい。

区画（３）は、上側に開口部を含んでいることが好ましい。この方法で、前記区画は、その内容物が管（１）内に放出されるよう操作することができる。そのような操作は、例えば当該装置／管を１８０度回転させることによるものであり得る。

あるいは、区画（３）は、特定のトリガによって浸透性にすることができるか、又は、破裂させることができる特定の材料から作製される。そのようなトリガは、温度変化、特定の波長の光の適用、又は、管（１）内で起こるようされた化学反応であり得る。最も好ましい区画（３）は、上記のようにその上側に開口部を有している。

本発明による装置は、加熱要素（４）、読み取り器（５）、及び、透明な下部取付板（６）を含んだシステム内に統合されるのが好ましい。

核酸の増幅及び検出のためのそのようなシステムは、少なくとも１つ、より好ましくは多数の本発明による装置を含んでいることが好ましい。

ＰＣＲ反応を実行するために、当該システムは、加熱要素（４）及び読み取り器（５）を含んでいることが好ましい。

当該システムは、１又は複数の当該装置を回転させるよう役立つ回転要素をさらに含んでいることが好ましい。

好ましい読み取り器は、ＣＣＤカメラを含む。

検出を促進するために、当該システムは、透明な下部取付板を含んでいることが最も好ましい。

別の態様において、本発明は、捕獲プローブに対する核酸のリアルタイムのハイブリダイゼーションを検出する方法に関し、当該方法は、
（ａ）上記の当該装置の底の区画にＰＣＲマスターミックス、適切なＰＣＲプライマー、及び、鋳型核酸、好ましくは鋳型ＤＮＡを含んだ試料を投与するステップ、
（ｂ）区画（３）にハイブリダイゼーションバッファーを投与するステップ、
（ｃ）内側に核酸（捕獲プローブ）のマイクロアレイを含んだ前記キャップで当該装置を閉じるステップ、
（ｄ）鋳型核酸の増幅のためにＰＣＲ反応を実行するステップ、
（ｅ）区画（３）の内容物が前記区画から流れ出るように、当該装置の向きを変えるステップ、
（ｆ）任意選択で、区画（３）の内容物の当該装置の内容物との混合を確実にするために、繰り返し当該装置の向きを変えるステップ、
（ｇ）前記増幅された鋳型核酸を前記捕獲プローブとハイブリッド形成させるステップ、
（ｈ）前記ハイブリッド形成した増幅された鋳型核酸を検出するステップ、
を含む。

この方法において、検出は、走査型読み取り器、最も好ましくはＣＣＤカメラを使用して実行されるのが好ましい。

本発明は、以下の第１の実施形態により例示される。

図１は、反応管の概略図を示している。ＰＣＲマスターミックス、適切な（ラベルされた）ＰＣＲプライマー、及び、鋳型ＤＮＡを含んだ試料が、管（１）の底に投与される。ハイブリダイゼーションバッファーが、管（１）の中にある開いた流体区画（３）に投与される。前記管には、内側に核酸のマイクロアレイを含んだキャップ（２）がかぶせられる。

管（１）は、本明細書においてシステム（８）と呼ばれる統合された読み取り装置内に置かれる（図２）。このシステムは、（迅速な）熱サイクリング（加熱要素４）の能力を持つ可動性のサーモブロック（ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ）、加熱された上蓋、及び、透明な下部取付板（６）から成る。下部取付板の下には、共焦点光学読み取り器（５）が置かれる。前記加熱要素は、熱サイクリング、等温増幅における温度調節、又は、ハイブリダイゼーション中の試料加熱に使用することができる。

試料は、分析されることになる場合、上記の前記管に投与され、次に、サーモブロック（４）内に置かれる（図３．１）。この図は、多数の管を保持することができるサーモブロックの例を示している。１つの管のための装置も可能である。管を有した加熱ブロック（４）は、管のキャップが加熱された蓋まで圧迫されることを確実にするよう、上に移動される（３．２）。この蓋は、ＰＣＲ熱サイクリング中に試料が蒸発するのを防ぐために、１００℃よりも僅かに高い一定温度で保たれる。熱サイクリングが完了した後、前記サーモブロックは下に移動され、１８０°回転される（３．３）。これは、流体を前記管の上まで流し、ハイブリダイゼーションバッファーがその区画（３）から流れ出るようにする。任意選択で、ＰＣＲ流体とハイブリダイゼーションバッファーの適切な混合を確実にするために、前記ブロックを繰り返し回転させることができる。任意選択で、９５℃の変性ステップのために、前記ブロックを再度直立させ上に移動させることができる。前記管がさかさまにされると、増幅されたＰＣＲ産物は、マイクロアレイ上の捕獲プローブとハイブリッド形成させられる。前記ブロックは、透明な取付板まで下に移動される。この取付板の下には、蛍光を検出することができる共焦点読み取り器がある。前記読み取り器は共焦点のため、測定（検出及び励起）体積は、前記マイクロアレイの表面から一般的に数マイクロメートルの所まで実質的に減少され、従って、前記読み取り器は表面特異性を高めた。高められた表面特異性の結果として、流体の洗浄又は除去が必要とされないため、ハイブリッド形成をリアルタイムで測定することができる。これは、図３．４に例示されている。前記読み取り器は、走査型読み取り器であり得る。

表面特異性を高める別の方法として、基板の表面にてエバネッセント波が励起され、表面に結合したフルオロフォアを励起するエバネッセント励起法を使用することができる。この状況において、前記キャップの内側に置かれた前記キャップの表面は基板である。

第１の方法として、前記基板／流体境界面にて全反射（ＴＩＲ）を使用して、アレイ表面の１００〜５００ｎｍ内で測定（励起）体積を生じることができる。しかし、ＴＩＲは、基板−流体の境界面の臨界角よりも大きい角度で励起光の基板内へのカップリングを可能にするために、基板に接続されたガラスプリズムの使用、又は、楔形を有した基板の使用を好む。

第２の好ましい方法として、金属等の透明でない組成物で前記基板を覆い、前記基板−流体の境界面に平行な面において流体内の光の回折限界よりも小さい少なくとも一次元を有して、開口部（のアレイ）で前記基板をパターン形成することができる。例として、面内で一次元以上を有した、及び、流体内の光の回折限界よりも小さいその他の次元を有したワイヤグリッドで前記基板をパターン形成することができる。これは、前記アレイ表面の５０ｎｍ内（一般的には２０〜３０ｎｍ）の励起体積を生じる。この方法の、〔エバネッセント励起に対する〕第１の方法と比較した利点は、より簡単である、すなわち、プリズム又は楔形の表面を持つ必要がなく、入射角及び励起スポットの形に対して特別な要求がなく、蛍光を画像化するために簡単なＣＣＤカメラを使用することができ、さらに、実質的により少ない励起体積を可能にすることである。

前記基板がワイヤグリッドでパターン形成される実施形態において、ヌクレオチドのアレイは、理想的にはワイヤグリッドの開口部に置くことができる。

さらなる検出技術に対して、例えば参照により援用される国際出願第ＩＢ２００５／０５３１６８号が参照される。

Claims (16)

1. 核酸の増幅及び検出のための装置であって、
   反応組成物を含んだ少なくとも１つの区画を含む管を含み、
   該管はキャップを含み、
   該キャップはその内側に核酸のマイクロアレイを含む、装置。
2. 前記少なくとも１つの区画が、ハイブリダイゼーションバッファーである反応組成物で満たされる、請求項１に記載の装置。
3. 前記区画を、その内容物が前記管内に放出されるよう操作することができる、請求項１又は２に記載の装置。
4. 前記区画が、その上側に開口部を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置。
5. 加熱要素、読み取り器、及び、透明な下部取付板を含んだシステム内に統合される、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置。
6. 少なくとも１つ、好ましくは多数の、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置を含む、核酸の増幅及び検出のためのシステム。
7. 加熱要素及び読み取り器をさらに含む、請求項６に記載のシステム。
8. １又は複数の前記装置を回転させるよう役立つ回転要素をさらに含む、請求項６に記載のシステム。
9. 前記読み取り器が共焦点読み取り器である、請求項６に記載のシステム。
10. 基板として前記キャップの表面を含み、前記マイクロアレイ表面にてフルオロフォアの励起を可能にするために前記基板が楔形である、請求項６に記載のシステム。
11. 基板として前記キャップの表面を含み、前記アレイ表面にてフルオロフォアの励起を可能にするために前記基板がプリズムに結合される、請求項６に記載のシステム。
12. 基板として前記キャップの表面を含み、前記アレイ表面にてフルオロフォアのエバネッセント励起を可能にするために、前記基板が、パターン形成された組成物で前記流体に面した境界面にて覆われる、請求項６に記載のシステム。
13. 透明な下部取付板をさらに含む、請求項６に記載のシステム。
14. 捕獲プローブに対する核酸のリアルタイムのハイブリダイゼーションを検出する方法であって、
    （ａ）請求項１に記載の装置の底の区画にＰＣＲマスターミックス、適切なＰＣＲプライマー、及び鋳型核酸、好ましくは鋳型ＤＮＡを含んだ試料を投与するステップ、
    （ｂ）区画にハイブリダイゼーションバッファーを投与するステップ、
    （ｃ）内側に捕獲プローブと呼ばれる核酸のマイクロアレイを含んだ前記キャップで前記装置を閉じるステップ、
    （ｄ）鋳型核酸の増幅のためにＰＣＲ反応を実行するステップ、
    （ｅ）前記区画の内容物が前記区画から流れ出るように、前記装置の向きを変えるステップ、
    （ｆ）任意選択で、前記区画の内容物の前記装置の内容物との混合を確実にするために、繰り返し前記装置の向きを変えるステップ、
    （ｇ）前記増幅された鋳型核酸を前記捕獲プローブとハイブリッド形成させるステップ、
    （ｈ）前記ハイブリッド形成した増幅された鋳型核酸を検出するステップ、
    を含む方法。
15. 検出が走査型読み取り器を使用して実行される、請求項１４に記載の方法。
16. 感染症の検出に使用するための、請求項１４に記載の方法。

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